ES2350112T3 - Detección de neisseria gonorrhoeae utilizando la región 5' no traducida del gen opa. - Google Patents

Abstract

Oligonucleotido especifico de Neisseria gonorrhoeae, que comprende una secuencia de nucleotidos que comprende la secuencia 5'-TTTGAACC-3', o su complemento, capaz de hibridizar con la region 5' no traducida de un gen opa de NG o su complemento, en el que dicho oligonucleotido es de 12-40 nucleotidos, preferentemente de 14-30, mas preferentemente de 16- 25, lo mas preferente de 18-22 nucleotidos de longitud, con la condicion de que dicha secuencia no es 5'-tcagtgatggttcaaagttc-3'.

Description

La presente invención se refiere a microbiología y a diagnósticos moleculares. Más específicamente, la presente invención se refiere a la detección específica y sensible de Neisseria gonorrhoeae (NG) en muestras clínicas.

Neisseria

gonorrhoeae es la segunda infección

bacteriana

más predominante transmitida sexualmente después de

Chlamydia

trachomatis. Una proporción significativa de las

infecciones, especialmente en las mujeres, son asintomáticas. Si permanecen sin descubrir, pueden resultar en una propagación a las parejas sexuales y en consecuencias a largo plazo tales como enfermedad inflamatoria pélvica, dolor pélvico crónico, embarazo ectópico, conjuntivitis neonatal e infertilidad (12). Por lo tanto, el diagnóstico exacto de infecciones sintomáticas y asintomáticas es crítico.

Se han desarrollado diferentes técnicas para detectar las infecciones genitales causadas por NG. El “estándar dorado” actual para el diagnóstico de la infección es cultivar en medio selectivo. Sin embargo, incluso bajo condiciones de laboratorio óptimas, la sensibilidad de los cultivos de gonococos está en el intervalo a partir de 85 hasta el 95% para la infección aguda (23) y cae aproximadamente un 50% para las hembras con infecciones crónicas (2) debido a una mala colección, transporte y almacenamiento de la muestra. Los métodos biológicos moleculares conocidos para la detección de NG incluyen técnicas basadas en la amplificación de ácidos nucleicos, que incluyen la reacción en cadena de la ligasa (LCR), el ensayo de amplificación del desplazamiento de la hebra y PCR (1, 9, 14, 17, 19, 24, 28). Aunque estos métodos han mostrado alta sensibilidad y especificidad, cada uno de estos ensayos tiene limitaciones que incluyen sensibilidades variables a los inhibidores; reactividad cruzada con otros microorganismos, rendimiento limitado, altos costes y equipamiento dedicado. Por ejemplo, el ensayo Cobas Amplicor para NG (Cobas Amplicor CT/NG; Roche Molecular Systems, Branchburg, New Jersey) produce resultados falsos positivos con determinadas cepas de N. subflava, N. cinerea y Lactobacillus, y es necesario un ensayo posterior de confirmación (11, 13, 22, 29). Los ensayos basados en los genes CppB y ARNr 16S se utilizan para la confirmación, sin embargo, de un 5 a 6% de cepas de NG no portan el plásmido CppB

(6), y no todos los ensayos basados en ARNr 16S son suficientemente sensibles y específicos(11, 30).

El ensayo de NG LCx® (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois) utiliza el método de amplificación del ácido nucleico LCR para detectar la presencia de ADN de NG directamente en muestras clínicas. Las cuatro sondas de oligonucleótidos en el ensayo LCx reconocen y se hibridan a una secuencia diana específica dentro de los genes Opa del ADN de NG (véase la Patente de EEUU Número 5.427.930). Los oligonucleótidos se diseñan para ser complementarios a la secuencia diana de manera que en presencia de la diana de NG, las sondas se unirán adyacentes una de la otra. A continuación, éstas pueden unirse de forma enzimática para formar el producto de amplificación que sirve posteriormente como secuencia diana adicional durante otras rondas de amplificación. El producto de la reacción de LCR se detecta en el analizador Abbott LCx.

Todas las cepas de meningococos y gonococos expresan las proteínas de opacidad (opa), denominadas así debido a su contribución a la opacidad de la colonia durante el crecimiento de las bacterias en placas de agar (26). Éstas son familia de las proteínas de membrana externa integrales básicas de aproximadamente 27 kDa. Se han identificado de once a trece genes opa individuales en NG, mientras que N. meningitides tienen menos (tres o cuatro) genes opa. Las proteínas similares a opa se expresan en diversos comensales de Neisseriaceae también (27). Los genes opa en NG están contenidos en lugares separados (opaA hasta -k) (4) y están sometidos a la variación de fase “on/off”. Cambios en la secuencia repetitiva dentro de los diferentes lugares de opa resulta en esta expresión variable en una sola bacteria (25). La expresión de opa se ha encontrado que promueve la adherencia de los gonococos a las células epiteliales, la entrada en las células epiteliales mediante la unión a los proteoglicanos de la superficie celular (3, 8, 16, 31, 32) e interacciones de los gonococos con los leucocitos polimorfonucleares (15). Además, la expresión de opa mejora la resistencia contra la destrucción mediada por el complemento (5).

Debido a que los genes opa son genes multicopia que se hospedan en regiones conservadas y codifican proteínas con funciones fisiológicas, los presentes inventores los han considerado como secuencias dianas adecuadas para un ensayo de amplificación PCR en tiempo real y se propusieron desarrollar un

ensayo basado en PCR específico y sensible para la detección de NG. Las secuencias que cubren una región conservada dentro de la región sin traducir 5' de los genes opa se obtuvieron de las bases de datos de NCBI. Sobre la base de la homología, se recuperaron secuencias de NG, N. meningitides y N. flava y se alinearon en la figura 1. Se diseñaron cebadores y una sonda de unión al surco menor (MGB) opa-1 (tabla 1) y se adaptaron a los estándares TaqMan utilizando el programa Primer Express (Applied Biosystems). El cebador de PCR directo utilizado en la presente invención (véase la tabla 1) se superpone parcialmente con la sonda de LCR 66.1 descrita en la patente de EEUU número 5.427.930. La sonda de oligonucleótidos opa-1 según la presente invención se superpone con los cinco nucleótidos en el extremo 3’ de la sonda LCR 66.3 de US

5.427.930. Para optimizar el ensayo de PCR de NG basado en opa, se ensayó un panel de 448 cepas clínicas de NG (véase Materiales y Métodos). De estas 448 cepas, 424 generaron una señal fluorescente positiva en el PCR TaqMan que emplea la sonda opa-1 y 24 no generaron señal. Sin embargo, al analizar los productos de PCR de estas 24 cepas “aberrantes” de NG en gel de agarosa, las 24 mostraron abundantes productos de PCR del tamaño esperado. Al parecer, los productos de PCR amplificados (amplicones) de las cepas “aberrantes” no fueron detectados por la sonda opa-1. De forma sorprendente, el análisis de secuencia de los amplicones que fueron generados por el conjunto de cebadores pero que no fueron detectados por la sonda opa-1 reveló exactamente la misma secuencia para las 24 cepas aberrantes de NG (indicadas en la figura 1). Esta secuencia está caracterizada por la presencia de una secuencia de nucleótidos 5'-TTTGAACC-3', que no está presente en ninguna de las regiones 5' sin traducir de los genes opa conocidos obtenidos de la base de datos NCBI, basadas en las qué se diseñó la sonda opa-1. La secuencia de las cepas aberrantes muestra dos desajustes y una inserción comparadas con la secuencia de la sonda opa-1, que es al parecer suficiente para evitar que la sonda se hibride a la secuencia diana amplificada, es decir, la región del nucleótido en la posición 58 a la posición 40 localizada 5’ del codón de iniciación de un gen que codifica una proteína de la opacidad de NG.

Por lo tanto, se diseñó una sonda nueva (opa-2) para detectar la secuencia amplificada de estas cepas aberrantes de NG. Se proporcionó un oligonucleótido específico de NG, que comprende

una secuencia de nucleótidos 5'-TTTGAACC-3', o su complemento, capaz de hibridizar a la región 5' sin traducir de un gen opa de NG que abarca los nucleótidos 57 a 50 localizados 5' del codón de iniciación de opa de NG (designado más adelante como secuencia diana) o su complemento. Esto significa que un nucleótido dentro del tramo de ocho nucleótidos puede ser sustituido por otro nucleótido, a condición de que el oligonucleótido pueda todavía reconocer y unirse a su secuencia diana. Preferentemente, la sustitución no implica la sustitución de los residuos T en el extremo 5', el residuo C o el residuo G en el extremo 3', ya que estos residuos representan los desajustes con la sonda opa-1 y son los posibles responsables del reconocimiento de las cepas aberrantes de NG.

Una secuencia complementaria 5'-tcagtgatggttcaaagttc-3’ se conoce de la Patente de EEUU número 6.617.162. En este documento se utilizó como cebador que tenía como diana el ARN alfa receptor de estrógeno humano. De esta manera, puede que sea visto como anticipación accidental de la presente invención.

El término “oligonucleótido” se refiere a una secuencia corta de monómeros de nucleótidos unidos (por ejemplo, fosfodiéster, alquílico y aril-fosfato, fosforotioato), o por enlaces no fosforoso (por ejemplo, peptídico, sulfamato y otros). Un oligonucleótido puede contener los nucleótidos modificados que tienen bases modificadas (por ejemplo, 5-metil citosina) y grupos azúcares modificados (por ejemplo, 2'-O-metil ribosil, 2'-Ometoxietil ribosil, 2'-amino ribosil y similares). La longitud del oligonucleótido puede variar. En general, la posibilidad de que se forme un híbrido entre un oligonucleótido y una secuencia de ácido nucleico diana complementaria se incrementa con el aumento de la longitud del oligonucleótido. Por otra parte, la especificidad de la formación de híbridos disminuye con el aumento de la longitud del oligonucleótido. Un oligonucleótido de la presente invención es preferentemente de 14 a 40 nucleótidos de longitud, más preferentemente de 16 a 30 nucleótidos, lo más preferente de 18 a 22 nucleótidos. La secuencia caracterizadora 5'-TTTGAACC-3’

preferentemente está flanqueada por ambos

extremos 5' y 3' por,

como

mínimo, un nucleótido complementario a la secuencia 5' sin

traducir de un gen opa de NG.

