JP3330599B2 - ギャップ充填リガーゼ連鎖反応を用いる標的核酸の増幅 - Google Patents

ギャップ充填リガーゼ連鎖反応を用いる標的核酸の増幅

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Description

【発明の詳細な説明】 背景 本発明は、リガーゼ連鎖反応（LCR）増幅を実施する
方法、詳しくは、連結しようとする位置で少なくとも１
個のプローブが可逆的に改変され、そのためそれが、リ
ガーゼが触媒する反応の基質にならないことを特徴とす
るリガーゼ連鎖反応増幅法に関する。例示的改変として
は、“凹部”を形成するための１つ以上の核酸塩基の非
存在が挙げられる。改変された末端は、プローブ二重鎖
の標的非依存性平滑末端連結を阻止または減少させ、こ
れは後に連結を可能にするために標的に依存する方法で
修正される。
多くの場合、核酸に基づく診断アッセイの可能性は、
数分子のみの標的から生じたシグナルを増幅する能力に
依存する。シグナル増幅は、一つの可能性のある解決法
であるが、標的増幅は、しばしば、核酸に基づくアッセ
イにおいて好ましい解決法となる。標的増幅は、標的と
して示された核酸部分の反復複写または複製を含む。
ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）として知られている
標的増幅技法において、標的核酸の相補鎖の外側末端で
ハイブリダイゼーションさせるために一対のプライマー
が過剰に用いられる。このプライマーはそれぞれ、標的
核酸を鋳型として用いポリメラーゼによって伸長する。
伸長生成物は、それ自体標的配列となり、オリジナルの
標的鎖から解離する。しかる後、新しいプライマーをハ
イブリダイゼーションさせ、ポリメラーゼによって伸長
させ、このサイクルを、標的配列分子の数を幾何学的に
増加させるために繰り返す。PCR法については、米国特
許第4,683,195号および同第4,683,202号に更に詳述され
ている。
標的増幅のための別の機序は、リガーゼ連鎖反応（LC
R）法として公知である。LCR法において、２つの第一
（一番目および二番目プローブ）プローブならびに２つ
の第二（三番目および四番目）プローブが過剰に用いら
れる。一番目のプローブは、標的鎖の一番目のセグメン
トとハイブリダイゼーションし、二番目のプローブは、
標的鎖の二番目のセグメントとハイブリダイゼーション
し、一番目と二番目のセグメントは隣接していることか
ら、第一プローブは、５′燐酸−３′ヒドロキシル関係
の中で相互に隣接し、また、リガーゼが２つのプローブ
を融合生成物の形に共有的に融合または連結することが
できる。更に、同様の隣接様式で、三番目の（第二）プ
ローブは、一番目のプローブの一部とハイブリダイゼー
ションすることができ、四番目の（第二）プローブは、
二番目のプローブの一部とハイブリダイゼーションする
ことができる。標的が最初に二重鎖である場合、当然第
二プローブも、まず標的相補体とハイブリダイゼーショ
ンする。第一プローブの融合鎖は、一旦標的鎖から離れ
たならば、連結して相補的な第二融合生成物を形成する
ことのできる、３番目および四番目のプローブとハイブ
リダイゼーションする。本明細書で述べているLCR法お
よびその改良点を理解するには、融合生成物が機能的に
は標的またはその相補体のいずれかと同一であることを
認識することが重要である。ハイブリダイゼーションお
よび連結のサイクルの繰り返しにより、標的配列の増幅
が達成される。この技法については、EP−Ａ−320 308
およびEP−Ａ−439 182に更に完璧に記載されている。
リガーゼ連鎖反応法と関連する潜在的問題は、標的に
依存しないプローブ連結により生じるバックグランドシ
グナルである。三番目のプローブは一番目のプローブと
ハイブリダイゼーションし四番目のプローブは二番目の
プローブとハイブリダイゼーションすることから、過剰
に加えられたプローブは、その中で容易に重複物を形成
することができる。この重複物は、標的の存在に依存す
ることなく連結される可能性があり、所望の増幅した標
的と識別不可能であり且つ更に増幅を支持することが可
能である融合生成物を形成する。標的に依存しないこれ
ら重複物の平滑末端連結は、比較的希な事象ではある
が、診断用アッセイにおいて好ましくない高いバックグ
ランドシグナルをもたらすことはよくあることである。
このバックグランド問題を克服するためのいくつか試
みが公表されている。例えば、WO 90/01069（Segev D
iagnostics）およびGB ２ 225 112A（Imperial Che
mical Industries Plc.）は、連結の前にポリメラー
ゼが媒介するギャップ充填段階（gap−filling step）
を含む、連結をベースとする増幅法の変形について記載
している。更に、EP−Ａ−439182は、バックグランドを
減少させるLCR法の変法について教示している。このよ
うな変法の一つは、ギャップ充填および連結を含む。し
かしながら、これらの文献は、本特許出願において教示
し請求したような特定の標的配列の選択については何等
教示していない。
従って、本発明の第一の目的は、偽陽性のバックグラ
ンドシグナルをもたらす、標的に依存しない連結の発生
を減少させることにより、核酸に基づくアッセイの感度
を改良することである。この目的は、本発明において
は、少なくとも一つのプローブ末端を改変し、そのため
それと相補的なプローブとハイブリダイゼーションした
場合、その結果できた二重鎖がパートナーである相補的
プローブ重複物に関して“平滑末端化”（即ち連結可
能）されなくなることにより満たされる。標的とハイブ
リダイゼーションした後、隣接したプローブが連結でき
るようにするために、改変された末端を、標的に依存す
る様式で“修正”する。本特許出願において教示したプ
ローブおよび関連する標的配列のいくつかの特徴は、こ
の研究を特に卓越したものにしている。
一つの特徴によると、プローブは、標的とハイブリダ
イゼーションする際にギャップを創出する、連結の位置
に相関する凹部を有する。そこで、プローブを連結でき
るようにするために、ギャップを標的に依存する方法で
充填する。ギャップ充填は、一つ以上のプローブ、好ま
しくは二つのプローブの伸長により達成することができ
る。両方のギャップを充填するのに四つのデオキシリボ
ヌクレオチド三燐酸のうち一つまたは最大で二つのみを
必要とするように標的を選択しプローブを設計する。
発明の概要 第一の態様において、本発明は、サンプル中の標的核
酸配列の存在を検出する方法に関し、この方法は、リガ
ーゼ連鎖反応を用いて、この標的配列の存在下、改造し
たプローブ分子の数の幾何学的増加を創出し、この方法
は、 ａ）核酸を含有すると思われるサンプルを提供するこ
と、但しその核酸は下記一般式で表される標的配列を有
する： ５′−（Ｎ）hXEp・FqZ（Ｎ）ｋ−３′ （ここで、Ｅは、任意の塩基を表し、Ｆは、Ｅ以外の任
意の塩基を表し、ｐおよびｑは、独立に１から約10まで
の整数であり、Ｘは、ＥまたはＦ′以外の任意の塩基を
表し、Ｚは、ＦまたはＥ′以外の任意の塩基を表し、Ｎ
は、任意の塩基を表し、ｈおよびｋは、独立に５から10
0までの整数であり、但し（ｐ＋ｈ）および（ｑ＋ｋ）
それぞれの和は、10以上であり、（Ｎ）ｈおよび（Ｎ）
ｋは、検出しようとする標的に特徴的である配列を表
す）； ｂ）下記一般式を有するそれぞれ四種類のプローブの複
数を提供すること： A:5′−（Ｎ）h +XEp−３′ Ａ′:3′−（Ｎ′）h +X′−５′ B:5′−Ｚ（Ｎ）k +−３′ Ｂ′:3′−Ｆ′qZ′（Ｎ′）k +−５′ （ここで、記号は、h+およびk+がそれぞれほぼｈおよび
ｋに近い値を必要とし25％以下まで変化することを除い
ては上記と同じ意味を有し、少なくとも一つのプローブ
が検出の可能な部分で標識されている）；またＥ′およ
びＦのデオキシリボヌクレオチド三燐酸、ポリメラーゼ
試薬並びにリガーゼ試薬を提供すること； ｃ）次のサイクルを少なくとも１回実施すること： ｉ）ハイブリダイゼーション条件下で前記プローブと
前記サンプルとを混合し、このプローブと、標的配列お
よび存在するとしたらその相補体とを又はそれらから創
出した改造プローブとをハイブリダイゼーションさせ
る； ii）標的配列または、それを鋳型として創出した改造
プローブを用い、前記のポリメラーゼ試薬を用いてその
３′末端にＦデオキシリボヌクレオチド三燐酸を付加す
ることによりプローブＡを伸長させ、前記のポリメラー
ゼ試薬を用いてその３′末端にＥ′デオキシリボヌクレ
オチド三燐酸を付加することによりプローブＢ′を伸長
させる； iii）前記のリガーゼ試薬を用いて、プローブＢに伸
長したプローブＡを連結し、プローブＡ′に伸長したプ
ローブＢ′を連結して改造プローブ分子を形成させる； iv）変性条件を提供して、この改造プローブ分子を前
記鋳型から分離する； ｄ）改造したプローブ分子と未改造の標識したプローブ
とを分けること；および ｅ）標的配列存在の尺度として改造したプローブまたは
画分中の前記標識の存在を検出すること を含むことを特徴とする。
Ｅ′のみのデオキシリボヌクレオチド三燐酸により両
方のギャップを充填することができることから、特に好
ましい実施態様において、ＦはＥ′である。好ましく
は、ｐおよびｑは小さい数、即ち、１以上３以下であ
る。整数ｐおよびｑは、等しくてもよいし、または１以
上離れていてもよい。好ましくは、標識は、少なくとも
プローブの一つと共有結合した一つ以上のハプテンを含
む。
別の態様において、本発明は、サンプル中の標的核酸
検出のための診断キットに関し、この核酸は、下記一般
式： ５′−（Ｎ）hXEp・FqZ（Ｎ）ｋ−３′ （ここで、ＥおよびＦは、独立に任意の塩基を表し、ｐ
およびｑは、独立に１から約10までの整数であり、Ｘ
は、ＥまたはＦ′以外の任意の塩基を表し、Ｚは、Ｆま
たはＥ′以外の任意の塩基を表し、Ｎは、任意の塩基を
表し、ｈおよびｋは、独立に５から100までの整数であ
り、但し（ｐ＋ｈ）および（ｑ＋ｋ）それぞれの和は、
10以上であり、（Ｎ）ｈおよび（Ｎ）ｋは、検出しよう
とする標的に特徴的である配列を表す）で表される標的
配列を有し、このキットは、 （ａ）下記一般式を有する四種類のプローブ： A:5′−（Ｎ）h +XEp−３′ Ａ′:3′−（Ｎ′）h +X′−５′ B:5′−Ｚ（Ｎ）k +−３′ Ｂ′:3′−Ｆ′qZ′（Ｎ′）k +−５′ （ここで、記号は、h+およびk+がそれぞれほぼｈおよび
ｋに近い値を必要とし25％以下まで変化することを除い
ては上記と同じ意味を有し、少なくとも一つのプローブ
が検出の可能な部分で標識されている）； （ｂ）前記のポリメラーゼ試薬を用いてその３′末端に
Ｆデオキシリボヌクレオチド三燐酸を付加することによ
り標的に依存する方法でプローブＡを伸長させ、かつ前
記のポリメラーゼ試薬を用いてその３′末端にＥ′デオ
キシリボヌクレオチド三燐酸を付加することにより標的
に依存する方法でプローブＢ′を伸長させ、それにより
標的とハイブリダイゼーションした場合第一プローブを
相互に連結可能にし、任意に、標的とハイブリダイゼー
ションした場合第二プローブを相互に連結可能にするこ
とができるポリメラーゼ試薬； （ｃ）Ｅ′およびＦのデオキシリボヌクレオチド三燐
酸；および （ｄ）改造プローブ分子を形成させるために、プローブ
Ｂに伸長したプローブＡを、プローブＡ′に伸長したプ
ローブＢ′を連結させるリガーゼ試薬 の組み合わせから成る。
また、特に好ましいキットは、改造したプローブ分子
を未改造の標識したプローブから分離する手段および／
または検出可能な標識を検出する手段をも含む。
また、別の態様において、本発明は、それぞれ四種類
のプローブの混合物を含む組成物に関し、この四種類の
プローブは、実施例で示した特定の配列セットから選ば
れる。これらの組成物は、上記方法による一定の病原体
の存在の検出に有用である。例示および請求した配列よ
