JP2012024109A - 核酸増幅法による単純ヘルペスウイルス1型および2型の検出 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、サンプル中の単純ヘルペスウイルス(HSV)の存在または非存在を、HSVの糖タンパク質G(US4)遺伝子の部分を増幅することによって検出し、および本明細書で開示するようなプライマーおよび検出プライマーを使用して増幅された核酸の存在を検出する方法に関する。本発明の方法は、さらに、サンプル中のHSVのタイプ、すなわちHSV−1またはHSV−2を同定する。本明細書に記載された増幅方法で使用されうるプライマーおよび検出プライマーを含むキットも本発明に包含される。
【選択図】図1
Description
例えば、制限酵素認識部位は、SDAで起こる指数関数的増幅に必要である(米国特許第5,455,166明細書および同5,270,184号明細書(特許文献7、8)参照)。対照的に、自己持続性配列複製法(3SR)および核酸配列をベースとする増幅法(NASBA)は、5’末端近傍にポリメラーゼプロモータを含む(3SRアッセイは、Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878(非特許文献7)に開示されている。)。このプロモータは、標的結合配列に追加され、テンプレートの複数のRNAコピーの転写を指示することによって増幅反応を推進する働きをする。選択された増幅反応に使用するために、このような特化した配列を標的結合配列に連結することは、通常行われることであり、当業者に周知である。
切断部位:5’−CTCGAG−3’(配列番号54)および5’−CCCGAG−3’(配列番号55)
HSV−1糖タンパク質−G鎖置換増幅標的領域のクローニング
表1に同定されている配列番号5および配列番号6のPCR増幅プライマーを用いてHSV−1(系統ATCC:VR−539)からのDNAについてPCRを行った。これらのプライマーを使用して、HSV−1の糖タンパク質G(US4)遺伝子内の152塩基対フラグメントを増幅した。PCR増幅されたDNAをpUC19プラスミドベクター(Gibco BRL; Grand Island,NY)に挿入した。組み換えクローンをHSVIGGプラスミド#1と命名した。プラスミド#1DNAをBamH1制限酵素で消化することによって精製および線状化した。次に、DNAをQIAクイック(Qiagen,Inc.;Valencia,CA)スピンカラムを用いて精製し、蛍光ピコグリーン(登録商標)試薬で分析することによって定量した。将来の実験のために標的HSV−1DNAの希釈物を10ng/μlのヒトDNAを含む水中で調製した。特異的HSV−1系統の希釈物および各希釈物中のHSV−1検出の結果を図5に示した。「プラス」の記号はサンプル中にHSV−1の存在を示し、「マイナス」の記号は、サンプル中にHSV−1がないことを示し、疑問符はサンプルの汚染の疑いを示す。すべての系統は、サンプルO−2526を除いて、ストックの1:10希釈で陽性であった。ストックの1:1,000希釈で23系統のうち20系統が陽性であった。ストックの1:100,000希釈では、23系統のうち15系統が陽性であった。
クローニングされたHSV−1DNAの増幅
HSV−1DNAを検出するためのアッセイの最初のステップとして、実施例1で説明した標的核酸法を用いてHSV−1DNAの増幅のためのSDAシステムを開発した。DNA増幅アッセイの分析感度はクローニングされたプラスミドの希釈物を用いて評価した。8つの複製SDA反応を各標的レベルで実施した。これら8つの反応は、反応あたり100、50、25、12.5、6.25、および0コピーの二本鎖DNAに等しい。増幅は、BDプローブテックET装置(BD Diagnostic System;Sparks,MD)を使用し、各50nMのHSV1GGLB1.0およびHSV1GGRB1.0バンパープライマー、100nMのHSV1GGLP1.0左側増幅プライマー、500nMのHSV1GGRP1.0右側増幅プライマー、250nMのHSV1GGAD1.0アダプタプライマー、500nMのTBD10.2 D/R検出プライマーを用いて実施した。これらのプライマーの配列は表1に列記されている。最終のバッファ条件は、以下の通りである:143mMビシン(Bicine)、82mMKOH、25MMKiPO4、12.5%DMSO、5mM酢酸マンガン、500mM2’−デオキシシトシン−5−o−(1−チオトリホスフェート)(dCsTP)、それぞれ100nMのdATP、dGTPおよびdTTP、100ng/μlBSA、約12単位のBstポリメラーゼ、および約30単位のBsoBI制限エンドヌクレアーゼ。
