JP4937911B2

JP4937911B2 - ｏｐａ遺伝子の５’非翻訳領域を用いたナイセリア・ゴノレアの検出法

Info

Publication number: JP4937911B2
Application number: JP2007524758A
Authority: JP
Inventors: マリアヘンドリカアンナハーマンス
Original assignee: ユルーンボッシュジーケンハウス
Priority date: 2004-08-05
Filing date: 2005-08-05
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2025-08-05
Also published as: ATE483824T1; WO2006014109A1; EP1789582A1; JP2008508875A; DE602005024023D1; US20080003591A1; EP1789582B1; ES2350112T3

Description

本発明は、微生物学および分子診断法に関する。より具体的には、本発明は、臨床試料におけるナイセリア・ゴノレア（Neisseria gonorrhoeae）(NG)の特異的および高感度な検出法に関する。

ナイセリア・ゴノレアは、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）に次いで、二番目に最も流行する、性的に伝染する細菌感染症である。特に女性における感染症の有意な割合は、無症候性である。発見されないままである場合、性的パートナーへの蔓延、および、骨盤の炎症疾患、慢性骨盤痛、子宮外妊娠、新生児結膜炎、および不妊症のような長期的な帰結をもたらす可能性がある（12）。そのため、症候性および無症候性感染症双方の正確な診断が重要である。

いくつかの技術が、NGにより引き起こされる生殖器の感染症を検出するために開発されてきた。感染症の診断のための現在の「ゴールデンスタンダード」は、選択培地上で培養することによる。しかしながら、最適な実験室条件下でさえ、淋菌の培養の感度は急性感染症の85〜95％の範囲であり（23）、不十分な標本収集、輸送および保存のために、慢性感染症を有する女性についてはおよそ50％に低下する（2）。NGの検出のための公知の分子生物学的方法は、リガーゼ連鎖反応（LCR）、鎖置換増幅（strand displacement amplification）アッセイおよびPCRを含む核酸増幅に基づく技術を含む（1,9,14,17,19,24,28）。これらの方法は、高い感度および特異性の双方を表すことが示されているが、これらの試験のそれぞれが、阻害剤に対するさまざまな感度；他の微生物との交差反応性、限定された処理量、高い価格および専用の装置を含む限界を有している。例えば、NGについてのCobas Amplicor試験（Cobas Amplicor CT/NG; Roche Molecular Systems, Branchburg, N.J.）は、N.スブフラバ（N.subflava）、N.シネレア（N.cinerea）およびラクトバチルス（Lactobacillus）のある株に伴う偽陽性結果を生成し、その後の確認試験が必要である（11,13,22,29）。CppBおよび16S rRNA遺伝子に基づくアッセイが確認のために用いられるが、NG株の5〜6％はCppBプラスミドを保有しておらず（6）、すべての16S rRNAに基づく試験が十分に高感度および特異的であるわけではない（11,30）。

LCx（登録商標）NGアッセイ（Abbott Laboratories, Abbott Park, IL）は、臨床標本においてNG DNAの存在を直接検出するためのLCR核酸増幅法を用いる。LCxアッセイにおける4種のオリゴヌクレオチドプローブは、NG DNAのOpa遺伝子中の特異的な標的配列を認識してハイブリダイズする（米国特許第5,427,930号参照）。オリゴヌクレオチドは、NG標的存在下で、プローブがお互いに隣接して結合するような方式で、標的配列に相補的に設計されている。そしてそれらは、その後に更なる増幅の循環の間に追加的な標的配列として働く増幅産物を形成するように、酵素的に結合され得る。LCR反応の産物が、Abbott LCx Analyzerにより検出される。

すべての髄膜炎菌および淋菌の株は、寒天プレート上での細菌の増殖中にコロニーの不透明度に貢献することからそのように呼ばれる、不透明（opacity）(opa)タンパク質を発現する（26）。それらは、およそ27kDaの塩基性の内在性外膜タンパク質のファミリーである。NGにおいては11から13種の個々のopa遺伝子が同定されているのに対し、N.メニンジティディス（N. meningitides）は、より少ない（3または4種の）opa遺伝子を有する。opa様タンパク質は、いくつかの共生ナイセリア類において同様に発現されている（27）。NGにおけるopa遺伝子は分離された座（opaAからK）に含まれ（4）、オン／オフ相の変化に供される。さまざまなopa座中の反復配列における変化が、単一の細菌におけるこの可変的な発現を結果的にもたらす（25）。opaの発現は、上皮細胞への淋菌の接着、細胞表面プロテオグリカンへの結合を通じた上皮細胞への進入（3,8,16,31,32）、および多形核リンパ球と淋菌の相互作用（15）を促進することが見出されている。さらに、opaの発現は、補体依存性殺傷に対する抵抗性を増強する（5）。

opa遺伝子は、保存された領域を含み、生理的な機能を伴うタンパク質をコードする多コピーの遺伝子であるため、本発明者らは、それらをリアルタイムPCR増幅アッセイに適した標的配列と考え、NGの検出のための特異的および高感度なPCRに基づくアッセイを開発することに着手した。opa遺伝子の5'非翻訳領域中の保存された領域を包含する配列は、NCBIデータベースより得られた。相同性に基づき、NG、N.メニンジティディス、およびN.フラバの配列が検索されて、図1に整列化された。プライマーおよび副溝結合（minor groove binding）（MGB）プローブopa-1（表1）が設計されて、Primer Expressソフトウェア（Applied Biosystems）を用いてTaqMan標準に適合化された。本発明において用いられたフォワードPCRプライマー（表1参照）は、米国特許第5,427,930号において開示されているLCRプローブ66.1と部分的に一致している。本発明によるオリゴヌクレオチドプローブopa-1は、米国特許第5,427,930号のLCRプローブ66.3の3'末端の5個のヌクレオチドと一致している。opaに基づくNG PCRアッセイを最適化するために、448例の臨床NG株のパネル（材料および方法の項を参照）が試験された。これらの448例うち、424例が、プローブopa-1を用いたTaqMan PCRにおいて陽性の蛍光シグナルを生成したが、24例は生成しなかった。しかしながら、アガロースゲル上でこれらの24例の「異常型」NG株のPCR産物を解析した際には、24例すべてが、期待された大きさの十分なPCR産物を示した。明らかに、「異常型」株の増幅されたPCR産物（アンプリコン（amplicon））は、プローブopa-1によって検出されなかった。驚いたことに、プライマーセットによって生成されたが、opa-1プローブによって検出されなかったアンプリコンの配列解析は、24例の異常型NG株すべてに対して同一の配列を正確に示した（図1に表示）。この配列は、NCBIデータベースより得られた公知のopa遺伝子の5'非翻訳領域（それらに基づいてプローブopa-1が設計された）のいずれにも存在しない、ヌクレオチド配列5'-TTTGAACC-3'の存在によって特徴付けられる。異常型株の配列は、opa-1プローブの配列と比較して2個のミスマッチおよび1個の挿入を示し、増幅された標的配列、すなわちNGの不透明タンパク質をコードする遺伝子の開始コドンの5'に位置する58位〜40位のヌクレオチド由来の領域にプローブがハイブリダイズするのを妨げるのに明らかに十分である。

