PL225633B1

PL225633B1 - Metoda identyfikacji wirusów RNA

Info

Publication number: PL225633B1
Application number: PL401707A
Authority: PL
Inventors: Krzysztof Pyrć; Karol Stożek; Jan Potempa
Original assignee: Univ Jagiellonski
Priority date: 2012-11-22
Filing date: 2012-11-22
Publication date: 2017-05-31
Also published as: WO2014081323A3; WO2014081323A2; PL401707A1

Description

Wynalazek dotyczy metody identyfikacji wirusów RNA polegającej na wykorzystaniu krótkich 6-8 nukleotydowych elementów DNA, jako miejsc przyłączenia specyficznych starterów w reakcji PCR w reakcji odwrotnej transkrypcji oraz syntezy drugiej nici, co pozwala na dodatnie do fragmentu kwasu nukleinowego syntetycznych adapterów pozwalających na późniejszą amplifikację materiału genetycznego wirusów RNA.

W szczególności, wynalazek obejmuje zastosowanie metody do identyfikacji wirusów RNA, w tym znanych patogenów i nowych patogenów, które w związku z naturalną zmiennością nie mogą zostać wykryte metodami standardowymi.

Zakażenia wirusowe są związane z licznymi chorobami ludzkimi oraz zwierzęcymi. Jednakże, ze względu na trudności w identyfikacji wirusów oraz ich dużą zmienność, czynniki etiologiczne lic znych chorób pozostają nieznane, jak na przykład w chorobie Kawasakiego. Przykładem trudności w identyfikacji wirusów w materiale klinicznym są choroby układu oddechowego. Trwające od wielu lat badania nad tymi chorobami wciąż prowadzą do identyfikowana nowych wirusów, np. ludzkiego koronawirusa NL63 lub HKU1, ludzkiego bokawirusa, wirusa SARS lub koronawirusa EMC. Niemożność identyfikacji wynika z dużej zmienności wirusów oraz z niedoskonałego systemu detekcji.

Znana ze stanu techniki jest standardowo stosowana do amplifikacji materiału genetycznego reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) stworzona przez Mullis'a i wsp. i opisana (US nr 4 683 195). Znane są również metody pozwalające na identyfikację nieznanych wirusów. Najstarszą znaną metodą jest mikroskopia elektronowa, umożliwiająca wizualizację części wirusa w materiale zakaźnym. Jednakże, metoda ta nie pozwala na charakterystykę molekularną patogenów i w związku z tym jest stosowana jako metoda pomocnicza. Obecnie wykorzystywane metody identyfikacji znanych wirusów obejmują szereg metod, poczynając od hodowli komórkowych, poprzez testy na obecność antygenów, aż po metody molekularne, pozwalające na amplifikację kwasów nukleinowych. Do metod molekularnych można zaliczyć również metody pozwalające na identyfikację nowych wirusów lub wariantów wirusów niewykrywalnych standardowymi metodami.

W tej ostatniej grupie najbardziej obiecujące są metody pozwalające na amplifikację materiału genetycznego niezależnie od jego sekwencji oraz metody, których działanie opiera się na obecności sekwencji kwasów nukleinowych, które występują w podobnej lokalizacji w genomach wszystkich patogenów należących do danej grupy/rodziny.

Do pierwszej grupy można zaliczyć metody takie jak losowa amplifikacja, pokaz różnicowy, czy metody identyfikacji wirusów w oparciu o powszechną obecność miejsc restrykcyjnych (np. metoda VIDISCA lub SISPA). W wymienionych powyżej technikach, amplifikacja kwasów nukleinow ych nie zależy od obecności specyficznego startera. Przykładowo, w amplifikacji losowej wykorzystywane startery zawierają sekwencję losową, zdolną przyłączyć się do jakiejkolwiek matrycy, włączając w to wirusowe kwasy nukleinowe. Bardziej specyficzną metodą jest pokaz różnicowy, w którym wykorzystywane są arbitralnie wybrane startery (o ustalonej sekwencji), które amplifikują losowe fragmenty kwasów nukleinowych (WO nr 9 813 521; US nr 2003 0 725 969; Welsh 1990). Optymalizacja (wybór odpowiedniej pary starterów), pozwala na amplifikację również kwasów nukleinowych pochodzenia wirusowego. Porównanie wyników do próbki referencyjnej pozwala stwierdzić, które amplikony mogą pochodzić od patogenów. Inna metodyka stosowana jest w metodach VIDISCA oraz SISPA (WO nr 9 808 981; US nr 2005 175 997; US nr 2004 259 109; US nr 2003 175 908; van der Hoek 2004; Reyes 1991). W tym przypadku amplifikacja kwasów nukleinowych opiera się na powszechnej obecności miejsc restrykcyjnych w kwasach nukleinowych. Odpowiedni dobór enzymów restrykcyjnych (w zależności od częstości cięcia) pozwala założyć, że każda odpowiednio długa cząsteczka kwasu nukleinowego będzie zawierała wybrane miejsca restrykcji.

