JP4311003B2 - 原核生物の遺伝子発現解析方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子発現解析の方法に関し、特に、原核生物についての遺伝子発現解析の方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、真核生物については、遺伝子発現の解析方法が知られている。即ち、真核生物の細胞からmRNAを抽出し、mRNAからcDNAを合成する。そして、cDNAを加工し、遺伝子発現解析に利用する方法である。例えば、特許文献１に開示された方法が挙げられる。
【０００３】
【特許文献１】
国際公開 ＷＯ ０２／４８３５２ Ａ１
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、原核生物の遺伝子発現解析をする場合、原核生物のmRNAは、ポリＡ配列を持たないため、従来の方法では、遺伝子発現解析を行うことができなかった。
【０００５】
本発明はかかる現状に鑑みてなされたものであって、原核生物について容易に遺伝子発現解析をすることができる原核生物の遺伝子発現解析方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段、作用及び効果】
その解決手段は、原核生物の細胞からmRNAを抽出するmRNA抽出工程と、上記mRNAの3'末端にポリＡを付加するポリＡ付加工程と、上記ポリＡが付加されたmRNAからcDNAを合成するcDNA合成工程と、上記cDNAから一端に第１アダプター配列を有し他端に第２アダプター配列を有するアダプター付きcDNA断片を作成するcDNA加工工程と、上記アダプター付きcDNA断片について、上記第１アダプター配列に相補的な配列を有する第１プライマーと、上記第２アダプター配列に相補的な配列を有する第２プライマーとを用いて、PCR反応を行う第１PCR工程と、上記第１PCR工程で増幅されたcDNA断片について電気泳動を行う電気泳動工程と、上記電気泳動の結果に基づいて、目的のcDNA断片を回収するcDNA断片回収工程と、を備え、前記mRNA抽出工程は、前記原核生物の細胞から全RNAを抽出する工程と、16SrRNAの一部に相補的な配列を有する第１ヌクレオチドを上記16S rRNAにハイブリダイズさせると共に、23S rRNAの一部に相補的な配列を有する第２ヌクレオチドを23S rRNAにハイブリダイズさせる工程と、上記第１ヌクレオチドのうち、上記16S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的である配列を有する第３ヌクレオチドが付加された第１タグ物質を、上記16S rRNAと上記第１ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせると共に、上記第２ヌクレオチドのうち、上記23S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的である配列を有する第４ヌクレオチドが付加された第２タグ物質を、上記23S rRNAと上記第２ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせる工程と、上記全RNAから、上記16S rRNAと上記第１ヌクレオチドと上記第３ヌクレオチドが付加された上記第１タグ物質との結合物を除去すると共に、上記23S rRNAと上記第２ヌクレオチドと上記第４ヌクレオチドが付加された上記第２タグ物質との結合物を除去する工程と、を有し、前記cDNA合成工程は、前記cDNAを合成すると共に上記cDNAの5'末端にタグ物質を付加し、前記cDNA加工工程は、上記cDNAを第１制限酵素で切断する第１切断工程と、上記タグ物質に高親和性を有する高親和性物質に結合させることにより、上記タグ物質を有するcDNA断片を回収する第１回収工程と、上記タグ物質を有するcDNA断片に、上記第１制限酵素の切断部位の配列に相補的な配列を有する第１アダプター配列を結合させる第１アダプター結合工程と、上記第１アダプター配列が結合されたcDNA断片を第２制限酵素で切断する第２切断工程と、上記高親和性物質に結合させることにより、上記タグ物質を有するcDNA断片を除去し、上記タグ物質を有しないcDNA断片を回収する第２回収工程と、上記タグ物質を有しないcDNA断片に、上記第２制限酵素の切断部位の配列に相補的な配列を有する第２アダプター配列を結合させる第２アダプター結合工程と、を有し、前記電気泳動工程は、ゲル電気泳動を行い、前記cDNA断片回収工程は、ゲルから目的の前記cDNA断片を含むゲルを切り出し、当該cDNA断片を回収し、前記cDNA断片回収工程後、回収した前記cDNA断片をプラスミドベクターに連結し、組換え体プラスミドを形成する連結工程と、上記組換え体プラスミドを大腸菌に導入する導入工程と、を備えることを特徴とする原核生物の遺伝子発現解析方法である。
【０００７】
本発明によれば、まず、原核生物の細胞からmRNAを抽出する。その後、抽出したmRNAの3'末端にポリＡテイルを付加する。そして、このポリＡテイルを利用して、mRNAからcDNAを合成する。次に、cDNA加工工程において、cDNAから一端に第１アダプター配列を有し他端に第２アダプター配列を有するアダプター付きcDNA断片を作成する。その後、このアダプター付きcDNA断片に対して、第１アダプター配列に相補的な配列を有する第１プライマーと、第２アダプター配列に相補的な配列を有する第２プライマーとを用いて、PCR反応を行う。次に、PCRで増幅されたcDNA断片について電気泳動を行う。そして、この電気泳動の結果に基づいて、目的のcDNA断片を回収し、遺伝子発現解析に利用する。
【０００８】
このような方法では、細胞から抽出したmRNAにポリＡを付加するので、これを利用することで容易にcDNAを合成することができる。従って、原核生物であっても、その遺伝子発現解析を容易に行うことができる。
さらに、cDNAから両端にアダプター配列を持つcDNA断片を作成し、これらのアダプター配列に相補的な配列を有するプライマーセットを用いてPCR反応を行うので、cDNA断片を多量に増幅することができる。従って、cDNA断片の群の中に存在する目的のcDNA断片が低濃度であっても、それを大幅に増幅することができ、電気泳動においてそれを容易に検出することができる。また、後述するように、第１，第２プライマーを適宜選択することにより、両端にアダプター配列を持つcDNA断片群の中から、一部のcDNA断片だけを選択的に増幅することができるため、遺伝子発現解析をより容易に行うことができる。
【０００９】
ここで、アダプター付きcDNA断片は、一端に第１アダプター配列を有し他端に第２アダプター配列を有するものであれば、いかなるものであってよい。即ち、このcDNA断片の群は、抽出に用いた細胞で発現されたほとんどすべての遺伝子が含まれる群であっても、その発現された遺伝子の一部だけが含まれる群であってもよい。また、このcDNA断片は、全長cDNAの両端にアダプター配列が付いたものでも、全長cDNAの一部分をなす断片の両端にアダプター配列が付いたものでもよい。また、第１アダプター配列及び第２アダプター配列は、それぞれいかなる塩基配列からなるものであっても構わないが、後に行うPCRの効率等を考慮して設計されたものであるのが好ましい。即ち、これらのアダプター配列がそれぞれ15塩基前後であると、安定したPCR反応を行うことができ、効率よくcDNA断片を増幅することができる。
【００１０】
第１プライマーは、第１アダプター配列に相補的な配列を有するものであれば、いかなるものであってもよい。ここでいう相補的な配列とは、第１アダプターに対し100％相補的な配列に限られず、PCR反応においてcDNA断片を増幅できる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。また、第１プライマーは、第１アダプター配列に相補的な配列のみからなるものに限られず、第１アダプター配列に相補的な配列に、さらに他の配列が繋がったものであってもよい。また、第１プライマーは、第１アダプター配列全体に対応するものに限られず、第１アダプター配列の一部に対応するものでもよい。
【００１１】
同様に、第２プライマーは、第２アダプター配列に相補的な配列を有するものであれば、いかなるものであってもよい。ここでいう相補的な配列も、第２アダプターに対し100％相補的な配列に限られず、PCR反応においてcDNA断片を増幅できる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。また、第２プライマーも、第２アダプター配列に相補的な配列のみからなるものに限られず、第２アダプター配列に相補的な配列に、さらに他の配列が繋がったものであってもよい。また、第２プライマーは、第２アダプター配列全体に対応するものに限られず、第２アダプター配列の一部に対応するものでもよい。
【００１２】
なお、これらのプライマーとして、それぞれ、その3'末端に任意の2塩基配列であるNNを有するものを利用することができる。ここで使用される「任意の2塩基配列であるNN」は、A、T、G、Cから任意に選択される配列である。ここで、各任意の配列を2塩基としたのは、当該方法の簡便性と解析精度を考慮した結果である。つまり、各任意の配列を2塩基とすることにより、256種類のプライマーセットが得られるため、cDNA断片の群を256種類の群に分類することができる。その結果、１つの群には、解析が容易な比較的少ない種類のcDNA断片が含まれるようになる。なお、この任意の2塩基配列NNを、一方のプライマーまたは両方のプライマーについて3塩基以上とすることも可能である。それによってプライマーの種類が増え、プライマーセットを1024種類や4096種類とすることができる。
【００１３】
次に、その他一般にPCR反応で用いられる種々の試薬について説明する。
DNAポリメラーゼは、PCR反応においてDNA鎖を変性させる際の高温に短時間加熱されても永久的には不活性化されず、しかも、高温における活性を有するものが好適である。例えば、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、メタノサーマス・フェルビドゥス（Methanothermus fervidus）、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）、T.フラブス（T.flavus）、T.ラクテウス（T.lacteus）、T.ルベンス（T.rubens）、T.ルバー（T.ruber）などの高熱菌由来のDNAポリメラーゼや、デスルフロコッカス・モビリス（Desulfurococcus mobilis）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィルクム（Methanobacterium thermoautotrophilcum）、スルホロブス・ソルファタリクス（Sulfolobus solfataricus）、S.アシドカルダリウス（S.acidocaldarius）、サーモプラスマ・アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum）、ピロコッカス・コダカラエンシス（Pyrococcus kodakaraensis KOD1株）などの高熱性古細菌由来のDNAポリメラーゼなどが挙げられる。これらのうち、入手容易性等の理由から、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）由来のDNAポリメラーゼ（Taq DNAポリメラーゼ）、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来のDNAポリメラーゼ、あるいは、ピロコッカス・コダカラエンシス（Pyrococcus kodakaraensis KOD1株）由来のDNAポリメラーゼを利用するのが好ましい。
【００１４】
さらに、PCR反応液には、DNAポリメラーゼによる核酸増幅前の活性を阻害するために、DNAポリメラーゼに特異的な抗体を混合してもよい。この抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え法により製造された抗体、化学的または組換え法により製造された抗体フラグメント（例えば、Fabフラグメント）が挙げられる。これらのうち、モノクローナル抗体を用いるのが特に好ましい。例えば、Taq DNAポリメラーゼに対する公知のモノクローナル抗体は、約20℃〜40℃においてTaq DNAポリメラーゼの酵素活性を阻害することができると共に、PCRの熱的サイクルにおける高温によって不活性化される。
【００１５】
また、PCR反応は、一般に、4種類のdNTP、即ち、dATP、dCTP、dGTP及びdTTPの存在化において行う。
さらに、PCR反応は、一般に、適当な緩衝剤を含む反応液中で行われる。効率よく核酸を増幅させるためである。緩衝液は、使用するDNAポリメラーゼ等により、反応の最適条件を得るため適宜変更することができる。例えば、pHを適当に調整したトリス系の緩衝液に、塩化カリウムや塩化マグネシウムを加えた緩衝液を利用することができる。
また、PCR反応液には、5％〜10％のDMSOと1％〜2％のベタインを添加してもよい。鋳型DNAとなるcDNA断片が二字構造を有する場合に産物が増幅されにくいという問題を、最小限に留める効果を有するものである。
【００１６】
電気泳動工程では、アクリルアミドゲル電気泳動やアガロースゲル電気泳動など、公知の平板ゲル電気泳動などにより、cDNA断片（PCR産物）を電気泳動し、cDNA断片を分画することができる。また、キャピラリーカラムを用いた電気泳動を利用することもできる。これらの電気泳動には、公知の電気泳動装置を利用すればよい。
【００１７】
cDNA断片回収工程は、電気泳動の結果に基づいて目的とするcDNA断片を回収する工程であれば、いかなる方法を利用することもできる。
例えば、標識物質を検出することができるDNAシークエンサーにcDNA断片を供試して電気泳動工程を行い、その解析結果から、回収するcDNA断片を決定する。次に、再度同一サンプルを電気泳動して、目的とするcDNA断片が検出されたときに、その部分のゲルを切り出し、そこから当該cDNA断片を回収する方法が挙げられる。
また、ゲル電気泳動後、標識物質を検出することができるスキャナー上にゲルを載置し、その解析結果から回収するcDNA断片を決定する。そして、その部分のゲルを切り出し、そこから当該cDNA断片を回収する方法が挙げられる。
【００１８】
【００１９】
原核生物においては、前述したようにmRNAにポリＡテイルがないため、このポリＡテイルを利用して抽出した全RNAからmRNAを精製する方法を採ることができない。
これに対し、本発明のmRNA抽出工程では、まず、原核生物の細胞から全RNAを抽出する。そして、抽出した全RNAに対し、16S rRNAの一部に相補的な配列を有する第１ヌクレオチドを16S rRNAにハイブリダイズさせると共に、23S rRNAの一部に相補的な配列を有する第２ヌクレオチドを23S rRNAにハイブリダイズさせる。その後、第１ヌクレオチドのうち、16S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的な配列を有する第３ヌクレオチドが付加された第１タグ物質を、16S rRNAと第１ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせる。また、第２ヌクレオチドのうち、23S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的な配列を有する第４ヌクレオチドが付加された第２タグ物質を、23S rRNAと第２ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせる。その後、全RNAから、16S rRNAと第１ヌクレオチドと第３ヌクレオチドが付加された第１タグ物質との結合物を除去すると共に、23S rRNAと第２ヌクレオチドと第４ヌクレオチドが付加された第２タグ物質との結合物を除去する。
このような方法によれば、全RNAから、全RNAの中に多量に存在する16S rRNAと23S rRNAの大部分を除去することができる。従って、mRNAを容易により高純度に精製することができる。
【００２０】