り僅かに短いまたは長い配列は、請求した配列と同様に
標的上の同じ位置にあるものとハイブリダイゼーション
することができる限り、本発明の範囲内に入ることは当
然のことである。
図面の簡単な説明 図１は、従来技術として公知であるリガーゼ連鎖反応
法の工程を示すグラフ図である。
図２は、本発明の普遍化したダブルギャップ変形例の
グラフ図である。
図３は、本発明のいくぶん更に特定のダブルギャップ
変形例のグラフ図である。
詳細な説明 本発明の目的のためには、標的配列は、１本鎖である
べきであると述べている。しかしながら、これは、標的
が実際に二本鎖ではあるが、プローブとのハイブリダイ
ゼーションに先立ちその相補体から単純に分離されてい
る場合を含むと理解されるべきである。二重鎖標的の場
合、三番目および四番目（第二）のプローブ、即ちＡ′
およびＢ′は、それぞれ標的相補体とハイブリダイゼー
ションすることにより最初の工程に関与する。１本鎖標
的の場合、これらは、最初のハイブリダイゼーション工
程には関与しないが、後のハイブリダイゼーション工程
に関与し、一番目および二番目のプローブを連結するこ
とにより生成させた第一融合配列と結合する。標的配列
は、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）を
含むことができる。
標的配列は、核酸を含有する事実上いかなる核酸物質
であってもよい。例えば、これに制限されるものではな
いが、実施例で具体的に挙げた細菌およびウィルスは、
核酸標的配列を有する。標的配列は、病原微生物または
ウィルスを表してもよいし、表さなくてもよい。また、
標的核酸は、遺伝上の検査によくあるケースのような、
特定の対立遺伝子の存在または特定の欠失突然変異につ
いて調べられる核酸を表すこともできる。最後に、標的
配列は、DNAの法医学分析におけるケースのような単純
に一般的目的の任意の核酸配列であってもよい。
本明細書中の“プライム記号”記号（′）は、相補的
塩基または配列を指すのに用いている。プローブは、そ
れが他のプローブにハイブリダイゼーションし、ハイブ
リダイゼーション領域において実質的に相補的な塩基対
を有する場合、他方のプローブに対して“相補的”であ
る。従って、プローブＡは、Ａ′と隣接しない末端を有
するとしてもＡ′に対して相補的であることが可能であ
る。同じことがＢおよびＢ′にもあてはまる。同様に、
短い配列XnおよびYmは、それぞれＸ′ｎおよびＹ′ｍと
命名した相補的配列を有する。最後に、単一の塩基、例
えばＱの相補体は、Ｑ′と命名する。本明細書で配列に
関して用いた“相補体”には、それがアッセイ条件下で
ハイブリダイゼーションさせることができる限り、ハイ
ブリダイゼーション領域において誤って組み合わされた
塩基対を有する配列をも含むものとする。
また、“４塩基”とは、関連する内容がDNAのそれで
ある場合、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン
（Ａ）およびチミン（Ｔ）を指すが、RNAとの関連にお
いてはアデニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン
（Ａ）およびラウシル（Ｕ）を指すことは、当然のこと
である。また、この用語は、上記の命名された塩基の類
似体および誘導体をも包括する。縮重塩基イノシン
（Ｉ）は、本発明に用いることができるが、本発明によ
るプローブの改変部分内でＩを用いることは、好ましく
ない。
平滑末端化二重鎖を形成することのできる２対のプロ
ーブの代りに、いくつかのプローブ対のうち１対の少な
くとも１つのプローブは、後に結果として生じた二重線
を“非平滑”化させるおよび／またはリガーゼが触媒す
る２つのプローブ二重鎖の融合のための適当な基質では
ないようにする“改変された”末端を初めに含むこと
が、本発明の重要な特徴である。“改変された末端”
は、その相補的プローブに関してよりもむしろ連結の位
置に関して定義される。“改変された末端”は、１つの
プローブ末端と次のプローブ末端（例えば、図２および
図３のプローブＡ′およびＢ参照）の間の“ギャップ”
を創出する排除された塩基を有する。
本明細書中では、改変された末端を、“凹部（reces
s）”と称し、この凹部は、標的とハイブリダイゼーシ
ョンした後の２つの第一または第二プローブ間のギャッ
プである。この改変された末端の存在により、標的非存
在下での、相補的プローブ二重鎖の相互の平滑末端連結
により創出される偽陽性シグナルが減少する。
プローブを連結可能にするために、後に改変部の“修
正（correction）”を行う。本明細書で用いた“修正”
とは、標的依存方法における、２つの第一プローブまた
は２つの第二プローブをそのパートナーに連結可能にす
る過程をいう。従って、標的、標的相補体またはそれら
から生じたポリヌクレオチド配列にハイブリダイゼーシ
ョンされるプローブのみが、“修正”される。“修正
は”は、用いた改変された末端の型に依存していくつか
の手法により達成することができる。
本明細書で用いた“連結の位置（point of ligatio
n）”または“連結させようとする位置”とは、鋳型に
依存する方法において連結させる予定である、２つのプ
ローブパートナー間の特定の位置をいう。それは、“修
正された”プローブが３′ヒドロキシル−５′燐酸関係
においてそのパートナーに隣接して存在する部位であ
る。各セットの４種類のLCRプローブのために、２箇所
の“連結の位置”、即ち第一プローブパートナーのため
の位置および第二プローブパートナーのための位置があ
る。従来のLCR法における２箇所の連結の位置は、お互
いに反対の位置にあることから、プローブ対が相互にハ
イブリダイゼーションする場合平滑末端化された二重鎖
を形成する。本発明における連結の位置は、お互いに反
対の位置にはないが、“凹部”の実施態様においては、
ギャップの効果によって相互に１つ以上の塩基によって
置き換えられている。連結の正確な位置は、実施態様に
より変化することから、この用語は、それぞれの実施態
様において更に定義する。
各プローブは、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ
核酸（RNA）から成ることができる。従来のヌクレオチ
ドホスホアミダイト化学およびアプライドバイオシステ
ムズ社（フォスター市、CA）；デュポン社（ウィルミン
トン、DE）；またはミリゲン社（ベッドフォード、MA）
から入手可能な装置を用い、所望のプローブを合成する
ことは、日常的手段である。適当なプローブ（例えば
Ａ′およびＢ）の５′末端の燐酸化は、リガーゼによる
連結に必要であるが、当業者に公知であるキナーゼまた
は市販の合成試薬により達成することができる。
本明細書の中で、塩基Ｘ、ＹおよびＱならびにそれら
の相補体は、４種の塩基の所定のサブセット（Ｎまたは
Ｍ）から選ばれると述べている。実際には、配列は、ま
ったく“選ばれる”わけではなく、標的鎖の配列により
指令される。この関連における“選ばれる”という用語
は、所望の特徴を有する標的配列の位置を確認し、標的
配列の好ましいセグメントの周辺にプローブを構築する
という意味に用いている。
概して、本発明の方法は、（ａ）標的（および、二重
鎖の場合は標的相補体が存在することから標的相補体）
に、改変したプローブをハイブリダイゼーションさせる
こと；（ｂ）プローブを連結可能にするため、標的に依
存する方法で改変部を修正すること；（ｃ）修正したプ
ローブをそのパートナーに連結し融合または連結生成物
を形成させること；および（ｄ）融合生成物を標的から
解離させること、および所望の標的配列を増幅させるた
めにハイブリダイゼーション、修正および連結工程を繰
り返す反復工程を含む。工程（ａ）、（ｃ）および
（ｄ）は、すべての実施態様にとって本質的に同じであ
り、一緒に考察することができる。これらは、一般的
に、従来のLCR法で用いるのと同じ工程である。工程
（ｂ）は、用いた改変の型によって変化するので、それ
ぞれ異なる型については、個々に考察する。
プローブの標的（および任意に標的相補体）へのハイ
ブリダイゼーションについては、従来技術、例えばEP−
320 308に適切に説明されている。プローブ鎖長、プロ
ーブ濃度および条件の厳密性はすべて、ハイブリダイゼ
ーションが起こる度合およびその割合に影響を与える。
好ましくは、プローブは、所望の特異性を提供するため
に、即ち、サンプル中で非標的配列とハイブリダイゼー
ションできないようにするために充分な長さがあるもの
である。典型的には、15から100個のオーダーの塩基を
有するプローブは、この目的にかなっている。ここで
は、好ましいものは、約15から約40塩基の長さを有する
プローブである。
プローブは、化学量論的に反応すると考えられること
から、ほぼ等モル濃度で加える。各プローブは、約５ナ
ノモル（nM）から約90nM、好ましくは約10nMから約35nM
の範囲の濃度で存在する。標準反応容量90μＬにとっ
て、これは、約3x1011から約１×1012の分子の各プロー
ブを加えることと同じであり、50μＬ当り約５×1011の
分子は、良好な出発点である。また、各反応に用いるプ
ローブの最適量は、実施する必要があるサイクル数およ
び、当然のことながら反応容量により変化する。プロー
ブ濃度は、所定数のサイクルに最適のシグナルを提供す
るために、当業者によって容易に決定される。
条件の厳密性が、温度、溶媒および他のパラメーター
に依存することは、一般的に当業者等に公知である。お
そらくこれらのパラメーターのうち最も容易に制御され
るものは、温度であり、従って、これは、一般にLCR法
の性能において変化する厳密なパラメーターである。本
発明の実施に要求される厳密な条件は、通常のLCR法の
それと類似していることから、当業者は下記実施例によ
り導かれるので、更なる詳細は不必要であると考えられ
る。
通常の方法における次の工程は、特定の修正工程であ
り、一つのプローブのその隣接するパートナーへの連結
を含む。従って、それぞれの修正された第一プローブ
は、その関連する第一プローブに連結し、それぞれの修
正された第二プローブは、その関連する第二プローブに
連結する。“隣接する”プローブは、標的と連続方向に
ハイブリダイゼーション可能な二つのプローブのうちい
ずれか一つであり、その一つは、パートナープローブの
３′ヒドロキシル末端とその燐酸化５′末端が隣接する
ように位置する。“隣接する”プローブは、改変された
末端の標的に依存する方法による修正によって創出す
る。酵素による連結は、二つの隣接するプローブを共有
的に結合させる好ましい方法であることから、本明細書
において“連結”の用語を用いる。しかしながら、“連
結”は、一般的用語であり、二つのプローブを共有的に
結合させるいかなる方法をも包含することは、当然のこ
とである。酵素による連結に代る一つの方法は、EP−Ａ
−324616に記載されているようなフォトライゲーション
（photo−ligation）である。
酵素による好ましい連結工程を可能にする条件および
試薬は、当業者等に公知であり、背景で述べた参考文献
に開示されている。本発明に有用な連結試薬としては、
T4リガーゼおよび、E.coliリガーゼのような原核生物リ
ガーゼ、およびEP−320 308に教示されているようなTh
ermus thermophilusリガーゼ（例えばATCC27634）が挙
げられる。この後者のリガーゼは、LCR法の加熱しての
サイクル実施中に活性を維持するその能力のためここに
おいて好ましいものである。熱に安定なリガーゼがない
ということは、サイクルを繰り返す度ごとに再度リガー
ゼを加えなければならない。また、有用なものは、Rabi
n等,J.Biol.Chem.261:10637−10647（1986年）によって
報告されているDrosophiliaのDNAリガーゼを含む真核生
物リガーゼである。
いったん連結したならば、融合し改造されたプローブ
