ES2257549T3 - Amplificacion y deteccion de mycoplasma pneumoniae. - Google Patents

Amplificacion y deteccion de mycoplasma pneumoniae.

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ES2257549T3 ES02731359T ES02731359T ES2257549T3 ES 2257549 T3 ES2257549 T3 ES 2257549T3 ES 02731359 T ES02731359 T ES 02731359T ES 02731359 T ES02731359 T ES 02731359T ES 2257549 T3 ES2257549 T3 ES 2257549T3
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Abstract

Un oligonucleótido que consiste en una secuencia de unión a la diana seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de unión a la diana de ORF6LP1 (SEQ ID n.º 1), ORF6LP2 (SEQ ID n.º 2), ORF6Left PCR (SEQ ID n.º 12), ORF6RP1 (SEQ ID n.º 3), ORF6RP2 (SEQ ID n.º 4) y ORF5Right PCR (SEQ ID n.º 13), y, opcionalmente, una secuencia requerida para una reacción de amplificación.

Description

Amplificación y detección de Mycoplasma pneumoniae.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a los métodos para determinar la presencia o ausencia de Mycoplasma pneumoniae en las muestras respiratorias o en otros especímenes de pacientes o de muestras de cultivos. El método implica usar cebadores de ácidos nucleicos para amplificar específicamente una secuencia diana dentro del gen ORF6, preferiblemente usando una de las técnicas de amplificación con desplazamiento de cadena (ADC), amplificación con desplazamiento de cadena termófila (ADCt) o ADCt fluorescente en tiempo real.
Antecedentes de la invención
M. pneumoniae es predominantemente un patógeno de las vías respiratorias humanas y puede causar bronquitis, faringitis y neumonía atípica. Infecta más comúnmente a los niños mayores o adultos jóvenes. Los métodos de laboratorio estándares para diagnosticar M. pneumoniae incluyen el cultivo y la serología. Ambos métodos presentan inconvenientes; M. pneumoniae es fastidioso y requiere de 1 a 3 semanas de cultivo, mientras que la serología es insensible e inespecífica. Los métodos de amplificación de ácidos nucleicos para detectar M. pneumoniae ofrecen potencialmente ventajas en relación a la velocidad y unas sensibilidad y especificidad mejores.
Se ha realizado la cartografía física, como se describe en Wenzel et al. (1988, Nucl. Acids Res. 16: 8323-8336), y la secuenciación de todo el genoma, como se describe en Himmelreich et al. (1996, Nucl. Acids Res. 24: 4420-4449), de M. pneumoniae. Se sabe que varias proteínas de la membrana del micoplasma están implicadas en la unión de M. pneumoniae a las células hospedadoras. Éstas incluyen las proteínas P1, HMW1 y HMW3 así como los productos de expresión de 40 y 90 kDa del gen ORF6, los cuales se encuentran asociados entre sí en un complejo proteico transmembranario (Sperker et al., 1991, Mol. Microbiol. 5: 299-306; Layh-Schmitt, 1993, Zentralbl Bakteriol 278: 287-295; Layh-Schmitt, et al., 1999, FEMS Microbiol. Lett. 174: 143-149; Layh-Schmitt et al., 2000, Microbiol. 146: 741-747). El gen ORF6 es uno de los dos marcos de lectura abiertos que flanquean el gen de la proteína de unión P1. Para esta región del genoma de M. pneumoniae, se ha propuesto una organización similar a la de un operón con el orden ORF4-ORF5/P1-ORF6 (Su et al., 1987, Infect. Immun. 55: 3023-3029). El gen ORF6 de 3950 pb contiene un elemento repetitivo (RepMP5) de 1900 pb que se repite un total de ocho veces por el genoma M. pneumoniae (Ruland et al., 1994, J. Bacteriol. 176: 5202-5209). La importancia del gen ORF6 en la patogenicidad del organismo lo convierte en una diana potencialmente útil para el desarrollo de las pruebas diagnósticas específicas de M. pneumoniae. La selección del elemento RepMP5 dentro del gen ORF6 como una diana para estos análisis también tiene la ventaja de que se puede aumentar la sensibilidad con relación a la que se puede alcanzar centrándose en una secuencia monocopia dentro del genoma de M. pneumoniae.
La amplificación de ácidos nucleicos es una tecnología poderosa, que permite la detección rápida de secuencias específicas diana y, por lo tanto, es una tecnología prometedora para la detección y la identificación rápidas de M. pneumoniae. Los cebadores oligonucleotídicos de la presente invención son aplicables a la amplificación de ácidos nucleicos y la detección de M. pneumoniae.
Los términos siguientes se definen en la presente memoria de la siguiente manera:
Un cebador de amplificación es un cebador para amplificar una secuencia de una diana mediante la extensión del cebador después de la hibridación con la secuencia diana. Los cebadores de amplificación tienen, por regla general, una longitud aproximada de 10 a 75 nucleótidos, preferiblemente una longitud aproximada de 15 a 50 nucleótidos. La longitud total de un cebador de amplificación para la ADC es, por regla general, de unos 25 a 50 nucleótidos. El extremo 3' de un cebador de amplificación para la ADC (la secuencia de unión a la diana) se hibrida en el extremo 3' de la secuencia diana. La secuencia de unión a la diana es de una longitud aproximada de 10 a 25 nucleótidos y confiere la especificidad de hibridación al cebador de amplificación. El cebador de amplificación para la ADC además comprende un sitio de reconocimiento para una endonucleasa de restricción en 5' de la secuencia de unión a la diana. El sitio de reconocimiento es para una endonucleasa de restricción que mellará una cadena de un ADN bicatenario cuando el sitio de reconocimiento está hemimodificado, como se describe en G. Walker et al. (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392- 396 y 1992, Nucl. Acids Res. 20: 1691-1696). Los nucleótidos en 5' del sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción (la "cola") funcionan como un sitio de retrocebado para la polimerasa cuando el resto del cebador de amplificación se mella y se desplaza durante la ADC. La función de retrocebado de los nucleótidos de la cola mantiene la reacción de la ADC y permite la síntesis de múltiples amplicones a partir de una sola molécula diana. La cola tiene, por regla general, una longitud aproximada de 10 a 25 nucleótidos. Su longitud y secuencia generalmente no son cruciales y se pueden seleccionar y modificar como de costumbre. Como la secuencia de unión a la diana es la porción de un cebador que determina la especificidad de su diana, para los métodos de amplificación que no requieren secuencias especializadas en los extremos de la diana, generalmente el cebador de amplificación consiste en, esencialmente, sólo la secuencia de unión a la diana. Por ejemplo, la amplificación de una secuencia diana de acuerdo con la invención usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por su nombre en inglés) utilizará cebadores de amplificación que consisten en las secuencias de unión a la diana de los cebadores de amplificación descritos en la presente memoria. Para los métodos de amplificación que requieren secuencias especializadas anexadas a la diana distintas al sitio mellable de reconocimiento de la endonucleasa de restricción y a la cola de la ADC [p. ej., un promotor de la ARN polimerasa para la replicación de secuencias automantenida (3SR, por su nombre en inglés), la amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA, por su nombre en inglés), el sistema de amplificación basado en la transcripción (SAT) o la amplificación en círculo rodante (ACR)], la secuencia especializada requerida se puede unir a la secuencia de unión a la diana con los métodos habituales para la preparación de oligonucleótidos sin alterar la especificidad de hibridación del cebador.
Un cebador de choque o un cebador externo es un cebador utilizado para desplazar productos de extensión del cebador en las reacciones de amplificación isotérmicas. El cebador de choque se hibrida a una secuencia diana cadena arriba del cebador de amplificación, de tal forma que la extensión del cebador de choque desplaza el cebador de amplificación cadena abajo y su producto de extensión.
La terminología diana o secuencia diana se refieren a secuencias del ácido nucleico a amplificar. Éstas incluyen la secuencia del ácido nucleico original a amplificar, la segunda cadena complementaria a la secuencia del ácido nucleico original a amplificar y una de las dos cadenas de una copia de la secuencia original que se produce mediante la reacción de amplificación. Estas copias sirven como dianas amplificables en virtud del hecho de que contienen copias de la secuencia a la que se hibridan los cebadores de amplificación.
Las copias de la secuencia diana que se generan durante la reacción de amplificación se citan como productos de amplificación, amplímeros o amplicones.
El término producto de extensión se refiere a la copia de una secuencia diana producida por hibridación de un cebador y la extensión del cebador por la polimerasa, utilizando la secuencia diana como una plantilla.
El término específico de especie se refiere a la detección, amplificación o hibridación de oligonucleótidos a una especie de un organismo o a un grupo de especies relacionadas sin unas detección, amplificación o hibridación de oligonucleótidos significativas a otras especies del mismo género o especies de un género diferente.
