CN109957492A - 一种用于二代测序dna文库构建的自动化液体处理工作站 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于二代测序DNA文库构建的自动化液体处理工作站。本发明的用于二代测序DNA文库构建的自动化液体处理工作站包括工作台面和移液模块，其中，所述工作台面包括储油槽，所述储油槽用于存储低密度油；所述工作台面还包括磁珠储存槽，所述磁珠储存槽用于存储用于纯化核酸的磁珠悬液；所述工作台面不包括用于容纳包含从磁珠洗脱的核酸的上清洗脱液的洗脱液接收板。本发明提供了一种面积更小、自动化程度更高、具有更多平行样本处理量的用于构建二代测序DNA文库的自动化液体处理工作站。

Description

一种用于二代测序DNA文库构建的自动化液体处理工作站
技术领域
本发明涉及自动化液体处理平台系统，具体涉及一种用于二代测序DNA文库构建的自动化液体处理工作站。
背景技术
液体处理工作站是一种自动化液体处理平台系统,可以转移指定量的试剂/样品或其他液体至指定的容器中。最简单的液体处理工作站可以实现一定体积的移液功能，复杂的液体处理工作站可以整合相应的实验室仪器如离心机、封膜机、加热模块、扫码器等实现更复杂的操作。现有移液工作站的主要模块有软件部分、工作台面、移液模块及其他附加模块，它们的功能大致如下：
1.软件
移液式工作站的软件无论是连接进电脑还是整合到移液系统中可以提供应用所需的功能及灵活性，既可以方便的控制和修改移液的基本命令如吸液、分液、取枪头、混匀等，还可以控制移液的基本参数如吸液的速度、方向等，同时还可控制整合进工作站的配件及仪器，实现整个流程的自动化运行。使用者可以根据实验需要对软件进行相应的编程，修改、增加或删减流程，还可以通过数据的输入和输出，完成样品的追踪、数据分析与计算等。
2.工作台面
工作台面是整个液体处理工作站的主体，台面的大小与实验流程的复杂程度直接相关。台面上根据需要放置不同类型的微孔板、试管、振荡器、试剂槽等等。台面上放置的模块主要分为两大类：耗材板位以及配件板位。
2.1耗材板位
耗材板位是指实验过程中所需的试剂耗材板位，包括不同规格的微孔板、深孔板、试剂槽、离心管架、废液槽、枪头载架等。
2.2配件板位
液体处理工作站根据实验需要可以选配各种功能模块、配件或仪器等，如振荡器、加热制冷模块、洗站、酶标仪、PCR仪、离心机、封膜机、扫码器等。
3.移液模块
移液模块是移液工作站的核心，实现试剂、样品等液体在不同容器配件之间的转移，完成加样、稀释等液体处理操作。移液模块包括机械臂及机械臂上配备的单个或多个通道的移液头。
3.1机械臂
液体处理工作站的机械臂可以在X,Y双方向上独立或者组合移动，有些工作站的机械臂可以在X,Y,Z三方向上移动，灵活地实现各种立体化移液操作。机械臂还可以移取各种规格的微孔板、枪头盒等物品，也可以完成工作站台面范围内的物品转移。
3.2移液头
不同品牌的液体处理工作站机械臂上配有的移液头数量不同,常见的为2/4/8个单通道移液头或者96/384个整体移液头,机械臂上配多少数量的移液头也可以根据具体的实验要求配置。有些液体处理工作站2或8个移液头共用一个注射泵，只能实现多孔平行移液，不能单独控制。精细的液体处理工作站每个独立的移液头由一个专用的注射泵控制，每个移液头的移液体积、移液头的间距、高度可以独立地进行控制。根据移液头的数量，可以灵活地实现单孔，单排或者整板的移液操作。
4.其他附加模块
某些液体处理工作站为了更好的完成移液操作、提高移液效率以及使用者的体验效果，会在工作站上安装一些附加模块，如液体检测模块、操作安全模块。检测模块可实时监控吸头的状态以及页面的位置、液体的流速，并可以识别气泡、凝块等故障，保证移液的准确度和可靠性。操作安全模块是为了避免实验过程中液体飞溅出或者出现故障，或操作者误入仪器操作区域采取的保护措施，如安全门、红外感应装置等。
