JP5892589B2 - マイクロデバイス及びバイオアッセイシステム - Google Patents

Description

本発明は、創薬やバイオテクノロジーの研究に使われ、特に細胞を培養しその機能や応答を評価する際に用いられる、マイクロデバイス及びバイオアッセイシステムに関する。

従来より、細胞の機能や応答を評価する場合には、細胞は主に培地を入れたウェルもしくはシャーレ内にて培養され、実験に用いられている。しかし、個別細胞の評価や細胞の応答を経時的に評価する場合には、少ない試料で、かつ灌流系で実験が行えることが望まれていた。

このような背景より、近年、微細加工技術を応用した細胞培養用のデバイスの開発が進んでいる。これらはマイクロチップと呼称され、いくつかの研究成果が報告されている（例えば、非特許文献１，２参照）。

これらのデバイスは、ガラス、シリコンウェハー、PDMSもしくはその他樹脂基板内に作製されたマイクロ流路内で各種実験を行うものである。サンプルや試薬および廃液の微量化が可能であるとともに、反応部の比界面積が大きいため、細胞の応答を効率よく行うことが可能である。また、培養部もしくは流路下部に測定器を設置することにより、リアルタイムでの評価を可能としている。

ネーチャー（NATURE）第l442巻（2006）ｐｐ403-11 ジャーナル オブ クロマトグラフィー エー（Journal of Chromatography A）, 第1111(2)巻, ｐｐ233-237 (2006).

マイクロチップに設けられた流路は微細であるため、気泡や夾雑物の除去手段を設けたり、培地や薬液の急な流量変化を防止する手段を設けることは困難であった。そのため、マイクロチップを用いた細胞培養において培地などの薬液を培養部に通液する際に、培養部に気泡や夾雑物が流入したり、溶液交換やデバイスを移動させる時に流量が急に変化することがあった。この場合、細胞のなかでも特に接着性細胞は培養部内に混入する気泡や流速の急激な変化の影響を受け易いため、接着能力の弱い細胞においては、デバイス内に保持することが困難であった。

本発明は、マイクロチップを用いた細胞培養において薬液を培養部に通液する際に、気泡や夾雑物の流入を防止し、また急な流量変化を防止することができるマイクロデバイス及びバイオアッセイシステムを提供することを目的とする。

本発明の第１の特徴は、培地供給用流路及び試料・薬液供給用流路のいずれか一方を培養部につなぐ流路切り替えバルブと、培地供給用流路と連通し培地が内部に充填された際に培地との比重差を用いて培地中の気泡及び夾雑物をトラップするチャンバーとを有するマイクロデバイスを要旨とする。

本発明の第２の特徴は、マイクロ流路が表面に形成された基板を備える培養部と、培地供給用流路及び試料・薬液供給用流路のいずれか一方を培養部につなぐ流路切り替えバルブと、培地供給用流路と連通し培地が内部に充填された際に密度差により培地中の気泡及び夾雑物をトラップするチャンバーとを有するバイオアッセイシステムを要旨とする。

本発明によれば、マイクロチップを用いた細胞培養において薬液を培養部に通液する際に、気泡や夾雑物の流入を防止し、また溶液交換やデバイス移動時に急な流量変化を防止することができるマイクロデバイス及びバイオアッセイシステムが提供される。

実施形態に係るマイクロデバイスを備えるバイオアッセイシステムの概略図である。 実施形態に係るマイクロデバイスを備えるバイオアッセイシステムの斜視図である。 実施形態に係る流路切り替えバルブの上面図である。 実施形態に係る流路切り替えバルブの切り欠き上面図である。 実施形態に係る流路切り替えバルブの切り欠き上面図である。 実施形態に係るチャンバーの断面図である。 実施形態の変形例に係るマイクロデバイスを備えるバイオアッセイシステムの斜視図である。 実施形態の変形例に係るマイクロデバイスを備えるバイオアッセイシステムの斜視図である。 実施形態の変形例に係るチャンバーの断面図である。

