JPH02174698A - 核酸配列の増幅および検出方法 - Google Patents
核酸配列の増幅および検出方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、試料中の標的核酸配列を増幅および検出する
方法およびキットに関する。さらに詳しくは、自動化に
対応できるポリメラーゼ鎖反応を応用した方法およびキ
ットに関する。
方法およびキットに関する。さらに詳しくは、自動化に
対応できるポリメラーゼ鎖反応を応用した方法およびキ
ットに関する。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題）ポリ
メラーゼ鎖反応（以下、ｒＰｃＲＪともいう）により、
試料中の存在を分析しようとする標的オリゴヌクレオチ
ド分子を増幅（すなわち、数を増加させること）するこ
とができる。
メラーゼ鎖反応（以下、ｒＰｃＲＪともいう）により、
試料中の存在を分析しようとする標的オリゴヌクレオチ
ド分子を増幅（すなわち、数を増加させること）するこ
とができる。
ポリメラーゼ鎖反応の１つのタイプが、米国特許第４，
６８３，２０２号および同第４，６８３，１９５号明細
書に開示されている。このタイプのポリメラーゼ鎖反応
では、２つの相補的なポリヌクレオチド鎖を２つのオリ
ゴヌクレオチドプライマーで処理して各核酸鎖に相補的
な各プライマーの伸張生成物を合成することにより該ポ
リヌクレオチド鎖を増幅している。これらのプライマー
の選択は、一方のプライマーの伸張生成物がいったん鋳
型から分離されたときに、このプライマーの伸張生成物
がもう一方のプライマーの伸張生成物の合成のための鋳
型を形成するように行う。鎖反応は、プライマー伸張生
成物を鋳型から変性させ、生成した一本鎖分子を同じプ
ライマーで処理して再びアニールさせ、ついで該プライ
マーから伸張生成物をさらに生成させるというサイクル
を通じて維持される。このサイクルは、検出し得る濃度
まで標的核酸部分を増加させるためできるだけ多く繰り
返す。
６８３，２０２号および同第４，６８３，１９５号明細
書に開示されている。このタイプのポリメラーゼ鎖反応
では、２つの相補的なポリヌクレオチド鎖を２つのオリ
ゴヌクレオチドプライマーで処理して各核酸鎖に相補的
な各プライマーの伸張生成物を合成することにより該ポ
リヌクレオチド鎖を増幅している。これらのプライマー
の選択は、一方のプライマーの伸張生成物がいったん鋳
型から分離されたときに、このプライマーの伸張生成物
がもう一方のプライマーの伸張生成物の合成のための鋳
型を形成するように行う。鎖反応は、プライマー伸張生
成物を鋳型から変性させ、生成した一本鎖分子を同じプ
ライマーで処理して再びアニールさせ、ついで該プライ
マーから伸張生成物をさらに生成させるというサイクル
を通じて維持される。このサイクルは、検出し得る濃度
まで標的核酸部分を増加させるためできるだけ多く繰り
返す。
一般に、増幅した標的核酸配列の検出は、ＰＣＲにより
生成した二本鎖生成物を変性した後、これら生成物を伸
張生成物とハイブリダイズする１または２以上のリポー
タ−プローブで処理することにより行う。リポータ−プ
ローブは検出可能な標識を有しており、通常、過剰量に
て加える。それゆえ、ハイブリダイズしなかったリポー
タ−プローブをハイブリダイズしたリポータ−プローブ
から分離しなければならず、分離工程が必要であった。
生成した二本鎖生成物を変性した後、これら生成物を伸
張生成物とハイブリダイズする１または２以上のリポー
タ−プローブで処理することにより行う。リポータ−プ
ローブは検出可能な標識を有しており、通常、過剰量に
て加える。それゆえ、ハイブリダイズしなかったリポー
タ−プローブをハイブリダイズしたリポータ−プローブ
から分離しなければならず、分離工程が必要であった。
リポータ−プローブを用いず、また分離工程を要さない
伸張生成物の池の検出方法では、臭化エチジウムで染色
したゲルで伸張生成物を検出する。
伸張生成物の池の検出方法では、臭化エチジウムで染色
したゲルで伸張生成物を検出する。
リポータ−プローブを用いるかまたはゲルを用いるかに
かかわらず、従来のＰＣＲ法は自動化が非常に困難であ
った。リポータ−プローブを用いる方法では、伸張生成
物を変性させ、リポータ−プローブをアニールさせ、つ
いで、ある場合には反応混合物から過剰のリポータ−プ
ローブを分離する必要がある。もちろんゲルを用いる方
法も時間がかかる上、操作が繁雑であり、従って速やか
に結果を得たいときの自動化には実際的でない。
かかわらず、従来のＰＣＲ法は自動化が非常に困難であ
った。リポータ−プローブを用いる方法では、伸張生成
物を変性させ、リポータ−プローブをアニールさせ、つ
いで、ある場合には反応混合物から過剰のリポータ−プ
ローブを分離する必要がある。もちろんゲルを用いる方
法も時間がかかる上、操作が繁雑であり、従って速やか
に結果を得たいときの自動化には実際的でない。
（課題を解決するための手段）
本発明は、試料中の標的核酸配列を増幅および検出する
方法であって、 （ａ）該標的核酸配列およびそれに相補的なストランド
にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダ
イズさせ、その際、一方のオリゴヌクレオチドプライマ
ーは反応性成分ペアの一方に結合しており、もう一方の
オリゴヌクレオチドプライマーは検出可能な残基に結合
しているかまたは検出可能な残基と反応することができ
るものであり、 （ｂ）各プライマーから各核酸ストランドに相補的な伸
張生成物を合成し、その際、各プライマーの伸張生成物
は、該伸張生成物をその相補体から分離させたときにも
う一方のプライマーから伸張生成物を合成するための鋳
型を形成するものであり、（ｃ）プライマー伸張生成物
が合成された鋳型から該プライマー伸張生成物を分離し
て一本鎖分子を生成させ、 （ｄ）上記工程（ｃ）で生成した各−木繊を鋳型として
用いてプライマー伸張生成物を合成することによって二
本鎖生成物を生成することのできる条件下で、上記工程
（ｃ）で得られた一本鎖分子を上記工程（ａ）のプライ
マーで処理し、 （ｅ）該少なくとも１種の反応性成分ペアの一方が結合
した固相上に上記工程（ｄ）の二本鎖生成物を捕捉させ
て、該二本鎖生成物を該反応性成分ペアにより固相に結
合させ、ついで （ｆ）該固相に結合した該検出可能な残基を検出する ことを特徴とする方法； 試料中の増幅された二本鎖の標的核酸配列をさらに増幅
し検出する方法であって、 （ａ）相補的な増幅標的ストランドに一対の第二オリゴ
ヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせ、その際
、各第二オリゴヌクレオチドプライマーは異なる反応性
成分ペアの第一成分に結合しており、 （ｂ）各第二プライマーから標的核酸ストランドに相補
的な伸張生成物を合成し、その際、各プライマーの伸張
生成物は、該伸張生成物をその相補体から分離させたと
きにもう一方のプライマーから伸張生成物を合成するた
めの鋳型を形成するものであり、 （ｃ）プライマー伸張生成物が合成された鋳型から該プ
ライマー伸張生成物を分離して一本鎖分子を生成させ、 （ｄ）上記工程（ｃ）で生成した一本鎖を鋳型として用
いてプライマー伸張生成物を合成することによって二本
鎖生成物を生成することのできる条件下で、上記工程（
ｃ）で得られた一本鎖分子を上記工程（ａ）のプライマ
ーで処理し、 （ｅ）該反応性成分ペアの一つの第二成分が結合した固
相上に上記工程（ｄ）の二本鎖生成物を捕捉させて、該
二本鎖生成物を該反応性成分ペアにより固相に結合させ
、 （ｆ）工程（ｅ）の前、工程（ｅ）の間、または工程（
ｅ）の後に、上記工程（ｄ）の該二本鎖生成物を該反応
性成分ペアのもう一方の検出可能な第二成分で処理し、
その際、該第二成分は該二本鎖生成物上の該第一の反応
性成分ペアと反応性で結合することができ、ついで （ｇ）該固相に結合した検出可能な第二成分を検出して
標的ストランドの増幅生成物の存否を調べることを特徴
とする方法； 試料中の標的オリゴヌクレオチド配列を増幅および検出
する方法であって、標的配列とハイブリダイズさせるた
めのものと標的配列の相補体とハイブリダイズさせるｆ
こめのらのの２つの第一プライマーを各標的配列に対し
て用いて該標的配列およびその相補体に相補的な第一の
伸張生成物を生成させ、その際、該第一の伸張生成物は
該第一プライマーから第一の伸張生成物をさらに合成す
るための鋳型を形成する方法において、第一プライマー
と標的配列との反応中または反応後に該第一の伸張生成
物を少なくとも１つの第二プライマーで処理し、その際
、該第二プライマーは少なくとも１つの該第一の伸張生
成物と３°側の第一プライマー末端部でハイブリダイズ
して第二の伸張生成物を生成することができ、該第二プ
ライマーは第一の反応性成分ペアの一方に結合しており
、ついで第二の伸張生成物が生成したかどうかを検出す
ることを特徴とする方法； 試料中の標的オリゴヌクレオチド配列を増幅および検出
する方法であって、標的配列とハイブリダイズさせるた
めのものと標的配列の相補体とノーイブリダイズさせる
ためのものの少なくとも２つの第一プライマーを各標的
配列に対して用いて該標的配列およびその相補体に相補
的な伸張生成物を生成させ、その際、該伸張生成物は該
プライマーから伸張生成物をさらに合成するための鋳型
を形成する方法において、該プライマーの少なくとも１
つを反応性成分ペアの第一成分に結合させ、該反応性成
分ペアの第二成分を結合させた固相を用いて該試料から
該伸張生成物を分離し、ついで該プライマーのもう一方
を検出することを特徴とする方法；および 標的核酸配列を増幅および検出するためのキットであっ
て、 （ｉ）標的核酸配列に相補的な１つのプライマーと標的
核酸配列相補的配列に相補的はもう１つのプライマーと
の少なくとも２つのプライマー（該プライマーからプラ
イマー伸張生成物が合成され、その際、各プライマー伸
張生成物が該プライマーからさらに伸張生成物を合成す
るための鋳型を形成し、また該プライマーの少なくとも
１つに反応性成分ペアの一方が結合している）、 （ｉｉ）ＤＮｐ、ポリメラーゼ、および（ｉｉｉ）該１
つのプライマー上の該反応性成分ペアの一方と結合し得
る反応性成分ペアの一方が結合した固相 からなることを特徴とするキットを提供するものである
。
方法であって、 （ａ）該標的核酸配列およびそれに相補的なストランド
にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダ
イズさせ、その際、一方のオリゴヌクレオチドプライマ
ーは反応性成分ペアの一方に結合しており、もう一方の
オリゴヌクレオチドプライマーは検出可能な残基に結合
しているかまたは検出可能な残基と反応することができ
るものであり、 （ｂ）各プライマーから各核酸ストランドに相補的な伸
張生成物を合成し、その際、各プライマーの伸張生成物
は、該伸張生成物をその相補体から分離させたときにも
う一方のプライマーから伸張生成物を合成するための鋳
型を形成するものであり、（ｃ）プライマー伸張生成物
が合成された鋳型から該プライマー伸張生成物を分離し
て一本鎖分子を生成させ、 （ｄ）上記工程（ｃ）で生成した各−木繊を鋳型として
用いてプライマー伸張生成物を合成することによって二
本鎖生成物を生成することのできる条件下で、上記工程
（ｃ）で得られた一本鎖分子を上記工程（ａ）のプライ
マーで処理し、 （ｅ）該少なくとも１種の反応性成分ペアの一方が結合
した固相上に上記工程（ｄ）の二本鎖生成物を捕捉させ
て、該二本鎖生成物を該反応性成分ペアにより固相に結
合させ、ついで （ｆ）該固相に結合した該検出可能な残基を検出する ことを特徴とする方法； 試料中の増幅された二本鎖の標的核酸配列をさらに増幅
し検出する方法であって、 （ａ）相補的な増幅標的ストランドに一対の第二オリゴ
ヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせ、その際