Un oligonucleótido preferente según la presente invención es 5'-CTTTGAACCATCAGTGAAA-3’ o su complemento. Tal como

se ilustra en los ejemplos, este oligonucleótido se utiliza de forma ventajosa como sonda de detección para detectar cepas aberrantes de NG en un ensayo PCR en tiempo real.

Cuando la especificidad de la sonda opa-2 fue investigada mediante el ensayo de un panel de microorganismos no NG, incluyendo ADN de otras 12 Neisseriaceae diferentes, no se detectó señal positiva al usar las sondas opa-1 y opa-2 (véase el punto 2.3 en el ejemplo más adelante). Los ensayos de sensibilidad (véase el punto 2.4 en el ejemplo más adelante) revelaron que el ADN de NG se podía medir de forma lineal en un intervalo de 8 escalas logarítmicas (véase la figura 2). Un femtogramo de ADN de NG era detectable en la mayoría de las muestras ensayadas. De esta manera, la presente invención da a conocer una sonda de oligonucleótidos para la detección específica y sensible de cepas de NG, que permanecen indetectables con una sonda de PCR basada en la secuencia de opa de cepas conocidas de NG. Las cepas aberrantes de NG detectadas por una sonda de nucleótidos de la presente invención se pueden detectar usando el ensayo ARNr 16S o el ensayo CppB. Sin embargo, tal como se ha mencionado anteriormente, estos ensayos generalmente no son suficientemente sensibles y específicos para la aplicación clínica.

Una sonda de oligonucleótidos según la presente invención se puede marcar con cualquier marcador conocido en la técnica de la química de ácidos nucleicos. En una realización, un oligonucleótido de la presente invención comprende uno o más marcadores detectables. Los marcadores detectables o etiquetas adecuados para el uso con las sondas de ácido nucleico son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen, sin constituir limitación, isótopos radiactivos, cromóforos, fluoróforos, agentes quimioluminiscentes y electroquimioluminiscentes, marcadores magnéticos, marcadores inmunológicos, ligandos y marcadores enzimáticos. Preferentemente, un oligonucleótido comprende un marcador cromóforo o fluorescente, ya que generalmente éstos se pueden detectar fácilmente con alta sensibilidad y especificidad. Ejemplos de marcadores fluorescentes son fluoresceínas, rodaminas, cianinas, ficoeritrinas y otros fluoróforos conocidos por los expertos en la materia, incluyendo 6-FAM, HEX, JOE, TET, ROX, TAMRA, fluoresceína, Cy3, Cy5, Cy5.5, rojo de Texas, rodamina, verde de rodamina, rojo de rodamina, 6-carboxirodamina 6G, verde de

Oregón

488, verde de Oregón 500, verde de Oregón 514 y 6

carboxirodamina 6G.

En

una realización de la presente invención, un

oligonucleótido específico de NG comprende un marcador fluorescente (fluoróforo) y/o agente de extinción de la fluorescencia. En una realización preferente, un oligonucleótido de la presente invención comprende un fluoróforo y un agente de extinción. Un oligonucleótido que comprende dicho par fluoróforo/extintor es convenientemente utilizado como sonda de TaqmanTM en un ensayo PCR en tiempo real (véase también más adelante). Los agentes de extinción son aquellas sustancias capaces de absorber energía emitidas por un fluoróforo para reducir la cantidad de fluorescencia emitida (es decir, extinción de la emisión del marcador fluorescente). Diferentes fluoróforos son extinguidos por diferentes agentes de extinción. Generalmente, las propiedades espectrales de un par agente fluoróforo/extintor son tales que una

o más longitudes de onda de absorción del extintor se superpone con una o más de las longitudes de onda de emisión del fluoróforo. Ejemplos de agentes de extinción son TAMRA, DABCYL, BHQ-1 y BHQ-2.

Un par fluoróforo/extintor preferente es fluoresceína/tetrametilrodamina; pares adicionales de fluoróforo/extintor se pueden seleccionar por los expertos en la materia por la comparación de las longitudes de onda de emisión y de excitación según las propiedades mencionadas anteriormente.

Los métodos para el marcado de la sonda son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen, por ejemplo, métodos químicos y enzimáticos. Los métodos para la incorporación de grupos químicos reactivos en los oligonucleótidos, en sitios específicos, son bien conocidos por los expertos en la materia. Los oligonucleótidos que contienen un grupo químico reactivo, situado en un sitio específico, se pueden combinar con un marcador unido a un grupo reactivo complementario (por ejemplo, un oligonucleótido que contiene un grupo reactivo nucleofílico se puede hacer reaccionar con un marcador unido a un grupo reactivo electrófilo) para unir un marcador a una sonda por técnicas químicas. Ejemplos de marcadores y métodos para la unión de un marcador a un oligonucleótido se describen, por ejemplo, en la patente de EEUU número 5.210.915; Kessler (ed.), Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules, Springer-Verlag, Berlín, 1992; Kricka (ed.) Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academia Press, San Diego,

1992; y Howard (ed.) en Methods in Nonradioactive Detection, Appleton & Lange, Norwalk, 1993. El marcado químico no específico de un oligonucleótido se puede lograr combinando el oligonucleótido con un producto químico que reacciona, por ejemplo, con un grupo funcional concreto de una base de nucleótidos, y simultáneamente o posteriormente hacer reaccionar el oligonucleótido con un marcador. Véase, por ejemplo, Draper y otros (1980) Biochemistry 19:17741781. La incorporación enzimática del marcador en un oligonucleótido se puede lograr llevando a cabo la modificación o polimerización enzimática de un oligonucleótido usando precursores marcados, o por adición enzimática del marcador a un oligonucleótido que ya existe. Véase, por ejemplo, la patente de EEUU número 5.449.767. Los ejemplos de modificar las enzimas incluyen, sin constituir limitación, las polimerasas de ADN, las transcriptasas inverso, las polimerasas de ARN, etc. Ejemplos de enzimas que son capaces de añadir el marcador a un oligonucleótido que ya existe incluyen, sin constituir limitación, quinasas, transferasas terminales, ligasas, glicosilasas, etc.

Para utilizar en un ensayo de amplificación que implique temperaturas elevadas, tales como PCR, u otros procedimientos que utilizan enzimas termoestables, el marcador será estable a temperaturas elevadas. Para los ensayos que implican polimerización, el marcador será tal que no interfiere con la actividad de la enzima polimerizadora. El marcador puede estar presente en el extremo 5' y/o 3' del oligonucleótido, y/o puede también estar presente internamente. El marcador se puede unir a cualquiera de las fracciones de las bases, azúcar o fosfato del oligonucleótido, o a cualquier grupo de unión que se una por sí mismo a una de estas fracciones.

En otra realización preferente, una sonda de oligonucleótido según la presente invención es un conjugado unión al surco menor (MGB) -oligonucleótido. Las sondas de unión al surco menor forman dúplex estables con dianas de ADN de cadena única, permitiendo así que sean utilizadas sondas cortas que tienen un poder discriminatorio mayor en ensayos basados en la hibridación. Preferentemente, la fracción MGB se seleccionan del grupo que comprende un trímero de 1,2-dihydro-(3H)pirrolo[3,2-e] indol-7-carboxilato (CDPI3) y un pentámero de N-metilpirrolo-4carboxi-2-amide (MPC5).

En otra realización, se sustituye una guanosina en un oligonucleótido específico de NG de la presente invención por una inosina. Se ha descubierto que la sustitución de inosina por guanosina en un conjugado MGB-oligonucleótido puede mejorar la estabilidad híbrida. Sin desear estar unido a ninguna teoría particular, es probable que la sustitución de la inosina hace la forma local del surco menor más favorable para la interacción con un MGB, aumentando de esta manera la fortaleza de la interacción MGB-surco menor.

En otro aspecto, la presente invención da a conocer un método para detectar una cepa de NG que comprende el uso de un oligonucleótido según la presente invención. En una realización preferente, un método de detección tal como se da a conocer en el presente documento implica la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), comprendiendo dicho método a) proporcionar el ADN de una cepa de NG o de una muestra de ensayo que se sospecha que contiene ADN de dicha cepa de NG; b) amplificar la región 5' sin traducir de un gen opa que abarcaba los nucleótidos 57 a 50 localizados 5' del codón de iniciación de opa usando un par de cebadores de amplificación del ácido nucleico; y c) detectar la presencia de producto de amplificación como indicación de la presencia de NG. Un oligonucleótido según la presente invención se puede utilizar como cebador en dicho ensayo de PCR. El término “cebador” tal como se utiliza en el presente documento se refiere a un oligonucleótido que es capaz de recocer la diana de amplificación que permite que una polimerasa del ADN se una de tal modo que sirve como punto de iniciación de la síntesis de ADN cuando se pone en condiciones en las cuales se induce la síntesis del producto de extensión del cebador que es complementario a una cadena de ácido nucleico, es decir, en presencia de nucleótidos y de un agente para la polimerización, tal como polimerasa del ADN y a una temperatura y pH adecuados. El cebador (de la amplificación) es preferentemente de cadena única para una eficiencia máxima de la amplificación. Preferentemente, el cebador es un oligodeoxinucleótido [el cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de productos de extensión en presencia del agente para la polimerización].