は、標的から解離（例えば融解）し、従来のLCR法を用
いるのと同様に、その過程は、数回サイクルを繰り返
す。サイクルの反復回数は、１回から約100回まで変え
ることができるが、ここでは約15回から約70回が好まし
い。
相補的（第二）プローブにハイブリダイゼーションす
る際に、連結しようとする位置から離れた末端が、それ
自体、他の所望でない連結反応に関与できないようにプ
ローブを設計することが好ましい。従って、連結可能な
付着末端または平滑末端は避けるべきである。このよう
な末端を用いる必要がある場合は、５′末端燐酸は、避
けるか、排除するかまたはブロックすべきである。これ
は、オリゴヌクレオチドプローブ（通常５′末端燐酸基
を担持しない）の合成、または（例えば、DNAの制限消
化を介して生じたオリゴヌクレオチドから）末端燐酸を
除去するホスファターゼ酵素の使用のいずれかを通じて
達成することができる。あるいは、プローブの“誤っ
た”外側末端の連結は、以下に詳細に述べるような“フ
ック（hook）”またはマーカー部分を有するプローブの
少なくとも一つの末端をブロックすることにより防止す
ることができる。上記技法の一つを用いない場合、プロ
ーブの外側末端を食い違いにすることができることか
ら、それらが結合した場合、それらは、指数増幅のため
の鋳型として役に立たない。
増幅を実施した場合、増幅した配列は、当業者に公知
の多数の従来法により検出することができる。代表的に
は、検出は、分離後、分離した画分中の標識の量を測定
することにより実施する。また、当然、分離した画分中
の標識は、システムに加えた標識の全量を把握し、未分
離の画分中に存在する量を測定することにより減算によ
り決定することができる。分離は、電気泳動、クロマト
グラフィーまたは下記の好ましい方法により達成するこ
とができる。
特に好ましい構造において、ハプテンまたは“フッ
ク”は、少なくとも二つのプローブの利用可能な外側末
端（融合生成物の反対側の末端）、好ましくは四つのプ
ローブすべての外側末端に結合している。“フック”
は、特異的リガンドー受容体親和性を有する任意の部分
である。代表的には、融合生成物の一方の末端（例え
ば、Ａの５′およびＡ′の３′末端）に位置するフック
は、固相上にコートされた特異的結合試薬（例えば抗体
またはアビジン）により固定化され得る抗原またはハプ
テンから成る。他方の末端（例えばＢの３′末端および
Ｂ′の５′末端）に位置するフックは、抗体−酵素結合
体のような標識または標識素により認識され得る異なる
抗原またはハプテンを含有する。例示的フックとして
は、当業者に公知の多数あるなかで、ビオチン、フルオ
レセインおよびジゴキシンが挙げられる。しかる後、酵
素によって検出可能な生成物に変わる基質を加える。エ
ンゾ社は、EP−Ａ−330 221に、一方の末端に結合した
ビオチン分子を有するオリゴヌクレオチドについて記載
している。
凹部によって改変された末端 本実施態様において、改変された末端は、一つ以上の
プローブから短い塩基配列を排除し、それにより標的
（または標的相補体、またはそれらから生じたポリヌク
レオチド）に二つのプローブがハイブリダイゼーション
する際、一方のプローブの５′末端および他方のプロー
ブの３′末端間に凹部（racess）またはギャップが残っ
たままになることにより創出される。標的を増幅するLC
R法のためには、プローブ間のギャップは、充填する必
要がある（即ち、改変部を“修正する”必要がある）。
先ずその仕方について、これは、ポリメラーゼまたは逆
転写酵素および、ギャップの反対側にある標的鎖に相補
的である過剰のデオキシリボヌクレオチド三燐酸を用い
て行うことができる。
しかしながら、本実施態様を詳細に考察する前に、所
定の用語に関する簡単な説明が役に立つと考えられる。
セット（例えばＳ）は、セットＳ内に含まれるすべての
構成要素から成る。従って、セット“非S"は、Ｓに見ら
れない“祖集団（universe）”の残るすべての構成要素
から成る。本願の目的にとっての“祖集団”は、上記の
ような４種の塩基Ｇ、Ｃ、ＡおよびＴ、またはＧ、Ｃ、
ＡおよびＵから成る。セットＳおよび他のセット（例え
ばＲ）の交点は、ＳおよびＲの両方に見られる構成要素
のみから成る。従って、本明細書で用いるように、セッ
ト“非Ｎかつ非M"は、ギャップXnまたはギャップYmのい
ずれにも存在しない塩基から成る。本発明によると、セ
ット“非Ｎかつ非M"は、空白のセットであってはならな
い、即ち、少なくとも１個の塩基は、“終結塩基”をコ
ードするためにこのセット内に残る必要がある。
伸長によるギャップ充填： この方法によると、本発明は、（ａ）標的（および、
二重鎖の場合は標的相補体が存在することから標的相補
体）にプローブをハイブリダイゼーションさせること；
（ｂ）Xnと命名した少なくとも一つのギャップに充填す
るために少なくとも一つのプローブを伸長させること；
（ｃ）伸長させたプローブを隣接するプローブに連結し
融合または連結した生成物を形成させること；および
（ｄ）融合生成物を標的から解離させること、および所
望の標的配列を増幅させるためにハイブリダイゼーショ
ン、伸長および連結工程を繰り返すことの反復工程を含
む。
シングルギャップ（“SG"）およびダブルギャップ
（“DG"）の両方の構造を含むこの方法において、“改
変された末端”を付与する“ギャップ"XnおよびYmは、
一つまたは両方の改変されたプローブの、ポリメラーゼ
または逆転写酵素を用いた伸長により“修正”される。
通常、DNA標的にハイブリダイゼーションしたプローブ
の伸長は、当業者に公知であるDNAポリメラーゼまたはK
lenow断片により達成される。RNA標的の場合、伸長は、
逆転写酵素によって達成される。例示的逆転写酵素とし
ては、通常、当業者等に入手可能なトリ骨随芽球症ウィ
ルス（AMV）およびモロニーマウス白血病ウィルス（Ｍ
−MuLV）由来のものが挙げられる。また、あるDNAポリ
メラーゼも、一定の条件下でRNAを鋳型として認識す
る。熱に安定でかつ、LCRに必要な高温でのサイクリン
グに耐え得る伸長試薬を用いることは、当然のことなが
ら好ましい。伸長試薬が熱安定ではない場合、LCRのサ
イクルごとに再添加する必要がある。このような熱安定
性ポリメラーゼとしては、ここでは、AmpliTaqTM（シー
タス−パーキン・エルマー社から入手可能）、Thermus
ポリメラーゼ（モレキュラー・バイオロジー・リソース
社、ミルウォーキー、WI、“MBR"から入手可能）およ
び、組み換え体または精製した、Thermus aquaticus、
Thermus thermophilusもしくは熱安定であることが公
知の他の種由来の天然のポリメラーゼが挙げられる。
この方法における伸長による修正は、ギャップ領域中
の標的塩基に相補的なデオキシリボヌクレオチド三燐酸
（dNTP）が反応混合物中に存在することを必要とする。
更に詳しくは、配列Xnを有するギャップにとって、供給
する必要があるdNTPを、dX′TPと命名する（ここでＸ′
は、ギャップXnにおける各塩基の相補体を表す）。dNTP
は、ファルマシア社（ピスカタウェイ、NJ）およびベセ
スダ・リサーチ・ラボラトリー社（ガイサーズバーグ、
MD）を含む多数の製造元から市販されている。
伸長したプローブが隣接するプローブと境を接しそれ
に連結することができるように連結の位置で正確に伸長
を終結させる必要がある。“終結塩基（stopbases）”
は、この目的のために用いる（図２参照）。Ｑ′と命名
した“終結塩基”は、その相補体Ｑに対応して定義し、
反応混合物からＱに相補的であるdNTPを除くことによ
り、即ち、反応混合物からdQ′TPを除くことにより達成
する。従って、４種のdNTPのうち相補的な３種を反応混
合物に加えるために、４種の塩基のうちの３種のみから
成るセット即ちＮからギャップ配列用塩基をどのように
選ばねばならないかが分かる。４番目のdNTP、即ちdQ′
TPが反応混合物中に存在しない場合、伸長は、所望の連
結位置で終結する。これは、当然の結果として、隣接す
るプローブにおいてＱ′が最初の塩基であり、終結塩基
をコードする、標的上の塩基がギャップに隣接する最初
の塩基（図２のXnギャップの５′末端）であることにな
る。
SG構造における概念を把握することは容易ではある
が、SG変形例は、下記に考察したダブルギャップ（DG）
変形例の非常に特殊なケースであることを理解すべきで
ある（SGにおいてｍ＝０）。しかしながら、DG構造のみ
が目下請求している発明と関連する。図２に示す通り、
一番目のプローブＡは、標的鎖Ｔの一番目のセグメント
にハイブリダイゼーションする。二番目のプローブＢ
は、標的鎖の二番目のセグメントにハイブリダイゼーシ
ョンし、２つのプローブ間に１個以上の塩基のギャップ
を残す。このギャップを標的に対しXnと命名する。伸長
および連結を行って、三番目のプローブ即ちＡ′は、改
造プローブ即ちA:Bの初めの部分にハイブリダイゼーシ
ョン可能になり、四番目のプローブ即ちＢ′は、改造プ
ローブ即ちA:Bの二番目の部分にハイブリダイゼーショ
ン可能になる。DG構造において、三番目のプローブ即ち
Ａ′および、四番目のプローブ即ちＢ′は、プローブ間
に１個以上の塩基のギャップが位置するようにハイブリ
ダイゼーションする。このギャップを改造プローブ（お
よび標的相補体）に対してYmと命名する。図２に示すよ
うに、標的鎖即ちＴは、相補体Ｔ′を有する二重鎖であ
ってもよい。この場合、三番目および四番目のプローブ
は、標的相補体の一番目および二番目のセグメントにハ
イブリダイゼーションすることにより、最初のハイブリ
ダイゼーションに関与することができる。
ポリメラーゼまたは転写酵素による伸長は、５′から
３′方向に進む。従って、ＡおよびＢ′の両者の３′末
端は、伸長を阻止するものがない場合ポリメラーゼによ
る伸長が可能である。鋳型が必要とする次の塩基が反応
混合物中に存在しない場合、伸長は終結する。従って、
プローブＡは、標的鎖に沿って終結塩基相補体（Ｑ）と
遭遇するまでギャップXnを介して伸長する。同様に、プ
ローブＢ′は、（標的相補体または改造したA:BのＡ半
分上で）終結塩基相補体（Ｑ）と遭遇するまでギャップ
Ymを介して伸長する。プローブＡ′またはＢのいずれ
も、ＡまたはＢ′の伸長のための鋳型として役に立たな
いことから、プローブＡおよびＢ′は標的（または前の
サイクル由来の改造ポリヌクレオチド生成物）にハイブ
リダイゼーションする場合にのみ伸長する。
上記のように、伸長したプローブが隣接するプローブ
即ちＢおよびＡ′の５′末端に連結することができるよ
うに、ＡおよびＢ′の伸長をそれぞれのギャップの末端
（即ち連結の位置）で終結することが重要である。従っ
て、反応混合物には、ギャップXnおよびYmの５′末端の
すぐ隣の塩基（Ｑ）に相補的なデオキシリボヌクレオチ
ド三燐酸がない。同じ塩基が両方向の伸長を停止する必
要がないことは、当然のことである。異なる塩基を用い
ることができるが、それがギャップのいずれかを充填す
る必要はない。これで本実施態様における連結の実際の
位置が必ずプローブＡ′およびＢの５′末端にあること
は明白である。またこれらが終結塩基Ｑ′の位置にある
ことは、単なる偶然の一致ではない。
よって、ギャップXnおよびYmはいかなる数の塩基長で
あってもよい、即ち、ｎは１以上のいかなる整数であっ
てもよいし、ｍは０より大きいいかなる整数であっても
よい。いずれのギャップがXnでいずれがYmかという選択
は、そもそも任意であるが、ｎおよびｍは両方ともゼロ
であってはならないことは、当然のことである。ギャッ
プは同じ長さである必要はない、即ち、ｍはｎと等しい
必要はない。ｍが０に等しい場合、ダブルギャップ変形
例は、本明細書で請求している実施態様に用いない特殊
なケースのシングルギャップの形に縮重する。塩基Ｘに
関する唯一の制限は、４種の塩基のうち１種からいずれ
か３種から成るセットＮから選ばれるということであ
る。同様に、塩基Ｙは、セットＭから選ばれる。少なく