Po konwersji enzymatycznej RNA oraz jednoniciowego DNA do dwuniciowego DNA, kwasy nukleinowe poddawane są działaniu wybranych restryktaz. Powstałe miejsca cięcia (tzw. lepkie końce) wykorzystywane są następnie, jako miejsca przyłączenia (ligacji) syntetycznych adapterów o znanej sekwencji. Adaptery te w dalszych etapach wykorzystywane są do specyficznej amplifikacji pełnej gamy kwasów nukleinowych.

Ponownie, porównanie wyników uzyskanych dla materiału zakaźnego z wynikami uzyskanymi dla próbki referencyjnej pozwala na wybranie elementów znajdujących się wyłącznie w materiale zakaźnym. Niestety, wszystkie opisane wyżej metody są pracochłonne i czasochłonne, a do ich przePL 225 633 B1 prowadzenia niezbędny jest wysoko wykwalifikowany personel. Metody te są trudnie do wykorzystania w standardowym laboratorium diagnostycznym.

Najbardziej czułą metodą identyfikacji wirusów dostępną w sprawie techniki jest wykorzystanie starterów uniwersalnych w standardowej amplifikacji kwasów nukleinowych. W metodyce tej wykorzystuje się obecność stałych, konserwatywnych miejsc w genomach wirusów należących do pojedynczej rodziny. Wykorzystanie takich miejsc dla projektowania starterów pozwala mieć nadzieje, że w prz ypadku nieznanych wirusów fragmenty te również będą obecne i możliwa będzie amplifikacja i identyf ikacja nowych wirusów lub nowych wariantów znanych wirusów. Największą wadą tej metody jest jej ograniczona skuteczność tylko do wirusów, które posiadają identyczne elementy o długości 18-25 nukleotydów, co świadczy, że wirusy należą do danej rodziny. Pewnym udogodnieniem w tym wypadku jest metoda CODEHOP, która umożliwia wykorzystanie konserwatywnych fragmentów białek i pr ojektowanie silnie zdegenerowanych starterów (Rose 1998).

Celem metody według wynalazku jest opracowanie nowej metody identyfikacji wirusów RNA oraz jej zastosowanie. Opracowana metoda jest bardziej specyficzna w stosunku do metod pozwalających na losową amplifikację i prostsza w realizacji. Ponadto, przejawia ona szerszą specyficzność w stosunku do standardowej reakcji PCR z wykorzystaniem starterów uniwersalnych. W opracowanej metodzie modyfikacją w stosunku do standardowej reakcji PCR jest przyłączenie na etapie odwrotnej transkrypcji oraz syntezy drugiej nici DNA syntetycznych adapterów, pozwalających na późniejsza amplifikację kwasów nukleinowych.