以下に、実施形態を挙げて本発明の説明を行うが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。図中同一の機能又は類似の機能を有するものについては、同一又は類似の符号を付して説明を省略する。但し、図面は模式的なものであるので、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。

図１は、実施形態に係るマイクロデバイスを備えるバイオアッセイシステムの概略図である。バイオアッセイシステム１は、マイクロ流路２１ａが表面に形成された基板（マイクロチップ）２１を備える培養部２０と、マイクロ流路２１ａの一端と流路Ｌ２を介してつながるマイクロデバイス１０Ａとを有する。マイクロデバイス１０Ａは、培地供給用流路Ｌ３及び試料供給用流路Ｌ１のいずれか一方を培養部２０につなぐ流路切り替えバルブ１３と、培地供給用流路Ｌ３と連通し培地が内部に充填された際に、培地との比重差を用いて培地中の気泡及び夾雑物をトラップするチャンバー１５とを有する。ここでは、バルブ１３と、チャンバー１５とは一体に形成されている。バイオアッセイシステム１は、さらにマイクロ流路の他端と廃液流路Ｌ４を介してつながる廃液回収部３５と、試料供給用流路Ｌ１を介してマイクロデバイスにつながるシリンジ３１と、培地供給用流路Ｌ３を介してマイクロデバイス１０Ａにつながるポンプ３３とを有する。なお、本明細書及び特許請求の範囲において、「基板（マイクロチップ）」とは、平板状でないデバイス並びにミリメートル幅の流路構造を持つデバイスも含めて呼称することとする。

図２に示すように、基台６０上に配置された培養部２０は、基板２１と、基板２１上に配置されたマイクロ流路２１ａに対応する箇所に開口部が設けられたフレーム状の固定具２３と、固定具２３を基台６０に取り付ける複数のネジ２７ａ…２７ｄとからなる。固定具２３の淵には、マイクロ流路２１ａにつながる複数の液供給口２９ａ、２９ｂ、…２９ｈを供える。なお、マイクロ流路２１ａの経路パターンは、直線状に制限されることなく用途に応じて種々のパターンを用いることができる。

基板２１の材質については、細胞培養に悪影響を与えるものでなければ特に制限はされず種々の材料を用いることができる。一般的にはガラス、シリコンウェハー、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、環状オレフィンポリマー、ポリスチレン等の樹脂を用いることができる。マイクロ流路２１ａの内径は細胞の大きさを考慮すると、直径１ｍｍ以下が好ましく、特に１００〜５００μｍが望ましい。

図３の上面図に示すように、マイクロデバイス１０Ａは、本体１１と、本体１１の略中心部に一端１３ａがはめ込み式に取り付けられた流路切り替えバルブ１３と、培地供給用流路Ｌ３上に本体１１と一体に形成されたチャンバー１５とからなる。マイクロデバイス１０Ａには、試料供給用流路Ｌ１、流路Ｌ２および培地供給用流路Ｌ３のそれぞれが嵌め込み式に取り付けられている。流路切り替えバルブ１３の一端１３ａの内部にはL字状の流路が設けられている。そのため、図４の切り欠き上面図に示すように、流路切り替えバルブ１３（仮想線）の長手方向軸が流路Ｌ２の長手方向軸と一致するように配置することで、試料供給用流路Ｌ１と流路Ｌ２がつながる。シリンジ３１から細胞を流し込むと、マイクロデバイス１０Ａを介して培養部２０へと流し込まれる。図５に示すように、一端１３ａを軸にして仮想線で示すように流路切り替えバルブ１３を９０度回転させて、流路切り替えバルブ１３を流路Ｌ２の長手方向に対して垂直に配置することで、培地供給用流路Ｌ３と流路Ｌ２がつながる。そしてポンプを作動させ、培地を送り込むことで、流路切り替えバルブ１３を介して培養部２０に培地が送り込まれる。