ここで、第１ヌクレオチドは、16S rRNAの一部に相補的な配列を有し、かつ、第３ヌクレオチドに相補的な配列を有するものであれば、いかなるものであってもよい。従って、16S rRNAの一部に相補的な配列と第３ヌクレオチドに相補的な配列以外の配列を有していても構わない。ここでいう16S rRNAの一部に相補的な配列とは、16S rRNAの一部に対し100％相補的な配列に限られず、適当な条件下で16S rRNAにハイブリダイズできる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。また、第３ヌクレオチド相補的な配列も、第３ヌクレオチドに対し100％相補的な配列に限られず、適当な条件下で第３ヌクレオチドにハイブリダイズできる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。また、第１ヌクレオチドのうち、第３ヌクレオチドに相補的な配列は、第３ヌクレオチド全体に対応するものに限られず、第３ヌクレオチドの一部に対応するものでもよい。
【００２１】
同様に、第２ヌクレオチドは、23S rRNAの一部に相補的な配列を有し、かつ、第４ヌクレオチドに相補的な配列を有するものであれば、いかなるものであってもよい。従って、23S rRNAの一部に相補的な配列と第４ヌクレオチドに相補的な配列以外の配列を有していても構わない。ここでいう23S rRNAの一部に相補的な配列も、23S rRNAの一部に対し100％相補的な配列に限られず、適当な条件下で23S rRNAにハイブリダイズできる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。また、第４ヌクレオチド相補的な配列も、第４ヌクレオチドに対し100％相補的な配列に限られず、適当な条件下で第４ヌクレオチドにハイブリダイズできる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。また、第２ヌクレオチドのうち、第４ヌクレオチドに相補的な配列は、第４ヌクレオチド全体に対応するものに限られず、第４ヌクレオチドの一部に対応するものでもよい。
【００２２】
一方、第３ヌクレオチドは、第１ヌクレオチドのうち、16S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的な配列を有するものであれば、いかなるものであってもよい。従って、第１ヌクレオチドの一部に相補的な配列以外の配列を有していても構わない。ここでいう第１ヌクレオチドの一部に相補的な配列も、前述したように、第１ヌクレオチドに対し100％相補的な配列に限られず、適当な条件下で第１ヌクレオチドにハイブリダイズできる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。
【００２３】
同様に、第４ヌクレオチドは、第２ヌクレオチドのうち、23S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的な配列を有するものであれば、いかなるものであってもよい。従って、第２ヌクレオチドの一部に相補的な配列以外の配列を有していても構わない。ここでいう第２ヌクレオチドの一部に相補的な配列も、前述したように、第２ヌクレオチドに対し100％相補的な配列に限られず、適当な条件下で第２ヌクレオチドにハイブリダイズできる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。
【００２４】
タグ物質は、その物質の性質を利用することで、全RNAの中からタグ物質を含む結合物を除去できるものであれば、いずれの物質を利用することもできる。例えば、マグネットビーズが挙げられる。これをタグ物質に利用すれば、マグネットスタンド等を利用してマグネットビーズを沈降させることで、タグ物質を含む結合物のみを沈降させ、除去することができる。
【００２５】
【００２６】
【００２７】
【００２８】
さらに、本発明によれば、cDNA合成工程において、cDNAを合成すると共にcDNAの5'末端にタグ物質を付加しておく。
そして、cDNA加工工程において、まず、cDNAを第１制限酵素で切断する。その後、タグ物質に高親和性を有する高親和性物質に結合させることにより、タグ物質を有するcDNA断片を回収し、タグ物質を有しないcDNA断片を除去する。即ち、cDNAの5'末端側（PolyT末端側）のcDNA断片を回収し、3'末端側のcDNA断片を除去する。その後、この回収されたcDNA断片に、第１制限酵素の切断部位の配列に相補的な配列を有する第１アダプター配列を結合させる。
あるいは、cDNAを第１制限酵素で切断した後、cDNA断片に、第１制限酵素の切断部位の配列に相補的な配列を有する第１アダプター配列を結合させる。その後、タグ物質に高親和性を有する高親和性物質に結合させることにより、タグ物質を有するcDNA断片を回収し、タグ物質を有しないcDNA断片を除去する。
【００２９】
次に、第１アダプター配列が結合されたcDNA断片を第２制限酵素で切断する。その後、高親和性物質に結合させることにより、今度は、タグ物質を有するcDNA断片を除去し、タグ物質を有しないcDNA断片を回収する。即ち、第１アダプターが結合された側のcDNA断片を回収し、第１アダプターがない側のDNA断片を除去する。その後、この回収されたcDNA断片に、第２制限酵素の切断部位の配列に相補的な配列を有する第２アダプター配列を結合させる。
あるいは、cDNA断片を第２制限酵素で切断した後、cDNA断片に、第２制限酵素の切断部位の配列に相補的な配列を有する第２アダプター配列を結合させる。その後、高親和性物質に結合させることにより、タグ物質を有するcDNA断片を除去し、タグ物質を有しないcDNA断片を回収する。
【００３０】
このようにすれば、一端に第１アダプター配列を有し他端に第２アダプター配列を有するアダプター付きcDNA断片を容易に作成することができる。また、このようにして作成されたcDNA断片の群は、細胞で発現されたほとんど全ての遺伝子、即ち、公知の遺伝子も未知の遺伝子も同様に、その群の中に含まれるようにすることが可能である。従って、遺伝子発現解析において有効に活用することができる。
【００３１】
なお、本発明において、第１回収工程で利用する高親和性物質は、第１回収工程においてタグ物質に結合させてもよいが、例えば、第１切断工程前に予めタグ物質に結合させておいてもよい。
また、第２回収工程で利用する高親和性物質も、第２回収工程においてタグ物質に結合させてもよいが、例えば、第２切断工程前に予めタグ物質に接合させておいてもよい。
【００３２】
ここで、タグ物質と高親和性物質とは、互いに高親和性をもって特異的に結合することが可能な結合対を構成する物質であれば、いずれを利用することもできる。
また、制限酵素とは、一般的に、制限エンドヌクレアーゼとも称される酵素であり、特定の配列において二本鎖DNAを加水分解し切断する酵素である。上記の方法においては、適切な断片を得るために２種類の制限酵素（第１制限酵素及び第２制限酵素）を組み合わせて使用する。使用する制限酵素は、cDNA断片を識別可能な長さを有する断片に切断することが可能なものが好ましい。また、合成されたcDNA断片のより多くを、好ましくは、ほとんど全てを切断するような酵素が好ましい。また、制限酵素は、４塩基認識酵素を使用しても６塩基認識酵素を使用してもよいが、特に、上記の理由から、４塩基認識酵素の使用が好ましい。
【００３３】
また、アダプター配列は、PCR増幅の際に用いるプライマーを結合させるために用いるものであるが、使用する制限酵素に応じて設計される。即ち、第１制限酵素の酵素切断部位に結合させるための第１アダプター配列は、第１制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有し、また、第２制限酵素の酵素切断部位に結合させるための第２アダプター配列は、第２制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する。
【００３４】
【００３５】
さらに、本発明によれば、電気泳動工程は、ゲル電気泳動を行う。また、cDNA断片回収工程は、電気泳動を行ったゲルから目的のcDNA断片を含むゲルを切り出し、そのcDNA断片を回収する。
このようにcDNA断片の群をゲル電気泳動によって分画すれば、例えばキャピラリーカラムによる電気泳動に比べ、サイズ分解能を向上させることができる。このため、目的とするcDNA断片のみをより特異的に回収することができる。
【００３６】
【００３７】
【００３８】
【００３９】
【００４０】
【００４１】
【００４２】
さらに、本発明によれば、cDNA断片回収工程後、回収したcDNA断片をプラスミドベクターに連結し、組換え体プラスミドを形成する連結工程を備える。また、組換え体プラスミドを大腸菌に導入する導入工程を備える。
このように、回収した目的のcDNA断片をプラスミドベクターに連結し、大腸菌に導入しておけば、cDNA断片の構造解析をする場合などに有効である。即ち、形質転換したその大腸菌を培養し、それからcDNA断片を有するプラスミドDNAを抽出すれば、これを例えば塩基配列の決定等の構造解析に用いることができる。
【００４３】
さらに、上記の原核生物の遺伝子発現方法であって、前記第１ヌクレオチドと前記第２ヌクレオチドは、前記16S rRNAと前記23S rRNAが持つ共通配列に対し相補的である配列を有する同一のものであり、前記第３ヌクレオチドと前記第４ヌクレオチドも同一のものであり、前記第１タグ物質と前記第２タグ物質も同一のものであることを特徴とする原核生物の遺伝子発現方法とすると良い。
本発明によれば、第１ヌクレオチドと第２ヌクレオチドは、16S rRNAと23S rRNAが持つ共通配列に相補的な配列を有する同一の配列からなる。また、第３ヌクレオチドと第４ヌクレオチドも同一の配列からなる。さらに、第１タグ物質と第２タグ物質も同一物である。
従って、第１ヌクレオチドと第２ヌクレオチド、第３ヌクレオチドと第４ヌクレオチド、第１タグ物質と第２タグ物質は、それぞれ1種類で足りる。このため、16S rRNAと23S rRNAの除去がさらに容易にできる。
さらに、上記のいずれかに記載の原核生物の遺伝子発現解析方法であって、前記第１プライマー及び前記第２プライマーの少なくともいずれかには、標識物質が付与されており、前記電気泳動において、上記標識物質を検出することを特徴とする原核生物の遺伝子発現解析方法とすると良い。
本発明によれば、第１プライマー及び第２プライマーの少なくともいずれかには、標識物質が付与されている。そして、電気泳動において、この標識物質を検出する。
このように、標識物質を有するプライマーを用いてPCRを行えば、PCR産物も標識物質を有することになる。従って、PCR反応を行っても依然として目的とするcDNA断片が比較的少ない場合であっても、電気泳動においてこの標識物質を認識することで、目的とするcDNA断片のゲル中の位置を容易に検出することができる。
なお、標識物質は、電気泳動において検出感度が高いものであれば、いずれのものを使用することもできる。例えば、6-カルボキシフルオレッセイン（以下、FAMと称す。）、4,7,2',4',5',7'-ヘキサクロロ-6-カルボキシフルオレッセイン（以下、HEXと称す。）、NED（アプライドバイオシステムズジャパン社）、6-カルボキシ-X-ローダミン（以下、Roxと称す。）等の蛍光物質などを使用することができる。これらの標識物質は、例えば、プライマーDNAの末端（例えば5'末端）に結合させればよい。
さらに、上記のいずれかに記載の原核生物の遺伝子発現解析方法であって、前記タグ物質と前記高親和性物質の組み合わせが、ビオチンとストレプトアビジン、ビオチンとアビジン、ＦＩＴＣと抗ＦＩＴＣ抗体、及び、ＤＩＧとアンタイＤＩＧのいずれかであることを特徴とする原核生物の遺伝子発現解析方法とすると良い。
前述したように、タグ物質と高親和性物質とは、互いに高親和性をもって特異的に結合することが可能な結合対を構成する物質であれば、いずれを利用することもできる。中でも、取り扱いの容易性や入手容易性などの理由から、本発明のように、タグ物質と高親和性物質の組合せとして、ビオチンとストレプトアビジン、ビオチンとアビジン、ＦＩＴＣと抗ＦＩＴＣ抗体、DIGとアンタイDIGを利用するのが特に好ましい。なお、各組合せにおいて、いずれをタグ物質として使用しても、いずれを高親和性物質として使用してもよい。
さらに、上記の原核生物の遺伝子発現解析方法であって、前記cDNA断片回収工程後、前記連結工程前に、回収した前記cDNA断片について、前記第１アダプター配列に相補的な配列を有する第３プライマーと、前記第２アダプター配列に相補的な配列を有する第４プライマーとを用いて、PCR反応を行う第２PCR工程を備えることを特徴とする原核生物の遺伝子発現解析方法とすると良い。
【００４４】
本発明によれば、cDNA断片回収工程後、連結工程前に、回収したcDNA断片について、第１アダプター配列に相補的な配列を有する第３プライマーと、第２アダプター配列に相補的な配列を有する第４プライマーとを用いて、PCR反応を行う第２PCR工程を備える。
このような工程を行えば、cDNA断片回収工程で回収したcDNA断片が少量しかなくても、それを大幅に増幅させることができる。従って、効率よくcDNA断片をプラスミドベクターに連結し、大腸菌に導入することができる。
【００４５】
なお、このPCR工程で使用する第３プライマーは、第１アダプター配列に相補的な配列を有するものであればよく、例えば、上記の第１プライマーを利用しても良い。但し、後の導入工程を考慮して、適当な制限酵素の認識配列を有する第３プライマーを利用すれば、導入工程を効率よく、また、確実に行うことができる。同様に、第４プライマーは、第２アダプター配列に相補的な配列を有するものであればよく、例えば、上記の第２プライマーを利用しても良いが、適当な制限酵素の認識配列を有する第４プライマーを利用すれば、導入工程を効率よく、また、確実に行うことができる。
【００４６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例を、図を参照しつつ説明する。
まず、原核生物の細胞において発現された遺伝子を以下のように分類する。即ち、原核生物の細胞から全RNAを抽出しさらにmRNAを精製する。そして、mRNAの3'末端にポリＡを付加する。その後、このポリＡを利用してmRNAからcDNA群を合成する。その後、得られたcDNA群を適切な２つの制限酵素によって切断し、また、両端にアダプター配列を結合して、識別可能なだけの長さを有しかつ両端にアダプター配列を有するアダプター付きcDNA断片の群を作成する。その後、アダプター付きcDNA断片の群を、256種類のプライマーセットを用いて256個の群に分類する。
【００４７】
この分類の手法を図１を参照しつつ説明する。mRNAからなる群１からcDNAの群２を合成する。これを適切な２つの制限酵素によって切断してcDNA断片の群３を得る。そして、このcDNA断片の両末端の各2塩基、全4塩基の配列に応じて、即ち、4塩基がA、T、G、Cのいずれであるかにより、cDNA断片の群３を分類する。具体的には、5'末端の塩基（図１中に黒塗りで示す。）によってまず4個の群４に分類する。そして、これは次の２番目の塩基（図１中に黒塗りで示す。）によってさらに16個の群５に分類する。さらに、3'末端の２番目の塩基（図１中に黒塗りで示す。）によって64個の群６に分類し、さらに、3'末端の塩基（図１中に黒塗りで示す。）により256個の群７に分類する。
【００４８】
次に、細胞からmRNAを抽出し、mRNAの群１から256種類のcDNA断片の群７を調製する手法について、図２及び図３を参照しつつ具体的に説明する。図２における各アルファベットは塩基配列を構成する塩基を示すが、Ｎ、Ｍ、Ｗ、Ｘ、Ｙ及びＺは任意の塩基を示し、ＸとＹ及びＷとＺは、互いに相補的に結合する。
【００４９】
本実施例においては、原核生物の遺伝子発現解析をするにあたり、大腸菌に組み入れたアンピシリン耐性遺伝子（blaＭ）を標的遺伝子として解析を行った。
【００５０】
まず、mRNA抽出工程において、試験対象となる原核生物の細胞からmRNA１０を抽出する。