Istotą wynalazku jest metoda identyfikacji wirusów RNA charakteryzująca się tym, że składa się z następujących etapów:

(a) oczyszczone RNA jest przepisywane na cDNA w reakcji odwrotnej transkrypcji, przy udziale startera składającego się z fragmentu DNA o sekwencji homologicznej do konserwatywnego regionu w sekwencji wirusowej mają długość 4-10 nukleotydów oraz fragmentu DNA stanowiącego adaptera o znanej sekwencji, a adapter o znanej sekwencji jest następnie wykorzystywany jako matryca do przyłączania starterów w późniejszej reakcji PCR;

(b) otrzymany w wyniku realizacji etapu (a) dupleks RNA-DNA jest trawiony enzymatycznie w celu uzyskania pojedynczej nici DNA;

(c) otrzymane w etapie (b) jednoniciowe cDNA jest enzymatycznie przepisywane na dwuniciowe DNA z wykorzystaniem enzymu pozwalającego na inicjowaną starterem syntezę DNA na matrycy DNA z wykorzystaniem startera do syntezy drugiej nici (SS) o podobnej budowie jak starter do syntezy pierwszej nici DNA (RT) o sekwencji homologicznej do konserwatywnego regionu w sekwencji wirusowej o długości 4-10 nukleotydów, a adapter o znanej sekwencji służący do amplifikacji DNA w późniejszej reakcji PCR znajduje się po jego stronie 5';

(d) otrzymane w etapie (c) dwuniciowe DNA z obu stron posiada syntetyczne fragmenty DNA o znanej sekwencji, które są wykorzystywane do amplifikacji w pierwszej reakcji PCR z wykorzyst aniem starterów o takiej samej sekwencji jak startery RT i SS lub o sekwencji homologicznej do jakiegokolwiek fragmentu starterów RT i SS;

(e) produkt otrzymany w etapie (d) jest wykorzystywany w drugiej reakcji PCR z wykorzystaniem starterów o sekwencji homologicznej do sekwencji starterów RT i SS zawierających przynajmniej 1 nukleotyd więcej od strony 3' w porównaniu do starterów RT i SS;

(f) produkt uzyskany w etapie (e) poddaje się analizie pozwalającej na ocenę wielkości uzyskanego fragmentu DNA.

Korzystnie, gdy sekwencja homologicznej do konserwatywnego regionu w sekwencji wirusowej w etapie (a) oraz etapie (c) ma długość 4-10 nukleotydów.

Równie korzystnie, gdy przy realizacji metody według wynalazku, proces kopiowania kwasu nukleinowego zachodzi w temperaturze poniżej 50°C pozwalającej na wydajne i specyficzne wiązanie się starterów do krótkich sekwencji komplementarnych w genomie wirusowym lub jego odpowiedniku w postaci jednoniciowego DNA.

Korzystnie, gdy dupleks RNA-DNA jest trawiony enzymatycznie przy użyciu RNazay H.

Równie korzystnie, gdy odległość między starterem RT, a starterem SS mieściła się w przedziale 50-300 nukleotydów.

Korzystnie, gdy reakcje kopiowania kwasu nukleinowego to odwrotna transkrypcja oraz synteza drugiej nici DNA.

PL 225 633 B1

Także korzystnie, gdy produkt uzyskany w etapie (e) poddaje się analizie pozwalającej na ocenę wielkości uzyskanego fragmentu DNA w postaci elektroforezy na żelu agarozowym lub poliakrylamidowym albo sekwencjonowaniu.

Tego typu analiza może być przeprowadzona np. przy użyciu elektroforezy na żelu agarozowym lub poliakrylamidowym albo też innej metody pozwalającej na poznanie sekwencji nukleotydowej (np. sekwencjonowanie). Wykorzystanie starterów o takiej konstrukcji jak opisane powyżej pozwala na wprowadzenie dłuższych fragmentów DNA o znanej sekwencji do sekwencji flankowanej przez s ekwencje konserwatywne, rozpoznawane przez startery. Powstałe w taki sposób fragmenty DNA mogą być następnie amplifikowane za pomocą standardowych starterów DNA komplementarnych do regionów o znanej sekwencji w reakcji PCR. Główną zaletą tej metody jest to, że miejsca konserwatywne konieczne dla namnożenia kwasu nukleinowego są znacznie krótsze niż te wykorzystywane w standardowej reakcji PCR z wykorzystaniem starterów uniwersalnych. Uzyskane amplikony mogą zostać następnie poddane analizie, przykładowo z wykorzystaniem analizy wielkości (np. na żelu agarozowym lub poliakrylamidowym) lub z wykorzystaniem sekwencjonowania.