El término sonda de análisis se refiere a cualquier oligonucleótido utilizado para facilitar la detección o identificación de un ácido nucleico. Las sondas detectoras, los cebadores detectores, las sondas de captura, los cebadores señaladores y las sondas indicadoras, tal y como se describen más abajo, son ejemplos de sondas de análisis.
Un cebador señalador comprende una secuencia de unión a la diana en 3' que se hibrida a una secuencia complementaria en la diana y que, además, comprende una secuencia de cola en 5' que no es complementaria a la diana (la secuencia adaptadora). La secuencia adaptadora es un marcador detectable indirectamente seleccionado de tal forma que su secuencia complementaria se hibridará al extremo 3' de la sonda indicadora descrita más abajo. El cebador señalador se hibrida, al menos parcialmente, a la secuencia diana cadena abajo del sitio de hibridación de un cebador de amplificación. El cebador señalador es extendido por la polimerasa de una manera similar a la extensión de los cebadores de amplificación. La extensión del cebador de amplificación desplaza el producto de extensión del cebador señalador de una manera dependiente de la amplificación de la diana, lo que produce un producto monocatenario que comprende una secuencia adaptadora en 5', una secuencia de unión a la diana cadena abajo y una secuencia de unión en 3' específica para la hibridación con un cebador de amplificación flanqueante para la ADC. La hibridación y la extensión de este cebador de amplificación flanqueante y su subsiguiente mella y extensión crea unos productos de amplificación que contienen la complementaria a la secuencia adaptadora que se puede detectar a modo de indicación de la amplificación de la diana.
Una sonda indicadora según la presente invención funciona como un oligonucleótido detector y comprende una marcación que, preferiblemente, es al menos un par colorante donante/extintor, a saber, un colorante donante de fluorescencia y un extintor (quencher) para el fluoróforo del donante. La marcación se une a una secuencia o a una estructura en la sonda indicadora (el resto indicador) que no se hibrida directamente a la secuencia diana. La secuencia de la sonda indicadora en 3' del resto indicador se selecciona para que se hibride a la complementaria de la secuencia adaptadora del cebador señalador. En general, el extremo 3' de la sonda indicadora no contiene secuencias con ninguna complementariedad significativa a la secuencia diana. Si están presentes los productos de la amplificación que contienen la complementaria de la secuencia adaptadora descritos anteriormente, luego pueden hibridarse al extremo 3' de la sonda indicadora. El cebado y la extensión desde el extremo 3' de la secuencia complementaria del adaptador permiten la formación de la complementaria del resto indicador. Esta formación suministra el resto indicador bicatenario, lo que permite detectar la marcación de la sonda indicadora e indica la presencia o la amplificación de la diana.
El término amplicón se refiere al producto de la reacción de amplificación generado a través de la extensión de cualquiera o de los dos cebadores de un par de cebadores de amplificación. Un amplicón puede contener ácidos nucleicos amplificados exponencialmente si ambos cebadores utilizados se hibridan a una secuencia diana. Alternativamente, se pueden generar amplicones mediante amplificación lineal si uno de los cebadores utilizados no se hibrida a la secuencia diana. Así, esta terminología se utiliza genéricamente en la presente memoria y no implica la presencia de ácidos nucleicos amplificados exponencialmente.
Compendio de la invención
La presente invención proporciona cebadores oligonucleotídicos que se pueden utilizar para amplificar una secuencia diana que se encuentra en M. pneumoniae. Más específicamente, la secuencia diana comprende un segmento del gen ORF6. Los cebadores de amplificación se han diseñado para la amplificación de gran eficacia y de gran especificidad a temperaturas elevadas, como en la ADCt y la PCR; sin embargo, también son útiles en las reacciones de amplificación a temperaturas bajas como la ADC convencional, 3SR, SAT, NASBA o ACR. Se utiliza una sonda indicadora oligonucleotídica que se hibrida a la complementaria de los cebadores señaladores específicos de la diana para detectar los productos de amplificación.
Los oligonucleótidos de la invención se pueden utilizar tras el cultivo como un medio para confirmar la identidad del organismo cultivado. Alternativamente, se pueden utilizar para la detección y la identificación de M. pneumoniae en las muestras clínicas de humanos o de animales utilizando los métodos de amplificación conocidos. En cualquier caso, los oligonucleótidos de la invención y los métodos de análisis proporcionan unos medios para discriminar rápidamente entre M. pneumoniae y otros microorganismos, lo que permite al profesional identificar este microorganismo rápidamente sin recurrir a los procedimientos más tradicionales en los que confía habitualmente. Esta identificación rápida del agente causal específico implicado en una infección proporciona información que se puede utilizar para determinar la acción adecuada en un breve periodo de tiempo.
Compendio de las secuencias
Las SEQ ID n.º 1 a 2 son las secuencias de los oligonucleótidos utilizados como cebadores cadena arriba para amplificar una secuencia dentro del gen ORF6. Las SEQ ID n.º 3 a 4 son las secuencias de los oligonucleótidos utilizados como cebadores cadena abajo para amplificar una secuencia dentro del gen ORF6. Las SEQ ID n.º 5 a 6 son las secuencias de los oligonucleótidos utilizados como cebadores de choque cadena arriba para amplificar por ADC. Las SEQ ID n.º 7 a 8 son las secuencias de los oligonucleótidos utilizados como cebadores de choque cadena abajo para amplificar por ADC. Las SEQ ID n.º 9 a 10 son las secuencias de los oligonucleótidos señaladores para la amplificación y la detección de una secuencia dentro del gen ORF6. La SEQ ID n.º 11 es una secuencia de una sonda indicadora diseñada para detectar una secuencia dentro del gen ORF6 cuando se utiliza junto a cualquiera de los cebadores señaladores anteriormente mencionados. La SEQ ID n.º 12 es una secuencia de un oligonucleótido utilizado como un cebador cadena arriba para amplificar por PCR una secuencia dentro del gen ORF6. La SEQ ID n.º 13 es una secuencia de un
oligonucleótido utilizado como un cebador cadena abajo para amplificar por PCR una secuencia dentro del gen ORF6.
Breve descripción de los dibujos
Los distintos objetos, ventajas y nuevas características de la presente invención se comprenderán fácilmente a partir de la siguiente descripción detallada cuando se lee junto con los dibujos adjuntos en los que:
La fig. 1 ilustra la detección de una secuencia diana del gen ORF6 del ácido nucleico de M. pneumoniae en una reacción de amplificación con desplazamiento de cadena (ADC) según el método de la invención.
La fig. 2 ilustra la generación de un producto de amplificación de 529 pb cuando las SEQ ID n.º 12 y 13 se utilizan en la amplificación por PCR de la secuencia diana del gen ORF6 del ácido nucleico de M. pneumoniae.
La fig. 3 ilustra la ausencia de reactividad cruzada de las SEQ ID n.º 12 y 13 cuando se utilizan en la amplificación por PCR del ácido nucleico de los organismos filogenéticamente relacionados con M. pneumoniae.
La fig. 4 ilustra el alineamiento de las secuencias de unión a la diana de las SEQ ID n.º 1, 3, 5, 7 y 9 en la amplificación por ADC del gen ORF6 de varias cepas de M. pneumoniae.
La fig. 5 ilustra el alineamiento de las secuencias de unión a la diana de las SEQ ID n.º 2, 4, 6, 8 y 10 en la amplificación por ADC del gen ORF6 de varias cepas de M. pneumoniae.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a oligonucleótidos, cebadores de amplificación y cebadores señaladores que muestran especificidad por M. pneumoniae en las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos. También se proporcionan los métodos para detectar e identificar ácidos nucleicos de M. pneumoniae utilizando los oligonucleótidos de la invención. Los métodos a usar preferidos son la ADC, la ADCt o la ADCt fluorescente y homogénea en tiempo real. Estos métodos los conocen los expertos en la técnica a partir de referencias tales como la patente de los EE.UU. n.º 5.547.861, la patente de los EE.UU. n.º 5.648.211, la patente de los EE.UU. n.º 5.846.726, la patente de los EE.UU. n.º 5.919.630, la patente de los EE.UU. n.º 5.928.869, la patente de los EE.UU. n.º 5.958.700, la patente de los EE.UU. n.º 5.935.791, la patente de los EE.UU. n.º 6.054.279, la patente de los EE.UU. n.º 6.130.047, la solicitud de la patente de los EE.UU. de n.º de serie.09/590.061, presentada el 8 de junio de 2000 y la solicitud de la patente de los EE.UU. de n.º de serie 09/602996, presentada el 23 de junio de 2000.
