JPH07184696A - 核酸固定化方法 - Google Patents

核酸固定化方法

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JPH07184696A JP6127416A JP12741694A JPH07184696A JP H07184696 A JPH07184696 A JP H07184696A JP 6127416 A JP6127416 A JP 6127416A JP 12741694 A JP12741694 A JP 12741694A JP H07184696 A JPH07184696 A JP H07184696A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 単純かつ有効な核酸の固定化方法、この固定
化を利用する核酸の検出方法、この方法で使用するため
の試薬および対応する試薬キットを提供すること。 【構成】 核酸を捕獲プローブと一緒にハイブリダイズ
することによる核酸固定化方法であって、捕獲プローブ
が形成されたハイブリッドの酵素的伸長および／または
酵素的分解に対して保護されることを特徴とする核酸固
定化方法、この固定化を利用する核酸の検出方法、この
方法で使用するための試薬および対応する試薬キット。 【効果】 本発明の核酸固定化方法を使用すると、簡単
で有効に固定化を行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸の固定化方法、こ
の固定化を利用する核酸の検出方法、この方法で使用す
るための試薬および対応する試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸を検出する場合、ホモジーニアス(h
omogeneous)アッセイ法とヘテロジーニアス(heterogene
ous)アッセイ法とに区別される。ホモジーニアスアッセ
イ法では、検出プローブおよび検出されるべき核酸が溶
液中でアッセイされ、一方、ヘテロジーニアスアッセイ
法では、検出されるべき核酸が固定化される。この固定
化は、共有結合を介して核酸を固相に直接結合させる
か、または親和性対の一方に核酸を結合させ、この対の
残りの方を固相に結合させることによって行われる。
【０００３】結合は、固相に結合され、かつ、検出され
るべき核酸と少なくとも一部相補的であるいわゆる捕獲
プローブ(capture probe)に核酸をハイブリダイズさせ
て該核酸を固定化させることによっても行われうる。捕
獲プローブは、いずれかの望ましい手段で固相に結合さ
れる。ヘテロジーニアス法の長所は、標識された試薬成
分が検出されるべき核酸から容易に分離されうることで
ある。
【０００４】検出されるべき核酸が捕獲プローブを介し
て固定化される方法の例は、直接結合を開示しているＥ
Ｐ−Ａ−０ ０７９ １３９および親和性対を介する結合
を開示しているＥＰ−Ａ−０ １９２ １６８に開示され
ている。該特許文献に開示されているアッセイ方法の特
徴は、検出されるべき核酸の、該検出されるべき核酸と
ハイブリダイズされうる捕獲プローブとのハイブリダイ
ゼーションである。過剰の検出プローブを除去した後、
捕獲プローブの標識化基を介して固相で、形成されたハ
イブリッドが検出される。
【０００５】核酸診断薬に標的特異的増幅法を導入する
と、他の場合にはめったに生じない核酸を多量に生じる
可能性があった。増幅核酸中にジゴキシゲニン標識を取
り込ませるこの種の方法は、ＷＯ ９２／０６２１６に
開示されている。
【０００６】ＰＣＴ／ＵＳ９２／０１７３５には、２'
−置換核酸の製造方法および制限酵素による分解に対す
るその耐性が開示されている。さらに、核酸が配列決定
される場合、３'−デオキシヌクレオチドが鎖をトラン
ケートし、３'方向の核酸の伸長を阻害することも知ら
れている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、特に
単純かつ有効な固定化方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、捕獲プローブ
が形成されたＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの酵素的伸長
および／または酵素的分解に対して保護されることを特
徴とする、核酸を捕獲プローブとハイブリダイズさせる
ことによる核酸固定化方法を提供するものである。
【０００９】本発明は、また、この固定化方法による固
定化およびこの目的に好適な試薬を利用する核酸の検出
方法を提供するものである。
【００１０】捕獲プローブは、他の核酸とハイブリダイ
ズさせることができるか、あるいは、固定化される核酸
である。固定化は、核酸を固相に結合させる手段であ
る。これは、直接結合(固相の表面への捕獲プローブの
共有結合)であっても、間接結合(イオン性、吸着性、ま
たは生物特異的結合)であってもよい。本発明では、好
ましい核酸は、生物特異的対の相手で標識され、一方、
固定化される核酸である。生物特異的対は、抗原／抗
体、ハプテン／抗体、ビタミン／受容体、ホルモン／受
容体、および糖／レクチンなどの組合せである。好まし
い組合せは、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプ
トアビジン、またはハプテン／抗体である。かかる標識
核酸は、例えば、対応して標識された活性モノヌクレオ
シド誘導体を使用する化学的オリゴヌクレオチド合成に
よって、または、対応して標識されたモノヌクレオシド
三リン酸の取込みを介する酵素合成によって、または完
全に合成された核酸を化学的に修飾することによって製
造されうる。
【００１１】酵素的伸長は、生きている細胞中または活
性酵素を含有するかかる細胞から誘導される流体中で生
じるプロセスである。該プロセスは、核酸を伸長させる
ポリメラーゼなどの酵素によって引き起こされる。これ
らの伸長反応は、特に、対応する酵素を試料に添加し
て、増幅プロセスを行う場合、核酸の測定を有意に妨害
する。
【００１２】この伸長反応を抑制するために、本発明
は、捕獲プローブを伸長に対して保護することを提案す
る。これは、伸長酵素の３'−または５'−末端への立体
的接近を阻害する化学残基を結合させることによって行
うことができる。これらの残基は、捕獲プローブの固定
化核酸とのハイブリダイゼーションをしばしば阻害する
か、または完全に予防するので、伸長が起こるヒドロキ
シル基を不活性基に置き換えるのが好ましい。
【００１３】かかる基としては、例えば、水素またはＣ
1〜Ｃ3アルキル基が挙げられ、好ましくは、水素であ
る。したがって、それらの末端では、得られた捕獲プロ
ーブは、３'−または５'−デオキシリボヌクレオシド残
基または２',３'−または２',５'−ジデオキシリボヌク
レオシド残基を含有する。捕獲プローブの３'−末端
は、保護されるべき好ましい末端である。
【００１４】酵素的分解は、生物学的試料液における一
般的な現象でもある。かかる分解は、ＤＮＡseまたはＲ
ＮＡseなどのエンド−またはエキソヌクレアーゼによっ
て引き起こされる。これは、また、制限酵素も含む。例
えば、ＲＮＡが固定化されるべき核酸として使用される
べきである場合、このＲＮＡは、捕獲プローブとしての
ＤＮＡおよびＲＮＡからなるハイブリッドが形成される
とすぐに、ＲＮＡｓｅＨによって分解させられる。これ
は、非修飾ＤＮＡ捕獲プローブによる固定化が非常に無
効果であるかまたは不可能であることを意味する。本発
明は、捕獲プローブを修飾することによってこれを除外
しようとするものであり、その結果、前記酵素は、もは
や、捕獲プローブおよび検出されるべき核酸のハイブリ
ッドを基質として認識しなくなった。
【００１５】例えば２位での、捕獲プローブの糖残基の
修飾は、非常に有効であることが証明された。ＲＮＡse
Ｈの存在下でのＲＮＡの固定化についての特に好ましい
組合せは、デオキシリボヌクレオチドの２'−ヒドロキ
シル基がＯ−アルキルまたはＯ−アルキレン基によって
置き換えられているものである。特に好ましい組合せ
は、ＷＯ ９１／１５４９９に開示されている。
【００１６】驚くべきことに、記載された指標を同時に
使用することによって、ＲＮＡ／ＤＮＡ−ハイブリッド
の酵素的分解および酵素的伸長に対して有効に核酸を保
護することが可能である。修飾は、それらの効果および
作用がお互いに負に影響しないように選択される。
【００１７】捕獲プローブとしては、さらに修飾されて
いてもよいオリゴまたはポリヌクレオチドが挙げられ
る。しかしながら、この修飾は、ハイブリダイゼーショ
ンが固定化されるべき核酸と塩基対にさせることによっ
て不可能になる可能性を排除しなければならない。
【００１８】固定捕獲プローブは、固相に結合される核
酸である。結合は、共有結合を形成することによって、
または、パートナーの一方が捕獲プローブに結合し、他