Przedmiot wynalazku został uwidoczniony w przykładach wykonania na załączonym rysunku, na którym:

figura 1 ilustruje zasadę działania metody według wynalazku, w której odwrotna transkrypcja oraz synteza drugiej nici DNA zostały przeprowadzone na materiale wyjściowym (całkowite RNA: kolor czarny) w obecności starterów składających się z krótkich elementów homologicznych do miejsc konserwatywnych w obrębie danej grupy wirusów (odpowiednio, ciemnozielony i ciemnoniebieski dla starterów RT i SS) oraz dłuższych syntetycznych adapterów, które mogą służyć jako matryca dla późniejszej amplifikacji w reakcji PCR (odpowiednio, jasnozielone i jasnoniebieskie dla starterów RT i SS). Produkty amplifikacji w reakcji PCR mogą zostać później poddane analizie z wykorzystaniem m. in. elektroforezy w żelu agarozowym i sekwencjonowania kwasów nukleinowych;

figura 2 ilustruje przykładowe startery 5' do wykorzystania w reakcji amplifikacji RNA z wykorzystaniem opisanej metody. Kolorem niebieskim oznaczony jest region stały w starterach, służący do amplifikacji w reakcji PCR. Kolorem czerwonym oznaczony jest fragment homologiczny do matrycy w genomie wirusa (na przykładzie ludzkiego koronawirusa NL63); starter SS oraz PCR1 mogą być identyczne;

figura 3 ilustruje działanie metody według wynalazku, w postaci detekcji wirusa HCoV-NL63 i HCoV-HKU1, gdzie M oznacza znacznik wielkości, W oznacza wodę, a NL63 i HKU1: próbki kontrolne (-) i zakaźne (+) pochodzące z hodowli komórkowej;

figura 4 ilustruje czułość metody według wynalazku, gdzie analizowano rozcieńczenia wirusa zawierające 109, 108, 107, 106 oraz 105 kopii wirusowego RNA/ml; dla każdej z próbek wykorzystane zostały trzy różne polimerazy DNA na matrycy DNA: DNA polimerazę I (A), polimerazę T7 DNA (B) oraz sekwenazę (C);

figura 5 ilustruje specyficzność metody według wynalazku; analiza została przeprowadzona na próbkach zawierających różne ludzkie wirusy RNA i DNA, włączając w to ludzkiego metapneumowirusa (hMPV), ludzkiego adenowirusa (AdV), rinowirusa (RV), enterowirusa (EV), wirusy grypy typu A i B (odpowiednio IAV oraz IBV); wirusy paragrypy typu 1, 2 i 3 (odpowiednio P1, P2 i P3); oraz ludzkiego wirusa RS (RSV), gdzie M oznacza znacznik wielkości DNA;

figura 6 ilustruje identyfikację ludzkiego koronawirusa HCoV-NL63 w różnych próbkach materiału klinicznego, gdzie próbki plwociny (P), popłuczyny oskrzelowo-pęcherzykowe (BALF) oraz popłuczyny z nosa (N)) zostały zadane materiałem zakaźnym HCoV-NL63 (TCID50 400); nie zaobserwowano znaczącego zahamowania reakcji w żadnym z materiałów, jak również nie zaobserwowano pojawiania się dodatkowych prążków; W oznacza wodę, a znaki „-” oraz „+” odpowiednio, próbki nie zawierające lub zawierające ludzki koronawirus NL63.

P r z y k ł a d 1. Szczegółowy opis realizacji metody według wynalazku

W pierwszym etapie reakcji oczyszczone RNA jest przepisywane na cDNA w reakcji odwrotnej transkrypcji. W tym wypadku wykorzystuje się starter RT (starter wspólny dla reakcji odwrotnej transkrypcji i pierwszej reakcji PCR). Starter ten składa się z krótkiego fragmentu DNA, o sekwencji hom ologicznej do konserwatywnego regionu w sekwencji wirusowej oraz dłuższego adaptera o znanej s ekwencji, służącego do amplifikacji DNA późniejszej reakcji PCR (fig. 1). W tym wypadku można zastosować starter składającego się fragmentu DNA o sekwencji homologicznej do konserwatywnego regionu w sekwencji wirusowej o długości 4-10 nt oraz dłuższego adaptera o znanej sekwencji, służącego do amplifikacji DNA w późniejszej reakcji PCR o długości 16-20 nt.