Los cebadores de la presente invención se diseñaron en base a un análisis de los datos de la secuencia del gen ORF6 a partir de la cepa M129 citada en el acceso al GenBank n.º NC 000912. Como se muestra en la tabla 1, se evaluó la especificidad para M. pneumoniae de los cebadores para PCR que abarcan varias regiones diana dentro del gen ORF6. La conservación de la secuencia dentro de la región diana seleccionada se evaluó mediante el análisis de la secuencia de los productos de la PCR a partir de 8 cepas de referencia de M. pneumoniae para demostrar la homología en la región diana. Se diseñaron dos sistemas de ADC dentro de la región diana del ORF6 amplificado por PCR. Los cebadores desarrollados para ser usados en la ADCt se muestran en la tabla 1. También se muestran los cebadores señaladores y la sonda indicadora para amplificar y detectar los amplicones resultantes. Los sitios de reconocimiento de la endonucleasa de restricción (BsoBI) en los cebadores de amplificación se muestran en negrita y las secuencias de unión a las dianas están en cursiva. La secuencia de unión a la diana de un cebador de amplificación determina su especificidad por la diana.
TABLA 1 Oligonucleótidos de amplificación
1
Como los ácidos nucleicos no requieren una complementariedad total para hibridarse, se debe entender que las secuencias de la sonda y del cebador descritas en la presente memoria se pueden modificar en cierta medida sin que dejen de ser útiles como sondas y cebadores específicos de M. pneumoniae. Tal y como se conoce en la técnica, la hibridación de secuencias de ácidos nucleicos complementarios y parcialmente complementarios se puede producir mediante el ajuste de las condiciones de hibridación para aumentar o disminuir el rigor (a saber, ajuste del pH, de la temperatura o del contenido de sales del tampón de hibridación). Tales pequeñas modificaciones de las secuencias descritas y cualquier ajuste necesario de las condiciones de hibridación realizados para mantener la especificidad para M. pneumoniae requieren sólo la experimentación habitual y se encuentran al alcance de los expertos en la
técnica.
Los productos de amplificación generados con los cebadores descritos en la presente memoria se pueden detectar por su tamaño característico, por ejemplo, como se ilustra en las figuras 2 y 3, en geles de poliacrilamida o agarosa teñidos con bromuro de etidio. Alternativamente, las secuencias amplificadas de la diana se pueden detectar por medio de una sonda de análisis, que es un oligonucleótido etiquetado con una marcación detectable. En una realización, se puede usar al menos una sonda de análisis etiquetada para detectar las secuencias amplificadas de la diana por hibridación (una sonda detectora), mediante hibridación y extensión tal y como se describe en Walker et al. (1992, Nucl. Acids Res. 20: 1691-1696) (un cebador detector) o mediante hibridación, extensión y conversión en la forma bicatenaria tal y como se describe en la patente europea EP 0 678 582 (un cebador señalador).
En la figura 1 se ilustra esquemáticamente una realización preferida para detectar la diana amplificada. En esta realización, la secuencia de cola en 5' del cebador señalador está comprendida por una secuencia que no se hibrida con la diana (la secuencia adaptadora). La secuencia adaptadora es un marcador detectable indirectamente que se puede seleccionar de tal forma que sea el mismo en diversos cebadores señaladores que tengan distintas secuencias de unión a la diana en 3' (a saber, una secuencia de cola en 5' "universal"). Los oligonucleótidos que tienen las SEQ ID n.º 9 y 10 son particularmente útiles como cebadores señaladores, junto con los cebadores de amplificación de la invención, para detectar los organismos de M. pneumoniae. Preferiblemente, una sonda de análisis es una única secuencia de sonda indicadora que se hibrida con la complementaria de la secuencia del adaptador de los cebadores señaladores de la invención. Un oligonucleótido que tiene la secuencia de la SEQ ID n.º 11 es particularmente útil como sonda indicadora cuando se usa junto con los cebadores señaladores de la invención para la detección de M. pneumoniae. Alternativamente, se puede seleccionar una sonda de análisis para hibridarse con una secuencia en la diana que esté entre los cebadores de amplificación. En una realización adicional, se puede usar como sonda de análisis un cebador de amplificación o la secuencia de unión a la diana del mismo.
La marcación detectable de la sonda de análisis es un resto que se puede detectar tanto directa como indirectamente como una indicación de la presencia del ácido nucleico diana. Para detectar directamente la marcación, las sondas de análisis se pueden etiquetar con un radioisótopo y detectarse por autrorradiografía, o se pueden etiquetar con un resto fluorescente y detectarse por fluorescencia tal y como se conoce en la técnica. Alternativamente, las sondas de análisis se pueden detectar indirectamente al etiquetarlas con una marcación que requiere otros reactivos adicionales para hacerla detectable. Las marcaciones detectables indirectamente incluyen, por ejemplo, los agentes quimioluminiscentes, enzimas que generan productos de reacción visibles y ligandos (p. ej., haptenos, anticuerpos o antígenos) que se pueden detectar al unirse a asociados de unión específicos marcados (p. ej., anticuerpos o antígenos/haptenos). Los ligandos también son útiles para inmovilizar el oligonucleótido marcado con el ligando (la sonda de captura) sobre una superficie sólida para facilitar su detección. Las marcaciones particularmente útiles incluyen la biotina (detectable al unirse a avidina o estreptavidina marcadas) y las enzimas tales como la peroxidasa de rábano o la fosfatasa alcalina (detectables al añadir los sustratos enzimáticos para generar los productos de reacción coloreados). Los métodos para añadir tales marcaciones a los oligonucleótidos, o para incluir tales marcaciones en ellos, se conocen bien en la técnica y cualquiera de estos métodos es adecuado para ser usado en la presente invención.
Los ejemplos de los métodos de detección específica que se pueden emplear incluyen un método quimioluminiscente en el cual los productos amplificados se detectan con una sonda de captura biotinilada y una sonda detectora conjugada a una enzima tal y como se describe en la patente de los EE.UU. n.º 5.470.723. Después de la hibridación de estas dos sondas de análisis en sitios diferentes en la región de análisis de la secuencia diana (entre los sitios de unión de los dos cebadores de amplificación), el complejo se captura en una placa de microvaloración recubierta con estreptavidina por medio de la sonda de captura, y la señal quimioluminiscente se revela y se lee en un luminómetro. En la reacción de ADC se puede incluir un cebador señalador tal y como se describe en la patente europea EP
0 678 582 como otra alternativa para detectar los productos de amplificación. En otra alternativa para detectar los productos de amplificación, el cebador señalador puede contener secuencias que no se hibridan con la secuencia diana, p. ej., la secuencia adaptadora. En esta realización, tal y como se ilustra en la figura 1, una sonda indicadora con una marcación asociada se puede hibridar con la complementaria de la secuencia adaptadora. En ambas realizaciones del cebador señalador, se generan productos de amplificación secundarios durante la ADC de forma dependiente de la amplificación de la diana y se puede percibir como una indicación de la amplificación de la diana.
Por conveniencia comercial, los cebadores de amplificación para la detección e identificación específicas de los ácidos nucleicos se pueden envasar en forma de un kit. Por regla general, tal kit contiene, al menos, un par de cebadores de amplificación. Los reactivos para realizar una reacción de amplificación de ácidos nucleicos también se pueden incluir con los cebadores de amplificación específicos de la diana, por ejemplo, tampones, cebadores adicionales, nucleótidos trifosfato, enzimas, etc. Los componentes del kit se envasan juntos en un envase común, que incluye opcionalmente las instrucciones para llevar a cabo una realización específica de los métodos de la invención. También se pueden incluir otros componentes opcionales en el kit, p. ej., un oligonucleótido etiquetado con una marcación adecuada para usarse como una sonda de análisis y/o reactivos o medios para detectar la marcación.
Para la presente invención, tal kit se puede configurar para proporcionar los componentes necesarios para un panel respiratorio de organismos que infectan las vías respiratorias. Tal panel respiratorio puede incluir Bordetella pertussis, Legionella pneumophila, M. pneumoniae y los organismos de la familia Chlamydiaceae además de otros microorganismos capaces de ocasionar una infección de las vías respiratorias. Así, tal panel respiratorio incluiría los cebadores para amplificar una secuencia del ácido nucleico específico para cada uno de los organismos del panel respiratorio. Los cebadores, de choque, cebadores señaladores y sondas indicadoras útiles para amplificar y detectar B. pertussis, L. pneumophila y los organismos de la familia Chlamydiaceae se describen en la solicitud de patente de los EE.UU. en tramitación con la presente con n.º de serie 09/626.855, presentada el 27 de julio de 2000, la solicitud de patente de los EE.UU. en tramitación con la presente con n.º de serie 09/626.354, presentada el 27 de julio de 2000 y la solicitud de patente de los EE.UU. en tramitación con la presente con n.º de serie 09/708.208, presentada el 8 de noviembre de 2000, respectivamente. Cuando se usa, tal kit con panel respiratorio puede permitir realizar reacciones de amplificación distintas para cada organismo o una o más reacciones de amplificación muliplex para proporcionar los resultados que indiquen la presencia o ausencia de cada uno de los organismos del panel.
