JP5523327B2 - 統合型マイクロ流体デバイスおよび方法 - Google Patents
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Description
本発明は、マイクロ流体工学の分野ならびに生化学および分子生物学の分野におけるマイクロ流体工学の応用に関する。本発明はさらに、統合型マイクロ流体プラットフォーム装置および関連の方法に関する。本発明はまた、核酸など、対象の生物学的分子を調製、増幅、および検出するためのマイクロ流体デバイスにも関する。本発明はまた、マイクロ流体デバイスを用いて、核酸など、対象の生物学的分子を調製、増幅、および検出する方法にも関する。
本出願は、参照によりその全体において本明細書に組込まれる、2007年10月12日出願の同時係属米国特許仮出願第60/979,515号の優先権およびその利益を主張する。
該当なし。
該当なし。
分子生物学は、核酸およびタンパク質などの高分子の形成、構造、および機能、ならびに細胞による遺伝情報の複製および伝達におけるそれらの役割のほか、生物のゲノム内で核酸を配列決定し、突然変異させ、さらに操作して、突然変異の生物学的効果を研究しうるような核酸の操作も取り扱う生物学の分野として広く定義することができる。
「マイクロ流体工学」とは、一般に、小容量流体を処理する系、デバイス、および方法を指す。マイクロ流体システムは、流体を操作する多種多様の作業を統合しうる。このような流体は、化学的または生物学的な試料を含みうる。これらのシステムはまた、生物学的アッセイ(例えば、医学的診断、薬剤の発見、および薬剤送達のためのアッセイ)、生化学的センサー、または生命科学研究一般のほか、環境解析、工業工程のモニタリング、および食品安全試験など、多くの適用領域も有する。
対象試料を解析するためのマイクロ流体デバイスであって、
a)マイクロ流体デバイスの本体
を含み、該マイクロ流体デバイス本体が、
i)試料調製領域と、
ii)核酸増幅領域と、
iii)核酸解析領域と、
iv)ネットワーク内において相互連結された複数の流体チャネルと
を含み、
試料調製領域、核酸増幅領域、および核酸解析領域の各々が、該ネットワーク内における少なくとも1つの流体チャネルにより、他の2つの領域の少なくとも1つと流体的に相互連結されるマイクロ流体デバイスが提供される。
a)マイクロ流体デバイスの本体
を含み、該マイクロ流体デバイス本体が、
i)試料調製領域と、
ii)核酸増幅領域と、
iv)ネットワーク内において相互連結された複数の流体チャネルと
を含み、
試料調製領域および核酸増幅領域の各々が、少なくとも1つの流体チャネルにより、他の領域と流体的に相互連結されるマイクロ流体デバイスも提供される。
試料取込みリザーバーと、
試料調製試薬リザーバーと、
試料精製媒体と
を含み、試料取込みリザーバー、試料調製試薬リザーバー、および試料精製媒体は、流体的に相互連結される。
核酸増幅リアクターと、
核酸増幅試薬リザーバーと、
核酸増幅産物リザーバーと、
を含み、核酸増幅リアクター、核酸増幅試薬リザーバー、および核酸増幅産物リザーバーは、流体的に相互連結される。
試料に対応する画像を解析して複数の画素を発生させるステップと、
複数の画素の各々に対して複数の数値を与えるステップと、
数値を生じさせて色強度値を提供するステップと
を含む。
ここで、添付の図面を参照して本発明を説明するが、これらにおいては、複数の図を通して同様の参照文字が同様のエレメントを示す。場合によって、本発明の理解を容易にするために、本発明の各種の態様が誇張されるかまたは拡大されて示されうることを理解されたい。
本発明は、試料調製、生物学的に活性な分子の増幅を組み合わせることが可能であり、調製された元の試料からの対象分子の解析および/または検出に適する生物学的試料を提供することが可能な、マイクロ流体デバイス(「チップ」)およびこれに基づく方法を提供する。本発明により提供される小規模装置および方法は、生物学的試料の調製および解析のためのより大規模な設備と比較して、より簡便であり、より迅速であり、より廉価であり、同等に有効である。
i)試料調製領域と、
ii)核酸増幅領域と、
iii)核酸解析領域と、
iv)ネットワーク内において相互連結された複数の流体チャネルと
を含み、
試料調製領域、核酸増幅領域、および核酸解析領域の各々が、該ネットワーク内における複数の流体チャネルの少なくとも1つにより、他の2つの領域の少なくとも1つと流体的に相互連結される(図1〜11)。
i)試料調製領域と、
ii)核酸増幅領域と、
iv)ネットワーク内において相互連結された複数の流体チャネルと
を含み、
試料調製領域および核酸増幅領域の各々が、該ネットワーク内における少なくとも1つの流体チャネルにより、他の領域と流体的に相互連結される(図1〜7)。
該解析デバイスは、マイクロ流体デバイス本体を含む。本発明による使用に適するマイクロ流体デバイス本体は、参照によりそれらの全体において本明細書に組込まれる、米国特許公開第US2006/0076068A1号(Youngら、2006年4月13日)、同第US2007/0166200A1号(Zhouら、2008年7月19日)、および同第US2007/0166199A1号(Zhouら、2008年7月19日)において説明されている。
マイクロ流体デバイスは、試料調製領域を含みうる。一実施形態において、試料調製領域は、
試料取込みリザーバーと、
試料調製試薬リザーバーと、
試料精製媒体と
を含み、
試料取込みリザーバー、試料調製試薬リザーバー、および試料精製媒体は、流体的に相互連結される(図1〜7)。
マイクロ流体デバイス本体は、核酸増幅領域を含む。核酸増幅領域は、
核酸増幅リアクターと、
核酸増幅試薬リザーバーと、
核酸増幅産物リザーバーと、
を含み、
核酸増幅リアクター、核酸増幅試薬リザーバー、および核酸増幅産物リザーバーは、流体的に相互連結される。
1.すべての溶液をそれぞれのリザーバーに添加する;
2.「細胞」−「ミキサー」間で細胞を複数回(例えば、10分間にわたり5回)循環させて細胞を溶解し、「ミキサー」内に残存する最終流過物と混合する;
3.「エタノール」から「ミキサー」へとエタノールを送出する;