La detección del producto de amplificación en principio se puede conseguir mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. El producto puede ser teñido directamente o marcado con

marcadores radioactivos, anticuerpos, colorantes luminiscentes, colorantes fluorescentes, o reactivos enzimáticos. Los teñidos directos de ADN incluyen por ejemplo colorantes intercaladotes tales como naranja de acridina, verde SYBR, bromuro de etidio, monoazida de etidio o colorantes de Hoechst. De forma alternativa, los fragmentos de ADN se pueden detectar por la incorporación de bases de dNTP marcadas en los fragmentos de ADN sintetizados. Los marcadores (fluorescentes) de detección que pueden ser asociados a las bases de nucleótidos incluyen, por ejemplo, fluoresceína, colorante de cianina o BrdUrd. Sin embargo, un método basado en PCR para detectar NG que utiliza un oligonucleótido de la presente invención implica preferiblemente la detección del producto amplificado obtenido por la reacción de amplificación del ADN descrita anteriormente mediante la hibridación del producto de reacción a una o más sondas de detección específicas, en el que se utiliza un oligonucleótido de la presente invención como sonda de detección. El término “sonda” se refiere a una secuencia de oligonucleótidos de cadena única que reconocerá y forma un dúplex de enlaces hidrógeno con una secuencia complementaria en una secuencia de ácido nucleico diana. Una sonda de oligonucleótidos de la presente invención se puede utilizar para detectar un producto de reacción de PCR que comprende los la región 5' sin traducir de un gen opa que abarcaba los nucleótidos 57 a 50 localizados 5' del codón de iniciación de opa. Preferentemente, los cebadores de la amplificación se diseñan de manera que flanquean la secuencia diana a ser detectada por la sonda (por ejemplo, la sonda opa-2). De uso particular en un método de detección de NG de la presente invención que utiliza una sonda de oligonucleótidos de la presente invención es el conjunto de cebadores que consiste en el cebador directo opa-Fw y el cebador inverso opa-Rv (véase la tabla 1). Este conjunto de cebadores da como resultado un producto de reacción de 76 nucleótidos, en el que el tramo de los nucleótidos 57 a 50 localizados 5' del codón de iniciación de opa es flanqueado por aproximadamente 40 nucleótidos en el extremo 5' y por aproximadamente 35 nucleótidos en el extremo 3'. El producto de reacción fue detectado con éxito por la sonda opa-2 de la presente invención. Preferentemente, un ensayo de amplificación de ácidos nucleicos que emplea un oligonucleótido de la presente invención (ya sea como cebador o como sonda) implica análisis de PCR cuantitativo en tiempo real (RQ). El RQ-PCR permite la

cuantificación exacta de los productos de PCR durante la fase exponencial del proceso de amplificación de PCR, que está en contraste total con la cuantificación en el punto final de PCR clásica. Debido a la detección en tiempo real de las señales fluorescentes durante y/o después de cada ciclo subsiguiente de PCR, los datos del PCR cuantitativo se pueden obtener en un período corto de tiempo y no se necesita el tratamiento de PCR posterior, de tal modo que se reduce de forma drástica el riesgo de contaminación del producto de PCR. Un ensayo de amplificación de ácidos nucleicos según la presente invención se puede llevar a cabo usando cualquier tipo de equipo de PCR en tiempo real, incluyendo los sistemas de detección ABI PRISM Sequence, LightCycler y LightCycler 2.0 Instruments de ROCHE DIAGNOSTICS, RapidCycler de Idaho Technology, LightCycler de Idaho Technology, Rotor-Gen, SmartCycler, iCycler y MyiQ Cycler, Mx4000 y Mx3000P, Opticon y Opticon 2, Techne Quantica System, ATC-901, InSyte Thermal Cycler, Notebookthermal cycler. La tecnología de RQ-PCR usualmente utiliza instrumentos ABI Prism 7000, 7700, 7900HT, 7300 ó 7500 (Taqman®) para detectar la acumulación de los productos de PCR de forma continua durante el procedimiento de PCR que permite de esta manera la cuantificación fácil y exacta en la fase exponencial temprana del PCR. Algunos sistemas de detección de secuencias ABI Prism utilizan sistemas de fibra óptica, que se conectan a cada pocillo en un formato de bandeja de PCR de 96 pocillos. Una fuente de luz láser excita cada pocillo y una cámara CCD mide el espectro y la intensidad de la fluorescencia de cada pocillo para generar datos en tiempo real durante la amplificación de PCR. Otros sistemas de detección de secuencias ABI Prism, tal como ABI Prism 7000, utilizan una lámpara halógena de tungsteno como fuente de excitación, una lente de Fresnel y una cámara CCD para medir la fluorescencia. El programa ABI Prism examina la intensidad de la fluorescencia de los colorantes del reportero y del extintor y calcula el aumento en intensidad normalizada de la emisión del reportero durante el curso de la amplificación. Los resultados a continuación se grafican contra el tiempo, representados por el número de ciclos, para producir una medición continua de la amplificación del PCR. Para proporcionar la cuantificación precisa de la diana inicial en cada reacción de PCR, la representación gráfica de la amplificación se examina en un punto durante la fase logarítmica temprana de acumulación del producto. Esto se logra

asignando un umbral de fluorescencia sobre el fondo y determinando el punto de tiempo en el cual la representación gráfica de la amplificación de cada muestra alcanza el umbral (definido como el número de ciclos del umbral o CT).

En la actualidad se pueden distinguir tres tipos principales de técnicas de RQ-PCR; aquellas que emplean un colorante intercalador, aquellas que usan una sonda denominada de hidrólisis (por ejemplo, TaqMan) y aquellas que utilizan una sonda de hibridación (por ejemplo, LightCycler). En una realización, se utiliza una detección con un oligonucleótido según la presente invención como cebador en un ensayo de PCR usando el colorante intercalador Verde SYBR I. Este colorante se puede unir al surco menor de la cadena doble del ADN, que mejora grandemente su fluorescencia. Durante los ciclos consecutivos de PCR, la cantidad del producto de PCR de cadena doble aumentará de forma exponencial, y por lo tanto se puede unir más colorante Verde SYBR I y emitir su fluorescencia (a 520 nanómetros). Se debe observar que la detección basada en Verde SYBR I de productos de PCR no es específica de una secuencia y que, por lo tanto, serán detectados también productos de PCR amplificados de forma no específica y dímeros del cebador. Además de Verde SYBR I, también se pueden utilizar otros colorantes en sistemas de detección no específicos tales como Amplifluor.

En una realización preferente, un método de la presente invención comprende la detección y cuantificación de una cepa de NG, usando RQ-PCR con una sonda de hidrólisis según la presente invención. Este tipo de RQ-PCR explota la actividad de exonucleasa

5' → 3' de la polimerasa de Thermus aquaticus (Taq) para detectar y cuantificar los productos de PCR específicos mientras avanza la reacción. La sonda de la hidrólisis, también designada como sonda de TaqMan o sonda de oligonucleótidos de colorante doble, se conjuga con un fluorocromo reportero (R) (por ejemplo, FAM, VIC o JOE) así como un fluorocromo extintor (Q) (por ejemplo, TAMRA). El fluorocromo extintor absorbe la fluorescencia del fluorocromo reportero mientras la sonda está intacta. Sin embargo, tras la amplificación de la secuencia diana, es decir, la región 5’ sin traducir de un gen opa de NG, la sonda de hidrólisis es desplazada e hidrolizada posteriormente por la polimerasa de Taq. Esto trae como resultado la separación de los fluorocromos reportero y extintor y por lo tanto la fluorescencia del fluorocromo reportero se hace detectable. Durante cada ciclo consecutivo de PCR, esta

fluorescencia aumentará aún más debido a la acumulación progresiva y del exponencial de los fluorocromos reporteros libres.

En aún otra realización de la presente invención, un ensayo para detectar NG implica análisis de RQ-PCR usando sondas de hibridación. En un ensayo de este tipo, se utilizan dos sondas específicas con secuencias yuxtapuestas, una de las cuales es un oligonucleótido según la presente invención, en el que una sonda es marcada con un fluorocromo donador (por ejemplo, FAM) en el extremo 3’ y la otra sonda es marcada con un fluorocromo aceptor (por ejemplo, LC Red640, LC Red705) en su extremo 5’. Ambas sondas deben hibridizar a las secuencias dianas yuxtapuestas de forma cercana en el fragmento de ADN amplificado, llevando de esta manera a los dos fluorocromos a una estrecha proximidad (es decir, de 1-5 nucleótidos) de manera que la luz emitida por el donador excita al aceptor. Esto trae como resultado la emisión de fluorescencia, que posteriormente se puede detectar durante la fase de apareamiento y la primera parte de la fase de extensión de la reacción de PCR. Después de cada ciclo subsiguiente de PCR, se pueden aparear más sondas de hibridación recuece, dando por resultado señales de fluorescencia mayores.

Además de los tres tipos de enfoques de RQ-PCR mencionados anteriormente, se pueden utilizar también otros tipos de sondas de oligonucleótidos según la presente invención, incluyendo sondas de marcadores moleculares, Scorpions, ResonSense, Hy-Beacon y Light-up.

Tal como se ha mencionado, el conjunto de cebadores que consiste en el opa-Fw y opa-Rev conjuntamente con la sonda de detección opa-2 da como resultado la detección de cepas aberrantes de NG que no fueron detectadas con la sonda de detección opa-1. Cuando un panel de cepas no aberrantes de NG se ensayó con la sonda opa-2, es decir, aquellas cepas que resultaron positivas con la sonda opa-1, al parecer solamente una de 21 resultó positiva con la sonda opa-2 también. Este resultado indica la presencia de las secuencias opa-1 y opa-2 en esa cepa particular (datos no mostrados). De esta manera, para detectar tanto cepas no aberrantes y aberrantes de NG en un método de la presente invención, es preferente que sea utilizado un oligonucleótido de la presente invención conjuntamente con una sonda capaz de detectar los amplicones de PCR de las cepas no aberrantes de NG, tal como la

sonda opa-1. Los valores de ciclo del umbral (Ct) muestran una señal diez veces mayor con la sonda opa-1 que con la sonda opa-2.

Tal como se ilustra a continuación, la presente invención es utilizada de forma ventajosa para el diagnóstico de NG en una muestra, incluyendo muestras clínicas. Se conoce que la infección con NG aumenta el riesgo de infección con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Las estimaciones de la relación de probabilidades para el riesgo incrementado de infección con VIH debido a la infección previa con una enfermedad transmitida sexualmente (ETS) es de 3,5 a 9,0 para NG. La infección con NG puede también estar asociada con un riesgo incrementado de seroconversión de VIH. Las altas tasas de incidencia de ambas infecciones, unidas con la prevalencia en las que no son diagnosticadas y/o tratadas, aumentan la necesidad de un mayor tamizado de enfermedades transmitidas sexualmente (ETS). Con la provisión de los nuevos oligonucleótidos que reconocen cepas de NG que anteriormente pasaban desapercibidas, la presente invención ahora ofrece un ensayo sensible, específico, semicuantitativo y fiable para la detección de NG en muestras (clínicas) y/o para la confirmación de ensayos menos específicos de NG.