なお、バルブについては、培地供給用流路Ｌ３及び試料供給用流路Ｌ１のいずれか一方を培養部に切り替えることができるのであれば、上述のバルブに限定されることなく、種々のバルブを用いることができる。内部容積を少なくするため流路内径が０．５ｍｍ程度のバルブを使用することが好ましい。

図６は、本体１１の一部に本体１１と一体に形成されたチャンバー１５の断面図である。チャンバー１５は、直方体形状をしている。使用する溶液量を考慮すると、流路の出入口の内径を０．４〜０．６ｍｍとしたときに一辺が５〜１０ｍｍとすることが好ましい。図２のポンプ３３を作動させて矢印で示すように培地供給用流路Ｌ３からチャンバー１５の入口からチャンバー１５内に培地を充填すると、培地中の気泡（主に空気）Ａは培地よりも比重が軽いので上方に移動し、夾雑物Ｂは培地よりも比重が重いので下方に沈降する。このようにして、比重の違いを利用することで、培地中の気泡Ａや夾雑物Ｂをチャンバー１５中にトラップすることで、培地から夾雑物Ｂや気泡Ａを除去することができる。なお、チャンバー１５のサイズ及び形状については、灌流する培地由来および配管時に発生する気泡Ａと、夾雑物Ｂを保持する機能を保てれば特に限定はされない。

マイクロデバイス１０Ａ（流路切り替えバルブ１３、チャンバー１５）の材質については、微細加工が可能で培養する細胞に悪影響を与えるものでなければ特に制限なく種々のものを使用することができる。使い捨て（ディスポーサブル）を考慮する場合はポリスチレンなど樹脂類を使用することが好ましく、耐薬品性を考慮する場合はポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）やフッ素樹脂を使用することが望ましい。

本実施形態に使用できる細胞の種類は、マイクロチャネルに接着する性能を持つ細胞であれば特に限定はされない。

次に、実施形態に係るマイクロデバイス及びバイオアッセイシステムの使用方法について、ＰＣ１２細胞およびＨＴ２２細胞の培養方法を例に挙げて、具体的に説明する。

（イ）まず図２に示すマイクロデバイスを備えるバイオアッセイシステムを用意する。ここでは、流路切り替えバルブとして、耐薬品性能を考慮しフッ素樹脂を用いて製造したものを用いた。図２の基板（マイクロチップ）２１として、幅０．３ｍｍ、深さ０．１ｍｍ、長さ６０ｍｍの直線状チャネルを持ち、チャネル内はコラーゲンにて予めコーティングしたものを用いた。

（ロ）次に、図４に示すように試料供給用流路Ｌ１と流路２が繋がるよう、マイクロデバイス１０Ａの流路切り替えバルブ１３が所定の位置にあることを確認する。その後、図２の試料供給用流路Ｌ１より１０^６/ｍＬ個程度の濃度の細胞懸濁液をマイクロデバイス１０Ａを介して基板２１に注入する。注入後、細胞を静置する。静置時間は細胞の性能により変化するものであるが、ここでは２時間静置することにより細胞をチャネル壁面に接着させた。

（ハ）細胞をチャネル壁面に接着させた後、図５に示すようにマイクロデバイス１０Ａの流路切り替えバルブ１３が所定の位置にあることを確認する。その後、培地供給用流路Ｌ３に繋がれているポンプ３３に用意されている培地を灌流させる。灌流速度は０．１μＬ/ｍｉｎ程度が好ましい。

以上のようにして、ＰＣ１２細胞およびＨＴ２２細胞を培養することができる。なお、薬剤アッセイなどで刺激物を投与する場合、培地供給用流路Ｌ３を他のチューブに差し替え、薬剤の入っているシリンジを接続することにより溶液交換を行うことができる。

（その他の実施形態）
上記のように、本発明は実施形態によって記載したが、この開示の一部をなす論述及び図面はこの発明を限定するものであると理解すべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかとなろう。