4.「ミキサー」内でエタノール/細胞溶液を混合する;
5.溶解した細胞溶液を、精製媒体を介して「廃棄物」へと送出する(例示的な態様によれば、精製媒体はシリカ膜を含む);
6.洗浄緩衝液AW1を、精製媒体を介して「廃棄物」へと送出する;
7.洗浄緩衝液AW2を、精製媒体を介して「廃棄物」へと送出する;
8.精製媒体上に吸収されたアルコールを除去する(これは、精製媒体を介して空気を引き込む、コントローラに装備されたポンプにより達成することができる);
9.乾燥ポンプを停止させる;
10.溶出緩衝液AEを、「溶出」から精製媒体(膜)を介して「NA1」へと送出する;
11.溶出緩衝液AEを、「溶出」から精製媒体(膜)を介して「NA2」へと送出する;
12.増幅試薬を、増幅マスター混合リザーバーから「NA2」へと送出する;
13.増幅混合物を、「NA2」から核酸増幅リアクターを介して「単位複製配列流出1」へと送出する;
14.核酸増幅リアクター内において、残りの増幅混合物を熱サイクリングする;
15.増幅産物を、増幅リアクターから「単位複製配列流出2」へと送出する;
16.増幅産物を、「単位複製配列流出2」から核酸解析領域へと送出して検出する。
マイクロ流体デバイスは、核酸解析領域を含みうる。核酸解析領域では、核酸増幅反応から結果として得られる単位複製配列を検出することができる。核酸解析領域には、当技術分野で知られる任意の単位複製配列検出アッセイを容易に適合させることができる。核酸精製領域、核酸増幅領域、および核酸解析領域の各々は、少なくとも1つの流体流路により、他の2つの領域の少なくとも1つと流体的に相互連結することができる。
を含みうる。
a)対象の疾患または障害と関連する核酸を含有することが疑われる試料を被験体から得るステップと、
b)試料中における対象の疾患または障害と関連する核酸を検出するステップと
を含むことができ、該検出するステップは、
対象核酸を含有することが疑われる試料を得るステップと、
本発明のマイクロ流体デバイスを用意するステップと、
試料調製領域に試料を導入するステップと、
核酸増幅用に試料を調製するステップと、
調製された試料を核酸増幅領域に導入するステップと、
核酸増幅領域において核酸増幅反応を実行して対象核酸を増幅するステップと、
増幅された対象核酸を核酸解析領域に導入するステップと、
増幅された対象核酸を検出するステップと
を含み、増幅された対象核酸の検出が、対象の疾患または障害の存在または素因と関連する。
マイクロ流体デバイスは、マイクロ流体デバイスの内部または外部に位置し、マイクロ流体デバイスまたはマイクロ流体デバイス上の特定の領域に作動的に連結される差圧送達システム、例えば、コントローラをさらに含みうる。一実施形態では、US2007/0166199A1(参照により本明細書に組込まれるZhouら、2008年7月19日)において開示されるコントローラを用いることができる。該コントローラは、一方が陽圧であり、他方が陰圧である、2つの圧力供給源を装備しうる。弁をシールするのに陽圧を用いうる一方、ダイアフラムを開くのには陰圧を用いうる。該配置により、ポンプ内における流体圧が弁よりも高圧とならず、弁による漏れが防止される。一態様において、コントローラ上におけるソレノイドマニホールドは、3つの圧力容器を含有しうる。この配置により、ソレノイド間における「クロストーク」を防止し、弁に供給される圧力が、近接する制御ソレノイドの変化に関わらず不変を保つ状態がもたらされる。
マイクロ流体デバイスは、機械通気ポンプまたは一連の通気ポンプなどの差圧送達供給源を含む場合もあり、これに連結される場合もある。
2種以上の個別の流体を迅速に混合する能力は、流体システムの共通の特徴である。一実施形態において、マイクロ流体デバイスは、試薬リザーバー下方のダイアフラムが流体を下方へと引き下ろし、次いで、ノズルを介して流体を上方へと押し上げることでこのようなリザーバーの底部からパルスジェットを発生させ、該リザーバー内で流体を混合するのに用いうる、リザーバーの下方に作製される小型のノズル構造を含むことができる。これは、反応混合物の「フラッフィング」に用いることができる。このようなフラッフィングを用いて、例えば、試薬リザーバー内において、より大きな容量および異なる粘稠度の溶液を混合することができる。
1つの測定器を用いるコンポーネントサブシステムを共有する多重マイクロ流体デバイスを作動させるために、多重ヒーターを用いることができる。そのすべてがコンポーネントサブシステムを共有する多重マイクロ流体デバイスを作動させる場合、すべてのデバイスが同時にサイクリングを終了することが望ましい。これを実行するためには、熱サイクリングを同期させなければならない。一実施形態において、これは、温度設定点をセンサーからの温度測定値と比較する制御ソフトウェアにおける条件付き論理文を用いて達成することができる。
本発明のマイクロ流体システムの特定の実施形態において、デバイスは、取り外し可能であり、ディスポーザブルである。これらの実施形態では、加熱エレメントがデバイスに直接には接触しない加熱システムを用いることができる。これにより、デバイス/マニホールド間の接触面が簡素化される。デバイスから加熱エレメントが除去される場合も、やはり、必要とされる領域に熱を伝導させなければならない。強制対流を用いることにより、加工されたチャネルまたはチューブを介して、オフチップのヒーターからデバイスの所与の領域へと熱を伝導させることができる。ヒーターおよび該接触面の両方に対する設計上の制約が簡素化される。
本発明の別の実施形態では、デバイス上における加熱操作(例えば、PCR熱サイクリングまたはRDB)に、誘導ヒーターを用いることができる。この適用における誘導ヒーターの大きな利点は、加熱の局在化、熱伝導の効率、およびマイクロ流体デバイスへの直接の接続の欠如(すなわち、マイクロ流体デバイスへの電気的接触が不要である)である。
NA増幅反応時において、熱サイクリングに用いられるヒーターは迅速に冷却されなければならない。冷却は、当技術分野で知られる任意の対流冷却エレメントまたは空気圧冷却エレメントにより達成することができる。例えば、小型の通気ポンプ出力からのチューブを用いて、ヒーターを冷却することができる。PCR操作温度は50〜100℃なので、空気圧冷却は、25℃の室温で作用する。加熱エレメントと、ヒーターと接触する空気との間の温度差が大きいほど、該エレメントは迅速に冷却される。ヒートシンクまたは熱電式冷却器をシステムに接続することにより、その効果を増大させることができる。