Para el tamizado y el diagnóstico eficaces, que podrían conducir a la prevención y control de NG, se le debe dar atención al tamizado de mujeres solteras de 15 a 21 años y a la detección en los pacientes sintomáticos que es poco probable que busquen diagnóstico y tratamiento.

También se da a conocer en el presente documento un kit

para

la detección de una cepa de NG, que comprende un par de

cebadores

de la amplificación de ácidos nucleicos capaces de

amplificar

una región que abarca los nucleótidos 57 a 50

localizados 5' del codón de iniciación de opa de NG y, como mínimo, una sonda de detección, en el que, como mínimo, un cebador o sonda de detección es un oligonucleótido según la presente invención. Tal como se ha mencionado anteriormente, el oligonucleótido se puede proporcionar con un marcador detectable y/o una fracción MGB. En una realización, un kit de la presente invención comprende un oligonucleótido cebador según la presente invención. En una realización preferente, un kit comprende una sonda de detección de oligonucleótidos según la presente invención, preferentemente la sonda opa-2. Más preferentemente, un estuche comprende una sonda de detección de oligonucleótidos según la presente invención y los

cebadores opa-Fw y opa-Rv. Preferentemente, un estuche de la presente invención comprende además la sonda de detección opa-1 y/o una polimerasa, preferentemente polimerasa de Taq. LEYENDAS DE LAS FIGURAS

Figura 1. Diseño de cebadores y de la sonda. Secuencia de las bases 92 a 16 de los genes opa 5' del codón de iniciación recuperados de la base de datos de NCBI. Los cuadrados grises claros indican la posición de los cebadores, los cuadrados grises oscuros indican la posición de la sonda (las secuencias como en la línea superior) Figura 2: (A) Perfiles de fluorescencia de diluciones seriadas con un factor de dilución de 10 por duplicado desde 100 fg hasta 10 µg/ml de ADN de NG obtenidos de la cepa 49226 de ATCC, analizada en el PCR en tiempo real basado en opa usando las sondas opa-1 y opa-2 y (B) curva patrón calculada a partir de los valores de Ct: y = -3,51* log(x) + 39,341; R2 = 0,995.

SECCIÓN EXPERIMENTAL

A efectos de ejemplificar más la presente invención, se muestra a continuación que un oligonucleótido según la presente invención es ventajosamente utilizado para la detección específica y sensible de NG en muestras clínicas.

1. Materiales y métodos

1.1 Panel de 448 cepas de NG. Desde septiembre de 2002 a abril de 2003 los pacientes con quejas indicativas de gonorrea visitaron la clínica de STI (Infecciones Transmitidas Sexualmente) en Ámsterdam, donde se registraron los datos clínicos y epidemiológicos y fueron tomadas las muestras. Se utilizaron muestras uretrales, cervicales, proctales o de la amígdala para inocular placas de agar GC-Lect (Beckton-Dickinson). El cultivo y la determinación de NG se llevaron a cabo en el Laboratorio de Salud Pública en Amsterdam tal como se ha descrito (6, 7). En el contexto de un estudio epidemiológico comunal, las cepas de NG fueron tipificadas por PCR-RFLP de los genes de opa y por que confirmaron posteriormente que las cepas verdaderas de NG se utilizaron para el aislamiento del ADN (18, 21).

1.2 Panel de 122 muestras clínicas positivas por Cobas amplicorTM . A partir de enero de 2003 hasta marzo de 2004 se analizaron un total de 3957 muestras clínicas de pacientes de la región que atiende el Hospital Gelre (Apeldoorn, Países Bajos) en el ensayo de Cobas amplicorTM para determinar la presencia de NG.

Fueron positivas 122 muestras (3,1%) para NG. Estas muestras, que consistieron en 36 de orina, 8 de uretra, 47 de cérvix, 29 de garganta y 2 anales (tabla 3A), se analizaron posteriormente en el ensayo ARNr 16S en tiempo real y en el ensayo opa.

1.3 Control de calidad para los diagnósticos moleculares del panel de NG de 2003. Para evaluar la prestación de las tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos para la detección de NG, se diseñó un panel por la parte del QCMD Working Party Sexually Transmitted Diseases (Chair Jurjen Schirm, Groningen, Países Bajos). El panel consistió en muestras de orina liofilizadas. Tal como se indicó por QCMD, se utilizaron 1,2 ml de agua para disolver el material liofilizado. Las muestras se procesaron como las orinas (descrito más adelante).

1.4 Extracción del ácido nucleico

Cepas bacterianas. Para el aislamiento de los ácidos nucleicos del panel de las 448 cepas de NG, se aisló el ADN a partir de algunas colonias usando la precipitación con isopropanol seguida de disolución de los precipitados en 50 µl de Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 (T10; (6, 20)), y diluido 10.000 veces en T10. Se añadieron 5 µl a la reacción de PCR. Para el aislamiento de los ácidos nucleicos de distintas cepas bacterianas, las bacterias fueron suspendidas en TE (EDTA 1 mM en el tampón Tris-HCl 10 mM, pH = 8,0) hasta una suspensión de aproximadamente 0,5 McFarland (véase: http://biology.fullerton.edu/courses/biol302/Web/3021abf99/guant.ht ml#mcfar) y se incubaron durante 15 minutos a 100 oC. Debido a los valores bajos de Ct (12-14 indicando una carga alta de ADN) cuando se analizaron directamente en PCR en tiempo real, se prepararon diluciones 1 en 1000 en TE y se analizaron. Se añadieron 5 µl a cada PCR.

Panel de 122 muestras clínicas positivas para NG por Cobas amplicorTM. Se centrifugaron de uno a 1,5 ml de orina durante 15 minutos a 13.000 rpm. El sobrenadante fue desechado y aproximadamente 100 µl se dejaron en el precipitado. Las muestras en el medio Amplicor STM y 2-SP (medio suministrado por Roche) se procesaron directamente. Se aisló ADN a partir de 100 µl de material usando el Kit de Aislamiento de ADN III (Hongos Bacterianos; Roche Diagnostics Holanda BV Almere, Países Bajos) y la estación de aislamiento MagnaPure LC (Roche Diagnostics Holanda BV Almere, Países Bajos) exactamente tal como describe el

fabricante. Los ácidos nucleicos fueron eluídos en un volumen final de 100 µL. Los aislamientos se dividieron para los ensayos de confirmación Cobas amplicorTM , ARNr 16S y el ensayo de NG basado en opa, que todos fueron llevados a cabo el mismo día. Se añadieron 25 µl en el ensayo Cobas amplicorTM, se añadieron 5 µl en el ensayo ARNr 16S y se añadieron 10 µl a la reacción del PCR de opa.

Otras muestras clínicas. La uretra seca o exudados tapones cervicales (Exudado minipunta de plástico 185CS01, Copan, AMDS-Benelux, Malden, Países Bajos) se colocaron en 500 µl de TE, se incubaron durante 30 min a 97 oC y se centrifugaron durante 1 min a 8.000 rpm. Se utilizaron 10 µl en el PCR. Para las muestras de orina: se centrifugó 1 ml a 10.000 rpm durante 15 minutos y se eliminó el sobrenadante. Los precipitados que permanecieron se disolvieron en 300 µl de TE y se incubaron durante 30 min a 97 oC. Se utilizaron 10 µl en el PCR.

Si ocurrió inhibición en el PCR (véase más adelante), el ADN se aisló a partir de 190 µl de muestra a la que se añadieron 10 µl de un herpesvirus de foca (PhHV) usando el Qiagen Blood Kit, siguiendo las instrucciones del fabricante, omitiendo el tratamiento con proteasa y eluyendo en 50 µL. Se utilizaron 10 µl en las reacciones de PCR.

1.5 Control de la inhibición de PCR

Para monitorizar la detección de NG en tiempo real, se llevó a cabo un PCR por separado en todas las muestras a las que se le añadió PhHV-1 hasta una concentración final de aproximadamente

5.000 a 10.000 copias de ADN por ml, equivalente a un valor de

ciclo del umbral (Ct) de aproximadamente 30 (29). Si Ct estaba dentro del intervalo de la media ± 2 desviaciones estándar, el PCR fue considerado libre de inhibición.

1.6. Ensayo de NG basado en opa. Se llevó a cabo un PCR de 25 µl que contenía Tris-HCl 20 mM pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 3 mM (preparado a partir del tampón PCR 10x suministrado con la polimerasa de Taq Platinum), 0,75 U de polimerasa de Taq Platinum (Invitrogen BV, Breda, Países Bajos), glicerol al 4% (calidad de biología molecular; CalBiochem, VWR International B.V., Ámsterdam, Países Bajos), 200 µM de cada dNTP (Amersham Bioscience, Roosendaal, Países Bajos), 0,5 µl de Rox Reference Dye (Invitrogen BV), 150 nM de sonda opa-1, -cuando se indica-150 nM de sonda opa2 (sintetizadas por Applied Biosystems, Nieuwerkerk a/d IJssel, Países Bajos), 300 nM de cebador opaFw y 300 nM de cebador opaRv

(Sigma-Genosys Ltd, Haverhill, Reino Unido) y 5 ó 10 µl de muestra (se utilizaron 5 µl de ADN al analizar el panel de 448 cepas de NG; se utilizaron 10 µl para todos los otros ensayos).

Se utilizó el sistema de detección de secuencias ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Nieuwerkerk IJssel a/d, Países Bajos) para la amplificación y detección (2 min a 50 oC, 10 min a 95 oC, 45 ciclos de 15 segundos a 95 oC, 60 segundos a 60 oC).

1.7 Ensayo Cobas amplicorTM para NG. El ensayo Cobas amplicorTM se llevó a cabo según las instrucciones de los fabricantes.