そのため、これらの異常型NG株の増幅された配列を検出するために新規のプローブ（opa-2）が設計された。提供されるのは、NGのopa開始コドンの5'に位置するヌクレオチド57〜50位（標的配列とさらに呼ばれる）またはその相補配列を含むNGのopa遺伝子の5'非翻訳領域にハイブリダイズすることが可能である、ヌクレオチド配列5'-TTTGAACC-3'およびその相補配列を含むNG特異的オリゴヌクレオチドである。これは、オリゴヌクレオチドが依然その標的配列を認識し、その標的配列に結合し得るとの条件で、8個のヌクレオチドのストレッチ中の1個のヌクレオチドが別のヌクレオチドによって置換されてもよいことを意味する。好ましくは、置換は、5'末端のT残基、3'末端のC残基またはG残基の置換を含まず、これはこれらの残基がopa-1プローブとミスマッチを示し、異常型NG株の認識の要因である可能性が高いからである。

相補的な配列5'-tcagtgatggttcaaagttc-3'は、米国特許第6,617,162号より公知である。そこにおいて、それはヒトエストロゲン受容体αRNAを標的とするプライマーとして使用されている。このように、それは本発明にとって偶発的な予期として見られ得る。

「オリゴヌクレオチド」という用語は、リン結合(例えばリン酸ジエステル、アルキルおよびアリールリン酸、ホスホロチオエート)または非リン結合（例えばペプチド、スルファメートおよびその他のもの）により連結されたヌクレオチド単量体の短い配列のことを指す。オリゴヌクレオチドは、修飾された塩基(例えば5-メチルシトシン)および修飾された糖基（例えば2'-O-メチルリボシル、2'-O-メトキシエチルリボシル、2'-フルオロリボシル、2'-アミノリボシルなど）を有する修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドの長さは多様であり得る。一般的に言えば、オリゴヌクレオチドおよび相補的な標的核酸配列の間でハイブリッドが形成される機会は、オリゴヌクレオチドの長さの増大とともに増加する。他方では、ハイブリッド形成の特異性は、オリゴヌクレオチドの増大された長さとともに減少する。本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは長さが14〜40ヌクレオチド、より好ましくは16〜30ヌクレオチド、もっとも好ましくは18〜22ヌクレオチドである。特徴的な配列5'-TTTGAACC-3’は、好ましくは5'および3'末端双方において、NGのopa遺伝子の5'非翻訳領域に相補的な少なくとも1個のヌクレオチドによって隣接される。

本発明による好ましいオリゴヌクレオチドは、

またはその相補配列である。実施例において例証されるように、このオリゴヌクレオチドは、リアルタイムPCRアッセイにおいてNGの異常型株を検出するための検出プローブとして有利に使用される。

12種の異なる他のナイセリア類由来のDNAを含む、NGでない微生物のパネルを試験することによってopa-2プローブの特異性が調査された時、プローブopa-1およびopa-2を用いた際には陽性シグナルが検出されなかった（下記の実施例における項目2.3参照）。感度アッセイ（下記の実施例における項目2.4参照）は、NG DNAが8対数目盛りの範囲を超えて直線的に測定され得たことを明らかにした（図2参照）。試験された試料の大部分において1フェムトグラムのNG DNAが検出可能であった。このように、本明細書により本発明は、公知のNG株のopa配列に基づくPCRプローブを用いた際には検出されないままであったNG株の特異的および高感度な検出のためのオリゴヌクレオチドプローブを提供する。本発明のヌクレオチドプローブによって検出される異常型NG株は、16S rRNA試験またはCppB試験を用いて検出されてもよい。しかしながら、上述したように、これらの試験は通常、臨床応用に十分なほど高感度および特異的ではない。

本発明によるオリゴヌクレオチドプローブは、核酸化学の技術分野において公知である任意の標識によって標識化され得る。一つの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは一つまたは複数の検出可能な標識を含む。核酸プローブと共に使用するのに適した検出可能な標識またはタグは当業者に周知であり、放射性同位元素、発色団、フルオロフォア、化学発光および電気化学発光薬、磁気性標識、免疫性標識、リガンドおよび酵素性標識を含むが、それらに限定されない。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、一般的に高い感度および特異性で容易に検出され得るため、発色団または蛍光標識を含む。蛍光標識の例は、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、フィコエリトリン、および、6-FAM、HEX、JOE、TET、ROX、TAMRA、フルオレセイン、Cy3、Cy5、Cy5.5、Texas Red、ローダミン（Rhodamine）、Rhodamine Green、Rhodamine Red、6-カルボキシローダミン6G（6-CarboxyRhodamine 6G）、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514および6-カルボキシローダミン6Gを含む、当業者に公知のその他のフルオロフォアである。

本発明の一つの態様において、NG特異的オリゴヌクレオチドは、蛍光標識（フルオロフォア）および／または蛍光消光薬を含む。好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、フルオロフォアおよび消光薬の双方を含む。そのようなフルオロフォア／消光剤のペアを含むオリゴヌクレオチドは、リアルタイムPCRアッセイにおいてTaqMan（商標）プローブとして適当に使用される（下記も参照）。消光薬は、放射された蛍光の量を減少させる（すなわち蛍光標識の放射を消光する）ために、フルオロフォアによって放射されたエネルギーを吸収することが可能な物質である。異なったフルオロフォアは、異なった消光薬によって消光される。一般に、特定のフルオロフォア／消光薬のペアのスペクトルの特性は、消光剤の一つまたは複数の吸収波長が、フルオロフォアの一つまたは複数の放射波長と部分的に重複するようなものである。消光薬の例は、TAMRA、DABCYL、BHQ-1およびBHQ-2である。好ましいフルオロフォア／消光剤のペアは、フルオレセイン／テトラメチルローダミンである；追加的なフルオロフォア／消光剤のペアは、上記の特性に従って放射および励起波長の比較により、当業者によって選択され得る。