PL 225 633 B1

Po przeprowadzeniu reakcji odwrotnej transkrypcji dupleks RNA-DNA jest trawiony enzymatycznie. Korzystne w tym wypadku jest zastosowanie enzymu, takiego jak RNaza H, specyficznie trawiącego nić RNA, bez uszkadzania nici DNA. Następnie, powstałe jednoniciowe cDNA jest enzymatycznie przepisywane na dwuniciowe DNA z wykorzystaniem enzymu pozwalającego na inicjowaną starterem syntezę DNA na matrycy DNA. W tej reakcji wykorzystywany jest starter do syntezy drugiej nici (SS), zaprojektowany identycznie jak starter do syntezy pierwszej nici DNA (RT). Starter ten składa się z krótkiego fragmentu DNA, o sekwencji homologicznej do konserwatywnego regionu w s ekwencji wirusowej położonego bliżej końca 5' (w oryginalnej matrycy) niż starter RT oraz dłuższego adaptera o znanej sekwencji, służącego do amplifikacji DNA późniejszej reakcji PCR (fig. 1). W tym wypadku stosuje się starter składający się z fragmentu DNA o sekwencji homologicznej do konserwatywnego regionu w sekwencji wirusowej o długości 4-10 nt oraz dłuższego adaptera o znanej sekwencji, służącego do amplifikacji DNA w późniejszej reakcji PCR o długości 16-20 nt. W tym wypadku startery RT i SS powinny być zaprojektowane w ten sposób, aby odległość między nimi nie była większa niż 300 nukleotydów i nie była mniejsza niż 50 nukleotydów.

Powstałe w reakcji odwrotnej transkrypcji i syntezy drugiej nici DNA dwuniciowe DNA z obu stron posiada syntetyczne fragmenty DNA o znanej sekwencji (adaptery), które są wykorzystywane do amplifikacji w pierwszej reakcji PCR z wykorzystaniem starterów RT i SS opisanych powyżej (lub innych starterów homologicznych do fragmentów DNA znajdujących się w obrębie adapterów). W tym wypadku są wykorzystanie adaptery na starterach RT i SS o różnej sekwencji, jednak możliwe jest zastosowanie adapterów o sekwencji identycznej. Po pierwszej amplifikacji produkt jest wykorzyst ywany w drugiej reakcji PCR (zagnieżdżony PCR) z wykorzystaniem starterów o sekwencji homologicznej do sekwencji starterów RT i SS, ale zawierających przynajmniej 1 nukleotyd więcej od strony 3' (w regionie sekwencji wirusowej) w porównaniu do starterów RT i SS. Amplifikacja w drugim etapie pozwala zwiększenie specyficzności reakcji i generację amplikonów, które mogą zostać poddane analizie na żelu lub poddane sekwencjonowaniu (fig. 1 oraz fig. 2).

P r z y k ł a d 2. Działanie metody na przykładzie koronowirusów

RNA zostało wyizolowane z próbki zawierającej cząstki wirusowe ludzkiego koronawirusa NL63 (hodowla na komórkach z małpiej nerki; linia LLC-MK2, numer ATCC: CCL-7) oraz ludzkiego koronawirusa HKU1 (hodowla na w pełni zróżnicowanych pierwotnych komórkach ludzkiego nabłonka oddechowego) za pomocą standardowego, komercyjnie dostępnego zestawu Total RNA mini kit (A & A Biotechnology) do izolacji całkowitego RNA. Czyste RNA zostało zawieszone w objętości 100 gl wody wolnej od nukleaz (Sigma Aldrich). Po izolacji, próbki byty inkubowane z DNazą (DNase Turbo, Thermo Scientific) przez okres 30 minut wystarczający do całkowitego usunięcia zanieczyszczającego DNA. W przykładzie zastosowano metodę pozwalającą na zwiększenie stężenia RNA w próbce. Po izolacji, RNA zostało strącone z wykorzystaniem trzech objętości (300 gl) izopropanolu, w obecności 30 gg glikogenu (Life Technologies). Reakcja strącania przeprowadzana była w temperaturze -20°C przez 16 godzin. Po strąceniu, próbki zostały żwirowane (12000 x g, 45 min), a uzyskane pelety przepłukane 70% alkoholem etylowym i wysuszone. Uzyskane RNA zostało rozpuszczone w 5 gl wody wolnej od nukleaz (Sigma-Aldrich). Uzyskane RNA zostało wykorzystane, jako materiał wyjściowy do reakcji.