发明内容
对于自动化液体处理工作站，要实现一定复杂度的流程，受限资源来自于软件和硬件两方面：
a.软件部分：流程完成的速度受限于能平行处理的线程数，或者说各模块的使用饱和度，这和流程本身的设计与软件的编译是否到位有关；
b.硬件部分：台面大小是能容纳多少模块的最终限制，使用更多的模块和台面能兼容更多步骤更复杂的流程，最终影响到自动化液体处理工作站的应用价值。
现有用于分子生物学的自动化液体处理工作站在提高精度方面，已经和传统手工移液操作持平，在高通量操作较复杂流程的应用需求越来越迫切。总之，缩减面积、提高自动化程度、增加平行样本处理量是对自动化液体处理工作站主要改进要求。
但是，目前仅有极少数的行业巨头能够制造用于构建二代测序DNA文库的自动化液体处理工作站，例如Hamilton公司的STAR平台，这些自动化液体处理工作站的设计、制造受到了生产商的严格限制，能够对其进行改进的空间十分有限。
因此，如何在允许的范围内对现有的用于构建二代测序DNA文库的自动化液体处理工作站进行较小改进，即能使其能够平行处理更多的样本，成为本领域技术人员面临的一个重大课题。
鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于仅通过对现有技术进行较小改进就提供一种面积更小、自动化程度更高、具有更多平行样本处理量的用于构建二代测序DNA文库的自动化液体处理工作站。
本发明人为解决上述技术问题进行了深入研究，发现通过在现有自动化液体处理工作站的基础之上，增加用于存储低密度油的储油槽并减除揭膜/封膜模块，且不设置用于容纳包含从磁珠洗脱的核酸的上清洗脱液的洗脱液接收板，就能够大幅缩减工作站面积、提高其自动化程度，从而使得单位时间内能够平行处理的样本量显著增加。本发明人基于上述发现完成了本发明，即本发明包括：
1.一种用于二代测序DNA文库构建的自动化液体处理工作站，其包括工作台面和移液模块，其中，
所述工作台面包括储油槽，所述储油槽用于存储低密度油；
所述工作台面还包括磁珠储存槽，所述磁珠储存槽用于存储用于纯化核酸的磁珠悬液(磁珠悬液由磁珠和结合液组成)；
所述工作台面不包括用于容纳包含从磁珠洗脱的核酸的上清洗脱液的洗脱液接收板。
2.根据项1所述的自动化液体处理工作站，其中，所述储油槽位的大小为标准板位大小的1/5以下。
3.根据项1或2所述的自动化液体处理工作站，其中，所述自动化液体处理工作站不包括揭膜/封膜模块。
4.根据项1～3中任一项所述的自动化液体处理工作站，其中，所述自动化液体处理工作站还包括自动控制模块，所述自动控制模块包括用于对自动化液体处理工作站进行控制的软件。
5.根据项1～4中任一项所述的自动化液体处理工作站，其中，所述工作台面还包括磁吸附/分离模块，用于吸附/分离所述磁珠。
6.根据项1～5中任一项所述的自动化液体处理工作站，其中，所述工作台面还包括吸头存放位，所述吸头存放位用于存放核酸磁珠纯化操作所需的吸头。
7.根据项1～6中任一项所述的自动化液体处理工作站，其中，所述工作台面还包括清洗液存储槽，所述清洗液存储槽用于存放核酸磁珠纯化操作所需的清洗液。
8.根据项1～7中任一项所述的自动化液体处理工作站，其中，所述工作台面还可以包括洗脱液存储槽，所述洗脱液存储槽用于存放核酸磁珠分离操作所需的洗脱液。
9.根据项1～8中任一项所述的自动化液体处理工作站，其中，所述移液模块包括机械臂和移液头。
10.根据项1～9中任一项所述的自动化液体处理工作站，其中，所述工作台面的整体大小为35个标准板位以下。