プローブ標識化の方法は当業者に周知であり、例えば化学的および酵素的方法を含む。オリゴヌクレオチドへの、特定の部位での反応性化学基の組み込みのための方法は、当業者に周知である。特定の部位に位置する反応性化学基を含むオリゴヌクレオチドは、化学技術によって標識をプローブに結合するために、相補的な反応基に付加される標識と化合され得る（例えば、求核性の反応基を含むオリゴヌクレオチドは、求電子性の反応基に付加される標識と反応され得る）。オリゴヌクレオチドへの標識の付加のための例示的な標識および方法は、例えば米国特許第5,210,915号; Kessler (ed.), Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules, Springer-Verlag, Berlin, 1992; Kricka (ed.) Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press, San Diego, 1992;およびHoward (ed.) Methods in Nonradioactive Detection, Appleton & Lange, Norwalk, 1993において記述されている。オリゴヌクレオチドの非特異的な化学標識化は、オリゴヌクレオチドを、例えばヌクレオチド塩基の特定の官能基と反応する化学物質と化合させ、同時にまたはその後に、オリゴヌクレオチドを標識と反応させることによって達成され得る。例えば、Draper et al.(1980) Biochemistry 19:1774-1781を参照されたい。オリゴヌクレオチドへの標識の酵素的な組み込みは、標識化された前駆体を用いてオリゴヌクレオチドの酵素的修飾または重合を実施すること、または既存のオリゴヌクレオチドに酵素的に標識を付加することによって達成され得る。例えば、米国特許第5,449,767号を参照されたい。修飾する酵素の例は、DNAポリメラーゼ、逆転写酵素、RNAポリメラーゼなどを含むが、それらに限定されない。既存のオリゴヌクレオチドに標識を付加し得る酵素の例は、キナーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、リガーゼ、グリコシラーゼなどを含むが、それらに限定されない。

PCRのような高い温度、または耐熱性の酵素を利用するその他の手順を含む増幅アッセイにおける使用のためには、標識は高い温度で安定であろう。重合を含むアッセイのためには、標識は重合酵素の活性に干渉しないようなものであろう。標識はオリゴヌクレオチドの5'および／または3'末端に存在し得、および／または内部に存在してもよい。標識はオリゴヌクレオチドの任意の塩基、糖、およびリン酸部分に、または自身がこれらの部分の一つに付加される任意の結合基に付加され得る。

もう一つの好ましい態様において、本発明によるオリゴヌクレオチドプローブは、副溝結合（MGB）オリゴヌクレオチド抱合体である。副溝結合プローブは、一本鎖DNA標的と安定な二本鎖を形成し、それによってより大きな識別力を有する短いプローブがハイブリダイゼーションに基づくアッセイにおいて使用されることを可能にする。好ましくは、MGB部分は、1,2-ジヒドロ-(3H)-ピロロ[3,2-e]インドール-7-カルボキシレート(CDPI3)の三量体およびN-メチルピロール-4-カルボキシ-2-アミド（MPC5）の五量体からなる群より選択される。

もう一つの態様において、本発明のNG特異的オリゴヌクレオチドにおけるグアノシンは、イノシンに置換される。MGBオリゴヌクレオチド抱合体におけるグアノシンに対するイノシンの置換は、ハイブリッドの安定性を増強し得ることが発見されている。任意の特定の理論に束縛されることを望まないが、イノシン置換は副溝の局所的な形状をMGBとの相互作用にとってより好都合にし、それによってMGBと副溝の相互作用の強さを増加させる可能性がある。

もう一つの局面において、本発明は、本発明によるオリゴヌクレオチドの使用を含む、NG株を検出するための方法を提供する。好ましい態様において、本明細書において提供された検出方法はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を含み、該方法は以下の段階を含む：a)NG株のDNAまたは該NG株のDNAを含むことが疑われる試験試料を提供する段階；b)核酸増幅プライマー対を用いて、opa開始コドンの5'に位置する57〜50位のヌクレオチドを含むopa遺伝子の5'非翻訳領域を増幅する段階；c)NGの存在の指標として増幅産物の存在を検出する段階。本発明によるオリゴヌクレオチドは、そのようなPCRアッセイにおいてプライマーとして使用され得る。本明細書において使用される「プライマー」という用語は、核酸鎖に相補的であるプライマー伸張産物の合成が誘導される条件下、すなわち、ヌクレオチドおよびDNAポリメラーゼのような重合のための試薬が存在し、適当な温度およびpHに置かれた場合に、増幅標的にアニーリングすることが可能であり、DNAポリメラーゼを付着させることを可能にし、それによってDNA合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドを指す。（増幅）プライマーは、増幅における最大の効率のために好ましくは一本鎖である。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシヌクレオチドである。プライマーは、重合のための試薬の存在下で伸張産物の合成の準備を行うために、十分に長くなければならない。