Całe uzyskane w izolacji RNA zostało zmieszane ze 1,5 pikomola (pM) startera RT (5'-CCA AGG GAT TCC CAA CCT YCC AAC-3'), inkubowane w całkowitej objętości 6,5 gl w temperaturze 65°C przez 5 minut, schłodzone na lodzie i zmieszane z 3,5 gl roztworu zawierającego 25 jednostek odwrotnej transkryptazy MultiScribe (Life Technologies), 1 x stężony bufor dla polimerazy I (Thermo Scientific), 0,4 gl deoksyrybonukleotydy (dNTP) w stężeniu 100 milimolowym (mM), 0,2 gl dimetylosulfotlenku. Reakcja odwrotnej transkrypcji prowadzona była przez 120 minut w temperaturze 37°C, a następnie enzymy zostały inaktywowane przez podgrzanie do 85°C przez 5 minut.

Powstałe jednoniciowe DNA (10 gl) zostało wykorzystane jako matryca do syntezy drugiej nici DNA. Reakcję syntezy drugiej nici DNA przeprowadzono w tej samej probówce, bez etapu oczyszczania, ponieważ pozwala to uniknąć strat materiału. W reakcji syntezy drugiej nici DNA próbka została poddana denaturacji termicznej (95°C przez 1 min.) i schłodzona na lodzie, a następnie dodana do niej została mieszanina reakcyjna w objętości 5 gl w składzie: 0,5 jednostek RNazy H, 0,5 gl 10 x stężonego buforu dla polimerazy I (Thermo Scientific), 4,5 jednostki polimerazy I (Thermo Scientific), 0,1 gl dimetylosulfotlenku oraz 3 pM startera SS (5'-GCA AGA TCC AAT CTA GAA TGA TSA-3'). Próbki były inkubowane przez 120 minut w temperaturze 15°C, a następnie dwuniciowe DNA zostało wyizolowane z mieszaniny z wykorzystaniem mieszaniny fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (pH

PL 225 633 B1

8,0). Uzyskane DNA zostało wytrącone z wykorzystaniem 300 μΙ izopropanolu (16 h; -20°C), żwirowane (12000 x g, 45 min.), przepłukane 70% alkoholem etylowym, wysuszone w temperaturze pokojowej, a następnie zawieszone w 5 pl wody wolnej od nukleaz (Sigma-Aldrich).

Uzyskane dwuniciowe DNA zostało użyte bezpośrednio do amplifikacji z wykorzystaniem opisanych powyżej starterów RT i SS i standardowej polimerazy taq DNA. Reakcja przeprowadzona została w objętości całkowitej 20 μl z wykorzystaniem odczynnika DreamTaq PCR Master Mix (Thermo Scientific) w obecności 1 pM startera RT i 1 pM startera SS oraz 5 μl uzyskanego dwuniciowego DNA. Profil termiczny przeprowadzonej reakcji został przedstawiony w tabeli 1.

T a b e l a 1

Etap	Czas	Temperatura	Liczba cykli
Denaturacja	3 min.	95°C	1
Amplifikacja	10 s	95°C	40
30 s	56°C
15 s	72°C
Końcowe wydłużanie	10 min.	72°C	1

Po pierwszej reakcji PCR przeprowadzona została druga reakcja PCR. 5 μl produktu pierwszej reakcji PCR zostało użyte w drugiej reakcji PCR w obecności starterów 5' PCR2 (5'-AAG ATC CAA TCT AGA ATG ATS ATT-3') oraz 3' PCR2 (5'-AAG GGA TTC CCA ACC TYC CAA CA-3'). Reakcja przeprowadzona została w objętości całkowitej 20 μl z wykorzystaniem odczynnika DreamTaq PCR Master Mix (Thermo Scientific) w obecności 12 pM startera 5'PCR2 i 12 pM startera 3'PCR2. Profil termiczny reakcji został przedstawiony w tabeli 2.