特定の実施形態において、本発明は、対象の核酸分子(本明細書ではまた、「対象核酸」、「標的核酸」、「標的ポリヌクレオチド」とも称する)を増幅および/または単離する方法を提供する。単離核酸分子(または「単離核酸」)とは、該核酸分子の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子(または「核酸」)である。「単離」核酸は、該核酸がそこに由来する生物のゲノムDNA内において、該核酸に天然の形で隣接する核酸配列(すなわち、該核酸の5’端および3’端に位置する配列)(例えば、タンパク質をコードする配列)を含有しない。他の実施形態において、単離核酸は、イントロン配列を含有しない。
さらなる態様において、本発明は、以下:コントローラ、視覚化装置もしくは検出装置、1種もしくは複数種の核酸プライマー、試料調合液、核酸増幅試薬および/または核酸検出試薬もしくは核酸解析試薬、緩衝液、ならびに洗浄剤、あるいはデバイスの使用説明書の1つまたは複数を伴う、本発明のマイクロ流体デバイスを、1つまたは複数の容器内において含みうる。容器内の試薬は、任意の形態、例えば、乾燥凍結形態、または溶液形態(例えば、蒸留水または緩衝液)などでありうる。キットは、本発明の方法に従い、対象分子の検出または測定に用いることができる。キットはまた、対象分子の作製または合成にも用いることができる。
6.1 3つの機能領域を有するマイクロ流体デバイスの実施形態
本実施例では、試料調製領域、核酸増幅領域、および増幅産物アッセイを実行するための領域である核酸解析領域の3つの機能領域を有するマイクロ流体デバイス(「チップ」)の実施形態(図1〜7)、ならびに該デバイスを用いる例示的な方法について説明する。
本実施例では、2つの機能領域を有するマイクロ流体デバイス(「チップ」)の別の実施形態(図8〜11)、およびそれを用いる方法について説明する。
「細胞」:懸濁細胞およびプロテイナーゼK
「ミキサー」:緩衝液AL
「エタノール」:エタノール
「AW1」:洗浄緩衝液AW1
「AW2」:洗浄緩衝液AW2
「溶出」:溶出緩衝液AE
「NA1」:核酸リザーバー1
「NA2」:核酸リザーバー2
「増幅マスター混合物」:増幅試薬リザーバー
「単位複製配列流出1」:増幅流出リザーバー1
「単位複製配列流出2」:増幅流出リザーバー2
「増幅リアクター」
の通りである。
1.10〜15分間にわたる、循環による細胞溶解
2.エタノールとの混合
3.細胞溶解液をSi膜へと移送する/廃棄する
4.AW1およびAW2をSi膜へと移送する/廃棄する
5.5〜10分間にわたり真空ポンプを作動させ、乾燥させる
6.溶出1および2
7.PCRマスターとの混合
8.PCRリアクターの充填
9.PCR反応
10.PCR産物の放出
の通りである。
本実施例では、試料調製領域および核酸増幅領域の2つの機能領域を有するが、オンチップの核酸解析領域は有さないマイクロ流体デバイス(「チップ」)の別の実施形態(図12〜16)について説明する。
この実施例では、図8〜11に示すマイクロ流体デバイスの実施形態を用いて、HEK 293T細胞から生成される全RNAの増幅結果を説明する。全RNAは、以下のプロトコールを用いてオンチップで調製し、ゲル電気泳動により解析した:
以下のデータは、使用者がマイクロ流体デバイスを用いて、実質的に介入することなく、迅速かつ容易にPCRを実施しうることを示す。細胞の溶解、DNAまたはRNAの抽出および精製、ならびに核酸に対するPCRおよびRT−PCRを含むすべての必要なステップを、単一のマイクロ流体デバイスシステム上で達成することができる。さらに、PCRによる単位複製配列の変性、およびリバースドットブロット(RDB)解析による、オリゴヌクレオチドプローブのアレイ上におけるハイブリダイゼーションを介するPCR産物の検出が可能なシステムもまた設計されている。
1.生の臨床試料を、細胞溶解緩衝液およびプロテイナーゼKを含有するリザーバーR1に導入する。
2.R1およびR3をリザーバーR2へと交互に送出することにより、R1の内容物を、リザーバーR3内に含有されるエタノールおよび核酸結合緩衝液と混合させる。
3.混合された試料(ここではR2内)をフィルターリザーバー(「フィルターRes」)へと移送し、該リザーバーの底部に位置するシリカ膜を介して吸引し、抽出された核酸をシリカへと結合させる。
4.シリカに結合した核酸を、「W1」内に含有される緩衝液により洗浄し、廃棄物を廃棄物リザーバーへと移送する。
5.シリカに結合した核酸を、「W2」内に含有される緩衝液により洗浄し、廃棄物を廃棄物リザーバーへと移送する。
6.通気ポンプを作動させて、シリカ膜を乾燥させる。
7.溶出緩衝液(リザーバーEluからの)をフィルターリザーバーへと送出し、インキュベート後、25μLの精製核酸を、リザーバーNA1へと溶出させる。
8.「NA1」からの精製核酸を核酸増幅混合物リザーバーへと移送し、1:9の比で鋳型を核酸増幅試薬と混合する(すなわち、プライマー対および他のすべての核酸増幅反応成分)。
9.核酸増幅マスター混合物および核酸鋳型を核酸増幅リアクターへと吸引する。
10.核酸増幅リアクター内において核酸増幅熱サイクリングを実行する。
11.最終核酸増幅産物を該産物リザーバー(「PCR Prod」)へと送出する。
マイクロ流体デバイスにより、「ベンチトップ」法と同様の形で効率的にRNAを抽出および精製しうるかどうかを判定するため、いずれもQuiagen社によるRNeasyプロトコールを用いる、マイクロ流体デバイスおよびベンチトップ法を共に用いて、等量(500,000個)の細胞を抽出にかけることにより、ヒト胚腎細胞(HEK 293−T細胞)からRNAを単離した。2つのプロトコール各々の複数回の反復に対するアガロースゲル電気泳動により、マイクロ流体デバイスが、「ベンチトップ」法と同等に機能したことが示される(図18)。