増幅産物の検出は、原則として、当技術分野において公知である任意の適当な方法によって達成され得る。産物は、直接染色されてもよいし、または放射性標識、抗体、発光色素、蛍光色素、もしくは酵素試薬で標識されてもよい。直接DNA染色は、例えば、アクリジンオレンジ、SYBR Green、エチジウムブロマイド、エチジウムモノアジドまたはHoechst色素のようなインターカレート（intercalating）する色素を含む。または、DNA断片は、合成されたDNA断片への標識されたdNTP塩基の組み込みによって検出されてもよい。ヌクレオチド塩基と結合される可能性がある（蛍光）検出標識は、例えばフルオレセイン、シアニン色素またはBrdUrdを含む。しかしながら、本発明のオリゴヌクレオチドを用いてNGを検出するためのPCRに基づく方法は、好ましくは、反応産物が一つまたは複数の特異的な検出プローブにハイブリダイズすることによる、上述のDNA増幅反応によって得られた増幅産物の検出であって、本発明のオリゴヌクレオチドが検出プローブとして使用される、検出を含む。「プローブ」という用語は、標的核酸配列において相補的な配列を認識し、水素結合二本鎖を形成するであろう一本鎖オリゴヌクレオチド配列のことを指す。本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、opa開始コドンの5'に位置する57〜50位のヌクレオチドを含むopa遺伝子の5'非翻訳領域を含むPCR反応産物を検出するために使用され得る。好ましくは、増幅プライマーは、プローブ（例えばプローブopa-2）によって検出される標的配列に隣接するような方法で設計される。本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いる、本発明のNG検出方法において特に使用されるのは、フォワードプライマーopa-Fwおよびリバースプライマーopa-Rvからなるプライマーセットである（表1参照）。このプライマーセットは76ヌクレオチドの反応産物を結果として生じ、opa開始コドンの5'に位置する57〜50位のヌクレオチドのストレッチが、5'末端で約40ヌクレオチド、および3'末端で約35ヌクレオチドによって隣接される。反応産物は、本発明のプローブopa-2によって成功裡に検出された。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドを（プライマーまたはプローブとして）使用する核酸増幅アッセイは、リアルタイム定量的（RQ）PCR解析を含む。RQ-PCRは、古典的なPCR終了点定量とは完全に対照的である、PCR増幅過程の指数関数相の間のPCR産物の正確な定量を可能にする。引き続く各PCRサイクルの間および／または後の蛍光シグナルのリアルタイムの検出のために、定量的なPCRデータが短い時間で得られることが可能であって、PCR後の過程は必要なく、それによってPCR産物の汚染のリスクを徹底的に減少させる。本発明による核酸増幅アッセイは、ABI PRISM Sequence detection system、ROCHE DIAGNOSTICSによるLightCycler & LightCycler 2.0 Instrument、Idaho TechnologyによるRapidCycler、Idaho TechnologyによるLightCycler、Rotor-Gene、SmartCycler、iCycler & MyiQ Cycler、Mx4000 & Mx3000P、Opticon & Opticon 2、Techne Quantica System、ATC-901、InSyte Thermal Cycler、Notebookthermal cyclerを含む、リアルタイムPCR装置の任意のタイプを用いて行われ得る。RQ-PCR技術は、典型的には、PCR過程の間に連続的にPCR産物の蓄積を検出し、それによってPCRの初期の指数関数相における容易かつ正確な定量を可能にするために、ABI Prism 7000、7700、7900HT、7300、または7500器械（TaqMan（登録商標））を用いる。いくつかのABI Prism sequence detection systemは96ウェルPCRトレイフォーマットにおける各ウェルに接続する、光ファイバーシステムを用いる。PCR増幅の間にリアルタイムデータを生成するために、レーザー光源が各ウェルを励起して、CCDカメラが各ウェル由来の蛍光スペクトルおよび強度を測定する。ABI Prism 7000のような、その他のABI Prism sequence detection systemは、蛍光を測定するために、励起源としてのタングステン‐ハロゲンランプ、フレネルレンズおよびCCDカメラを用いる。ABI Prismソフトウェアは、増幅の過程を通して、レポーターおよび消光剤色素の蛍光強度を検査し、標準化されたレポーター放出強度における増加を計算する。そして結果が、PCR増幅の連続的な測定を生成するために、サイクル数によって表される時間に対してプロットされる。各PCR反応において初期標的の正確な定量を提供するために、増幅プロットは産物蓄積の初期対数相の間の点において検査される。これは、バックグラウンドより上の蛍光閾値を割り当て、各試料の増幅プロットが閾値に達する時点（閾値サイクル数またはCTとして定義される）を決定することによって達成される。

現在では、RQ-PCR技術は3種類の主要なタイプに分類され得る；インターカレートする色素を使用するもの、いわゆる加水分解（例えばTaqMan）プローブを用いるもの、およびハイブリダイゼーション（例えばLightCycler）プローブを用いるものである。一つの態様において、本発明の検出に係るオリゴヌクレオチドは、インターカレートする色素SYBR Green Iを用いるPCRアッセイにおいてプライマーとして用いられる。この色素は、二本鎖DNAの副溝に結合することが可能であり、その蛍光を顕著に増強する。連続的なPCRサイクルの間に、二本鎖PCR産物の量は指数関数的に増加するであろうし、そしてそのためにより多くのSYBR Green I色素が結合して（520nmでの）蛍光を放出することが可能である。SYBR Green Iに基づくPCR産物の検出は、配列特異的ではなく、結果として非特異的に増幅されたPCR産物およびプライマー二量体も検出されるであろうことが、注意されるべきである。SYBR-Green Iに加えて、他の色素もAmplifluorのような非特異的検出システムにおいて使用され得る。

好ましい態様において、本発明の方法は、本発明による加水分解プローブを伴うRQ-PCRを用いる、NG株の検出および定量を含む。このタイプのRQ-PCRは、反応の進行とともに特異的なPCR産物を検出し、かつ定量化するために、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）（Taq）ポリメラーゼの5'→3'エクソヌクレアーゼ活性を活用する。TaqManプローブまたは二重色素オリゴヌクレオチドプローブとも称される加水分解プローブは、消光剤（Q）蛍光色素（例えばTAMRA）と同様にレポーター（R）蛍光色素（例えばFAM、VICまたはJOE）と共役する。消光剤蛍光色素は、プローブが完全である限り、レポーター蛍光色素の蛍光を吸収する。しかしながら、標的配列、すなわちNGのopa遺伝子の5'非翻訳領域の増幅と同時に、Taqポリメラーゼによって加水分解プローブが置換され、その後加水分解される。これがレポーターおよび消光剤蛍光色素の分離を結果として生じ、その結果としてレポーター蛍光色素の蛍光が検出可能になる。連続的な各PCRサイクルの間に、遊離のレポーター蛍光色素の連続的および指数関数的蓄積のため、この蛍光が更に増加するであろう。

本発明のまた更なる態様において、NGを検出するアッセイは、ハイブリダイゼーションプローブを用いるRQ-PCR解析を含む。そのようなアッセイにおいては、二つの並列する配列特異的なプローブが用いられ、そのうち一つは本発明によるオリゴヌクレオチドであり、一つのプローブは3'末端で供与体蛍光色素（例えばFAM）で標識され、もう一つのプローブはその5'末端で受容体蛍光色素（例えばLC Red640、LC Red705）で標識される。双方のプローブは、増幅されたDNA断片上で接近して並列する標的配列にハイブリダイズすべきであり、それによって二つの蛍光色素が極めて近接して（すなわち1〜5ヌクレオチド以内）、放出された供与体の光が受容体を励起するであろう。これが結果として蛍光の放出をもたらし、その後PCR反応のアニーリング相および伸長相の初めの部分の間に検出され得る。連続的な各PCRサイクルの後に、より多いハイブリダイゼーションプローブがアニーリングすることが可能であり、結果的により高い蛍光シグナルを生じる。

上述された3種類の主要なRQ-PCRアプローチに加えて、分子ビーコン（beacon）、Scorpions、ResonSense、Hy-Beacon、およびLight-upプローブを含む、本発明によるオリゴヌクレオチドプローブのその他のタイプも使用されてよい。