、各第二オリゴヌクレオチドプライマーは異なる反応性
成分ペアの第一成分に結合しており、 （ｂ）各第二プライマーから標的核酸ストランドに相補
的な伸張生成物を合成し、その際、各プライマーの伸張
生成物は、該伸張生成物をその相補体から分離させたと
きにもう一方のプライマーから伸張生成物を合成するた
めの鋳型を形成するものであり、 （ｃ）プライマー伸張生成物が合成された鋳型から該プ
ライマー伸張生成物を分離して一本鎖分子を生成させ、 （ｄ）上記工程（ｃ）で生成した一本鎖を鋳型として用
いてプライマー伸張生成物を合成することによって二本
鎖生成物を生成することのできる条件下で、上記工程（
ｃ）で得られた一本鎖分子を上記工程（ａ）のプライマ
ーで処理し、 （ｅ）該反応性成分ペアの一つの第二成分が結合した固
相上に上記工程（ｄ）の二本鎖生成物を捕捉させて、該
二本鎖生成物を該反応性成分ペアにより固相に結合させ
、 （ｆ）工程（ｅ）の前、工程（ｅ）の間、または工程（
ｅ）の後に、上記工程（ｄ）の該二本鎖生成物を該反応
性成分ペアのもう一方の検出可能な第二成分で処理し、
その際、該第二成分は該二本鎖生成物上の該第一の反応
性成分ペアと反応性で結合することができ、ついで （ｇ）該固相に結合した検出可能な第二成分を検出して
標的ストランドの増幅生成物の存否を調べることを特徴
とする方法； 試料中の標的オリゴヌクレオチド配列を増幅および検出
する方法であって、標的配列とハイブリダイズさせるた
めのものと標的配列の相補体とハイブリダイズさせるｆ
こめのらのの２つの第一プライマーを各標的配列に対し
て用いて該標的配列およびその相補体に相補的な第一の
伸張生成物を生成させ、その際、該第一の伸張生成物は
該第一プライマーから第一の伸張生成物をさらに合成す
るための鋳型を形成する方法において、第一プライマー
と標的配列との反応中または反応後に該第一の伸張生成
物を少なくとも１つの第二プライマーで処理し、その際
、該第二プライマーは少なくとも１つの該第一の伸張生
成物と３°側の第一プライマー末端部でハイブリダイズ
して第二の伸張生成物を生成することができ、該第二プ
ライマーは第一の反応性成分ペアの一方に結合しており
、ついで第二の伸張生成物が生成したかどうかを検出す
ることを特徴とする方法； 試料中の標的オリゴヌクレオチド配列を増幅および検出
する方法であって、標的配列とハイブリダイズさせるた
めのものと標的配列の相補体とノーイブリダイズさせる
ためのものの少なくとも２つの第一プライマーを各標的
配列に対して用いて該標的配列およびその相補体に相補
的な伸張生成物を生成させ、その際、該伸張生成物は該
プライマーから伸張生成物をさらに合成するための鋳型
を形成する方法において、該プライマーの少なくとも１
つを反応性成分ペアの第一成分に結合させ、該反応性成
分ペアの第二成分を結合させた固相を用いて該試料から
該伸張生成物を分離し、ついで該プライマーのもう一方
を検出することを特徴とする方法；および 標的核酸配列を増幅および検出するためのキットであっ
て、 （ｉ）標的核酸配列に相補的な１つのプライマーと標的
核酸配列相補的配列に相補的はもう１つのプライマーと
の少なくとも２つのプライマー（該プライマーからプラ
イマー伸張生成物が合成され、その際、各プライマー伸
張生成物が該プライマーからさらに伸張生成物を合成す
るための鋳型を形成し、また該プライマーの少なくとも
１つに反応性成分ペアの一方が結合している）、 （ｉｉ）ＤＮｐ、ポリメラーゼ、および（ｉｉｉ）該１
つのプライマー上の該反応性成分ペアの一方と結合し得
る反応性成分ペアの一方が結合した固相 からなることを特徴とするキットを提供するものである
。
本発明は、標的核酸配列を検出および増幅するための方
法およびキットに関する。本発明の方法には、反応性成
分ペアの一方に結合したオリゴヌクレオチドプライマー
を、それぞれ標的核酸配列およびそれに相補的なストラ
ンドとハイブリダイズさせることが含まれる。標的核酸
配列が存在するときは、各核酸ストランドに相補的な伸
張生成物が各プライマーから合成され、各プライマーか
らの伸張生成物は、その相補体から分離されたときに、
もう一方のプライマーから伸張生成物をさらに合成する
ための鋳型を形成する。プライマー伸張生成物は、合成
の行われた鋳型から分離されて一本鎖分子を生成する。
法およびキットに関する。本発明の方法には、反応性成
分ペアの一方に結合したオリゴヌクレオチドプライマー
を、それぞれ標的核酸配列およびそれに相補的なストラ
ンドとハイブリダイズさせることが含まれる。標的核酸
配列が存在するときは、各核酸ストランドに相補的な伸
張生成物が各プライマーから合成され、各プライマーか
らの伸張生成物は、その相補体から分離されたときに、
もう一方のプライマーから伸張生成物をさらに合成する
ための鋳型を形成する。プライマー伸張生成物は、合成
の行われた鋳型から分離されて一本鎖分子を生成する。
この一本鎖分子は、生成した各一本鎖分子を鋳型として
用いてプライマー伸張生成物を生成することにより二本
鎖生成物をさらに生成する条件下でプライマー処理を行
う。
用いてプライマー伸張生成物を生成することにより二本
鎖生成物をさらに生成する条件下でプライマー処理を行
う。
二本鎖生成物は、プライマーに結合した上記反応性成分
ペアのもう一方の成分を固定化した固相上に捕捉させる
ことにより一対の反応性成分ペアにより固相と結合させ
る。固相捕捉工程の前、工程中、または工程後に、検出
可能な残基で標識した別の反応性成分ペアの一方の成分
で二本鎖生成物を処理することにより、該二本鎖生成物
を検出可能な残基で標識させる。ついで該固相に結合し
た検出可能な残基を検出して、試料中に標的核酸配列が
存在するかどうかを調べる。
ペアのもう一方の成分を固定化した固相上に捕捉させる
ことにより一対の反応性成分ペアにより固相と結合させ
る。固相捕捉工程の前、工程中、または工程後に、検出
可能な残基で標識した別の反応性成分ペアの一方の成分
で二本鎖生成物を処理することにより、該二本鎖生成物
を検出可能な残基で標識させる。ついで該固相に結合し
た検出可能な残基を検出して、試料中に標的核酸配列が
存在するかどうかを調べる。
従って、本発明のこの方法は固相を用いた容易な分離手
順を掛供するものであり、結合標識を未結合標識から分
離するのと同時に標識伸張生成物を反応混合物から分離
することができる。
順を掛供するものであり、結合標識を未結合標識から分
離するのと同時に標識伸張生成物を反応混合物から分離
することができる。
本発明はまた、ＤＮＡプローブアッセイを行うためのキ
ットをも機供する。本発明のキットには、少なくとも１
つに反応性成分ペアの一方の成分が結合したプライマー
、および該反応性成分ペアの一方に反応性である反応性
成分ペアのもう一方が結合した固相物質が含まれる。
ットをも機供する。本発明のキットには、少なくとも１
つに反応性成分ペアの一方の成分が結合したプライマー
、および該反応性成分ペアの一方に反応性である反応性
成分ペアのもう一方が結合した固相物質が含まれる。
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
本発明には「捕捉」オリゴヌクレオチドプライマーを用
いたポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）が含まれ、該各「捕
捉」オリゴヌクレオチドプライマーは反応性成分ペアの
一方に結合している。第１図において、二本鎖標的配列
を変性させ（工程Ａ）、各標的配列の３°末端に捕捉プ
ライマーをアニールさせる（工程Ｂ）。捕捉プライマー
の長さは、一方の捕捉プライマーが、もう一方の捕捉プ
ライマーに相補的な標的ヌクレオチド鎖部分とハイブリ
ダイズすることができないものであることが重要である
。
いたポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）が含まれ、該各「捕
捉」オリゴヌクレオチドプライマーは反応性成分ペアの
一方に結合している。第１図において、二本鎖標的配列
を変性させ（工程Ａ）、各標的配列の３°末端に捕捉プ
ライマーをアニールさせる（工程Ｂ）。捕捉プライマー
の長さは、一方の捕捉プライマーが、もう一方の捕捉プ
ライマーに相補的な標的ヌクレオチド鎖部分とハイブリ
ダイズすることができないものであることが重要である
。
捕捉プライマーは、それぞれ５′末端にて反応性成分ペ
アの一方の成分（下記にて定義）と結合しており、各成
分は第１図中では○またはへの符号で示しである。本発
明にとって明らかに本質的でないことだが、５°末端に
反応性成分ペアの一方の成分が存在することは５゛−３
°工クソヌクレアーゼ的分解活性による分解反応を抑制
する効果をも有する。
アの一方の成分（下記にて定義）と結合しており、各成
分は第１図中では○またはへの符号で示しである。本発
明にとって明らかに本質的でないことだが、５°末端に
反応性成分ペアの一方の成分が存在することは５゛−３
°工クソヌクレアーゼ的分解活性による分解反応を抑制
する効果をも有する。
ついで、ＤＮＡポリメラーゼを用いて各プライマーの３
゛末端を伸張させることによりプライマー伸張生成物を
合成する（工程Ｃ）。ついで、上記工程Ｃの二本鎖生成
物を変性させることにより伸張生成物を鋳型から分離し
、工程Ｃの伸張生成物に新たなプライマーをアニールさ
せる（工程り参照）。ついで、伸張生成物をさらに合成
する（工程Ｅ）。工程Ｅの二本鎖生成物を用い、標的核
酸配列の濃度を検出可能なレベルまで増加させるのに必
要なだけできるだけ多く工程りを繰り返す。
゛末端を伸張させることによりプライマー伸張生成物を
合成する（工程Ｃ）。ついで、上記工程Ｃの二本鎖生成
物を変性させることにより伸張生成物を鋳型から分離し
、工程Ｃの伸張生成物に新たなプライマーをアニールさ
せる（工程り参照）。ついで、伸張生成物をさらに合成
する（工程Ｅ）。工程Ｅの二本鎖生成物を用い、標的核
酸配列の濃度を検出可能なレベルまで増加させるのに必
要なだけできるだけ多く工程りを繰り返す。
ＰＣＲが完了したら、各ストランドの５°末端にＯおよ
び△で示される反応性成分ペアの一方の成分を有する二
本鎖生成物（工程Ｆ）が反応混合物中で優勢になる。
び△で示される反応性成分ペアの一方の成分を有する二
本鎖生成物（工程Ｆ）が反応混合物中で優勢になる。
本発明に用いるのに適当な反応性成分ペアの例としては
、共有結合性および非共有結合性反応性成分ペアが挙げ
られる。適当な非共有結合性反応性成分ペアとしては、
抗体と抗原、ビオチンとアビジン、酵素と酵素レセプタ
ー、炭水化物とレクチン、酵素と酵素補助因子および相
補的ＤＮＡ鎖のペアのような一般的なりガント−抗リガ
ンド成分が挙げられる。特異的結合成分、すなわち互い
に非共有結合的特異性を育する成分（たとえばビオチン
とアビジン、または抗体と抗原など）から反応性成分ペ
アを選択するのが好ましい。適当な共有結合性反応性成
分ペアとしては、鉛や水銀のような重金属（固相または
標識に結合）と反応する遊離のチオール（各プライマー
の５°末端に結合）か挙げられる。
、共有結合性および非共有結合性反応性成分ペアが挙げ
られる。適当な非共有結合性反応性成分ペアとしては、
抗体と抗原、ビオチンとアビジン、酵素と酵素レセプタ
ー、炭水化物とレクチン、酵素と酵素補助因子および相
補的ＤＮＡ鎖のペアのような一般的なりガント−抗リガ
ンド成分が挙げられる。特異的結合成分、すなわち互い
に非共有結合的特異性を育する成分（たとえばビオチン
とアビジン、または抗体と抗原など）から反応性成分ペ
アを選択するのが好ましい。適当な共有結合性反応性成
分ペアとしては、鉛や水銀のような重金属（固相または
標識に結合）と反応する遊離のチオール（各プライマー
の５°末端に結合）か挙げられる。
検出すべき生成物（工程Ｆ）の反応混合物からの分離は
、反応性成分の１つ（たとえばΔで示されるもの）を該
反応性成分に反応性もしくは相補的なもう一方の反応性