マイクロ流体デバイス上において有効な熱サイクリングを達成しうることを示すため、BioRad MJ Mini熱サイクラーまたはマイクロ流体デバイス内でコントローラ上に搭載されて用いられた熱サイクラーを用いる30サイクルにより、5×103コピーのプラスミド(prlpGL3)を増幅した。アガロースゲル電気泳動により見られる通り、いずれの場合においても適切な単位複製配列が得られたことは、マイクロ流体デバイスシステムにより、実質的に「手」作業を必要とすることなく、適正な単位複製配列を作製することが可能であったことを示す(図21)。
マイクロ流体デバイスによる熱サイクリングと並んで、核酸の抽出および精製の全般的条件が整備されると、生試料導入時における特定の遺伝子標的の検出が達成される。特定の原型的なマイクロ流体デバイスを構成して、どのくらい迅速に対象標的を検出しうるかを示すため、PCR解析により特定の対象標的を検出するのに生物学実験室で既に開発された、ベンチトッププロトコールを実施するマイクロ流体デバイスを開発した。マイクロ流体デバイスの重大な最適化なしに、当技術分野で知られる標準的なアッセイ条件およびプロトコールを用いて、必要とされるすべての調製ステップおよび解析ステップ(すなわち、細胞溶解、核酸抽出/精製、およびPCR増幅)を実施するシステム。
本実施例で用いられるマイクロ流体デバイスの実施形態は、2つの機能領域を有した(図12〜16)。大腸菌の非病原性菌株K12の誘導体であるDH5aを、オンチップにおける処理のための試料供給源として用いた。DH10bのゲノムに基づいて、プライマーを作製した。rrs遺伝子によりコードされる16SのリボソームRNA。「腸内細菌共通抗原」(ECA)は、wyzE遺伝子によりコードされる。用いられたプライマーは、16S_367(7本/ゲノム)およびECA_178(1本/ゲノム)であった(Bayardelle P.およびZahrullah M.(2002年)、「Development of oligonucleotide primers for the specific PCR−based detection of the most frequent Enterohacteriaceae species DNA using wec gene templates」、Can.J.Microhiol.、第48巻、113〜122頁を参照されたい)。
本試験の主目的は、マイクロ流体デバイスの実施形態により、PCRベースのアッセイを用いて、アップルジュース、アップルサイダー、およびミルクなどの食品マトリックス中における大腸菌を検出する、すべての調製ステップおよび解析ステップを有効に実施しうると示すことであった。
本試験では2つの異なる設計を評価したが、この実施例では、評価された設計の1つだけに焦点を絞る(図18〜21)。このマイクロ流体デバイスは、単一のマイクロ流体デバイス上における2つの機能領域を用いる。第1の領域は、すべての試料調製(すなわち、細胞溶解、DNA抽出/精製)を組込み、第2の領域は、PCR増幅用である。これらの領域内には、各種の機能を達成する3つのポンプ/弁群が配置されている。流体は、同じポンプダイアフラムを共有する各リザーバー間で移送されうる。加えて、複数の供給源リザーバーを単一の目的リザーバーに組み合わせて、有効な混合を達成することができ、これはまた、ポンプの二方向性によっても増強されうる。略述すると、以下のステップが実行された。
1.「R1」内において室温で5〜10分間にわたり、細胞溶解緩衝液およびプロテイナーゼKと共に20μLの大腸菌試料をインキュベートする。
2.R1およびR3を「R2」へと交互に送出することにより、R1を「R3」からのEtOH/DNA結合緩衝液と混合する。
3.混合された試料を、「R2」からフィルターリザーバーへと移送し、該溶液を、該リザーバーの底部に位置するシリカ膜を介して吸引し、抽出されたDNAをシリカに結合させる。
4.シリカと結合したDNAを「W1」内の洗浄緩衝液1により洗浄し、廃棄物を廃棄物リザーバーへと移送する。
5.シリカと結合したDNAを「W2」内の洗浄緩衝液2により洗浄し、廃棄物を廃棄物リザーバーへと移送する。
6.シリカ膜を乾燥させるため、数分間にわたり通気ポンプを作動させ、シリカ膜を介して空気を吸引させる。
7.(リザーバーEluからの)溶出緩衝液をフィルターリザーバーへと送出し、インキュベートし、25μlの精製DNAをリザーバーNA1へと溶出させる。
8.DNA鋳型をNA1リザーバーからPCR 混合物リザーバーへと移送し、1:9の比で鋳型をPCR試薬と混合する(すなわち、プライマー対および他のすべてのPCR反応成分)。
9.DNA鋳型と共にPCRマスター混合物をPCRリアクターへと吸引する。
10.PCRリアクター内においてPCR熱サイクリングを実行する。
11.PCR産物を該産物リザーバー(「PCR Prod」)へと送出する。
アッセイ条件を確立する一助とするため、初めの試行の焦点を、PBS中に導入された既知量(または数)の大腸菌に絞った。PBS中に大腸菌500,000個を導入し、マイクロ流体デバイス上でDNAを単離/精製した。25μLの単離DNA鋳型から1μLのアリコートを取り出し、「ベンチトップ」のPCR増幅にかける一方、該25μLの単離DNA鋳型の別の1μLアリコートを、1:9の比でPCRマスター混合物と混合し、マイクロ流体デバイス上でさらに増幅した。図32において、同じマイクロ流体デバイス上において完全に統合されたDNA単離/精製およびPCRから得られたゲルプロファイル(レーン4)との、「ベンチトップ」PCR試料のゲルプロファイル(レーン3)の比較では、識別できない結果が示された。同じゲル上におけるレーン1および2は、それぞれ、陰性対照(水)および陽性対照(UV吸光度測定に基づく、細菌1000個に由来するDNA)を表す。同じ種類の試料に対する反復的解析により基本的に再現可能な結果がもたらされることは、マイクロ流体デバイスを用いて、問題となる細菌を信頼できる形で検出し、「ベンチトップ」のPCR解析と事実上識別できない結果を得ることが可能であったことを示す。
上記と同様の複数のさらなる実験を実施することにより、以下のアッセイプロトコールが確立された。
95℃で2分間にわたる最初のインキュベーション。各サイクルを
95℃で5〜15秒間
60℃で20〜30秒間
72℃で20〜25秒間