1.8 Ensayo de confirmación ARNr 16S fue realizado en dos laboratorios independientes. Se utilizaron los cebadores NG16S

F: TAT CGG AAC GTA CCG GGT AG y NG16S R: GCT TAT TCT TCA GGT ACC GTC AT para amplificar un fragmento de 379 pares de bases, y las sondas NG16S FL: CGG GTT GTA AAG GAC TTT TGT CAG GGA A-fl y NG16R LC: AAG GCT GTT GCC AAT ATC GGC GG-p para detectar el producto de PCR (Boel E y otros, manuscrito en preparación). Se utilizaron para la amplificación y detección 25 µl de PCR que contenían 250 nM de cada cebador y sonda, 4 mM de MgCl2 en 1x LC Mastermix (LC DNA Master Hybridisation Probes kit, Roche Diagnostics Holanda BV Almere, Países Bajos). Se utilizó LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics Holanda BV Almere, Países Bajos) para la amplificación y detección (10 minutos 95 oC, 45 ciclos de 5 segundos a 95 oC, 10 segundos a 55 oC y 20 segundos a 72 oC; curva de fusión 20 seg a 95oC, 10 seg a 35 oC, rampa de 0,2 oC/segundo 85 oC; enfriar 30 segundos a 40 oC)

1.9 Detección de PhHV. Se detectó PhHV tal como se ha descrito (29).

1.10 Análisis de secuencia. Se utilizaron los cebadores Ml3-opa Fw TGT AAA ACG ACG GCC AGT GTT GAA ACA CCG CCC GG y Ml3-opa Rv CAG GAA ACA GCT ATG ACC CGG TTT GAC CGG TTA AAA AAA GAT (300 nM cada uno) para la amplificación. El PCR se llevó a cabo tal como se describió anteriormente. El producto de PCR se purificó añadiendo 4 µl de exonucleasa combinada I (10 U/mL) y fosfatasa alcalina de camarón (2 U/µl, USB Corporation, Amersham Bioscience, Roosendaal, Países Bajos) a 20 µl del producto de PCR, incubación de 15 min. a 37oC, seguida de inactivación de 15 min. a 80oC (Termociclador PTC200, MJ Research, Biozym TC bv, Landgraaf, Países Bajos). Los fragmentos se secuenciaron utilizando cebadores M13. Las reacciones de 20 µl contenían 5 µl de producto de PCR purificado, 4 µl Mezcla

de Reacción Lista de Secuenciación de Ciclo del Terminador BigDye (Applied Biosystems) y 7,5 pmol de cebador directo o inverso. Se llevaron a cabo veinticinco ciclos de 10 segundos a 96oC, 5 segundos a 50oC y 2,5 minutos a 60oC, y los productos se purificaron en Sephadex (G-50 Superfine) antes de ser analizados en un Analizador de ADN ABI Prism 3700 (Applied Biosystems). Para cada una de las cepas de NG 24 aberrantes, se determinaron una secuencia directa y una inversa.

1.11

Sensibilidad. Las bacterias de NG (ATCC 49226) se resuspendieron en tampón TE a una suspensión de 0,96 McFarland y se incubaron durante 15 min. a 100oC. Se aisló el ADN a partir de 190 µl de suspensión bacteriana a la que se añadieron 10 µl de PhHV como control interno utilizando el Kit Qiagen Blood, siguiendo las instrucciones del fabricante, omitiendo el tratamiento con proteasa. El ADN se eluyó en 50 µl y el contenido de ADN determinado de forma fotoespectrométrica (Eppendorf BioPhotometer) fue de 18,85 ng/µl (dilución 1:1: A260: 0,192, A280: 0,107, conc. del eluato = 18,6 ng/µl, dilución 1:4: A260: 0,099, A280: 0,056, conc. de eluato = 19,1 ng/µl). Se realizaron diluciones en serie con un factor de dilución de 10 que contenían de 10 µg/ml a 100 fg/mL. Se utilizaron 10 µl de cada dilución para las reacciones de PCR por duplicado. Un genoma de NG pesa aproximadamente 2,45 fg (2,2 x 109 pares de bases (10) x 665 da/bp x 1,67 x 10-24 g/da).

2.

Resultados

2.1 Cebadores y diseño de la sonda. Las secuencias que cubren una región conservada dentro la región sin traducir 5' de los genes opa se obtuvieron de la base de datos NCBI. Sobre la base de la homología, se recuperaron secuencias de NG, N. meningitides y

N. flava y se alinearon en la figura 1. Se diseñaron cebadores y una sonda de unión al surco menor (MGB) opa-1 (tabla 1) y se adaptaron a los estándares Taqman utilizando el programa Primer Express (Applied Biosystems). Las sondas de unión al surco menor forman dúplex estables con ADN de cadena única dianas, permitiendo así que las sondas cortas sean utilizadas en los ensayos basados en hibridación.

2.2 Optimización del ensayo de NG basado en opa. De un panel de 448 cepas de NG clínicas (véase Materiales y Métodos), 424 generaron una señal fluorescente positiva en el PCR TaqMan que empleó la sonda opa-1, mientras que la señal fluorescente de 24 cepas permaneció indetectable. Sin embargo, al analizar los

productos de PCR de las 24 cepas aberrantes de NG en gel de agarosa, los 24 mostrados abundantes productos de PCR del tamaño esperado. Aparentemente los productos de PCR de las cepas aberrantes no fueron detectados por la sonda opa-1. La secuenciación de los productos de PCR reveló exactamente la misma secuencia en las 24 cepas (indicada en la figura 1). La sonda opa-1 de MGB se diseñó para cubrir esta secuencia y se incluyó en los ensayos de NG basados en los genes opa. Debido a que los genes opa son genes multicopia es algo sorprendente detectar solamente una secuencia en los productos de PCR de las 24 cepas aberrantes de NG. Posteriormente se analizó el ADN a partir de 21 de las cepas de NG no aberrantes del panel anterior usando el ensayo de NG solamente con la sonda opa-1. Apareció uno positivo de 21 también con la sonda opa-2, indicando la presencia de las secuencias de opa-1 y opa-2 en esa cepa particular (datos no mostrados). Los valores del ciclo de umbral (Ct) muestran una señal diez veces más alta con la sonda opa-1 que con la sonda opa-2.

2.3 Especificidad. Además de la detección de 448 cepas de NG, también se evaluó la especificidad del ensayo de NG ensayando un panel de microorganismos no NG (tabla 2), incluyendo ADN a partir de otras 12 Neisseriaceae diferentes. No se observó señal en el PCR en tiempo real de opa en ninguno de los microorganismos ensayados utilizando las sondas opa-1 y la sonda opa-2. De esta forma, el ensayo de NG basado en opa tal como se ha descrito es específico para cepas de NG y no muestra reactividad las otras Neisseriaceae ni con ninguno de los otros microorganismos ensayados hasta ahora.

2.4 Sensibilidad. Se utilizaron dos métodos para calcular el número de genomas aún detectables en el ensayo opa. Se aisló ADN de la cepa de NG 49226 ATCC tal como se describió en Materiales y Métodos y se diluyó hasta un nivel indetectable. Basado en el valor de McFarland de la suspensión bacteriana original y asumiendo que 1 McFarland es equivalente a 3 x 108 bacterias/ml, se pudieron aún detectar 0,06 genomas bacterianos en 4 de 6 reacciones. Sin embargo, el estándar de McFarland mide la turbiedad de bacterias y es muy inexacto como medida de la cantidad de bacterias. Un modo más preciso de cuantificar el número de bacterias es medir el contenido de ADN y calcular el número de bacterias sobre la base del peso del genoma. El ADN se cuantificó de forma espectrofotométrica tal como se describió en Materiales y

Métodos y se realizaron diluciones en serie con un factor de dilución de 10 en el intervalo a partir de 100 fg a 10 µg de ADN por ml y se amplificó en el ensayo opa. El ADN de NG se podría medir de forma lineal en un intervalo de 8 escalas logarítmicas (figura 2). Se calculó la eficacia del PCR y fue de un 93% cuando las sondas opa-1 y opa-2 estaban presentes en el PCR (la eficacia fue de un 98% empleando solamente la sonda opa-1). Fue detectable un fg de ADN de NG (equivalente a 0,41 genoma de NG) en 4 de 6 reacciones.

2.5 Muestras clínicas. Para ensayar el desempeño clínico del ensayo opa durante un período de 15 meses se recogieron 122 muestras clínicas de una serie de 3957 muestras clínicas, que resultaron positivas con el ensayo Cobas amplicorTM para NG (tabla 3A). Estas 122 muestras incluyeron muestras de orina, de garganta, de cérvix, de uretra y de ano. Las muestras se analizaron en dos laboratorios independientes en el ensayo de confirmación de ARNr 16S y en el ensayo de NG basado en opa. Ambos laboratorios obtuvieron exactamente los mismos resultados con el ensayo de ARNr 16S. Treinta y seis muestras fueron encontradas positivas y 83 muestras fueron negativas en los tres ensayos (la tabla 3B muestra los datos primarios y la tabla 3C resume estos resultados). Esto está conforme los conocimientos de que el ensayo Cobas amplicorTM produce resultados falsos positivos que necesitan confirmación posterior. Las tres muestras restantes que fueron negativas en el de ARNr 16S fueron positivas en el ensayo opa. El hecho de que las tres muestras mostraron los valores más altos de Ct en el ensayo opa (35, 35, y 37) sugirió que la discrepancia podría ser debida a una diferencia en el nivel de detección del PCR y del ensayo opa. Por lo tanto, se analizó una dilución en serie de ADN de NG en ambos ensayos el mismo día. Los resultados de este ensayo revelaron una diferencia de 10 veces en la sensibilidad entre el PCR de ARNr 16S y el PCR de opa en ventaja para el PCR de opa (tabla 4; la diferencia es de cinco veces teniendo en cuenta el volumen de entrada de ADN). En esta serie de 3957 muestras clínicas el ensayo opa detectó un 8% más de positivos que el PCR de ARNr 16S.

2.6 Panel de Control de Calidad para Diagnósticos Moleculares (QCMD, Glasgow, Reino Unido) de noviembre de 2003. Un panel de QCMD se distribuyó en noviembre de 2003. El panel se analizó en el Cobas amplicorTM y 6 muestras se enviaron a dos laboratorios de referencia nominados por Roche para NG en los

Países Bajos. Además, el panel se analizó en el ensayo de ARNr 16S y en el ensayo basado en opa. Los resultados se muestran en la tabla 5. La muestra NG03-04 se perdió en el ensayo Cobas amplicorTM .

