BE898664A

BE898664A - Procede de preparation du derive 5'-o-triphosphoryl-5-(3-allylaminobiotine) uridine et du derive 5'-o-triphosphoryl-2'-desoxy-5-(3-allylaminobiotine) uridine

Info

Publication number: BE898664A
Application number: BE0/212199A
Authority: BE
Original assignee: Wallone Region
Priority date: 1984-01-12
Filing date: 1984-01-12
Publication date: 1984-05-02

Abstract

Procédé de préparation du dérivé 5'-0-triphosphoryl-5-(3-allylaminobiotine) uridine et du dérivé 5'-0-triphosphoryl-2'-désoxy-5-(3-allylaminobiotine) uridine par la réaction d'un dérivé 5-mercurique de l'uridine triphosphate ou de la désoxyuridine triphosphate avec l'allylaminobiotine, composé mercurique obtenu par la réaction de la 5'-0-triphosphoryl 2'-désoxyuridine avec un composé mercurique choisi parmi, l'acétate, le chlorure, le nitrate, le perchlorate, l'acétamide et le trinitrométhane mercuriques. L'allyminobiotine s'obtient par la réaction de la N-hydroxysuccimidique de biotine avec l'allylamine.

Description


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  DEMANDE DE BREVET 
 EMI1.1 
 D'I J V E i4 T 1 0 N D'IMVFNTION 
POUR "Procédé de préparation du dérivé   5'-0-triphosphoryl-5- (3-allyl-   
 EMI1.2 
 ajrinobiotine) uridine et du dérivé 5'-0-triphosphoryl-2'-desoxy 5- (3-allylaminobiotine)   uridine."DEPOSEE PAR :    
Région wallonne, représentée par l'Exécutif Régional
Wallon, Boulevard de l'Emperaur, 11, 1000 BRUXELLES Cette invention a été réalisée à l'Université Libre de Bruxelles, Faculté des Sciences, Département de Biologie moléculaire, rue des Chevaux, 67, 1640   Rhode-Saint-Genèse,   Belgique, par Messieurs Alfredo Morais Cravador, Docteur en Sciences, Georges Huez, Chercheur Qualifié FNRS et Madame Marie-Jose ARIAS, Licenciée en Sciences Chimiques. 

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  Procédé de   préparation du dérive 5'-0-triphosphoryl-5-   (3-allylaminobiotine) uridine et du dérivé 5'-0-triphosphoryl - 2'-désoxy-5- (3-allylaminobiotine) uridine. 



  L'invention concerne un procédé de préparation du dérivé   5'-0-   triphosphoryl-5- (3-allylaminobiotine) uridine (en abréviation   Bio-UTP)   et du dérivé 5'-0-triphosphoryl-2'-désoxy-5-93-allyl-   aminobiotine)   uridine, (en abréviation   Bio-dl1I'P)   obtenus par un procédé de synthèse simplifié. 



  De tels dérivés de la biotine et de l'uridine triphosphate (UTP) ou de la désoxyuridine triphosphate (dUTP) sont représentés par la formule générale suivante. 
 EMI2.1 
 



  Avec R et   R'=   OH pour le dérivé de l'uridine et R = OH et R' pour le dérivé de la désoxyuridine. 



  De tels analogues de nucléotides, (Bio-UTP et Bio-dUTP) qui peuvent être utilisés notamment ccmne marqueurs par   incotporation dans   des polynucléotides, trouvent de nombreuses applications dans les recherches biomédicales et de recombinaison génétique. 



  Le procédé de synthèse du Bio-UrP et du Bio-dUTP décrit par P. R. 



  Langer, A. A. Waldrop. et D. C. Ward (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 



  78, (1981) 6633) fait appel à trois réactions successives. 



  Dans une première phase, l'uridine triphosphate (UTP) ou la désoxyuridine triphosphate (dUTP) est mis en réaction avec de l'acétate mercurique pour obtenir les dérivés respectifs 5-mercurique de l'UTP ou de la dUTP. 

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  Dans une deuxième phase, les dérivés mercuriques de l'UTP ou de la   DUTP   sont mis en réaction avec l'allylamine en présence d'un catalyseur pour obtenir les dérivés   5-allylarnino-UTP     ou   dUTP. 
 EMI3.1 
 



  Ces dérivés doivent être purifiés en deux étapes, d'abord par chromatographie sur colonne DEAE Sephadex, ensuite par chramatographie liquide à haute performance. 



  Dans une troisième étape, les produits de réaction de la deuxième phase sont mis en réaction avec   l'ester N-hydroxysuccimidique   de la biotine pour obtenir respectivement le Bio-UTP et le Bio-dUTP. 



  Le produit final est enfin purifié par chromatographie sur colonne   de DEAE Sephadex.    