として、25〜35サイクル。72℃で3分間にわたる最後のインキュベーション。
PBSに導入された細菌について報告された方式と同様の方式で、各濃度の大腸菌を市販のアップルサイダーに導入し、マイクロ流体デバイスシステムにおいて解析した。アップルサイダーに導入された細菌500,000個の解析(図30A)により、「ベンチトップ」のPCR解析(レーン3)と完全統合型マイクロ流体デバイスによる解析(レーン4)との間で基本的に識別できない結果がもたらされた。レーン1および2は、それぞれ、陰性対照および陽性対照を表す。陰性対照レーン内において現れる微弱なバンドは、実験室内における二次汚染による可能性が高い。アップルサイダーに導入される菌数を100,000個に低下させることによってもまた、標的配列の良好な増幅が示された(図30B)。レーン1〜2が完全統合型マイクロ流体デバイスでの試行により生成される単位複製配列を示す一方、レーン4〜5は、同じDNAに対する「ベンチトップ」のPCR増幅により生成される単位複製配列を示す。レーン3は、陰性対照を表す。
同様の方式で、各濃度の大腸菌を市販のアップルジュースに導入した。細菌10,000個をアップルジュースに導入した(図33)ところ、完全統合型マイクロ流体デバイスでの試行から得られた結果(レーン4〜5)は、同じマイクロ流体デバイス上で単離されたDNAに対する「ベンチトップ」のPCR解析により得られた結果と識別できなった。レーン1は陰性対照を表す。
ミルク中に1,000,000個の大腸菌を導入し、上述の確立されたプロトコールを用いて調べたところ、状況は、アップルジュースまたはアップルサイダーよりも複雑であった。脱脂粉乳の場合、試験に対するタンパク質の干渉は極めて限定されたものであり、予期した結果が得られた(図36)。しかし、細胞溶解緩衝液に対して1:1の容量比で全乳を調べたところ、DNAが単離されなかったことから、全乳中に存在する脂肪により単離過程が抑制されることが示される可能性が高い。
本試験により、マイクロ流体システムを用いて、アップルジュース、アップルサイダー、およびミルクなどの食品マトリックス中における大腸菌を検出しうることが示された。これらの結果は、単一のマイクロ流体デバイス上においてすべての調製機能および解析機能を実施しうることを明確に示す。
本実施例では、例えば、PCRリアクターを有するマイクロ流体デバイスの核酸増幅領域内における密閉された核酸増幅リアクターと共に用いうる圧力除去デバイスについて説明する。圧力除去(緩和)デバイスは、シールされたマイクロ流体デバイスの内部に設置することができる。圧力除去デバイスは、弁に類似するが、直径を貫通する導管状の切除部を有し(図38)、流体は通常、ダイアフラム上部の導管を介して流動可能であり、システム圧が増大すると、流体は、設計およびシステム圧に応じて空気圧により制御されるかまたは雰囲気に対して開放される、緩和デバイスのダイアフラムを押しやり、ダイアフラムのたわみにより、該密閉システム内における物質が維持される一方で、圧力除去のためのさらなる空間がもたらされる。
本実施例では、特定の実施形態において、核酸増幅リアクター、例えば、PCRリアクターの上部に接着することで、高温時における熱効果の結果としてリアクターがたわむことを防止しうる、剛性構造について説明する(図39)。マイクロ流体デバイス材料としてポリスチレンを用いる場合、リアクターの上部は、高温、例えば、95℃時において「たわみ」変形を受ける場合がある。冷却時において、チャンバー内の圧力は、変形および/または液体の漏出により陰圧となる場合があり、これにより、底部膜がたわみ、ヒーターとの共形接触が失われる。結果として、再現可能で高品質の核酸増幅を達成することが困難となりうる。リアクター上部に剛性構造を用いることにより、このような熱膨張がリアクターの上部から離れ、ヒーターを圧迫する膜へと方向づけられる。
本実施例では、リバースドットブロット(RDB)検出用の核酸プローブを固定化するのに用いうる方法について説明する。
1.(0.5M重炭酸Na)原液に由来する200μMプローブ溶液のうち50μlを、
2.445μlの0.5M重炭酸Na溶液に混合し、
3.次いで、これに、総容量が500μlとなるように、5μlの食用色素(黄色1号;赤色〜青緑色)を添加し、
4.調製された溶液中にピンを浸し、該ピンを既に調製したBiodyne C膜に1秒間にわたり接触させることにより該Biodyne C膜上にピンからの液滴を滴下させ、これを2サイクルにわたり繰り返す。
5.プローブアレイを有するBiodyne C膜を、0.1N NaOH中で5秒間にわたり洗浄する。
6.次いで、2回目は滅菌水中で5秒間にわたり洗浄する。
7.次いで、対流熱乾燥により35秒間にわたり乾燥させる。
8.完全に通気乾燥させる。
9.約1分間にわたり、0.1N NaOH中ですすぐ。
10.滅菌水中ですすぐ。
11.完全に通気乾燥させる。
上記の開示によって提供される本願発明の具体例として、以下の発明が挙げられる。
[1] 対象試料を解析するためのマイクロ流体デバイスであって、
a)マイクロ流体デバイスの本体
を含み、前記マイクロ流体デバイス本体が、
i)試料調製領域と、
ii)核酸増幅領域と、
iii)核酸解析領域と、
iv)ネットワーク内において相互連結された複数の流体チャネルと
を含み、
試料調製領域、核酸増幅領域、および核酸解析領域の各々が、前記ネットワーク内における複数の流体チャネルの少なくとも1つにより、他の2つの領域の少なくとも1つと流体的に相互連結されるマイクロ流体デバイス。
[2] 対象試料を解析するためのマイクロ流体デバイスであって、
a)マイクロ流体デバイスの本体
を含み、前記マイクロ流体デバイス本体が、
i)試料調製領域と、
ii)核酸増幅領域と、
iv)ネットワーク内において相互連結された複数の流体チャネルと
を含み、
試料調製領域および核酸増幅領域の各々が、前記ネットワーク内における複数の流体チャネルの少なくとも1つにより、他の領域と流体的に相互連結されるマイクロ流体デバイス。
[3] マイクロ流体デバイス本体の選択される領域に、周囲圧力に対して陽圧または陰圧を加えることが可能な差圧供給源を含む、[1]または[2]に記載のマイクロ流体デバイス。