とも１個の終結塩基Ｑ′は維持する必要があることか
ら、それぞれＸおよびＹにとって可能である塩基を表す
合わせたセットＮおよびＭは、４種の塩基のうち３種以
下を含む必要がある。よって、Ｙは、４種の塩基のうち
ゼロからいずれの３種であってもよいが、但し、少なく
とも１種の塩基は、セット“非Ｎかつ非M"中に残る。セ
ットＮが４種の塩基のうち３種以下から成る場合、Ｙ
は、その相補体がプローブ伸長停止のために終結塩基
Ｑ′として役に立つことができる少なくとも１種の塩基
が残っている限り、Ｎ内にない塩基であってもよい。１
つの終結塩基は、XnおよびYmギャップの両方において伸
長を停止させるために役立つことができる。
ｍがｎに等しい場合、配列Ymに対する第２の制限が起
きる。ギャップが同じ長さである場合、配列Ymは、配列
Xnに相補的であってはならないか、又はプローブＡおよ
びＢ′の３′末端は、“付着末端”を構成する。“付着
末端”は、連結および増幅が進行するように、プローブ
ＡがプローブＢ′にハイブリダイゼーションして標的に
依存しない二重鎖複合体を形成させる。ｍがｎに等しい
場合、Ymは、むしろXnに相補的でないほうが好ましい。
いいかえると、プローブＡおよびＢ′の末端は、少なく
とも、同じ長さであってもよいが相補的ではない“滑ら
かな末端（slippery ends）”であるほうがよい。
本発明の好ましい態様において、四番目のプローブ
Ｂ′は、標的内のXn配列ギャップと長さが等しいXnの
３′末端配列を含む。この配置は、本発明に必須ではな
いが、ギャップとしては、プローブ間に形成されること
のみが必要である。従って、四番目のプローブＢ′の
３′末端は、配列Xnの３′末端がなければ停止する。た
だし、二番目のプローブＢに関する３′凹部末端はな
い。伸長は５′から３′の方向に起き、dX′TPは、（Xn
を介して伸長するために）とにかく存在する必要がある
ことから、一番目のプローブＡがXnギャップを介して伸
長するように、プローブＢ′は、ギャップ（Ymおよび、
Xnのいずれかの残存物の両方）を介して伸長する。
ダブルギャップの実施態様に用いる本発明の通常の方
法を以下に簡単に説明する。まず、プローブＡおよびＢ
を、標的が存在する場合、それにハイブリダイゼーショ
ンさせる。標的が二重鎖である場合、まずこれを変性さ
せ、プローブＡ′およびＢ′が標的相補体にハイブリダ
イゼーションできるようにする。適切なポリメラーゼの
存在下、プローブＡおよびＢ′は、標的鎖を鋳型として
用い、それぞれdX′TPおよびdY′TPをそれらの３′末端
に付加することにより伸長する。しかしながら、ポリメ
ラーゼが鋳型上の塩基Ｑに遭遇する場合、dQ′TPがdNTP
として反応混合物中に供給されないことから、プローブ
Ａを更に伸長することは不可能になる。伸長は、プロー
ブＢの５′末端に隣接するプローブＡの伸長した３′末
端との連結位置で正確に終結する。鋳型上のプローブ
Ａ′およびＢの存在が伸長を終結させるかどうかは分か
っていない。しかし、それらが存在しない場合でも、適
当な終結塩基選択に注意を払っているとしたら、伸長は
停止する。
次に、リガーゼを用いて、伸長したプローブＡの３′
ヒドロキシル末端をプローブＢの５′燐酸末端に結合さ
せ、融合または連結した第一プローブと標的鎖との二重
鎖複合体を形成させる。標的が二重鎖であり相補体Ｔ′
を有する場合、プローブＡ′およびＢ′が標的相補体に
ハイブリダイゼーションするならば、リガーゼは、初め
のサイクルにおいてプローブＡ′およびＢ′をも結合さ
せる。これらが、標的相補体よりもむしろ過剰のプロー
ブＡおよびＢにハイブリダイゼーションする場合、末端
が平滑でも付着でもなく連結のための基質がないことか
ら連結は阻害される。
引き続いて、二重鎖複合体は、解離し、新しいプロー
ブＡ、Ａ′、ＢおよびＢ′は、標的、標的相補体およ
び、最初のサイクル由来の両方の融合ポリヌクレオチド
にハイブリダイゼーションすることができる。伸長およ
び連結は、前述の通りに起こりそのプロセスを繰り返す
ことができる。
ＸおよびＹの例示的組み合わせ、それらのdNTPカウン
ターパート、およびその結果得られる、ＱおよびＱ′に
なる可能性を表１に示す。
ダブルギャップの場合、ギャップXnおよびYmの長さは
１または１以上のいかなる整数であってもよい。例え
ば、１から20までの塩基のギャップは、可能である。し
かしながら、実際的には、より短い鎖長、例えば１個か
ら３個または５個の塩基のギャップが好ましい。ほんの
１個または２個の塩基のギャップは、真のシグナル対バ
ックグランドの比を大幅に増加させ、終結塩基およびdX
TPのために最も多数のオプション（options）を残すこ
とが知見された。プローブは、実際には、終結塩基を
“選択する”というよりむしろ存在する標的の全体にわ
たって設計することから、１個または２個の塩基のギャ
ップが、最も多くの場合好ましい。更に、ダブルギャッ
プの実施態様は、シングルギャップ変形例より好ましい
ことが分かった。
標的配列の特徴： 明白にするために、ダブルギャップを、ここで“p"が
一方の鎖のギャップ中の塩基の数であり、“q"が他方の
鎖のギャップ中の塩基の数である、“DGp,q"として表
す。従って、好ましいダブルギャップの具体例は、その
５′末端が連結に関与する２つのプローブのそれぞれか
ら２個の塩基を喪失しており、これをDG2,2と命名す
る。この好ましい実施態様において、他の２つのプロー
ブの３′末端は重複しないで、むしろ標的鎖（およびそ
の相補体）と同じ位置で終結する。やはり本明細書にお
ける意味を明白にするために、標的配列の塩基間の小点
またはピリオド即ち“."の使用は、相補的プローブにハ
イブリダイゼーションする場合、２つのプローブ中のギ
ャップのためにプローブが平滑末端化されるであろう位
置を表す。言い替えると、プローブＡおよびＢ′（図３
参照）は、プローブＡ′およびＢにギャップが存在しな
い場合連結の位置で平滑末端化されるであろう３′末端
を有する。それが、連結が起きたであろう、小点によっ
て示された位置である。しかしながら、本発明によるギ
ャップの存在によって、プローブＡおよびＢ′が伸長
し、それによって、実際の連結の２つの埋め合せ位置
（offset points）が創出される。
特に好ましいDG実施態様において、両方のギャップ
は、たった１つの型のデオキシリボヌクレオチド三燐酸
で充填可能である。これは、配列−Ep.E′ｑ−（ここ
で、Ｅは、いずれかの塩基を表し、ｐおよびｑは１から
約10の間の整数である）を有する標的配列の選択を必要
とする。その３′末端が伸長／連結に関与するところの
２つのプローブ（例えば図３のプローブＡおよびＢ′）
が両方ともＥおよびＥ′間の小点“."で終結するように
プローブセットを設計する必要がある。“終結塩基”を
提供するために、更に要件を付け加える。標的配列は、
Ｅ鎖から外側の隣の位置にＥ以外の塩基を有する必要が
あり、同様に、Ｅ′鎖から外側の隣の位置にＥ′以外の
塩基を有する必要がある。これは、−LPp.E′qJ−（こ
こで、Ｌは、Ｅ以外のいずれかの塩基であり、Ｊは、
Ｅ′以外のいずれかの塩基である）として表すことがで
きる。最後に、ハイブリダイゼーションを容易にするの
に充分なプローブ鎖長を提供し、かつ任意に特異性を提
供するために、領域（Ｎ）ｈおよび（Ｎ）ｋを用いて、 ５′−（Ｎ）hLEp.E′qJ（Ｎ）ｋ−３′ （ここで、Ｎは、他の任意の塩基Ｎとは無関係の任意の
塩基を表し、ｈおよびｋはそれぞれ５より大きい整数で
ある）を生じさせる。通常、所望の特異性を提供するた
めに、個々のプローブは、少なくとも10または11ヌクレ
オチド鎖長、即ち（ｐ＋ｈ）および（ｑ＋ｋ）の和が少
なくとも10でなければならず、より普通には約20から40
であるが、100までまたはそれ以上であってもよい。上
記のように、ｐおよびｑは、同じであってもよいし、異
なっていてもよく、通常小さい数、例えば１−３であ
る。
この好ましいGD2,2系において、プローブは、図３に
示した名称を用いて以下のように設計し合成する： Ａ′ ハプテン１−３′−（Ｎ′）ｈ＋Ｌ′−５′ ３′−EqJ′（Ｎ′）ｋ＋−５′−ハプテン２ Ｂ′ Ａ ハプテン１−５′−（Ｎ′）ｈ＋LEp−３′ ５′−Ｊ（Ｎ）ｋ＋−５′−ハプテン２ Ｂ （ここで、ｈ′およびｋ′はｈおよびｋに正確に等しい
必要はないことを除いは、これらの記号は上記に定義し
た通りである）。標的配列または相補的プローブの任意
かより僅かに短いまたは長いことは、任意のプローブに
とっても全く差し支えない。この鎖長における変形は、
“＋”記号により示す。この変形は、通常プローブ鎖長
の20−25％以下、好ましくは10％以下である。また、鎖
長における変形がないことも当然可能である。更に、ｈ
＋およびｋ＋は、それぞれの場合に異なる数を表すこと
もできるが、ただし、これらは20−25％変形制限の範囲
内である。従って、プローブＡは、プローブＡ′より正
確にｐ塩基分だけ長い必要はなく（これらの（Ｎ）h+部
分の鎖長も同様に変化することができる）、同様のこと
がk+ならびにプローブＢおよびＢ′についても言える。
Ｅ′のみの単一のデオキシリボヌクレオチド三燐酸
は、すべてのギャップを充填するために必要である。塩
基ＬおよびＪは、Ｑと同じ機能を果たす、即ち、終結塩
基Ｑ′をコードする。しかしながら、本実施態様におい
てＬおよびＪに加える更なる制限のため、ここではこれ
らの名称ＬおよびＪを用いる。本明細書中に前述したよ
うに、ハプテン１および２は、連結した生成物の分離お
よび検出を可能にするのに役立つ。これらは、特に、IM
x（登録商標）装置（アボットラボラトリーズ社）にお
ける自動検出に有用である。ハプテン１は、ハプテン２
と異なっているほうがよい。抗体を生じさせることので
きる実質的に任意の低分子量化合物も、ハプテンとして
用いてもよい。
この好ましい実施態様の数例を下記表IIの最初の欄、
および以下の例に示す。
本発明の他のより普遍化した実施態様は、すべてのギ
ャップを充填するのにたった２つの型のデオキシリボヌ
クレオチド三燐酸を必要とする、標的配列およびプロー
ブセットを利用する。この態様の例を、表IIの第２欄に
示し、その標的配列を下記一般式によって表す： ５′−（Ｎ）hXEp.FqZ（Ｎ）ｋ−３′ ここで、Ｎ、ｐ、ｑ、ｈおよびｋは、すべて、前述の通
りに定義する。Ｅは、前述のような任意の塩基であって
もよい。Ｆは、Ｅ以外の任意の塩基であってもよい（も
し、これがＥであるならば、ｐ＝ｑの場合その末端は
“付着”である）が、Ｅ′である場合、このケースは上
記のより単純な実施態様に退歩する。Ｆの選択における
更なる柔軟性ゆえに、終結塩基ＸおよびＺに対し更なる
制限を加える。Ｘは、ＥまたはＦ′以外の任意の塩基で
あってもよく、一方、Ｚは、ＦまたはＥ′以外の任意の
塩基であってもよい。ギャップは、Ｅ′およびＦのデオ
キシリボヌクレオチド三燐酸によって充填される。
このDG2,2系において、プローブは、図３に示した名
称を用い以下のように設計し合成する： Ａ′ ハプテン１−３′−（Ｎ′）ｈ＋Ｘ′−５′ ３′−Ｆ′qZ′（Ｎ′）ｋ＋−５′−ハプテン２
Ｂ′ Ａ ハプテン１−５′−（Ｎ）ｈ＋XEp−３′ ５′−Ｚ（Ｎ）ｋ＋−５′−ハプテン２ Ｂ すべてのギャップを充填するために必要とする２つのデ
オキシリボヌクレオチド三燐酸は、ＦおよびＥ′であ
る。塩基ＸおよびＺは、終結塩基Ｑ′をコードするＱと
同じ機能を果たす。しかしながら、本実施態様において
ＸおよびＺに加える更なる制限のため、ここではこれら
の名称ＸおよびＺを用いる。また、この制限はまた、Ｌ
およびＪに対する制限と異なる。ハプテンは、上記の通
りである。
本明細書で終結塩基をコードする“X"（またはプロー
ブに用いるＸもしくはＸ′）は、Xnギャップまたは、Xn
ギャップを充填するのに必要とされるdX′TPと混同しな
いことが、重要である。残念なことに、アルファベット
は、26文字しかなく、ほとんど本明細書において使用し
ている。ＸおよびＸ′の２つの使用間の混同は、その関