成分と反応させることにより行い、その際、後者の反応
性成分は微細粒子のような固相に結合している。固相に
結合した伸張生成物を用いることにより、濾過するかま
たはアボット・ラボラトリーズから販売されているＩＭ
ｘ（Ｒ）使捨て反応セル中を通過させて反応混合物から
伸張生成物を分離することができる。
、反応性成分の１つ（たとえばΔで示されるもの）を該
反応性成分に反応性もしくは相補的なもう一方の反応性
成分と反応させることにより行い、その際、後者の反応
性成分は微細粒子のような固相に結合している。固相に
結合した伸張生成物を用いることにより、濾過するかま
たはアボット・ラボラトリーズから販売されているＩＭ
ｘ（Ｒ）使捨て反応セル中を通過させて反応混合物から
伸張生成物を分離することができる。
他の固相を用いることもできる。たとえば、第二の成分
を媒体（たとえば膜やフィルター）に直接結合させ、伸
張生成物を該媒体中に通すことによって該媒体に・直接
捕捉させることができる。従来の固相分離法にビーズや
カラムを用いて反応混合物から伸張生成物を分離するこ
ともできる。もちろん、この場合、ビーズまたはカラム
には反応性成分ペアの第二成分が結合していなければな
らない。
を媒体（たとえば膜やフィルター）に直接結合させ、伸
張生成物を該媒体中に通すことによって該媒体に・直接
捕捉させることができる。従来の固相分離法にビーズや
カラムを用いて反応混合物から伸張生成物を分離するこ
ともできる。もちろん、この場合、ビーズまたはカラム
には反応性成分ペアの第二成分が結合していなければな
らない。
固相分離の前、固相分離の間、または固相分離の後に、
他の反応性成分ペアの一方の成分くたとえばＯで示され
るもの）を、該成分に特異的な反応性成分ペアの第二成
分と反応させる。その際、該第二成分は下記に示すよう
に検出可能な標識で標識しである。上記から明らかなよ
うに（工程Ｈ参照）、５°末端にそれぞれ反応性成分ペ
アの第二成分を介して標識かまたは固相に結合した反応
性成分ペアの成分（好ましくは特異的結合成分）を有す
る２つの相補的オリゴヌクレオチド鎖を含む結合体が生
成される。過剰の標識／反応性ペア成分結合体成分は、
ＤＮＡ鎖の反対側に結合した微細粒子を用いた濾過によ
り結合標識から分離する。
他の反応性成分ペアの一方の成分くたとえばＯで示され
るもの）を、該成分に特異的な反応性成分ペアの第二成
分と反応させる。その際、該第二成分は下記に示すよう
に検出可能な標識で標識しである。上記から明らかなよ
うに（工程Ｈ参照）、５°末端にそれぞれ反応性成分ペ
アの第二成分を介して標識かまたは固相に結合した反応
性成分ペアの成分（好ましくは特異的結合成分）を有す
る２つの相補的オリゴヌクレオチド鎖を含む結合体が生
成される。過剰の標識／反応性ペア成分結合体成分は、
ＤＮＡ鎖の反対側に結合した微細粒子を用いた濾過によ
り結合標識から分離する。
いったん固相を溶液から分離したら、標的核酸配列を鋳
型として用いてプライマー伸張生成物が生成したことが
、固相に結合した標識により示される。標的核酸配列が
存在しないときは、伸張生成物は生成されず、工程Ｈの
二本鎖複合体生成は不可能である。
型として用いてプライマー伸張生成物が生成したことが
、固相に結合した標識により示される。標的核酸配列が
存在しないときは、伸張生成物は生成されず、工程Ｈの
二本鎖複合体生成は不可能である。
本発明のＰＣＲ法は、自動化するのか容易である。オリ
ゴヌクレオチド捕捉プライマー（各プライマーは反応性
成分ペアの一方の成分に結合している）を用い、通常の
方法を用いて該プライマーを処理して標的核酸配列を増
幅させることができる。しかしながら、いったん二本鎖
生成物が生成したら（工程Ｆ）変性させることもリポー
タ−ＤＮＡプローブを加えることも８要ない。伸張生成
物を二本鎖のまま残し、標識反応性成分で検出し、固相
に結合した反応性成分により分離（検出の前、検出の間
、または検出の後）することができる。
ゴヌクレオチド捕捉プライマー（各プライマーは反応性
成分ペアの一方の成分に結合している）を用い、通常の
方法を用いて該プライマーを処理して標的核酸配列を増
幅させることができる。しかしながら、いったん二本鎖
生成物が生成したら（工程Ｆ）変性させることもリポー
タ−ＤＮＡプローブを加えることも８要ない。伸張生成
物を二本鎖のまま残し、標識反応性成分で検出し、固相
に結合した反応性成分により分離（検出の前、検出の間
、または検出の後）することができる。
一方の捕捉プライマー上の反応性成分はもう一方の捕捉
プライマー上の反応性成分とは異なるのが好ましい。反
応性成分の異なるペアから２つの反応性成分を選択する
のが最も好ましい。たとえば、一方のプライマー上に存
在する固相結合体に反応性の反応性成分がビオチンであ
る場合（固相結合体はアビジンまたは抗ビオチンを含む
）は、もう一方のプライマー上に存在する標識と結合す
べき反応性成分は標識抗体と反応性のハブテンまたは抗
原であればよい。従って、標識反応性成分は固相結合体
と交差反応を起こすことがなく、また増幅された生成物
（工程Ｆ）の各末端の反応性成分同士も相互に反応する
ことはない。
プライマー上の反応性成分とは異なるのが好ましい。反
応性成分の異なるペアから２つの反応性成分を選択する
のが最も好ましい。たとえば、一方のプライマー上に存
在する固相結合体に反応性の反応性成分がビオチンであ
る場合（固相結合体はアビジンまたは抗ビオチンを含む
）は、もう一方のプライマー上に存在する標識と結合す
べき反応性成分は標識抗体と反応性のハブテンまたは抗
原であればよい。従って、標識反応性成分は固相結合体
と交差反応を起こすことがなく、また増幅された生成物
（工程Ｆ）の各末端の反応性成分同士も相互に反応する
ことはない。
別の態様においては、各捕捉プライマーに結合する反応
性成分は同じものであってもよい。この態様は凝集型ア
ッセイには有用であるが、固相捕捉アッセイには望まし
くない。というのは、二本鎖複合体が固相および標識結
合体の両方に結合したことを確認するのは一層困難であ
るからである。
性成分は同じものであってもよい。この態様は凝集型ア
ッセイには有用であるが、固相捕捉アッセイには望まし
くない。というのは、二本鎖複合体が固相および標識結
合体の両方に結合したことを確認するのは一層困難であ
るからである。
反応性成分ペアの成分をＤＮＡプライマーに結合させる
方法は、もちろん用いた反応性成分ペアの成分の型に依
存する。しかしながら、好ましい結合は５′水酸基を介
した共有結合によるものである。１つの方法として、ホ
スホールアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ
）化学によりプライマー合成中にオリゴヌクレオチドの
５′水酸基に第一級脂肪族アミンを加える。引き続き、
このアミンをハプテン種（たとえばフルオレセイン、イ
ソチオシアナートまたはビオチン−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル）と反応させて反応性成分ペア成分
に結合したプライマーを得る。
方法は、もちろん用いた反応性成分ペアの成分の型に依
存する。しかしながら、好ましい結合は５′水酸基を介
した共有結合によるものである。１つの方法として、ホ
スホールアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ
）化学によりプライマー合成中にオリゴヌクレオチドの
５′水酸基に第一級脂肪族アミンを加える。引き続き、
このアミンをハプテン種（たとえばフルオレセイン、イ
ソチオシアナートまたはビオチン−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル）と反応させて反応性成分ペア成分
に結合したプライマーを得る。
伸張生成物の生成は、鋳型にアニールしたプライマーを
ＤＮＡポリメラーゼ（好ましくはヨーロッパ特許第２５
８，０１７号明細書に開示されているＴａｑボ」ツメラ
ーゼのような温度安定ＤＮＡポリメラーゼ）にさらすこ
とによって行う。ＤＮＡポリメラーゼは、もちろん鋳型
ストランドをコピーして５°→３″の方向にプライマー
からＤＮＡを合成する。二本鎖伸張生成物を変性させる
好ましい方法は、米国特許第４，６８３，２０２号明細
書に開示されているようにＰＣＲサイクル中に高温（た
とえ−１ｉ９５℃）にさらすことによるものであるので
、温度安定ポリメラーゼを用いるのが好ましい。
ＤＮＡポリメラーゼ（好ましくはヨーロッパ特許第２５
８，０１７号明細書に開示されているＴａｑボ」ツメラ
ーゼのような温度安定ＤＮＡポリメラーゼ）にさらすこ
とによって行う。ＤＮＡポリメラーゼは、もちろん鋳型
ストランドをコピーして５°→３″の方向にプライマー
からＤＮＡを合成する。二本鎖伸張生成物を変性させる
好ましい方法は、米国特許第４，６８３，２０２号明細
書に開示されているようにＰＣＲサイクル中に高温（た
とえ−１ｉ９５℃）にさらすことによるものであるので
、温度安定ポリメラーゼを用いるのが好ましい。
しかしながら、伸張生成物を変性させるために異なる方
法を用いたときは、他のＤＮＡポリメラーゼまたはその
断片（クレノー断片を含む）を用いてよい。
法を用いたときは、他のＤＮＡポリメラーゼまたはその
断片（クレノー断片を含む）を用いてよい。
本発明はまた、「ネスト」プライマーを用いて行うこと
もできる（第２図）。二本ＩＩＩ的配列配列２図、工程
Ａ）を変性させ、一本鎖の標的部位に「第二プライマー
をアニールさせる。第一プライマーは、各標的ストラン
ドの３゛末端におけるＰｔおよびＰ、部位でハイブリダ
イズする。ついでＰＣＲを用い、第一の伸張生成物を合
成させ（工程Ｃ）、所望の程度に増幅されるまでこの手
順を繰り返す。
もできる（第２図）。二本ＩＩＩ的配列配列２図、工程
Ａ）を変性させ、一本鎖の標的部位に「第二プライマー
をアニールさせる。第一プライマーは、各標的ストラン
ドの３゛末端におけるＰｔおよびＰ、部位でハイブリダ
イズする。ついでＰＣＲを用い、第一の伸張生成物を合
成させ（工程Ｃ）、所望の程度に増幅されるまでこの手
順を繰り返す。
この場合、標的配列がまずいかにして増幅されるかは問
題ではなく、いかなる増幅法もこの手順に用いることが
できることを理解する必要がある。
題ではなく、いかなる増幅法もこの手順に用いることが
できることを理解する必要がある。
第一プライマーで所望の程度の増幅が完了したら、上記
工程Ａ−Ｄで生成した第一の伸張生成物に第二プライマ
ー（第２図、工程Ｅ）をアニールする。この第二プライ
マーは「捕捉」プライマーであり、５°末端に上記反応
性成分ペアの成分を有している。第二プライマーは、第
一プライマーおよび第二プライマーが同じストランド上
にハイブリダイズしたと仮定したときに、各ストランド
上において第一プライマーの３°末端が存在する部位の
近くまたは隣の部位（しかし、重なり合ってはならない
）にハイブリダイズするように合成する。
工程Ａ−Ｄで生成した第一の伸張生成物に第二プライマ
ー（第２図、工程Ｅ）をアニールする。この第二プライ
マーは「捕捉」プライマーであり、５°末端に上記反応
性成分ペアの成分を有している。第二プライマーは、第
一プライマーおよび第二プライマーが同じストランド上
にハイブリダイズしたと仮定したときに、各ストランド
上において第一プライマーの３°末端が存在する部位の
近くまたは隣の部位（しかし、重なり合ってはならない
）にハイブリダイズするように合成する。
第２図、工程Ｅから明らかなように、たとえば、１番目
の第二プライマーは配列Ｐ、の隣にある配列Ｐ％にハイ
ブリダイズし、該配列Ｐ１には、もし溶液中に１番目の
第一プライマーが第二プライマーとともに存在するなら
該１番目の第一プライマーがハイブリダイズする。２番
目の第二プライマーは、Ｐ２部位の隣のＰ！′部位にハ
イブリダイズし、該Ｐ１部位には２番目の第一プライマ
ーが溶液中に存在するときに該２番目の第一プライマー
がハイブリダイズする。
の第二プライマーは配列Ｐ、の隣にある配列Ｐ％にハイ