11.一种构建二代测序DNA文库的方法，其包括使用项1～10中任一项所述的自动化液体处理工作站进行操作的步骤。
12.根据项11所述的方法，其中，不进行揭膜/封膜操作，取而代之地进行油封/去油封操作。
13.根据项11所述的方法，其中，纯化过程中不进行将核酸从磁珠上洗脱下来的洗脱操作。
14.一种构建二代测序DNA文库的方法，其中，不进行揭膜/封膜操作，取而代之地进行油封/去油封操作。
15.根据项14所述的方法，其中，纯化过程中不进行将核酸从磁珠上洗脱下来的洗脱操作。
根据本发明，用于构建二代测序DNA文库的自动化液体处理工作站在单位时间内能够平行处理的样本量得以显著增加。例如，Hamilton公司的STAR平台在4小时内能够平行处理96个样本，而在其基础上进行改进而得到的本发明的自动化液体处理工作站在4小时内能够平行处理192个样本。
附图说明
图1为显示现有技术的自动化液体处理工作站的柱式纯化板位设置情况的示意图。
图2为显示现有技术的自动化液体处理工作站的磁珠纯化板位设置情况的示意图。
图3为显示本发明的一种实施方式的自动化液体处理工作站的磁珠纯化板位设置情况的示意图。
图4为显示本发明实施例自动化流程中工作台面板位设置情况的示意图。
发明的具体实施方式
本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突以本说明书中的定义为准。
首先，在一个方面中，本发明提供一种用于二代测序DNA文库构建的自动化液体处理工作站(本发明的自动化液体处理工作站)，其包括工作台面和移液模块；其中，所述工作台面包括储油槽，所述储油槽用于存储低密度油，所述储油槽位的大小为标准板位大小的1/5以下；所述工作台面还包括磁珠储存槽，所述磁珠储存槽用于存储用于纯化核酸的磁珠悬液；所述工作台面不包括用于容纳包含从磁珠洗脱的核酸的上清洗脱液的洗脱液接收板。
目前的二代测序用DNA文库的构建操作中包含了较多的温度孵育步骤，要实现此流程的自动化运行需要非常大的台面放置所需的试剂耗材,还需要连接温度孵育模块、密封模块等模块。目前的大多数自动化方案在每步的温度孵育过程都是进行离线操作，即手动将反应容器进行密封后孵育再放回到工作站内进行下一步的操作。如果要实现这一步的自动化操作，则需要在工作站内安装封膜/揭膜模块，这些模块不仅占据大量的工作站台面，而且价格昂贵，利用率低。
与此相对，本发明的自动化液体处理工作站的特征之一是在工作台面上设置包括储油槽，所述储油槽用于存储低密度油，所述储油槽位的大小仅为标准板位大小的1/5以下，例如为1/12～1/10。本发明的自动化液体处理工作站在温度孵育反应中使用(惰性)低密度油(例如矿物油或石蜡油等在分子实验常规条件(0～100摄氏度)下，呈现一定程度的物理化学惰性，对光、热、酸碱稳定，短时间内不与核酸或水溶性蛋白发生反应，且密度小于水的烃类或两种以上烃类的混合物)密封水相反应体系的方法替代盖/膜封操作，通过增加较少量对油相移液操作，和一个占板位较小的储油槽位，节省了对工作站密封/去密封两个大模块的投入，使用移液操作这个基础模块保证了流程的连续性。惰性低密度油封直接接触下部水相的优势还在于与水相的温度保持一致，有利于避免温度差蒸发，可以作为一种温度缓冲层存在，有效的保证了水相反应温度的稳定和均一。这种去除了温度差避免蒸发的效果，还有一个很大的好处，在于降低分子实验室中需要仔细避免的高温浴中产生的核酸气溶胶污染。
因此，本发明的自动化液体处理工作站可以不包括揭膜/封膜模块。
在本发明中，通过使用惰性低密度油相密封水相反应体系的方法替代封膜操作，只需要一个占板位较小的储油槽位(例如1/12SBS板位)，然后用移液头(单通道或多通道)吸取低密度油分装至反应板中进行密封，省略封膜/揭膜的操作，保证了自动化流程的连续性。