具体的には、原核生物の細胞から全RNAを抽出する。その後、16S rRNAの一部に相補的な配列を有する第１ヌクレオチドを16S rRNAにハイブリダイズさせると共に、23S rRNAの一部に相補的な配列を有する第２ヌクレオチドを23S rRNAにハイブリダイズさせる。次に、第１ヌクレオチドのうち、16S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的である配列を有する第３ヌクレオチドが付加された第１タグ物質を、16S rRNAと上記第１ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせる。また、第２ヌクレオチドのうち、23S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的である配列を有する第４ヌクレオチドが付加された第２タグ物質を、23S rRNAと第２ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせる。その後、全RNAから、16S rRNAと第１ヌクレオチドと第３ヌクレオチドが付加された第１タグ物質との結合物を除去すると共に、23S rRNAと第２ヌクレオチドと第４ヌクレオチドが付加された第２タグ物質との結合物を除去する。
【００５１】
好ましくは、第１ヌクレオチドと第２ヌクレオチドを、16S rRNAと23S rRNAが持つ共通配列に対し相補的である配列を有する同一のものとする。また、第３ヌクレオチドと第４ヌクレオチドも同一のものとする。さらに、第１タグ物質と第２タグ物質も同一のものとする。
即ち、図３に示すように、全RNAを抽出した後、16S rRNAと23S rRNAが持つ共通配列に対し相補的である配列を有する第１ヌクレオチド３２を、16S rRNAと23S rRNAにそれぞれハイブリダイズさせる。次に、第１ヌクレオチドのうち、16S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的である配列を有する第３ヌクレオチド３３が付加された第１タグ物質３４を、16S rRNAまたは23S rRNAと第１ヌクレオチド３２との結合物にそれぞれハイブリダイズさせる。その後、全RNAから、16S rRNAまたは23S rRNAと、第１ヌクレオチド３２と、第３ヌクレオチド３３が付加された第１タグ物質３４との結合物をそれぞれ除去する。
【００５２】
本実施例では、アンピシリン耐性遺伝子を持つ大腸菌、即ち、プラスミドpBluescriptを持つ大腸菌（DH5α株）を培養し、その細胞から、まず、全RNAを抽出した。この全RNAの抽出には、RNA抽出キット（Rneasy Protect Bacterial Mini Kit）を用いて、添付のマニュアルに従って抽出した。その後、抽出した全RNA10μgを用いて、mRNAを精製した。この精製には、MICROB Express Bacterial mRNA Isolation Kit（Ambion社製）を利用した。精製法は、添付のマニュアルに従った。
【００５３】
次に、ポリA付加工程において、mRNA１０の3'末端にポリAを付加し、ポリAが付いたmRNA１１を得る（図２参照）。
このポリA化反応の反応組成は次の通りである。 なお、5×PolyA bufferは、宝酒造のPolyA Polymerase添付の組成を参考に作成した。また、PolyA Polymeraseは、宝酒造製のものを使用した。
mRNA 500ng Xμl
５×PolyA buffer 4μl
５×MnCl2 4μl
PolyA Polymerase 1μl
DEPC処理水 11-Xμl
Total 20μl
【００５４】
上記の反応液を37℃で1時間インキュベートした。その後、反応液に TE buffer 180μlとフェノール・クロロフォルム溶液200μlを加えて混合した。続いて、この混合液を15,000rpmで5分間、室温で遠心分離した。そして、上澄み溶液を185μl（92.5μl×2）吸い取った。続いて、この上澄み溶液に3M酢酸ナトリウムを18.5μl加えて混合した。さらに、この溶液に520μlの99.5％エタノールを加えて混合した。その後、この溶液を−80℃で10分間保冷した。次に、これを15,000rpmで5分間、4℃で遠心分離した後、70％エタノールで沈殿をリンスした。続いて、これを15,000rpmで5分間、4℃で遠心分離した後、上澄みを除去した。その後、沈殿を風乾させ、DEPC処理水7μlに溶解した。このようにして、mRNAの3'末端にポリAテイルを付加させた。
【００５５】
次に、cDNA合成工程において、ポリAが付加されたmRNA１１から逆転写酵素を用いてcDNA１２を合成する。またその際、cDNAの5'末端にタグ物質を付加する。
本実施例では、mRNAの3'末端側のポリAテイルに相補的なオリゴdTプライマーをビオチン（タグ物質）で標識化しものをプライマーとして用いて、cDNAを合成した。
PolyA mRNA溶液（mRNA量は500ng） 7μl
10mM dNTP Mix 1μl
50μM Biotin-NotＩ anchored dt18 2μl
Total 10μl
まず、上記の混合物を65℃で5分間加温後、氷中で1分間以上放置した。
【００５６】
一方で、下記の混合物を作成した。なお、この混合物の作成には、インビトロジェン社のスーパースクリプトファーストストランドシステムを使用した。
10×RT buffer 2μl
25mM MgCl2 4μl
0.1M DTT 2μl
RNase out 1μl
Super Script II 1μl
Total 10μl
そして、この混合物を氷中で保冷した上記混合物に加えて混合した後、42℃で1時間インキュベートした。この反応液を1st Strand Mixとする。
【００５７】
また一方で、下記の混合物（これを2nd Strand Mixとする。）を作成した。この混合物は、インビトロジェン社製のものを利用した。
5×2nd Strand buffer 30μl
10mM dNTP Mix 4μl
0.1M DTT 2μl
E.coli Ligase 2μl
E.coli polymerase 4μl
RNaseH 1μl
DEPC処理水 87μl
Total 130μl
そして、この混合物を、上記の1st strand合成反応が終了するまで氷中に保存した。
【００５８】
次に、冷却した2nd Strand Mix 130μlを、上記の1st Strand Mixに加えて混合した後、16℃で2時間反応させた。その後は、70℃で15分間反応させて、酵素を失活させた。
反応終了後は、TE buffer 150μlを加え、さらに、フェノール・クロロフォルム溶液（和光純薬）を300μl加えて混合した。続いて、15,000rpmで5分間、室温で遠心分離した。その後、上澄み溶液を280μl吸い取り、これに3M酢酸ナトリウムを28μl加えて混合した。
その後、さらに770μlの99.5％エタノールを加えて混合した。そして、−80℃で10分間保冷した。次に、これを15,000rpmで15分間、4℃で遠心分離した後、70％エタノールで沈殿をリンスした。続いて、これを15,000rpmで3分間、4℃で遠心分離した後、上澄みを除去した。その後、沈殿を風乾させ、10mM Tris 25μlに溶解した。このようにして、mRNAからcDNAを合成した。
【００５９】
次に、cDNA加工工程について説明する。
まず、第１切断工程において、合成されたcDNA１２を第１制限酵素を用いて切断する。
本実施例では、下記の混合物を作成し、37℃で一晩放置した。なお、第１制限酵素として、４塩基認識制限酵素の１つであるHhaＩを用いた。
cDNA溶液 23μl
M buffer 5μl
HhaＩ（20U） 2μl
Water 20μl
Total 50μl
【００６０】
次に、65℃で15分間加温し、酵素を失活させた。その後、3M酢酸ナトリウム（和光純薬）を5μl加え、さらに99.5％エタノールを160μl加えて混合した。そして、−80℃で10分間保冷した。次に、これを15,000rpmで15分間、4℃で遠心分離した後、70％エタノールで沈殿をリンスした。続いて、これを15,000rpmで3分間、4℃で遠心分離した後、上澄みを除去した。その後、沈殿を風乾させた。
【００６１】
次に、第１アダプター結合工程において、切断されたcDNA断片に、第１制限酵素の切断部位の配列に相補的な配列を有する第１アダプター配列を結合させる。
本実施例では、風乾した沈殿を、5μlの1pmol/μlの第１アダプター溶液に溶解し、宝酒造のLigation kitのＩ液を5μl加えて混合した後、16℃で2時間反応させた。なお、第１アダプター配列を図４（ａ）に示した。
【００６２】
次に、第１回収工程において、タグ物質に高親和性を有する高親和性物質を結合させることにより、タグ物質を有するcDNA断片を回収する。
本実施例では、ストレプトアビジン（高親和性物質）１４を用いてビオチン１３を捕捉し、切断されたcDNA断片の3'末端側のみを回収した。具体的には、反応液にTE bufferを90μl加え、さらに、ビーズ懸濁液（ダイナル社製）を100μl加えた。そして、磁気ビーズに固定したストレプトアビジン１４に結合させることにより、切断されたcDNA断片の3'末端側を回収した。
【００６３】
次に、第２切断工程において、回収したcDNA断片を第２制限酵素を用いて切断する。
本実施例では、下記の混合物（２サンプル分）を作成した。なお、第１制限酵素として、４塩基認識制限酵素の１つであるSau3AIを用いた。
Sau3AI 10μl
H buffer 40μl
Water 250μl
Total 300μl
そして、この混合液を上記のビーズ入りチューブに150μl添加して混合する。そして、37℃で3時間保温する。
【００６４】
次に、第２回収工程において、高親和性物質に結合させることにより、タグ物質を有するcDNA断片を除去し、タグ物質を有しないcDNA断片を回収する。
具体的には、上記の反応終了後に、マグネットスタンドにチューブを立ててビーズを引きつけ、上澄み185μｌを新しいチューブに移す。そして、再度、TE buffer 100μlをビーズ入りチューブに入れて混合する。その後、再びマグネットスタンドにチューブを立ててビーズを引きつけ、上澄み85μｌを新しいチューブに移す。
次に、サンプル270μlに対して、３M酢酸ナトリウムを27μl、エタノールを750μl、ペイントペレット（宝酒造）を2μl加えて混合する。そして、−20℃で一晩放置する。その後、これを15,000rpmで15分間、4℃で遠心分離した後、70％エタノール500μlで沈殿をリンスした。続いて、これを15,000rpmで3分間、4℃で遠心分離した後、上澄みを除去した。その後、沈殿を風乾させた。
【００６５】
次に、第２アダプター結合工程において、回収されたcDNA断片に、第２制限酵素の切断部位の配列に相補的な配列を有する第２アダプター配列を結合させる。
本実施例では、風乾した沈殿を、5μlの1pmol/μlの第２アダプター溶液に溶解し、宝酒造のLigation kit ver.2のＩ液を5μl加えて混合した後、16℃で2時間反応させた。なお、第２アダプター配列を図４（ｂ）に示した。
次に、TE buffer 190μlと加え、さらに、フェノール・クロロフォルム溶液を200μl加えて混合した。続いて、15,000rpmで10分間、室温で遠心分離した。その後、上澄み溶液185μlを新しいチューブに移した。そして、これに3M酢酸ナトリウムを20μl加えて、さらに99.5％エタノールを510μlを加えて混合した。その後、-80℃で20分間保冷した。次に、これを15,000rpmで15分間、4℃で遠心分離した後、70％エタノール200μlで沈殿をリンスした。続いて、これを15,000rpmで3分間、4℃で遠心分離した後、上澄みを除去した。
その後、沈殿を風乾させ、TE buffer 50μlに溶解した。
以上のcDNA加工工程において、両末端に既知配列を含むアダプター付きcDNA断片１７の群が構築される。
【００６６】
次に、第１PCR工程において、アダプター付きcDNA断片１７の群について、第１アダプター配列に相補的な配列を有する第１プライマーと、第２アダプター配列に相補的な配列を有する第２プライマーとを用いて、PCR反応を行う。
本実施例では、このプライマーセットとして、図５（ａ）に示すように、第１アダプター配列に相補的な配列と、増幅させる方向にさらに2塩基の配列（図５中にNNで示す。）を有するプライマーと、図５（ｂ）に示すように、第２アダプター配列に相補的な配列と、増幅させる方向にさらに2塩基の配列を有するプライマー（図５中にNNで示す。）とを使用する。それぞれのプライマーの増幅される方向に付与した2塩基は、A、T、G、Cの４種類の塩基からなる全ての組合せによって設計されるので、合計256種類のプライマーセットが考えられる。従って、これらすべてのプライマーセットを用いて、cDNA断片１７の群についてPCRを行うことにより、256種類のcDNA断片１８の群に分類すると共に、PCR増幅を行うことが可能である。なお、PCRは、公知の手法により行えばよい。
以上のようにして得た256種類のcDNA断片１８の群は、目的とするcDNA断片を回収するためのサンプルとして利用することができる。
【００６７】
次に、256種類のcDNA断片の群の中から１つのcDNA断片の群をサンプルとして選択し、以下に示す手法により、目的とするcDNA断片を回収する。この手法については、図６を参照しつつ説明する。
まず、第１PCR工程において、cDNA断片の群２１について、第１アダプター配列１５に相補的な配列を有し、かつ、標識物質が結合された第１プライマーと、第２アダプター配列１６に相補的な配列を有する第２プライマーとを用いて、PCR反応により増幅させる。
具体的には、第１アダプター配列１５に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド１に、蛍光物質である近赤外蛍光色素IRD-800が結合された第１プライマーと、第２アダプター配列１６に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド２からなる第２プライマーとを用いて、PCR反応を行った。第１，第２プライマーは、それぞれ公知の手法により合成すればよい。
【００６８】
オリゴヌクレオチド１：
5'-cataggatcagatcagttgcgctc-3'
オリゴヌクレオチド２：
5'-gcactagtgcaatcgcacttgaacgatgatctg-3'
【００６９】
PCR反応の反応組成は、次の通りである。なお、KOD Dash、dNTPs、10×bufferは、東洋紡のものを使用した。
cDNA 0.5〜5ng
KOD Dash 2.5U
dNTPs 0.2mM（最終濃度）
10×buffer 5μl
IRD-800 蛍光標識プライマー 5pmol
Reverse primer 10pmol
Total 50μl
また、PCR反応は、パーキンエルマー社製の GeneAmp 2400 を用いて行った。PCR条件は、Stepdown PCR（Biotechniques，1996，20：478-485を参照されたい。）により行った。
【００７０】
本実施例では、アンピシリン耐性遺伝子の3'末端側が釣り上げられるはずであるので、図７に塩基配列とHhaIサイト及びSau3AIサイトと示すアンピシリン耐性遺伝子の658-826の断片が増幅してくるはずである。また、第１，第２アダプター配列を考慮すると、214bpのアダプター付きcDNA断片が増幅されるはずである。
【００７１】
次に、電気泳動工程において、第１PCR工程で増幅されたcDNA断片の群２２（PCR産物）についてゲル電気泳動を行う。
本実施例では、増幅したcDNA断片の群２２を、蛍光色素の読み取れるDNAシークエンサー（LI-COR社製LIC-4200L(S)-1）に供試し、サイズ分画のためにアクリルアミドゲル電気泳動を行った。アクリルアミドゲル２３の組成は、上記DNAシークエンサーに付属のマニュアルに従った。
【００７２】
次に、cDNA断片回収工程において、電気泳動の結果に基づいて、ゲルから目的のcDNA断片２４を含むゲルを切り出し、当該cDNA断片２４を回収する。
本実施例では、アクリルアミドゲル電気泳動を行った結果、図８に示すように、推定通りの位置にバンド（214bp）が現れた。なお、図８はシークエンサのデータより取得した画像である。次に、電気泳動を行ったゲルについて、濾紙を使用してゲルをゲル板から剥がした。続いて、濾紙にくっついたゲルを蛍光色素の検出できるスキャナー上に載置し、ゲル全体をイメージ化した。そして、目的のcDNA断片がゲル中のどの位置にあるかを把握し、この目的のcDNA断片を含むゲルを切り出した。なお、本実施例では、LI-COR社のゲルイメージングシステムオデッセイを使用した。
その後、切り出したアクリルアミドゲルから目的のcDNA断片を回収した。このDNAの抽出は、Omega Bio-tek社のE.Z.N.A. Poly-Gel DNA Extraction kitを使用した。
【００７３】