SDAによる単純ヘルペス1ウイルス粒子の検出
HSV−1を検出するための本発明のプライマーおよびプローブの能力を確認するために、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC;Manassas,VA)から得たHSV−1の4系統、Quest Diagnostic(Baltimore,MD)から得た10系統、およびオハイオ州立大学(OSU)からの14の分類されていないHSVサンプルについてSDAを実施した。
SDA法の分析感度
本発明で開示されたプライマーおよびプローブを使用したHSV−1アッセイの検出限界を決定するために、クローニングした標的核酸の希釈物およびウイルス粒子の一連の希釈物についてSDA反応を実施した。ウイルス粒子のストックを電子顕微鏡(Electron Microscopy Bioservices)で数えた。16の複製を各標的レベルで試験した。
HSV−1DNAに対するSDAの特異性
HSV−2の16の系統をHSV1GGSDAシステムで試験した。HSV−2希釈物の10ミリリットルの各懸濁液を反応あたり添加した。試験した17のストックのうちの1つがHSV1GGシステムで陽性であった。結果を表5に示す。加えて、23の他の微生物を、開示された本発明の方法のプライマーおよびプローブを用いて試験した。これらの微生物には、細菌、酵母および臨床標本中で遭遇するであろう他のウイルスが含まれる。試験された微生物のいずれもHSV−1に対して陽性ではなかった。結果を表6に示す。
HSV−2糖タンパク質−GSDA標的領域のクローニング
プライマーHSV2PCRRおよびHDV2PCRLを用いてHSV−2系統のATCC VR−540からのDNAについて、69℃のアニーリング温度でPCRを実施した。これらのプライマーは、HSV−2の糖タンパク質G(US4)遺伝子の範囲内の254塩基対フラグメントを増幅する。pUC18プラスミドベクター(invitrogen)に増幅したDNAを挿入した。組み換えクローンにはpHSV2−NT#9−1という名を付けた。プラスミドDNAを、BamHI制限酵素を用いて消化することにより精製し線状化した。DNAをQIAGEN QIAクイックスピンカラムを用いて精製し、蛍光ピコグリーン(登録商標)試薬による分析で定量した。将来の実験のための標的DNAの希釈物を7ng/μlのサーモン精子DNAを含有する水中で調製した。
クローニングされたHSV−2DNAの増幅
DNA増幅アッセイの分析感度はクローニングされたプラスミドの希釈物を用いて評価した。8つの複製SDA反応をステム2.0および5.2を用いて各標的レベルで実施した。これら8つの反応は、反応あたり500、250、100、50、25、10、および0コピーの二本鎖DNAに等しい。増幅は、BDプローブテックET装置を使用し、各50nMのHSV2GGLB1.0およびHSV2GGRB1.0、100nMのHSV2GGLP1.0、500nMのHSV2GGRP2.0もしくは5.2、250nMのHSV2GGAD1.0、500nMのMPC.D/Rを用いて実施した。これらのプライマーの配列は表2に列記されている。最終のバッファ条件は、以下の通りである:71mMビシン(Bicine)、56.6mMKOH、23.9mMKPO4、15.4%DMSO、5mM酢酸マンガン、500mM2’−デオキシシトシン−5−o−(1−チオトリホスフェート)(dCsTP)、それぞれ100nMのdATP、dGTPおよびdTTP、100μg/μlBSA、約3.515単位のBstポリメラーゼ、および約30単位のBsoBI制限エンドヌクレアーゼ。