方が固相に結合する生物特異的結合を形成する２つのパ
ートナー(例えば、ハプテン／抗体、ビタミン／レセプ
ター、好ましくは、ビオチン／ストレプトアビジン)を
介して生物特異的に行われうる。
【００１９】固定化されうる捕獲プローブは、固相に結
合していないが、前記固定捕獲プローブになりうる核酸
である。これを行うためには、固定捕獲プローブは、固
相との化学的反応能を有する残基(例えば、光活性化さ
れうる残基)または生物特異的結合のパートナーを含有
する。
【００２０】可能な固相としては、キュベット、微量滴
定プレートまたは粒子(例えば、プラスチック被覆磁気
ビーズ)が挙げられる。
【００２１】本発明の核酸固定化を行うためには、捕獲
プローブを、固定化されるべき核酸を含有する試料と接
触させる。ハイブリダイゼーションは、使用される核酸
の長さおよび捕獲プローブに依存する条件下で行われ
る。当業者は、いくつかの実験で、例えば、融点を測定
することによって、これらの条件を決定することができ
る。しかしながら、一般に、これらの条件は、捕獲プロ
ーブと同一の(非修飾の)ヌクレオチド配列を有する核酸
に関する条件と異ならない。
【００２２】使用される捕獲プローブが既に固定化され
た核酸である場合、捕獲プローブの核酸とのハイブリダ
イゼーションは、核酸の固定化と同時に起こる。所望に
より、固相で形成されたハイブリッドを、核酸を含有す
る液体から分離することができる。次いで、固相結合ハ
イブリッドを洗浄することができ、所望により、さらな
る反応について利用可能である。
【００２３】捕獲プローブが固定化されうるものである
場合、ハイブリッド含有液体を、捕獲プローブ固定化能
を有する固相と接触させる。これを行うためには、固相
は、捕獲プローブを固定化させるために使用される基の
結合相手を含有するのが好ましい。固定捕獲プローブを
用いる場合、さらなるプロセシング工程が続く。
【００２４】固定化されるべき核酸は、望ましい種類お
よび望ましい起源のものであり得る。これらは、天然試
料、例えば、体液または培養試料中で生じる核酸である
が、天然試料をプロセシングすることによって得られた
試料中で生じる核酸であってもよい。故に、それらは、
修飾されていても非修飾であってもよい。修飾は、核酸
の配列、長さ、および／または化学構造に関することが
できる。好ましい場合、核酸は、核酸のコピーまたは試
料中に初めから含有されていた核酸配列である。さらに
また、好ましいコピーは、初期核酸の一部のin vitro増
殖によって生じる増幅産物である。特に好ましい増幅産
物は、初期核酸での核酸の酵素的伸長によって鋳型とし
て形成されるものである。かかるin vitro増幅の例とし
ては、ＰＣＲ、ＬＣＲまたはプロモーター制御増幅が挙
げられる。
【００２５】他の好ましい具体例では、核酸は、検出可
能な基を取り込むことによって修飾される。この取込み
は、酵素的または化学的反応を介して行われうる。酵素
的反応は、それらが前記増幅の間に生じるので特に好ま
しい。この場合、伸長のために検出可能な修飾モノヌク
レオシド三リン酸を使用することが特に好都合であるこ
とが証明された。好ましい方法では、次いで、全ての取
り込まれていない検出可能な基を分離する。固定化され
るべき核酸が検出されうるように修飾される場合、固定
化された後、公知の方法で固相で検出することができ
る。故に、検出工程は、固定化工程に続く。本発明の別
の課題は、本発明の固定化工程に次ぐ固定ハイブリッド
の検出を使用する核酸検出方法である。特に好ましい方
法では、検出可能な基は、固定核酸で測定される。
【００２６】検出可能な基は、直接または間接的に検出
可能な基である。直接検出可能な基としては、例えば、
放射性(32Ｐ)基、有色基または蛍光性基または金属原子
が挙げられる。間接的に検出可能な基としては、例え
ば、抗体、抗原、ハプテンまたは酵素または酵素学的に
活性な部分酵素などの免疫学的または酵素学的に有効な
化合物が挙げられる。それらは、次反応または反応のシ
ーケンスで検出可能である。ハプテンは、それらが一般
にポリメラーゼの基質として標識ヌクレオシド三リン酸
と一緒に良く供され、ハプテンまたはハプテン化ヌクレ
オシドに対する標識抗体との次反応が容易に行われうる
ので特に好ましい。かかるヌクレオシド三リン酸は、例
えば、臭素−ヌクレオシド三リン酸またはジゴキシゲニ
ン、ジゴキシン−またはフルオレセイン結合ヌクレオシ
ド三リン酸である。ＥＰ−Ａ−０３２４ ４７４に開示
されているステロイドおよびその検出は、特に好適であ
ることが証明された。
【００２７】本発明の方法の第１の具体例では、検出さ
れるべき核酸は、それにハイブリダイズされる検出プロ
ーブを介して検出される。この検出プローブは、検出さ
れるべき核酸のセグメントにハイブリダイズすることが
できるヌクレオチド配列を有する。該セグメントは、捕
獲プローブがハイブリダイズするものと異なる。結果
は、捕獲プローブ、検出されるべき核酸および検出プロ
ーブからなる、いわゆるサンドイッチハイブリッドであ
る。これら３つの核酸のハイブリダイゼーション配列
は、主に、自由に選択され得る。好ましい方法では、サ
ンドイッチ形成は、実質的に同時に生じる。特に好まし
いサンドイッチ試験の具体例では、検出されるべき核酸
を含有する試料に捕獲プローブを添加する。次いで、検
出されるべき核酸またはその一部を増幅させ、次に、検
出プローブの助けによって、ハイブリダイゼーション条
件下で形成されたハイブリッドを検出する。捕獲プロー
ブによくあることであるが、酵素的伸長／分解に対して
検出プローブを同様に保護すること、および増幅の前ま
たは間にそれを添加することも可能である。
【００２８】好ましい具体例では、検出されるべき核酸
は、検出可能な標識ヌクレオチド、特に、モノヌクレオ
チドを酵素的に取り込みつつ、固相に固定化される捕獲
プローブの存在下で増幅される。過剰のモノヌクレオチ
ドの可能な分離後、取り込まれた検出可能なヌクレオチ
ドの量を介して、固相に固定化された核酸を測定する。
特に好ましい本発明に係る増幅は、ＥＰ−Ａ−０ ３２
９ ８２２に開示されている方法である。本発明方法の
特に優れている点は、固定化されるべきＲＮＡ(転写物)
が捕獲プローブおよびＲＮＡのハイブリッドによって分
解に対して保護されるように捕獲物を修飾することであ
る。
【００２９】固定化可能な捕獲プローブを使用する場
合、本発明は、２つの具体例を有する。第１の具体例で
は、検出されるべき核酸を固定化可能な捕獲プローブお
よび検出可能な標識モノヌクレオチドの存在下で増幅さ
せる。全ての公知の増幅方法を使用することができる。
好ましい方法は、サイクルの間に変性させる熱サイクル
を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＥＰ−Ｂ−０ ２０１
１８４）である：該増幅反応は、所望の容器中で行うこ
とができる。次いで、反応混合物を、固相に固定化可能
な捕獲プローブを固定化させることができる容器に移
す。過剰のモノヌクレオシドを分離し、検出されるべき
核酸の存在についての指標として固相の標識を使用する
のが好ましい。
【００３０】第２の好ましい具体例では、増幅反応は、
すでに、固定化可能な核酸を内壁に結合させることがで
きる容器中で生じる。これは、増幅混合物を別の容器中
に移すことは、もはや必要ではないという点で優れてい
る。熱循環的に制御された増幅反応、例えば、ＰＣＲま
たはＬＣＲを使用する場合、本発明は、同様のコーティ
ングを有する熱安定容器を使用することを提案する。
【００３１】該反応容器がすでにハイブリッドを検出す
るのに好適であることを条件とし、直接標識を使用する
場合、該反応は、試薬を添加せずに、増幅の開始から検
出の最後まで制御されうる。
【００３２】現在公知の方法は、増幅法の後に、反応混
合物がプローブを添加するための環境に曝露されなけれ
ばならないという欠点（汚染）を有する。プローブが増
幅試薬と一緒に添加される場合、該方法は、好都合に
は、あまりピペッティング工程を必要とせず、次に、反
応容器を増幅および試薬（例えば、捕獲プローブ）の添
加後に再度開放してはならない。この特徴は、標識を検
出するために試薬の添加を必要としない直接標識を用い
る方法について特に好都合である。かかる場合、例え
ば、エレクトロケミルミネセンス標識の場合、増幅の開
始からアナライト依存性シグナルの測定まで試薬を添加
しない。しかしながら、試薬の添加は、いつでも可能で
ある。
【００３３】本発明の他の課題は、修飾されて核酸およ
び相補的核酸のハイブリッドにおける核酸の酵素的分解
ならびに酵素的伸長に対して保護される核酸、さらにま
た、核酸を固定化させるための捕獲プローブとしてのそ
の使用である。好ましい方法では、これらの核酸は、核
塩基(nucleobase)の位置で、特に、相補的核酸に対する
水素結合能を有する機能性アミノ基で修飾される。それ