ブリダイズし、該配列Ｐ１には、もし溶液中に１番目の
第一プライマーが第二プライマーとともに存在するなら
該１番目の第一プライマーがハイブリダイズする。２番
目の第二プライマーは、Ｐ２部位の隣のＰ！′部位にハ
イブリダイズし、該Ｐ１部位には２番目の第一プライマ
ーが溶液中に存在するときに該２番目の第一プライマー
がハイブリダイズする。
第二（捕捉）プライマーを用いて！または２以上、好ま
しくは１−１０のＰＣＲサイクルを行い、二本鎖分子の
各末端に反応性成分ペアの成分を有する二本鎖伸張生成
物（工程Ｆ、第２図）を生成させる。これら二本鎖分子
は、ついで上記のように標識結合体により検出し、固相
結合体により分離することができる。
しくは１−１０のＰＣＲサイクルを行い、二本鎖分子の
各末端に反応性成分ペアの成分を有する二本鎖伸張生成
物（工程Ｆ、第２図）を生成させる。これら二本鎖分子
は、ついで上記のように標識結合体により検出し、固相
結合体により分離することができる。
ネスト第一および第二プライマーを用いることによる利
点は、特異性が向上することである。第二の伸張生成物
は、第二プライマーが第一の伸張生成物にハイブリダイ
ズしなければ合成されることはない。従って、第一プラ
イマーが所望の標的核酸配列以外の核酸配列にハイブリ
ダイズしている場合には、第二プライマーは実際の第一
の伸張生成物にハイブリダイズすることはない。第二の
伸張生成物は、第一の伸張生成物が正確に合成された場
合にのみ生成される。従って、１または２以上、好まし
くは１〜１０のＰＣＲサイクルを行って第二の伸張生成
物の濃度を検出可能なものにするために第二プライマー
を反応混合物に加えるときには、特異性を向上させるこ
とができる。
点は、特異性が向上することである。第二の伸張生成物
は、第二プライマーが第一の伸張生成物にハイブリダイ
ズしなければ合成されることはない。従って、第一プラ
イマーが所望の標的核酸配列以外の核酸配列にハイブリ
ダイズしている場合には、第二プライマーは実際の第一
の伸張生成物にハイブリダイズすることはない。第二の
伸張生成物は、第一の伸張生成物が正確に合成された場
合にのみ生成される。従って、１または２以上、好まし
くは１〜１０のＰＣＲサイクルを行って第二の伸張生成
物の濃度を検出可能なものにするために第二プライマー
を反応混合物に加えるときには、特異性を向上させるこ
とができる。
一対のネスト第二プライマーの代わりに単一のネスト第
二プライマーを用いることができ（第３図）、その際、
一対のプライマー（ｐｔお上びｐｔ）を用いて第一の伸
張生成物を生成させる。第一プライマーの一方（Ｐ、）
は「捕捉」プライマーであるが（すなわち、第一反応性
成分ペアの一方の成分に結合している）、もう一方の第
一プライマー（Ｐ、）はそうではない。第二「捕捉」プ
ライマーＰ、’（５″末端に第二反応性成分ペアの一方
の成分を有する）は、プライマーＰ！が溶液中に存在す
る場合にその３°末端がハイブリダイズする部位の近く
または隣（しかし、重なる合わない）の部位で第一の伸
張生成物にハイブリダイズする。各ストランドの両５゛
末端に反応性成分ペアの成分を有する（反応性成分ペア
の成分の一方は第一プライマーから、もう一方は第二プ
ライマーからのもの）二本鎖オリゴヌクレオチド配列が
生成するように、Ｐｔ’プライマーを用いて第二の伸張
生成物を生成させる。
二プライマーを用いることができ（第３図）、その際、
一対のプライマー（ｐｔお上びｐｔ）を用いて第一の伸
張生成物を生成させる。第一プライマーの一方（Ｐ、）
は「捕捉」プライマーであるが（すなわち、第一反応性
成分ペアの一方の成分に結合している）、もう一方の第
一プライマー（Ｐ、）はそうではない。第二「捕捉」プ
ライマーＰ、’（５″末端に第二反応性成分ペアの一方
の成分を有する）は、プライマーＰ！が溶液中に存在す
る場合にその３°末端がハイブリダイズする部位の近く
または隣（しかし、重なる合わない）の部位で第一の伸
張生成物にハイブリダイズする。各ストランドの両５゛
末端に反応性成分ペアの成分を有する（反応性成分ペア
の成分の一方は第一プライマーから、もう一方は第二プ
ライマーからのもの）二本鎖オリゴヌクレオチド配列が
生成するように、Ｐｔ’プライマーを用いて第二の伸張
生成物を生成させる。
別の態様においては、第一プライマー（Ｐ、およびＰ！
、第４図）を第一の反応性成分ペアの同じ成分に結合さ
せ、第一プライマーＰＩ′およびＰ！′は第一の反応性
成分ペアとは異なる第二の反応性成分ペアの第一成分に
結合させることができる。従って、第二の伸張生成物が
生成したときには、第４図に示す上うな各ストランドの
５゛末端に反応性成分ペアの成分を宵するハイブリッド
が生成し、これは上記のようにして固相分離により分離
し、標識することができる。この態様はもっともらしい
Ｑ様であるが、他の態様のような良好な結果は得られて
おらず、従って余り好ましいものではない。
、第４図）を第一の反応性成分ペアの同じ成分に結合さ
せ、第一プライマーＰＩ′およびＰ！′は第一の反応性
成分ペアとは異なる第二の反応性成分ペアの第一成分に
結合させることができる。従って、第二の伸張生成物が
生成したときには、第４図に示す上うな各ストランドの
５゛末端に反応性成分ペアの成分を宵するハイブリッド
が生成し、これは上記のようにして固相分離により分離
し、標識することができる。この態様はもっともらしい
Ｑ様であるが、他の態様のような良好な結果は得られて
おらず、従って余り好ましいものではない。
本発明の５番目の態様は第５図に示しである。
二本ｗ１標的配列（工程Ａ）を変性させ、得られたスト
ランドに上記手順に従って一対のプライマーをアニール
させる。しかしながら、一方のプライマーには、記号「
θ」で示される検出可能な標的が５末端に直接結合して
いる。もう一方のプライマーには、上記反応性成分ペア
の一方の成分が５゛末端に結合している。伸張生成物を
合成しく工程Ｃ）、所望の程度に増幅するために必要な
だけできるだけ多く繰り返す（工程Ｄ１第５図）。増幅
後、二本鎖伸張生成物を固相（たとえば第５図、工程Ｅ
に示す微細粒子）上に捕捉するが、該固相は該反応性成
分ペアのもう一方の成分（伸張生成物上の反応性成分ペ
アの成分と反応性）を有している。従って、反応性成分
ペアの成分を得する一方のプライマーと、直接結合した
検出可能な標識を有するもう一方のプライマーを用いる
ことにより、捕捉および直接検出を容易に行うことがで
きる。
ランドに上記手順に従って一対のプライマーをアニール
させる。しかしながら、一方のプライマーには、記号「
θ」で示される検出可能な標的が５末端に直接結合して
いる。もう一方のプライマーには、上記反応性成分ペア
の一方の成分が５゛末端に結合している。伸張生成物を
合成しく工程Ｃ）、所望の程度に増幅するために必要な
だけできるだけ多く繰り返す（工程Ｄ１第５図）。増幅
後、二本鎖伸張生成物を固相（たとえば第５図、工程Ｅ
に示す微細粒子）上に捕捉するが、該固相は該反応性成
分ペアのもう一方の成分（伸張生成物上の反応性成分ペ
アの成分と反応性）を有している。従って、反応性成分
ペアの成分を得する一方のプライマーと、直接結合した
検出可能な標識を有するもう一方のプライマーを用いる
ことにより、捕捉および直接検出を容易に行うことがで
きる。
この第５の１３様において、化学発光または蛍光標識を
用いるのが好ましい。化学発光標識をプライマーに直接
結合させるには、ホスホールアミダイト化学によりプラ
イマー合成の間に一方のプライマーの５°水酸基を第一
級脂肪族アミンと反応させることにより行うことができ
る。ついでアミンを有するプライマーをアクリジン活性
エステルと反応させてアクリジンをプライマーに結合さ
せることができる。プライマーはまた、下記実施例６に
記載するように、蛍光源（ｆ １ｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）
に直接結合させることができる。ついで、上記のごとく
いかなるプライマーもＰＣＨに用いることができる。
用いるのが好ましい。化学発光標識をプライマーに直接
結合させるには、ホスホールアミダイト化学によりプラ
イマー合成の間に一方のプライマーの５°水酸基を第一
級脂肪族アミンと反応させることにより行うことができ
る。ついでアミンを有するプライマーをアクリジン活性
エステルと反応させてアクリジンをプライマーに結合さ
せることができる。プライマーはまた、下記実施例６に
記載するように、蛍光源（ｆ １ｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）
に直接結合させることができる。ついで、上記のごとく
いかなるプライマーもＰＣＨに用いることができる。
化学発光源（ｃｈｅｍ ｉ ｌｕｍｏｐｈｏｒｅｓ）に
加えて、色原体および蛍光源を含む他の検出可能な標識
を用いることもできるが、ただしＰＣＲ手順に必要とさ
れる温度循環に標識が耐えられなければならない。
加えて、色原体および蛍光源を含む他の検出可能な標識
を用いることもできるが、ただしＰＣＲ手順に必要とさ
れる温度循環に標識が耐えられなければならない。
本発明に用いる反応物は、キットの形態で使用者に提供
される。本発明のキットには、プライマー（少なくとも
１つが反応性成分ペアの一方の成分に結合している）、
ＤＮＡポリメラーゼ、および反応性成分ペアのもう一方
の成分を有する固相が含まれる。本発明の第一の態様を
行うときには、キットには、それぞれ異なる反応性成分
ペアの成分に結合した２つのプライマー、検出可能な標
識−反応性成分ペア成分結合体、および固相結合体およ
び上記ポリメラーゼが含まれる。本発明の第二または第
四の態様を行うときには、キットには２対の「ネストプ
ライマー」が含まれ、そのうち少なくとも１つのプライ
マーには、反応性成分ペアの成分（面相に結合した該反
応性成分ペアのもう一方の成分と結合することができる
）が結合しており、ＤＮＡポリメラーゼも含まれている
。本発明の第三の＠様を行うときには、反応性成分ペア
の成分が結合した唯一っのネストプライマーを用いれば
よい。最後に本発明の第五の態様を行うときには、キッ
トには２つのプライマーが含まれ、そのうちの一方のプ
ライマーは検出可能な標識に直接結合しており、もう一
方のプライマーは反応性成分ペアの一方の成分に結合し
ている。キットにはまた固相／反応性成分ペア成分結合
体およびＤＮＡポリメラーゼが含まれる。
される。本発明のキットには、プライマー（少なくとも
１つが反応性成分ペアの一方の成分に結合している）、
ＤＮＡポリメラーゼ、および反応性成分ペアのもう一方
の成分を有する固相が含まれる。本発明の第一の態様を
行うときには、キットには、それぞれ異なる反応性成分
ペアの成分に結合した２つのプライマー、検出可能な標
識−反応性成分ペア成分結合体、および固相結合体およ
び上記ポリメラーゼが含まれる。本発明の第二または第
四の態様を行うときには、キットには２対の「ネストプ
ライマー」が含まれ、そのうち少なくとも１つのプライ
マーには、反応性成分ペアの成分（面相に結合した該反
応性成分ペアのもう一方の成分と結合することができる
）が結合しており、ＤＮＡポリメラーゼも含まれている
。本発明の第三の＠様を行うときには、反応性成分ペア
の成分が結合した唯一っのネストプライマーを用いれば
よい。最後に本発明の第五の態様を行うときには、キッ
トには２つのプライマーが含まれ、そのうちの一方のプ
ライマーは検出可能な標識に直接結合しており、もう一
方のプライマーは反応性成分ペアの一方の成分に結合し
ている。キットにはまた固相／反応性成分ペア成分結合
体およびＤＮＡポリメラーゼが含まれる。
つぎに本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらに限られるものではない。
が、本発明はこれらに限られるものではない。
一＊＊％ＪＩ（オリゴヌクレオチドの合成）β−シアノ
エチルホスホールアミダイトを用い、アプライド・バイ
オシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
）３８０ Ｂ Ｄ ＮＡシンセサイザー上にて、Ａ−Ｇ
で示す（下記第１表参照）ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ
）プライマーを合成した。結合収率を最大にするために
、３０秒間の待ち時間で結合を行った。オリゴヌクレオ
チド鎖合成が完了した後、最後のサイクルでアミノモデ
ィファイア−（Ａｍｉｎｏｍｏｄｉｆｉｅｒ）■［クロ
ンチク（ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）、パロアルト、ＣＡ］を加
え、酸化および脱保護により第一級アミン末端オリゴヌ
クレオチド鎖を得た。
エチルホスホールアミダイトを用い、アプライド・バイ
オシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
）３８０ Ｂ Ｄ ＮＡシンセサイザー上にて、Ａ−Ｇ
で示す（下記第１表参照）ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ
）プライマーを合成した。結合収率を最大にするために
、３０秒間の待ち時間で結合を行った。オリゴヌクレオ
チド鎖合成が完了した後、最後のサイクルでアミノモデ
ィファイア−（Ａｍｉｎｏｍｏｄｉｆｉｅｒ）■［クロ
ンチク（ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）、パロアルト、ＣＡ］を加
え、酸化および脱保護により第一級アミン末端オリゴヌ
クレオチド鎖を得た。
］（オリゴヌクレオチド標識）
実質的にアープイア（Ｕｒｄｅａ）らのプロトコール［
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ｌ
６ （１１）４９３７〜４９５６（１９８８）コに従い
、実施例１で得たＦＯＲプライマーを反応性成分ペアの
成分に結合させた。
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ｌ
６ （１１）４９３７〜４９５６（１９８８）コに従い
、実施例１で得たＦＯＲプライマーを反応性成分ペアの
成分に結合させた。
（注）＊ＦＩ−フルオレセイン
フルオレセインが反応性成分ペアの成分である場合（す
なわち、プライマーＣおよびＤ）には、センス（ｓｅｎ
ａｅ）プライマー（５°−ＮＨｔ −ＴＴＧＴＣＣＴＧ
ＧＴＴＡＴＣＧＣＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴＧＣＧ（ｉＣ
ＧＴＴ−３°および５°−Ｎ１１．−ＣＴＴＣＡＴＣＣ
ＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＡＴＴ
ＧＧ−３°）を室温にてホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
９，０）（１００μＱ）中のフルオレセインイソチオシ
アナート（２＋９）で１５時間処理した。過剰のフルオ
レセインは、水（１０１１２）で平衡化しておいたＮＡ
Ｐ−５カラム（ファルマシア、ビスタカウェイ、ＮＪ）
に反応混合物を通すことにより除いた。真空下に溶出液
から溶媒を除き、黄色の残渣をホルムアミド（１５０μ
ｍ２）中に集めた。フルオレセイン化オリゴヌクレオチ
ドの精製を、４０ワツトの一定電力でのスラブゲル（０
，１５ｘ４０ｃ峠上のゲル電気泳動（１２％ポリアクリ
ルアミド／８ＭＩＱ素）により行った。
なわち、プライマーＣおよびＤ）には、センス（ｓｅｎ
ａｅ）プライマー（５°−ＮＨｔ −ＴＴＧＴＣＣＴＧ
ＧＴＴＡＴＣＧＣＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴＧＣＧ（ｉＣ
ＧＴＴ−３°および５°−Ｎ１１．−ＣＴＴＣＡＴＣＣ
ＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＡＴＴ
ＧＧ−３°）を室温にてホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
９，０）（１００μＱ）中のフルオレセインイソチオシ
アナート（２＋９）で１５時間処理した。過剰のフルオ
レセインは、水（１０１１２）で平衡化しておいたＮＡ
Ｐ−５カラム（ファルマシア、ビスタカウェイ、ＮＪ）
に反応混合物を通すことにより除いた。真空下に溶出液
から溶媒を除き、黄色の残渣をホルムアミド（１５０μ
ｍ２）中に集めた。フルオレセイン化オリゴヌクレオチ
ドの精製を、４０ワツトの一定電力でのスラブゲル（０
，１５ｘ４０ｃ峠上のゲル電気泳動（１２％ポリアクリ
ルアミド／８ＭＩＱ素）により行った。
ＵＶシャドーイングによりフルオレセイン化バンドを同
定した後、プライマーを切り出し、０．１Ｍトリス、０
．５Ｍ ＮａＣ１，５ｍＭ ＥＤＴＡを用い、６０℃で
１６時間抽出した。
定した後、プライマーを切り出し、０．１Ｍトリス、０
．５Ｍ ＮａＣ１，５ｍＭ ＥＤＴＡを用い、６０℃で
１６時間抽出した。
ビオチンが反応性成分ペアの成分である場合（すなわち
プライマーＥおよびＦ）には、アンチセンス（ａｎｔｉ
ｓｅｎｓｅ）プライ？ （５’ −ＮＨＩ−ＡＧＧＧ
ＡＡＡＣＴＴＡＧＡＧＴＴＧＣＣＴＴＧＡＧＣＡＧＧＡ
ＧＴＣＧＴＧ−３°および５°−ＮＨＩ−ＧＣＧＧＴＡ
ＴＡＡＡＧＧＧＡＣＴＣＡＣＧＡＴＧＣＴＧＴＡＣＡＧ
ＡＣＴＴ〜３°）をリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，
５Ｘ１００ｔｔ（１）中に溶解し、室温にてジメチルホ
ルムアミド（ＤＭＦ）（１００μＣ）中のビオチン−（
アミノカプロイル）。
プライマーＥおよびＦ）には、アンチセンス（ａｎｔｉ
ｓｅｎｓｅ）プライ？ （５’ −ＮＨＩ−ＡＧＧＧ
ＡＡＡＣＴＴＡＧＡＧＴＴＧＣＣＴＴＧＡＧＣＡＧＧＡ
ＧＴＣＧＴＧ−３°および５°−ＮＨＩ−ＧＣＧＧＴＡ
ＴＡＡＡＧＧＧＡＣＴＣＡＣＧＡＴＧＣＴＧＴＡＣＡＧ
ＡＣＴＴ〜３°）をリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，
５Ｘ１００ｔｔ（１）中に溶解し、室温にてジメチルホ
ルムアミド（ＤＭＦ）（１００μＣ）中のビオチン−（
アミノカプロイル）。
Ｎ−ヒトミキシスクシンイミドエステル（２ｕ）で１６
時間処理した。これらのプライマーは、フルオレセイン
標識オリゴヌクレオチドについて上記と同様にしてゲル
濾過および電気泳動により精製した。
時間処理した。これらのプライマーは、フルオレセイン
標識オリゴヌクレオチドについて上記と同様にしてゲル
濾過および電気泳動により精製した。
実施例３（捕捉プライマーの単一ペア）１ｕＱ当たりＯ
かまたは１０’Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）プラスミド
ＤＮＡ分子を有するＤＮＡ溶液（ｌμＱ）を含有する２
つの反応液を標的として用い、ＬＯｍＭ）リス（ＰＨ８
，３）、５０ｍＭ ＫＣＩ。
かまたは１０’Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）プラスミド
ＤＮＡ分子を有するＤＮＡ溶液（ｌμＱ）を含有する２
つの反応液を標的として用い、ＬＯｍＭ）リス（ＰＨ８
，３）、５０ｍＭ ＫＣＩ。
２ 、５ ｍＭ ＭｇＣＩ！、２００μＭ各デオキシリ
ボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、０．０１％ゼラ
チンおよびｌ、２５単位ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含
有する緩衝液中でプライマーＤおよびＦ（第１表参照、
反応性成分ペア成分を用いて実施例２と同様にして調製
）を用いてＰＣＲを３０サイクル行った。最終的なオリ
ゴヌクレオチド濃度は、それぞれ０．ｌμＭであった。
ボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、０．０１％ゼラ
チンおよびｌ、２５単位ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含
有する緩衝液中でプライマーＤおよびＦ（第１表参照、
反応性成分ペア成分を用いて実施例２と同様にして調製
）を用いてＰＣＲを３０サイクル行った。最終的なオリ
ゴヌクレオチド濃度は、それぞれ０．ｌμＭであった。
各試料に少量の無機油を加えた。サイクルの前に試料を
９４℃で５分間加熱して変性させた。各ＰＣＢサイクル
は、１分間の変性工程（９４℃）、２分間のアニーリン
グ工程（５０℃）、および２分間の伸張工程（７２℃）
からなっていた。反応液の容量は５０μＱであった。増
幅されたＤＮＡ生成物は、）（ＢＶ表面抗原遺伝子内で
の２つのプライマー配列の物理的位置によって決定され
るように、３９２塩基対（ｂｐ）であった。各末端に反
応性成分ペアの成分を有する二重標識ＤＮＡ生成物を、
抗フルオレセインコーティング微細粒子および抗ビオチ
ン：アルカリホスファターゼ検出結合体を用いたアボッ
トＩＭｘの試作品上で行った微細粒子イムノアッセイに
より検出した。その結果は以下のようであった。
９４℃で５分間加熱して変性させた。各ＰＣＢサイクル
は、１分間の変性工程（９４℃）、２分間のアニーリン
グ工程（５０℃）、および２分間の伸張工程（７２℃）
からなっていた。反応液の容量は５０μＱであった。増
幅されたＤＮＡ生成物は、）（ＢＶ表面抗原遺伝子内で
の２つのプライマー配列の物理的位置によって決定され
るように、３９２塩基対（ｂｐ）であった。各末端に反
応性成分ペアの成分を有する二重標識ＤＮＡ生成物を、
抗フルオレセインコーティング微細粒子および抗ビオチ
ン：アルカリホスファターゼ検出結合体を用いたアボッ
トＩＭｘの試作品上で行った微細粒子イムノアッセイに
より検出した。その結果は以下のようであった。
立五玖 シグナル
０ ５１．０
１０’ ３２３．８
実施例４（第一および第二プライマーのネストペア）
ＬｕＱ当たり０．１０”、１０３．１０４、ｌＯＳまた
は１０’ＨＢＶプラスミドＤＮＡ分子を有するストック
ＤＮＡ溶液（１Ｂｇ）を含有する６つの反応液を標的と
して用い、ＨＢＶ表面抗原遺伝子特異的第一オリゴヌク
レオチドプライマーＡおよびＢを用いてＰＣＲを３０サ
イクル行った。ＰＣＲ反応条件は、オリゴヌクレオチド
の最終濃度がそれぞれｌμＭであった他は実施例３に記
載したものと同じであった。増幅されたＤＮＡ生成物は
、ＨＢＶ表面抗原遺伝子内での２つのプライマー配列の
物理的位置によって決定されるように、４９２塩基対（
ｂｐ）であった。
は１０’ＨＢＶプラスミドＤＮＡ分子を有するストック
ＤＮＡ溶液（１Ｂｇ）を含有する６つの反応液を標的と
して用い、ＨＢＶ表面抗原遺伝子特異的第一オリゴヌク
レオチドプライマーＡおよびＢを用いてＰＣＲを３０サ
イクル行った。ＰＣＲ反応条件は、オリゴヌクレオチド
の最終濃度がそれぞれｌμＭであった他は実施例３に記
載したものと同じであった。増幅されたＤＮＡ生成物は
、ＨＢＶ表面抗原遺伝子内での２つのプライマー配列の
物理的位置によって決定されるように、４９２塩基対（
ｂｐ）であった。
３０ＰＣＲサイクル完了後、各反応液（５μＱ）を標的
として用い、ＨＢＶ表面表面抗原遺伝子特異的オリゴヌ
クレオチドプライマ鉛ＣびＥ（第１表参照、反応性成分
ペア成分を用いて実施例２と同様にして調製）を用いて
ＰＣＲ（５０μｅ全反応容量）をさらに５サイクル行っ
た。プライマーＣおよびＥは、同じストランドにハイブ
リダイズすると仮定した場合に第一プライマーＡおよび
Ｂの３′末端が存在する部位の隣（しかし、重なり合わ
ない）の部位にて標的核酸配列とハイブリダイズする。
として用い、ＨＢＶ表面表面抗原遺伝子特異的オリゴヌ
クレオチドプライマ鉛ＣびＥ（第１表参照、反応性成分
ペア成分を用いて実施例２と同様にして調製）を用いて
ＰＣＲ（５０μｅ全反応容量）をさらに５サイクル行っ