此外，目前的二代测序用DNA文库的构建操作中还包含了多步核酸纯化操作。核酸纯化的步骤是先将核酸结合到一定的介质上，然后用清洗液清洗1～2遍，最后用洗脱液将核酸洗脱下来，进行下一步的操作。目前核酸纯化的自动化方案主要有柱式纯化和磁珠纯化。其中，与柱式纯化相比，磁珠纯化是占位更少、自动化程度更高的纯化方式。
磁珠纯化主要是将核酸结合到磁珠介质上，结合磁分离器使固液分离。自动化操作需要的主要板位如图2所示。
目前磁珠纯化主要自动化模块操作步骤包括：
1)使用移液头将一定量的磁珠悬液分装到样本板中，混匀并静置一段时间使核酸结合到磁珠上；
2)使用抓手将样本板转移至磁吸附模块，静置一定时间使磁珠吸附；
3)使用移液头吸弃上清废液；
4)保持样本板在磁吸附模块上，转移一定体积的清洗液至样本板中清洗磁珠；
5)吸弃清洗废液；
6)重复清洗步骤4)和5)；
7)使用抓手将样本板转移至原来位置，加入一定体积的洗脱液混匀，将核酸洗脱下来；
8)使用抓手将样本板转移至磁吸附模块，静置一定时间使磁珠吸附；
9)使用移液头将上清洗脱液转移至洗脱液接收板中用于下一步的操作。
磁珠纯化由于液体操作简单，占据的工作站台面相对柱式纯化要小很多，所以目前大多数自动化纯化方案都采用磁珠纯化的形式。但是，传统的磁珠纯化使用多个洗脱液接收板，洗脱液接收板占据了多个工作台面板位，且磁珠纯化步骤越多，洗脱液接收板越多，占据的板位也越多。这不利于自动化液体处理工作站的小型化、自动化。
与此相对，本发明的自动化液体处理工作站不设置用于容纳包含从磁珠洗脱的核酸的上清洗脱液的洗脱液接收板。即，在磁珠纯化的过程中，不用洗脱液将核酸从磁珠上洗脱下来，而是直接将下一步的反应液加入磁珠中进行with beads反应，反应结束后如果需要纯化则只需要加入结合液和清洗液进行纯化，这种方法节省了洗脱液接收板的板位(如图3)。复杂流程中磁珠纯化的次数越多，节省的板位也越多，优势更为明显。这样做的好处在于减少分离这一步需要的额外耗材以及板位，提高了单个反应舱——耗材/板位的利用率。
总之，相对当前普遍采用的磁珠纯化方式的液体处理工作站，本发明的自动化液体处理工作站只增加了一个例如1/12SBS板位的低密度油储液槽，却节省了3个洗脱液接收板(SBS板位)板位和封膜/揭膜模块。
以下，将本发明的自动化液体处理工作站与传统自动化液体处理工作站(以Illumina TruSeq DNA试剂盒进行NGS样本制备的流程为例)的主要部件对比总结如表1。
表1
利用硅基磁性微粒(下面称磁珠)代替硅基滤柱作为主要的纯化(buffer置换)操作体系，可以兼容移液操作。通过增加液体操作步骤和较小的磁珠储位，替换掉需要占据较大体积的滤柱以及真空负压设备。利用硅基磁珠对高温、pH＝3～10、高盐、高醇体系的稳定性，可反复进行纯化操作的特性，带着磁珠不影响反应效果的前提下，去除不必要的把磁珠和后续反应体系的分离的步骤。这样做的好处在于减少分离这一步需要的额外耗材以及板位，提高了单个反应舱——耗材/板位的利用率。
利用本发明的自动化液体处理工作站可以有效提高自动化工作站的模块利用率以及自动化操作的流畅性，例如在Hamilton STAR平台上采用Illumina TruSeq DNA试剂盒进行NGS样品制备的方案(更多信息可访问http://www.ObliqueBio.com/)。使用的Hamilton Microlab STAR平台主要配置如下表格：
Microlab STAR(55channels)
8个1000μL独立移液通道
96通道CO-RE移液头
CO-RE抓手
微孔板载架
叠放式吸头载架
