JP6058399B2 - 自己完結的生物学的アッセイ装置、方法及び応用 - Google Patents
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Description
図17Oで示されるように、全ての必要な試薬を貯槽54(加熱分析貯槽)へ要求に従い分配する。貯槽54(加熱分析貯槽)の内容物を要求に従い、撹拌、加熱及びインキュベートする。貯槽54(加熱分析貯槽)の全て又は一部の内容物を貯槽41(分析貯槽)にポンプして、貯槽54(加熱分析貯槽)の内容物の分析を続いて進行する。ゆすぎ緩衝液を貯槽41(ゆすぎ緩衝液)に分配し、貯槽41に前にポンプされた内容物の全てが消費される場合に、貯槽41(ゆすぎ緩衝液)の内容物を貯槽41(分析貯槽)にポンプしてアッセイを完了する。最後に、貯槽41(分析貯槽)内のフィルタ上に表示される結果を光学的に分析する。
実施態様では、本発明は対象核酸分子(これはまた「対象核酸」、「ターゲット核酸」、「ターゲットポリヌクレオチド」とも参照される)の増幅及び/又は単離の方法を提供する。単離された核酸分子(又は「単離核酸」)は、前記核酸分子の天然原料中に存在する他の核酸から分離された核酸分子(又は「核酸」)である。好ましくは、「単離」核酸は、前記核酸が由来する有機体のゲノムDNA中の核酸(即ち前記核酸の5’及び3’末端に位置する配列)を自然に切り出した遊離の核酸配列(例えばタンパク質をコードする配列)である。他の実施態様では、前記単離された核酸はイントロンのない配列である。
当業者に明らかなことは、前記CARDに基づく診断アッセイが、ベンチトップアッセイが現在使用されている多くの異なる応用のために使用されてきている、ということである。プラスチックCARDの設計が、全ての必要なミクロ流体ネットワーク、バルブ、ポンプ及び貯槽を、簡単な安価な使い捨てのミクロ流体装置を可能にする。全てのアッセイ機能(即ち、フロー及び混合速度、熱サイクルを含む温度制御、レジデンスタイムなど)がソフトウェアで容易に制御されることから、複雑な多重PCRアッセイが熟練度の異なる個々人により容易に実施され得る。さらに、CARDは、ポータブルな電池駆動POC制御装置に挿入され得るか、又は高スループットEncompassMDx(TM)ワークステーションに挿入され得る。しかし形式の選択に拘わらず容易に実施が達成される。
実施例1: ワルファリン感受性のためのゲノム薬理学的アッセイ
この例はワルファリン感受性のゲノム薬理学的アッセイの具体的な実施例を示す、前記CARDに完全に組み込まれ自動化されている。逆ドットブロット(RDB)は結果を分析するために実施された。しかし以下示されるように前記プライマ伸長方法もまた使用され得る。以下記載されるプロトコルは当業者に容易に、プライマ及びプローブの選択により対象の単一塩基多型(SNP)のためのアッセイに適合され得る。
1. 前記CARD(オペレーターが行う唯一のステップ)へ原料試験片を適用するステップ、
2. 化学的細胞溶解ステップ、
3. 核酸抽出及び前記CARDに含まれるシリカカラムへ結合させることによる精製ステップ、
4. 前記シリカカラムから精製核酸溶出ステップ、
5. 前記精製核酸の一部を、緩衝液、プライマ、ヌクレオチドトリリン酸、塩化マグネシウム、TaqDNA、ポリメラーゼ及びウラシル−DNAグルコシラーゼ(これは起こり得ないアプリコンのクロスオーバーコンタミネーションを保証するために使用される)を含むPCR増幅を実行するために必要な全ての試薬を含むPCRマスタ混合物と混合するステップ、
6. 前記完全な混合物を、前記マニホールドに埋め込まれた抵抗ヒーター上に直接位置されるPCR熱サイクルチャンバ内に導入するステップ、
7. 前記熱サイクルプログラムを完了させた後、前記アンプリコンを前記検出モジュール内に導入し、そこでアッセイ、例えばプライマ伸長反応(図26A、B)又は逆ドットブロット(RDB)アッセイ「図29)などのアッセイを実施するステップ、
8. 例えばプライマ伸長方法又はRBD膜を介して分析膜上に検出されたスポットの画像化及び分析するステップ、
9. 結果をユーザに提供するステップ。
次のプローブセットが、CYP2C9*2、CYP2C9*3及びVKORCl*2を検出するために使用された。
(a) オペレーターが、前記サンプルインプット貯槽内に、血液又は口腔スワブ懸濁物のサンプルを5μl添加する。