実施形態においては、基台６０上に流路Ｌ２につながる１つのマイクロデバイス１０Ａを配置した。しかし、図７に示すように、複数の流路切り替えバルブ１３を並列に配置し、そして一方の液を他方の液と反応させても構わない。また図２の培養部２０と流路切り替えバルブ１３の間にさらに流路切り替えバルブ１３を直列に配置しても構わない。培養部２０への通液をより確実に止めることができるからである。また図２の培養部２０の廃液流路Ｌ４側にもマイクロデバイス１０Ａを設けても構わない。

実施形態においては、チャンバーとバルブが一体に形成されたマイクロデバイス１０Ａを用いた。しかし、チャンバーは、図８に示すように、バルブから独立して形成しても構わない。この場合のチャンバーの寸法や材質は、バルブ一体型と同様とすることが好ましい。また、図２のチャンバーとバルブが一体に形成された流路切り替えバルブに加えて、図８のチャンバーを設けても構わない。図２のチャンバーと図８のチャンバーを組み合わせて用いても構わない。

実施形態においては、チャンバー１５の入口と出口を、マイクロデバイス１０Ａの本体１１の厚み方向の略中心にそれぞれ設けたが、それに限定されるものではない。例えば、図９に示すように、チャンバー１５の入口は、本体１１の厚み方向の略中心より上面側に外すように設け、チャンバー１５の出口は、本体１１の厚み方向の略中心より下面側に外して配置しても構わない。但し、入口が上面に近すぎると気泡Ａがチャンバー１５内部で舞うおそれがあるので、略中心と上面の中間程度に配置することが好ましい。出口が下面に近すぎると夾雑物Ｂが舞うおそれがあるので、略中心と下面の間の中間程度に配置することが好ましい。また夾雑物Ｂがチャンバー１５内で舞うことを防止するため、底面に堰１１ｂを設けても構わない。

本発明によれば、マイクロチップを用いた細胞培養において薬液を培養部に通液する際に、気泡や夾雑物の流入を防止し、また急な流量変化を防止することができるマイクロデバイス及びバイオアッセイシステムが提供される。

１：バイオアッセイシステム
１０Ａ：流路切り替えバルブ
１３：弁
１５：チャンバー
２０：培養部
２１：基板（マイクロチップ）
２１ａ：マイクロ流路
３１：シリンジ
３３：ポンプ
３５：廃液回収部
Ｌ１：試料・薬液供給用流路
Ｌ２：流路
Ｌ３：培地供給用流路
Ｌ４：廃液流路

Claims (4)

1. 培地供給用流路及び試料供給用流路のいずれか一方を培養部につなぐ流路切り替えバルブと、
   前記培地供給用流路と連通する入口、および、培養部に通液する流路とつながれる出口を有し、培地が内部に充填された際に前記培地との比重差を用いて前記培地中の気泡及び夾雑物をトラップするチャンバー
   とを有し、
   前記チャンバーは、上下方向の厚みが、前記入口および出口それぞれの内径の６分の５０以上であることを特徴とするマイクロデバイス。
2. 前記チャンバーは、前記流路切り替えバルブと一体に形成されていることを特徴とする請求項１記載のマイクロデバイス。
3. 前記チャンバーは、前記入口および出口それぞれの内径が０．４〜０．６ｍｍであって、一辺が５〜１０ｍｍの直方体状であることを特徴とする請求項１又は２に記載のマイクロデバイス。
4. マイクロ流路が表面に形成された基板を備える培養部と、
   培地供給用流路及び試料供給用流路のいずれか一方を前記培養部につなぐ流路切り替えバルブと、
   前記培地供給用流路と連通する入口、および、培養部に通液する流路とつながれる出口を有し、培地が内部に充填された際に密度差により培地中の気泡及び夾雑物をトラップするチャンバー
   とを有し、
   前記チャンバーは、上下方向の厚みが、前記入口および出口それぞれの内径の６分の５０以上であることを特徴とするバイオアッセイシステム。

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