た。プライマーＣおよびＥは、同じストランドにハイブ
リダイズすると仮定した場合に第一プライマーＡおよび
Ｂの３′末端が存在する部位の隣（しかし、重なり合わ
ない）の部位にて標的核酸配列とハイブリダイズする。
最終的なオリゴヌクレオチド濃度は、それぞれ１ＢＭで
あった。二本鎖ＤＮＡ分子の各末端に反応性成分ペアの
成分を有する２０３ｂｐＰＣＲ生成物を、抗フルオレセ
インコーティング微細粒子および抗ビオチン：アルカリ
ホスファターゼ検出結合体を用いたアボットＩＭＸの試
作品上で行った微細粒子イムノアッセイにより検出した
。
あった。二本鎖ＤＮＡ分子の各末端に反応性成分ペアの
成分を有する２０３ｂｐＰＣＲ生成物を、抗フルオレセ
インコーティング微細粒子および抗ビオチン：アルカリ
ホスファターゼ検出結合体を用いたアボットＩＭＸの試
作品上で行った微細粒子イムノアッセイにより検出した
。
その結果は以下のようであった。
立五玖 シグナル
０ ８、Ｏ
ｔｏ” Ｌｌ、６
１０’ １０６．７
１０’ ６１１．８
１０’ ９８４．２
１０’ １１００．４
実施例５（単一ネスト捕捉プライマー）ｌμＱ当たりＯ
かまたは１０’ＨＢＶプラスミドＤＮＡ分子を有するＤ
ＮＡ溶液（ｌμＱ）を含有する２つの反応液を標的とし
て用い、ＨＢＶ表面抗原遺伝子特異的第一オリゴヌクレ
オチドプライマ−ＡおよびＦ（第１表参照）を用いてＰ
ＣＲを３０サイクル行った。プライマーＦは、単一の反
応性成分ペア成分を用いて実施例２と同様にして調製し
た。オリゴヌクレオチドの最終濃度は、それぞれｌμＭ
であった。ＰＣＨの反応条件は、上記実施例４に記載し
たものと同一であった。
かまたは１０’ＨＢＶプラスミドＤＮＡ分子を有するＤ
ＮＡ溶液（ｌμＱ）を含有する２つの反応液を標的とし
て用い、ＨＢＶ表面抗原遺伝子特異的第一オリゴヌクレ
オチドプライマ−ＡおよびＦ（第１表参照）を用いてＰ
ＣＲを３０サイクル行った。プライマーＦは、単一の反
応性成分ペア成分を用いて実施例２と同様にして調製し
た。オリゴヌクレオチドの最終濃度は、それぞれｌμＭ
であった。ＰＣＨの反応条件は、上記実施例４に記載し
たものと同一であった。
３０ＰＣＲサイクル完了後、各反応液（５μＩ２）を標
的として用い、ＨＢＶ表面抗原遺伝子特異的オリゴヌク
レオチドプライマーＣおよびＦ（第１表参照、反応性成
分ペア成分を用いて実施例２と同様にして調製）を用い
てＰＣＲをさらに５サイクル行った。オリゴヌクレオチ
ドの最終濃度は、それぞれ１ＢＭであった。４４０ｂｐ
二重標識ＤＮＡ生成物を実施例２と同様にして検出した
。その結果は以下のようであった。
的として用い、ＨＢＶ表面抗原遺伝子特異的オリゴヌク
レオチドプライマーＣおよびＦ（第１表参照、反応性成
分ペア成分を用いて実施例２と同様にして調製）を用い
てＰＣＲをさらに５サイクル行った。オリゴヌクレオチ
ドの最終濃度は、それぞれ１ＢＭであった。４４０ｂｐ
二重標識ＤＮＡ生成物を実施例２と同様にして検出した
。その結果は以下のようであった。
立五玖 シグナル
０ ３Ｂ、２
１０’ ２２５．３
直接標識の調製：
下記反応式（化合物５を経て）に従い、４−（２−カル
ボキシ−１−エチル）−７−ヒドロキシ−２−オキソ−
２８−１−ベンゾピランを合成した。
ボキシ−１−エチル）−７−ヒドロキシ−２−オキソ−
２８−１−ベンゾピランを合成した。
下記反応式において、Ｒは水素原子を表す。
寒鼻％Ｉ６（直接標識プライマー）
簡単に説明すると、４−ブロモメチル−７−メドキンク
マリン（化合物ＩＸアルドリッチ・ケミカル）を以下の
ようにして４−（２−ビス（カルブエトキシ）−１−エ
チル）−７−メドキシー２−オキソ−２）（−１−ベン
ゾビラン（化合物２）に変換した。
マリン（化合物ＩＸアルドリッチ・ケミカル）を以下の
ようにして４−（２−ビス（カルブエトキシ）−１−エ
チル）−７−メドキシー２−オキソ−２）（−１−ベン
ゾビラン（化合物２）に変換した。
ＤＭＦ（Ｉ ０ｘ（１）中の６０％ＮａＨ無機油分散液
（６ミリモル）（２４０ｘ９）の懸濁液に、マロン酸ジ
エチル（９６１μＱ）を加えた。泡立ちが静まり懸濁液
が透明な溶液に清澄化した後、４−ブロモメチル−７−
メドキシクマリン（化合物ＩＯ１３４６１９，５ミリモ
ル）を−度に加えた。室温で４時間撹拌シタ後、ＤＭＦ
を除き、残渣を０．０１Ｍ ＨＣ１／ヘキサン間に分配
した。有機相を濃縮して真空乾燥し、ついでＥｔＯＡｃ
／ヘキサン（５０：５ｏ）（４１１２）中にできるだけ
多く回収した。
（６ミリモル）（２４０ｘ９）の懸濁液に、マロン酸ジ
エチル（９６１μＱ）を加えた。泡立ちが静まり懸濁液
が透明な溶液に清澄化した後、４−ブロモメチル−７−
メドキシクマリン（化合物ＩＯ１３４６１９，５ミリモ
ル）を−度に加えた。室温で４時間撹拌シタ後、ＤＭＦ
を除き、残渣を０．０１Ｍ ＨＣ１／ヘキサン間に分配
した。有機相を濃縮して真空乾燥し、ついでＥｔＯＡｃ
／ヘキサン（５０：５ｏ）（４１１２）中にできるだけ
多く回収した。
ＤＭＳＯ（６３！１２）中の４−（２−ビス（カルブエ
トキシ）−１−エチル）−７−メドキシー２−オキソ−
２８−１−ベンゾビラン（化合物２）（４４，８Ｒ９，
０，１３ミリモル）の溶液に、ＮａＣ１（１５１９）、
ついで水（４，６ｍＱ）を加えた。反応混合物を１８０
℃の油浴中で２．５時間撹拌し、室温に冷却した。
トキシ）−１−エチル）−７−メドキシー２−オキソ−
２８−１−ベンゾビラン（化合物２）（４４，８Ｒ９，
０，１３ミリモル）の溶液に、ＮａＣ１（１５１９）、
ついで水（４，６ｍＱ）を加えた。反応混合物を１８０
℃の油浴中で２．５時間撹拌し、室温に冷却した。
反応混合物に水（４５１σ）を加えた後、得られた乳濁
液をＥｔＯＡｃ（２Ｘ ４０１１２）で抽出した。有機
相を回転蒸発によりａ［、真空乾燥した。ヘキサン中の
２５％ＥｔＯＡｃ（３ｘ＆）中に回収した後、同じ溶媒
系を用いたフラッシュクロマトグラフィーにより４−（
２−カルブエトキシ−１−エチル）ニア−メトキシー２
−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾビラン（化合物３ Ｘ３１
、４． ｘ９）を８８％の収率で得た。
液をＥｔＯＡｃ（２Ｘ ４０１１２）で抽出した。有機
相を回転蒸発によりａ［、真空乾燥した。ヘキサン中の
２５％ＥｔＯＡｃ（３ｘ＆）中に回収した後、同じ溶媒
系を用いたフラッシュクロマトグラフィーにより４−（
２−カルブエトキシ−１−エチル）ニア−メトキシー２
−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾビラン（化合物３ Ｘ３１
、４． ｘ９）を８８％の収率で得た。
０℃のジクロロメタン（１０収）中のＡｌＣ１，１（７
２６！９．５．４ミリモル）の懸濁液にＥｔＳＨ（４ｘ
ｆ２）を加えた。懸濁液は数秒内に透明な溶液になった
。
２６！９．５．４ミリモル）の懸濁液にＥｔＳＨ（４ｘ
ｆ２）を加えた。懸濁液は数秒内に透明な溶液になった
。
ついで、ジクロロメタン（４１Ｑ）中の化合物３（２９
８貢９．１．０８ミリモル）を加ると、黄色の溶液が赤
色になった。水浴を除き、反応混合物を室温まで３時間
撹拌した。溶媒を室温下で除き、残渣を充分真空乾燥し
た。残渣をＥｔＯＡｃ中にできるだけ多く抽出し、つい
で抽出物をＥｔｏＡｃ／ヘキサン（３０／７０）を用い
たフラッシュクロマトグラフィーにかけた。長波長およ
び短波長ＵＶ活性バンドにより、４−（２−カルブエト
キシ−１−エチル）−７−ヒドロキシ−２−オキソ−２
８−１−ベンゾビラン（化合物４０７６．７ｍ９）を収
率２７％で得た。
８貢９．１．０８ミリモル）を加ると、黄色の溶液が赤
色になった。水浴を除き、反応混合物を室温まで３時間
撹拌した。溶媒を室温下で除き、残渣を充分真空乾燥し
た。残渣をＥｔＯＡｃ中にできるだけ多く抽出し、つい
で抽出物をＥｔｏＡｃ／ヘキサン（３０／７０）を用い
たフラッシュクロマトグラフィーにかけた。長波長およ
び短波長ＵＶ活性バンドにより、４−（２−カルブエト
キシ−１−エチル）−７−ヒドロキシ−２−オキソ−２
８−１−ベンゾビラン（化合物４０７６．７ｍ９）を収
率２７％で得た。
エステル（４）の試料（３６，７ｘ９）を水（１０ｘＱ
）中に懸濁し、ＮａＯＨの５０％水溶液（２５１１Ｑ）
を加えた。得られた溶液を室温で４時間撹拌した。
）中に懸濁し、ＮａＯＨの５０％水溶液（２５１１Ｑ）
を加えた。得られた溶液を室温で４時間撹拌した。
この時間の経過後にＴＣＬ（薄層クロマトグラフィーＸ
ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝３０／７０）分析にかけたとこ
ろ、出発物質は全く残留してぃなかった。
ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝３０／７０）分析にかけたとこ
ろ、出発物質は全く残留してぃなかった。
ＩＭ Ｉ−（ｃＩ（Ｉｉｆ２）を用いて混合物を酸性に
した。
した。
酸性化すると沈澱が生成し、白色固体が１時間で析出し
、た。固体を濾取した後、ＩＭ ＨＣｌで充分に洗浄し
、真空乾燥して分析的に純粋な４−（２−カルボキシ−
１−エチル）−７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−１
−ベンゾビラン（化合物５）（１４，１ｊ１９）を４３
％の収率で得た。
、た。固体を濾取した後、ＩＭ ＨＣｌで充分に洗浄し
、真空乾燥して分析的に純粋な４−（２−カルボキシ−
１−エチル）−７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−１
−ベンゾビラン（化合物５）（１４，１ｊ１９）を４３
％の収率で得た。
プライマーの直接標識：
４−（２−カルボキシ−１−エチル）−７−ヒドロキシ
−２−オキソ−２）（−１−ベンゾビラン（化合物５）
を以下のようにして４−（２−カルボキン−１−エチル
）−７−ヒドロキシ−２−オキソ−２８−１−ベンゾビ
ランＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（化合物６
）に活性化した。Ｍ ｅ ＣＮ （６ｍ１２）中の化合
物５の懸濁液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（４，７
ｘｙ、４１ミリモル）、ジシクロへキシルカルボジイミ
ド（ＤＣＣＤ８８．４１１Ｆ、４１ミリモル）および４
．４−ツメチルアミノピリジン（２Ｒｇ）を加えた。反
応混合物を室温で２４時間撹拌し、溶媒を真空下で除い
た。残渣をＤＭＦ（７５０μｇ）中に回収した。その後
、化合物６をアンチセンスプライマー、５°−ＮＨ、−
ＧＣＧＧＴＡＴＡＡＡＧＧＧＡＣＴＣＡＣＧＡＴＧＣＴ
ＧＴＡＣＡＧＡＣＴＴ−３’と直接結合した。
−２−オキソ−２）（−１−ベンゾビラン（化合物５）
を以下のようにして４−（２−カルボキン−１−エチル
）−７−ヒドロキシ−２−オキソ−２８−１−ベンゾビ
ランＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（化合物６
）に活性化した。Ｍ ｅ ＣＮ （６ｍ１２）中の化合
物５の懸濁液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（４，７
ｘｙ、４１ミリモル）、ジシクロへキシルカルボジイミ
ド（ＤＣＣＤ８８．４１１Ｆ、４１ミリモル）および４
．４−ツメチルアミノピリジン（２Ｒｇ）を加えた。反
応混合物を室温で２４時間撹拌し、溶媒を真空下で除い
た。残渣をＤＭＦ（７５０μｇ）中に回収した。その後
、化合物６をアンチセンスプライマー、５°−ＮＨ、−
ＧＣＧＧＴＡＴＡＡＡＧＧＧＡＣＴＣＡＣＧＡＴＧＣＴ
ＧＴＡＣＡＧＡＣＴＴ−３’と直接結合した。
得られた標識オリゴヌクレオチドを、反応性成分ペア成
分を含有するプライマー（実施例２参照）と同様の手順
にて１４％の収率で精製した。
分を含有するプライマー（実施例２参照）と同様の手順
にて１４％の収率で精製した。