Las secuencias de unión a la diana de los cebadores de amplificación le confieren especificidad de hibridación de especie a los oligonucleótidos y, por lo tanto, proporcionan especificidad de especie a la reacción de amplificación. Así, las secuencias de unión a la diana de los cebadores de amplificación de la invención también son útiles para otros protocolos de amplificación de ácidos nucleicos como la PCR, la ADC convencional (un esquema de reacción que es esencialmente el mismo que el de la ADCt pero llevado a cabo a menores temperaturas con enzimas mesófilas), 3SR, NASBA, SAT y ACR. Específicamente, cualquier protocolo de amplificación que utilice la hibridación cíclica y específica de los cebadores con la secuencia diana, la extensión de los cebadores usando la secuencia diana como molde y la separación o el desplazamiento de los productos de extensión de la secuencia diana puede emplear las secuencias de unión a la diana de la invención. Para los métodos de amplificación que no requieran secuencias especializadas que no se unan a la diana (p. ej., PCR), los cebadores de amplificación pueden consistir, esencialmente, en las secuencias de unión a la diana de los cebadores de amplificación enumerados en la tabla 1.
Opcionalmente, se pueden añadir otras secuencias, tal y como se requieren para realizar una reacción de amplificación determinada, a las secuencias de unión a la diana descritas en la presente memoria sin alterar la especificidad de especie del oligonucleótido. A modo de ejemplo, los cebadores de amplificación específicos pueden contener un sitio de reconocimiento para la endonucleasa de restricción BsoBI que se mella durante la reacción de ADC. Al experto en la técnica le resultará obvio que el sito de reconocimiento de BsoBI se puede sustituir por otros sitios mellables por endonucleasas de restricción que incluyen, pero no se limitan a ellos, los sitios de reconocimiento descritos en la patente europea EP 0 684 315. Preferiblemente, el sitio de reconocimiento es para una endonucleasa de restricción termófila de manera que la reacción de amplificación se pueda realizar en las condiciones de la ADCt. De forma similar, la secuencia de cola del cebador de amplificación (en 5' respecto al sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción) no es crítico generalmente, aunque se debe evitar que el sitio de restricción usado para la ADC y las secuencias se hibride tanto con su propia secuencia de unión a la diana como con los otros cebadores. En consecuencia, algunos cebadores de amplificación para la ADC consisten en las secuencias de unión a la diana en 3', un sitio de reconocimiento mellable por la endonucleasa de restricción en 5' respecto a la secuencia de unión a la diana, y una secuencia de cola de una longitud de unos 10 a 25 nucleótidos en 5' respecto al sitio de reconocimiento de la enzima de restricción. El sitio mellable por la endonucleasa de restricción y la secuencia de cola son las secuencias requeridas para la reacción de la ADC.
Tal y como se describe en la solicitud de patente de los EE.UU. con n.º de serie 09/573.242, presentada el 18 de mayo de 2000, algunos cebadores de amplificación para la ADC pueden consistir en secuencias específicas de la diana tanto en 5' como en 3' del sitio de reconocimiento de la enzima de restricción. Con este diseño se consigue un aumento de la eficacia de la hibridación específica a la diana. Para otras reacciones de amplificación (p. ej., 3SR, NASBA, SAT y ACR), los cebadores de amplificación pueden consistir en la secuencia de unión a la diana y secuencias adicionales requeridas para la reacción de amplificación seleccionada (p. ej., las secuencias requeridas para la ADC tal y como se describió anteriormente o un promotor reconocido por la ARN polimerasa para la 3SR). La adaptación de las secuencias de unión a la diana de la invención para los métodos de amplificación distintos a la ADC emplea los métodos habituales para preparar cebadores de amplificación, como la síntesis química y los requerimientos estructurales bien conocidos para los cebadores de la reacción de amplificación seleccionada. En consecuencia, las secuencias de unión a la diana de la invención se pueden adaptar con facilidad para amplificar y detectar la diana específica del organismo M. pneumoniae en diversas reacciones de amplificación sólo con los métodos habituales para la producción, la detección sistemática y la optimización.
En la ADC, los cebadores de choque no son esenciales para la especificidad de especie, ya que funcionan desplazando los cebadores de amplificación específicos de especie cadena abajo. Sólo se requiere que los cebadores de choque se hibriden con la diana cadena arriba de los cebadores de amplificación de manera que, cuando se extienden, desplacen el cebador de amplificación y su producto de extensión. Por lo tanto, la secuencia concreta del cebador de choque no es crítica por lo general, y se puede deducir de cualquier secuencia diana cadena arriba que esté lo suficientemente cerca al sitio de unión del cebador de amplificación como para permitir el desplazamiento del producto de extensión del cebador de amplificación en cuanto se extiende el cebador de choque. Los emparejamientos erróneos ocasionales con la diana en la secuencia del cebador de choque o algún tipo de hibridación cruzada con secuencias que no son de la diana, generalmente, no afectan negativamente la eficacia de la amplificación siempre que el cebador de choque siga siendo capaz de hibridarse con la secuencia específica de la diana.
Las reacciones de amplificación que empleen los cebadores de la invención pueden incorporar timina tal y como se explica en Walker et al. (1992, Nucl. Acids Res.20: 1691-1696), o se puede sustituir total o parcialmente la TTP con la 2'-desoxiuridina 5'-trifosfato en la reacción para reducir la contaminación cruzada de las posteriores reacciones de amplificación, p. ej., como se explica en la patente europea EP 0 624 643. La dU (uridina) se incorpora en los productos de amplificación y se puede escindir mediante un tratamiento con uracilo ADN glucosilasa (UDG). Estos sitios abásicos originan un producto de amplificación que no se puede amplificar en las posteriores reacciones de amplificación. La UDG se puede inactivar mediante el inhibidor de la uracilo ADN glucosilasa (UGI, por su nombre en inglés) antes de realizar la subsiguiente amplificación con el objeto de prevenir la escisión del dU en los productos de amplificación recién formados.
La ADC es un método isotérmico de amplificación de ácidos nucleicos en el que se producen, en la mezcla de reacción, la extensión de los cebadores, la mella del sitio hemimodificado de reconocimiento/escisión de la endonucleasa de restricción, el desplazamiento de los productos de extensión monocatenarios, la hibridación de los cebadores con los productos de la extensión (o la secuencia original de la diana) y la posterior extensión de los cebadores. En esto se diferencia de la PCR, en la que las etapas de la reacción se producen en fases discontinuas o ciclos como resultado de las características cíclicas de la temperatura en la reacción. La ADC se basa en 1) la capacidad de una endonucleasa de restricción de mellar la cadena sin modificar de la forma hemifosforotioato en su sitio de reconocimiento/escisión bicatenario y 2) la capacidad de ciertas polimerasas para iniciar la replicación en las mellas y desplazar la cadena que no hace de molde que se encuentra cadena abajo. Después de una incubación inicial a una temperatura elevada (aproximadamente 95ºC) para desnaturalizar las secuencias bicatenarias de la diana con el fin de hibridar los cebadores, tiene lugar a una temperatura constante la posterior polimerización y el desplazamiento de las cadenas recién sintetizadas. La producción de cada nueva copia de la secuencia diana consiste en cinco etapas: 1) unión de los cebadores de amplificación a una secuencia original de la diana o a un producto de extensión monocatenario desplazado previamente polimerizado, 2) extensión de los cebadores mediante una polimerasa con la actividad 5'-3' exonucleasa inactivada para incorporar un \alpha-tio-desoxinucleósido trifosfato (\alpha-tio-dNTP), 3) mella de un sitio de restricción bicatenario hemimodificado, 4) disociación de la enzima de restricción del sitio de mella y 5) extensión desde el extremo 3' de la mella mediante la polimerasa con la actividad 5'-3' exonucleasa inactivada, con desplazamiento de la cadena recién sintetizada cadena abajo. La mella, la polimerización y el desplazamiento se producen simultánea y continuamente a una temperatura constante debido a que la extensión desde la mella regenera otro sitio de restricción mellable. Cuando se usa un par de cebadores de amplificación, y cada uno de ellos se hibrida con una de las dos cadenas de una secuencia bicatenaria de la diana, la amplificación es exponencial. Esto es así porque las cadenas sentido y antisentido sirven como molde para el cebador opuesto en las posteriores rondas de amplificación. Cuando se usa un solo cebador de amplificación, la amplificación es lineal porque sólo una de las cadenas sirve de molde para la extensión del cebador. Ejemplos de endonucleasas de restricción que mellan sus sitios de reconocimiento/escisión bicatenarios cuando se incorpora un \alpha-tio-dNTP son HincII, HindII, AvaI, NciI y Fnu4HI. Todas estas endonucleasas de restricción y otras que presenten la actividad melladora requerida resultan adecuadas para ser usadas en la ADC convencional. Sin embargo, son relativamente termolábiles y pierden la actividad por encima de aproximadamente 40ºC.