述べられたように、opa-Fwおよびopa-Revからなるプライマーセットは、opa-2検出プローブとの組み合わせで、opa-1検出プローブでは検出されなかった異常型NG株の検出を結果として生じた。非異常型NG株のパネルがopa-2プローブを用いて試験されたとき、すなわちそれらの株はopa-1プローブで陽性と試験されるが、21例のうちたった1例のみがプローブopa-2で同様に陽性を示すことが判明した。この結果は、その特定の株におけるopa-1およびopa-2配列の存在を示す（データは示していない）。このように、本発明の方法において非異常型および異常型NG株の双方を検出するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、プローブopa-1のような非異常型NG株のPCRアンプリコンを検出することが可能であるプローブとの組み合わせで使用されることが好ましい。閾値サイクル（Ct）値は、プローブopa-2よりもプローブopa-1を用いた方が10倍高いシグナルを示す。

以下に例証されるように、本発明は、臨床試料を含む試料におけるNGの診断のために有利に使用される。NGの感染は、ヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus）（HIV）感染に対するリスクを増加することが公知である。性感染病（sexually transmitted disease）（STD）への以前の感染による、HIV感染の増加したリスクに対するオッズ比推定値は、NGについて3.5〜9.0である。NGの感染は、HIV血清転換の増加したリスクとも関連づけられる可能性がある。双方の感染が診断されず、かつ／または処置されずに進行する罹患率と連関する、双方の感染の高い発病率は、より大きな性感染病（STD）スクリーニングの必要性を強調する。本発明は、以前には検出されないままであったNG株を認識する新規のオリゴヌクレオチドを供給し、（臨床）検体におけるNGの検出のための、および／または、特異性がより低いNG試験の確認のための、高感度、特異的、半定量的な、および信頼度が高いアッセイを、今や提供する。

NGの予防および制御を導き得る有効なスクリーニングおよび診断のためには、15〜21歳の独身女性のスクリーニング、ならびに診断および処置を要求する可能性が低い徴候性患者における検出に、注意が払われるべきである。

また本明細書において提供されるのは、NGのopa開始コドンの5'に位置する57〜50位のヌクレオチドを含む領域を増幅することが可能である核酸増幅プライマー対および少なくとも一つの検出プローブを含み、少なくとも一つのプライマーまたは検出プローブが本発明によるオリゴヌクレオチドである、NG株の検出のためのキットである。上記で示されたように、オリゴヌクレオチドは検出可能な標識および／またはMGB部分と共に提供されてもよい。一つの態様において、本発明のキットは、本発明によるオリゴヌクレオチドプライマーを含む。好ましい態様において、キットは、本発明によるオリゴヌクレオチド検出プローブ、好ましくはプローブopa-2を含む。最も好ましくは、キットは、本発明によるオリゴヌクレオチド検出プローブ、ならびにプライマーopa-Fwおよびopa-Rvを含む。好ましくは、本発明のキットは、検出プローブopa-1および／またはポリメラーゼ、好ましくはTaqポリメラーゼを更に含む。

実験項
本発明を更に例証するために、本発明によるオリゴヌクレオチドが臨床試料におけるNGの特異的および高感度な検出のために有利に用いられることが、以下に示される。

1. 材料および方法
1.1 448例のNG株のパネル．2002年9月〜2003年4月に、淋病を示す病訴を有する患者がアムステルダムにあるSTI（性感染症）クリニックを訪れ、そこで臨床および疫学データが登録されて試料が取得された。尿道、子宮頸部、直腸または扁桃の検体が、GC-Lect寒天プレート（Beckton-Dickinson）に播種するのに用いられた。培養およびNGの決定は、アムステルダムの公衆衛生研究所（the Public Health Laboratory）で記述されたように行われた（6,7）。地域社会の疫学研究の関係において、NG株は、真のNG株がDNA単離に用いられたことを更に確認する、opaおよびpor遺伝子のPCR-RFLPによって分類された（18,21）。

1.2 122例のCobas amplicor（商標）陽性の臨床試料のパネル．2003年1月〜2004年3月にGelre Hospital（Apeldoorn, The Netherlands）によって供与された地域の患者由来の合計3957例の臨床試料が、Cobas amplicor（商標）においてNGの存在について解析された。122例の試料（3.1％）がNGに対して陽性を示した。これらの試料は、36例の尿、8例の尿道、47例の子宮頸部、29例の咽喉、および2例の肛門試料よりなり（表3A）、リアルタイム16S rRNA試験およびopaアッセイにおいて更に解析された。

1.3 Quality Control for Molecular Diagnostics NG 2003パネル．NGの検出に対する核酸増幅技術の性能を評価するために、精度管理パネルがQCMD Working Party on Sexually Transmitted Disease（Chair Jurjen Schirm, Groningen, The Netherlands）によって設計された。パネルは凍結乾燥尿試料からなっていた。QCMDによって指示されたように、1.2mlの水が凍結乾燥材料を溶解するのに用いられた。検体は尿として処理された（以下に記述）。

1.4 核酸抽出
細菌株．448例のNG株パネルからの核酸の単離については、DNAが数個のコロニーよりイソプロパノール沈殿を用いて単離され、続いて沈殿が50μlの10mM Tris-HCl、pH8.0（T10; (6,20)）に溶解されて、T10で10,000倍に希釈された。5μlがPCR反応に添加された。その他の細菌株からの核酸の単離については、細菌がおよそ0.5 MaFarland（http://biology.fullerton.edu/courses/biol 302/Web/302labf99/quant.html#mcfar参照）の懸濁液となるようにTE（10mM Tris-HCl緩衝液pH=8.0中の1mM EDTA）に懸濁されて、15分間、100℃でインキュベーションされた。リアルタイムPCRにおいて直接解析された際の低いCt値のために（12〜14は高いDNAロードを示す）、TEでの1000分の1希釈物が調製されて解析された。5μlが各PCRに添加された。

122例のCobas amplicor（商標）NG陽性臨床試料のパネル．1〜1.5mlの尿が15分、13,000rpmで遠心分離された。上清が廃棄され、およそ100μlが沈殿上に残された。Amplicor STMおよび2-SP培地（Rocheにより納入された培地）における試料は、直接処理された。DNAは100μlの材料より、DNA Isolation Kit III (Bacterial Fungi; Roche Diagnostics Nederland BV Almere, The Netherlands)およびMagnaPure LC Isolation station (Roche Diagnostics Nederland BV Almere, The Netherlands)を用いて、正確に製造業者によって記述されたとおりに単離された。核酸は、最終容量100μlで溶出された。単離物は、Cobas amplicor（商標）、16S rRNA確認試験およびopaに基づくNGアッセイのために分割され、すべて同一の日に実施された。25μlがCobas amplicor（商標）に添加され、5μlが16S rRNA試験に添加され、かつ10μlがopa-PCR反応に添加された。