冷却模块
24位磁分离仪
此文库制备方案从离线的Covaris超声打断仪剪切产生的双链DNA片段开始，末端修复反应、加A反应、接头连接反应和PCR扩增都是离线进行。自动化方案可在4小时内平行处理96个样品。
而采用本发明的自动化液体处理工作站，同样使用Hamilton的移液式工作站，主要配置清单如下：
Microlab STAR Let(30channels)
2个1000μL独立移液通道
96通道CO-RE移液头
CO-RE抓手
微孔板载架
吸头载架
冷却模块
磁力板
同样从打断后的双链DNA片段开始，但是末端修复反应、加A反应和接头连接反应都是在线上自动化完成。而且所需的台面减小(55channels减少至30channels)，节省大量成本。自动化方案可在4小时内平行处理192个样品。
实施例
Microlab STARLet平行处理192个双链DNA片段文库构建方案Hamilton MicrolabSTARLet平台配制如下：
Microlab STARLet
2个1000μL独立移液通道
96通道CO-RE移液头
CO-RE抓手
2个孵育模块
吸头载架
深孔板载架
多功能载架
试剂槽载架
2个磁力板
自动化流程(工作台面板位设置如图4所示)如下：
需要说明的是，核酸保存液可以直接设置在建库试剂盒模块内；各步骤的反应mix(即反应液)可先在(反应液)分装板上配置完成，使用分装板可以进一步提高自动化液体处理平台的工作效率；磁珠试剂可以包括磁珠悬液，磁珠和结合液。
采用此自动化方案可在4小时内平行处理192个样品，且构建的DNA文库的品质符合测序要求。
工业实用性
根据本发明，提供了一种面积更小、自动化程度更高、具有更多平行样本处理量的用于构建二代测序DNA文库的自动化液体处理工作站。

Claims (10)

1.一种用于二代测序DNA文库构建的自动化液体处理工作站，其包括工作台面和移液模块，其中，所述工作台面包括储油槽，所述储油槽用于存储低密度油；
所述工作台面还包括磁珠储存槽，所述磁珠储存槽用于存储用于纯化核酸的磁珠悬液；
所述工作台面不包括用于容纳包含从磁珠洗脱的核酸的上清洗脱液的洗脱液接收板。
2.根据权利要求1所述的自动化液体处理工作站，其中，所述储油槽位的大小为标准板位大小的1/5以下。
3.根据权利要求1所述的自动化液体处理工作站，其中，所述自动化液体处理工作站不包括揭膜/封膜模块。
4.根据权利要求1所述的自动化液体处理工作站，其中，所述自动化液体处理工作站还包括自动控制模块，所述自动控制模块包括用于对自动化液体处理工作站进行控制的软件。
5.根据权利要求1所述的自动化液体处理工作站，其中，所述工作台面还包括磁吸附/分离模块，用于吸附/分离所述磁珠。
6.根据权利要求1所述的自动化液体处理工作站，其中，所述工作台面还包括吸头存放位，所述吸头存放位用于存放核酸磁珠纯化操作所需的吸头。
7.根据权利要求1所述的自动化液体处理工作站，其中，所述工作台面还包括清洗液存储槽，所述清洗液存储槽用于存放核酸磁珠纯化操作所需的清洗液。
8.根据权利要求1所述的自动化液体处理工作站，其中，所述移液模块包括机械臂和移液头。
9.根据权利要求1所述的自动化液体处理工作站，其中，所述工作台面的整体大小为35个标准板位以下。
10.一种构建二代测序DNA文库的方法，其包括使用权利要求1～9中任一项所述的自动化液体处理工作站进行操作的步骤。
优选的，所述方法中，不进行揭膜/封膜操作，取而代之地进行油封/去油封操作。
优选的，所述方法中，核酸的磁珠纯化过程中不进行将核酸从磁珠上洗脱下来的洗脱操作。
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