らは、天然核塩基に関しては修飾されない。
【００３４】本発明の別の課題は、核酸を伸長させるた
めの酵素を有する第１容器Ａおよび本発明の捕獲プロー
ブを有する第２容器Ｂからなる試薬キットを提供するこ
とである。
【００３５】これまたは他の容器は、好ましくは、核酸
の固定化および増幅または検出に必要な全ての他の試薬
を含有する。かかる試薬は、バッファー、モノヌクレオ
シド三リン酸、標識化試薬などである。
【００３６】特に好ましい容器Ｂは、本発明に従って修
飾されている検出可能な検出プローブまたは検出可能な
モノヌクレオシド三リン酸を特徴とする。さらにまた、
容器Ａは、核酸、特に、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド中
のＲＮＡを分解する酵素を含有することができる。
【００３７】本発明の課題は、特定のエレクトロケミル
ミネセンス標識モノヌクレオシド三リン酸を提供するこ
とでもある。
【００３８】エレクトロケミルミネセンス特性を有する
基は知られている。それらは、以下、エレクトロケミル
ミネセンス基Ｅと記す。Ｅの特に好ましいエレクトロケ
ミルミネセンス性成分は、５００g／molを超える原子
量、好ましくは、５５０〜２０００g／molを有する配位
錯体Ｋである。好ましい金属イオンは、周期表のＶIIｂ
およびＶIIIｂ亜族のイオンであり、特に、Ｒu、Ｏs、
Ｒeであり、特に好ましくは、ルテニウムである。
【００３９】配位錯体における金属イオンの好適なリガ
ンドは、特に、ＷＯ ９２／１０２６７またはＥＰ−Ａ
−０ ３４０ ６０５に開示されているような有機リガン
ドまたは基である。
【００４０】好適な有機リガンドは、窒素、酸素または
硫黄などの、対応する金属原子に対して電子供与体とし
て作用する原子を含有する炭化水素である。電子供与体
は、金属イオンと錯体形成させるような幾何学的配置に
配置されるのが好適である。ルテニウムの場合、ビピリ
ジル残基が好ましいリガンドである。
【００４１】さらにまた、リガンドの１つを介して、錯
体をモノヌクレオシド三リン酸に結合させる。好ましい
方法では、配位錯体とヌクレオシド三リン酸の原子との
間にスペーサー基Ａを配置させる。スペーサー基は、好
ましくは、所望により鎖の側部に結合されるさらなる基
を有する、３個、特に、５〜１５個、より特に、４〜１
０個の原子からなる原子鎖である。この原子の鎖は、ヘ
テロ原子、例えば、−Ｏ−(酸素)またはＮＲ2−基(ここ
で、Ｎは、窒素であり、Ｒ2は、水素またはＣ1〜Ｃ6ア
ルキル基である)によって中断されていてもよい炭化水
素鎖を含有するのが好ましい。この原子の鎖は、成分−
(ＣＲ3 2−ＣＲ3 2−Ｏ)(ここで、Ｒ3は、水素またはＣ1
〜Ｃ6アルキル基である)を１回含有するのが好ましい。
スペーサー基は、１０００g／mol未満の分子量を有する
のが好ましい。
【００４２】好ましくは、エレクトロケミルミネセンス
基Ｅは、モノヌクレオチドの核塩基の原子Ｎに共有結合
される。
【００４３】結合のための好ましい部位は、ピリミジン
のＣ５、Ｃ６、Ｃ４またはＮ４およびプリンのＣ８また
はＮ６およびデアザプリンのＣ７である。
【００４４】好ましいモノヌクレオシド三リン酸は、式
Ｉ： Ｐ−Ｚ−Ｂ−Ｅ (Ｉ) [式中、Ｐは、トリホスファート基またはトリホスファ
ートアナログ基であり、Ｚは、糖または糖アナログ基で
あり、Ｂは、核塩基または核塩基アナログ基であり、Ｅ
は、エレクトロケミルミネセンス基である]で示される
モノヌクレオシド三リン酸である。
【００４５】トリホスファート、糖、および核塩基は、
天然モノヌクレオシド三リン酸中に含有される基であ
る。アナログ基は、１個または数個の原子を置き換える
ことによって得られるこれらの基であり、式Ｉで示され
る化合物の特性、すなわち、核酸における取込みを実質
的に阻害しないこれらの基である。
【００４６】トリホスファートアナログは、例えば、１
個または数個の酸素原子を硫黄原子と置き換えた基であ
る。糖アナログは、環内酸素原子が−ＣＲ4 2−基(ここ
で、Ｒ4は、水素またはＣ1〜Ｃ6アルキル基である)によ
って置き換えられた基である。核塩基アナログは、例え
ば、デアザプリン、好ましくは、７−デアザプリンであ
る。
【００４７】好ましいモノヌクレオシド三リン酸は、式
Ｉa：
【化２】 [式中、Ｘは、水素またはＯＲ1−基であり、Ｒ1は、Ｃ1
〜Ｃ6アルキル基、Ｃ1〜Ｃ6アルキレン基または水素で
あり、Ｂは、プリン、デアザプリンまたはピリミジン基
であり、Ａは、スペーサー基であり、Ｋは、エレクトロ
ケミルミネセンス性配位錯体である]で示される化合物
またはそのアルカリおよびアルカリ土類塩である。
【００４８】驚くべきことに、実験によって、前記金属
錯体と同じくらい大きな基でさえ、核酸におけるモノヌ
クレオシド三リン酸の取込みを触媒する酵素による標識
化されたモノヌクレオシド三リン酸の取込みを実質的に
妨害しないことが判明した。取り込まれた標識モノヌク
レオシド三リン酸の量は、エレクトロケミルミネセンス
による標識化された核酸の検出のために充分である。本
発明の方法は、エレクトロケミルミネセンスを使用する
従来技術方法と比較して非常に高度の感度を示す。
【００４９】特に驚くべきことに、非常に高い動的測定
範囲、すなわち、モノヌクレオシド三リン酸の所定濃度
で測定されるべき核酸の最少の定量可能な量に対する最
大の定量可能な量の比を示す。この比は、１０7の値を
超えることもある。
【００５０】別の方法で、モノヌクレオシド三リン酸を
取り込むことができる。
【００５１】１つの方法は、検出されるべき核酸にハイ
ブリダイズされるオリゴヌクレオチド、いわゆるプライ
マーの伸長である。ポリメラーゼ、好ましくは、ＤＮＡ
−ポリメラーゼによって触媒される反応で、核酸のセグ
メントをプライマーの３'−末端に結合させる。このセ
グメントは、対応する検出されるべき核酸のセグメント
と実質的に相補的である。この反応は、存在する核酸の
セグメントを増幅させつつ、形成された伸長生成物を使
用して循環的に行うことができる。かかる方法は、ＥＰ
−Ａ−０ ２０１ １８４に開示されている。
【００５２】別の可能性は、複製起源またはプロモータ
ーを含有する核酸の複製または転写である。この場合、
核酸は、プライマー伸長なしでモノヌクレオチドだけか
らなる。実施例は、ＷＯ ９１／０３５７３またはＷＯ
９１／０２８１８から公知である。
【００５３】取込みの間に、モノヌクレオチドの少なく
とも１つのタイプ((d)ＡＴＰ、(d)ＣＴＰ、(d)ＧＴＰ、
またはdＴＴＰ／(d)ＵＴＰ)は、反応混合物中で、部分
的に、または、完全に、エレクトロケミルミネセンス性
モノヌクレオシド三リン酸によって置き換えられる。好
ましい方法では、モノヌクレオシド三リン酸の１つのタ
イプ(例えば、dＵＴＰ)の１０〜５０％が標識アナログ
(例えば、ルテニウム錯体標識dＵＴＰ)によって置き換
えられる。標識モノヌクレオシド三リン酸の好ましい濃
度は、２０〜７０μＭの範囲であり、特に好ましくは、
２５〜４０μＭの範囲である。取込み反応の全ての他の
条件は、前記文献に開示されているものと実質的に異な
らない。
【００５４】それらの構造に依存して、エレクトロケミ
ルミネセンス標識モノヌクレオシド三リン酸は、種々の
方法で生成されうる。
【００５５】基を核塩基に結合させるべきである場合、
天然塩基のアミノ基を、求電子基、例えば、スペーサー
基の活性エステル基と反応させうる。
【００５６】これらのモノヌクレオシド三リン酸と、ア
ミノ基を有するスペーサー基を塩基の一原子ですでに有
している反応性エレクトロケミルミネセンス性化合物と
の反応が、特に好都合であることが証明された。例とし
ては、５位においてアルキルアミノ基で置換されたモノ
ヌクレオシド三リン酸が含有されることが挙げられる
[プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ(Ｐroc.Ｎat
l.Ａcad.Ｓci.,ＵＳＡ)、７８、６６３３−３７(１９９
１)]。
【００５７】反応性基を有するエレクトロケミルミネセ
ンス性化合物は、例えば、イゲン・カンパニー(ＩＧＥ
Ｎ company)から購入することができる。アミドは、活
性エステルおよびアミンからアミドを慣用的に形成する
ことに適用される条件と同様の条件下で形成される。
【００５８】以下に、添付図面について説明する。「図
１」は、増幅のためにＰＣＲを使用する本発明の検出方
法を示す流れ図である。「図２」は、増幅のためにＮＡＳ
ＢＡを使用する本発明の検出方法を示す流れ図である。
「図３」は、プローブを用いないＰＣＲ(黒い棒)と比較し
て、本発明のＨpbadw２１−ＤＮＡ測定(プローブを用い
るＰＣＲ)の結果を示すグラフである。「図４」は、ＮＡ
ＳＢＡ(プローブを用いる：黒い棒)を使用するリステリ
ア(Ｌisteria)測定のための同様のグラフである。「図
５」は、ＮＡＳＢＡを用いる捕獲プローブの存在におけ