その他の臨床試料．乾燥尿道または子宮頸部スワブ（プラスチックミニチップスワブ185CS01, Copan, AMDS-benelux, Malden, The Netherlands）は500μlのTE中に置かれ、30分間、97℃でインキュベーションされて、1分間、8,000rpmで遠心分離された。10μlがPCRにおいて用いられた。尿試料について：1mlが10,000rpmで15分間遠心分離され、上清が除去された。残った沈殿が300μlのTEに溶解されて、30分間97℃でインキュベーションされた。10μlがPCRにおいて用いられた。

PCRにおいて阻害が起きた場合には（下記参照）、DNAは、10μlのアザラシヘルペスウイルス（PhHV）が添加された190μlの試料より、Qiagen Blood Kitを用いて、製造業者の指針に従い、プロテアーゼ処理を省略し、かつ50μlで溶出して、単離された。10μlがPCR反応において用いられた。

1.5 PCR阻害対照
リアルタイムNG検出をモニターするために、およそ30の閾値サイクル（Ct）値に相当する、mlあたりおよそ5,000〜10,000DNAコピーの最終濃度でPhHV-1が添加されたすべての試料について、独立したPCRが実施された（29）。Ctが平均±2標準偏差の範囲内であれば、PCRは阻害がないと考えられた。

1.6 opaに基づくNGアッセイ．20mM TrisHCl pH8.4、50mM KCl、3mM MgCl2（Platinum Taq polymeraseと共に納入された10x PCR緩衝液より調製された）、0.75U Platinum Taq Polymerase（Invitrogen BV, Breda, The Netherlands）、4％グリセロール（分子生物学用グレード; CalBiochem, VWR International B.V., Amsterdam, The Netherlands）、200μMの各dNTP（Amersham Bioscience, Roosendaal, The Netherlands）、0.5μl Rox Reference Dye（Invitrogen BV）、150nM プローブopa-1、指示されたときには150nM プローブopa-2（Applied Biosystems, Nieuwerkerk a/d IJssel, The Netherlandsにより合成された）、300nM opa Fwプライマーおよび300nM opa Rvプライマー（Sigma-Genosys Ltd, Haverhill, United Kingdom）ならびに5〜10μlの試料（448例のNG株パネルを解析する際には5μl DNAが用いられた；その他のすべてのアッセイには10μlが用いられた）を含む、25μlのPCRが行われた。

ABI Prism sequence detection system 7000（Applied Biosystems, Nieuwerkerk a/d IJssel, The Netherlands）が、増幅および検出に用いられた（2分50℃、10分95℃、15秒95℃および60秒60℃の45サイクル）。

1.7 NGについてのCobas amplicor（商標）試験．Cobas amplicor（商標）試験は、製造業者の使用説明書に従って行われた。

1.8 16S rRNA確認試験は二箇所の独立した実験室において行われた。プライマー

が、379bpの断片を増幅するために用いられ、かつ、プローブ

が、PCR産物を検出するために用いられた（Boel E et al., 原稿準備中）。25μlのPCRは、1x LC Mastermix（LC DNA Master Hybridisation Probes kit, Roche Diagnostics Nederland BV Almere, The Netherlands）中に、250nMの各プライマーおよびプローブ、4mM MgCl2を含んだ。LightCycler 2.0（Roche Diagnostics Nederland BV Almere, The Netherlands）が、増幅および検出に用いられた（10分95℃、ならびに、5秒95℃、10秒55℃、および20秒72℃の45サイクル；融解曲線20秒95℃、10秒35℃、1秒あたり0.2℃の勾配で85℃；冷却30秒40℃）。

1.9 PhHVの検出．PhHVは記述されたように検出された（29）。

1.10 配列解析．以下が増幅に用いられた。

PCRは上述のように実施された。PCR産物は、20μlのPCR産物への4μlの混合されたエクソヌクレアーゼI(10U/mL)およびシュリンプアルカリホスファターゼ（2U/μl、USB Corporation, Amersham Bioscience, Roosendaal, The Netherlands）の添加、37℃で15分のインキュベーション、続いて15分80℃の不活性化（PTC-200 thermocycler, MJ Research, Biozym TC bv, Landgraaf, The Netherlands）によって精製された。断片は、M13プライマーを用いて配列決定された。20μlの反応は、5μlの精製されたPCR産物、4μl BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Mix（Applied Biosystems）および7.5pmolのフォワードまたはリバースプライマーを含んだ。96℃で10秒、50℃で5秒、および60℃で2.5分の25サイクルが実施され、産物は、ABI Prism 3700 DNA Analyzer（Applied Biosystems）上で解析される前に、Sephadex（G-50 Superfine）を通して精製された。24例の各「異常型」NG株について、一つのフォワードおよび一つのリバース配列が決定された。

1.11 感度．NG細菌（ATCC 49226）は、0.96 McFarlandの懸濁液になるようにTE緩衝液に再懸濁され、15分間100℃でインキュベーションされた。内部対照として10μlのPhHVが添加された190μlの細菌懸濁液より、Qiagen Blood Kitを用いて、製造業者の指針に従い、プロテアーゼ処理を省略して、DNAが単離された。DNAは50μlで溶出され、分光光度的に（Eppendorf BioPhotometer）決定されたDNA量は、18.85ng/μl（1:1希釈：A260:0.192、A280:0.107、溶出液の濃度＝18.6ng/μl、1:4希釈：A260:0.099、A280:0.056、溶出液の濃度＝19.1ng/μl）であった。10μg/mL〜100fg/mLを含む、10倍連続希釈が作成された。各希釈の10μlが、二連のPCR反応に用いられた。1個のNGゲノムは、およそ2.45fg（2,2 x 10⁹ bp (10) x 665 da/bp x 1.67 x 10-24 g/da）の重さである。

2．結果
2.1 プライマーおよびプローブの設計．opa遺伝子の5'非翻訳領域中の保存された領域をカバーする配列は、NCBIデータベースより得られた。相同性に基づき、NG、N.メニンジティディス、およびN.フラバの配列が検索されて、図1に整列化された。プライマーおよび副溝結合（MGB）プローブopa-1（表1）が設計されて、Primer Expressソフトウエア（Applied Biosystems）を用いてTaqMan標準に適合化された。副溝結合プローブは、一本鎖DNA標的と安定な二本鎖を形成し、それによって短いプローブがハイブリダイゼーションに基づくアッセイに使用されるのを可能にする。