標識プライマーのＰＣＲおよび検出：
各プライマー（１００ピコモル）およびＨＢＶ標的（４
０アトモル、すなわち４０Ｘ１０−”モル）を用いてＰ
ＣＲを行った。Ｔａｑポリメラーゼ（０゜５単位）およ
び必須ヌクレオチド三リン酸（２ナノモル）を全量１０
０μＱとなるように加えた後、反応混合物を９５℃で１
分間（変性）、５０℃で２分間（アニール）および７４
℃で２分間（プライマー伸張）のサイクルに供した。ア
ガロースゲル電気泳動により、ＰＣＨにより二本鎖生成
物ＤＮＡバンドが生成したことが示された。標的を加え
ないとＰＣＲは進行しなかった。
０アトモル、すなわち４０Ｘ１０−”モル）を用いてＰ
ＣＲを行った。Ｔａｑポリメラーゼ（０゜５単位）およ
び必須ヌクレオチド三リン酸（２ナノモル）を全量１０
０μＱとなるように加えた後、反応混合物を９５℃で１
分間（変性）、５０℃で２分間（アニール）および７４
℃で２分間（プライマー伸張）のサイクルに供した。ア
ガロースゲル電気泳動により、ＰＣＨにより二本鎖生成
物ＤＮＡバンドが生成したことが示された。標的を加え
ないとＰＣＲは進行しなかった。
捕捉および蛍光検出のための抗フルオレセインコーティ
ングラテックス微細粒子を読み出しとして用い、二重標
識ＰＣＲ生成物の自動化検出を行った。抗フルオレセイ
ンは、ＥＤＡＣを用いてカルボキシル化ラテックス微細
粒子に共有結合的に結合してあった。微細粒子で捕捉し
クマリンで標識した二本鎖生成物の蛍光検出を、ソフト
ウェアを変えたＩＭｘアナライザー（アボット・ラボラ
トリーズ、ＩＬ）のブレッドボード上で行った。クマリ
ン標識ＰＣＲプライマーは、３７８ｎｍで最大励起を、
４６０ｒｖ＋で最大放出を有していた。これらの最大値
は、ＩＭＸの波長検出範囲に充分台まれていた。該器緘
上での自動化捕捉／蛍先読み出しのためのプロトコール
は以下の通りである。炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ９
）を用い、ＰＣＲ生成物の試料（３５μｌりを１００μ
Ｑに希釈した。ついで、溶液（３５μＱ）を抗フルオレ
セイン結合微細粒子（０，１％固形分（ｖ／ｖ）、７５
μ１２）とともに３７℃で１０分間インキュベートした
。インキュベージシン溶液（１００μＱ）をガラス繊維
マトリックス上に浸漬し炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ
９）で洗浄した後、微細粒子上のシグナルを分光測光法
により測定した。その結果は以下のようであった。
ングラテックス微細粒子を読み出しとして用い、二重標
識ＰＣＲ生成物の自動化検出を行った。抗フルオレセイ
ンは、ＥＤＡＣを用いてカルボキシル化ラテックス微細
粒子に共有結合的に結合してあった。微細粒子で捕捉し
クマリンで標識した二本鎖生成物の蛍光検出を、ソフト
ウェアを変えたＩＭｘアナライザー（アボット・ラボラ
トリーズ、ＩＬ）のブレッドボード上で行った。クマリ
ン標識ＰＣＲプライマーは、３７８ｎｍで最大励起を、
４６０ｒｖ＋で最大放出を有していた。これらの最大値
は、ＩＭＸの波長検出範囲に充分台まれていた。該器緘
上での自動化捕捉／蛍先読み出しのためのプロトコール
は以下の通りである。炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ９
）を用い、ＰＣＲ生成物の試料（３５μｌりを１００μ
Ｑに希釈した。ついで、溶液（３５μＱ）を抗フルオレ
セイン結合微細粒子（０，１％固形分（ｖ／ｖ）、７５
μ１２）とともに３７℃で１０分間インキュベートした
。インキュベージシン溶液（１００μＱ）をガラス繊維
マトリックス上に浸漬し炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ
９）で洗浄した後、微細粒子上のシグナルを分光測光法
により測定した。その結果は以下のようであった。
ＰＣＲ生成物 カウント
フルオレセイン−クマリン ４１７
フルオレセインービオチン ３８８
フルオレセイン（標識なし） ３７９（注）クマリン
標識は常に存在し酵素によっては生成されないので、本
実施例ではシグナルの単位はカウントである。前記すべ
ての場合においてシグナル単位はカウント／秒／秒（こ
れは速度を表す）である。これは蛍光残基はアルカリホ
スファターゼにより生成するからであり、測定されるの
はこの酵素の速度である。
標識は常に存在し酵素によっては生成されないので、本
実施例ではシグナルの単位はカウントである。前記すべ
ての場合においてシグナル単位はカウント／秒／秒（こ
れは速度を表す）である。これは蛍光残基はアルカリホ
スファターゼにより生成するからであり、測定されるの
はこの酵素の速度である。
実施例７（器械を用いない検出）
実施例３で得た４つの異なる二本鎖ＰＣＲ生成物を、微
細粒子イムノアッセイ法による検出に供した。一つのＰ
ＣＲ生成物はハブテンを含んでおらず（プライマーＢお
よびＣ由来）、らう−っのＰＣＲ生成物はフルオレセイ
ンハブテンのみを含んでおり（プライマーＢおよびＣ由
来）、第三のＰＣＲ生成物はビオチンハブテンのみを含
んでおり（プライマーＦおよびＣ由来）、第四のＰＣＲ
生成物はフルオレセインおよびビオチンハプテンの両方
を含んでいた（プライマー〇およびＦ由来）。これらの
ＰＣＲ生成物を抗フルオレセインコーティング微細粒子
とともにインキュベートし、ＩＭＸウェッジ上に捕捉し
た。抗ビオチン：アルカリホスファターゼ結合体を加え
、ニトロブルーテトラゾリウム１５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリルポスフェートを添加することにより
結合生成物を視覚化した。フルオレセインとビオチンの
両方を含むＰＣＲ生成物を捕捉したウェッジのみが目に
見える青色を示した（第６図参照）。
細粒子イムノアッセイ法による検出に供した。一つのＰ
ＣＲ生成物はハブテンを含んでおらず（プライマーＢお
よびＣ由来）、らう−っのＰＣＲ生成物はフルオレセイ
ンハブテンのみを含んでおり（プライマーＢおよびＣ由
来）、第三のＰＣＲ生成物はビオチンハブテンのみを含
んでおり（プライマーＦおよびＣ由来）、第四のＰＣＲ
生成物はフルオレセインおよびビオチンハプテンの両方
を含んでいた（プライマー〇およびＦ由来）。これらの
ＰＣＲ生成物を抗フルオレセインコーティング微細粒子
とともにインキュベートし、ＩＭＸウェッジ上に捕捉し
た。抗ビオチン：アルカリホスファターゼ結合体を加え
、ニトロブルーテトラゾリウム１５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリルポスフェートを添加することにより
結合生成物を視覚化した。フルオレセインとビオチンの
両方を含むＰＣＲ生成物を捕捉したウェッジのみが目に
見える青色を示した（第６図参照）。
実施例８（イムノクロマトグラフィー検出）実施例７で
得た４つの異なる二本鎖ＰＣＲ生成物を、ヨーロッパ特
許出願公報ＢＰ２９９ ４２８号明細書の教示されてい
るイムノクロマトグラフィー法による検出に供した。１
５０ｍＭ ＮａＣ１，１００ｍＭ）リス、２％アルカリ
処理カゼイン、ｐＨ７，４の溶液中に抗ビオチン結合コ
ロイド状セレンを分散した懸濁液とともにＰＣＲ生成物
を約！０秒間インキュベ−１−した。この懸濁液に、下
端から約ＩＧ１ｔのところに０ 、２３１９／ ｘ（ｌ
の濃度で抗フルオレセインを垂らしておいたニトロセル
ロースのストリップ（約０．４Ｘ４．８ｃｉ＋）を浸し
た。毛管作用により懸濁液がストリップを上昇していっ
たときに、ビオチンとフルオレセインの両方がＰＣＲ生
成物上に存在する場合にのみ抗ビオチン：セレン複合体
はストリップ上に保持された（第７図参照）。
得た４つの異なる二本鎖ＰＣＲ生成物を、ヨーロッパ特
許出願公報ＢＰ２９９ ４２８号明細書の教示されてい
るイムノクロマトグラフィー法による検出に供した。１
５０ｍＭ ＮａＣ１，１００ｍＭ）リス、２％アルカリ
処理カゼイン、ｐＨ７，４の溶液中に抗ビオチン結合コ
ロイド状セレンを分散した懸濁液とともにＰＣＲ生成物
を約！０秒間インキュベ−１−した。この懸濁液に、下
端から約ＩＧ１ｔのところに０ 、２３１９／ ｘ（ｌ
の濃度で抗フルオレセインを垂らしておいたニトロセル
ロースのストリップ（約０．４Ｘ４．８ｃｉ＋）を浸し
た。毛管作用により懸濁液がストリップを上昇していっ
たときに、ビオチンとフルオレセインの両方がＰＣＲ生
成物上に存在する場合にのみ抗ビオチン：セレン複合体
はストリップ上に保持された（第７図参照）。
実施例９（分光測光検出）
実施例３で得た３つの異なるＰＣＲ生成物を、抗フルオ
レセインコーティング１７４インチポリスチレンビーズ
および抗ビオチンニアルカリホスファターゼ結合体を用
いた固相酵素イムノアッセイシステムによる検出に供し
た。これらＰＣＲ生成物の一つはビオチンハプテンのみ
を有しており、もう一つはフルオレセインハブテンのみ
を有しており、第三のものはビオチンおよびフルオレセ
インの両方を有していた。シグナルの測定は、クオンタ
ム（Ｑ ｕａ＋ｓｔｕｍ）分光光度計（アボット・ラボ
ラトリーズ）を用いて行った。その結果は、以下の通り
であった。
レセインコーティング１７４インチポリスチレンビーズ
および抗ビオチンニアルカリホスファターゼ結合体を用
いた固相酵素イムノアッセイシステムによる検出に供し
た。これらＰＣＲ生成物の一つはビオチンハプテンのみ
を有しており、もう一つはフルオレセインハブテンのみ
を有しており、第三のものはビオチンおよびフルオレセ
インの両方を有していた。シグナルの測定は、クオンタ
ム（Ｑ ｕａ＋ｓｔｕｍ）分光光度計（アボット・ラボ
ラトリーズ）を用いて行った。その結果は、以下の通り
であった。
ＰＣＲ生成物 シグナルビオチンのみ
０．１３３フルオレセインのみ
０．１６１ビオチンおよびフルオレセイン ０．
５６５
０．１３３フルオレセインのみ
０．１６１ビオチンおよびフルオレセイン ０．
５６５
第１図は、それぞれ反応性成分ペアの成分を結合した２
つのプライマーを用いた本発明の第一の実施態様を示す
模式図、 第２図は、２対のプライマー（一方のペアは他のペア内
にネストしている）を用いた（各ネストペアには反応性
成分ペアの成分が結合している）本発明の第二の実施態
様を示す模式図、 第３図は、一つのプライマーが他の２つのプライマー内
にネストしている３つのプライマーを用いた本発明の第
三の実施態様を示す模式図、第４図は、２組のネストプ
ライマーペア（一方のペアには反応性成分ペアの成分が
結合しており、もう一方のペアには第二の反応性成分ペ
アの成分が結合している）を用いた本発明の第四の実施
態様を示す模式図、 第５図は、２つのプライマー（一方のプライマーは反応
性成分ペアの成分に結合しており、もう一方のプライマ
ーは検出可能な残基に結合している）を用いた本発明の
第五の実施態様を示す模式第６図は、器械を用いない読
み出しアッセイの結果を写真で示したものであり、左上
のプローブはビオチンもフルオレセインも含まないもの
、右上のプローブはビオチンのみを含むもの、左下のプ
ローブはフルオレセインのみを含むもの、右下のプロー
ブはビオチンとフルオレセインの両方を含むものであり
、 第７図は、イムノクロマトグラフィーアッセイの結果を
写真で示したものであり、このうちストリップ０はビオ
チンもフルオレセインも含んでおらず、ストリップＦは
フルオレセインのみを含んでおり、ストリップＢはビオ
チンのみを含んでおり、ストリップＢＰはビオチンとフ
ルオレセインの両方を含んでいるものである。 第（図の（１） １転由ｅＬｉ乙利 （Ｂ） 萬 図 の 萬２図の（１） 第 図 ■ Ｃヒ 笛２図 （：２） い ：′５つ浄Ｍ（内容に変更なし２
つのプライマーを用いた本発明の第一の実施態様を示す
模式図、 第２図は、２対のプライマー（一方のペアは他のペア内
にネストしている）を用いた（各ネストペアには反応性
成分ペアの成分が結合している）本発明の第二の実施態
様を示す模式図、 第３図は、一つのプライマーが他の２つのプライマー内