るエレクトロケミルミネセンス性標識を使用するＨＩＶ
Ｉ測定の結果を示す。「図６」は、ジゴキシゲニン標識
モノヌクレオシドが転写物に取り込まれるＮＡＳＢＡを
使用する核酸の増幅および検出のための反応スキームを
示す流れ図である。「図７」は、Ｒu(bpyr)3−ＡＡ−dＵ
ＴＰの構造を示す。「図８」は、Ｒu(bpyr)3−ＤＡＤＯＯ
−dＵＴＰの構造を示す。「図９」の(ａ)および(ｂ)は、
標識核酸の分子量の差異を示すアガロースゲルの図面代
用写真である。「図１０」は、ゲルにおけるビオチン標識
プローブとのハイブリダゼーションによって取り込まれ
た種々の量の(bpyr)3−ＡＡ−dＵＴＰまたはＲu(bpyr)3
−ＤＡＤＯＯ−dＵＴＰを用いた増幅生成物の検出を示
す図面代用写真である。「図１１」は、反応において使用
されるルテニウム標識モノヌクレオシドの量に対するシ
グナルの高さの依存性を示すグラフである。「図１２」
は、ルテニウム標識が取り込まれた場合の核酸の量依存
性検出を示す別のグラフである。「図１３」は、本発明の
別の具体例と比較するグラフである。縦縞の棒は、第２
容器が捕獲プローブを特異的に結合するのに使用される
具体例についての値を示しており、横縞の棒は、増幅お
よび壁結合が単一の容器中で行われる例の値を示す。点
を付した棒は、酵素反応の間に発生した溶液の色を検出
するために反応混合物を検出容器に移した具体例に関す
る値を示す。
【００５９】以下の実施例において、本発明をさらに詳
細に説明する。
【００６０】
【実施例】
実施例１ 捕獲プローブの直接および次なる使用を用いるＨＢＶの
検出 反応混合物あたり１ng〜１００atgの濃度のＨpbadw２１
をポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)(ＥＰ−Ａ−０ ２００
３６２)についての標的として使用した。ＰＣＲ混合物
についての容量は１００μlであった。混合物は、以下
の成分からなっていた：
【００６１】
【表１】
【００６２】１０ Ｘ ＰＣＲバッファー：１００mＭ ト
リス(Ｔris)／ＨＣl、５００mＭ ＫＣl、１５mＭ ＭgＣ
l2、１mg／mlゼラチン、pＨ９.０。 プライマー１：オリゴデオキシヌクレオチド、１８me
r、d(GGAGTGTGGATTCGCACT)(位置２２６７−２２８４；
ＥＭＢＬ、サブタイプadw、配列番号１)。 プライマー２：オリゴデオキシヌクレオチド、１８me
r、d(TGAGATCTTCTGCGACGC)(位置２４３６ｃ−２４１９
ｃ、ＥＭＢＬ、サブタイプadw、配列番号２)。 Ｈpbadw２１：クローン化されたＨＢＶ−ＤＮＡ；pＵＣ
ＢＭ２０(ベーリンガー・マンハイム)においてクローン
化され、直線化されたＨＢＶadw−配列のヌクレオチド
２９−２６０６(ＥＭＢＬ)。 ビオチニル化された捕獲プローブ：d(AGCCTATAGACCACCA
AATGCCCCTAT)５'−ビオチニル化(配列番号３)位置２２
９０−２３１６；ＥＭＢＬ、サブタイプadw、 参考文献：オノ(Ｏno)ら、(１９８３)、ニュークリイッ
ク・アシッズ・リサーチ(Ｎucl.Ａcids Ｒes.)１１。
【００６３】以下のサイクル条件下で、パーキン・エル
マー・サーマル・サイクラー(Ｐerkin Ｅlmer Ｔhermal
Ｃycler)でＰＣＲ混合物を増幅させる：９３℃で３分
間；(９４℃で１分間、５０℃で１分間、７０℃で２分
間)×３０；９５℃で５分間、３７℃で５分間。
【００６４】ビオチン標識プローブは、反応混合物あた
り１００ngの濃度であった。ＰＣＲの間に、Ｂio−１６
−ddＵＴＰ(ベーリンガー・マンハイム、Ｃat.Ｎo.１４
２７,５９８)を用いて、プローブをその３'−末端でブ
ロックした(参考文献：シュミッツ,ゲー・ゲー(Ｓchmit
z,Ｇ.Ｇ.)ら、(１９９０)アナリティカル・バイオケミ
ストリー(Ａnal.Ｂiochem.)１９２、２２２)。
【００６５】検出のためにストレプトアビジン被覆微量
滴定プレートを使用した(ベーリンガー・マンハイム・
ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツン
グ、ＥＰ−Ａ−０ ２６９ ０９２)。
【００６６】１．プローブを用いないＰＣＲに次ぐハイ
ブリダイゼーションの検出 増幅工程の後に、ＰＣＲ混合物２０μlにビオチン標識
捕獲プローブ４０ngを添加した。この混合物を９５℃ま
で５分間加熱し、次いで、氷上で冷却し、３７℃で１５
分間インキュベートした。次いで、ハイブリダイゼーシ
ョンバッファー(５０mＭリン酸塩バッファー、７５０m
Ｍ ＮaＣl、７５mＭ クエン酸ナトリウム、０.０５％Ｂ
ＳＡ、pＨ６.８)１８０μlを添加し；次いで、この混合
物をストレプトアビジン被覆(ＳＡ)微量滴定プレートの
ウエル中にピペットで移し、３７℃で１時間インキュベ
ートした。該混合物を０.９％ＮaＣlで３回洗浄した
後、０.２Ｕ／ml抗ジゴキシゲニン−ＰＯＤ(ベーリンガ
ー・マンハイム)を有するコンジュゲートバッファー(１
００mＭ トリスｘＨＣｌ、０.９％ＮaＣl、１％ＢＳ
Ａ、pＨ７.５)２００μlをピペット操作によって添加
し、３７℃で２０分間インキュベートした。再度３回洗
浄した後、検出のためにＡＢＴＳR(１.９mmol／l)２０
０μlを使用し、吸光度をＨg４０５nmで測定した。
【００６７】２．ＰＣＲの間に直接使用されるプローブ
を用いるＰＣＲの検出(本発明によって提案された) 捕獲プローブ１００ngの存在下で増幅を行った。増幅
後、ＰＣＲ反応混合物２０μlにハイブリダイゼーショ
ンバッファー１８０μlを直接添加し、前記１の記載に
従って処理した。結果を「図３」に示す。
【００６８】実施例２ プローブを直接使用する場合およびしない場合のプロモ
ーター制御増幅(ＮＡＳＢＡ) 使用するアナライトは、反応混合物あたり５０ng〜５fg
の濃度の単離した染色体リステリア(Ｌisteria)単核細
胞質遺伝子(monocytogene)ＤＮＡ(ＷＯ ９０／０８１９
７を参照)であった。ＮＡＳＢＡは、ＥＰ−Ａ−０ ３２
９ ８２２に開示されている。ＮＡＳＢＡは、Ｔ7−ＲＮ
Ａポリメラーゼプロモーター配列を使用して、二本鎖ア
ナライトＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変換させる反応の前に
行われる(ＰreＮＡＳＢＡ)。これは、通常、シークエナ
ーゼ(ＳequenaseR)を使用することによって行われる。
しかしながら、主に、ＤＮＡポリメラーゼが好適であ
る。
【００６９】
【表２】
【００７０】この混合物を９５℃まで５分間加熱し、次
いで、氷上で冷却した。１０mＭジチオトレイトール(Ｄ
ＴＴ)に調節し；次いで、１３ Ｕ Ｔ7−ＤＮＡポリメラ
ーゼ(シークエナーゼ(ＳequenaseR)、ユナイテッド・ス
テイツ・バイオケミカルズ(Ｕnited Ｓtates Ｂiochemi
cals)による)を添加した。次いで、該混合物を３７℃で
１５分間インキュベートし、再度、９５℃まで加熱し、
再度、氷上で冷却した。
【００７１】IIＡ ＮＡＳＢＡ増幅：反応工程１ ａ．反応混合物の組成 ＮＡＳＢＡについて使用した容量は、２５μlであった
(ＮＡＳＢＡ−Ｍix ２３μl ＋ ＰreＮＡＳＢＡ−Ｍix
２μl、実施例２のパートＩから)。
【００７２】
【表３】
【００７３】１０ ｘ ＮＡＳＢＡバッファー：４００n
Ｍ トリス／ＨＣl、５００mＭ ＫＣl、１２０mＭ ＭgＣ
l2、pＨ８.５。 プライマー３：
【化３】 配列番号４、ＰIII−領域(位置３５−５６)。下線部
は、Ｔ7−ＲＮＡ−ポリメラーゼプロモーター配列であ
る。 プライマー４：d(GTAATCATCCGAAACCGCTCA)、配列番号
５、ＰIII−領域(位置１９６ｃ−２１６ｃ)。
【００７４】ＮＡＳＢＡ増幅を、４０℃で１.５〜２時
間生じさせた。
【００７５】ｂ）ハイブリダイゼーション 増幅後、ＮＡＳＢＡ混合物にビオチニル化プローブ２０
０ngを添加し、９５℃まで５分間加熱し、次いで、氷上
で冷却した。次いで、該混合物を３７℃で３０分間イン
キュベートした。
【００７６】プローブ：d(CGTTTTACTTCTTGGACCG)、配列
番号６、５'−末端で、ビオチナマイト(biotinamite)
(アプライド・バイオシステムズ(Ａpplied Ｂiosystem
s))でビオチニル化した。ＰIII領域(位置１６２ｃ−１
８０ｃ)。
【００７７】ｃ．微量滴定プレートにおける検出 ハイブリダイゼーション混合物５μlにハイブリダイゼ
ーションバッファー(５０mＭリン酸塩バッファー、７５
０mＭ ＮaＣl、７５mＭ クエン酸ナトリウム、０.０５
％ＢＳＡ、pＨ６.８)１９５μlを添加した。次いで、該
混合物を微量滴定プレートのウエル中にピペットで移
し、３７℃でさらに１時間インキュベートした。０.９
％ＮaＣl溶液で３回洗浄した後、３７℃で２０分間、コ
ンジュゲートバッファー(１００mＭトリス−ＨＣl、０.