Las dianas a amplificar por ADC se pueden preparar por fragmentación de ácidos nucleicos más largos por restricción con una endonucleasa que no corte la secuencia diana. Sin embargo, se prefiere por lo general que los ácidos nucleicos diana que tienen los sitios seleccionados de reconocimiento/escisión de la endonucleasa de restricción para mellar en la reacción de ADC se generen tal y como se describe en Walker et al. (1992, Nucl. Acids Res. 20: 1691-1696) y en la patente de los EE.UU. n.º 5.270.184 (específicamente incorporada en la presente memoria por referencia). Brevemente, si la secuencia diana es bicatenaria, se le hibridan cuatro cebadores. Dos de los cebadores (S1 y S2) son cebadores de amplificación para la ADC y dos (B1 y B2) son cebadores externos o de choque. S1 y S2 se unen a cadenas opuestas de los ácidos nucleicos bicatenarios flanqueando la secuencia diana. B1 y B2 se unen a la secuencia diana en 5' (esto es, cadena arriba) de S1 y S2, respectivamente. Luego, la polimerasa sin actividad exonucleasa se usa para extender simultáneamente los cuatro cebadores en presencia de tres desoxinucleósidos trifosfato y al menos un desoxinucleósido trifosfato modificado [p. ej., 2'-desoxiadenosina 5'-O-(1-tiotrifosfato), "dATP\alphaS"]. La extensión de B1 y B2, por ese motivo, desplaza los productos de extensión de S1 y S2 del molde original de la secuencia diana. Los productos de extensión monocatenarios desplazados de los cebadores de amplificación sirven como dianas para que se unan los cebadores de amplificación opuestos y el cebador de choque (p. ej., el producto de extensión de S1 se une a S2 y B2). La siguiente iteración de la extensión y el desplazamiento da lugar a fragmentos de ácidos nucleicos bicatenarios con sitios hemimodificados de reconocimiento/escisión de la endonucleasa de restricción a cada extremo. Éstos son sustratos adecuados para la amplificación por ADC. Como en la ADC, cada etapa de la reacción de generación de las dianas se produce simultánea y continuamente, generándose secuencias de la diana con las secuencias de reconocimiento/escisión en los extremos que se requieren para que la enzima de restricción melle en la ADC. Como todos los componentes de la reacción de ADC están ya presentes en la reacción de generación de las dianas, las secuencias de la diana que se generan automática y continuamente entran en la iteración de la ADC y se amplifican.
Para prevenir la contaminación cruzada de una reacción de ADC con los productos de amplificación de otra, se debe incorporar dUTP en el ADN amplificado en la ADC en lugar de dTTP sin inhibición de la reacción de amplificación. Los ácidos nucleicos modificados con uracilo pueden ser reconocidos e inactivados específicamente mediante el tratamiento con la uracilo ADN glucosilasa (UDG). Por lo tanto, si se incorpora el dUTP en el ADN amplificado por ADC en la reacción precedente, cualquier otra reacción de ADC posterior se puede tratar con la UDG antes de amplificar las dianas bicatenarias, y no se podrá amplificar ningún ADN que contenga dU de las reacciones de amplificación previas. El ADN de la diana a amplificar en la reacción subsiguiente no contiene dU y no se verá afectado por el tratamiento con la UDG. La UDG, entonces, se puede inhibir mediante tratamiento con el UGI antes de amplificar la diana. Alternativamente, la UDG se puede inactivar por calor. En la ADCt, la mayor temperatura de la propia reacción (>= 50ºC) se puede usar a la vez para inactivar la UDG y amplificar la diana.
La ADC requiere una polimerasa que carezca de actividad exonucleasa 5'->3', que inicie la polimerización en las mellas monocatenarias de los ácidos nucleicos bicatenarios y que desplace la cadena hacia 3' de la mella mientras genera una nueva cadena complementaria con la cadena sin mellar como molde. La polimerasa debe extender por adición de nucleótidos a un 3'-OH libre. Para optimizar la reacción de ADC, también es deseable que la polimerasa sea muy procesiva para maximizar la longitud de la secuencia diana que se puede amplificar. Las polimerasas muy procesivas son capaces de polimerizar nuevas cadenas de gran longitud antes de disociarse y terminar la síntesis del producto de extensión. La actividad desplazadora es esencial para la reacción de amplificación, ya hace que la diana quede disponible para sintetizar más copias y generar el producto de extensión monocatenario al que un segundo cebador de amplificación se puede hibridar en las reacciones de amplificación exponenciales. La actividad melladora de la enzima de restricción también es de gran importancia ya que las mellas son lo que perpetúa la reacción y permiten iniciar las posteriores rondas de amplificación.
La ADCt se realiza esencialmente como la ADC convencional descrita por Walker et al. (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392-396 y 1992, Nucl. Acids Res. 20: 1691-1696), con la sustitución con una polimerasa y una endonucleasa de restricción que permanecen activas a temperaturas más elevadas que las enzimas utilizadas en la ADC. Naturalmente, la temperatura de la reacción se ajustará a la temperatura más alta adecuada para las enzimas sustitutas, y el sitio de reconocimiento/escisión por la endonucleasa de restricción HincII se reemplazará por el sitio de reconocimiento/escisión por la endonucleasa de restricción apropiado para la endonucleasa seleccionada. También contrasta con lo descrito por Walker et al., que el profesional puede incluir las enzimas en la mezcla de reacción antes de la etapa de desnaturalización inicial si son lo suficientemente estables a la temperatura de desnaturalización. Las endonucleasas de restricción preferidas a usar en la ADCt son BsrI, BstNI, BsmAI, BslI y BsoBI (New England BioLabs), y BstOI (Promega). Las polimerasas preferidas para la ADCt son Bca (Panvera) y Bst (New England Biolabs).
Además, las reacciones de la ADC y ADCt para amplificar dianas de ácidos nucleicos más grandes (p. ej., moléculas de ácido nucleico de una longitud superior a unas 100 pares de bases) se puede potenciar al incluir una proteína de unión al ADN, tal como gp32, en la mezcla de reacción. Esta técnica la conocen los expertos en la técnica a través de su exhaustiva descripción en la publicación de la solicitud de patente europea n.º 0 869 187 A2.
La ADCt fluorescente y homogénea en tiempo real es una modificación de la ADCt. Se emplean oligonucleótidos detectores para producir una menor extinción de la fluorescencia de una manera dependiente de la diana. Los oligonucleótidos detectores contienen un par colorante dador/aceptor unido de tal forma que la extinción de la fluorescencia se produce en ausencia de la diana. El desplegamiento o linealización de una estructura secundaria por apareamientos intramoleculares de las bases en el oligonucleótido detector en presencia de la diana aumenta la distancia entre los colorantes y reduce la extinción de la fluorescencia. Por lo general, el desplegamiento de la estructura secundaria por apareamiento de bases implica apareamientos intermoleculares de bases entre la secuencia de la estructura secundaria y una cadena complementaria de tal forma que la estructura secundaria se interrumpe, al menos, parcialmente. Se puede linealizar completamente en presencia de una cadena complementaria de suficiente longitud. En una realización preferida, se encuentra presente un sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción (SRER) en los dos colorantes de tal manera que el apareamiento intermolecular de las bases entre la estructura secundaria y la cadena complementaria también produce un SRER bicatenario y escindible por una endonucleasa de restricción. La escisión mediante la endonucleasa de restricción separa los colorantes dador y aceptor en fragmentos distintos de ácidos nucleicos, lo que contribuye aún más a la disminución de la extinción. En cualquier realización, un cambio asociado en el parámetro de fluorescencia (p. ej., un aumento de la intensidad de la fluorescencia del dador, una disminución en la intensidad de la fluorescencia del aceptor, o una razón de fluorescencia antes y después del desplegamiento) se monitoriza como una indicación de la presencia de una secuencia diana. Lo preferido es la monitorización del cambio en la intensidad de la fluorescencia del dador, pues este cambio es, por lo general, mayor que el cambio en la intensidad de la fluorescencia del aceptor. También se pueden monitorizar otros parámetros de fluorescencia tales como un cambio en la vida de la fluorescencia. La escisión de un oligonucleótido se refiere a la ruptura de los enlaces fosfodiéster de ambas cadenas de un ADN bicatenario o a la ruptura de un enlace fosfodiéster de un ADN monocatenario. Esto contrasta con la mella, que se refiere a la ruptura del enlace fosfodiéster sólo en una de las dos cadenas de un ADN bicatenario.