Las

muestras NG03-05 y NG03-07 se perdieron en el ensayo de

confirmación

en ambos laboratorios de referencia nominados por

Roche

en los Países Bajos. Las muestras NG03-08 y NG03-09 se

perdieron en uno de los dos laboratorios de referencia. El ensayo opa, en cambio, detectó todas las muestras que contenían NG. Los ciclos de umbral de las muestras NG03-04 y NG03-07 (indicados como Pos (+/-) por QCMD) fueron de 33,2 y 33,5, respectivamente, indicando un límite de detección del ensayo bueno.

Tabla 1. Secuencias de cebadores y sondas utilizados para la

detección de NG en tiempo real.

Opa-Fw

GTT GAA ACA CCG CCC GG

Opa-Rv

CGG TTT GAC CGG TTA AAA AAA GAT

Sonda opa-1

CCC TTC AAC ATC AGT GAA A-MGB

Sonda opa-2

CTT TGA ACC ATC AGT GAA A-MGB

Tabla 2. Reactividad del ensayo de NG basado en opa (sondas opa-1 y opa-2) con diferentes especies de Neisseria y otros microorganismos.

Especies

n Número de cepa1 / Origen Ensayo opa

Neisseria cinerea

1 A8413902 Negativo

Neisseria denitrificans

1 A8413892 Negativo

Neisseria elongata

1 NRBM 9013012 Negativo

Neisseria flavescens

1 NRBM 9306492 Negativo

Neisseria lactamica

2 NRBM 9002952,3 Negativo

Neisseria meningitides

11 ATCC 131023,4 Negativo

Neisseria mucosa

2 404892,3 Negativo

Neisseria perflava

1 A8413992 Negativo

Neisseria polysaccherea

1 BD02-004845 Negativo

Neisseria sicca

1 A8414012 Negativo

Neisseria subflava

1 3 Negativo

Neisseria subflava var flava

1 NRBM 9211852 Negativo

Bacteroides fragilis

2 ATCC 252853 Negativo

Bacteroides vulgatus

1 ATCC 10583 Negativo

Especies

n Número de cepa1 / Origen Ensayo opa

Campylobacter jejuni

1 ATCC 11392 Negativo

Chlamydia trachomatis

2 3 Negativo

Candida albicans

2 ATCC 900283 Negativo

Candida glabrata

1 ATCC 90030 Negativo

Candida krusei

1 ATCC 6258 Negativo

Candida parapsilosis

1 ATCC 90018 Negativo

Corynebacterium aquaticum

1 6 Negativo

Corynebacterium diphteriae mitis

1 SKMM panel 1996 Negativo

Corynebacterium diphteriae belfranti

1 SKMM panel 1996 Negativo

Corynebacterium diphteriae mitis/ belfranti

2 SKMM panel 2000 Negativo

Corynebacterium diphteriae

1 SKMM panel 2001 Negativo

Corynebacterium ulcerans

2 SKMM panel 2000 Negativo

Cryptococcus neoformans

1 ATCC 90112 Negativo

Enterococcus faecalis

1 ATCC 29212 Negativo

Enterococcus casseliflavus

1 ATCC 700327 Negativo

Escherichia coli

3 ATCC 25922, 35218, 3 Negativo

Gardnerella vaginalis

1 ATCC 14018 Negativo

Haemophilus influenzae

3 ATCC 49247, 49766, 9006, 3 Negativo

Haemophilus parainfluenzae

1 3 Negativo

Haemophilus ducreyi

1 3 Negativo

Klebsiella oxytoca

1 ATCC 700324 Negativo

Lactobacillus species

1 ATCC 314 Negativo

Legionalle pneumophila serogrupo 1

1 RMM 220186 Negativo

Moraxella catarrhalis

1 3 Negativo

M. atlantii (¿?)

1 3 Negativo

Moraxella catarrhalis

1 3 Negativo

Peptostreptococcus magnus

1 ATCC 29328 Negativo

Pseudomona aeruginosa

2 ATCC 27853, 3 Negativo

Proteus mirabilis

1 3 Negativo

Salmonella

2 Grupo B: S36198403 Negativo

Serratia odorifera

1 ATCC 33077 Negativo

Especies

n Número de cepa1 / Origen Ensayo opa

Shigella

1 3 Negativo

Staphilococcus aureus

4 ATCC 25923, 29213, 43300, 3 Negativo

Staphilococcus coagulase neg

1 3 Negativo

Staphilococcus epidermidis

1 ATCC 12228 Negativo

Staphilococcus marcescens

1 3 Negativo

Streptococcus pneumoniae

3 ATCC 49619, 6306, 3 Negativo

Streptococcus haemolyticus Grupo B

2 6 Negativo

MRSA

2 3,8 Negativo

Treponema pallidum

1 3 Negativo

1ATCC, Colección Americana de Cultivos Tipo; NRBM, Laboratorio de referencia en Holanda para Meningitis Bacteriana. SKMM, Organización Holandesa para el Control de Calidad en Microbiología Médica. 2Centro Médico de Ámsterdam, Centro Médico Académico, Departamento de Microbiología Médica, Ámsterdam 3(6), GG&GD, Servicio de Salud Municipal, Ámsterdam, Países Bajos. 4Determinado por Vitek NHI (Vitek Systems, Inc., Hazelwood, Mo.), confirmado por NRBM. 5Departamento de Referencias Especiales para Identificación de Bacterias (LIS-BBD), Instituto Nacional de Salud Pública y Medio Ambiente (RIVM), Países Bajos. 6Determinado por API-Coryne (Biomerieux, Boxtel, Países Bajos). 7Determinado por Kit de PathoDx látex Strep Grouping (Diagnostic Product Corporation, Los Angeles, Calif.). 8Determinado por Staphaurex Plus (Remel Inc., Lenexa. KS), confirmado por el Instituto Nacional de Salud Pública y Medio Ambiente (RIVM), Países Bajos.

Tabla 3. Evaluación del ensayo de NG de ARNr 16S y ensayo opa en 122 materiales clínicos determinados positivos en el ensayo Cobas amplicorTM para NG. Se realizó el ensayo de confirmación ARNr 16S en 2 laboratorios: Microbiología Médica y Enfermedades Infecciosas, Apeldoorn, Países Bajos y en un laboratorio de referencia para Chlamydia trachomatis y ensayos de NG para Roche en Países Bajos. (A) composición del panel; (B) resultados del análisis; (C) resumen de los resultados.

A

Número de muestras

Material

Medio STM Medio 2-SP

Orina

36

Exudado cervical

40 7

Exudado de uretra

8 0

Exudado de garganta

13 16

Exudado anal

2 0

B

Número

Material Cobas amplicorTM Ensayo opa de NG basado en

1ero

2do 3ero ARNr 16S Resultado Ct 1 Ct 2 Resultado

3000134

Uretra/STM 0,418 1,073 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3000691

Uretra/STM 3,874 3,864 0,003 Pos Pos 23,18 22,88 Pos

3000923

Cérvix/STM >4,000 >4,000 Pos Pos 30,85 31,01 Pos

3002317

Orina 2,073 0,768 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3002783

Garganta/2SP 3,176 3,133 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3003334

Cérvix/STM 3,061 1,715 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3003712

Cérvix/STM 0,700 1,111 1,077 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3003804

Garganta/2SP 1,741 0,617 0,241 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3004006

Cérvix/STM 0,023 0,000 0,256 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3004084

Cérvix/STM 0,013 0,413 0,428 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3004216

Garganta/2SP 3,876 3,871 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3004467

Orina 3,875 3,695 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3005725

Cérvix/STM 3,697 3,695 Pos POS 25,13 24,81 POS

3006301

Cérvix/STM >4,000 3,570 Pos POS 30,14 29,82 POS

3007145

Garganta/2SP 3,700 1,737 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3007162

Orina 3,700 3,700 Pos POS 18,49 18,78 POS

3007642

Cérvix/STM 2,658 2,597 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3008007

Orina >4,000 3,865 Pos POS 20,92 20,70 POS

3008130

Cérvix/2-SP 2,729 1,755 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3008789

Cérvix/STM 1,825 3,700 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3008890

Garganta/2SP 1,274 0,551 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3014038

Orina 4,000 3,853 Pos POS 20,35 20,45 POS

3014168

Garganta/2SP 2,899 2,943 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3014426

Orina 3,576 3,576 Pos POS 22,35 22,35 POS

3014874

Orina 3,853 4,000 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3015212

Garganta/2SP 3,676 3,867 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

Número

Material Cobas amplicorTM Ensayo opa de NG basado en

3015524

Cérvix/2-SP 1,438 1,065 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3015756

Garganta/STM 3,699 3,873 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3016505

Cérvix/STM 1,084 0,004 2,312 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3016563

Orina 3,702 3,482 Pos POS 25,75 26,37 POS

3016659

Garganta/STM 1,015 0,587 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3016802

Garganta/STM 3,880 3,880 1,332 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3017657

Garganta/STM 3,878 3,878 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3017697

Cérvix/STM 3,880 2,588 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3018301

Orina >4,000 >4,000 Pos POS 26,64 27,57 POS

3018340

Orina 3,881 3,716 Pos POS 17,07 16,94 POS

3018609

Garganta/STM 3,880 >4,000 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3019168

Cérvix/STM 3,370 3,395 Pos POS 27,40 27,68 POS

3019492

Orina 1,018 0,429 0,366 Indet. Neg 34,90 35,23 POS

3019904

Cérvix/2-SP 2,291 0,042 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3020148

Cérvix/2-SP 3,876 3,874 1,677 pos POS 20,52 20,18 POS

3020175

Orina >4,000 2,999 pos POS 27,11 28,00 POS

3021628

Garganta/2SP 1,925 2,663 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3021792

Cérvix/STM 0,398 0,282 0,341 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3022405

Uretra/STM 3,874 3,701 2,012 pos POS 22,44 22,29 POS

3022410

Cérvix/2-SP 0,239 0,281 0,810 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3022411