９ ＮaＣl、１％ＢＳＡ、pＨ７.５)中、０.２Ｕ／ml抗
−ジゴキシゲニン−ＰＯＤ(ベーリンガー・マンハイム)
２００μlと一緒にインキュベートし続けた。該混合物
を再度３回洗浄し、次いで、ＡＢＴＳR(ベーリンガー・
マンハイム)(１.９mmol／l)２００μlを添加し、吸光度
をＨg４０５nmで測定した。
【００７８】IIＢ ＮＡＳＢＡ増幅：反応工程２ ａ．反応混合物の組成 ＮＡＳＢＡ反応混合物の組成は、IIＡで使用したものと
一致する。さらに、増幅の間に、捕獲プローブを混合物
あたり１４０ngの濃度で直接添加した。ＮＡＳＢＡ反応
の間に、捕獲プローブの直接使用のために、５'−末端
でビオチン標識化(アプライド・バイオシステムズ・イ
ンコーポレイテッド(ＡppliedＢiosystems Ｉnc.)によ
るビオチンアミド)し、３'−末端で親水性リンカーでブ
ロックした２'−Ｏ−アリルリボオリゴヌクレオチドを
使用した。２'−Ｏ−アリル修飾オリゴヌクレオチドの
「ＲＮＡ鎖」は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド中でＲＮＡ
seＨによって分解されない(参考文献：イノウエ,エイチ
(Ｉnoue,Ｈ.)ら(１９８７)ＦＥＢＳ Ｌett.２１５、３
２７−３３０)ので、これを捕獲プローブとして使用し
た。該オリゴヌクレオチドの３'−末端をブロックし
て、ポリメラーゼ反応の間に非特異的な伸長を回避す
る。
【００７９】配列：５'−ビオチン−CGU UUU ACU UCU U
GG ACC−G−３'−ブロック(配列番号７) C＝２'−Ｏ−アリルシチジン G＝２'−Ｏ−アリルグアノシン A＝２'−Ｏ−アリルアデノシン U＝２'＝Ｏ＝アリルウリジン ３'−ブロック：
【化４】
【００８０】ファルマシア(Ｐharmacia)によるオリゴヌ
クレオチド合成器(ジーン・アセンブラー(Ｇene Ａssem
bler))を使用して、イリバレン(Ｉribarren)ら(参考文
献：イリバレン,エイ・エム(Ｉribarren,Ａ.Ｍ.)ら(１
９９０)ＰＮＡＳ８７、７７４７−７７５１)によるプロ
トコールに従って、ベーリンガー・マンハイム・バイオ
ケミカルズ(Ｂoehringer Ｍannheim Ｂiochemicals)に
よる２'−Ｏ−アリルヌクレオシドホスホラスアミダイ
トを用いて、この捕獲プローブを合成した。
【００８１】ｂ）ハイブリダイゼーション 適用しない。
【００８２】ｃ）ＭＴＰ検出 この方法は、ＮＡＳＢＡ混合物５mlを用いてＩcのため
に使用した方法と同一であった。結果を「図４」に示す。
【００８３】実施例３ ＮＡＳＢＡを使用するＨＩＶ−１の検出 以下の実施例では、ＮＡＳＢＡ増幅系(ＥＰ−Ａ−０ ３
２９ ８２２)の助けによってＨＩＶ−１を検出した。ビ
オチン標識捕獲プローブの存在下でＮＡＳＢＡを行っ
た。取り込まれた標識(ルテニウム標識ＵＴＰ)を介し
て、増幅生成物を直接検出した。
【００８４】この試験は、ＡＩＤＳまたはＡＲＣ(ＡＩ
ＤＳ症候群)に罹っている患者のＨＩＶ陽性血清を網羅
した。マニアティス(Ｍaniatis)ら[モレキュラー・クロ
ーニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Ｍolecular
Ｃloning: Ａ laboratory manual)(コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリーズ(Ｃold Ｓpring Ｈarbor
Ｌab.)、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバ
ー、１９４−１９５、１９８２)]に従って、グアニジナ
ム・ホット・フェノール法(Ｇuanidinum ＨotＰhenol
Ｍethod)の後に、ＲＮＡを単離し、ＲＮＡ溶液のアリコ
ット１０μlを−７０℃で貯蔵した。ＮＡＳＢＡ反応の
前に、ＲＮＡ溶液を１：１０、１：１００、１：１００
０、１：１００００に希釈し、ＮＡＳＢＡ反応に各２μ
lを使用した。
【００８５】ＮＡＳＢＡ反応および反応混合物の組成に
ついては、実施例２ IIｂに言及されており、digＵＴＰ
の代わりに３０μＭルテニウム標識ＵＴＰ(＝Ｒu(bpyr)
3−ＡＡ−ＵＴＰ)を使用した(合成の詳細については、
実施例４を参照)。
【００８６】使用したプライマーおよびプローブ： ＯＴ１８８：
【化５】 Ｐ１(配列番号８) ＯＴ４２： ACAGGAGCAGATGATACAGTATTAG Ｐ２(配列番号９) ＯＴ１５： ５'−Ｂio−UGGAAGAAAUCUGUUGACUCAGAUUGG
UUGC−ブロック−３' 試料(配列番号１０)
【００８７】配列ＯＴ１８８の下線部は、Ｔ7−ＲＮＡ
−ポリメラーゼプロモーターと一致する。
【００８８】オリゴヌクレオチドＯＴ１５は、その３'
−末端で２'−Ｏ−アリルリボオリゴヌクレオチドに対
してブロックされ(実施例２ IIＢを参照)、その５'−末
端でビオチニル化されている。 参考文献：キエヴィッツ,ティ(Ｋievits,Ｔ.)ら(１９９
１)、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・メソッズ
(Ｊ.of Ｖiol.Ｍethods)２７３−２８６。
【００８９】増幅生成物の検出 反応後、ＮＡＳＢＡ反応混合物５μlにリン酸塩バッフ
ァー(６２mＭ リン酸ナトリウム、０.９４Ｍ ＮaＣl、
９４mＭ クエン酸ナトリウム、pＨ７)２０μl中の磁気
ビーズ(ダイナビーズ(ＤynabeadsR) Ｍ−２８０、スト
レプトアビジン、ダイナル(Ｄynal))１０μg(２×１０6
ビーズ)を添加し、３７℃で３０分間インキュベートし
た。次いで、磁石を使用して試料カップの底にビーズを
集めた。毎回リン酸塩バッファー１００μlを用いて２
回洗浄した。次いで、ビーズを該リン酸バッファー１０
０μlに懸濁させ、ＥＣＬアッセイバッファー(０.２Ｍ
ＫＨ2ＰＯ4、０.０５Ｍ ＮaＣl、０.１Ｍトリプロピル
アミン、pＨ７.５；参考文献：ジェイ・ケイ・リランド
(Ｊ.Ｋ.Ｌeland)ら(１９９０)、ジャーナル・オブ・エ
レクトロケミカル・ソサイエティ(Ｊ.Ｅlectrochem.Ｓo
c.)、１３７：３１２７−３３)２５０μlを添加した。
９４０Ｖの光電子増倍管電圧を用いてＥＣＬアナライザ
ー(オリゲン(Ｏrigen)１.０；イゲン・インコーポレイ
テッド(Ｉgen Ｉnc.)によって製造された)で測定を行っ
た。測定時間は、２Ｖ／秒のランプで２秒間であった。
各試料についての全測定サイクルは、２分であった。結
果を「図５」に示す。
【００９０】実施例４ Ｒu(bpyr)3-ＡＡ−ＵＴＰの合成 オリゲン(ＯrigenR)標識(イゲン・インコーポレイテッ
ド)＝[４−(Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニルプ
ロピル)−４'−メチル−２,２'−ビピリジン−ビス(２,
２'−ビピリジン)]−ルテニウム(II)−ジヘキサフルオ
ロホスファートＡＡ−ＵＴＰ＝５−(３−アミノアリル)
−ウリジン三リン酸は、ランガー(Ｌanger)ら[プロシー
ディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシズ・ユー・エス・エイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓc
i.,ＵＳＡ)、７８、６６３３−３７、１９８１]に従っ
て製造した。 ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
【００９１】ＡＡ−ＵＴＰ(リチウム塩)５.５mg(０.０
１mmol)を０.１Ｍホウ酸ナトリウムバッファー(pＨ８.