Un oligonucleótido detector para la ADCt fluorescente y homogénea en tiempo real puede ser un oligonucleótido que comprende tanto una sección monocatenaria 5' o 3' que se hibrida con la secuencia diana (la secuencia de unión a la diana), así como una estructura secundaria por apareamientos intramoleculares de las bases adyacente a la secuencia de unión a la diana. En una realización preferida, tal y como se ilustra en la figura 1, el oligonucleótido detector es una sonda indicadora que comprende una sección monocatenaria 5' o 3' que no se hibrida con la secuencia diana. Mejor dicho, la sección monocatenaria en 5' o 3' se hibrida con la complementaria de la secuencia adaptadora del cebador señalador (la secuencia de unión complementaria al adaptador). Una característica adicional de la sonda indicadora es que esta sección hibridante es adyacente a una estructura secundaria por apareamientos intramoleculares de las bases. Los oligonucleótidos detectores de la invención comprenden además un par colorante dador/aceptor unido al oligonucleótido detector de tal manera que la fluorescencia del dador se extingue cuando la estructura secundaria se debe a apareamientos intramoleculares de las bases, y el desplegamiento o linealización de la estructura secundaria da lugar a un descenso en la extinción de la fluorescencia.
El oligonucleótido detector de la invención para la ADCt fluorescente y homogénea en tiempo real comprende una secuencia que forma una estructura secundaria por apareamientos intramoleculares de las bases en las condiciones de reacción seleccionadas para la extensión o la hibridación de los cebadores. En una realización, la estructura secundaria se puede colocar adyacente a la secuencia de unión a la diana del oligonucleótido detector de manera que, al menos, una porción de la secuencia de unión a la diana forme una cola monocatenaria en 3' o 5'. En una realización preferida, tal y como se ilustra en la figura 1, la estructura secundaria se coloca adyacente a la secuencia de unión a la complementaria del adaptador del oligonucleótido detector de la sonda indicadora para que, al menos, una porción de la secuencia de unión complementaria al adaptador forme una cola monocatenaria en 3' o 5'. Tal y como se emplea en esta memoria, el término "adyacente a la secuencia de unión a la diana" o "adyacente a la secuencia de unión complementaria al adaptador" significa que toda o parte de la secuencia de unión complementaria al adaptador/a la diana se deja monocatenaria en una cola 5' o 3' que queda disponible para la hibridación con la diana/el adaptador complementario. Esto es, la estructura secundaria no comprende toda la secuencia de unión complementaria al adaptador/a la diana. Una porción de la secuencia de unión complementaria al adaptador/a la diana puede estar involucrada en el apareamiento intramolecular de las bases en la estructura secundaria, y puede incluir toda o parte de una primera secuencia implicada en el apareamiento intramolecular de las bases en la estructura secundaria, pero preferiblemente no se extiende hacia su secuencia complementaria. Por ejemplo, si la estructura secundaria es una estructura en tallo y bucle (p. ej., una "horquilla") y la secuencia de unión complementaria al adaptador/a la diana del oligonucleótido detector está presente como una cola monocatenaria en 3', la secuencia de unión complementaria al adaptador/a la diana también se puede extender por todo o parte del primer brazo del tallo y, opcionalmente, por todo o parte del bucle. Sin embargo, la secuencia de unión complementaria al adaptador/a la diana preferiblemente no se extiende hacia el segundo brazo de la secuencia implicada en el apareamiento de bases intramolecular del tallo. Es decir, es deseable evitar el tener ambas secuencias implicadas en apareamientos de bases intramoleculares en una estructura secundaria capaz de hibridarse con la complementaria del adaptador/de la diana. Los apareamientos erróneos en la porción de bases apareadas intramolecularmente de la estructura secundaria del oligonucleótido detector pueden reducir la magnitud del cambio de la fluorescencia en presencia de la diana, pero son aceptables si no se busca la sensibilidad del análisis. Los apareamientos erróneos en la secuencia de unión complementaria al adaptador/a la diana de la cola monocatenaria también son aceptables, pero, de forma similar, pueden reducir la sensibilidad y/o especificidad del análisis. Sin embargo, es una característica de la presente invención que el apareamiento de bases perfecto tanto en la estructura secundaria como en la secuencia de unión complementaria al adaptador/a la diana no ponga la reacción en un compromiso. Los apareamientos perfectos en las secuencias implicadas en la hibridación mejoran la especificidad del análisis sin efectos negativos en la cinética de la reacción.
Cuando se añaden a la reacción de amplificación la sonda indicadora del oligonucleótido detector de la invención, se convierte en la forma bicatenaria al hibridarse y extenderse tal y como se ilustra en la figura 1. El desplazamiento de la cadena realizado por la polimerasa también despliega o linealiza la estructura secundaria y la convierte en una forma bicatenaria mediante la síntesis de una cadena complementaria. El SRER, si está presente, también se hace bicatenario y escindible por la endonucleasa de restricción. Como la estructura secundaria está desplegada o linealizada por la actividad desplazadora de la cadena de la polimerasa, aumenta la distancia entre el colorante dador y el aceptor, y por consiguiente, se reduce la extinción de la fluorescencia del dador. El cambio asociado en la fluorescencia tanto del colorante dador como del aceptor se puede monitorizar o detectar como una indicación de la amplificación de la secuencia diana. Generalmente, la escisión en la SRER aumenta más la magnitud del cambio en la fluorescencia al producir dos fragmentos distintos del producto de amplificación secundario bicatenario, teniendo cada uno unido a él uno de los dos colorantes. Estos fragmentos tienen libertad para difundir en la solución de la reacción, lo que aumenta adicionalmente la distancia entre los colorantes del par dador/aceptor. Se puede detectar y/o monitorizar un aumento en la intensidad de la fluorescencia del dador o una disminución en la intensidad de la fluorescencia del aceptor como una indicación de que la amplificación de la diana se está produciendo o se ha producido, pero también se pueden monitorizar otros parámetros de fluorescencia que se vean afectados por la proximidad del par colorante dador/aceptor. También se puede detectar un cambio en la intensidad de la fluorescencia del dador o del aceptor como un cambio en una razón de intensidades de florescencia del dador y/o el aceptor. Por ejemplo, un cambio en la intensidad de la fluorescencia se puede detectar como: a) un aumento de la razón entre fluorescencia del fluoróforo dador tras haber linealizado o desplegado la estructura secundaria y la fluorescencia del fluoróforo dador en el oligonucleótido detector antes de linealizarlo o desplegarlo, o b) como una disminución de la razón entre la fluorescencia del colorante aceptor tras linealizar o desplegar y la fluorescencia del colorante aceptor en el oligonucleótido detector antes de linealizarlo o desplegarlo.
Será obvio que, además de para la ADC, los oligonucleótidos detectores de la invención se pueden adaptar para ser usados en la detección de los amplicones en otros métodos de amplificación por extensión de cebadores (p. ej., PCR, 3SR, SAT o NASBA). Por ejemplo, los métodos se pueden adaptar para ser usados en la PCR con el uso de cebadores de amplificación y una ADN polimerasa desplazadora de cadenas que carezca de la actividad exonucleasa 5'->3' (p. ej., la Taq con calidad de secuenciación de Promega, o exo Vent o exo Deep Vent de New England BioLabs) en la PCR. Los cebadores señaladores se hibridan con la diana al menos parcialmente cadena abajo de los cebadores de amplificación de la PCR, se desplazan y se hacen bicatenarios tras la hibridación con la sonda indicadora del oligonucleótido detector y la subsiguiente extensión. En la PCR, cualquier SRER se puede, opcionalmente, seleccionar para usarse en el oligonucleótido detector, pues por lo general, no hay desoxinucleósidos trifosfato modificados presentes que puedan inducir la mella en lugar de la escisión del SRER. Como la termociclación es una característica de la amplificación por PCR, la endonucleasa de restricción se añade preferiblemente a baja temperatura después del último ciclo de hibridación y extensión de los cebadores para detectar la amplificación a punto final. Sin embargo, podría estar presente durante la amplificación una endonucleasa de restricción termófila que permanezca activa a lo largo de las fases a elevada temperatura de la PCR para producir un análisis en tiempo real. Como en los sistemas de ADC, el alejamiento del par colorante reduce la extinción de la fluorescencia, de modo que un cambio en un parámetro de fluorescencia como la intensidad sirve de indicación de la amplificación de la diana.