[4] 差圧供給源およびマイクロ流体デバイス本体に作動的に連結される差圧送達システムを含む、[1]または[2]に記載のマイクロ流体デバイス。
[5] 差圧供給源から所望の開位置または閉位置への圧力を変換するための、複数の流体チャネルの少なくとも2つの中に配置される、少なくとも1つのダイアフラムを含む、[1]または[2]に記載のマイクロ流体デバイス。
[6] 試料調製領域が、
試料取込みリザーバーと、
試料調製試薬リザーバーと、
試料精製媒体と
を含み、
試料取込みリザーバー、試料調製試薬リザーバー、および試料精製媒体が、流体的に相互連結される、[1]または[2]に記載のマイクロ流体デバイス。
[7] 試料精製媒体が配置される試料精製媒体リザーバーを含む、[6]に記載のマイクロ流体デバイス。
[8] 試料精製媒体が試料精製リザーバーの底部に配置される、[7]に記載のマイクロ流体デバイス。
[9] 試料精製媒体が複数の流体チャネルの1つに配置される、[6]に記載のマイクロ流体デバイス。
[10] 核酸増幅領域が、
核酸増幅リアクターと、
核酸増幅試薬リザーバーと、
核酸増幅産物リザーバーと
を含み、
核酸増幅リアクター、核酸増幅試薬リザーバー、および核酸増幅産物リザーバーが、流体的に相互連結される、[1]または[2]に記載のマイクロ流体デバイス。
[11] 核酸増幅産物抽出領域を含む、[2]に記載のマイクロ流体デバイス。
[12] 核酸増幅産物抽出領域が核酸抽出リザーバーを含む、[10]に記載のマイクロ流体デバイス。
[13] 試料精製媒体がシリカ膜である、[6]に記載のマイクロ流体デバイス。
[14] 対象試料が、流体材料、気体材料、液体材料中に実質的に溶解した固体材料、エマルジョン材料、スラリー材料、またはその中に粒子が懸濁する流体材料である、[1]または[2]に記載のマイクロ流体デバイス。
[15] 対象試料が生物学的材料を含む、[1]または[2]に記載のマイクロ流体デバイス。
[16] 対象試料が流体中における細胞の懸濁液を含む、[1]または[2]に記載のマイクロ流体デバイス。
[17] マイクロ流体デバイス本体が、複数層の弱溶剤接着ポリスチレンを含む、[1]または[2]に記載のマイクロ流体デバイス。
[18] 試料取込みリザーバーを含む、[1]または[2]に記載のマイクロ流体デバイス。
[19] 試料調製領域が、試料取込みリザーバーと流体的に連結された試料混合ダイアフラムを含む、[18]に記載のマイクロ流体デバイス。
[20] マイクロ流体デバイス本体が、試料精製媒体を通気乾燥させる手段を含む、[1]または[2]に記載のマイクロ流体デバイス。
[21] 試料調製領域が廃棄物リザーバーを含む、[1]または[2]に記載のマイクロ流体デバイス。
[22] 試料調製領域が溶出試薬リザーバーを含む、[1]または[2]に記載のマイクロ流体デバイス。
[23] 試料調製試薬が磁気ビーズを含む、[6]に記載のマイクロ流体デバイス。
[24] 試料調製試薬が溶解試薬を含む、[6]に記載のマイクロ流体デバイス。
[25] 核酸増幅リアクターが熱サイクルリアクターである、[1]または[2]に記載のマイクロ流体デバイス。
[26] 熱サイクルリアクターの底部がポリスチレンの薄層である、[25]に記載のマイクロ流体デバイス。
[27] 熱サイクルリアクターの底部が、熱サイクリングの間に、マイクロ流体デバイス本体上または本体内には配置されないヒーターにより加熱される、[25]に記載のマイクロ流体デバイス。
[28] 核酸増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写酵素(RT−)PCR、cDNA末端迅速増幅(RACE)、ローリングサイクル増幅、核酸配列ベース増幅(NASBA)、転写物媒介増幅(TMA)、およびリガーゼ連鎖反応からなる群から選択される、
[1]または[2]に記載のマイクロ流体デバイス。
[29] 核酸解析領域が、対象核酸と対象核酸のプローブとの間の相互作用を検出するための領域を含む、[1]に記載のマイクロ流体デバイス。
[30] 対象核酸を検出する方法であって、
対象核酸を含有することが疑われる試料を得るステップと、
[]1に記載のマイクロ流体デバイスを用意するステップと、
試料調製領域に試料を導入するステップと、
核酸増幅用に試料を調製するステップと、
調製された試料を核酸増幅領域に導入するステップと、
核酸増幅領域において核酸増幅反応を実行して対象核酸を増幅するステップと、
増幅された対象核酸を核酸解析領域に導入するステップと、
増幅された対象核酸を検出するステップと
を含む方法。
[31] 対象核酸を検出する方法であって、
対象核酸を含有することが疑われる試料を得るステップと、
[2]に記載のマイクロ流体デバイスを用意するステップと、
試料調製領域に試料を導入するステップと、
核酸増幅用に試料を調製するステップと、
調製された試料を核酸増幅領域に導入するステップと、
核酸増幅領域において核酸増幅反応を実行して対象核酸を増幅するステップと、
増幅された対象核酸を検出するステップと
を含む方法。
[32] 対象核酸が対象の疾患または障害と関連する、[30]または[31]に記載の方法。
[33] 検出するステップが、増幅された対象核酸と対象核酸のプローブとの間の相互作用を検出するステップを含む、[30]または[31]に記載の方法。
[34] 検出するステップが、色強度、蛍光強度、電気信号強度、または化学発光強度を可視化するステップを含む、[30]または[31]に記載の方法。
[35] 検出するステップが、試料中における少なくとも1種の対象分子に対応する強度値を発生させるステップを含む、[30]または[31]に記載の方法。
[36] 強度値が、色強度値、蛍光強度値および化学発光強度値、電流または電圧からなる群から選択される、[35]に記載の方法。
[37] 色強度値を発生させるステップが、
試料に対応する画像をデジタル化して複数の画素を発生させるステップと、
複数の画素の各々に対して複数の数値を与えるステップと、
数値を生じさせて色強度値を提供するステップと
を含む、[36]に記載の方法。
[38] 閾値を計算するステップと、色強度値を閾値と比較して対象分子を検出するステップとをさらに含む、[36]に記載の方法。