2.2 opaに基づくNGアッセイの最適化．448例の臨床NG株のパネル（材料および方法の項を参照）のうち、424例は、プローブopa-1を用いたTaqMan-PCRにおいて陽性の蛍光シグナルを生成したが、一方24株の蛍光シグナルは検出不可能なままであった。しかしながら、アガロースゲル上で24例の異常型NG株のPCR産物を解析した際には、24例すべてが、期待された大きさの十分なPCR産物を示した。明らかに、異常型株のPCR産物は、プローブopa-1によって検出されなかった。PCR産物の配列決定は、24株すべてにおいて、同一の配列を正確に示した（図1に表示）。MGBプローブopa-2は、この配列をカバーするように設計され、かつopa遺伝子に基づくNGアッセイに含められた。opa遺伝子は多コピーの遺伝子であるため、24例の異常型NG株のPCR産物において唯一の配列を検出したことは、幾分本発明者らを驚かせた。本発明者らは続いて、プローブopa-2のみを伴うNGアッセイを用いて、上記のパネル由来の非異常型NG株の21例由来のDNAを解析した。21例のうち1例がプローブopa-2で同様に陽性を示し、その特定の株におけるopa-1およびopa-2配列の存在を示した（データは示していない）。閾値サイクル（Ct）値は、プローブopa-2よりもプローブopa-1を用いた方が10倍高いシグナルを示す。

2.3 特異性．448例のNG株の検出に加えて、NGアッセイの特異性が、12種の異なる他のナイセリア類由来のDNAを含む、NGでない微生物のパネル（表2）を試験することによって、更に評価された。プローブopa-1およびプローブopa-2を用いて試験された任意の微生物において、opaリアルタイムPCRにおけるシグナルは観察されなかった。このように、記述されたopaに基づくNGアッセイは、NG株に特異的であり、他のナイセリア類にも、これまで試験された他の任意の微生物にも、交差反応性を示さない。

2.4 感度．二つの方法が、opaアッセイにおいてなお検出可能なゲノムの数を計算するのに用いられた。NG ATCC株49226より、材料および方法の項に記述されたように、DNAが抽出され、検出不可能なレベルまで希釈された。もとの細菌懸濁液のMcFarland値および1McFarlandが3 x 10⁸細菌／mlに相当するとの仮定に基づくと、0.06細菌ゲノムが、6反応中4反応においてなお検出可能であった。しかしながら、McFarland標準は細菌の濁度を測定し、細菌の量の測定としてはかなり不正確である。細菌の数を定量化するより正確な方法は、DNA量を測定し、かつゲノムの重量に基づいて細菌の数を計算することによる。DNAは、材料および方法の項に記述されたように分光光度的に定量化され、mlあたり100fg〜10μgDNAの範囲の10倍連続希釈が作製されてopaアッセイにおいて増幅された。NG DNAは、8対数目盛りの範囲を超えて直線的に測定され得た（図2）。プローブopa-1およびopa-2がPCRにおいて存在した際には、PCR効率は93％であると計算された（効率はプローブopa-1のみを用いた際には98％であった）。1fgのNG DNA（0.41NGゲノムに相当）が、6反応中4反応において検出可能であった。

2.5 臨床試料．opaアッセイの臨床上の性能を試験するために、15ヶ月の間に、一連の3957例の臨床試料からNGについてのCobas amplicor（商標）試験において陽性を示した122例の臨床試料が収集された（表3A）。これらの122例の試料は、尿、咽喉、子宮頸部、尿道、および肛門スワブを含んでいた。試料は、二つの独立した実験室において、16S rRNA確認試験およびopaに基づくNGアッセイで解析された。双方の実験室が、16S rRNA試験で正確に同一の結果を取得した。3試験すべてにおいて、36試料が陽性と判明し、83試料が陰性であった（表3Bは生データを示し、表3Cはこれらの結果を要約する）。これは、Cobas amplicor（商標）試験がその後の確認を必要とする偽陽性結果を生じるという認識を確認する。16S rRNA試験において陰性であった残りの3試料は、opaアッセイにおいて陽性であった。3試料がopaアッセイにおいて最も高いCt値を示したという事実は（35,35,および37）、矛盾が16S rRNA PCRおよびopaアッセイの検出レベルにおける差異による可能性があることを示唆した。そのため、本発明者らは、同一の日に双方のアッセイにおいてNG DNAの希釈系列を解析した。この試験の結果は、opa-PCRの利点において16S rRNA PCRとopa-PCRとの間の感度における10倍の差異を示した（表4；差異は、DNA投入容量を考慮に入れると5倍である）。この一連の3957例の臨床試料において、opa試験は16S rRNA PCRよりも8％多い陽性を検出した。

2.6 Quality Control for Molecular Diagnostics（QCMD, Glasgow, UK）パネル2003年11月．QCMDパネルが2003年11月に配布された。パネルはCobas amplicor（商標）において解析され、6試料が、二箇所のRocheによって指名されたオランダにおけるNGについての参照実験室に送付された。加えて、パネルは16S rRNA試験およびopaに基づくアッセイにおいて解析された。結果が表5に示される。試料NG03-04は、Cobas amplicor（商標）試験において見落とされた。試料NG03-05およびNG03-07は、Rocheによって指名されたオランダにおける参照実験室双方での確認試験において見落とされた。試料NG03-08およびNG03-09は二箇所の参照実験室のうち一箇所において見落とされた。対照的に、opaアッセイはNGを含むすべての試料を検出した。試料NG03-04およびNG03-07（QCMDにより陽性（＋／−）として示された）の閾値サイクルはそれぞれ33.2および33.5であり、アッセイの良好な検出限界を示した。

（表１）リアルタイムNG検出に用いられたプライマーおよびプローブの配列。

（表２）種々のナイセリア種およびその他の微生物を用いたopaに基づくNGアッセイ（プローブopa-1およびopa-2）の反応性。

¹ATCC, American Type Culture Collection; NRBM, Netherlands Reference Laboratory for Bacterial Meningitis. SKMM, Dutch Organization for Quality Control in Medical Microbiology.
²Amsterdam Medical Center, Academic Medical Center, Dept. Medical Microbiology, Amsterdam
³(6), GG&GD, Municipal Health Service, Amsterdam, The Netherlands.
⁴Vitek NHI(Vitek Systems, Inc., Hazelwood, Mo.)によって決定され、NRBMによって確認された。
⁵Special Reference Department for Identification of Bacteria (LIS-BBD), National Institute of Public Health and the Environment (RIVM), The Netherlands.
⁶API-Coryne (Biomerieux, Boxtel, The Netherlands)によって決定された。
⁷PathoDx latex Strep Grouping Kit (Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, Calif.)によって決定された。
⁸Staphaurex≪ Plus (Remel Inc., Lenexa, KS)によって決定され、National Institute of Public Health and the Environment (RIVM), The Netherlandsによって確認された。