Orina 2,687 2,670 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3022616

Orina 3,701 3,704 pos POS 14,76 15,38 POS

3022968

Orina Uretra/ST 3,876 3,703 pos POS 15,74 15,45 POS

3023068

M 3,703 3,000 pos POS 19,09 18,72 POS

3023131

Garganta/2SP 3,700 3,700 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3024817

Garganta/2SP >4,000 3,700 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3026059

Cérvix/STM 1,585 0,923 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3026466

Orina >4,000 3,876 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3026746

Orina 2,672 2,367 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3026956

Uretra/STM 3,873 >4,000 pos POS 20,16 20,11 POS

3027264

Cérvix/STM 0,566 0,320 0,508 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3027747

Cérvix/STM 2,597 >4,000 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3028019

Garganta/STM >4,000 >4,000 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3028242

Cérvix/STM >4,000 >4,000 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3028608

Cérvix/STM 1,628 0,164 0,756 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3028720

Orina 3,871 3,574 pos POS 24,10 23,50 POS

3028885

Orina >4,000 >4,000 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3028908

Garganta/STM 0,351 1,388 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3029932

Cérvix/STM 3,876 >4,000 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3029934

Cérvix/STM 2,687 3,479 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3030124

Orina 2,045 3,698 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3030854

Cérvix/STM 1,912 0,845 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

Número

Material Cobas amplicorTM Ensayo opa de NG basado en

3031245

Garganta/2SP 1,021 0,814 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3031637

Cérvix/STM 2,927 3,177 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3033597

Cérvix/STM 1,550 0,003 0,400 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3034432

Cérvix/STM >4,000 3,879 pos POS 28,38 28,83 POS

3034549

Garganta/2SP 3,879 3,881 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3034555

Orina 3,879 >4,000 pos POS POS

3034615

Cérvix/STM 2,547 2,529 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3035182

Orina >4,000 3,702 pos POS 24,38 23,74 POS

3035184

Cérvix/STM >4,000 3,878 pos POS 25,84 26,05 POS

3035191

Uretra/STM 3,869 3,702 pos POS 22,57 23,04 POS

3035192

Orina >4,000 1,879 pos POS 16,44 16,53 POS

3035334

Cérvix/STM 2,579 0,002 1,400 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3035774

Garganta/ STM 1,511 0,872 0,582 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3036773

Cérvix/2-SP 0,543 1,049 0,476 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3037060

Cérvix/STM 0,345 2,928 0,022 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3037201

Ano/STM 0,606 0,863 1,004 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3037203

Garganta/ STM 2,924 2,707 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3037284

Ano/STM 0,612 0,943 0,295 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3037289

Garganta/ STM 0,422 1,186 0,629 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3037439

Cérvix/STM 1,559 1,468 0,011 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3037702

Cérvix/STM 1,553 1,855 Indet. Neg 34,59 34,92 POS

3038009

Orina >4,000 1,237 pos POS 18,29 18,32 POS

3038033

Orina 3,710 >4,000 pos POS 25,73 24,41 POS

3036897

Orina 3,883 3,882 pos POS 19,38 21,28 POS

3030191

Uretra/STM 3,702 3,698 pos POS 22,12 22,68 POS

3021712

Garganta/ STM 0,884 2,44 2,034 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3021756

Orina 3,691 3,873 pos POS 18,72 19,06 POS

3021769

Orina 3,867 3,873 pos POS 29,06 29,20 POS

3021202

Garganta/ STM 0,407 0,372 0,346 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3018355

Orina 2,908 2,504 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3014292

Orina 2,392 2,409 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

3002538

Orina >4,000 3,873 pos POS 16,16 16,12 POS

3002536

Cérvix/STM 3,686 2,832 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

4001319

Cérvix/STM 3,876 >4,000 Indet. Neg 36,20 37,97 POS

4001329

Orina 1,187 1,008 0,810 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

4001343

Orina >4,000 >4,000 pos POS 28,09 28,54 POS

4001818

Garganta/2SP 3,881 3,702 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

4002020

Orina >4,000 3,099 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

Número

Material Cobas amplicorTM Ensayo opa de NG basado en

4002021

Cérvix/2-SP >4,000 >4,000 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

4002056

Uretra/STM >4,000 3,878 Indet. Indet. Indet. Neg

4002770

Cérvix/STM 0,337 0,277 0,135 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

4003263

Cérvix/STM 2,24 0,714 2,309 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

4003420

Cérvix/STM 3,708 >4,000 pos POS 29,47 29,68 POS

4004017

Cérvix/STM >4,000 >4,000 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

4004160

Cérvix/STM 0,278 0,203 0,288 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

4004282

Garganta/2SP >4,000 >4,000 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

4005083

Garganta/ STM 2,123 3,036 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

4005301

Cérvix/STM 0,212 1,015 0,625 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

4005658

Orina 1,838 3,104 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

4006517

Orina 3,886 3,882 pos POS 19,55 20,02 POS

4006379

Cérvix/STM 3,886 3,882 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

4006381

Cérvix/STM 3,71 >4,000 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

4006589

Garganta/2SP 3,882 >4,000 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

4006824

Garganta/2SP 3,579 0,665 3,283 Indet. Neg Indet. Indet. Neg

Material

Ensayo Ensayo opa

Resultado

Neg Pos

Orina

ARNr 16S* Neg 13 1

Pos

0 22

Exudado cervical

ARNr 16S* Neg 37 2

Pos

0 8

Exudado de uretra

ARNr 16S* Neg 0 6

Pos

29 0

Exudado de garganta

ARNr 16S* Neg 2 0

Pos

2 0

Exudado anal

ARNr 16S* Neg 83 3

Total

ARNr 16S* Pos 0 36

*Se obtuvieron exactamente los mismos resultados en los dos laboratorios independientes.

Tabla 4. Comparación de la sensibilidad del ensayo ARNr 16S y el ensayo opa. Los números corresponden a los números del ciclo de umbral (CT).

ADN en el PCR (fg/µl)

Ct ensayo ARNr 16S Ct ensayo opa

10.000

27,06 24,3 ± 0,0

1.000

32,17 28,4 ± 0,0

100

36,22 32,0 ± 0,1

10

>41,00 35,9 ± 0,3

1

Indetectable 42,4

Tabla 5. Evaluación del panel de NG de QCMD de noviembre de 2003.

Código QCMD

Cobas AmplicorTM Lab. Ref. 1 Lab. Ref. 2 Ensayo ARNr 16S Ensayo opa Resultado QCMD % resultados correctos

Resultado

Ct

NG03-01

0,005 Neg Neg Indet. Neg 100%

NG03-02

0,004 Neg Neg Indet. Neg 100%

NG03-03

3,873 Pos Pos Pos Pos 28,4 Pos (++) 97%

NG03-04

0,006 Neg Pos 33,2 Pos (+/-) 48%

NG03-05

2,541 Neg Neg Neg Pos 31,2 Pos (+) 92%

NG03-06

0,004 Neg Neg Indet. Neg 98%

NG03-07

2,157 Neg Neg Neg Pos 33,5 Pos (+/-) 53%

NG03-08

3,873 Pos Neg Pos Pos 30,8 Pos (+) 90%

NG03-09

3,873 Neg Pos Pos Pos 26,5 Pos (+) 81%

NG03-10

>4,000 Pos Pos Pos Pos 28,1 Pos (++) 95%

>4,000: señal por encima de 4,000

REFERENCIAS

1. Akduman, D., J. M. Ehret, K. Messina, S. Ragsdale, and

F. N. Judson. 2002. Evaluation of a strand displacement amplification assay (BD ProbeTec-SDA) for detection of Neisseria gonorrhoeae in urine specimens. J Clin Microbiol 40:281-3.

2.

Bassiri, M., P. A. Mardh, and M. Domeika. 1997. Multiplex AMPLICOR PCR screening for Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in women attenting non-sexually transmitted disease clinics. The European Chlamydia Epidemiology Group. J Clin Microbiol 35:2556-60.

3.

Bessen, D., and E. C. Gotschlich. 1986. Interactions of gonococci with HeLa cells: attachment, detachment,

replication, penetration, and the role of protein II. Infect Immun 54:154-60.

4.

Bhat, K. S., C. P. Gibbs, O. Barrera, S. G. Morrison, F. Jahnig, A. Stern, E. M. Kupsch, T. F. Meyer, and J. Swanson. 1991. The opacity proteins of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 are encoded by a family of 11 complete genes. Mol Microbiol 5:1889-901.

5.

Bos, M. P., D. Hogan, and R. J. Belland. 1997. Selection of Opa+ Neisseria gonorrhoeae by limited availability of normal human serum. Infect Immun 65:645-50.

6.

Bruisten, S. M., G. T. Noordhoek, A. J. C. van den Brule, B. Duim, C. H. E. Boel, K. El-Faouzi, R. du Maine,

S. Mulder, D. Luijt, and J. Schirm. 2004. Multicenter Validation of the cppB Gene as a PCR Target for Detection of Neisseria gonorrhoeae. J Clin Microbiol In Press.

7. Buimer, M., G. J. van Doornum, S. Ching, P. G. Peerbooms, P. K. Plier, D. Ram, and H. H. Lee. 1996. Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae by ligase chain reaction-based assays with clinical specimens from various sites: implications for diagnostic testing and screening. J Clin Microbiol 34:2395

400.

8. Chen, T., R. J. Belland, J. Wilson, and J. Swanson. 1995. Adherence of pilus-Opa+ gonococci to epithelial cells in vitro involves heparan sulfate. J Exp Med 182:511

7.

9.

Ching, S., H. Lee, E. W. Hook, 3rd, M. R. Jacobs, and J. Zenilman. 1995. Ligase chain reaction for detection of Neisseria gonorrhoeae in urogenital swabs. J Clin Microbiol 33:3111-4.

10.

Dempsey, J. A., W. Litaker, A. Madhure, T. L. Snodgrass, and J. G. Cannon. 1991. Physical map of the chromosome of Neisseria gonorrhoeae FA1090 with locations of genetic markers, including opa and pil genes. J Bacteriol 173:5476-86.