El cambio en la fluorescencia que resulta del desplegamiento o la linealización de los oligonucleótidos detectores se puede detectar en un determinado momento de la reacción. Sin embargo, ya que las estructuras secundarias linealizadas se producen a la vez que la hibridación o la extensión de los cebadores, el cambio en la fluorescencia también se puede monitorizar a media que la reacción ocurre, esto es, en "tiempo real". Este formato de ensayo homogéneo en tiempo real se puede usar para proporcionar información semicuantitativa o cuantitativa sobre la cantidad de diana presente inicialmente. Por ejemplo, la velocidad a la que cambia la intensidad de la fluorescencia durante la reacción de desplegamiento o linealización (tanto como parte de los métodos de detección con amplificación de la diana como sin la amplificación) es una indicación de la concentración inicial de la diana. Como resultado, cuando están presentes más copias iniciales de la secuencia diana, la fluorescencia del dador alcanza más rápidamente un valor umbral determinado (esto es, menor tiempo para la positividad). La disminución de la fluorescencia del aceptor exhibe, de forma similar, un menor tiempo para la positividad, detectada como el tiempo requerido para alcanzar un valor mínimo determinado. Además, la velocidad del cambio de los parámetros de la fluorescencia durante el trascurso de la reacción es más rápida en las muestras que contienen mayores cantidades iniciales de la diana que en las muestras que contienen menores cantidades iniciales de la diana (a saber, un aumento de la pendiente de la curva de fluorescencia). Estas u otras medidas tal y como se conocen en la técnica (p. ej., patente de los EE.UU. n.º 5.928.907, solicitud de patente de los EE.UU. de n.º de serie. 09/196.123, presentada el 20 de noviembre de 1998 y la solicitud de patente de los EE.UU. con n.º de serie 09/574.031, presentada el 19 de mayo de 2000, todas las cuales se incorporan específicamente por referencia en la presente memoria) se pueden hacer como una indicación de la presencia de la diana o como una indicación de la amplificación de la diana. La cantidad inicial de diana se determina, por lo general, por comparación de los resultados experimentales con los resultados para cantidades conocidas de la diana.
Los análisis para detectar la presencia de determinadas secuencias de la diana según los métodos de la invención se pueden realizar en solución o en una fase sólida. Los análisis homogéneos a punto final en tiempo real en los que el oligonucleótido detector funciona como un cebador se realizan típicamente en solución. Los análisis de hibridación con los oligonucleótidos detectores de la invención también se pueden realizar en solución (p. ej., como los análisis homogéneos en tiempo real) pero también están particularmente bien diseñados para los análisis en fase sólida para detectar la diana a punto final o en tiempo real. En un análisis en fase sólida, el oligonucleótido detector se puede inmovilizar sobre la fase sólida (p. ej., microesferas, membranas o el recipiente de la reacción) a través de marcaciones internas o terminales con los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un oligonucleótido detector marcado con biotina se puede inmovilizar sobre una fase sólida modificada con avidina donde producirá un cambio en la fluorescencia cuando se expone a la diana en las condiciones de hibridación adecuadas. La captura de la diana de esta manera facilita la separación de la diana a partir de la muestra y permite la retirada de las sustancias de la muestra que puedan interferir con la detección de la señal u otros aspectos del análisis. Un ejemplo de un sistema de fase sólida usable es un formato en matriz (array) como los conocidos en la técnica.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustran realizaciones específicas de la invención descritas en la presente memoria. Como les será obvio a los expertos en la técnica, es posible realizar diversos cambios y modificaciones, que se contemplan en el alcance de la invención descrita.
Ejemplo 1 Especificidad por el ORF6 de M. pneumoniae
Para determinar la especificidad por el gen ORF6 de M. pneumoniae, se realizó una amplificación por PCR con el ADN de varias cepas de M. pneumoniae con los cebadores SEQ ID n.º 12 y SEQ ID n.º 13. Resumiendo, las condiciones de la PCR fueron las siguientes: 10 \muM de cada uno de los cebadores de SEQ ID n.º 12 y SEQ ID n.º 13; 200 nM de cada uno de dATP, dTTP, dCTP y dGTP; 5 unidades de la ADN polimerasa AmpliTAQ (Perkin Elmer) y 1 \mul de una dilución 1:10 de la reserva del organismo de la ATCC en un volumen de reacción de 50 \mul que contiene el tampón de la AmpliTAQ a 1X. La PCR se realizó en un termociclador Peltier PTC-200 de MJ Research y las condiciones de ciclación de la temperatura consistieron en un ciclo a 95ºC durante 5 minutos seguido de 35 ciclos a 95ºC durante 45 segundos, a 52ºC durante 45 segundos y a 72ºC durante 60 segundos. Se mezclaron 9 \mul de cada producto de PCR con 1 \mul de colorante de carga y se analizó por electroforesis en gel de agarosa. Se usó el marcador de pesos moleculares en escalera de 100 pb (GibcoBRL) para estimar el tamaño del producto. El gel se migró a 98 V durante 45 minutos, aproximadamente. La figura 2 ilustra los resultados del análisis de los productos de amplificación de 8 cepas de M. pneumoniae de la ATCC en un gel de agarosa. La tabla 1 muestra las cepas ensayadas con la identificación de las bandas que se corresponden con las bandas marcadas de en la figura 2.
TABLA 1 
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ID de la banda  \+  \hskip2cm   \+  Cepa   ATCC \cr  A
\+ \+ 15531\cr  B \+ \+ 15492\cr  C \+ \+ 15293\cr  D \+ \+ 15377\cr
 E \+ \+ 29085\cr  F \+ \+ 39505\cr  G \+ \+ 29342\cr  H \+ \+
49894\cr}
En cada caso, se observó un producto de PCR de 529 pb (la región de la diana de ORF6 amplificada), lo que demostró la presencia del gen ORF6 en las ocho cepas de M. pneumoniae.
Para determinar si existen homólogos del gen ORF6 en las especies que están filogenéticamente relacionadas con M. pneumoniae, se amplificó por PCR el ADN de otras 4 especies de Mycoplasma con los cebadores SEQ ID n.º 12 y SEQ ID n.º 13 en las condiciones descritas anteriormente. Los productos de la PCR se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% tal y como se ilustra en la figura 3. Los resultados de este análisis se exponen en la tabla 2. Sólo el control positivo de M. pneumoniae (ATCC 0.29342) produjo una banda del tamaño previsto de 529 pb, lo que indica que los cebadores para ORF6 de SEQ ID n.º 12 y SEQ ID n.º 13 son específicos para esta especie.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 2 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \hskip3,5cm  \+  ID de la   banda  \+  \hskip2,5cm  \+
 Organismo/cepa \cr  \+ I \+ \+  M. orale /cepa ATCC
15539\cr  \+ J \+ \+  M.   pneumoniae /cepa   ATCC 29342
(control)\cr  \+ K \+ \+  M.   gallisepticum /cepa ATCC
19610\cr  \+ L \+ \+  M. synoviae /cepa ATCC 25204\cr  \+ M \+
\+  M.   genitalium /cepa   ATCC
33530\cr}
Ejemplo 2 Alineamientos de las secuencias
Los productos de PCR generados en el ejemplo 1 se secuenciaron y se recopiló un alineamiento de las ocho secuencias del ORF6 con el programa MegAlign (DNAStar).
Se diseñaron dos sistemas ADC dentro de la región ORF6 bordeada por los cebadores SEQ ID n.º 12 y SEQ ID n.º 13. La figura 4 ilustra el alineamiento de las secuencias de unión a la diana de los oligonucleótidos del sistema 1 de ADC SEQ ID n.º 1, SEQ ID n.º 3, SEQ ID n.º 5, SEQ ID n.º 7 y SEQ ID n.º 9 con la región de la diana de ORF6. Se incorporó un apareamiento erróneo intencionadamente en la SEQ ID n.º 5 (C reemplazada por T) para evitar interacciones con la SEQ ID n.º 1. La figura 5 ilustra el alineamiento de las secuencias de unión a la diana de los oligonucleótidos del sistema 2 de ADC SEQ ID n.º 2, SEQ ID n.º 4, SEQ ID n.º 6, SEQ ID n.º 8 y SEQ ID n.º 10 con la región de la diana de ORF6. No existen apareamientos erróneos dentro de las regiones de unión a la diana de estos oligonucleótidos.
Los alineamientos demuestran la homología dentro de las secuencias de unión a la diana de los oligonucleótidos para ambos sistemas de ADC para el ORF6 a lo largo de todas las cepas evaluadas de M. pneumoniae.
Ejemplo 3 Sistemas de ADC diseñados para el gen ORF6
Para evaluar la especificidad de los oligonucleótidos que comprenden los dos sistemas de ADC antes mencionados para la secuencia diana del ORF6, se evaluaron las homologías de la secuencia de ácidos nucleicos con la herramienta básica de búsqueda de alineamientos locales ("BLAST" por su nombre en inglés) que se conoce bien en la técnica (1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2267-2268; 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410; 1993, Nature Genetics 3: 266-272; 1997, Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402). Se usó BLASTN para comparar una secuencia de consulta (query) nucleotídica frente a una base de datos de secuencias de nucleótidos. El programa BLASTN identifica las secuencias homólogas por identificación de segmentos similares, los cuales se citan en la presente memoria como "parejas de segmentos de elevada puntuación" entre una secuencia de ácido nucleico de consulta y una secuencia de prueba que se obtiene, preferiblemente, de una base de datos de ácidos nucleicos. Las parejas de segmentos de elevada puntuación se identifican (esto es, se alinean), preferiblemente, por medio de una matriz de puntuación, muchas de las cuales son conocidas en la técnica. Preferiblemente, la matriz de puntuación que se usa es la matriz Blosum62 (1992, Science 256: 1443-1445; 1993, Proteins 17: 49-61). El programa BLASTN evalúa la significación estadística de todas las parejas de segmentos de elevada puntuación identificadas y, preferiblemente, selecciona los segmentos que satisfacen un umbral de significación especificado por el usuario, como el porcentaje de homología. Preferiblemente, la significación estadística de la pareja de segmentos de elevada puntuación se evalúa con la fórmula de Karlin para la significación estadística (1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2267-2268).