次に、第２PCR工程において、回収したcDNA断片２４について、第１アダプター配列１５に相補的な配列を有する第３プライマーと、第２アダプター配列１６に相補的な配列を有する第４プライマーとを用いて、再度PCR反応を行う。
具体的には、フォワード側には、第１アダプター配列に相補的な配列を有すると共に制限酵素NotI部位の配列を有する第３プライマーを、リバース側には、第２アダプター配列に相補的な配列を有すると共に制限酵素SpeI部位の配列を有する第４プライマーを用いて、PCR反応を行った。第３プライマーは、オリゴヌクレオチド３からなり、第４プレイマーは、オリゴヌクレオチド４からなる。
【００７４】
オリゴヌクレオチド３：
5'-cagcggccgctcataggatcagatcagttgcgctc-3'
オリゴヌクレオチド４：
5'-gcactagtgcaatcgcacttgaacgatgatctg-3'
【００７５】
また、このPCR工程においても、PCR反応は、パーキンエルマー社製の GeneAmp2400 を用い、Stepdown PCR（Biotechniques，1996，20：478-485を参照されたい。）の条件により行った。使用した酵素（DNAポリメラーゼ）は、東洋紡社製の KOD Dash 酵素である。反応液の組成は、添付のマニュアルに従った。
【００７６】
次に、連結工程において、第２PCR工程で増幅したcDNA断片２４の産物をプラスミドベクター２５に連結し、組換え体プラスミド２６を形成する。
具体的には、増幅したcDNA断片２４の産物を制限酵素NotIとSpeIで処理した上で、プラスミドベクター（pbluescriptII）２５に連結し、組換え体プラスミド２６を形成した。この連結は、宝酒造社製のライゲーションキットver.2 を使用し、その添付マニュアルに従って行った。
次に、導入工程において、組換え体プラスミド２６を大腸菌に導入する。
本実施例では、コンピテントセルとして E.coli DH5αを使用し、公知の手法により、組換え体プラスミド２６を大腸菌に導入した。
【００７７】
次に、形質転換した大腸菌から、公知の手法により組換え体プラスミドを抽出した。このプラスミドの抽出は、複数個のコロニーについて行った。そして、抽出したそれぞれの組換え体プラスミドについて、組み込まれたcDNA断片の塩基配列を決定した。その結果、cDNA断片は、確かに、アンピシリン耐性遺伝子の一部であった。
【００７８】
以上で説明したように、本実施例では、まず、原核生物の細胞からmRNAを抽出する。その後、抽出したmRNAの3'末端にポリＡテイルを付加する。そして、このポリＡテイルを利用して、mRNAからcDNAを合成する。次に、cDNA加工工程において、cDNAから一端に第１アダプター配列を有し他端に第２アダプター配列を有するアダプター付きcDNA断片を作成する。その後、このアダプター付きcDNA断片に対して、第１アダプター配列に相補的な配列を有する第１プライマーと、第２アダプター配列に相補的な配列を有する第２プライマーとを用いて、PCR反応を行う。次に、PCRで増幅されたcDNA断片について電気泳動を行う。そして、この電気泳動の結果に基づいて、目的のcDNA断片を回収し、遺伝子発現解析に利用する。
【００７９】
このような方法では、細胞から抽出したmRNAにポリＡを付加するので、これを利用することで容易にcDNAを合成することができる。従って、原核生物であっても、その遺伝子発現解析を容易に行うことができる。
さらに、cDNAから両端にアダプター配列を持つcDNA断片を作成し、これらのアダプター配列に相補的な配列を有するプライマーセットを用いてPCR反応を行うので、cDNA断片を多量に増幅することができる。従って、cDNA断片の群の中に存在する目的のcDNA断片が低濃度であっても、それを大幅に増幅することができ、電気泳動においてそれを容易に検出することができる。また、後述するように、第１，第２プライマーを適宜選択することにより、両端にアダプター配列を持つcDNA断片群の中から、一部のcDNA断片だけを選択的に増幅することができるため、遺伝子発現解析をより容易に行うことができる。
【００８０】
また、本実施例のmRNA抽出工程では、まず、原核生物の細胞から全RNAを抽出する。そして、抽出した全RNAに対し、16S rRNAの一部に相補的な配列を有する第１ヌクレオチドを16S rRNAにハイブリダイズさせると共に、23S rRNAの一部に相補的な配列を有する第２ヌクレオチドを23S rRNAにハイブリダイズさせる。その後、第１ヌクレオチドのうち、16S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的な配列を有する第３ヌクレオチドが付加された第１タグ物質を、16S rRNAと第１ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせる。また、第２ヌクレオチドのうち、23S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的な配列を有する第４ヌクレオチドが付加された第２タグ物質を、23S rRNAと第２ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせる。その後、全RNAから、16S rRNAと第１ヌクレオチドと第３ヌクレオチドが付加された第１タグ物質との結合物を除去すると共に、23S rRNAと第２ヌクレオチドと第４ヌクレオチドが付加された第２タグ物質との結合物を除去する。
さらに具体的には、第１ヌクレオチドと第２ヌクレオチドは、16S rRNAと23S rRNAが持つ共通配列に相補的な配列を有する同一の配列からなる。また、第３ヌクレオチドと第４ヌクレオチドも同一の配列からなる。さらに、第１タグ物質と第２タグ物質も同一物である。
【００８１】
従って、全RNAから、全RNAの中に多量に存在する16S rRNAと23S rRNAの大部分を除去することができる。従って、mRNAを容易により高純度に精製することができる。また、第１ヌクレオチドと第２ヌクレオチド、第３ヌクレオチドと第４ヌクレオチド、第１タグ物質と第２タグ物質は、それぞれ1種類で足りるため、16S rRNAと23S rRNAの除去がさらに容易にできる。
【００８２】
また、本実施例では、cDNA合成工程において、cDNAを合成すると共にcDNAの5'末端にタグ物質を付加しておく。
そして、cDNA加工工程において、まず、cDNAを第１制限酵素で切断する。その後、切断されたcDNA断片に、第１制限酵素の切断部位の配列に相補的な配列を有する第１アダプター配列を結合させる。その後、タグ物質に高親和性を有する高親和性物質に結合させることにより、タグ物質を有するcDNA断片を回収し、タグ物質を有しないcDNA断片を除去する。即ち、cDNAの5'末端側（PolyT末端側）のcDNA断片を回収し、3'末端側のcDNA断片を除去する。
次に、第１アダプター配列が結合されたcDNA断片を第２制限酵素で切断する。その後、高親和性物質に結合させることにより、今度は、タグ物質を有するcDNA断片を除去し、タグ物質を有しないcDNA断片を回収する。即ち、第１アダプターが結合された側のcDNA断片を回収し、第１アダプターがない側のDNA断片を除去する。その後、この回収されたcDNA断片に、第２制限酵素の切断部位の配列に相補的な配列を有する第２アダプター配列を結合させる。
【００８３】
このため、一端に第１アダプター配列を有し他端に第２アダプター配列を有するアダプター付きcDNA断片を容易に作成することができる。また、このようにして作成されたcDNA断片の群は、細胞で発現されたほとんど全ての遺伝子、即ち、公知の遺伝子も未知の遺伝子も同様に、その群の中に含まれるようにすることが可能である。従って、遺伝子発現解析において有効に活用することができる。
【００８４】
また、本実施例では、電気泳動工程は、ゲル電気泳動を行う。また、cDNA断片回収工程は、電気泳動を行ったゲルから目的のcDNA断片を含むゲルを切り出し、そのcDNA断片を回収する。
このようにcDNA断片の群をゲル電気泳動によって分画すれば、例えばキャピラリーカラムによる電気泳動に比べ、サイズ分解能を向上させることができる。このため、目的とするcDNA断片のみをより特異的に回収することができる。
【００８５】
また、本実施例では、第１プライマーには、標識物質が付与されている。そして、電気泳動において、この標識物質を検出する。
このように、標識物質を有するプライマーを用いてPCRを行えば、PCR産物も標識物質を有することになる。従って、PCR反応を行っても依然として目的とするcDNA断片が比較的少ない場合であっても、電気泳動においてこの標識物質を認識することで、目的とするcDNA断片のゲル中の位置を容易に検出することができる。
【００８６】
また、本実施例では、第１制限酵素としてHhaIを使用し、第２制限酵素としてSau3AIを使用している。
このような酵素を利用することにより、cDNA断片を識別可能な長さを有する断片に切断することができる。また、合成されたcDNA断片のより多くを切断することができる。
【００８７】
また、本実施例では、タグ物質としてビオチンを利用し、高親和性物質としてストレプトアビジンを利用している。このようなものを使用することは、その取り扱いの容易性や入手容易性などの理由から特に好ましい。
【００８８】
また、本実施例では、cDNA断片回収工程後、回収したcDNA断片をプラスミドベクターに連結し、組換え体プラスミドを形成する連結工程を備える。また、組換え体プラスミドを大腸菌に導入する導入工程を備える。
このように、回収した目的のcDNA断片をプラスミドベクターに連結し、大腸菌に導入しておけば、cDNA断片の構造解析をする場合などに有効である。即ち、形質転換したその大腸菌を培養し、それからcDNA断片を有するプラスミドDNAを抽出すれば、これを例えば塩基配列の決定等の構造解析に用いることができる。
【００８９】
また、本実施例では、cDNA断片回収工程後、連結工程前に、回収したcDNA断片について、第１アダプター配列に相補的な配列を有する第３プライマーと、第２アダプター配列に相補的な配列を有する第４プライマーとを用いて、PCR反応を行う第２PCR工程を備える。
このような工程を行えば、cDNA断片回収工程で回収したcDNA断片が少量しかなくても、それを大幅に増幅させることができる。従って、効率よくcDNA断片をプラスミドベクターに連結し、大腸菌に導入することができる。
【００９０】
以上において、本発明の実施の形態を実施例に即して説明したが、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で、適宜変更して適用できることは言うまでもない。
例えば、上記実施例のcDNA加工工程では、第１切断工程、第１回収工程、及び、第１アダプター結合工程について、第１切断工程、第１アダプター結合工程、第１回収工程の順序で行っているが、これらの工程を、第１切断工程、第１回収工程、第１アダプター結合工程の順序で行うようにしてもよい。
また、上記実施例のcDNA加工工程では、第２切断工程、第２回収工程、及び、第２アダプター結合工程について、第２切断工程、第２回収工程、第２アダプター結合工程の順序で行っているが、これらの工程を、第２切断工程、第２アダプター結合工程、第２回収工程の順序で行うようにしてもよい。
【００９１】
【配列表】
＜110＞ アイシン精機株式会社
AISIN SEIKI CO.,LTD
＜120＞ DNA回収法
＜130＞ ＡＫ０２０５２６
＜160＞ 4
＜210＞ 1
＜211＞ 24
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ 第１アダプター配列を参考にして合成
＜400＞ 1
cataggatca gatcagttgc gctc 24
＜210＞ 2
＜211＞ 33
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ 第２アダプター配列を参考にして合成
＜400＞ 2
gcactagtgc aatcgcactt gaacgatgat ctg 33
＜210＞ 3
＜211＞ 35
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ 第１アダプター配列と制限酵素NotI部位の配列を参考にして合成
＜400＞ 3
cagcggccgc tcataggatc agatcagttg cgctc 35
＜210＞ 4
＜211＞ 33
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ 第２アダプター配列と制限酵素SpeI部位の配列を参考にして合成
＜400＞ 3
gcactagtgc aatcgcactt gaacgatgat ctg 33
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例に関し、目的とするcDNA断片を回収するためのサンプルとなるcDNA断片群の作成方法についての概要を示す説明図である。
【図２】 実施例に関し、目的とするcDNA断片を回収するためのサンプルとなるcDNA断片群の作成方法についての詳細を示す説明図である。
【図３】 実施例に関し、rRNAを除去する方法を説明する説明図である。
【図４】 実施例に関し、（ａ）は第１アダプター配列を示す説明図であり、（ｂ）は第２アダプター配列を示す説明図である。
【図５】 実施例に関し、２５６種類のcDNA断片群に分類するためのプライマーセットの配列を示す説明図である。
【図６】 実施例に関し、cDNA断片の群から目的とするcDNA断片を回収する方法を示す説明図である。
【図７】 実施例に関し、アンピシリン耐性遺伝子の塩基配列と、その中のHhaI切断部位及びSau3AI切断部位を示す説明図である。
【図８】 実施例に関し、RT-PCRで増幅したcDNA断片の群を電気泳動した結果を示す、図面に変わる写真である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子発現解析の方法に関し、特に、原核生物についての遺伝子発現解析の方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、真核生物については、遺伝子発現の解析方法が知られている。即ち、真核生物の細胞からmRNAを抽出し、mRNAからcDNAを合成する。そして、cDNAを加工し、遺伝子発現解析に利用する方法である。例えば、特許文献１に開示された方法が挙げられる。
【０００３】
【特許文献１】
国際公開 ＷＯ ０２／４８３５２ Ａ１
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、原核生物の遺伝子発現解析をする場合、原核生物のmRNAは、ポリＡ配列を持たないため、従来の方法では、遺伝子発現解析を行うことができなかった。
【０００５】
本発明はかかる現状に鑑みてなされたものであって、原核生物について容易に遺伝子発現解析をすることができる原核生物の遺伝子発現解析方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段、作用及び効果】