連する内容により回避されると考えられる。
本発明の他の変形例としては、DG2,2以外のDG構造が
挙げられる。表IIおよび実施例に示すように、DG1,1;DG
1,2（および2,1）;DG2,3（および3,2）およびDG3,3も可
能である。更に、下記の表IIIは、約３より長いギャッ
プ接合点の可能性は低いことを示しているが、10個まで
の塩基のギャップは、ｐおよびｑの総称的なケースに含
まれる。ほぼｑに等しいｐ（即ち、１または２しか違わ
ない）を有することは、有利なことかもしれないが、必
ずしも必要というわけではない。テストしたわけではな
いが、ダブルギャップ1,3または2,4が本発明に有効では
ないと考える理由はない。
上記考察は、表IIで用いた“特殊な”記号について詳
細に述べている。“従来の”記号については、当業者等
に更に説明する必要はないだろう。
上記に概説した要件を満たす特定の標的配列を調査及
び同定する方法が当業者等に公知であることは、理解さ
れよう。例えば、多数のデータベースが、容易に入手可
能なコンピューターソフトウェア（例えば、マックベク
ター（MacVector）、マックモーリー（MacMolly）また
はジーンワークス（Geneworks））によって調査するこ
とのできる配列情報（例えば、ジーンバンク（GENBAN
K）、NBRF、EMBLまたはスイスプロット（Swiss−Pro
t））を含有する。また、任意の微生物の公知のゲノム
中にも、要件を満たす複数の所在を一般的に見い出すで
あろうことも当然のことである。例えば、約9.7キロベ
ースを含有するHIV １（実施例１−５参照）からのSF2
CG単離物だけを調査しても、2000以上の可能性のあるDG
位置が明白になる。それぞれの型のギャップおよび充填
状況の内訳を表IIIに示す。ｐ＝ｑである場合、１つの
位置にある一方の鎖上のDGp,qが、反対側の鎖上のDGp,q
部位をも含むことは当然のことである。Ｆ＝Ｅ′（即ち
単一dNTP充填）である条件では、２つの標的部位は、実
際にはたった一つの位置である。従って、すべての対称
的ダブルギャップ（ｐ＝ｑ）については、表には、調査
によって実際に分かった半分の数を報告している。対照
的に、一方の鎖上の非対称のDG（例えばDG1,2またはDG
2,3）は、反対側の鎖上の２番目の異なる部位（この時
はDG2,1またはDG3,2を除く）を表す。従って、非対称部
位は、数を２分することなく表に報告されている。
実施例11−12参照 3.Hatt,C.等Nuc.Acids Res.16:4053−4067 （1988年），実施例13参照 HIV １単離物の13箇所の75DG2,2単一dNTP充填部位は、
gag領域内に位置する。これらの13箇所の位置を、添付
書類Ａに示す。
ゲノム配列を把握していない場合、LCR法の任意かの
変形例を用いる前に、少なくとも或る一部は確立する必
要がある。典型的には、当業者は、日常的方法、例え
ば、Maniatis,T.等Molecular Cloning:A Laboratory Ma
nual Cold Spring Harbor Laboratory,コールドスプリ
ングハーバー、NY（1982年および1989年）のようなこの
主題に関する従来の文献に教示されているようなクロー
ニングおよび配列決定法を介して配列を決定することが
できる。
いくつかの型、菌株または血清型等の普遍的なプロー
ブセット（HIVまたはChlamydiaのケースのような）を探
求しようと、一つの型だけを同定するための特定のプロ
ーブセット（HPVのケースのような）を探求しようと、
それぞれ保存された配列または新規な配列を同定するた
めに、このような調査から得られた配列と他の微生物の
ゲノムとをどのように比較するかは、当業者には、分か
るであろう。更に、通常の研究室レベルの研究は、特定
のプローブセットの普遍性または特異性を確認すること
が必要である。特異性がギャップ領域によって得られる
ようにプローブを設計することも可能であるが、（Ｎ）
ｈおよび（Ｎ）ｋの鎖長および種類は、それぞれのプロ
ーブの普遍性または特異性に大きく影響する。
更なる特徴 任意の“凹んだ（recessed）”変形例の態様において
も、ギャップ充填に用いるデオキシリボヌクレオチド三
燐酸は、マーカー部分を含有するように修飾することが
できる。例示的マーカーとしては、ラジオアイソトープ
のような直接標識、またはビオチン、ジゴキシンまた
は、固相もしくは標識形成系のいずれかにより認識され
ることが可能な他のハプテンのようなフックが挙げられ
る。放射性標識としては、なかでも32Pおよび3Hが挙げ
られる。
マーカーのdNTP内への取り込みは、通常、従来の有機
化学の分野である。リンカーまたはスペーサを用いるこ
とができるが、必須ではない。重要なことは、修飾され
たdNTPが、標的鎖上のその相補体と反対側のギャップ中
に組み込まれ、かつ隣接する塩基と共有的に結合するこ
とができることである。
実施例 本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発
明は、これによりいかようにも制限されるものではな
い。例えば、配列の特定の鎖長がリストアップされる。
同じ地図上の位置があてはまるが塩基の数が僅かに少な
いまたは多い配列は、これらの配列の等価物であると考
えられ、リストアップした配列と同じ標的上の同じ位置
にハイブリダイゼーションする限り、本発明の範囲内に
入る。
特に断わらない限り、実施例中の配列は５′末端が左
方にくるように記載している。実施例中、いくつかのプ
ローブは、プローブに共有的に結合したハプテンで標識
しており、ここで、“FL"はフルオレセインハプテンを
表し、“BIO"は、ビオチンハプテンを表す。ハプテン
は、示されるように３′末端または５′末端のいずれか
で結合している。実施例中、プローブのナンバリングの
仕方は、図３のそれぞれのプローブA,A′、B,B′に対す
る少数.1、.2、.3または.4に引き続く地図上の位置に対
応している。従って、プローブの配置 .1:.3 .2:.4 は、図２または３と比較した場合さかさまになっている
配置をもたらす。プローブをあたかもハイブリダイゼー
ションさせたように直線化する場合、与えられた地図上
の位置は、最も左側の塩基を表している。最も左側の位
置は、最も小さい数を生じさせることが分かっているの
で、この情報から残りの地図上の位置を計算することが
できる。
ほとんどの実施例において、結果は、IMx（登録商
標）装置で読み取った。これは、アボットラボラトリー
ズ社から市販されており、EP−Ａ−288 793およびFior
e M.等Clin.Chem.,34/9:1726−1732（1988年）に記載さ
れいる。IMx装置は、典型的に２−８カウント/sec/sec
（c/s/s）の範囲で“機械”ノイズまたはバックグラン
ドを生じさせる。
ポリメラーゼの量は、以下の通りに定義した（例えば
MBRによる）単位で表す、即ち、酵素１単位は70℃で30
分間に酸不溶性物質中に10ナノモルの全ヌクレオチドを
取り込むのに必要とする酵素の量に等しい。リガーゼの
単位は、95％精製したThermus thermophilus DNAリガ
ーゼ1mgは、約１×108単位の比活性を有すると（アボッ
トラボラトリーズ社により内部用に）定義されている。
これは正確に標準化されておらず20％まで変動するの
で、最適化は、当業者の手椀にかかっている。
実施例１−12は、いくつかの異なる配列を用いたヒト
免疫不全ウィルス（HIV1）の検出に関する。配列、それ
らの地図上の位置（Sanchez−Pescado,R.等Science 22
7:484−492（1985年）によるSF2CG単離物）、およびそ
れらの配列番号を下記表IVに示す。添付書類Ａは、HIV1
のgag領域におけるDG2,2標的の数および地図上の位置を
示す。
実施例１ ダブルギャップLCR（DG2,2）は、85℃で65秒のインキ
ュベーションおよび50℃で65秒のインキュベーションか
ら成るサイクル40回を実施した。反応には、０または10
2標的分子のいずれかを提供した。標的DNAは、pBR322中
にクローン化したHIV1 DNAのBamH1断片である。陰性反
応は、10ナノグラムのヒト胎盤DNAを含有した。陽性反
応は、10ナノグラムの胎盤DNAのバックグランドにHIV1
プラスミドDNAの指示した数のコピーを含有した。用い
たLCRオリゴヌクレオチドを表IVにリストアップする。
これらのオリゴヌクレオチドは、HIV1ゲノム（HIVSF2CG
単離物、Sanchez−Pescado参照）のgag領域内の地図上
の位置1667−1716に特異的である。反応は、50mMのEPPS
pH7.8、100mMのKCl、10mMのMgCl2、1mMのDTT、10mMの
NH4Cl、100μＭのNAD、10μg/mlのBSA、５×1011分子の
各オリゴヌクレオチド1667.1、1667.2、1667.3、1667.4
（それぞれ配列番号１−４）、１μＭの２′−デオキシ
グアノシン５′−三燐酸、0.5単位のThermus DNAポリ
メラーゼ（モレキュラーバイオロジーリソース社、“MB
R"）、および3400単位のThermus thermophilus DNAリ
ガーゼを含有する緩衝液中で行った。反応容量は50μｌ
であり、各反応液はサイクリングする前に25μｌの鉱油
でおおった。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイによりLCR増幅生
成物を検出した。
標的分子の数 割合（rate） 0 5.76 102 1686.8 実施例２ ダブルギャップLCR（DG2,2）は、実施例１に記載した
ものと同じサイクリングパラメーターを用い40サイクル
実施した。反応には、０、10または102標的分子のいず
れかを、二重に提供した。陰性反応は、１マイクログラ
ムのヒト胎盤DNAを含有した。陽性反応は、１マイクロ
グラムのヒト胎盤DNA中に102のHIV標的DNA分子を含有し
た。用いたオリゴヌクレオチドを表IVにリストアップす
る。これらのオリゴヌクレオチドは、HIV1ゲノム（HIV
SF2CG単離物）のgag領域内の地図上の位置912−961に
特異的である。反応は、50mMのEPPS pH7.8、20mMの
K+、30mMのMgCl2、7.5×1011分子の各オリゴヌクレオチ
ド912.1、912.2、912.3、912.4（それぞれ配列番号５−
８）、100μＭのNAD、１μＭの２′−デオキシシチジン
５′−三燐酸、0.5単位のThermus DNAポリメラーゼ（M
BR社）、および3400単位のThermus thermophilus DNA
リガーゼを含有する緩衝液中で行った。反応容量は50μ
ｌであり、各反応液は25μｌの鉱油でおおった。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイにより増幅生成物
を検出した。
標的分子の数 割合 0 3.8 10 32.8 102 604.4 実施例３ ダブルギャップLCR（DG2,2）は、85℃で65秒のインキ
ュベーションおよび60℃で65秒のインキュベーションか
ら成るサイクル40回を実施した。反応には、０または10
2HIV1標的DNA分子の任意かを、４重に提供した。陰性反
応は、１マイクログラムのヒト胎盤DNAを含有した。陽
性反応は、１マイクログラムのヒト胎盤DNA中に102のHI
V1標的DNA分子を含有した。用いたオリゴヌクレオチド
を表IVにリストアップする。これらのオリゴヌクレオチ
ドは、オリゴヌクレオチド2086.3の15番号のヌクレオチ
ドが、分子内で可能なヘアピン構造（ＣからＧに変化し
たオリゴヌクレオチド2086.4の８番目）を崩壊するため
に、ＧからＣに変化したことを除いては、HIV1ゲノム
（HIVSF2CG単離物）のgag領域内の地図上の位置2086−2
135に特異的である。反応は、オリゴヌクレオチド2086.