SDAによるHSV−2ウイルス粒子の検出
HSV−2を検出するための本発明のプライマーおよびプローブの能力を確認するために、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)から得たHSV−2の2系統、Quest Diagnostic(Baltimore,MD)から得た9系統、およびApaI分析によってHSV−2として分類されたオハイオ州立大学(OSU)からの5系統についてSDAを実施した。
HSV−2DNAに対するSDAの特異性
HSV−1の25の系統をHSV2GGSDAシステム1.0、2.0および5.2で試験した。HSV−1希釈物の10ミリリットルの各懸濁液を反応あたり添加した。試験した25の系統のいずれもHSV−2システムで検出されなかった。結果を表8に示す。加えて、他の微生物のパネルを、開示された本発明の方法のプライマーおよびプローブを用いて試験した。これらの微生物には、細菌、酵母および臨床標本中で遭遇するであろう他のウイルスが含まれる。試験された微生物のいずれもHSV−1に対して陽性ではなかった。結果を表9に示す。
Claims (17)
- 配列番号7〜8のいずれか1つの標的結合配列からなる配列、5’BsoBI制限エンドヌクレアーゼ認識部位、および5’非標的特異的5’テール末端配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
- 配列番号7または8の配列からなることを特徴とする請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 単純ヘルペスウイルス1型(HSV−1)標的配列を検出する方法であって、
(a)請求項1または2に記載のポリヌクレオチドをハイブリダイズする工程、および(b)HSV−1標的配列を検出する工程を含むことを特徴とする方法。 - (a)配列番号8又は7のいずれか1つの標的結合配列からなるHSV−1標的結合部位を有する配列、5’BsoBI制限エンドヌクレアーゼ認識部位、および5’非標的特異的5’テール末端配列を含む第一の増幅プライマーを用いて、HSV−1標的配列を増幅する工程、
(b)配列番号18を含むか、または配列番号9〜17のいずれか1つの標的結合配列からなるHSV−1標的結合部位を有する配列を含む第二の増幅プライマー配列を用いて、HSV−1標的配列を増幅する工程、および
(c)増幅されたHSV−1標的配列を検出する工程
をさらに含むことを特徴とする請求項3に記載の方法。 - 前記第一のプライマーが配列番号7または配列番号8の配列を含むことを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 請求項4または5に記載の方法であって、
(i) 増幅反応が鎖置換増幅(SDA)反応であるか、または
(ii)検出方法が、直接検出、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、in situ ハイブリダイゼーション、転写介在増幅手法(TMA)、自己持続性配列複製法(Self-Sustaining Sequence Replication)(3SR)、ローリングサークル増幅法(Rolling Circle Amplification)(RCA)、Qβレプリカーゼシステム、および核酸配列をベースとする増幅法(Nucleic Acid Sequence Based Amplification)(NASBA)からなる群から選択されるか、または
(iii)第一の増幅プライマーが、ヘアピン、g−カルテット、およびアッセイプローブに結合する配列から選択される配列をさらに含むか、または
(iv)第一の増幅プライマーが、好ましくは蛍光部分である検出可能な標識をさらに含むか、または
(v)第一の増幅プライマーが、制限酵素認識部位およびRNAポリメラーゼプロモータから選択される配列を含むか、または
(vi)前記方法が、内部増幅対照(IAC)を増幅する工程をさらに含む
ことを特徴とする方法。 - (i)IACが配列番号26〜27から選択されるか、または