  Le schéma de synthèse décrit ci-dessus nécessite 3 reactions et 3 étapes de purification mettant en jeu ure fonction triphosphate particulièrement labile. Il a des désavantages d'être long, laborieux et sujet à dégradation de par l'instabilité relative des intermédiaires mis en jeu. De plus, les caractéristiques structurales du produit final et du produit de la seconde phase dans le procédé décrit, ne permettent pas une interprétation immédiate en   spectrophotanétrie UV   du résultat de la réaction car ces produits ont des spectres UV semblables. 



  La présente invention a pour objet de remédier à ces divers inconvénients. Suivant l'invention, on prépare le dérivé   5'-0-tripos-     phoryl-5 (3-allylaminobiotine)   uridine (Bio-UTP) et le dérivé 5' -0- triphosphoryl -2'-désoxy-5- (3-allylaminobiotine) uridine   (Bio-dUTP)   par la réaction, en présence d'un catalyseur, d'un dérivé 5-mercurique de l'uridine triphosphate ou de la   21 -désoxyuridine   triphosphate de formule générale (I). 
 EMI3.2 
 

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 dans laquelle R et R'= OH pour le dérivé de l'uridine, R = OH et   R'=   H pour le dérivé de la désoxyuridine, et R"= radical choisi parmi l'acétate, le chorure, le nitrate, le perchlorate, l'acétamide, le trinitranéthane, avec l'allylaminobiotine de formule générale (II).

   
 EMI4.1 
 



  L'allylaminobiotine de formule II est mis en réaction avec le dérivé mercurique de formule générale I en présence d'un catalyseur. 
 EMI4.2 
 



  Le catalyseur est choisi parmi le KPdCl PdCl , Pd (NOj . (R. F. Heck, J. Amer. Chem. Soc. 90 (1968) 5531). 



  Le composé mercurique de formule générale (I) est obtenu par la   réac-   tion de la   5'-0-triphosphoryluridine   ou   de la 5'-0-triphosphoryl-2'-   désoxyuridine de formule générale (III) : 
 EMI4.3 
 dans laquelle R et R'= OH pour le dérivé de l'uridine et R = OH et   R'=   H pour le dérivé de la désoxyuridine, avec un   compose   mercurique choisi parmi l'acétate, le chlorure, le nitrate, le perchlorate,   l'acêtanide,   et le   trinitrométhane   mercuriques. 



  La réaction est réalisée dans un milieu tamponné à   50oC.   



  Le produit de la réaction est isolé par extraction et précipitation. 

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  L'allylaminobiotine de formule générale II est obtenue par la réaction de l'ester N-hydroxysuccimidique de biotine de formule générale (IV). 
 EMI5.1 
 avec l'allylamine. 



  (J. Becker, M. Wilchek and E. Katchalski (1971) Proc. Natl. Acad. 



  Sci. USA 68,2604). 



    L'exu-ple donné   ci-après, qui ne limite en rien le procédé de synthèse faisant l'objet de la présente invention, permettra de mieux comprendre l'invention. 



  L'exemple donné se réfère à l'obtention du Bio-DUTP, Préparation du dérivé 5-mercurique de   la dut   On agite, par exemple, 4 h à 500C une solution aqueuse d'acétate de 
 EMI5.2 
 sodium 0. 1 M, pH 6, de désoxyuridine trip 10 mM, d'acétate mercuri- que 50   mM.   On ajoute du chlorurede lithium jusqu'à une concentration de 0.17 M. La solution est extraite avec de l'acétate   d'éthyle.   La phase acqueuse est précipitée avec de l'éthanol. Le précipité est lavé avec de l'éthanol et avec de l'éther   diéthylique.   



  Préparation de l'allylaminobiotine. 



  A une solution de N-hydroxysuccinimidebiotine (45mg, 0,13 mmol) dans la dimethylformamide anhydre (0,5 ml), on ajoute l'allylamine (15 mg, 0,26   mol).   La solution est agitée pendant 2h à   20oC,   puis concentrée sous vide. Le résidu est recristallisé dans   l'isopropa-   nol-éther anhydres. 



  On a obtenu 35 mg de cristaux incolores. 



  F : 162-1630C 

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 Préparation du 5'-0-triphosphoryl (-5-allylaminobiotine)   désoxyuridine   A une solution d'allylaminobiotine (2 mg, 0, 01 mmol) dans l'acétate de sodium acqueux (0,1 M, pH 5, 0,8 ml) on ajoute le dérivé 5-mercurique de la   2'-désoxyuridine   triphosphate (1) (5 mg, 0,01 mmol) et ensuite le tetrachloro palladate de potassium (2,3 mg, 0,01 mmol) en suspension dans   50 ul   d'eau. Le mélange est agité 11 h à   20 C,   filtré sur milipore ou centrifugé. Le surnageant est déposé sur une colonne de Sephadex DEAE A25 de 2,5 ml et élué dans un gradient linéaire 0,1 M à 0,9 M de bicarbonate de triéthylammonium (TEAB, pH 7,5). 