T a b e l a 2

Etap	Czas	Temperatura	Ilość cykli
Denaturacja	3 min.	95°C	1
Amplifikacja 1	10 s	95°C	13
30 s	68°C-56°C*
11 s	72°C
Amplifikacja 2	10 s	95°C	30
30 s	55°C
11 s	72°C
Końcowe wydłużanie	10 min.	72°C	1

* W każdym cyklu temperatura tego etapu była obniżana o 1°C

Po reakcji cała mieszanina została nałożona na 1,5% żel agarozowy i powstałe fragmenty DNA zostały uwidocznione z wykorzystaniem barwnika DNA. Uzyskane wyniki pokazane zostały na fig. 3. Amplifikacja doprowadziła do powstania fragmentu DNA o prawidłowej wielkości (około 169 nukleotydów), zarówno dla ludzkiego koronawirusa NL63, jak i dla ludzkiego koronawirusa HKU1. Nie zaobserwowano powstawania sygnału w próbkach kontrolnych (próbki z hodowli komórkowych niezakażonych koronawirusami). Sekwencjonowanie powstałego fragmentu DNA potwierdziło jego tożsamość i wykazało, że możliwa jest specyficzna amplifikacja wirusowego RNA z wykorzystaniem niniejszej metody.

P r z y k ł a d 3. Czułość metody

W celu oceny czułości metody, stężenie RNA w próbkach wyjściowych zawierających HCoVNL63 (hodowla komórkowa) zostało oznaczone z wykorzystaniem ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (reakcja qPCR). Oznaczenie zostało przeprowadzone na wyizolowanym z materiału RNA, które zostało przepisane na cDNA w reakcji odwrotnej transkrypcji. cDNA zostało wykorzystane w reakcji z wykorzystaniem zestawu do qPCR oraz sondy znakowanej FAM (6-karboksyfluoresceina)/-TAMRA (6-karboksytetrametylorodamina) (200 nM) i specyficznych starterów (w stężeniu 900 nM

PL 225 633 B1 każdy). Sekwencje wykorzystanych starterów oraz sondy w reakcji qPCR dla ludzkiego koronawirusa NL63 podane zostały w tabeli 3. Metodyka analizy została opisana uprzednio (Milewska 2012).

T a b e l a 3

Nazwa startera/sondy	Sekwencja startera/sondy (5'-3')
Starter 5' [63NF2]	AAA CCT CGT TGG AAG CGT GT
Starter 3' [63NR1]	CTG TGG AAA ACC TTT GGC ATC
Sonda [63NP]	FAM-ATG TTA TTC AGT GCT TTG GTC CTC GTG AT-TAMRA

Reakcja została przeprowadzona na aparacie do qPCR (7500fast) z wykorzystaniem poniższego profilu termicznego (tabela 4).

T a b e l a 4

Etap	Czas	Temperatura	Ilość cykli
Denaturacja	10 min.	92°C	1
Amplifikacja	15 s	92°C	40
1 min.	60°C

Po oznaczeniu stężenia wirusowego RNA w badanych próbkach, przygotowane zostały rozcieńczenia zawiesiny cząstek wirusowych o stężeniach od 109, 108, 107, 106 oraz 105 kopii wirusowego RNA/ml. Próbki te zostały wykorzystane jako matryca w analizie. Oznaczenie przeprowadzone zostało zgodnie z opisem podanym w przykładzie 2, z tą różnicą, że zostały wykorzystane trzy różne polimerazy DNA na matrycy DNA: DNA polimeraza I (A), polimeraza T7 DNA (B) oraz sekwenaza (C). Uzyskane wyniki przedstawione zostały na fig. 4, gdzie widać, że zastosowanie polimerazy I (A) oraz polimerazy T7 (B) pozwoliło uzyskać wyższą czułość niż sekwenaza (C).