11.

Farrell, D. J. 1999. Evaluation of AMPLICOR Neisseria gonorrhoeae PCR using cppB nested PCR and 16S rRNA PCR. J Clin Microbiol 37:386-90.

12.

Hook, E. W. r., and H. H. Handsfield. 1990. Gonococcal infections in the adult. In K. K. H. e. al (ed.), Sexually transmitted diseases. McGraw-Hill, New York.

13.

Katz, A. R., P. V. Effler, R. G. Ohye, B. Brouillet, M.

V. Lee, and P. M. Whiticar. 2004. False-positive gonorrhea test results with a nucleic acid amplification test: the impact of low prevalence on positive predictive value. Clin Infect Dis 38:814-9.

14.

Kehl, S. C., K. Georgakas, G. R. Swain, G. Sedmak, S. Gradus, A. Singh, and S. Foldy. 1998. Evaluation of the abbott LCx assay for detection of Neisseria gonorrhoeae in endocervical swab specimens from females. J Clin Microbiol 36:3549-51.

15.

Kupsch, E. M., B. Knepper, T. Kuroki, I. Heuer, and T.

F. Meyer. 1993. Variable opacity (Opa) outer membrane proteins account for the cell tropisms displayed by Neisseria gonorrhoeae for human leukocytes and epithelial cells. Embo J 12:641-50.

16.

Makino, S., J. P. van Putten, and T. F. Meyer. 1991. Phase variation of the opacity outer membrane protein controls invasion by Neisseria gonorrhoeae into human epithelial cells. Embo J 10:1307-15.

17.

Martin, D. H., C. Cammarata, B. Van Der Pol, R. B. Jones, T. C. Quinn, C. A. Gaydos, K. Crotchfelt, J. Schachter, J. Moncada, D. Jungkind, B. Turner, and C. Peyton. 2000. Multicenter evaluation of AMPLICOR and automated COBAS AMPLICOR CT/NG tests for Neisseria gonorrhoeae. J Clin Microbiol 38:3544-9.

18.

O’Rourke, M., C. A. Ison, A. M. Renton, and B. G. Spratt. 1995. Opa-typing: a high-resolution tool for studying the epidemiology of gonorrhoea. Mol Microbiol 17:865-75.

19.

Palladino, S., J. W. Pearman, I. D. Kay, D. W. Smith,

G. B. Harnett, M. Woods, L. Marshall, and J. McCloskey. 1999. Diagnosis of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. Genitourinary infections in males by the Amplicor PCR assay of urine. Diagn Microbiol Infect Dis 33:141-6.

20. Peerbooms, P. G., M. N. Engelen, D. A. Stokman, B. H. van Benthem, M. L. van Weert, S. M. Bruisten, A. van

Belkum, and R. A. Coutinho. 2002. Nasopharyngeal carriage of potential bacterial pathogens related to day care attendance, with special reference to the molecular epidemiology of Haemophilus influenzae. J Clin Microbiol

40: 2832-6.

21. Rahman, M., A. Alam, K. Nessa, S. Nahar, D. K. Dutta,

L. Yasmin, S. Monira, Z. Sultan, S. A. Khan, and M. J.Albert. 2001. Treatment failure with the use of ciprofloxacin for gonorrhea correlates with the prevalence of fluoroquinolone-resistant Neisseria gonorrhoeae strains in Bangladesh. Clin Infect Dis 32:884-9.

22.

Roche Diagnostic Systems Inc. 1999. Amplicor® Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae (CT/NG) test package insert., Roche Diagnostic Systems Inc. Branchburg, N.J.

23.

Schmale, J. D., J. E. Martin, Jr., and G. Domescik. 1969. Observations on the culture diagnosis of gonorrhea in women. Jama 210:312-4.

24.

Smith, K. R., S. Ching, H. Lee, Y. Ohhashi, H. Y. Hu,

H. C. Fisher, 3rd, and E. W. Hook, 3rd. 1995. Evaluation of ligase chain reaction for use with urine for identification of Neisseria gonorrhoeae in females attending a sexually transmitted disease clinic. J Clin Microbiol 33:455-7.

25.

Stern, A., M. Brown, P. Nickel, and T. F. Meyer. 1986. Opacity genes in Neisseria gonorrhoeae: control of phase and antigenic variation. Cell 47:61-71.

26.

Swanson, J. 1978. Studies on gonococcus infection. XII. Colony color and opacity varienats of gonococci. Infect Immun 19:320-31.

27.

Toleman, M., E. Aho, and M. Virji. 2001. Expression of pathogen-like Opa adhesins in commensal Neisseria: genetic and functional analysis. Cell Microbiol 3:33-44.

28.

Van Der Pol, B., D. V. Ferrero, L. Buck-Barrington, E. Hook, 3rd, C. Lenderman, T. Quinn, C. A. Gaydos, J. Lovchik, J. Schachter, J. Moncada, G. Hall, M. J. Tuohy, and R. B. Jones. 2001. Multicenter evaluation of the BDProbeTec ET System for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in urine specimens, female endocervical swabs, and male urethral swabs. J Clin Microbiol 39:1008-16.

29.

van Doornum, G. J., J. Guldemeester, A. D. Osterhaus, and H. G. Niesters. 2003. Diagnosing herpesvirus infections by real-time amplification and rapid culture. J Clin Microbiol 41:576-80.

30.

Van Dyck, E., H. Smet, L. Van Damme, and M. Laga. 2001. Evaluation of the Roche Neisseria gonorrhoeae 16S rRNA PCR for confirmation of AMPLICOR PCR-positive samples and comparison of its diagnostic performance according to storage conditions and preparation of endocervical specimens. J Clin Microbiol 39:2280-2.

31.

van Putten, J. P., and S. M. Paul. 1995. Binding of syndecan-Like cell surface proteoglycan receptors is required for Neisseria gonorrhoeae entry into human mucosal cells. Embo J 14:2144-54.

32.

Weel, J. F., C. T. Hopman, and J. P. van Putten. 1991. In situ expression and localization of Neisseria gonorrhoeae opacity proteins in infected epithelial cells: apparent role of Opa proteins in cellular invasion. J Exp Med 173:1395-405.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Oligonucleótido específico de Neisseria gonorrhoeae, que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia 5’-TTTGAACC-3’, o su complemento, capaz de hibridizar con la región 5’ no traducida de un gen opa de NG o su complemento, en el que dicho oligonucleótido es de 12-40 nucleótidos, preferentemente de 14-30, más preferentemente de 1625, lo más preferente de 18-22 nucleótidos de longitud, con la condición de que dicha secuencia no es 5’-tcagtgatggttcaaagttc-3’.

2. 2.

   Oligonucleótido, según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de nucleótidos 5’-CTTTGAACCATCAGTGAAA-3’ o su complemento (sonda opa-2).

3. 3.

   Oligonucleótido, según la reivindicación 1 ó 2, que comprende uno o más marcadores detectables, preferentemente un marcador cromóforo o fluorescente, más preferentemente un marcador seleccionado del grupo que comprende 6-FAM, HEX, JOE, TET, ROX, TAMRA, Fluoresceína, Cy3, Cy5, Cy5.5, Rojo Texas, Rodamina, Verde Rodamina, Rojo Rodamina, 6-CarboxiRodamine 6G, verde Oregón 488, verde Oregón 500, verde Oregón 514 DABCYL, BHQ-1 y BHQ-2.

4. 4.

   Oligonucleótido, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho oligonucleótido es un conjugado oligonucleótido-unión al surco menor (MGB), en el que preferentemente MGB se selecciona del grupo que comprende un trímero de 1,2-dihidro-(3H)-pirrolo[3,2-e]indol-7-carboxilato (CDPI3) y un pentámero de N-metilpirrol4-carbox-2-amida (MPC5).

5. 5.

   Método para detectar una cepa de Neisseria gonorrhoeae que comprende el uso de un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho método comprende preferentemente amplificación de ácidos nucleicos.

6. 6.

   Método, según la reivindicación 5, que involucra la tecnología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), preferentemente la tecnología cuantitativa en tiempo real (RQ-PCR), comprendiendo dicho método:

   a) proporcionar el ADN de una cepa de NG o una muestra de ensayo que se sospecha que contiene ADN de dicha cepa de NG;

   b) amplificar la región 5’ no traducida de la región de un gen opa que comprende los nucleótidos 57 a 50 localizados 5’ del codón de inicio de opa utilizando

   un par de cebadores de amplificación de ácidos

   nucleicos; y

   c) detectar la presencia del producto de amplificación, una indicación de la presencia de NG, utilizando preferentemente, como mínimo, una sonda de detección capaz de hibridizarse al producto de amplificación;

   en el que, como mínimo, un cebador o, como mínimo, una sonda de detección es un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

7. 7.

   Método, según la reivindicación 6, en el que dicho par de cebadores comprende opa Fw y opa Rv mostrados en la tabla 1.

8. 8.

   Método, según la reivindicación 7, en el que dicha sonda de detección tiene la secuencia de nucleótidos 5’-CTT TGA ACC ATC AGT GAA A-3’.

9. 9.

   Método, según la reivindicación 8, en el que se utiliza una sonda de detección adicional, preferentemente en el que dicha sonda de detección tiene la secuencia de nucleótidos 5’-CCC TTC AAC ATC AGT GAA A-3’.

10. 10.

    Uso de un método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 para la detección, preferentemente la detección cuantitativa, de la presencia de Neisseria gonorrhoeae en una muestra clínica.

11. 11.

    Kit para la detección de una cepa de Neisseria gonorrhoeae, que comprende un par de cebadores de amplificación de ácidos nucleicos capaces de amplificar una región que comprende los nucleótidos 57 a 50 localizados 5’ del codón de inicio del gen opa de Neisseria gonorrhoeae y, como mínimo, una sonda de detección, en el que, como mínimo, un cebador y/o sonda de detección es un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, comprendiendo opcionalmente una polimerasa, preferentemente Taq polimerasa.

12. 12.

    Kit, según la reivindicación 11, que comprende los cebadores opa Fw y opa Rv y la sonda de detección opa-2, opcionalmente comprendiendo además la sonda de detección opa-1.