[39] 少なくとも1つの色強度値と閾値とをデータベースに保存するステップをさらに含む、
[38]に記載の方法。
[40] 閾値が、少なくとも1種の陰性対照試料を用いて計算される、[38]に記載の方法。
[41] 被験体における対象の疾患または障害の存在または素因を判定する方法であって、
a)対象の疾患または障害と関連する核酸を含有することが疑われる試料を被験体から得るステップと、
b)試料中における対象の疾患または障害と関連する核酸を検出するステップと
を含み、前記検出するステップが、
[1]に記載のマイクロ流体デバイスを用意するステップと、
試料調製領域に試料を導入するステップと、
核酸増幅用に試料を調製するステップと、
調製された試料を核酸増幅領域に導入するステップと、
核酸増幅領域において核酸増幅反応を実行して対象核酸を増幅するステップと、
増幅された対象核酸を核酸解析領域に導入するステップと、
増幅された対象核酸を検出するステップと
を含み、
増幅された対象核酸の検出が、対象の疾患または障害の存在または素因と関連する方法。
[42] 被験体における対象の疾患または障害の存在または素因を判定する方法であって、
a)対象の疾患または障害と関連する核酸を含有することが疑われる被験体を対象から得るステップと、
b)試料中における対象の疾患または障害と関連する核酸を検出するステップと
を含み、前記検出するステップが、
[2]に記載のマイクロ流体デバイスを用意するステップと、
試料調製領域に試料を導入するステップと、
核酸増幅用に試料を調製するステップと、
調製された試料を核酸増幅領域に導入するステップと、
核酸増幅領域において核酸増幅反応を実行して対象核酸を増幅するステップと、
増幅された対象核酸を検出するステップと
を含み、
増幅された対象核酸の検出が、対象の疾患または障害の存在または素因と関連する方法。
[43] 前記検出するステップが、増幅された対象核酸の量(またはレベル)を決定するステップを含み、
前記量(またはレベル)を対象核酸のあらかじめ選択された量(またはレベル)と比較するステップをさらに含む、[41]または[42]に記載の方法。
[44] 前記量(またはレベル)とあらかじめ選択された量(またはレベル)との間の差が、対象の疾患または障害の存在または素因を示す、[43]に記載の方法。
101 試料調製領域
102 核酸増幅領域
103 核酸解析領域
111 試薬リザーバー
112 核酸増幅リアクター
113 解析領域リザーバー
114 廃棄物リザーバー
Claims (41)
- 対象試料を解析するためのマイクロ流体デバイスであって、
a)マイクロ流体デバイスの本体
を含み、前記マイクロ流体デバイス本体が、
i)試料調製領域と、
ii)核酸増幅領域と、
iii)ネットワーク内において相互連結された複数の流体チャネルと
を含み、
試料調製領域および核酸増幅領域の各々が、前記ネットワーク内における複数の流体チャネルの少なくとも1つにより、他の領域と流体的に相互連結され、
前記デバイス本体がさらに、
上面及び下面を有する単一の非弾性基板層であって、上面に1以上のマイクロフィーチャを有する基板層、並びに
前記基板層の上面と接触して一体となっており、前記1以上のマイクロフィーチャの上方に配置されてダイアフラム弁を形成している単一の非弾性膜層であって、前記非弾性膜層が前記基板層の実質的に上面に接する弛緩状態と、前記膜層が前記基板層の上面から移動して分離した作動状態とを有する、膜層
を備え、
さらにまた、前記デバイスが前記基板層及び前記膜層からなる2層のデバイスである、マイクロ流体デバイス。 - 対象試料を解析するためのマイクロ流体デバイスであって、
a)マイクロ流体デバイスの本体
を含み、前記マイクロ流体デバイス本体が、
i)試料調製領域と、
ii)核酸増幅領域と、
iii)ネットワーク内において相互連結された複数の流体チャネルと
を含み、
試料調製領域および核酸増幅領域の各々が、前記ネットワーク内における複数の流体チャネルの少なくとも1つにより、他の領域と流体的に相互連結され、
前記デバイス本体がさらに、
上面及び下面を有する単一の非弾性基板層、並びに
前記基板層の上面と接触して一体となっており、前記基板層に接着されない非接着領域を有する単一の非弾性膜層
を備え、ここで、前記膜層の非接着領域は、前記基板層内に配置される第1の流体チャネルと、前記第1の流体チャネルとは分離した第2の流体チャネルとを少なくとも部分的に覆い、弛緩状態において前記第1の流体チャネルと前記第2の流体チャネルとの間のシールを形成し、作動状態において前記基板層上面から分離して前記第1の流体チャネルと前記第2の流体チャネルとの間に流体の流動に適する空洞を提供し、
さらにまた、前記デバイスが前記基板層及び前記膜層からなる2層のデバイスである、マイクロ流体デバイス。 - iv)核酸解析領域をさらに含み、前記核酸解析領域が、前記ネットワーク内における複数の流体チャネルの少なくとも1つによって他の2つの領域の少なくとも1つと流体的に相互連結される、請求項1または2に記載のマイクロ流体デバイス。
- マイクロ流体デバイス本体の選択される領域に、周囲圧力に対して陽圧または陰圧を加えることが可能な差圧供給源を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のマイクロ流体デバイス。
- 差圧供給源およびマイクロ流体デバイス本体に作動的に連結される差圧送達システムを含む、請求項4に記載のマイクロ流体デバイス。
- 差圧供給源から所望の開位置または閉位置への圧力を変換するための、複数の流体チャネルの少なくとも2つの中に配置される、少なくとも1つのダイアフラムを含む、請求項4に記載のマイクロ流体デバイス。
- 試料調製領域が、
試料取込みリザーバーと、
試料調製試薬リザーバーと、
試料精製媒体と
を含み、
試料取込みリザーバー、試料調製試薬リザーバー、および試料精製媒体が、流体的に相互連結される、請求項1〜3のいずれか1項に記載のマイクロ流体デバイス。 - 試料精製媒体が配置される試料精製媒体リザーバーを含む、請求項7に記載のマイクロ流体デバイス。
- 試料精製媒体が試料精製リザーバーの底部に配置される、請求項8に記載のマイクロ流体デバイス。