にネストしている３つのプライマーを用いた本発明の第
三の実施態様を示す模式図、第４図は、２組のネストプ
ライマーペア（一方のペアには反応性成分ペアの成分が
結合しており、もう一方のペアには第二の反応性成分ペ
アの成分が結合している）を用いた本発明の第四の実施
態様を示す模式図、 第５図は、２つのプライマー（一方のプライマーは反応
性成分ペアの成分に結合しており、もう一方のプライマ
ーは検出可能な残基に結合している）を用いた本発明の
第五の実施態様を示す模式第６図は、器械を用いない読
み出しアッセイの結果を写真で示したものであり、左上
のプローブはビオチンもフルオレセインも含まないもの
、右上のプローブはビオチンのみを含むもの、左下のプ
ローブはフルオレセインのみを含むもの、右下のプロー
ブはビオチンとフルオレセインの両方を含むものであり
、 第７図は、イムノクロマトグラフィーアッセイの結果を
写真で示したものであり、このうちストリップ０はビオ
チンもフルオレセインも含んでおらず、ストリップＦは
フルオレセインのみを含んでおり、ストリップＢはビオ
チンのみを含んでおり、ストリップＢＰはビオチンとフ
ルオレセインの両方を含んでいるものである。 第（図の（１） １転由ｅＬｉ乙利 （Ｂ） 萬 図 の 萬２図の（１） 第 図 ■ Ｃヒ 笛２図 （：２） い ：′５つ浄Ｍ（内容に変更なし２
Claims (22)
- （１）試料中の標的核酸配列を増幅および検出する方法
であって、 （ａ）該標的核酸配列およびそれに相補的なストランド
にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダ
イズさせ、その際、一方のオリゴヌクレオチドプライマ
ーは反応性成分ペアの一方に結合しており、もう一方の
オリゴヌクレオチドプライマーは検出可能な残基に結合
しているかまたは検出可能な残基と反応することができ
るものであり、 （ｂ）各プライマーから各核酸ストランドに相補的な伸
張生成物を合成し、その際、各プライマーの伸張生成物
は、該伸張生成物をその相補体から分離させたときにも
う一方のプライマーから伸張生成物を合成するための鋳
型を形成するものであり、（ｃ）プライマー伸張生成物
が合成された鋳型から該プライマー伸張生成物を分離し
て一本鎖分子を生成させ、 （ｄ）上記工程（ｃ）で生成した各一本鎖を鋳型として
用いてプライマー伸張生成物を合成することによって二
本鎖生成物を生成することのできる条件下で、上記工程
（ｃ）で得られた一本鎖分子を上記工程（ａ）のプライ
マーで処理し、 （ｅ）該少なくとも１種の反応性成分ペアの一方が結合
した固相上に上記工程（ｄ）の二本鎖生成物を捕捉させ
て、該二本鎖生成物を該反応性成分ペアにより固相に結
合させ、ついで （ｆ）該固相に結合した該検出可能な残基を検出する ことを特徴とする方法。 - （２）工程（ａ）のもう一方のプライマーが検出可能な
残基に直接結合している請求項（１）記載の方法。 - （３）工程（ａ）のもう一方のプライマーが第二の反応
性成分ペアの第一成分に結合しており、該第二の反応性
成分ペアの第二成分は検出可能な残基に結合しており、
工程（ｆ）の前に該二本鎖生成物を該第二の反応性成分
ペアの第二成分で処理する工程をさらに含む請求項（１
）記載の方法。 - （４）反応性成分ペアが、抗体と抗原、ビオチンとアビ
ジン、酵素と酵素レセプター、炭水化物とレクチン、ビ
オチンと抗ビオチンおよび一対の相補的ＤＮＡ鎖よりな
る群から選ばれたものである請求項（３）記載の方法。 - （５）工程（ｃ）および（ｄ）を少なくとも１回繰り返
す請求項（１）記載の方法。 - （６）反応性成分ペアの第一成分に結合した両方のプラ
イマーが共通の第二成分と反応性の成分に結合している
請求項（３）記載の方法。 - （７）試料中の増幅された二本鎖の標的核酸配列をさら
に増幅し検出する方法であって、 （ａ）相補的な増幅標的ストランドに一対の第二オリゴ
ヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせ、その際
、各第二オリゴヌクレオチドプライマーは異なる反応性
成分ペアの第一成分に結合しており、 （ｂ）各第二プライマーから標的核酸ストランドに相補
的な伸張生成物を合成し、その際、各プライマーの伸張
生成物は、該伸張生成物をその相補体から分離させたと
きにもう一方のプライマーから伸張生成物を合成するた
めの鋳型を形成するものであり、 （ｃ）プライマー伸張生成物が合成された鋳型から該プ
ライマー伸張生成物を分離して一本鎖分子を生成させ、 （ｄ）上記工程（ｃ）で生成した一本鎖を鋳型として用
いてプライマー伸張生成物を合成することによって二本
鎖生成物を生成することのできる条件下で、上記工程（
ｃ）で得られた一本鎖分子を上記工程（ａ）のプライマ
ーで処理し、 （ｅ）該反応性成分ペアの一つの第二成分が結合した固
相上に上記工程（ｄ）の二本鎖生成物を捕捉させて、該
二本鎖生成物を該反応性成分ペアにより固相に結合させ
、 （ｆ）工程（ｅ）の前、工程（ｅ）の間、または工程（
ｅ）の後に、上記工程（ｄ）の該二本鎖生成物を該反応
性成分ペアのもう一方の検出可能な第二成分で処理し、
その際、該第二成分は該二本鎖生成物上の該第一の反応
性成分ペアと反応性で結合することができ、ついで （ｇ）該固相に結合した検出可能な第二成分を検出して
標的ストランドの増幅生成物の存否を調べることを特徴
とする方法。 - （８）一対の第一オリゴヌクレオチドプライマーを用い
たポリメラーゼ鎖反応により最初の増幅を行う請求項（
７）記載の方法。 - （９）工程（ｃ）および（ｄ）を少なくとも１回繰り返
す請求項（７）記載の方法。 - （１０）試料中の標的オリゴヌクレオチド配列を増幅お
よび検出する方法であって、標的配列とハイブリダイズ
させるためのものと標的配列の相補体とハイブリダイズ
させるためのものの２つの第一プライマーを各標的配列
に対して用いて該標的配列およびその相補体に相補的な
第一の伸張生成物を生成させ、その際、該第一の伸張生
成物は該第一プライマーから第一の伸張生成物をさらに
合成するための鋳型を形成する方法において、第一プラ
イマーと標的配列との反応中または反応後に該第一の伸
張生成物を少なくとも１つの第二プライマーで処理し、
その際、該第二プライマーは少なくとも１つの該第一の
伸張生成物と３’側の第一プライマー末端部でハイブリ
ダイズして第二の伸張生成物を生成することができ、該
第二プライマーは第一の反応性成分ペアの一方に結合し
ており、ついで第二の伸張生成物が生成したかどうかを
検出することを特徴とする方法。 - （１１）第一の伸張生成物を少なくとも２つの第二プラ
イマーで処理し、１つの第二プライマーは第一の反応性
成分ペアの一方と結合し、もう１つの第二プライマーは
第二の反応性成分プライマーの一方と結合している請求
項（１０）記載の方法。 - （１２）第一の反応性成分ペアおよび第二の反応性成分
ペアのうち少なくとも１つが検出可能な残基と反応性で
あり、該検出可能な残基を該反応性成分ペアと反応させ
該検出可能な残基を検出することにより第二の伸張生成
物を検出する請求項（１１）記載の方法。 - （１３）第二プライマーの少なくとも１つが特異的結合
成分ペアの一方と結合しており、該特異的結合成分ペア
のもう一方が結合した固相を用いて第二の伸張生成物を
分離し第二の伸張生成物が固相上に捕捉されているかど
うかを検出することによって第二の伸張生成物を検出す
る請求項（１１）記載の方法。 - （１４）第一プライマーの少なくとも１つが第二の反応
性成分ペアの一方に結合している請求項（１０）記載の
方法。 - （１５）反応性成分ペアの第一成分に結合した両方のプ
ライマーが共通の第二成分と反応性の成分に結合してい
る請求項（１１）または（１３）記載の方法。 - （１６）試料中の標的オリゴヌクレオチド配列を増幅お
よび検出する方法であって、標的配列とハイブリダイズ
させるためのものと標的配列の相補体とハイブリダイズ
させるためのものの少なくとも２つの第一プライマーを
各標的配列に対して用いて該標的配列およびその相補体
に相補的な伸張生成物を生成させ、その際、該伸張生成
物は該プライマーから伸張生成物をさらに合成するため
の鋳型を形成する方法において、該プライマーの少なく
とも１つを反応性成分ペアの第一成分に結合させ、該反
応性成分ペアの第二成分を結合させた固相を用いて該試
料から該伸張生成物を分離し、ついで該プライマーのも
う一方を検出することを特徴とする方法。 - （１７）プライマーのもう一方に検出可能な標識を直接
結合させ、固相を用いて分離した伸張生成物を該標識で
検出できるようにすることをさらに含む請求項（１６）
記載の方法。 - （１８）反応性成分ペアが、抗体と抗原、ビオチンとア
ビジン、炭水化物とレクチンおよび酵素と酵素レセプタ
ーよりなる群から選ばれたものである請求項（１６）記
載の方法。 - （１９）標的核酸配列を増幅および検出するためのキッ
トであって、 （ｉ）標的核酸配列に相補的な１つのプライマーと標的
核酸配列相補的配列に相補的なもう１つのプライマーと
の少なくとも２つのプライマー（該プライマーからプラ
イマー伸張生成物が合成され、その際、各プライマー伸
張生成物が該プライマーからさらに伸張生成物を合成す
るための鋳型を形成し、また該プライマーの少なくとも
１つに反応性成分ペアの一方が結合している）、 （ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、および （ｉｉｉ）該１つのプライマー上の該反応性成分ペアの
一方と結合し得る反応性成分ペアの一方が結合した固相 からなることを特徴とするキット。 - （２０）もう一方のプライマーが第二の反応性成分ペア
の第一成分に結合している請求項（１９）記載のキット
。 - （２１）第二の反応性成分ペアの第二成分に結合した検
出可能な残基を含む結合体をさらに含む請求項（２０）
記載のキット。 - （２２）もう一方のプライマーが検出可能な標識に結合
している請求項（１９）記載のキット。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US23864988A | 1988-08-30 | 1988-08-30 | |
| US238649 | 1988-08-30 | ||
| US39405189A | 1989-08-17 | 1989-08-17 | |
| US394051 | 1989-08-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02174698A true JPH02174698A (ja) | 1990-07-06 |
| JP3001906B2 JP3001906B2 (ja) | 2000-01-24 |
Family
ID=26931836
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1224313A Expired - Lifetime JP3001906B2 (ja) | 1988-08-30 | 1989-08-30 | 核酸配列の増幅および検出方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0357011B1 (ja) |
| JP (1) | JP3001906B2 (ja) |
| KR (1) | KR970006389B1 (ja) |
| AT (1) | ATE110789T1 (ja) |
| AU (1) | AU629845B2 (ja) |
| CA (1) | CA1336394C (ja) |
| DE (1) | DE68917834T2 (ja) |
| ES (1) | ES2063091T3 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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