その解決手段は、原核生物の細胞からmRNAを抽出するmRNA抽出工程と、上記mRNAの3'末端にポリＡを付加するポリＡ付加工程と、上記ポリＡが付加されたmRNAからcDNAを合成するcDNA合成工程と、上記cDNAから一端に第１アダプター配列を有し他端に第２アダプター配列を有するアダプター付きcDNA断片を作成するcDNA加工工程と、上記アダプター付きcDNA断片について、上記第１アダプター配列に相補的な配列を有する第１プライマーと、上記第２アダプター配列に相補的な配列を有する第２プライマーとを用いて、PCR反応を行う第１PCR工程と、上記第１PCR工程で増幅されたcDNA断片について電気泳動を行う電気泳動工程と、上記電気泳動の結果に基づいて、目的のcDNA断片を回収するcDNA断片回収工程と、を備え、前記mRNA抽出工程は、前記原核生物の細胞から全RNAを抽出する工程と、16SrRNAの一部に相補的な配列を有する第１ヌクレオチドを上記16S rRNAにハイブリダイズさせると共に、23S rRNAの一部に相補的な配列を有する第２ヌクレオチドを23S rRNAにハイブリダイズさせる工程と、上記第１ヌクレオチドのうち、上記16S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的である配列を有する第３ヌクレオチドが付加された第１タグ物質を、上記16S rRNAと上記第１ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせると共に、上記第２ヌクレオチドのうち、上記23S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的である配列を有する第４ヌクレオチドが付加された第２タグ物質を、上記23S rRNAと上記第２ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせる工程と、上記全RNAから、上記16S rRNAと上記第１ヌクレオチドと上記第３ヌクレオチドが付加された上記第１タグ物質との結合物を除去すると共に、上記23S rRNAと上記第２ヌクレオチドと上記第４ヌクレオチドが付加された上記第２タグ物質との結合物を除去する工程と、を有し、前記cDNA合成工程は、前記cDNAを合成すると共に上記cDNAの5'末端にタグ物質を付加し、前記cDNA加工工程は、上記cDNAを第１制限酵素で切断する第１切断工程と、上記タグ物質に高親和性を有する高親和性物質に結合させることにより、上記タグ物質を有するcDNA断片を回収する第１回収工程と、上記タグ物質を有するcDNA断片に、上記第１制限酵素の切断部位の配列に相補的な配列を有する第１アダプター配列を結合させる第１アダプター結合工程と、上記第１アダプター配列が結合されたcDNA断片を第２制限酵素で切断する第２切断工程と、上記高親和性物質に結合させることにより、上記タグ物質を有するcDNA断片を除去し、上記タグ物質を有しないcDNA断片を回収する第２回収工程と、上記タグ物質を有しないcDNA断片に、上記第２制限酵素の切断部位の配列に相補的な配列を有する第２アダプター配列を結合させる第２アダプター結合工程と、を有し、前記電気泳動工程は、ゲル電気泳動を行い、前記cDNA断片回収工程は、ゲルから目的の前記cDNA断片を含むゲルを切り出し、当該cDNA断片を回収し、前記cDNA断片回収工程後、回収した前記cDNA断片をプラスミドベクターに連結し、組換え体プラスミドを形成する連結工程と、上記組換え体プラスミドを大腸菌に導入する導入工程と、を備えることを特徴とする原核生物の遺伝子発現解析方法である。
【０００７】
本発明によれば、まず、原核生物の細胞からmRNAを抽出する。その後、抽出したmRNAの3'末端にポリＡテイルを付加する。そして、このポリＡテイルを利用して、mRNAからcDNAを合成する。次に、cDNA加工工程において、cDNAから一端に第１アダプター配列を有し他端に第２アダプター配列を有するアダプター付きcDNA断片を作成する。その後、このアダプター付きcDNA断片に対して、第１アダプター配列に相補的な配列を有する第１プライマーと、第２アダプター配列に相補的な配列を有する第２プライマーとを用いて、PCR反応を行う。次に、PCRで増幅されたcDNA断片について電気泳動を行う。そして、この電気泳動の結果に基づいて、目的のcDNA断片を回収し、遺伝子発現解析に利用する。
【０００８】
このような方法では、細胞から抽出したmRNAにポリＡを付加するので、これを利用することで容易にcDNAを合成することができる。従って、原核生物であっても、その遺伝子発現解析を容易に行うことができる。
さらに、cDNAから両端にアダプター配列を持つcDNA断片を作成し、これらのアダプター配列に相補的な配列を有するプライマーセットを用いてPCR反応を行うので、cDNA断片を多量に増幅することができる。従って、cDNA断片の群の中に存在する目的のcDNA断片が低濃度であっても、それを大幅に増幅することができ、電気泳動においてそれを容易に検出することができる。また、後述するように、第１，第２プライマーを適宜選択することにより、両端にアダプター配列を持つcDNA断片群の中から、一部のcDNA断片だけを選択的に増幅することができるため、遺伝子発現解析をより容易に行うことができる。
【０００９】
ここで、アダプター付きcDNA断片は、一端に第１アダプター配列を有し他端に第２アダプター配列を有するものであれば、いかなるものであってよい。即ち、このcDNA断片の群は、抽出に用いた細胞で発現されたほとんどすべての遺伝子が含まれる群であっても、その発現された遺伝子の一部だけが含まれる群であってもよい。また、このcDNA断片は、全長cDNAの両端にアダプター配列が付いたものでも、全長cDNAの一部分をなす断片の両端にアダプター配列が付いたものでもよい。また、第１アダプター配列及び第２アダプター配列は、それぞれいかなる塩基配列からなるものであっても構わないが、後に行うPCRの効率等を考慮して設計されたものであるのが好ましい。即ち、これらのアダプター配列がそれぞれ15塩基前後であると、安定したPCR反応を行うことができ、効率よくcDNA断片を増幅することができる。
【００１０】
第１プライマーは、第１アダプター配列に相補的な配列を有するものであれば、いかなるものであってもよい。ここでいう相補的な配列とは、第１アダプターに対し100％相補的な配列に限られず、PCR反応においてcDNA断片を増幅できる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。また、第１プライマーは、第１アダプター配列に相補的な配列のみからなるものに限られず、第１アダプター配列に相補的な配列に、さらに他の配列が繋がったものであってもよい。また、第１プライマーは、第１アダプター配列全体に対応するものに限られず、第１アダプター配列の一部に対応するものでもよい。
【００１１】
同様に、第２プライマーは、第２アダプター配列に相補的な配列を有するものであれば、いかなるものであってもよい。ここでいう相補的な配列も、第２アダプターに対し100％相補的な配列に限られず、PCR反応においてcDNA断片を増幅できる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。また、第２プライマーも、第２アダプター配列に相補的な配列のみからなるものに限られず、第２アダプター配列に相補的な配列に、さらに他の配列が繋がったものであってもよい。また、第２プライマーは、第２アダプター配列全体に対応するものに限られず、第２アダプター配列の一部に対応するものでもよい。
【００１２】
なお、これらのプライマーとして、それぞれ、その3'末端に任意の2塩基配列であるNNを有するものを利用することができる。ここで使用される「任意の2塩基配列であるNN」は、A、T、G、Cから任意に選択される配列である。ここで、各任意の配列を2塩基としたのは、当該方法の簡便性と解析精度を考慮した結果である。つまり、各任意の配列を2塩基とすることにより、256種類のプライマーセットが得られるため、cDNA断片の群を256種類の群に分類することができる。その結果、１つの群には、解析が容易な比較的少ない種類のcDNA断片が含まれるようになる。なお、この任意の2塩基配列NNを、一方のプライマーまたは両方のプライマーについて3塩基以上とすることも可能である。それによってプライマーの種類が増え、プライマーセットを1024種類や4096種類とすることができる。
【００１３】
次に、その他一般にPCR反応で用いられる種々の試薬について説明する。
DNAポリメラーゼは、PCR反応においてDNA鎖を変性させる際の高温に短時間加熱されても永久的には不活性化されず、しかも、高温における活性を有するものが好適である。例えば、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、メタノサーマス・フェルビドゥス（Methanothermus fervidus）、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）、T.フラブス（T.flavus）、T.ラクテウス（T.lacteus）、T.ルベンス（T.rubens）、T.ルバー（T.ruber）などの高熱菌由来のDNAポリメラーゼや、デスルフロコッカス・モビリス（Desulfurococcus mobilis）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィルクム（Methanobacterium thermoautotrophilcum）、スルホロブス・ソルファタリクス（Sulfolobus solfataricus）、S.アシドカルダリウス（S.acidocaldarius）、サーモプラスマ・アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum）、ピロコッカス・コダカラエンシス（Pyrococcus kodakaraensis KOD1株）などの高熱性古細菌由来のDNAポリメラーゼなどが挙げられる。これらのうち、入手容易性等の理由から、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）由来のDNAポリメラーゼ（Taq DNAポリメラーゼ）、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来のDNAポリメラーゼ、あるいは、ピロコッカス・コダカラエンシス（Pyrococcus kodakaraensis KOD1株）由来のDNAポリメラーゼを利用するのが好ましい。
【００１４】
さらに、PCR反応液には、DNAポリメラーゼによる核酸増幅前の活性を阻害するために、DNAポリメラーゼに特異的な抗体を混合してもよい。この抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え法により製造された抗体、化学的または組換え法により製造された抗体フラグメント（例えば、Fabフラグメント）が挙げられる。これらのうち、モノクローナル抗体を用いるのが特に好ましい。例えば、Taq DNAポリメラーゼに対する公知のモノクローナル抗体は、約20℃〜40℃においてTaq DNAポリメラーゼの酵素活性を阻害することができると共に、PCRの熱的サイクルにおける高温によって不活性化される。
【００１５】
また、PCR反応は、一般に、4種類のdNTP、即ち、dATP、dCTP、dGTP及びdTTPの存在化において行う。
さらに、PCR反応は、一般に、適当な緩衝剤を含む反応液中で行われる。効率よく核酸を増幅させるためである。緩衝液は、使用するDNAポリメラーゼ等により、反応の最適条件を得るため適宜変更することができる。例えば、pHを適当に調整したトリス系の緩衝液に、塩化カリウムや塩化マグネシウムを加えた緩衝液を利用することができる。
また、PCR反応液には、5％〜10％のDMSOと1％〜2％のベタインを添加してもよい。鋳型DNAとなるcDNA断片が二字構造を有する場合に産物が増幅されにくいという問題を、最小限に留める効果を有するものである。
【００１６】
電気泳動工程では、アクリルアミドゲル電気泳動やアガロースゲル電気泳動など、公知の平板ゲル電気泳動などにより、cDNA断片（PCR産物）を電気泳動し、cDNA断片を分画することができる。また、キャピラリーカラムを用いた電気泳動を利用することもできる。これらの電気泳動には、公知の電気泳動装置を利用すればよい。
【００１７】
cDNA断片回収工程は、電気泳動の結果に基づいて目的とするcDNA断片を回収する工程であれば、いかなる方法を利用することもできる。
例えば、標識物質を検出することができるDNAシークエンサーにcDNA断片を供試して電気泳動工程を行い、その解析結果から、回収するcDNA断片を決定する。次に、再度同一サンプルを電気泳動して、目的とするcDNA断片が検出されたときに、その部分のゲルを切り出し、そこから当該cDNA断片を回収する方法が挙げられる。
また、ゲル電気泳動後、標識物質を検出することができるスキャナー上にゲルを載置し、その解析結果から回収するcDNA断片を決定する。そして、その部分のゲルを切り出し、そこから当該cDNA断片を回収する方法が挙げられる。
【００１８】
【００１９】
原核生物においては、前述したようにmRNAにポリＡテイルがないため、このポリＡテイルを利用して抽出した全RNAからmRNAを精製する方法を採ることができない。
これに対し、本発明のmRNA抽出工程では、まず、原核生物の細胞から全RNAを抽出する。そして、抽出した全RNAに対し、16S rRNAの一部に相補的な配列を有する第１ヌクレオチドを16S rRNAにハイブリダイズさせると共に、23S rRNAの一部に相補的な配列を有する第２ヌクレオチドを23S rRNAにハイブリダイズさせる。その後、第１ヌクレオチドのうち、16S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的な配列を有する第３ヌクレオチドが付加された第１タグ物質を、16S rRNAと第１ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせる。また、第２ヌクレオチドのうち、23S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的な配列を有する第４ヌクレオチドが付加された第２タグ物質を、23S rRNAと第２ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせる。その後、全RNAから、16S rRNAと第１ヌクレオチドと第３ヌクレオチドが付加された第１タグ物質との結合物を除去すると共に、23S rRNAと第２ヌクレオチドと第４ヌクレオチドが付加された第２タグ物質との結合物を除去する。
このような方法によれば、全RNAから、全RNAの中に多量に存在する16S rRNAと23S rRNAの大部分を除去することができる。従って、mRNAを容易により高純度に精製することができる。
【００２０】
ここで、第１ヌクレオチドは、16S rRNAの一部に相補的な配列を有し、かつ、第３ヌクレオチドに相補的な配列を有するものであれば、いかなるものであってもよい。従って、16S rRNAの一部に相補的な配列と第３ヌクレオチドに相補的な配列以外の配列を有していても構わない。ここでいう16S rRNAの一部に相補的な配列とは、16S rRNAの一部に対し100％相補的な配列に限られず、適当な条件下で16S rRNAにハイブリダイズできる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。また、第３ヌクレオチド相補的な配列も、第３ヌクレオチドに対し100％相補的な配列に限られず、適当な条件下で第３ヌクレオチドにハイブリダイズできる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。また、第１ヌクレオチドのうち、第３ヌクレオチドに相補的な配列は、第３ヌクレオチド全体に対応するものに限られず、第３ヌクレオチドの一部に対応するものでもよい。
【００２１】
同様に、第２ヌクレオチドは、23S rRNAの一部に相補的な配列を有し、かつ、第４ヌクレオチドに相補的な配列を有するものであれば、いかなるものであってもよい。従って、23S rRNAの一部に相補的な配列と第４ヌクレオチドに相補的な配列以外の配列を有していても構わない。ここでいう23S rRNAの一部に相補的な配列も、23S rRNAの一部に対し100％相補的な配列に限られず、適当な条件下で23S rRNAにハイブリダイズできる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。また、第４ヌクレオチド相補的な配列も、第４ヌクレオチドに対し100％相補的な配列に限られず、適当な条件下で第４ヌクレオチドにハイブリダイズできる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。また、第２ヌクレオチドのうち、第４ヌクレオチドに相補的な配列は、第４ヌクレオチド全体に対応するものに限られず、第４ヌクレオチドの一部に対応するものでもよい。
【００２２】
一方、第３ヌクレオチドは、第１ヌクレオチドのうち、16S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的な配列を有するものであれば、いかなるものであってもよい。従って、第１ヌクレオチドの一部に相補的な配列以外の配列を有していても構わない。ここでいう第１ヌクレオチドの一部に相補的な配列も、前述したように、第１ヌクレオチドに対し100％相補的な配列に限られず、適当な条件下で第１ヌクレオチドにハイブリダイズできる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。
【００２３】