５)２mlに溶解させた。これは、ＤＭＳＯ １.５mlにオ
リゲン(ＯrigenR)標識１５.８mg(０.０１５mmol)の溶液
を添加し、室温で一晩撹拌して行った。次いで、イオン
交換クロマトグラフィー(セファデックス(Ｓephadex)Ｄ
ＥＡ、Ｃl型；勾配液：０〜０.４Ｍ ＬiＣl)によって、
Ｒu(bpyr)3−ＡＡ−ＵＴＰ生成物を精製した。収量：７
mg(理論値の４６％)。
【００９２】実施例５ Ｒu(bpyr)3−ＡＡ−dＵＴＰおよびＲu(bpyr)3−ＤＡＤ
ＯＯ−dＵＴＰの合成 ランガー(Ｌanger)ら(１９８１)プロシーディングズ・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・
ユー・エス・エイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,ＵＳＡ)、
７８：６６３３−３７に従って、５−(３−アミノアリ
ル)−dＵＴＰ(＝ＡＡdＵＴＰ)を製造した；５−水銀−d
ＵＴＰをＮ−アリル−Ｎ'−(８−アミノ−３,５−ジオ
キサ−オクチル)尿素と反応させることによって、ＤＡ
ＤＯＯ−dＵＴＰを得た。
【００９３】Ｒu(bpyr)3−ＡＡ−dＵＴＰ(「図７」)の合
成 ０.１Ｍホウ酸ナトリウムバッファーにＡＡdＵＴＰ ３.
２mgを溶解させ、オリゲン(ＯrigenR)標識５.６mgのＤ
ＭＳＯ ５６０μl中溶液と一緒にＲＴで一晩撹拌した。
該反応をＴＬＣおよびペーパー電気泳動を介して制御
し、次いで、イオン交換クロマトグラフィーによって、
生成物を精製した。 収量：３.８mg(理論値の４８％)。 [Ｍ＋Ｈ]+：１１８０.１
【００９４】Ｒu(bpyr)3−ＤＡＤＯＯ−ｄＵＴＰ(「図
８」)の合成 ａ．Ｎ−アリル−Ｎ'−(８−アミノ−３,５−ジオキサ
オクチル)尿素の合成 ジアミノジオキサオクタン(メルク(Ｍerck))１５g(０.
１mol)をジイソプロピルエーテル５００ml中で−４０℃
に冷却した。アリルイソシアナート(フルカ(Ｆluka))
５.５g(０.０６mol)をゆっくりと滴下した。−４０℃で
３０分間撹拌した後、該混合物をＲＴにし、蒸留によっ
てジイソプロピルエーテルを除去した。残留物を酢酸エ
ステル６００mlと一緒に１時間撹拌し、沈殿物を濾過に
よって取り出し、酢酸エステルで３回洗浄した。合わせ
た酢酸エステルフラクションを濃縮し、得られた生成物
を、９：１〜８：２の酢酸エステル／メタノール溶媒勾
配液を用いてフラッシュクロマトグラフィーに付して精
製した。 収量：４.５g(理論値の２９％)、無色の液体。
【００９５】ｂ．５−水銀−dＵＴＰとの反応 ベルグストローム(Ｂergstrom)ら(１９７７)、Ｊ.Ｃarb
ohydr.Ｎucleosides,Ｎucleotides、４：２５７に従っ
て、５−水銀−dＵＴＰ(＝ＨgdＵＴＰ)を製造した。酢
酸ナトリウムバッファー(pＨ５)２０mlにＨgdＵＴＰ ３
７０mg(０.５４mmol)およびＫ2ＰdＣl4 １１３mgを溶解
させた。次いで、Ｎ−アリル−Ｎ'−(８−アミノ−３,
５−ジオキサオクチル)尿素０.５g(２.１６mmol)を滴下
し、ＲＴで一晩撹拌した。濾過によって沈殿物を除去
し、濾液を濃縮し、０〜０.３Ｍ ＬiＣlのバッファー勾
配液を用いてイオン交換クロマトグラフィー(ＤＥＡＥ
−セファデックス−ＣＬ−型)によって精製した。次い
で、生成物をアセトン／エタノール(２：１)から２回沈
殿させ、該沈殿物を濾過によって取り出し、洗浄し、次
いで、乾燥させた。ＤＡＤＯＯ−dＵＴＰ ６０mg(理論
値の１５.７％)を得た。
【００９６】ｃ．ＤＡＤＯＯ−dＵＴＰをオリゲン(Ｏri
genR)標識と反応させることによって、Ｒu(bpyr)3−Ａ
Ａ−dＵＴＰについての記載に従って、合成を行った。
【００９７】実施例６ ＰＣＲ増幅およびＲu(bpyr)3−ＡＡ−dＵＴＰおよびＲu
(bpyr)3−ＤＡＤＯＯ−dＵＴＰによるＨＢＶ−ＤＮＡの
標識 Ｈpbadw２１ １ngを増幅させた；ＰＣＲ反応混合物の容
量は、１００μlであった(ＰＣＲ Ｍix ８０μl、試料
２０μl)。
【００９８】ＰＣＲ Ｍixは、以下の組成を有した：
【００９９】
【表４】
【０１００】１０ ｘ ＰＣＲ−バッファー：１００mＭ
トリス／ＨＣl、５００mＭ ＫＣl、１５mＭ ＭgＣl2、
１００mg／mlゼラチン、pＨ９.０ プライマー１：オリゴデオキシヌクレオチド、１８me
r、 d(GGAGTGTGGATTCGCACT)配列番号１、 (位置２２６７−２２８４；ＥＭＢＬ、サブタイプadw) プライマー２：オリゴデオキシヌクレオチド、１８me
r、 d(TGAGATCTTCTGCGACGC)配列番号２、 (位置２４３６Ｃ−２４１９Ｃ；ＥＭＢＬ；サブタイプa
dw) Ｈpbadw２１： pＵＣ ＢＭ２０(ベーリンガー・マンハ
イム)中でクローン化され、直線化されたadw２１
【０１０１】９４℃で６０秒、５０℃で６０秒、および
７０℃で１２０秒を３０サイクル用いて、パーキン・エ
ルマー・サーマル・サイクラー(Ｐerkin Ｅlmer Ｔherm
alＣycler)において、ＰＣＲ反応混合物を増幅させた。
Ｒu(bpyr)3−ＡＡ−dＵＴＰおよびＲu(bpyr)3−ＤＡＤ
ＯＯ−dＵＴＰ濃度を、６６μＭ、３０μＭ、１０μ
Ｍ、１μＭおよび０.１μＭ〜０.０１μＭで変化させ、
増幅混合物中の合計Ｒu(bpyr)3−dＵＴＰ／dＴＴＰ濃度
２００μＭを有するようにdＴＴＰ濃度を増加させた。
【０１０２】比較するために、種々の濃度のジゴキシゲ
ニン−１１−dＵＴＰ(ベーリンガー・マンハイム、Ｃa
t.Ｎo.１０３９ ０８８)を取り込んだ同一のＰＣＲ反応
混合物を試験し、修飾ヌクレオチドを取り込んでいない
ＰＣＲ反応混合物も試験した。
【０１０３】
【表５】
【０１０４】
【表６】
【０１０５】
【表７】
【０１０６】１％アガロースゲル上に種々のＰＣＲ反応
混合物を各１０μl適用し、臭化エチジウムによって、
増幅生成物を肉眼で見ることができるようにした(「図
９」)。そのより高い分子量のために、取り込まれたＲu
(bpyr)3−ＤＡＤＯＯ−dＵＴＰ(＝長いスペーサー)を有
する増幅生成物は、ゲル上で、Ｒu(bpyr)3−ＡＡ−dＵ
ＴＰ生成物(＝短いスペーサー)よりも遅い。しかしなが
ら、これは、より高濃度の修飾ヌクレオチドが存在し、
かくして、増幅反応の間に、対応して多量の標識が取り
込まれる場合にだけ生じる。結果は、非修飾生成物と比
較して分子量が増加する。
【０１０７】実施例７ ビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブとのフィルタ
ーハイブリダイゼーション ビオチニル化捕獲プローブ：ビオチナミダイト(アプラ
イド・バイオシステムズ(Ａpplied Ｂiosystems))でビ