(ii)前記方法が、増幅されたIACを検出する工程、好ましくは、増幅されたIACが増幅された標的配列とは異なる手段で検出される工程をさらに含む
ことを特徴とする請求項6に記載の方法。 - 請求項7に記載の方法であって、
(a)配列番号18を含むか、または配列番号9〜17のいずれか1つの標的結合配列からなるHSV−1標的結合部位を有する配列を含む1以上のポリヌクレオチドをハイブリダイズする工程、および
(b)HSV−1標的配列を検出する工程であって、好ましくは、前記1以上のポリヌクレオチドが、好ましくは蛍光部分である検出可能な標識をさらに含む工程
をさらに含むことを特徴とする方法。 - 請求項4または5において規定された1以上の第一のプライマーを含むことを特徴とする配列を検出するためのキット。
- 請求項9に記載のキットであって、
(I)(i)増幅プライマー、好ましくは配列番号9〜18から選択されるもの、または
(ii)バンパープライマー、好ましくは配列番号23〜25から選択されるもの、または
(iii)アダプタプライマー、好ましくは配列番号19〜22から選択されるもの、および
(iv)検出プライマー、好ましくは配列番号30〜35から選択されるもの
をさらに含むか、或いは
(II)前記キットはHSV−1標的配列を検出するためのものであり、配列番号7〜8からの1つ、および配列番号9〜18からの少なくとも1つから選択される増幅プライマーの1つ以上;および配列番号23〜25から選択されるバンパープライマーを含み、好ましくは、前記キットは、(i)配列番号19〜22から選択される1以上のアダプタプライマー;および(ii)配列番号30〜35からなる群から選択される1以上の検出プライマー;および/または(iii)配列番号26〜27から選択される1以上のIAC標的配列;および(iv)配列番号28〜29からなる群から選択される1以上のIACアダプタプライマーをさらに含む
ことを特徴とするキット。 - 請求項4または5において定義された1以上の第一のプライマーを含むことを特徴とするHSV−1を検出するための組成物。
- (I)配列番号9〜18および配列番号23〜25のいずれか1つの標的結合配列からなる1以上のプライマーをさらに含むこと、および/または
(II)(a)アダプタプライマーの3’末端に位置する標的結合配列を介して標的配列にハイブリダイズすることができるアダプタプライマー配列であって、このアダプタプライマーが5’ジェネリックテールを含み、かつこのアダプタプライマーが配列番号19〜22からなる群から選択されるもの;および
(b)検出プライマーの3’部分を介してアダプタプライマーの5’テールにハイブリダイズすることができる検出プライマー配列であって、この検出プライマー配列が5’制限酵素認識部位、ならびに、蛍光部分、放射性同位体、化学発光剤、目で見える反応生成物を生じることができる酵素基質、およびリガンドで検出可能に標識されたリガンド結合パートナーからなる群から選択される検出可能な標識を含むもの
をさらに含み、好ましくは、
(i)前記検出プライマー配列がヘアピンおよびカルテットからなる群から選択される構造部分を含むか、または
(ii)前記検出可能な標識が蛍光部分であり、好ましくはこの蛍光部分が、フルオロセイン(FAM)/ローダミン(ROX);FAM/P−(ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL);ROX/DABCYL;フルオロセインイソチオシアネート(FITC)/テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC);FITC/テキサスレッド(商標);FITC/N−ヒドロキシスクシンイミジル1−ピレンブチレート(PYB);FITC/エオシンイソチオシアネート(EITC);N−ヒドロキシスクシンイミジル1−ペンタンスルホネート(PYS)/FITC;FITC/ローダミン X;およびFITC/テトラメチルローダミン(TAMRA)からなる群から選択されるドナーおよびクエンチャー色素対を含むか、または
(iii)前記検出プライマーが配列番号30〜35からなる群から選択されるものであること;および/または