同様に、第４ヌクレオチドは、第２ヌクレオチドのうち、23S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的な配列を有するものであれば、いかなるものであってもよい。従って、第２ヌクレオチドの一部に相補的な配列以外の配列を有していても構わない。ここでいう第２ヌクレオチドの一部に相補的な配列も、前述したように、第２ヌクレオチドに対し100％相補的な配列に限られず、適当な条件下で第２ヌクレオチドにハイブリダイズできる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。
【００２４】
タグ物質は、その物質の性質を利用することで、全RNAの中からタグ物質を含む結合物を除去できるものであれば、いずれの物質を利用することもできる。例えば、マグネットビーズが挙げられる。これをタグ物質に利用すれば、マグネットスタンド等を利用してマグネットビーズを沈降させることで、タグ物質を含む結合物のみを沈降させ、除去することができる。
【００２５】
【００２６】
【００２７】
【００２８】
さらに、本発明によれば、cDNA合成工程において、cDNAを合成すると共にcDNAの5'末端にタグ物質を付加しておく。
そして、cDNA加工工程において、まず、cDNAを第１制限酵素で切断する。その後、タグ物質に高親和性を有する高親和性物質に結合させることにより、タグ物質を有するcDNA断片を回収し、タグ物質を有しないcDNA断片を除去する。即ち、cDNAの5'末端側（PolyT末端側）のcDNA断片を回収し、3'末端側のcDNA断片を除去する。その後、この回収されたcDNA断片に、第１制限酵素の切断部位の配列に相補的な配列を有する第１アダプター配列を結合させる。
あるいは、cDNAを第１制限酵素で切断した後、cDNA断片に、第１制限酵素の切断部位の配列に相補的な配列を有する第１アダプター配列を結合させる。その後、タグ物質に高親和性を有する高親和性物質に結合させることにより、タグ物質を有するcDNA断片を回収し、タグ物質を有しないcDNA断片を除去する。
【００２９】
次に、第１アダプター配列が結合されたcDNA断片を第２制限酵素で切断する。その後、高親和性物質に結合させることにより、今度は、タグ物質を有するcDNA断片を除去し、タグ物質を有しないcDNA断片を回収する。即ち、第１アダプターが結合された側のcDNA断片を回収し、第１アダプターがない側のDNA断片を除去する。その後、この回収されたcDNA断片に、第２制限酵素の切断部位の配列に相補的な配列を有する第２アダプター配列を結合させる。
あるいは、cDNA断片を第２制限酵素で切断した後、cDNA断片に、第２制限酵素の切断部位の配列に相補的な配列を有する第２アダプター配列を結合させる。その後、高親和性物質に結合させることにより、タグ物質を有するcDNA断片を除去し、タグ物質を有しないcDNA断片を回収する。
【００３０】
このようにすれば、一端に第１アダプター配列を有し他端に第２アダプター配列を有するアダプター付きcDNA断片を容易に作成することができる。また、このようにして作成されたcDNA断片の群は、細胞で発現されたほとんど全ての遺伝子、即ち、公知の遺伝子も未知の遺伝子も同様に、その群の中に含まれるようにすることが可能である。従って、遺伝子発現解析において有効に活用することができる。
【００３１】
なお、本発明において、第１回収工程で利用する高親和性物質は、第１回収工程においてタグ物質に結合させてもよいが、例えば、第１切断工程前に予めタグ物質に結合させておいてもよい。
また、第２回収工程で利用する高親和性物質も、第２回収工程においてタグ物質に結合させてもよいが、例えば、第２切断工程前に予めタグ物質に接合させておいてもよい。
【００３２】
ここで、タグ物質と高親和性物質とは、互いに高親和性をもって特異的に結合することが可能な結合対を構成する物質であれば、いずれを利用することもできる。
また、制限酵素とは、一般的に、制限エンドヌクレアーゼとも称される酵素であり、特定の配列において二本鎖DNAを加水分解し切断する酵素である。上記の方法においては、適切な断片を得るために２種類の制限酵素（第１制限酵素及び第２制限酵素）を組み合わせて使用する。使用する制限酵素は、cDNA断片を識別可能な長さを有する断片に切断することが可能なものが好ましい。また、合成されたcDNA断片のより多くを、好ましくは、ほとんど全てを切断するような酵素が好ましい。また、制限酵素は、４塩基認識酵素を使用しても６塩基認識酵素を使用してもよいが、特に、上記の理由から、４塩基認識酵素の使用が好ましい。
【００３３】
また、アダプター配列は、PCR増幅の際に用いるプライマーを結合させるために用いるものであるが、使用する制限酵素に応じて設計される。即ち、第１制限酵素の酵素切断部位に結合させるための第１アダプター配列は、第１制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有し、また、第２制限酵素の酵素切断部位に結合させるための第２アダプター配列は、第２制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する。
【００３４】
【００３５】
さらに、本発明によれば、電気泳動工程は、ゲル電気泳動を行う。また、cDNA断片回収工程は、電気泳動を行ったゲルから目的のcDNA断片を含むゲルを切り出し、そのcDNA断片を回収する。
このようにcDNA断片の群をゲル電気泳動によって分画すれば、例えばキャピラリーカラムによる電気泳動に比べ、サイズ分解能を向上させることができる。このため、目的とするcDNA断片のみをより特異的に回収することができる。
【００３６】
【００３７】
【００３８】
【００３９】
【００４０】
【００４１】
【００４２】
さらに、本発明によれば、cDNA断片回収工程後、回収したcDNA断片をプラスミドベクターに連結し、組換え体プラスミドを形成する連結工程を備える。また、組換え体プラスミドを大腸菌に導入する導入工程を備える。
このように、回収した目的のcDNA断片をプラスミドベクターに連結し、大腸菌に導入しておけば、cDNA断片の構造解析をする場合などに有効である。即ち、形質転換したその大腸菌を培養し、それからcDNA断片を有するプラスミドDNAを抽出すれば、これを例えば塩基配列の決定等の構造解析に用いることができる。
【００４３】
さらに、上記の原核生物の遺伝子発現方法であって、前記第１ヌクレオチドと前記第２ヌクレオチドは、前記16S rRNAと前記23S rRNAが持つ共通配列に対し相補的である配列を有する同一のものであり、前記第３ヌクレオチドと前記第４ヌクレオチドも同一のものであり、前記第１タグ物質と前記第２タグ物質も同一のものであることを特徴とする原核生物の遺伝子発現方法とすると良い。
本発明によれば、第１ヌクレオチドと第２ヌクレオチドは、16S rRNAと23S rRNAが持つ共通配列に相補的な配列を有する同一の配列からなる。また、第３ヌクレオチドと第４ヌクレオチドも同一の配列からなる。さらに、第１タグ物質と第２タグ物質も同一物である。
従って、第１ヌクレオチドと第２ヌクレオチド、第３ヌクレオチドと第４ヌクレオチド、第１タグ物質と第２タグ物質は、それぞれ1種類で足りる。このため、16S rRNAと23S rRNAの除去がさらに容易にできる。
さらに、上記のいずれかに記載の原核生物の遺伝子発現解析方法であって、前記第１プライマー及び前記第２プライマーの少なくともいずれかには、標識物質が付与されており、前記電気泳動において、上記標識物質を検出することを特徴とする原核生物の遺伝子発現解析方法とすると良い。
本発明によれば、第１プライマー及び第２プライマーの少なくともいずれかには、標識物質が付与されている。そして、電気泳動において、この標識物質を検出する。
このように、標識物質を有するプライマーを用いてPCRを行えば、PCR産物も標識物質を有することになる。従って、PCR反応を行っても依然として目的とするcDNA断片が比較的少ない場合であっても、電気泳動においてこの標識物質を認識することで、目的とするcDNA断片のゲル中の位置を容易に検出することができる。
なお、標識物質は、電気泳動において検出感度が高いものであれば、いずれのものを使用することもできる。例えば、6-カルボキシフルオレッセイン（以下、FAMと称す。）、4,7,2',4',5',7'-ヘキサクロロ-6-カルボキシフルオレッセイン（以下、HEXと称す。）、NED（アプライドバイオシステムズジャパン社）、6-カルボキシ-X-ローダミン（以下、Roxと称す。）等の蛍光物質などを使用することができる。これらの標識物質は、例えば、プライマーDNAの末端（例えば5'末端）に結合させればよい。
さらに、上記のいずれかに記載の原核生物の遺伝子発現解析方法であって、前記タグ物質と前記高親和性物質の組み合わせが、ビオチンとストレプトアビジン、ビオチンとアビジン、ＦＩＴＣと抗ＦＩＴＣ抗体、及び、ＤＩＧとアンタイＤＩＧのいずれかであることを特徴とする原核生物の遺伝子発現解析方法とすると良い。
前述したように、タグ物質と高親和性物質とは、互いに高親和性をもって特異的に結合することが可能な結合対を構成する物質であれば、いずれを利用することもできる。中でも、取り扱いの容易性や入手容易性などの理由から、本発明のように、タグ物質と高親和性物質の組合せとして、ビオチンとストレプトアビジン、ビオチンとアビジン、ＦＩＴＣと抗ＦＩＴＣ抗体、DIGとアンタイDIGを利用するのが特に好ましい。なお、各組合せにおいて、いずれをタグ物質として使用しても、いずれを高親和性物質として使用してもよい。
さらに、上記の原核生物の遺伝子発現解析方法であって、前記cDNA断片回収工程後、前記連結工程前に、回収した前記cDNA断片について、前記第１アダプター配列に相補的な配列を有する第３プライマーと、前記第２アダプター配列に相補的な配列を有する第４プライマーとを用いて、PCR反応を行う第２PCR工程を備えることを特徴とする原核生物の遺伝子発現解析方法とすると良い。
【００４４】
本発明によれば、cDNA断片回収工程後、連結工程前に、回収したcDNA断片について、第１アダプター配列に相補的な配列を有する第３プライマーと、第２アダプター配列に相補的な配列を有する第４プライマーとを用いて、PCR反応を行う第２PCR工程を備える。
このような工程を行えば、cDNA断片回収工程で回収したcDNA断片が少量しかなくても、それを大幅に増幅させることができる。従って、効率よくcDNA断片をプラスミドベクターに連結し、大腸菌に導入することができる。
【００４５】
なお、このPCR工程で使用する第３プライマーは、第１アダプター配列に相補的な配列を有するものであればよく、例えば、上記の第１プライマーを利用しても良い。但し、後の導入工程を考慮して、適当な制限酵素の認識配列を有する第３プライマーを利用すれば、導入工程を効率よく、また、確実に行うことができる。同様に、第４プライマーは、第２アダプター配列に相補的な配列を有するものであればよく、例えば、上記の第２プライマーを利用しても良いが、適当な制限酵素の認識配列を有する第４プライマーを利用すれば、導入工程を効率よく、また、確実に行うことができる。
【００４６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例を、図を参照しつつ説明する。
まず、原核生物の細胞において発現された遺伝子を以下のように分類する。即ち、原核生物の細胞から全RNAを抽出しさらにmRNAを精製する。そして、mRNAの3'末端にポリＡを付加する。その後、このポリＡを利用してmRNAからcDNA群を合成する。その後、得られたcDNA群を適切な２つの制限酵素によって切断し、また、両端にアダプター配列を結合して、識別可能なだけの長さを有しかつ両端にアダプター配列を有するアダプター付きcDNA断片の群を作成する。その後、アダプター付きcDNA断片の群を、256種類のプライマーセットを用いて256個の群に分類する。
【００４７】
この分類の手法を図１を参照しつつ説明する。mRNAからなる群１からcDNAの群２を合成する。これを適切な２つの制限酵素によって切断してcDNA断片の群３を得る。そして、このcDNA断片の両末端の各2塩基、全4塩基の配列に応じて、即ち、4塩基がA、T、G、Cのいずれであるかにより、cDNA断片の群３を分類する。具体的には、5'末端の塩基（図１中に黒塗りで示す。）によってまず4個の群４に分類する。そして、これは次の２番目の塩基（図１中に黒塗りで示す。）によってさらに16個の群５に分類する。さらに、3'末端の２番目の塩基（図１中に黒塗りで示す。）によって64個の群６に分類し、さらに、3'末端の塩基（図１中に黒塗りで示す。）により256個の群７に分類する。
【００４８】
次に、細胞からmRNAを抽出し、mRNAの群１から256種類のcDNA断片の群７を調製する手法について、図２及び図３を参照しつつ具体的に説明する。図２における各アルファベットは塩基配列を構成する塩基を示すが、Ｎ、Ｍ、Ｗ、Ｘ、Ｙ及びＺは任意の塩基を示し、ＸとＹ及びＷとＺは、互いに相補的に結合する。
【００４９】
本実施例においては、原核生物の遺伝子発現解析をするにあたり、大腸菌に組み入れたアンピシリン耐性遺伝子（blaＭ）を標的遺伝子として解析を行った。
【００５０】
まず、mRNA抽出工程において、試験対象となる原核生物の細胞からmRNA１０を抽出する。
具体的には、原核生物の細胞から全RNAを抽出する。その後、16S rRNAの一部に相補的な配列を有する第１ヌクレオチドを16S rRNAにハイブリダイズさせると共に、23S rRNAの一部に相補的な配列を有する第２ヌクレオチドを23S rRNAにハイブリダイズさせる。次に、第１ヌクレオチドのうち、16S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的である配列を有する第３ヌクレオチドが付加された第１タグ物質を、16S rRNAと上記第１ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせる。また、第２ヌクレオチドのうち、23S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的である配列を有する第４ヌクレオチドが付加された第２タグ物質を、23S rRNAと第２ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせる。その後、全RNAから、16S rRNAと第１ヌクレオチドと第３ヌクレオチドが付加された第１タグ物質との結合物を除去すると共に、23S rRNAと第２ヌクレオチドと第４ヌクレオチドが付加された第２タグ物質との結合物を除去する。
【００５１】
好ましくは、第１ヌクレオチドと第２ヌクレオチドを、16S rRNAと23S rRNAが持つ共通配列に対し相補的である配列を有する同一のものとする。また、第３ヌクレオチドと第４ヌクレオチドも同一のものとする。さらに、第１タグ物質と第２タグ物質も同一のものとする。
即ち、図３に示すように、全RNAを抽出した後、16S rRNAと23S rRNAが持つ共通配列に対し相補的である配列を有する第１ヌクレオチド３２を、16S rRNAと23S rRNAにそれぞれハイブリダイズさせる。次に、第１ヌクレオチドのうち、16S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的である配列を有する第３ヌクレオチド３３が付加された第１タグ物質３４を、16S rRNAまたは23S rRNAと第１ヌクレオチド３２との結合物にそれぞれハイブリダイズさせる。その後、全RNAから、16S rRNAまたは23S rRNAと、第１ヌクレオチド３２と、第３ヌクレオチド３３が付加された第１タグ物質３４との結合物をそれぞれ除去する。
【００５２】
本実施例では、アンピシリン耐性遺伝子を持つ大腸菌、即ち、プラスミドpBluescriptを持つ大腸菌（DH5α株）を培養し、その細胞から、まず、全RNAを抽出した。この全RNAの抽出には、RNA抽出キット（Rneasy Protect Bacterial Mini Kit）を用いて、添付のマニュアルに従って抽出した。その後、抽出した全RNA10μgを用いて、mRNAを精製した。この精製には、MICROB Express Bacterial mRNA Isolation Kit（Ambion社製）を利用した。精製法は、添付のマニュアルに従った。
【００５３】
次に、ポリA付加工程において、mRNA１０の3'末端にポリAを付加し、ポリAが付いたmRNA１１を得る（図２参照）。