オチニル化されたd(AGA CCA CCA AAT GCC CCT AT)配列
番号１１は、ＨＢＶadw−配列の位置２２９７−２３１
６と一致する；ＥＭＢＬ配列データバンク。参考文献：
オノ(Ｏno)ら(１９８３)、ヌークリイック・アシッズ・
リサーチ(Ｎucl.Ａcids Ｒes.)、１１：１７４７−１７
５７。
【０１０８】１％アガロースゲル上に、ＰＣＲ反応混合
物１〜６、１／１〜６／１および１／３〜２／３ １０
μlを適用し、次いで、ナイロン膜上にブロットし、シ
ー・エイチ・ケスラー(ＣＨ.Ｋessler)ら(１９８０)「ノ
ン−レイディオオクティブ・ラベリング・アンド・ディ
テクション・オブ・ヌークリイック・アシッズ」(Ｎon-r
adioactive labelling and detection of nucleic acid
s)、Ｂio.Ｃhem.Ｈoppe−Ｓeyler、３７１：９１７−９
２７に従って、前記ビオチニル化オリゴヌクレオチドプ
ローブ１００ngと一緒に４５℃で一晩ハイブリダイズさ
せた。ストレプトアビジンおよびアルカリホスファター
ゼ(ベーリンガー・マンハイム、Ｃat.Ｎo.１０９３ ２
６６)、ＮＢＴ／Ｘ−ホスファート(ベーリンガー・マン
ハイム、Ｃat.Ｎo.１３８３ ２１３および７６０ ９８
６)からなるコンジュゲートを用いて、ビオチンを検出
した。「図１０」に示すとおり、所望の増幅生成物は、増
幅生成物に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブ
を使用するハイブリダイゼーションによって全てのＰＣ
Ｒ反応混合物において検出される。
【０１０９】実施例８ ハイブリダイゼーションおよび検出 ８.１ ２段アッセイ 混合物１、４および６ならびに１／１、４／１および６
／１ １０μlを０.０５Ｍ ＮaＯＨで１：１０に希釈し
た。５分後、この混合物１００μlを、既に濃度９４ng
／mlのビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブを含有
しているハイブリダイゼーションバッファー(６２.５m
Ｍリン酸ナトリウム、０.９４Ｍ ＮaＣl、94mＭクエン酸
ナトリウム、pＨ＝６.５)４００μlで中和した。同時
に、ＰＣＲ反応混合物１、４および６ならびに１／１、
４／１および６／１を１００℃まで加熱し、次いで、氷
上で冷却することによって熱変性に付した。３７℃で１
時間、ハイブリダイズさせた後、ストレプトアビジン被
覆磁気粒子(ダイナビーズ(ＤynabeadsR)Ｍ−２８０、ス
トレプトアビジン、ダイナル(Ｄynal))のハイブリダイ
ゼーションバッファー(濃度６００μg／ml)中懸濁液５
０μlを添加し、３７℃でさらに１時間インキュベート
した。次いで、磁石を用いて、磁気ビーズを試料カップ
の底に集め、上澄み液をデカントし、ビーズを、再度、
毎回リン酸塩バッファー(５０mＭリン酸ナトリウムバッ
ファー、pＨ７.４)５００μlで２回洗浄した。最後に、
ビーズをリン酸塩バッファー２００μl中に懸濁させ、
次いで、ＥＣＬアッセイバッファー５００μlを添加し
(ブラックバーン(Ｂlackburn)ら(１９９１)、Ｃlin.Ｃh
em.３７：１５３４−１５３９を参照)、次いで、ＥＣＬ
アナライザー(オリゲン(ＯrigenR)１.０、イゲン(ＩＧ
ＥＮ)、アメリカ合衆国ロックヴィル)上で測定した。
【０１１０】９４０Ｖの光電子増倍管電圧で測定を行っ
た。測定時間は、２Ｖ／秒のランプ圧で２秒であった。
各試料についての完全な測定サイクルは、２分であっ
た。
【０１１１】８.２ １段アッセイ この第２の、より簡単なアッセイ法では、ＰＣＲ反応混
合物の変性およびビオチニル化捕獲プローブとのハイブ
リダイゼーションは、２段階アッセイについて前記した
とおり行った。３７℃で２時間のハイブリダイゼーショ
ン後、この溶液中にさらなる磁気ビーズ５０μlをピペ
ットで移し、次いで、「結合／遊離」の分離なしでＥＣＬ
アナライザーで直接測定した。測定したブランクは、ハ
イブリダイゼーションブッファー中のＲu(bpyr)3−ＡＡ
−dＵＴＰの対応する濃度であった。光電子倍増管の電
圧は、８００Ｖであり、他のすべての測定条件は、前記
条件と同じであった。「図１１」に、増幅混合物中の種々
の濃度のＲu(bpyr)3−ＡＡ−dＵＴＰおよびＲu(bpyr)3
−ＤＡＤＯＯ−dＵＴＰに依存して測定されたＥＬＣピ
ーク度を示す。
【０１１２】実施例９ ＨＢＶプラスミド−ＤＮＡの検出 標的は、Ｈpbadw ２１に対してであった。以下の濃度：
１ng、１pg、１００fg、１fg、２００agを用いた。ＰＣ
Ｒにおいて最終濃度１０μＭ Ｒu(bpyr)3−ＡＡ−dＵＴ
Ｐ／１９０μl dＴＴＰを使用した後、および３０μＭ
Ｒu(bpyr)3−ＡＡ−dＵＴＰ／１７０μl dＴＴＰを使用
した後、実施例２の条件に従って、増幅を行った。ビオ
チニル化捕獲プローブ(配列番号３)とハイブリダイズさ
せ、「結合／遊離」分離せずに「一段アッセイ」に従ってＳ
Ａ磁気ビーズに結合させた後、該増幅生成物をオリゲン
(ＯrigenR)１.０アナライザーで測定した。使用した光
電子倍増管電圧は、９００Ｖであり、他のすべての条件
は、４.２項に記載した条件と同じであった。「図１２」
に、種々の標的濃度に依存して測定されたＥＬＣピーク
度を示す。
【０１１３】実施例１０ 熱安定性ＳＡで被覆した微量滴定プレートにおけるthre
ＰＣＲの間に間接的にプローブを使用するＨＢＶの検出 実施例１の記載に従って、ＰＣＲ混合物を調製した。し
かしながら、混合物の体積を５０μlに減少させ、シグ
マ(Ｓigma)鉱油(シグマ・ミネラル・オイル(Ｓigma Ｍi
neral Ｏil)、淡白色油Ｍ−３５１６)３０μlで覆っ
た。プライマー、ビオチニル化捕獲プローブIIおよび鋳
型ならびに使用濃度は、同一であった。当該工程を開始
する前に、熱安定性ストレプトアビジン(ＳＡ)で被覆し
たテクネプレート(Ｔechne plate)(Ｃat.Ｎo.１４０８
００)においてＰＣＲを行った。増幅のために、ＭＷ−
２ Ｔechne−Ｃyclerを使用した。サイクル条件は、実
施例１において使用した条件と同一であった。ＰＣＲ
後、該混合物を３７℃で３０分間放置した。次いで、３
回洗浄し(実施例1を参照)、プレートを、各ウエルにつ
いてコンジュゲートバッファー(実施例１を参照)１００
μlと一緒にインキュベートした。次いで、３回洗浄
し、次に、ＡＢＴＳR溶液(実施例１を参照)１００mlと
反応させた。測定した吸光度を「図１３」に示す。右側
(ＳＡ−ＭＴＰ ＰＣＲ)の棒は、種々の濃度についての
吸光度を示す。
【０１１４】実施例１１ 熱安定性ＳＡで被覆した微量滴定プレートにおけるthre
ＰＣＲの間に間接的にプローブを使用するＨＢＶの検出 ＰＣＲ Ｃycler９６００について使用した容器は、０.