(III)増幅反応によってサンプル中のHSV−1標的配列の検出のためのプライマーを含み、このプライマーは、
(a)HSV−1標的配列にハイブリダイズできる第一の増幅プライマー配列であって、第一の増幅プライマーが配列番号7〜8からなる群から選択されるもの、
(b)HSV−1標的配列の相補体にハイブリダイズできる第二の増幅プライマー配列であって、第二の増幅プライマーが配列番号9〜18からなる群から選択されるもの、
(c)第一の増幅プライマーの上流でHSV−1標的配列にハイブリダイズできる第一のバンパープライマー配列であって、第一のバンパープライマーが配列番号23であるもの、および
(d)第二の増幅プライマーの上流でHSV−1標的配列の相補体にハイブリダイズできる第二のバンパープライマー配列であって、第二の増幅プライマーが配列番号24〜25からなる群から選択されるもの
を含むこと
を特徴とする請求項11に記載の組成物。 - サンプル中のHSV−1標的配列の存在を検出するための請求項3に記載の方法であって、前記方法が、
(a)配列番号7〜8からなる群から選択される第一の増幅プライマー、および配列番号9〜18からなる群から選択される第二の増幅プライマーにサンプルを添加し、増幅されたHSV−1核酸生成物を産生する工程、および
(b)増幅されたHSV−1核酸生成物を検出する工程であって、増幅生成物の検出がサンプル中のHSV−1の存在を示す工程
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項13に記載の方法であって、
(i)前記増幅されたHSV−1核酸生成物が、ユニバーサル検出、ゲル電気泳動、および定量的ハイブリダイゼーションからなる群から選択される方法によって検出されること、または
この方法が、
(c)配列番号23の第一のバンパープライマーおよび配列番号25または配列番号26の第二のバンパーをサンプルに添加する工程をさらに含むこと
を特徴とする方法。 - 検出工程が、
(d)第一の増幅プライマーおよび配列番号19〜22からなる群から選択されるアダプタプライマーを増幅されたHSV−1標的配列にハイブリダイズする工程であって、アダプタプライマーが第一の増幅プライマーの下流でハイブリダイズする工程、
(e)第一の増幅プライマーおよびアダプタプライマーの3’末端を伸長し、アダプタプライマー伸長生成物を産生する工程であって、第一の増幅プライマーの伸長がアダプタプライマー伸長生成物を置換する工程、
(f)第二の増幅プライマーをアダプタプライマー伸長生成物へハイブリダイズする工程、
(g)第二の増幅プライマーの3’末端を伸長し、アダプタプライマー伸長生成物およびその相補体を含む二本鎖分子を産生する工程であって、各鎖がニック可能な制限酵素部位を含む工程、
(h)二本鎖分子をニッキングし、5’部分および3’部分を造り出す工程であって、5’部分がニッキングされたテールを含み、3’部分がニッキングされた相補性アダプタプライマー伸長生成物を含む工程、
(i)ニッキングされたテールの3’末端を伸長し、ニッキングされた相補性アダプタプライマー伸長生成物を置換する工程であって、置換され、ニッキングされた相補性アダプタプライマー伸長生成物が一本鎖である工程、
(j)一本鎖相補性アダプタプライマー伸長生成物へ検出プライマーをハイブリダイズする工程であって、検出プライマーが検出可能な標識を含み、HSV−1標的配列を検出する工程、
(k)検出プライマーおよび相補性アダプタプライマー伸長生成物の3’末端を伸長し、検出プライマー伸長生成物およびその相補体を含む二本鎖検出分子を産生する工程であって、各鎖が開裂可能な制限酵素認識部位を含む工程、
(l)二本鎖検出分子を開裂する工程、および
(m)検出可能な標識を検出する工程
をさらに含むことを特徴とする請求項14に記載の方法。 - (n)配列番号26〜27からなる群から選択される内部増幅対照(IAC)標的配列を増幅する工程、
(o)第一の増幅プライマーおよび配列番号28〜29からなる群から選択されるIACアダプタプライマーをIACにハイブリダイズする工程であって、アダプタプライマーが第一の増幅プライマーの下流でハイブリダイズする工程、