El análisis con el BLASTN se realizó con la base de datos GenBank usando la secuencia diana que pasa por encima de los cebadores de choque derecho e izquierdo para cada uno de los sistemas de ADC para ORF6 1 (SEQ ID n.º 5 a SEQ ID n.º 7) y 2 (SEQ ID n.º 6 a SEQ ID n.º 8). El análisis de los resultados sólo mostró una homología significativa con las secuencias del genoma de M. pneumoniae. Estos resultados demuestran que los oligonucleótidos que comprenden los sistemas 1 y 2 de ADC para el ORF6 son específicos de M. pneumoniae.
<110> BECTON, DICKINSON Y COMPAÑIA
\vskip0.400000\baselineskip
<120> AMPLIFICACIÓN Y DETECCIÓN DE MYCOPLASMA PNEUMONIAE 
\vskip0.400000\baselineskip
<130> p-5202.70
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/283.601
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2001-04-13
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn v. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgattccgct ccagacttct cgggaatgcc ttgagttttg a 
\hfill
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgattccgct ccagacttct cgggcaaccc cggaccca 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accgcatcga ttgactgtct cgggagaccc ggaagtgtc 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accgcatcga ttgactgtct cgggcaccgg tcaactttc 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttcggaccaa agtaat 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aatggggttg ctca 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gacatagctg gcgaa 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atccaggggt tcat 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acgttagcca ccatacggat gaaggcactt aatggctcgc ag 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acgttagcca ccatacggat tcaccgctt taagctcgat a 
\hfill
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tagtgcccga gcactacgtt agccaccata cggat 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tacaggatcc acgagttcgg atcaaggt 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acgtaagctt tcgaatccag gggttcat 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 213
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia consenso
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (198)..(213)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a, t, c o g
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
3 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 202
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycoplasma pneumoniae 
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
4 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 201
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycoplasma pneumoniae 
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 186
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycoplasma pneumoniae 
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
6 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 182
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycoplasma pneumoniae 
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
7 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 200
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycoplasma pneumoniae 
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
8 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 213
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycoplasma pneumoniae 
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
9 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 197
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycoplasma pneumoniae 
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
10 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 197
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycoplasma pneumoniae 
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
11 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 248
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia consenso
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222>(247)..(248)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a, t, c o g
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
12 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 247
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycoplasma pneumoniae 
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
13 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 247
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycoplasma pneumoniae 
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
14 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 216
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycoplasma pneumoniae 
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
15 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 228
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycoplasma pneumoniae 
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
16 
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<210> 28
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<211> 262
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<212> ADN
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<213> Mycoplasma pneumoniae 
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<400> 28
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17 
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<210> 29
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<211> 255
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<212> ADN
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<213> Mycoplasma pneumoniae 
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<400> 29
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18 
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<210> 30
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<211> 261
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<212> ADN
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<213> Mycoplasma pneumoniae 
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<400> 30
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<210> 31
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<211> 203
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<212> ADN
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<213> Mycoplasma pneumoniae 
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<400> 31
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20

Claims (10)

1. Un oligonucleótido que consiste en una secuencia de unión a la diana seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de unión a la diana de ORF6LP1 (SEQ ID n.º 1), ORF6LP2 (SEQ ID n.º 2), ORF6Left PCR (SEQ ID n.º 12), ORF6RP1 (SEQ ID n.º 3), ORF6RP2 (SEQ ID n.º 4) y ORF5Right PCR (SEQ ID n.º 13), y, opcionalmente, una secuencia requerida para una reacción de amplificación.
2. El oligonucleótido de la reivindicación 1, en el que la secuencia requerida para la reacción de amplificación es un sitio de reconocimiento de una endonucleasa de restricción que se puede mellar mediante una endonucleasa de restricción.
3. Un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en ORF6ADPT1 (SEQ ID n.º 9), un ácido nucleico complementario a la SEQ ID n.º 9, ORF6ADPT2 (SEQ ID n.º 10) y un ácido nucleico complementario a la SEQ ID n.º 10.
4. Una pareja de cebadores de amplificación que comprenden:
a) un primer cebador que consiste en una secuencia de unión a la diana seleccionada del grupo que consiste en ORF6LP1 (SEQ ID n.º 1), ORF6LP2 (SEQ ID n.º 2) y ORF6Left PCR (SEQ ID n.º 12), y, opcionalmente, una secuencia requerida para una reacción de amplificación; y
b) un segundo cebador que consiste en una secuencia de unión a la diana seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de unión a la diana ORF6RP1 (SEQ ID n.º 3), ORF6RP2 (SEQ ID n.º 4) y ORF5Rigth PCR (SEQ ID n.º 13), y, opcionalmente, una secuencia requerida para una reacción de amplificación.
5. Un kit que comprende:
a) uno o más cebadores seleccionados del grupo que consiste en ORF6LP1 (SEQ ID n.º 1), ORF6LP2 (SEQ ID n.º 2) y ORF6Left PCR (SEQ ID n.º 12),
b) uno o más cebadores seleccionados del grupo que consiste en ORF6RP1 (SEQ ID n.º 3), ORF6RP2 (SEQ ID n.º 4) y ORF5Rigth PCR (SEQ ID n.º 13),
c) uno o más cebadores señaladores seleccionados del grupo que consiste en ORF6ADPT1 (SEQ ID n.º 9), un ácido nucleico complementario a la SEQ ID n.º 9, ORF6ADPT2 (SEQ ID n.º 10) y un ácido nucleico complementario a la SEQ ID n.º 10.
6. El kit de la reivindicación 5 que además comprende:
e) un par de cebadores específicos para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico específica de Legionella pneumophila;
f) un par de cebadores específicos para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico específica de Bordetella pertusis; y
g) un par de cebadores específicos para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico indicativa de una infección por clamidias.
7. Un método para detectar la presencia o ausencia de organismos de Mycoplasma pneumoniae en una muestra, donde dicho método comprende:
a) tratar dicha muestra utilizando un par de cebadores del ácido nucleico en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos en la que dicho primer cebador es ORF6LP2 (SEQ ID n.º 2) y dicho segundo cebador es ORF6RP1 (SEQ ID n.º 3), y
b) detectar cualquier producto del ácido nucleico amplificado, en el que la detección del producto amplificado indica la presencia de organismos de Mycoplasma pneumoniae.
8. Un método para detectar la presencia o ausencia de organismos de Micoplasma pneumoniae en una muestra, donde dicho método comprende:
a) tratar dicha muestra utilizando un par de cebadores del ácido nucleico en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos en la que dicho primer cebador es ORF6LP2 (SEQ ID n.º 2) y dicho segundo cebador es ORF6RP2 (SEQ ID n.º 4), y
b) detectar cualquier producto del ácido nucleico amplificado, en el que la detección del producto amplificado indica la presencia de organismos de Mycoplasma pneumoniae.
9. Un método para amplificar una secuencia del ácido nucleico diana de un organismo de Mycoplasma pneumoniae que comprende:
a) hibridar al ácido nucleico
i)
un primer cebador de amplificación seleccionado del grupo que consiste en las secuencias de unión a la diana de ORF6LP1 (SEQ ID n.º 1), ORF6LP2 (SEQ ID n.º 2) y ORF6Left PCR (SEQ ID n.º 12), y, opcionalmente, una secuencia requerida para una reacción de amplificación, y
ii)
un segundo cebador de amplificación seleccionado del grupo que consiste en las secuencias de unión a la diana de ORF6RP1 (SEQ ID n.º 3), ORF6RP2 (SEQ ID n.º 4) y ORF6Right PCR (SEQ ID n.º 13), y, opcionalmente, una secuencia requerida para la reacción de amplificación; y
b) extender el primer y el segundo cebador de amplificación sobre la secuencia del ácido nucleico diana por medio de lo cual se amplifica la secuencia del ácido nucleico diana.
10. El método de la reivindicación 7, 8 ó 9 en el que la reacción de amplificación del ácido nucleico es una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o una reacción de amplificación con desplazamiento de cadena (ADC).
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