1、2086.2、2086.3、2086.4（それぞれ配列番号９−1
2）を各反応につき7.5×1011分子で用いたことを除いて
は、実施例２で用いたものと同じ緩衝液中で行った。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイによりLCR増幅生
成物を検出した。
標的分子の数 割合 0 5.9 102 249.5 実施例４ ダブルギャップLCR（DG2,2）は、実施例３で用いたも
のと同じサイクリングパラメーターを用い、40サイクル
実施した。反応には、０または102HIV1標的DNA分子の任
意かを、４重に提供した。陰性反応は、１マイクログラ
ムのヒト胎盤DNAを含有した。陽性反応は、１マイクロ
グラムのヒト胎盤DNA中に102のHIV1標的DNA分子を含有
した。用いたオリゴヌクレオチドを表IVにリストアップ
する。これらのオリゴヌクレオチドは、HIV1ゲノム（HI
VSF2CG単離物）のgag領域内の地図上の位置789−838に
特異的である。反応条件は、それぞれ7.5×1011分子の
オリゴヌクレオチド789.1、789.2、789.3、789.4（それ
ぞれ配列番号13−16）および１μＭの２−デオキシアデ
ノシン５′−三燐酸を用いたことを除いては、実施例２
のそれと同じである。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイによりLCR増幅生
成物を検出した。
標的分子の数 割合 0 3.8 102 604.4 実施例５ ダブルギャップLCR（DG1,1）は、85℃で65秒のインキ
ュベーションおよび65℃で65秒のインキュベーションか
ら成るサイクル45回を実施した。反応には、０または10
2標的DNA分子のいずれかを、二重に提供した。陰性反応
は、10ナノグラムのヒト胎盤DNAを含有した。陽性反応
は、10ナノグラムのヒト胎盤DNA中に102のHIV1標的DNA
分子を含有した。用いたオリゴヌクレオチドは、HIV1ゲ
ノム（HIV SF2CG単離物）のLTR領域内の地図上の位置5
08−559に特異的である。反応は、オリゴヌクレオチド5
08.1、508.2、508.3、および508.4（それぞれ配列番号1
7−20）を各反応につき5x1011分子で用い、かつ２′−
デオキシシチジン５′−三燐酸を１μＭで用いたことを
除いては、実施例１で用いたものと同じ緩衝液中で行っ
た。
増幅させた後、反応後をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイによりLCR増幅生
成物を検出した。
標的分子の数 割合 0 4.5 102 1284.8 実施例６ ダブルギャップLCR（DG2,3）は、前述の実施例と同様
にサイクルを30−50回実施した。用いたオリゴヌクレオ
チドを表IVにリストアップする。これらのオリゴヌクレ
オチドは、HIV1ゲノム（HIV SF2CG単離物）のvpuコー
ド領域内の地図上の位置5569−5616に特異的である。反
応条件は、それぞれ35x10 11分子のオリゴヌクレオチド
5569.1、5569.2、5569.3、5569.4（それぞれ配列番号21
−24）および１μＭの２′−デオキシシチジン５′−三
燐酸を用いたことを除いては、実施例１−３に記載した
ものと同様である。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイにより増幅生成物
を検出した。
実施例７ ダブルギャップLCR（DG2,2）は、90℃で65秒のインキ
ュベーションおよび65℃で65秒のインキュベーションか
ら成るサイクル45回を実施した。反応には、０または10
2HIV1標的DNA分子のいずれかを、二重に提供した。陰性
反応は、10ナノグラムのヒト胎盤DNAを含有した。陽性
反応は、10ナノグラムの胎盤DNA中に102のHIV1標的分子
を含有した。用いたオリゴヌクレオチドを表IVにリスト
アップする。これらのオリゴヌクレオチドは、HIV1ゲノ
ム（HIV SF2CG単離物）のgag領域内の地図上の位置145
0−1498に特異的である。反応は、それぞれ５×1011分
子のオリゴヌクレオチド1450.1、1450.2、1450.3、およ
び1450.4（それぞれ配列番号25−28）を用いたことを除
いては、実施例２に記載したものと同じ緩衝液中で行っ
た。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイによりLCR増幅生
成物を検出した。
標的分子の数 割合 0 4.8 102 1932.5 実施例８ ダブルギャップLCR（DG2,1:2dNTP）は、前述の実施例
と同様にサイクルを30−50回実施した。用いたオリゴヌ
クレオチドを表IVにリストアップする。これらのオリゴ
ヌクレオチドは、HIV1ゲノム（HIV SF2CG単離物）のga
g領域内の地図上の位置1573−1620の特異的である。反
応条件は、それぞれ約５×1011分子のオリゴヌクレオチ
ド1573.1、1573.2、1573.3、1573.4（それぞれ配列番号
29−31）ならびにそれぞれ約１μＭの２′−デオキシシ
チジン５′−三燐酸および２′−デオキシアデノシン
５′−三燐酸を用いたことを除いては、実施例１−３に
記載したものと同様である。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイにより増幅生成物
を検出した。
実施例９ ダブルギャップLCR（DG2,2:2dNTP）は、前述の実施例
と同様にサイクルを30−50回実施した。用いたオリゴヌ
クレオチドを表IVにリストアップする。これらのオリゴ
ヌクレオチドは、HIV1ゲノム（HIVSF2CG単離物）のpol
領域内の地図上の位置4060−4107に特異的である。反応
条件は、それぞれ約５×1011分子のオリゴヌクレオチド
4060.1、4060.2、4060.3、4060.4（それぞれ配列番号33
−36）ならびにそれぞれ約１μＭの２′−デオキシチミ
ジン５′−三燐酸および２′−デオキシシチジン５′−
三燐酸を用いたことを除いては、実施例１−３に記載し
たものと同様である。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイにより増幅生成物
を検出した。
実施例10 ダブルギャップLCR（DG3,2:2dNTP）は、前述の実施例
と同様にサイクルを30−50回実施した。用いたオリゴヌ
クレオチドを表IVにリストアップする。これらのオリゴ
ヌクレオチドは、HIV1ゲノム（HIVSF2CG単離物）のgag
領域内の地図上の位置2683−2730に特異的である。反応
条件は、それぞれ約５×1011分子のオリゴヌクレオチド
2683.1、2683.2、2683.3、2683.4（それぞれ配列番号37
−40）ならびにそれぞれ約１μＭの２′−デオキシアデ
ノシン５′−三燐酸および２′−デオキシグアノシン
５′−三燐酸を用いたことを除いては、実施例１−３に
記載したものと同様である。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイにより増幅生成物
を検出した。
実施例11 ダブルギャップLCR（DG3,3:2dNTP）は、表IVにリスト
アップしたオリゴヌクレオチドを用いて前述の実施例と
同様にサイクルを30−50回実施した。これらのオリゴヌ
クレオチドは、HIV1ゲノム（HIV SF2CG単離物）のgag
領域内の地図上の位置1753−1800に特異的である。反応
条件は、それぞれ約５×1011分子のオリゴヌクレオチド
1753.1、1753.2、1753.3、1753.4（それぞれ配列番号41
−44）ならびにそれぞれ約１μＭの２′−デオキシチミ
ジン５′−三燐酸および２′−デオキシシチジン５′−
三燐酸を用いたことを除いては、実施例１−３に記載し
たものと同様である。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイにより増幅生成物
を検出した。
実施例12 ダブルギャップLCR（DG3,3）は、前述の実施例と同様
にサイクルを30−50回実施した。用いたオリゴヌクレオ
チドを表IVにリストアップする。これらのオリゴヌクレ
オチドは、分子内で可能なヘアピン構造（ＡからＧに変
化したオリゴヌクレオチド3697.2の５番目）を崩壊する
ためにオリゴヌクレオチド3697.1の17番目のヌクレオチ
ドがＴからＣに変化したことを除いては、HIV1ゲノム
（HIV1SF2CG単離物）のpol領域内の地図上の位置3697−
3744に特異的である。反応条件は、それぞれ約５×1011
分子のオリゴヌクレオチド3697.1、3697.2、3697.3、36
97.4（それぞれ配列番号45−48）および１μＭの２′−
デオキシチミジン５′−三燐酸を用いたことを除いて
は、実施例１−３に記載したものと同様である。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイにより増幅生成物
を検出した。
実施例13−15は、HIV2DNAの検出に関する。これらの
配列、Franchini,G.等,Proc.Natl.Acad Sci.86:2433−2
437（1988年）による地図上の位置および配列番号を下
記表Ｖに示す。
実施例13 ダブルギャップLCR（DG2,2）は、実施例１に記載した
ものと同じサイクリングパラメーターを用い、45サイク
ル実施した。反応には、０、102または103標的分子のい
ずれかを、３重に提供した。標的DNAは、pTZ18中にクロ
ーン化されたHIV2ゲノムDNAのセグメントである。陰性
反応は、１マイクログラムのヒト胎盤DNAを含有した。
陽性反応は、１マイクログラムのヒト胎盤DNAのバック
グランドにHIV2含有プラスミドDNAの指示した数のコピ
ーを含有した。用いたオリゴヌクレオチドを表Ｖにリス
トアップする。これらのオリゴヌクレオチドは、オリゴ
ヌクレオチド2060.3の14番目のヌクレオチドが、分子内
で可能なヘアピン構造（ＧからＴに変化したオリゴヌク
レオチド2060.4の９番目）を崩壊するために、ＣからＡ
に変化したことを除いては、HIV2ゲノム（HIV21SY単離
物）のgag領域内の地図上の位置2060−2109に特異的で
ある。反応は、それぞれ５×1011分子のオリゴヌクレオ
チド2060.1、2060.2、2060.3、2060.4（それぞれ配列番
号49−52）および１μＭの２′−デオキシチミジン５′
−三燐酸を用いたことを除いては、実施例２に記載した
ものと同じ緩衝液中で行った。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイによりLCR増幅生
成物を検出した。
標的分子の数 割合 0 8.4 102 318.4 103 789.3 実施例14 ダブルギャップLCR（DG2,2）は、前述の実施例と同様
にサイクルを30−50回実施した。用いたオリゴヌクレオ
チドを表Ｖにリストアップする。これらのオリゴヌクレ
オチドは、HIV2ゲノム（HIV21SY単離物）のgag領域内の
地図上の位置1094−1143に特異的である。反応条件は、
それぞれ約５×1011分子のオリゴヌクレオチド1094.1、
1094.2、1094.3、1094.4（それぞれ配列番号53−56）お
よび１μＭの２′−デオキシチミジン５′−三燐酸を用
いたことを除いては、実施例１−３に記載したものと同
様である。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイにより増幅生成物
を検出した。
実施例15 ダブルギャップLCR（DG2,2）は、前述の実施例と同様
にサイクルを30−50回実施した。用いたオリゴヌクレオ
チドを表Ｖにリストアップする。これらのオリゴヌクレ
オチドは、HIV2ゲノム（HIV21SY単離物）内の地図上の
位置4661−4710に特異的である。反応条件は、それぞれ
約５×1011分子のオリゴヌクレオチド4661.1、4661.2、
4661.3、4661.4（それぞれ配列番号57−60）および１μ
Ｍの２′−デオキシチミジン５′−三燐酸を用いたこと
を除いては、実施例１−３に記載したものと同様であ
る。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイにより増幅生成物
を検出した。
実施例16−19は、16および18の型であるヒトパピロー
マウィルス（HPV）の検出に関する。これらの配列およ
び配列番号を表VIに示す。18の型（実施例８および10）
の地図上の位置は、Seedorf,K.等Virology 145:181−18
5（1985年）に記載されており、一方16の型の地図上の
位置は、Zhang,Y.−X.,Morrison,S.G.,およびH.D,Caldw
ell,Nuc.Acids Res.18:1061（1990年）に記載されてい
る。
実施例16 ダブルギャップLCRは、実施例１に記載したものと同
じサイクリングパラメーターを用い、35サイクル実施し
た。反応には、０または102標的DNA分子のいずれかを提
供した。標的DNAは、pGEM3中にクローン化された全長HP
V18ゲノムDNAである。陰性反応は、15ナノグラムの仔牛
胸腺DNAを含有した。陽性反応は、15ナノグラムの仔牛
胸腺DNA中に102のHPV18標的DNA分子を含有した。用いた
オリゴヌクレオチドを表VIにリストアップする。これら
のオリゴヌクレオチドは、HPV18ゲノム３のE6/E7領域内
の地図上の位置631−676に特異的である。反応は、それ
ぞれ５×1011分子のオリゴヌクレオチド631.1、631.2、
631.3、631.4（それぞれ配列番号61−64）および１μＭ
の２′−デオキシグアノシン５′−三燐酸を用いたこと
を除いては、実施例１に記載したものと同じ緩衝液中で
行った。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイによりLCR増幅生
成物を検出した。
標的分子の数 割合 0 6.8 102 166.6 実施例17 ダブルギャップLCR（DG2,2）は、実施例３に記載した
ものと同じ反応条件を用い、35サイクル実施した。反応
には、０または102標的DNA分子のいずれかを提供した。
標的DNAは、pSP65中にクローン化された全長HPV16ゲノ
ムDNAである。陰性反応は、15ナノグラムの仔牛胸腺DNA
を含有した。陽性反応は、15ナノグラムの仔牛胸腺DNA
中に102の標的HPV16DNA分子を含有した。用いたオリゴ
ヌクレオチドを表VIにリストアップする。これらのオリ
ゴヌクレオチドは、HPV16ゲノムのE6/E7領域内の地図上
の位置480−526に特異的である。反応は、それぞれ５×
1011分子のオリゴヌクレオチド480.1、480.2、480.3、4
80.4（それぞれ配列番号65−68）および１μＭの２′−
デオキシグアノシン５′−三燐酸を用いたことを除いて
は、実施例１で用いたものと同じ緩衝液中で行った。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイによりLCR増幅生
成物を検出した。
標的分子の数 割合 0 5.9 102 289.6 実施例18 ダブルギャップLCR（DG2,2）は、実施例１に記載した
ものと同じサイクリングパラメーターを用い、35サイク
ル実施した。反応には、０または106標的DNA分子のいず
れかを、二重に提供した。標的DNAは、プラスミド中に
クローン化された全長HPV18ゲノムDNAである。陰性反応
は、15ナノグラムの仔牛胸腺DNAを含有した。陽性反応
は、15ナノグラムの仔牛胸腺DNA中に106の標的HPV18DNA
分子を含有した。用いたオリゴヌクレオチドを表VIにリ
ストアップする。これらのオリゴヌクレオチドは、HPV1
8ゲノムのE6/E7領域内の地図上の位置488−534に特異的
である。反応は、それぞれ５×1011分子のオリゴヌクレ
オチド488.1、488.2、488.3、488.4（それぞれ配列番号
69−72）および１μＭの２′−デオキシシチジン５′−
三燐酸を用いたことを除いては、実施例１に記載したも
のと同じ緩衝液中で行った。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイによりLCR増幅生
成物を検出した。
標的分子の数 割合 0 7.0 106 978.2 実施例19 ダブルギャップLCR（DG1,2）は、88℃で65秒のインキ
ュベーションおよび50℃で80秒のインキュベーションか
ら成るサイクルを40回実施した。反応には、０、104ま
たは106標的DNA分子のいずれかを３重に提供した。標的
DNAは、種々のプラスミド中にクローン化された全長ウ
ィルス性ゲノムである。すべての反応は、330ナノグラ
ムのヒト胎盤DNAを含有した。陽性反応は、104または10
6分子のHPV6、16、18、31、33または61を含有した。用
いたオリゴヌクレオチドを表VIにリストアップする。こ
れらのオリゴヌクレオチドは、HPV16ゲノム内の地図上
の位置6604−6651に対応するが、この配列に正確に対応
する訳ではない。上記にリストアップしたすべてのHPV
の型間の共通配列（consensus）を表すヌクレオチドの
変化を合成中に誘導した。反応は、それぞれ４×1012分
子のオリゴヌクレオチド6604.1、6604.2、6604.3、660
4.4（それぞれ配列番号73−76）、18,000単位のThermus
thermophilus DNAリガーゼ、４単位のThermus DNA
ポリメラーゼ（MBR）、10μＭのNAD,および1.7μＭの
２′−デオキシアデノシン５′−三燐酸を用いたことを
除いては、実施例２に記載したものと同じ緩衝液中で行
った。反応容量は、200μであり、鉱油でおおわなか
った。
増幅させた後、アボットIMx自動イムノアッセイシス
テムを用いて実施したサンドイッチイムノアッセイによ
りLCR反応生成物を検出した。
実施例20−21は、単純ヘルペスウィルス（HSV）の検
出に関する。用いた配列、McGeoch,D.J.等J.Gen.Virol.