(p)第一の増幅プライマーおよびIACアダプタプライマーの3’末端を伸長し、IACアダプタプライマー伸長生成物を産生する工程であって、第一の増幅プライマーの伸長がIACアダプタプライマー伸長生成物を置換する工程、
(q)IACアダプタプライマー伸長生成物へ第二の増幅プライマーをハイブリダイズする工程、
(r)第二の増幅プライマーの3'末端を伸長し、IACアダプタプライマー伸長生成物およびその相補体を含む二本鎖分子を産生する工程であって、各鎖がニック可能な制限酵素部位を含む工程、
(s)二本鎖分子をニッキングする工程、
(t)相補性IACアダプタプライマー伸長生成物のニッキングされたテール末端を伸長し、一本鎖でニッキングされた相補性アダプタプライマー伸長生成物を置換する工程、
(u)一本鎖相補性IACアダプタプライマー伸長生成物にIAC検出プライマーをハイブリダイズする工程であって、IAC検出プライマーが検出可能な標識を含み、IACを検出する工程、
(v)IAC検出プライマーおよび一本鎖相補性IACアダプタプライマー伸長生成物の3’末端を伸長し、検出プライマー伸長生成物およびその相補体を含む二本鎖検出分子を産生する工程であって、各鎖が開裂可能な制限酵素認識部位を含む工程、
(w)二本鎖検出分子を開裂する工程、および
(x)検出可能な標識を検出する工程
をさらに含むことを特徴とする請求項15に記載の方法。 - HSV−1標的配列をサンプル中で検出するための請求項3に記載の方法であって、前記方法が、
(a)配列番号7〜8からなる群から選択される配列を有する第一の増幅プライマーをHSV−1標的配列へハイブリダイズする工程、
(b)配列番号23の第一のバンパープライマーをHSV−1標的配列へハイブリダイズする工程であって、第一のバンパープライマーが第一の増幅プライマーの上流でHSV−1標的配列にハイブリダイズし、第二のバンパープライマーが第二の増幅プライマーの上流で相補性HSV−1標的配列にハイブリダイズする工程、
(c)第一のバンパープライマーおよび第一の増幅プライマーの3’末端を伸長し、第一の増幅プライマー伸長生成物を産生する工程であって、第一のバンパープライマーの伸長が第一の増幅プライマー伸長生成物を置換する工程、
(d)配列番号9〜18からなる群から選択される配列を有する第二の増幅プライマーを第一の増幅プライマー伸長生成物へハイブリダイズする工程、
(e)配列番号24〜25からなる群から選択される配列を有する第二のバンパープライマーを第一の増幅プライマー伸長生成物へハイブリダイズする工程、
(f)第二のバンパープライマーおよび第二の増幅プライマーの3’末端を伸長し、第二の増幅プライマー伸長生成物を産生する工程であって、第二のバンパープライマーの伸長が第二の増幅プライマー伸長生成物を置換する工程、
(g)第一の増幅プライマーを第二の増幅プライマー伸長生成物へハイブリダイズする工程、
(h)工程(g)の第一の増幅プライマーの3’末端を伸長し、第二の増幅プライマー伸長生成物およびその相補体を含む二本鎖分子を産生する工程であって、各鎖がニック可能な制限酵素部位を含む工程、
(i)二本鎖分子をニッキングし、5’部分と3’部分を造り出す工程であって、5’部分はニッキングされたテールを含み、3’部分はニッキングされた第二の増幅プライマー伸長生成物およびその相補体を含む工程、
(j)ニッキングされたテールの3’末端を伸長し、ニッキングされた第二増幅プライマー伸長生成物を置換する工程であって、ニッキングされた相補性第二増幅プライマー伸長生成物が一本鎖である工程、
(k)ニッキングされたテールの3’末端を伸長し、ニッキングされた相補性第二増幅プライマー伸長生成物を置換する工程であって、ニッキングされた相補性第二増幅プライマー伸長生成物が一本鎖である工程、
(l)第一の増幅プライマーおよび第二の増幅プライマーを、各一本鎖分子に別々にハイブリダイズし、工程(h)〜(k)を繰り返し、これによってHSV−1標的配列を増幅することによって2種類の一本鎖分子を指数関数的に増幅する工程、
(m)増幅されたHSV−1標的配列を検出する工程
を含むことを特徴とする方法。
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