- 試料精製媒体が複数の流体チャネルの1つに配置される、請求項7に記載のマイクロ流体デバイス。
- 核酸増幅領域が、
核酸増幅リアクターと、
核酸増幅試薬リザーバーと、
核酸増幅産物リザーバーと
を含み、
核酸増幅リアクター、核酸増幅試薬リザーバー、および核酸増幅産物リザーバーが、流体的に相互連結される、請求項1〜3のいずれか1項に記載のマイクロ流体デバイス。 - 核酸増幅産物解析領域を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のマイクロ流体デバイス。
- 核酸増幅産物解析領域が核酸解析リザーバーを含む、請求項12に記載のマイクロ流体デバイス。
- 試料精製媒体がシリカ膜である、請求項7に記載のマイクロ流体デバイス。
- 対象試料が、流体材料、気体材料、液体材料中に実質的に溶解した固体材料、エマルジョン材料、スラリー材料、または粒子が懸濁している流体材料であり、生物学的材料および流体中における細胞の懸濁液のうちの少なくとも1つをさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のマイクロ流体デバイス。
- マイクロ流体デバイス本体が、複数層の弱溶剤接着ポリスチレンを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のマイクロ流体デバイス。
- 試料取込みリザーバーを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のマイクロ流体デバイス。
- 試料調製領域が、試料取込みリザーバーと流体的に連結された試料混合ダイアフラムを含む、請求項17に記載のマイクロ流体デバイス。
- マイクロ流体デバイス本体が、試料精製媒体を通気乾燥させる手段を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のマイクロ流体デバイス。
- 試料調製領域が廃棄物リザーバーおよび溶出試薬リザーバーのうちの少なくとも1つを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のマイクロ流体デバイス。
- 試料調製試薬が磁気ビーズを含む、請求項7に記載のマイクロ流体デバイス。
- 試料調製試薬が溶解試薬を含む、請求項7に記載のマイクロ流体デバイス。
- 核酸増幅リアクターが熱サイクルリアクターである、請求項11に記載のマイクロ流体デバイス。
- 熱サイクルリアクターの底部がポリスチレンの薄層である、請求項23に記載のマイクロ流体デバイス。
- 熱サイクルリアクターの底部が、熱サイクリングの間に、マイクロ流体デバイス本体上または本体内には配置されないヒーターにより加熱される、請求項23に記載のマイクロ流体デバイス。
- 核酸解析領域が、対象核酸と対象核酸のプローブとの間の相互作用を検出するための領域を含む、請求項3に記載のマイクロ流体デバイス。
- 対象核酸を検出する方法であって、
請求項3に記載のマイクロ流体デバイスを用意するステップと、
試料調製領域に、前記対象核酸を含有することが疑われる試料を導入するステップと、
核酸増幅用に試料を調製するステップと、
調製された試料を核酸増幅領域に導入するステップと、
核酸増幅領域において核酸増幅反応を実行して対象核酸を増幅するステップと、
増幅された対象核酸を検出するステップと
を含む方法。 - 核酸増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写酵素(RT−)PCR、cDNA末端迅速増幅(RACE)、ローリングサイクル増幅、核酸配列ベース増幅(NASBA)、転写物媒介増幅(TMA)、およびリガーゼ連鎖反応からなる群から選択される、請求項27に記載の方法。
- 増幅された対象核酸を核酸解析領域に導入するステップをさらに含む、請求項27に記載の方法。
- 検出するステップが、増幅された対象核酸と対象核酸のプローブとの間の相互作用を検出するステップを含む、請求項27または28に記載の方法。
- 検出するステップが、色強度、蛍光強度、電気信号強度、または化学発光強度を可視化するステップを含む、請求項27または28に記載の方法。
- 検出するステップが、試料中における少なくとも1種の対象分子に対応する強度値を発生させるステップを含む、請求項27または28に記載の方法。
- 強度値が、色強度値、蛍光強度値および化学発光強度値、電流または電圧からなる群から選択される、請求項32に記載の方法。
- 色強度値を発生させるステップが、
試料に対応する画像をデジタル化して複数の画素を発生させるステップと、
複数の画素の各々に対して複数の数値を与えるステップと、
数値を生じさせて色強度値を提供するステップと
を含む、請求項33に記載の方法。 - 閾値を計算するステップと、色強度値を閾値と比較して対象分子を検出するステップとをさらに含む、請求項33に記載の方法。
- 閾値が、少なくとも1種の陰性対照試料を用いて計算される、請求項35に記載の方法。
- 試料中における対象の疾患または障害と関連する核酸を検出する方法であって、
請求項1または2に記載のマイクロ流体デバイスを用意するステップと、
試料調製領域に、前記核酸を含有することが疑われる試料を導入するステップと、
核酸増幅用に試料を調製するステップと、
調製された試料を核酸増幅領域に導入するステップと、
核酸増幅領域において核酸増幅反応を実行して対象核酸を増幅するステップと、
増幅された対象核酸を検出するステップと
を含む、方法。 - 増幅された対象核酸を核酸解析領域に導入するステップをさらに含む、請求項37に記載の方法。
- 前記検出するステップが、増幅された対象核酸の量を決定するステップを含み、
前記量を対象核酸のあらかじめ選択された量と比較するステップをさらに含む、請求項37または38に記載の方法。 - 前記量とあらかじめ選択された量との間の差が、対象の疾患または障害の存在または素因を示す、請求項39に記載の方法。
- 前記非弾性基板層が硬質プラスチック基板層であり、前記非弾性膜層が硬質プラスチック膜層である、請求項1〜26のいずれか1項に記載のマイクロ流体デバイス。
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