68:19−38（1987年）による地図上の位置および配列番
号を表Ｖに示す。
実施例20 ダブルギャップLCR（DG2,2）は、85℃で60秒のインキ
ュベーションおよび50℃で60秒のインキュベーションか
ら成るサイクルを60回実施した。反応には、０または10
2標的DNA分子のいずれかを二重に提供した。標的DNA
は、pUC19中にクローン化されたHSV2ゲノムの4538bpセ
グメントである。陰性反応は、10ナノグラムのヒト胎盤
DNAを含有した。陽性反応は、10ナノグラムのヒト胎盤D
NA中に102HSV2プラスミド分子を含有した。用いたオリ
ゴヌクレオチドを表VIIにリストアップする。これらの
オリゴヌクレオチドは、HSV2ゲノム２のUS4領域内の地
図上の位置4751−4798に特異的である。反応は、各反応
につき５×1011分子のオリゴヌクレオチド4751.1、475
1.2、4751.3、4751.4（それぞれ配列番号77−80）、お
よび１μＭの２′−デオキシシチジン５′−三燐酸を用
いたことを除いては、実施例１に記載したものと同じ緩
衝液中で行った。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイによりLCR増幅生
成物を検出した。
標的分子の数 割合 0 6.0 102 2096.0 実施例21 ダブルギャップLCR（DG1,1）は、実施例１に記載した
ものと同じサイクリングパラメーターを用い、60サイク
ル実施した。反応には、０または102標的DNA分子のいず
れかを、二重に提供した。陰性反応は、10ナノグラムの
ヒト胎盤DNAを含有した。陽性反応は、10ナノグラムの
ヒト胎盤DNA中に102のHSV標的DNA分子を含有した。用い
たオリゴヌクレオチドを表VIIにリストアップする。こ
れらのオリゴヌクレオチドは、HSV2ゲノムの地図上の位
置6465−6512に特異的である。反応は、各反応につき５
×1011のオリゴヌクレオチド6465.1、6465.2、6465.3、
および6465.4（それぞれ配列番号81−84）および１μＭ
の２′−デオキシシチジン５′−三燐酸を用いたことを
除いては、実施例１に記載したものと同じ緩衝液中で行
った。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイによりLCR反応生
成物を検出した。
標的分子の数 割合 0 6.0 102 1156.2 実施例22−24は、Chlamydia trachomatis DNAの検
出に関する。用いた配列および配列番号を表VIIに示
す。MOMP領域（実施例11および12）の地図上の位置は、
Baehr,W.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:4000−4004（19
88年）［EMBL Genbank Data Base:Intelligenetics,Acc
ession＃JO3813］により、一方、潜在プラスミド領域
（実施例13）の地図上の位置は、Hatt,C.等Nuc.Acids R
es.16:4053−4067（1988年）による。
実施例22 ダブルギャップLCR（DG2,2）は、実施例３に記載した
ものと同じサイクリングパラメーターを用い、35サイク
ル実施した。反応には、０または102標的DNA分子のいず
れかを、二重に提供した。標的DNAは、精製したChlamyd
ia trachomatisゲノムDNAである。陰性反応は、330ナ
ノグラムのヒト胎盤DNAを含有した。陽性反応は、330ナ
ノグラムのヒト胎盤DNA中に102のChlamydia標的DNA分子
を含有した。用いたオリゴヌクレオチドを表VIIIにリス
トアップする。これらのオリゴヌクレオチドは、主要外
膜蛋白質（MOMP）遺伝子内の地図上の位置36−89に特異
的である。反応は、それぞれ５×1011分子のオリゴヌク
レオチド36.1、36.2、36.3、36.4（それぞれ配列番号85
−88）および１μＭの２′−デオキシシチジン５′−三
燐酸を用いたことを除いては、実施例２に記載したもの
と同じ緩衝液中で行った。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイによりLCR増幅生
成物を検出した。
標的分子の数 割合 0 7.2 102 34.2 実施例23 ダブルギャップLCR（DG1,2）は、85℃で60秒のインキ
ュベーションおよび59℃で60秒のインキュベーションか
ら成るサイクルを40回実施した。反応には、０または10
2標的DNA分子のいずれかを二重に提供した。陰性反応
は、330ナノグラムのヒト胎盤DNAを含有した。陽性反応
は、330ナノグラムのヒト胎盤DNA中に102のChlamydia標
的DNA分子を含有した。用いたオリゴヌクレオチドを表V
IIIにリストアップする。これらのオリゴヌクレオチド
は、MOMP遺伝子内の地図上の位置552−595に特異的であ
る。反応は、それぞれ８×1011分子のオリゴヌクレオチ
ド552.1、552.2、552.3、552.4（それぞれ配列番号89−
92）、およびα32Pで標識した１μＭの２′−デオキシ
シチジン５′−三燐酸を用いたことを除いては、実施例
３に記載したものと同じ緩衝液中で行った。
増幅させた後、330v定電圧で約２時間8.0Mの尿素を用
い10％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により反応
生成物を分離した。この後、増感紙（オプション）を用
い約12時間ゲルのオートラジオグラフをとった。標的の
存在下、オートラジオグラフィーは、伸長した未連結の
プローブおよび、より長い連結した生成物に匹敵し得る
バンドを示した。陰性の対照は、認識し得るバンドを示
さなかった。
実施例24 ダブルギャップLCR（DG2,2）は、85℃で60秒のインキ
ュベーションおよび59℃で60秒のインキュベーションか
ら成るサイクルを40回実施した。反応には、０または10
2標的分子のいずれかを二重に提供した。陰性反応は、3
30ナノグラムのヒト胎盤DNAを含有した。陽性反応は、3
30ナノグラムのヒト胎盤DNA中に102のChlamydia標的DNA
分子を含有した。用いたオリゴヌクレオチドを表VIIIに
リストアップする。これらのオリゴヌクレオチドは、Ch
lamydia trachomatis潜在プラスミド内の地図上の位置
6693−6739に特異的である。反応は、それぞれ８×1011
分子のオリゴヌクレオチド6693.1、6693.2、6693.3、66
93.4（それぞれ配列番号93−96）、および１μＭの２′
−デオキシグアノシン５′−三燐酸を用いたことを除い
ては、実施例３に記載したものと同じ緩衝液中で行っ
た。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイによりLCR増幅生
成物を検出した。
標的分子の数 割合 0 4.8 102 1538.8 実施例25−29は、Neisseria gonorrhoeaeの検出に関
する。用いた配列を表IXに示す。laz領域（実施例25）
の地図上の位置は、Gotschlich,E.C.,およびM.C.Seiff.
FEMS Microbiol.Letts.43:253−255（1987年）による。
P.II/opa領域（実施例26＆27）の地図上の位置は、Ster
n,A.,M.Brown,P.Nickel,およびT.F.Meyer,Cell 47:61−
71（1986年）による。pilin領域（実施例28＆29）の地
図上の位置は、Meyer,T.F.,E.Billyard,R.Hass,S.Storz
bach,およびM.So.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6110−61
14（1984年）による。
実施例25 ダブルギャップLCR（DG2,1）は、85℃で30秒のインキ
ュベーションおよび54℃で60秒のインキュベーションか
ら成るサイクルを35回実施した。反応には、指示した細
胞由来のゲノムDNAを二重に提供した。すべてのNeisser
ia DNAは、320ngのヒト胎盤DNAの存在下でテストし
た。用いたオリゴヌクレオチド（上記表IX参照）は、Ne
isseria gonorrhoeae laz遺伝子内の地図上の位置27
−74に特異的である。反応は、それぞれ５×1011分子の
オリゴヌクレオチド27.1、27.2、27.3、27.4（それぞれ
配列番号97−100）、および１μＭの２′−デオキシシ
チジン５′−三燐酸を用いたことを除いては、実施例３
に記載したものと同じ緩衝液中で行った。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイによりLCR増幅生
成物を検出した。
実施例26 ダブルギャップLCR（DG3,2）は、85℃で30秒のインキ
ュベーションおよび57℃で60秒のインキュベーションか
ら成るサイクルを27回実施した。反応には、指示した細
胞由来のゲノムDNAを二重に提供した。すべてのNeisser
ia DNAは、320ngのヒト胎盤DNAの存在下でテストし
た。用いたオリゴヌクレオチド（上記表IX参照）は、Ne
isseria gonorrhoeae opa遺伝子内の地図上の位置66
−113に特異的である。反応は、それぞれ５×1011分子
のオリゴヌクレオチド66.1、66.2、66.3、66.4（それぞ
れ配列番号101−104）、および１μＭの２′−デオキシ
グアノシン５′−三燐酸を用いたことを除いては、実施
例３に記載したものと同じ緩衝液中で行った。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイによりLCR増幅生
成物を検出した。
実施例27 ダブルギャップLCR（DG2,2）は、85℃で30秒のインキ
ュベーションおよび54℃で60秒のインキュベーションか
ら成るサイクルを35回実施した。反応には、指示した細
胞由来のゲノムDNAを二重に提供した。すべてのNeisser
ia DNAは、320ngのヒト胎盤DNAの存在下でテストし
た。用いたオリゴヌクレオチド（上記表IX参照）は、Ne
isseria gonorrhoeae opa遺伝子内の地図上の位置114
−165に特異的である。反応は、それぞれ５×1011分子
のオリゴヌクレオチド114.1、114.2、114.3、114.4（そ
れぞれ配列番号105−108）、および１μＭの２′−デオ
キシグアノシン５′−三燐酸を用いたことを除いては、
実施例３に記載したものと同じ緩衝液中で行った。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイによりLCR増幅生
成物を検出した。
実施例28 ダブルギャップLCR（DG2,2）は、85℃で30秒のインキ
ュベーションおよび50℃で60秒のインキュベーションか
ら成るサイクルを35回実施した。反応には、指示した細
胞由来のゲノムDNAを二重に提供した。すべてのNeisser
ia DNAは、320ngのヒト胎盤DNAの存在下でテストし
た。用いたオリゴヌクレオチド（上記表IX参照）は、Ne
isseria gonorrhoeae pilin遺伝子内の地図上の位置8
22−873に特異的である。反応は、それぞれ５×1011分
子のオリゴヌクレオチド822.1、822.2、822.3、822.4
（それぞれ配列番号109−112）、および１μＭの２′−
デオキシシチジン５′−三燐酸を用いたことを除いて
は、実施例３に記載したものと同じ緩衝液中で行った。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイによりLCR増幅生
成物を検出した。
実施例29 ダブルギャップLCR（DG2,2）は、前述の実施例と同様
にサイクルを30−50回実施した。用いたオリゴヌクレオ
チド（上記表IX参照）は、Neisseria gonorrhoeae pi
lin遺伝子内の地図上の位置933−973に特異的である。
反応は、それぞれ５×1011分子のオリゴヌクレオチド93
3.1、933.2、933.3、933.4（それぞれ配列番号113−11
6）、および１μＭの２′−デオキシグアノシン５′−
三燐酸を用いたことを除いては、実施例３に記載したも
のと同じ緩衝液中で行った。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイによりLCR増幅生
成物を検出した。
実施例30および31は、“ライム（Lyme）”の疾病の原
因物質であるBorrelia burgdorferiの検出に関する。
用いた配列、Rosa,P.A.およびT.G.Schwan,J.infect.Di
s.160:1018−1029（1989年）による地図上の位置およ
び、配列番号を下記表Ｘに示す。
実施例30 ダブルギャップLCR（DG2,2）は、85℃で25秒のインキ
ュベーションおよび50℃で70秒のインキュベーションか
ら成るサイクルを45回実施した。反応には、０または10
2標的DNA分子のいずれかを二重に提供した。標的DNA
は、pUC18中にクローン化された任意のBorrelia burgd
orferiゲノム配列である。陰性反応は、10ナノグラムの
仔牛胸腺DNAを含有した。陽性反応は、10ナノグラムの
仔牛胸腺DNA中に102のBorrelia標的DNA分子を含有し
た。用いたオリゴヌクレオチドを表Ｘにリストアップす
る。これらのオリゴヌクレオチドは、クローン化された
BorreliaゲノムDNAの地図上の位置５−53に特異的であ
る。反応は、それぞれ３×1012分子のオリゴヌクレオチ
ド5.1、および5.3（それぞれ配列番号117および119）、