このポリA化反応の反応組成は次の通りである。 なお、5×PolyA bufferは、宝酒造のPolyA Polymerase添付の組成を参考に作成した。また、PolyA Polymeraseは、宝酒造製のものを使用した。
mRNA 500ng Xμl
５×PolyA buffer 4μl
５×MnCl2 4μl
PolyA Polymerase 1μl
DEPC処理水 11-Xμl
Total 20μl
【００５４】
上記の反応液を37℃で1時間インキュベートした。その後、反応液に TE buffer 180μlとフェノール・クロロフォルム溶液200μlを加えて混合した。続いて、この混合液を15,000rpmで5分間、室温で遠心分離した。そして、上澄み溶液を185μl（92.5μl×2）吸い取った。続いて、この上澄み溶液に3M酢酸ナトリウムを18.5μl加えて混合した。さらに、この溶液に520μlの99.5％エタノールを加えて混合した。その後、この溶液を−80℃で10分間保冷した。次に、これを15,000rpmで5分間、4℃で遠心分離した後、70％エタノールで沈殿をリンスした。続いて、これを15,000rpmで5分間、4℃で遠心分離した後、上澄みを除去した。その後、沈殿を風乾させ、DEPC処理水7μlに溶解した。このようにして、mRNAの3'末端にポリAテイルを付加させた。
【００５５】
次に、cDNA合成工程において、ポリAが付加されたmRNA１１から逆転写酵素を用いてcDNA１２を合成する。またその際、cDNAの5'末端にタグ物質を付加する。
本実施例では、mRNAの3'末端側のポリAテイルに相補的なオリゴdTプライマーをビオチン（タグ物質）で標識化しものをプライマーとして用いて、cDNAを合成した。
PolyA mRNA溶液（mRNA量は500ng） 7μl
10mM dNTP Mix 1μl
50μM Biotin-NotＩ anchored dt18 2μl
Total 10μl
まず、上記の混合物を65℃で5分間加温後、氷中で1分間以上放置した。
【００５６】
一方で、下記の混合物を作成した。なお、この混合物の作成には、インビトロジェン社のスーパースクリプトファーストストランドシステムを使用した。
10×RT buffer 2μl
25mM MgCl2 4μl
0.1M DTT 2μl
RNase out 1μl
Super Script II 1μl
Total 10μl
そして、この混合物を氷中で保冷した上記混合物に加えて混合した後、42℃で1時間インキュベートした。この反応液を1st Strand Mixとする。
【００５７】
また一方で、下記の混合物（これを2nd Strand Mixとする。）を作成した。この混合物は、インビトロジェン社製のものを利用した。
5×2nd Strand buffer 30μl
10mM dNTP Mix 4μl
0.1M DTT 2μl
E.coli Ligase 2μl
E.coli polymerase 4μl
RNaseH 1μl
DEPC処理水 87μl
Total 130μl
そして、この混合物を、上記の1st strand合成反応が終了するまで氷中に保存した。
【００５８】
次に、冷却した2nd Strand Mix 130μlを、上記の1st Strand Mixに加えて混合した後、16℃で2時間反応させた。その後は、70℃で15分間反応させて、酵素を失活させた。
反応終了後は、TE buffer 150μlを加え、さらに、フェノール・クロロフォルム溶液（和光純薬）を300μl加えて混合した。続いて、15,000rpmで5分間、室温で遠心分離した。その後、上澄み溶液を280μl吸い取り、これに3M酢酸ナトリウムを28μl加えて混合した。
その後、さらに770μlの99.5％エタノールを加えて混合した。そして、−80℃で10分間保冷した。次に、これを15,000rpmで15分間、4℃で遠心分離した後、70％エタノールで沈殿をリンスした。続いて、これを15,000rpmで3分間、4℃で遠心分離した後、上澄みを除去した。その後、沈殿を風乾させ、10mM Tris 25μlに溶解した。このようにして、mRNAからcDNAを合成した。
【００５９】
次に、cDNA加工工程について説明する。
まず、第１切断工程において、合成されたcDNA１２を第１制限酵素を用いて切断する。
本実施例では、下記の混合物を作成し、37℃で一晩放置した。なお、第１制限酵素として、４塩基認識制限酵素の１つであるHhaＩを用いた。
cDNA溶液 23μl
M buffer 5μl
HhaＩ（20U） 2μl
Water 20μl
Total 50μl
【００６０】
次に、65℃で15分間加温し、酵素を失活させた。その後、3M酢酸ナトリウム（和光純薬）を5μl加え、さらに99.5％エタノールを160μl加えて混合した。そして、−80℃で10分間保冷した。次に、これを15,000rpmで15分間、4℃で遠心分離した後、70％エタノールで沈殿をリンスした。続いて、これを15,000rpmで3分間、4℃で遠心分離した後、上澄みを除去した。その後、沈殿を風乾させた。
【００６１】
次に、第１アダプター結合工程において、切断されたcDNA断片に、第１制限酵素の切断部位の配列に相補的な配列を有する第１アダプター配列を結合させる。
本実施例では、風乾した沈殿を、5μlの1pmol/μlの第１アダプター溶液に溶解し、宝酒造のLigation kitのＩ液を5μl加えて混合した後、16℃で2時間反応させた。なお、第１アダプター配列を図４（ａ）に示した。
【００６２】
次に、第１回収工程において、タグ物質に高親和性を有する高親和性物質を結合させることにより、タグ物質を有するcDNA断片を回収する。
本実施例では、ストレプトアビジン（高親和性物質）１４を用いてビオチン１３を捕捉し、切断されたcDNA断片の3'末端側のみを回収した。具体的には、反応液にTE bufferを90μl加え、さらに、ビーズ懸濁液（ダイナル社製）を100μl加えた。そして、磁気ビーズに固定したストレプトアビジン１４に結合させることにより、切断されたcDNA断片の3'末端側を回収した。
【００６３】
次に、第２切断工程において、回収したcDNA断片を第２制限酵素を用いて切断する。
本実施例では、下記の混合物（２サンプル分）を作成した。なお、第１制限酵素として、４塩基認識制限酵素の１つであるSau3AIを用いた。
Sau3AI 10μl
H buffer 40μl
Water 250μl
Total 300μl
そして、この混合液を上記のビーズ入りチューブに150μl添加して混合する。そして、37℃で3時間保温する。
【００６４】
次に、第２回収工程において、高親和性物質に結合させることにより、タグ物質を有するcDNA断片を除去し、タグ物質を有しないcDNA断片を回収する。
具体的には、上記の反応終了後に、マグネットスタンドにチューブを立ててビーズを引きつけ、上澄み185μｌを新しいチューブに移す。そして、再度、TE buffer 100μlをビーズ入りチューブに入れて混合する。その後、再びマグネットスタンドにチューブを立ててビーズを引きつけ、上澄み85μｌを新しいチューブに移す。
次に、サンプル270μlに対して、３M酢酸ナトリウムを27μl、エタノールを750μl、ペイントペレット（宝酒造）を2μl加えて混合する。そして、−20℃で一晩放置する。その後、これを15,000rpmで15分間、4℃で遠心分離した後、70％エタノール500μlで沈殿をリンスした。続いて、これを15,000rpmで3分間、4℃で遠心分離した後、上澄みを除去した。その後、沈殿を風乾させた。
【００６５】
次に、第２アダプター結合工程において、回収されたcDNA断片に、第２制限酵素の切断部位の配列に相補的な配列を有する第２アダプター配列を結合させる。
本実施例では、風乾した沈殿を、5μlの1pmol/μlの第２アダプター溶液に溶解し、宝酒造のLigation kit ver.2のＩ液を5μl加えて混合した後、16℃で2時間反応させた。なお、第２アダプター配列を図４（ｂ）に示した。
次に、TE buffer 190μlと加え、さらに、フェノール・クロロフォルム溶液を200μl加えて混合した。続いて、15,000rpmで10分間、室温で遠心分離した。その後、上澄み溶液185μlを新しいチューブに移した。そして、これに3M酢酸ナトリウムを20μl加えて、さらに99.5％エタノールを510μlを加えて混合した。その後、-80℃で20分間保冷した。次に、これを15,000rpmで15分間、4℃で遠心分離した後、70％エタノール200μlで沈殿をリンスした。続いて、これを15,000rpmで3分間、4℃で遠心分離した後、上澄みを除去した。
その後、沈殿を風乾させ、TE buffer 50μlに溶解した。
以上のcDNA加工工程において、両末端に既知配列を含むアダプター付きcDNA断片１７の群が構築される。
【００６６】
次に、第１PCR工程において、アダプター付きcDNA断片１７の群について、第１アダプター配列に相補的な配列を有する第１プライマーと、第２アダプター配列に相補的な配列を有する第２プライマーとを用いて、PCR反応を行う。
本実施例では、このプライマーセットとして、図５（ａ）に示すように、第１アダプター配列に相補的な配列と、増幅させる方向にさらに2塩基の配列（図５中にNNで示す。）を有するプライマーと、図５（ｂ）に示すように、第２アダプター配列に相補的な配列と、増幅させる方向にさらに2塩基の配列を有するプライマー（図５中にNNで示す。）とを使用する。それぞれのプライマーの増幅される方向に付与した2塩基は、A、T、G、Cの４種類の塩基からなる全ての組合せによって設計されるので、合計256種類のプライマーセットが考えられる。従って、これらすべてのプライマーセットを用いて、cDNA断片１７の群についてPCRを行うことにより、256種類のcDNA断片１８の群に分類すると共に、PCR増幅を行うことが可能である。なお、PCRは、公知の手法により行えばよい。
以上のようにして得た256種類のcDNA断片１８の群は、目的とするcDNA断片を回収するためのサンプルとして利用することができる。
【００６７】
次に、256種類のcDNA断片の群の中から１つのcDNA断片の群をサンプルとして選択し、以下に示す手法により、目的とするcDNA断片を回収する。この手法については、図６を参照しつつ説明する。
まず、第１PCR工程において、cDNA断片の群２１について、第１アダプター配列１５に相補的な配列を有し、かつ、標識物質が結合された第１プライマーと、第２アダプター配列１６に相補的な配列を有する第２プライマーとを用いて、PCR反応により増幅させる。
具体的には、第１アダプター配列１５に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド１に、蛍光物質である近赤外蛍光色素IRD-800が結合された第１プライマーと、第２アダプター配列１６に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド２からなる第２プライマーとを用いて、PCR反応を行った。第１，第２プライマーは、それぞれ公知の手法により合成すればよい。
【００６８】
オリゴヌクレオチド１：
5'-cataggatcagatcagttgcgctc-3'
オリゴヌクレオチド２：
5'-gcactagtgcaatcgcacttgaacgatgatctg-3'
【００６９】
PCR反応の反応組成は、次の通りである。なお、KOD Dash、dNTPs、10×bufferは、東洋紡のものを使用した。
cDNA 0.5〜5ng
KOD Dash 2.5U
dNTPs 0.2mM（最終濃度）
10×buffer 5μl
IRD-800 蛍光標識プライマー 5pmol
Reverse primer 10pmol
Total 50μl
また、PCR反応は、パーキンエルマー社製の GeneAmp 2400 を用いて行った。PCR条件は、Stepdown PCR（Biotechniques，1996，20：478-485を参照されたい。）により行った。
【００７０】
本実施例では、アンピシリン耐性遺伝子の3'末端側が釣り上げられるはずであるので、図７に塩基配列とHhaIサイト及びSau3AIサイトと示すアンピシリン耐性遺伝子の658-826の断片が増幅してくるはずである。また、第１，第２アダプター配列を考慮すると、214bpのアダプター付きcDNA断片が増幅されるはずである。
【００７１】
次に、電気泳動工程において、第１PCR工程で増幅されたcDNA断片の群２２（PCR産物）についてゲル電気泳動を行う。
本実施例では、増幅したcDNA断片の群２２を、蛍光色素の読み取れるDNAシークエンサー（LI-COR社製LIC-4200L(S)-1）に供試し、サイズ分画のためにアクリルアミドゲル電気泳動を行った。アクリルアミドゲル２３の組成は、上記DNAシークエンサーに付属のマニュアルに従った。
【００７２】
次に、cDNA断片回収工程において、電気泳動の結果に基づいて、ゲルから目的のcDNA断片２４を含むゲルを切り出し、当該cDNA断片２４を回収する。
本実施例では、アクリルアミドゲル電気泳動を行った結果、図８に示すように、推定通りの位置にバンド（214bp）が現れた。なお、図８はシークエンサのデータより取得した画像である。次に、電気泳動を行ったゲルについて、濾紙を使用してゲルをゲル板から剥がした。続いて、濾紙にくっついたゲルを蛍光色素の検出できるスキャナー上に載置し、ゲル全体をイメージ化した。そして、目的のcDNA断片がゲル中のどの位置にあるかを把握し、この目的のcDNA断片を含むゲルを切り出した。なお、本実施例では、LI-COR社のゲルイメージングシステムオデッセイを使用した。
その後、切り出したアクリルアミドゲルから目的のcDNA断片を回収した。このDNAの抽出は、Omega Bio-tek社のE.Z.N.A. Poly-Gel DNA Extraction kitを使用した。
【００７３】
次に、第２PCR工程において、回収したcDNA断片２４について、第１アダプター配列１５に相補的な配列を有する第３プライマーと、第２アダプター配列１６に相補的な配列を有する第４プライマーとを用いて、再度PCR反応を行う。
具体的には、フォワード側には、第１アダプター配列に相補的な配列を有すると共に制限酵素NotI部位の配列を有する第３プライマーを、リバース側には、第２アダプター配列に相補的な配列を有すると共に制限酵素SpeI部位の配列を有する第４プライマーを用いて、PCR反応を行った。第３プライマーは、オリゴヌクレオチド３からなり、第４プレイマーは、オリゴヌクレオチド４からなる。
【００７４】
オリゴヌクレオチド３：
5'-cagcggccgctcataggatcagatcagttgcgctc-3'
オリゴヌクレオチド４：
5'-gcactagtgcaatcgcacttgaacgatgatctg-3'
【００７５】
また、このPCR工程においても、PCR反応は、パーキンエルマー社製の GeneAmp2400 を用い、Stepdown PCR（Biotechniques，1996，20：478-485を参照されたい。）の条件により行った。使用した酵素（DNAポリメラーゼ）は、東洋紡社製の KOD Dash 酵素である。反応液の組成は、添付のマニュアルに従った。
【００７６】
次に、連結工程において、第２PCR工程で増幅したcDNA断片２４の産物をプラスミドベクター２５に連結し、組換え体プラスミド２６を形成する。
具体的には、増幅したcDNA断片２４の産物を制限酵素NotIとSpeIで処理した上で、プラスミドベクター（pbluescriptII）２５に連結し、組換え体プラスミド２６を形成した。この連結は、宝酒造社製のライゲーションキットver.2 を使用し、その添付マニュアルに従って行った。
次に、導入工程において、組換え体プラスミド２６を大腸菌に導入する。
本実施例では、コンピテントセルとして E.coli DH5αを使用し、公知の手法により、組換え体プラスミド２６を大腸菌に導入した。
【００７７】
次に、形質転換した大腸菌から、公知の手法により組換え体プラスミドを抽出した。このプラスミドの抽出は、複数個のコロニーについて行った。そして、抽出したそれぞれの組換え体プラスミドについて、組み込まれたcDNA断片の塩基配列を決定した。その結果、cDNA断片は、確かに、アンピシリン耐性遺伝子の一部であった。
【００７８】