  Le produit éluant en fin de gradient présente le spectre UV attendu   (gk max   = 240   nm.   min = 265 nm,    max   = 275 nm dans l'eau) et une pureté   de # 90%   d'après analyse par HPLC. 



  Le dérivé ainsi obtenu a été introduit dans du DNA correspondant au gène de globine par nicktranslation. Le DNA ainsi substitué réagit avec l'avidine fixée fixée sur colonne d'ultragel avec la même efficacité que le produit obtenu par la méthode antérieurement connue, décrite dans l'article de P. R. Langer et al.   (Proc.   Nat. Acad. Sci. 



  USA 78 (1981) 6633). 



  La même procédure de synthèse peut être utilisée pour l'obtention du Bio-UTP. 



  Comme avantages du procédé nouveau de synthèse faisant l'objet de la présente invention citons : - la rapidité et la simplicité ; - la diminution des risques de dégradation des dérivés triphospohorylés qui ne sont engagés qu'une seule fois dans une réaction et une fois dans une étape de purification ; - l'obtention, après mercuration en une étape, d'un produit final dont la structure permet une purification aisée en une seule étape par chromatographie sur colonne de Sephadex - l'identification facile du produit final car sa structure   lectrsnique   caractéristique se différencie aisément par spectrophotométrie UV de celle du produit de départ. 

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  Les dérivés 5'-0-triphosphoryl-5- (3-allylaminobiotine) uridine et 5' -0- triphosphoryl -2'-désoxy-5-93-allylaminobiotine) uridine obtenus sont utilisés, notamment carme marqueurs internes des acides nucléiques. 



  Des possibilités d'applications sont, par exemple, l'isolement ou la mise en évidence d'un   PNA.   d'une espèce bien définie dans une population hétérogène de   RNN,   ou la mise en évidence de séquences de   RNA   ou de DNA par hybridation in situ ou après transfert de ces molécules sur filtre de nitrocellulose (Southern blot ou Northern blot), ou encore l'isolement de   RNN   spécifiques de protéines induites.

Claims

Revendications 1. Procédé de préparation du dérivé 5'-o-triphosphoryl-5- (3-allylamino biotine) uridine et du dérivé 5'-O-triphosphoryl -2'-désoxy-5-93-allylaminobiotine0 uridine, caractérisé par la réaction, en présence d'un catalyseur, d'un dérivé 5-mercurique de l'uridine triphosphate cu de la désoyuridine triphophate de formule générale I : EMI8.1 EMI8.2 dans laquelle R et R'= pour le dérivé de l'uridine, R = CH etR'=HpourledérivédeladésoxyuridineetR''= radical choisi parmi l'acétate, le chlorure, le nitrate, le perchlorate, l'acétamide, le trinitrométhane, avec l'allylaminobiotine de formule générale :

II : EMI8.3 EMI8.4 2. procédé de préparation du dérivé 5'-O-triphosphoryl-5- (3-allylamin biotine) uridine et du dérivé 5'-0-triphosphoryl - uridine suivant la reven- dication 1, caractérisé en ce que le composé de formule générale I est obtenu par la réaction de la 5'-0-triphosphryl- 2'-désaxyuridine de formule générale : <Desc/Clms Page number 9> EMI9.1 dans laquelle R et R'= OH pour le dérivé de l'uridine et R = OH et R'= H pour le dérivé de la désoxyuridine, avec un composé mercurique choisi parmi l'acétate, le chlorure, le nitrate, le perchlorate, l'acétamide, et le trinitrométhane mercuriques.

3. Procédé de préparation du dérivé 5'-0-triphosphoryl-5- (3-allyla- minobiotine) uridine et du dérivé 5'-0-triphosphoryl-2-désoxy - 5- (3-allylaminobiotine) uridine suivant les revendications l et 2, caractérisé en ce que le composé de formule II est obtenu par la réaction de l'ester N-hydroxysuccimidique de biotine de formule générale : EMI9.2 avec l'ally lamine. <Desc/Clms Page number 10> 4. Procédé de préparation du dérivé 5'-0-triphosphoryl-5- (3-allyl- aminobiotine) uridine et 5' -0- tripyhosphoryl -2'- désoxy -5- (3- allylaminobiotine) uridine, suivant la revendication 1 caractérisé EMI10.1 en ce que le catalyseur est choisi parmi le K2 PdCl4, Li2PdCl4, LiPdCl3, Pd (ND3) ,Pd(OOOCH-).

5. Dérivé 5'-0-triphospboryl-5- uridine et 5' - uridine, obtenus suivant les revendications 1 à 4, caractérisés en ce qu'ils sont utilisés comme marqueurs internes des acides nucléiques.