それぞれ２×1012分子のオリゴヌクレオチド5.2、5.4
（それぞれ配列番号118および120）、1032単位のThermu
s thermophilus DNAリガーゼならびに１μＭの２′−
デオキシチミジン５′−三燐酸を用いたことを除いて
は、実施例１に記載したものと同じ緩衝液中で行った。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイによりLCR増幅生
成物を検出した。
標的分子の数 割合 0 6.0 102 152.0 実施例31 ダブルギャップLCR（DG1,1）は、85℃で65秒のインキ
ュベーションおよび50℃で60秒のインキュベーションか
ら成るサイクルを45回実施した。反応には、０または10
2標的分子のいずれかを二重に提供した。陰性反応は、1
0ナノグラムのサケ精子DNAを含有した。陽性反応は、10
ナノグラムのサケ精子DNA中に102のBorrelia標的DNA分
子を含有した。用いたオリゴヌクレオチドを表Ｘにリス
トアップする。これらのオリゴヌクレオチドは、クロー
ン化されたBorreliaゲノムDNAの地図上の位置181−228
に特異的である。反応は、それぞれ１×1012分子のオリ
ゴヌクレオチド181.1、181.2、181.3、181.4（それぞれ
配列番号121−124）、500単位のThermus thermophilus
DNAリガーゼ、1.6単位のThermus DNAポリメラーゼ（MB
R）および１μＭの２′−デオキシシチジン５′−三燐
酸を用いたことを除いては、実施例１に記載したものと
同じ緩衝液中で行った。
増幅させた後、反応液をIMx希釈用緩衝液で1:1に希釈
し、アボットIMx自動イムノアッセイシステムを用いて
実施したサンドイッチイムノアッセイによりLCR増幅生
成物を検出した。
標的分子の数 割合 0 5.0 102 319.0 上記実施例は、本発明を具体的に説明するために供す
るものであり、本発明は、これによりいかようにも制限
されるものではなく、本発明の全範囲は、添付の請求の
範囲により明白にされる。
フロントページの続き (72)発明者 デイリー，ブルース・エル アメリカ合衆国、イリノイ・60002、ア ンテイオツク、ノース・ネベリヤー・ド ライブ・40841 (72)発明者 フウ，シヤン−ユン アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リ バテイビル、セダー・グレン・ドライ ブ・1763 (72)発明者 クラトツクビル，ジオン・デイビツド アメリカ合衆国、ウイスコンシン・ 53143、ケノーシヤ、フイフス・アベニ ユー・7101 (72)発明者 ラツフラー，トーマス・ジー アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リ バテイビル、パインハースト・コート・ 1964 (72)発明者 マーシヤル，ロナルド・エル アメリカ合衆国、イリノイ・60099、ズ イオン、ウインスロツプ・コート・900 (72)発明者 リネハード，ローリー・エイ アメリカ合衆国、ウイスコンシン・ 53142、ケノーシヤ、シツクステイフイ フス・アベニユー・8104 (72)発明者 ソロモン，ナタリー・エイ アメリカ合衆国、イリノイ・60089、バ ツフアロー・グローブ、ソーンデイル・ ドライブ・467 審査官 本間 夏子 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/09 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】サンプル中の標的核酸配列の存在を検出す
    る方法であって、該方法は、リガーゼ連鎖反応法を用い
    て、該標的配列の存在下、改造したプローブ分子の数の
    幾何学的増加を創出し、該方法が、 ａ）核酸を含有すると思われるサンプルを提供するこ
    と、但し、該核酸は下記一般式で表される標的配列を有
    する： ５′−（Ｎ）hXEp.FqZ（Ｎ）ｋ−３′ （ここで、Ｅは、任意の塩基を表し、Ｆは、Ｅ以外の任
    意の塩基を表し、ｐおよびｑは、独立に１から10までの
    整数であり、Ｘは、ＥまたはＦ′以外の任意の塩基を表
    し、Ｚは、ＦまたはＥ′以外の任意の塩基を表し、Ｎ
    は、任意の塩基を表し、ｈおよびｋは、独立に５から10
    0までの整数であり、但し（ｐ＋ｈ）および（ｑ＋ｋ）
    それぞれの和は10以上であり、（Ｎ）ｈおよび（Ｎ）ｋ
    は、検出しようとする標的に特徴的である配列を表
    す）； ｂ）下記一般式を有するそれぞれ四種類のプローブの複
    数を提供すること： Ａ :5′−（Ｎ）h +XEp−３′ Ａ′:3′−（Ｎ′）h +X′−５′ Ｂ :5′−Ｚ（Ｎ）k +−３′ Ｂ′:3′−Ｆ′qZ′（Ｎ′）k +−５′ （ここで、記号は、h+およびk+がそれぞれｈおよびｋか
    ら25％以下の範囲内で変化する整数であり、Ｅ′、
    Ｆ′、Ｘ′、Ｚ′およびはＮ′はそれぞれＥ、Ｆ、Ｘ、
    ＺおよびＮに相補的な塩基または配列であることを除い
    ては上記と同じ意味を有し、少なくとも一つのプローブ
    が検出の可能な部分で標識されている）；また、Ｅ′お
    よびＦのデオキシリボヌクレオチド三燐酸、ポリメラー
    ゼ試薬ならびにリガーゼ試薬を提供すること； ｃ）下記のサイクルを少なくとも１回実施すること： ｉ）ハイブリダイゼーション条件下で該プローブと該サ
    ンプルとを混合し、このプローブと、標的配列および存
    在するとしたらその相補体とをまたは、それらから創出
    した改造プローブとをハイブリダイゼーションさせる； ii）標的配列または、それを鋳型として創出した改造プ
    ローブを用い、該ポリメラーゼ試薬を用いてその３′末
    端にＦデオキシリボヌクレオチド三燐酸を付加すること
    によりプローブＡを伸長させ、該ポリメラーゼ試薬を用
    いてその３′末端にＥ′デオキシリボヌクレオチド三燐
    酸を付加することによりプローブＢ′を伸長させる； iii）該リガーゼ試薬を用いて、プローブＢに伸長した
    プローブＡを連結し、プローブＡ′に伸長したプローブ
    Ｂ′を連結して改造プローブ分子を形成させる； iv）変性条件を提供して、該改造プローブ分子を該鋳型
    から分離する； ｄ）改造したプローブ分子と未改造の標識したプローブ
    とを分けること；および ｅ）標的配列存在の尺度として、改造したプローブまた
    は画分中の該標識の存在を検出すること を含むことを特徴とする前記方法。
  2. 【請求項２】ＦがＥ′であり、これによって工程ｂ）
    が、Ｅ′のみのデオキシリボヌクレオチド三燐酸の添加
    を必要とする、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】ｐおよびｑは、独立に１から３までの整数
    である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 【請求項４】プローブＡの５′末端およびプローブＡ′
    の３′末端が、第一ハプテンで標識されている、請求項
    １に記載の方法。
  5. 【請求項５】分離工程（工程ｄ）が、該第一ハプテンお
    よびその関連プローブを固相上に捕獲することを含む、
    請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】工程ｃ）のサイクルを約20回から約60回繰
    り返す、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】サンプル中の標的核酸配列検出用診断キッ
    トであって、該核酸は、下記一般式： ５′−（Ｎ）hXEp.FqZ（Ｎ）ｋ−３′ （ここで、ＥおよびＦは、独立に任意の塩基を表し、ｐ
    およびｑは、独立に１から約10までの整数であり、Ｘ
    は、ＥまたはＦ′以外の任意の塩基を表し、Ｚは、Ｆま
    たはＥ′以外の任意の塩基を表し、Ｎは、任意の塩基を
    表し、ｈおよびｋは、独立に５から100までの整数であ
    り、但し（ｐ＋ｈ）および（ｑ＋ｋ）それぞれの和は10
    以上であり、（Ｎ）ｈおよび（Ｎ）ｋは、検出しようと
    する標的に特徴的である配列を表す）からなる標的配列
    を有し、ならびに、該キットは、 （ａ）下記一般式を有する四種類のプローブ： Ａ :5′−（Ｎ）h +XEp−３′ Ａ′:3′−（Ｎ′）h +X′−５′ Ｂ :5′−Ｚ（Ｎ）k +−３′ Ｂ′:3′−Ｆ′qZ′（Ｎ′）k +−５′ （ここで、記号は、h+およびk+がそれぞれｈおよびｋか
    ら25％以下の範囲内で変化する整数であり、Ｅ′、
    Ｆ′、Ｘ′、Ｚ′およびＮ′はそれぞれＥ、Ｆ、Ｘ、Ｚ
    およびＮに相補的な塩基または配列であることを除いて
    は上記と同じ意味を有し、少なくとも一つのプローブが
    検出の可能な部分で標識されている）； （ｂ）ポリメラーゼ試薬を用いてその３′末端にＦデオ
    キシリボヌクレオチド三燐酸を付加することにより標的
    に依存する方法でプローブＡを伸長させ、かつ該ポリメ
    ラーゼ試薬を用いてその３′末端にＥ′デオキシリボヌ
    クレオチド三燐酸を付加することにより標的に依存する
    方法でプローブＢ′を伸長させ、それにより標的とハイ
    ブリダイゼーションした場合第一プローブを相互に連結
    可能にし、任意に、標的とハイブリダイゼーションした
    場合第二プローブを相互に連結可能にすることができる
    前記ポリメラーゼ試薬； （ｃ）Ｅ′およびＦのデオキシリボヌクレオチド三燐
    酸；ならびに、 （ｄ）改造プローブ分子を形成させるために、プローブ
    Ｂに伸長したプローブＡを、プローブＡ′に伸長したプ
    ローブＢ′を連結させるリガーゼ試薬 の組み合わせから成ることを特徴とする前記診断キッ
    ト。
  8. 【請求項８】未改造の標識プローブから改造したプロー
    ブ分子を分離する手段をも含む、請求項７に記載のキッ
    ト。
  9. 【請求項９】HIV1のDNA検出に有用な物質の組成物であ
    って、該組成物が４種類のDNAプローブの混合物を含
    み、該プローブが、表IVに記載され且つ配列番号１、
    ２、３および4;5、６、７および8;9、10、11および12;1
    3、14、15および16;17、18、19および20;21、22、23お
    よび24;25、26、27および28;29、30、31および32;33、3
    4、35および36;37、38、39および40;41、42、43および4
    4;または45、46、47および48により識別されるプローブ
    セットから選ばれることを特徴とする前記組成物。
  10. 【請求項１０】HIV2のDNA検出に有用な物質の組成物で
    あって、該組成物が４種類のDNAプローブの混合物を含
    み、該プローブが、表Ｖに記載され且つ配列番号49、5
    0、51および52;53、54、55および56;または57、58、59
    および60により識別されるプローブセットから選ばれる
    ことを特徴とする前記組成物。
  11. 【請求項１１】HPVのDNA検出に有用な物質の組成物であ
    って、該組成物が４種類のDNAプローブの混合物を含
    み、該プローブが、表VIに記載され且つ配列番号61、6
    2、63および64;65、66、67および68;69、70、71および7
    2;または73、74、75および76により識別されるプローブ
    セットから選ばれることを特徴とする前記組成物。
  12. 【請求項１２】HSVのDNA検出に有用な物質の組成物であ
    って、該組成物が４種類のDNAプローブの混合物を含
    み、該プローブが、表VIIに記載され且つ配列番号77、7
    8、79および80;または81、82、83および84により識別さ
    れるプローブセットから選ばれることを特徴とする前記
    組成物。
  13. 【請求項１３】Chlamydia trachomatisのDNA検出に有
    用な物質の組成物であって、該組成物が４種類のDNAプ
    ローブの混合物を含み、該プローブが、表VIIIに記載さ
    れ且つ配列番号85、86、87および88;89、90、91および9
    2;または93、94、95および96により識別されるプローブ
    セットから選ばれることを特徴とする前記組成物。
  14. 【請求項１４】Neisseria gonorrhoeaeのDNA検出に有
    用な物質の組成物であって、該組成物が４種類のDNAプ
    ローブの混合物を含み、該プローブが、表IXに記載され
    且つ配列番号97、98、99および100;101、102、103およ
    び104;105、106、107および108;109、110、111および11
    2;または113、114、115および116により識別されるプロ
    ーブセットから選ばれることを特徴とする前記組成物。
  15. 【請求項１５】Borrelia burgdorferiのDNA検出に有用
    な物質の組成物であって、該組成物が４種類のDNAプロ
    ーブの混合物を含み、該プローブが、表Ｘに記載され且
    つ配列番号117、118、119および120;または121、122、1
    23および124により識別されるプローブセットから選ば
    れることを特徴とする前記組成物。
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