以上で説明したように、本実施例では、まず、原核生物の細胞からmRNAを抽出する。その後、抽出したmRNAの3'末端にポリＡテイルを付加する。そして、このポリＡテイルを利用して、mRNAからcDNAを合成する。次に、cDNA加工工程において、cDNAから一端に第１アダプター配列を有し他端に第２アダプター配列を有するアダプター付きcDNA断片を作成する。その後、このアダプター付きcDNA断片に対して、第１アダプター配列に相補的な配列を有する第１プライマーと、第２アダプター配列に相補的な配列を有する第２プライマーとを用いて、PCR反応を行う。次に、PCRで増幅されたcDNA断片について電気泳動を行う。そして、この電気泳動の結果に基づいて、目的のcDNA断片を回収し、遺伝子発現解析に利用する。
【００７９】
このような方法では、細胞から抽出したmRNAにポリＡを付加するので、これを利用することで容易にcDNAを合成することができる。従って、原核生物であっても、その遺伝子発現解析を容易に行うことができる。
さらに、cDNAから両端にアダプター配列を持つcDNA断片を作成し、これらのアダプター配列に相補的な配列を有するプライマーセットを用いてPCR反応を行うので、cDNA断片を多量に増幅することができる。従って、cDNA断片の群の中に存在する目的のcDNA断片が低濃度であっても、それを大幅に増幅することができ、電気泳動においてそれを容易に検出することができる。また、後述するように、第１，第２プライマーを適宜選択することにより、両端にアダプター配列を持つcDNA断片群の中から、一部のcDNA断片だけを選択的に増幅することができるため、遺伝子発現解析をより容易に行うことができる。
【００８０】
また、本実施例のmRNA抽出工程では、まず、原核生物の細胞から全RNAを抽出する。そして、抽出した全RNAに対し、16S rRNAの一部に相補的な配列を有する第１ヌクレオチドを16S rRNAにハイブリダイズさせると共に、23S rRNAの一部に相補的な配列を有する第２ヌクレオチドを23S rRNAにハイブリダイズさせる。その後、第１ヌクレオチドのうち、16S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的な配列を有する第３ヌクレオチドが付加された第１タグ物質を、16S rRNAと第１ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせる。また、第２ヌクレオチドのうち、23S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的な配列を有する第４ヌクレオチドが付加された第２タグ物質を、23S rRNAと第２ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせる。その後、全RNAから、16S rRNAと第１ヌクレオチドと第３ヌクレオチドが付加された第１タグ物質との結合物を除去すると共に、23S rRNAと第２ヌクレオチドと第４ヌクレオチドが付加された第２タグ物質との結合物を除去する。
さらに具体的には、第１ヌクレオチドと第２ヌクレオチドは、16S rRNAと23S rRNAが持つ共通配列に相補的な配列を有する同一の配列からなる。また、第３ヌクレオチドと第４ヌクレオチドも同一の配列からなる。さらに、第１タグ物質と第２タグ物質も同一物である。
【００８１】
従って、全RNAから、全RNAの中に多量に存在する16S rRNAと23S rRNAの大部分を除去することができる。従って、mRNAを容易により高純度に精製することができる。また、第１ヌクレオチドと第２ヌクレオチド、第３ヌクレオチドと第４ヌクレオチド、第１タグ物質と第２タグ物質は、それぞれ1種類で足りるため、16S rRNAと23S rRNAの除去がさらに容易にできる。
【００８２】
また、本実施例では、cDNA合成工程において、cDNAを合成すると共にcDNAの5'末端にタグ物質を付加しておく。
そして、cDNA加工工程において、まず、cDNAを第１制限酵素で切断する。その後、切断されたcDNA断片に、第１制限酵素の切断部位の配列に相補的な配列を有する第１アダプター配列を結合させる。その後、タグ物質に高親和性を有する高親和性物質に結合させることにより、タグ物質を有するcDNA断片を回収し、タグ物質を有しないcDNA断片を除去する。即ち、cDNAの5'末端側（PolyT末端側）のcDNA断片を回収し、3'末端側のcDNA断片を除去する。
次に、第１アダプター配列が結合されたcDNA断片を第２制限酵素で切断する。その後、高親和性物質に結合させることにより、今度は、タグ物質を有するcDNA断片を除去し、タグ物質を有しないcDNA断片を回収する。即ち、第１アダプターが結合された側のcDNA断片を回収し、第１アダプターがない側のDNA断片を除去する。その後、この回収されたcDNA断片に、第２制限酵素の切断部位の配列に相補的な配列を有する第２アダプター配列を結合させる。
【００８３】
このため、一端に第１アダプター配列を有し他端に第２アダプター配列を有するアダプター付きcDNA断片を容易に作成することができる。また、このようにして作成されたcDNA断片の群は、細胞で発現されたほとんど全ての遺伝子、即ち、公知の遺伝子も未知の遺伝子も同様に、その群の中に含まれるようにすることが可能である。従って、遺伝子発現解析において有効に活用することができる。
【００８４】
また、本実施例では、電気泳動工程は、ゲル電気泳動を行う。また、cDNA断片回収工程は、電気泳動を行ったゲルから目的のcDNA断片を含むゲルを切り出し、そのcDNA断片を回収する。
このようにcDNA断片の群をゲル電気泳動によって分画すれば、例えばキャピラリーカラムによる電気泳動に比べ、サイズ分解能を向上させることができる。このため、目的とするcDNA断片のみをより特異的に回収することができる。
【００８５】
また、本実施例では、第１プライマーには、標識物質が付与されている。そして、電気泳動において、この標識物質を検出する。
このように、標識物質を有するプライマーを用いてPCRを行えば、PCR産物も標識物質を有することになる。従って、PCR反応を行っても依然として目的とするcDNA断片が比較的少ない場合であっても、電気泳動においてこの標識物質を認識することで、目的とするcDNA断片のゲル中の位置を容易に検出することができる。
【００８６】
また、本実施例では、第１制限酵素としてHhaIを使用し、第２制限酵素としてSau3AIを使用している。
このような酵素を利用することにより、cDNA断片を識別可能な長さを有する断片に切断することができる。また、合成されたcDNA断片のより多くを切断することができる。
【００８７】
また、本実施例では、タグ物質としてビオチンを利用し、高親和性物質としてストレプトアビジンを利用している。このようなものを使用することは、その取り扱いの容易性や入手容易性などの理由から特に好ましい。
【００８８】
また、本実施例では、cDNA断片回収工程後、回収したcDNA断片をプラスミドベクターに連結し、組換え体プラスミドを形成する連結工程を備える。また、組換え体プラスミドを大腸菌に導入する導入工程を備える。
このように、回収した目的のcDNA断片をプラスミドベクターに連結し、大腸菌に導入しておけば、cDNA断片の構造解析をする場合などに有効である。即ち、形質転換したその大腸菌を培養し、それからcDNA断片を有するプラスミドDNAを抽出すれば、これを例えば塩基配列の決定等の構造解析に用いることができる。
【００８９】
また、本実施例では、cDNA断片回収工程後、連結工程前に、回収したcDNA断片について、第１アダプター配列に相補的な配列を有する第３プライマーと、第２アダプター配列に相補的な配列を有する第４プライマーとを用いて、PCR反応を行う第２PCR工程を備える。
このような工程を行えば、cDNA断片回収工程で回収したcDNA断片が少量しかなくても、それを大幅に増幅させることができる。従って、効率よくcDNA断片をプラスミドベクターに連結し、大腸菌に導入することができる。
【００９０】
以上において、本発明の実施の形態を実施例に即して説明したが、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で、適宜変更して適用できることは言うまでもない。
例えば、上記実施例のcDNA加工工程では、第１切断工程、第１回収工程、及び、第１アダプター結合工程について、第１切断工程、第１アダプター結合工程、第１回収工程の順序で行っているが、これらの工程を、第１切断工程、第１回収工程、第１アダプター結合工程の順序で行うようにしてもよい。
また、上記実施例のcDNA加工工程では、第２切断工程、第２回収工程、及び、第２アダプター結合工程について、第２切断工程、第２回収工程、第２アダプター結合工程の順序で行っているが、これらの工程を、第２切断工程、第２アダプター結合工程、第２回収工程の順序で行うようにしてもよい。
【００９１】
【配列表】
＜110＞ アイシン精機株式会社
AISIN SEIKI CO.,LTD
＜120＞ DNA回収法
＜130＞ ＡＫ０２０５２６
＜160＞ 4
＜210＞ 1
＜211＞ 24
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ 第１アダプター配列を参考にして合成
＜400＞ 1
cataggatca gatcagttgc gctc 24
＜210＞ 2
＜211＞ 33
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ 第２アダプター配列を参考にして合成
＜400＞ 2
gcactagtgc aatcgcactt gaacgatgat ctg 33
＜210＞ 3
＜211＞ 35
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ 第１アダプター配列と制限酵素NotI部位の配列を参考にして合成
＜400＞ 3
cagcggccgc tcataggatc agatcagttg cgctc 35
＜210＞ 4
＜211＞ 33
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ 第２アダプター配列と制限酵素SpeI部位の配列を参考にして合成
＜400＞ 3
gcactagtgc aatcgcactt gaacgatgat ctg 33
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例に関し、目的とするcDNA断片を回収するためのサンプルとなるcDNA断片群の作成方法についての概要を示す説明図である。
【図２】 実施例に関し、目的とするcDNA断片を回収するためのサンプルとなるcDNA断片群の作成方法についての詳細を示す説明図である。
【図３】 実施例に関し、rRNAを除去する方法を説明する説明図である。
【図４】 実施例に関し、（ａ）は第１アダプター配列を示す説明図であり、（ｂ）は第２アダプター配列を示す説明図である。
【図５】 実施例に関し、２５６種類のcDNA断片群に分類するためのプライマーセットの配列を示す説明図である。
【図６】 実施例に関し、cDNA断片の群から目的とするcDNA断片を回収する方法を示す説明図である。
【図７】 実施例に関し、アンピシリン耐性遺伝子の塩基配列と、その中のHhaI切断部位及びSau3AI切断部位を示す説明図である。
【図８】 実施例に関し、RT-PCRで増幅したcDNA断片の群を電気泳動した結果を示す、図面に変わる写真である。
Claims (5)
- 原核生物の細胞からmRNAを抽出するmRNA抽出工程と、
上記mRNAの3'末端にポリＡを付加するポリＡ付加工程と、
上記ポリＡが付加されたmRNAからcDNAを合成するcDNA合成工程と、
上記cDNAから一端に第１アダプター配列を有し他端に第２アダプター配列を有するアダプター付きcDNA断片を作成するcDNA加工工程と、
上記アダプター付きcDNA断片について、上記第１アダプター配列に相補的な配列を有する第１プライマーと、上記第２アダプター配列に相補的な配列を有する第２プライマーとを用いて、PCR反応を行う第１PCR工程と、
上記第１PCR工程で増幅されたcDNA断片について電気泳動を行う電気泳動工程と、
上記電気泳動の結果に基づいて、目的のcDNA断片を回収するcDNA断片回収工程と、を備え、
前記mRNA抽出工程は、
前記原核生物の細胞から全RNAを抽出する工程と、
16S rRNAの一部に相補的な配列を有する第１ヌクレオチドを上記16S rRNAにハイブリダイズさせると共に、23S rRNAの一部に相補的な配列を有する第２ヌクレオチドを23S rRNAにハイブリダイズさせる工程と、
上記第１ヌクレオチドのうち、上記16S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的である配列を有する第３ヌクレオチドが付加された第１タグ物質を、上記16S rRNAと上記第１ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせると共に、上記第２ヌクレオチドのうち、上記23S rRNAに相補的な部位とは別の部位に対し相補的である配列を有する第４ヌクレオチドが付加された第２タグ物質を、上記23S rRNAと上記第２ヌクレオチドの結合物にハイブリダイズさせる工程と、
上記全RNAから、上記16S rRNAと上記第１ヌクレオチドと上記第３ヌクレオチドが付加された上記第１タグ物質との結合物を除去すると共に、上記23S rRNAと上記第２ヌクレオチドと上記第４ヌクレオチドが付加された上記第２タグ物質との結合物を除去する工程と、
を有し、
前記cDNA合成工程は、前記cDNAを合成すると共に上記cDNAの5'末端にタグ物質を付加し、
前記cDNA加工工程は、
上記cDNAを第１制限酵素で切断する第１切断工程と、
上記タグ物質に高親和性を有する高親和性物質に結合させることにより、上記タグ物質を有するcDNA断片を回収する第１回収工程と、
上記タグ物質を有するcDNA断片に、上記第１制限酵素の切断部位の配列に相補的な配列を有する第１アダプター配列を結合させる第１アダプター結合工程と、
上記第１アダプター配列が結合されたcDNA断片を第２制限酵素で切断する第２切断工程と、
上記高親和性物質に結合させることにより、上記タグ物質を有するcDNA断片を除去し、上記タグ物質を有しないcDNA断片を回収する第２回収工程と、
上記タグ物質を有しないcDNA断片に、上記第２制限酵素の切断部位の配列に相補的な配列を有する第２アダプター配列を結合させる第２アダプター結合工程と、
を有し、
前記電気泳動工程は、ゲル電気泳動を行い、
前記cDNA断片回収工程は、ゲルから目的の前記cDNA断片を含むゲルを切り出し、当該cDNA断片を回収し、
前記cDNA断片回収工程後、回収した前記cDNA断片をプラスミドベクターに連結し、組換え体プラスミドを形成する連結工程と、
上記組換え体プラスミドを大腸菌に導入する導入工程と、を備える
ことを特徴とする原核生物の遺伝子発現解析方法。 - 請求項１に記載の原核生物の遺伝子発現方法であって、
前記第１ヌクレオチドと前記第２ヌクレオチドは、前記16S rRNAと前記23S rRNAが持つ共通配列に対し相補的である配列を有する同一のものであり、
前記第３ヌクレオチドと前記第４ヌクレオチドも同一のものであり、
前記第１タグ物質と前記第２タグ物質も同一のものである
ことを特徴とする原核生物の遺伝子発現方法。 - 請求項１または請求項２に記載の原核生物の遺伝子発現解析方法であって、
前記第１プライマー及び前記第２プライマーの少なくともいずれかには、標識物質が付与されており、
前記電気泳動において、上記標識物質を検出する
ことを特徴とする原核生物の遺伝子発現解析方法。 - 請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の原核生物の遺伝子発現解析方法であって、
前記タグ物質と前記高親和性物質の組み合わせが、ビオチンとストレプトアビジン、ビオチンとアビジン、ＦＩＴＣと抗ＦＩＴＣ抗体、及び、ＤＩＧとアンタイＤＩＧのいずれかである
ことを特徴とする原核生物の遺伝子発現解析方法。 - 請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の原核生物の遺伝子発現解析方法であって、
前記cDNA断片回収工程後、前記連結工程前に、回収した前記cDNA断片について、前記第１アダプター配列に相補的な配列を有する第３プライマーと、前記第２アダプター配列に相補的な配列を有する第４プライマーとを用いて、PCR反応を行う第２PCR工程を備える
ことを特徴とする原核生物の遺伝子発現解析方法。
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