５ml容のパーキン・エルマー(Ｐerkin Ｅlmer)カップ
(Ｃat.Ｎo.：Ｎ８０１.０５３７)であった。ＥＰ−Ｂ−
０ ３３１ １２７に従って、カップの内側を熱安定性ス
トレプトアビジンで被覆した。実施例１０と同様に、反
応混合物を調製した。しかしながら、反応混合物の容量
は、１００μlであり、ＰＣＲは、油で覆わなかった。
該カップにコンジュゲートバッファーおよびＡＢＴＳR
を２００μl／カップ添加した。ＡＢＴＳRと一緒に１５
分間インキュベートした後、該混合物をヌンクプレート
(Ｎunc plate)(Ｃat.Ｎo.：８３８７１３)中に移し、測
定器で測定した。測定した吸光度を「図１３」に示す(中
央の棒)。
【０１１５】実施例１２ 熱安定性ストレプトアビジンでのテクネプレートおよび
ＥＰ−カップの被覆ＥＰ−Ｂ−０ ３３１ １２７に従っ
て被覆を行った。
【０１１６】
【発明の効果】本発明の核酸固定化方法を使用すると、
簡単で有効な固定化を行うことができた。
【０１１７】
【配列表】
【０１１８】配列番号：１ 配列の長さ：１８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GGAGTGTGGA TTCGCACT 18
【０１１９】配列番号：２ 配列の長さ：１８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 TGAGATCTTC TGCGACGC 18
【０１２０】配列番号：３ 配列の長さ：２７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ＡＧＣＣＴＡＴＡＧＡ ＣＣＡＣＣＡＡＡＴＧ ＣＣＣＣＴＡＴ
２７
【０１２１】配列番号：４ 配列の長さ：５２塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡ ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ ＴＡＧＧＧＡＧＡＣＧ ＣＧＣ
ＴＴＴＡＣＣＴ ＧＣＴＴＣＧＧＣＧＡ ＴＴ ５２
【０１２２】配列番号：５ 配列の長さ：２１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GTAATCATCC GAAACCGCTC A 21
【０１２３】配列番号：６ 配列の長さ：１９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 CGTTTTACTT CTTGGACCG 19
【０１２４】配列番号：７ 配列の長さ：１９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 CGUUUUACUU CUUGGACCG 19
【０１２５】配列番号：８ 配列の長さ：４７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGCCTGG CTTTAATTTT ACTGGTA 47
【０１２６】配列番号：９ 配列の長さ：２５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ACAGGAGCAG ATGATACAGT ATTAG 25
【０１２７】配列番号：１０ 配列の長さ：３１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 UGGAAGAAAU CUGUUGACUC AGAUUGGUUG C 31
【０１２８】配列番号：１１ 配列の長さ：２０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 AGACCACCAA ATGCCCCTAT 20
【図面の簡単な説明】
【図１】 増幅のためにＰＣＲを使用する本発明の検出
方法を示す流れ図。
【図２】 増幅のためにＮＡＳＢＡを使用する本発明の
検出方法を示す流れ図。
【図３】 プローブを用いないＰＣＲ(黒い棒)と比較し
て本発明のＨｐｂａｄｗ２１−ＤＮＡ測定(プローブを
用いるＰＣＲ)の結果を示すグラフ。
【図４】 ＮＡＳＢＡ(プローブを用いる：黒い棒)を使
用するリステリア(Ｌisteria)測定の結果を示すグラ
フ。
【図５】 ＮＡＳＢＡを用いる捕獲プローブの存在にお
けるエレクトロケミルミネセンス標識を使用するＨＩＶ
Ｉ測定の結果を示すグラフ。
【図６】 ジゴキシゲニン標識モノヌクレオシドが転写
物に取り込まれるＮＡＳＢＡを使用する核酸の増幅およ
び検出のための反応スキームを示す流れ図。
【図７】 Ｒu(ｂｐｙｒ)3−ＡＡ−ｄＵＴＰの構造式を
示す図。
【図８】 Ｒu(ｂｐｙｒ)3−ＤＡＤＯＯ−ｄＵＴＰの構
造式を示す図。
【図９】 (ａ)および(ｂ)は、標識核酸の分子量の差異
を示すアガロースゲルの図面代用写真。
【図１０】 ゲルにおけるビオチン標識プローブとのハ
イブリダゼーションによって取り込まれた種々の量の
(ｂｐｙｒ)3−ＡＡ−ｄＵＴＰまたはＲu(ｂｐｙｒ)3−
ＤＡＤＯＯ−ｄＵＴＰを用いた増幅生成物の検出を示す
図面代用写真。
【図１１】 反応において使用されるルテニウム標識モ
ノヌクレオシドの量に対するシグナルの高さの依存性を
示すグラフ。
【図１２】 ルテニウム標識が取り込まれた場合の核酸
の量依存性検出を示すグラフ。
【図１３】 本発明の別の具体例と比較するグラフ。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年１０月１４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正内容】
【図９】 (ａ)および(ｂ)は、標識核酸の分子量の差異
を示すためのアガロースゲルを用いたクロマトグラムの
図面代用写真。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１０】 ゲルにおけるビオチン標識プローブとのハ
イブリダゼーションによって取り込まれた種々の量の
(ｂｐｙｒ)3−ＡＡ−ｄＵＴＰまたはＲu(ｂｐｙｒ)3−
ＤＡＤＯＯ−ｄＵＴＰを用いた増幅生成物の検出のため
のクロマトグラムの図面代用写真。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 コルネリア・クルーゼ−ミュラー ドイツ連邦共和国デー−26188エーデヴェ ヒト、オルデンブルガー・シュトラーセ３ 番 (72)発明者 ジビレ・ベルナー ドイツ連邦共和国デー−82319シュタルン ベルク、レッテンベルガー・ヴェーク21番 (72)発明者 コルティナ・カレッタ ドイツ連邦共和国デー−81379ミュンヘン、 ゼーハウザー・シュトラーセ14番

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 核酸を捕獲プローブとハイブリダイズさ
    せることによる核酸固定化方法であって、捕獲プローブ
    が形成されたハイブリッドの酵素的伸長および／または
    酵素的分解に対して保護されることを特徴とする核酸固
    定化方法。
  2. 【請求項２】 捕獲プローブの３'末端が伸長に対して
    保護される請求項１記載の固定化方法。
  3. 【請求項３】 検出可能な標識が電場を加えることによ
    って励起されうる基である請求項２記載の検出方法。
  4. 【請求項４】 捕獲プローブとのハイブリダイゼーショ
    ンによって核酸を固定化させ、固定化されたハイブリッ
    ドを検出することによる核酸の検出方法であって、捕獲
    プローブが酵素的伸長および／または酵素的分解に対し
    て保護されることを特徴とする核酸の検出方法。
  5. 【請求項５】 合成の間に、コピーが検出可能に標識さ
    れる請求項４記載の検出方法。
  6. 【請求項６】 検出可能な標識が検出可能に標識された
    モノヌクレオシド三リン酸を介して取り込まれる請求項
    ５記載の検出方法。
  7. 【請求項７】 核酸またはその一部の１個または数個の
    検出可能に標識されたコピーを形成し、捕獲プローブと
    のハイブリダイゼーションによって該コピーを固定化さ
    せ、固定化されたハイブリッドを検出ことによる核酸の
    検出方法であって、捕獲プローブが酵素的伸長および／
    または酵素的分解に対して保護されることを特徴とする
    核酸の検出方法。
  8. 【請求項８】 捕獲プローブがコピーの合成の間にすで
    に存在する請求項７記載の検出方法。
  9. 【請求項９】 検出プローブがコピーの合成の間にすで
    に存在する請求項８記載の検出方法。
  10. 【請求項１０】 合成の間にコピーが検出可能に標識さ
    れる請求項７記載の検出方法。
  11. 【請求項１１】 検出可能な標識が検出可能に標識され
    たモノヌクレオシド三リン酸を介して取り込まれる請求
    項１０記載の検出方法。
  12. 【請求項１２】 核酸を伸長させるための酵素を含有す
    る容器Ａおよび捕獲プローブを含有する容器Ｂからなる
    核酸増幅および固定化用試薬キットであって、捕獲プロ
    ーブが酵素的伸長および／または酵素的分解に対して保
    護されることを特徴とする核酸増幅および固定化用試薬
    キット。
  13. 【請求項１３】 請求項１２記載の試薬キットおよび検
    出可能な検出プローブまたは検出可能に標識されたモノ
    ヌクレオシド三リン酸からなることを特徴とする核酸検
    出用試薬キット。
  14. 【請求項１４】 相補的核酸に対する水素結合能を有す
    る核塩基の位置で、天然核塩基に関して修飾することが
    できないことを特徴とする、酵素的伸長および酵素的分
    解に対して保護された修飾核酸。
  15. 【請求項１５】 式Ｉ： Ｐ−Ｚ−Ｂ−Ｅ (Ｉ) [式中、 Ｐは、トリホスファート基またはトリホスファートアナ
    ログ基であり、 Ｚは、糖または糖アナログ基であり、 Ｂは、核塩基または核塩基アナログ基であり、 Ｅは、エレクトロケミルミネッセンス基である]で示さ
    れるモノヌクレオシド三リン酸。
  16. 【請求項１６】 構造式Ｉa： 【化１】 [式中、 Ｘは、水素またはＯＲ1基であり、 Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基、Ｃ1〜Ｃ6アルキレン基ま
    たは水素であり、 Ｂは、プリン、デアザプリンまたはピリミジン基であ
    り、 Ａは、スペーサー基であり、 Ｋは、エレクトロケミルミネッセンス性配位錯体であ
    る]で示される請求項１５記載のモノヌクレオシド三リ
    ン酸ならびにそのアルカリおよびアルカリ土類塩。
  17. 【請求項１７】 エレクトロケミルミネッセンス基が５
    ００g／molを超える原子量を有する金属イオンおよび１
    個または数個の有機リガンドの配位錯体である請求項１
    ５または１６記載のモノヌクレオシド三リン酸。
  18. 【請求項１８】 残基Ｅの分子量が５５０〜２０００g
    ／molの範囲である請求項１７記載のモノヌクレオシド
    三リン酸。
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