P r z y k ł a d 4. Specyficzność metody

W celu oceny specyficzności metody według wynalazku, zestaw starterów opisanych w przykładzie 2 został wykorzystany w analizie przeprowadzonej na materiale zakaźnym zawierającym różne wirusy RNA i DNA. Analiza została przeprowadzona zgodnie z opisem zamieszczonym w przykładzie 1 oraz przykładzie 2 z wykorzystaniem jako matrycy stężonego RNA wyizolowanego z próbek z hodowli komórkowych zakażonych ludzkim metapneumowirusem (hMPV), adenowirusem (Adv), rinowirusem (RV), wirusami grypy A i B (odpowiednio IAV i IBV), wirusami paragrypy 1, 2, 3 (odpowiednio P1, P2 oraz P3) oraz wirusem RS (RSV), komórek kontrolnych (eon) oraz wody (W). Zgodnie z fig. 5, nie zaobserwowano reaktywności krzyżowej, tj. nie powstały produkty o identycznej masie lub ilości dla żadnego z zastosowanych patogenów ani dla próbek kontrolnych. Amplifikacja wirusów HCoV-NL63 oraz HCoV-HKU1 doprowadziła do powstania produktu o pożądanej wielkości. Wykazuje to, że opracowana metoda jest wysoce specyficzna.

P r z y k ł a d 5. Działanie metody w materiale klinicznym

Opisana metoda została zaprojektowana w celu identyfikacji wirusowego RNA także w próbkach klinicznych. W związku z tym analiza została przeprowadzona na różnych próbkach klinicznych negatywnych w kierunku koronawirusów, włączając w to plwocinę (P), popłuczyny oskrzelowo-pęcherzykowe (BALF) oraz popłuczyny z nosa (N), zadane materiałem zakaźnym pochodzącym z hodowli komórkowej (miano końcowe TCID50 wynosiło 400, co w warunkach zakażenia in vitro odpowiada M.O.I. około 0,005). Analiza została przeprowadzona zgodnie z opisem zawartym w przykładzie 1 oraz przykładzie 2. Produkty amplifikacji zostały poddane analizie na żelu agarozowym, którego zdjęcie pokazane zostało na fig. 6. Nie zaobserwowano zahamowania reakcji w próbkach klinicznych.

Bibliografia

1. Milewska, Ciejka J. et al. (2012) Antiviral research, DOI 10.1016/j.antiviral. 2012 11 006).

2. Reyes G., R., Kim J., P. (1991). Mol. Cell. Probes, 5 (6): 473-81.

3. Rose T., M., Schultz E., R., Henikoff J., G., Pietrokovski S., McCallum C., M., Henikoff S. (1998). Nucleic Acids Res, 26 (7): 1628-35.

4. van der Hoek L., Pyre K. et al. (2004). Nat. Med., 10 (4): 368-73.

5. Welsh J., McClelland M. (1990). Nucleic Acids Res., 18 (24): 7213-8.

Claims

1. Metoda identyfikacji wirusów RNA, znamienna tym, że składa się z następujących etapów:

(f) produkt uzyskany w etapie (e) poddaje się analizie pozwalającej na ocenę wielkości uzysk anego fragmentu DNA.

2. Metoda według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencja homologicznej do konserwatywnego regionu w sekwencji wirusowej w etapie (a) oraz etapie (c) ma długość 4-10 nukleotydów.

3. Metoda według zastrz. 1, znamienna tym, że proces kopiowania kwasu nukleinowego zachodzi w temperaturze poniżej 50°C pozwalającej na wydajne i specyficzne wiązanie się starterów do krótkich sekwencji komplementarnych w genomie wirusowym, lub jego odpowiedniku w postaci jednoniciowego DNA.

4. Metoda według zastrz. 1, znamienna tym, że dupleks RNA-DNA jest trawiony enzymatycznie przy użyciu RNazy H.

5. Metoda według zastrz. 1, znamienna tym, że odległość między starterem RT a starterem SS mieści się w przedziale 50-300 nukleotydów.

6. Metoda według zastrz. 1, znamienna tym, że reakcje kopiowania kwasu nukleinowego to odwrotna transkrypcja oraz synteza drugiej nici DNA.

7. Metoda według zastrz. 1, znamienna tym, że produkt uzyskany w etapie (e) poddaje się analizie pozwalającej na ocenę wielkości uzyskanego fragmentu DNA.