（表３）NGについてのCobas amplicor（商標）試験において陽性を示した122例の臨床材料での16S rRNA NG試験およびopaアッセイの評価。16S rRNA確認試験は、二箇所の実験室で行われた：Medical Microbiology and Infectious Diseases, Apeldoorn, Netherlandsおよびオランダにおけるロシュのためのクラミジア・トラコマチスおよびNG試験についての参照実験室。（A）パネルの構成；（B）解析の結果；（C）結果の要約。
A

^＊正確に同一の結果が二箇所の独立した実験室において得られた。

（表４）16S rRNA試験およびopaアッセイの感度の比較。数字は閾値サイクル数（CT）に相当する。

（表５）QCMD NGパネル2003年11月の評価。

＞4,000：4,000を超えるシグナル

参照文献

プライマーおよびプローブの設計。NCBIデータベースより検索されたopa遺伝子開始コドン5'の92〜16塩基の配列。薄い灰色の四角はプライマーの位置を示し、濃い灰色の四角はプローブの位置を示す（配列は上の行に従う）。プローブopa-1およびopa-2を用いたopaに基づくリアルタイムPCRにおいて解析された、ATCC株49226より得られたNG DNAの100fg〜10μg/mL由来の、二連の10倍連続希釈の蛍光プロファイル。 Ct値より計算された標準曲線：y = -3,51^*log(x) + 39,341; R² = 0,995.

Claims

配列5'-TTTGAACC-3'、またはその相補配列を含むヌクレオチド配列を含み、ナイセリア・ゴノレア（Neisseria gonorrhoeae：NG）のopa遺伝子の5'非翻訳領域またはその相補配列にハイブリダイズすることが可能であり、12〜40ヌクレオチドの長さであり、ただし該配列が5'-tcagtgatggttcaaagttc-3ではないことを条件とする、ナイセリア・ゴノレア特異的オリゴヌクレオチド。
14〜30ヌクレオチドの長さである、請求項1記載のナイセリア・ゴノレア特異的オリゴヌクレオチド。
16〜25ヌクレオチドの長さである、請求項2記載のナイセリア・ゴノレア特異的オリゴヌクレオチド。
18〜22ヌクレオチドの長さである、請求項3記載のナイセリア・ゴノレア特異的オリゴヌクレオチド。
ヌクレオチド配列5'-CTT TGA ACC ATC AGT GAA A-3'またはその相補配列（プローブopa-2）を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
一つまたは複数の検出可能な標識、発色団標識、または蛍光標識を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
6-FAM（商標）、HEX（商標）、JOE（商標）、TET（商標）、ROX（商標）、TAMRA（商標）、フルオレセイン（商標）、Cy3（商標）、Cy5（商標）、Cy5.5（商標）、Texas Red（商標）、ローダミン（商標）、Rhodamine Green（商標）、Rhodamine Red（商標）、6-カルボキシローダミン 6G（商標）、Oregon Green（商標） 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、DABCYL（商標）、BHQ（登録商標）-1およびBHQ-2からなる群より選択される標識を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
副溝結合（MGB）オリゴヌクレオチド抱合体である、請求項1〜7のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
MGBが1,2-ジヒドロ-(3H)-ピロロ[3,2-e]インドール-7-カルボキシレート（CDPI3）の三量体およびN-メチルピロール4-カルボキシ-2-アミド（MPC5）の五量体からなる群より選択される、請求項8記載のオリゴヌクレオチド。
請求項1〜9のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドの使用を含むナイセリア・ゴノレア株を検出するための方法。
核酸増幅を含む、請求項10記載の方法。
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を含み、以下の段階を含む方法であって、少なくとも一つのプライマーまたは少なくとも一つの検出プローブが請求項1〜9のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドである、請求項10または11記載の方法：
a）NG株のDNAまたは該NG株のDNAを含むことが疑われる試験試料を提供する段階；
b）核酸増幅プライマー対を用いて、opa開始コドンの5'に位置する57〜50位のヌクレオチドを含むopa遺伝子の5'非翻訳領域を増幅する段階；および
c）NGの存在の指標として増幅産物の存在を検出する段階。
PCR技術がリアルタイム定量的PCR（RQ-PCR）技術である、および/または、増幅産物の存在が、増幅産物にハイブリダイズすることが可能である少なくとも1つの検出プローブを用いて検出される、請求項12記載の方法。
プライマー対が、ヌクレオチド配列5'-GTT GAA ACA CCG CCC GG-3'(opa Fw)および5'-CGG TTT GAC CGG TTA AAA AAA GAT-3'(opa Rv)を含む、請求項12または13記載の方法。
検出プローブが、ヌクレオチド配列5'-CTT TGA ACC ATC AGT GAA A-3'を含む、請求項12または13記載の方法。
追加的な検出プローブが用いられ、該検出プローブが、ヌクレオチド配列5'-CCC TTC AAC ATC AGT GAA A-3'を含む、請求項15記載の方法。
臨床試料におけるナイセリア・ゴノレアの存在の検出のための、請求項10〜16のいずれか一項記載の方法の使用。
ナイセリア・ゴノレアopa遺伝子の開始コドンの5'に位置する57〜50位のヌクレオチドを含む領域を増幅することが可能である核酸増幅プライマー対、および少なくとも一つの検出プローブを含むナイセリア・ゴノレア株の検出のためのキットであって、少なくとも一つのプライマーおよび／または検出プローブが、請求項1〜9のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドである、キット。
ポリメラーゼを更に含む、請求項18記載のキット。
プライマー5'-GTT GAA ACA CCG CCC GG-3'(opa Fw)および5'-CGG TTT GAC CGG TTA AAA AAA GAT-3'(opa Rv)、ならびに検出プローブ5'-CTT TGA ACC ATC AGT GAA A-3'(opa-2)を含む、請求項18または19記載のキット。
検出プローブ5'-CCC TTC AAC ATC AGT GAA A-3'(opa-1)を更に含む、請求項20記載のキット。