(b) 細胞貯蔵緩衝液30μlを前記試薬インプット貯蔵へ分配し、それを前記サンプルインプット貯槽内へポンプする。
(c) 30μlのプロテイナーゼK及び溶解緩衝液の混合物を前記試薬貯槽に分配し、それを前記サンプルインプット貯槽内にポンプし、5分間インキュベートする。
(d) 30μlのエタノールを前記試薬貯槽に分配し、それを前記サンプルインプット貯槽へポンプする。
(e) 前記サンプルインプット貯槽の内容物全てを前記精製貯槽内の前記フィルタの上部にポンプし、その後内容物を前記フィルタを通して吸引しそれを廃棄へポンプする。
(f) 40μlのエタノールを前記試薬インプット貯槽内に分配し、それを前記精製貯槽内の前記フィルタ上にポンプし、その後内容物を前記フィルタを通して吸引し、それを廃棄へポンプする。
(g) 70μlの洗浄緩衝液1を前記試薬インプット貯槽に分配し、それを前記精製貯槽内の前記フィルタ上にポンプし、その後内容物を前記フィルタを通して吸引し、廃棄へポンプする。
(h) 70μlの洗浄緩衝液2を前記試薬インプット貯槽に分配し、それを前記精製貯槽内の前記フィルタ上にポンプし、その後内容物を前記フィルタを通して吸引し、廃棄へポンプする。
(i) 90μlの水を前記試薬インプット貯槽へ分配し、それを廃棄へポンプする。
(j) 70μlの溶出緩衝液を前記試薬インプット貯槽に分配し、それを前記精製貯槽内の前記フィルタ上にポンプし、その後それをそれが通ってきたチャンネルを通って廃棄へポンプして戻される。その後全ての残流体を前記フィルタを通して吸引しそれを廃棄へポンプする。
(a) 50μlの溶出緩衝液を1つの溶出貯槽へ分配し、その一部分を他の溶出貯槽へポンプし、その後残りを前記精製貯槽内の前記フィルタの底部を通じてポンプして上げ、その後それを少なくとも2回前記精製貯槽を交互に満たしたり空にしてそれをフラフィングする。
(a) 12μlのPCRのマスタ混合物1を1つの前記マスタ混合物貯槽に分配し、その後12μlのPCRマスタ混合物2で他のマスタ混合貯槽へ分配を繰り返す。
(b) 前記精製貯槽の内容物の小部分(ダイヤフラム3フレックス分)を、溶出緩衝液がポンプされた前記第2の溶出貯槽へポンプする。
(c) 前記精製貯槽から少量の材料を移動するためにダイヤフラム1回フレックス分を増幅貯槽の1つにポンプし、その後同じ増幅貯槽を、前記増幅貯槽と同じ側の前記マスタ混合物貯槽からの前記マスタ混合物で満たす。これを繰り返して前記第2の増幅貯槽を満たす。
(a) 10分間、37℃、
(b) 2分間、95℃、
(c)次を40サイクル:
(i) 30秒間、95℃、
(ii) 30秒間、45℃、
(iii) 30秒間、72℃、
(iv) 3分間、72℃。
RDBフィルタブロックは熱サイクルの間に実施され、2つのステップが増幅を完全に行わせるために連携させる。
(a) 80μlの水を前記分析試薬貯槽内に分配し、それを分析フィルタへポンプし、その後時計回り及び反時計回りに交互に廃棄へ15回循環させる。
(b) 80μlの0.1NのNaOHを前記分析試薬貯槽へ分配し、それを前記分析フィルタへポンプし、それをその後時計回り及び反時計回りに交互に廃棄へ15回循環させる。
(c) 80μlの水を前記分析試薬貯槽に分配し、それを前記分析フィルタへポンプし、それをその後時計回り及び反時計回りに交互に廃棄へ循環させる。このステップを2回以上繰り返す。
(a) 80μlのSS緩衝液(0.15MのNaCl+0.01Mのリン酸ナトリウム+0.001MのEDTA+0.1%のSDS;最終pH7.25−7.50)を前記分析貯槽へ分配し、それを前記分析フィルタへポンプし、それを循環させる。80μlの水を前記分析試薬貯槽へ分配し、それを前記分析フィルタへポンプし、その後時計回り及び反時計回りに交互に5回循環させ、その後10分間循環させずにインキュベートする。
10分間の前ハイブリダイゼーションの間にこれらのプロセスが開始され得る。
(a) 前記増幅反応での温度を、前記SS緩衝液を添加する直前の30秒間95℃に上げる。
(b) 同時に80μlのSS緩衝液を前記分析試薬貯槽に分配し、それを前記増幅リアクタの1つにポンプする。他の増幅リアクタでも繰り返す。
(c) 増幅反応ヒーターを切り、前記増幅リアクタを冷却して、前記ワックス/シリコーンのシーリング層を固化させ、アンプリコンを取り出す際に液状相ワックス/シリコーン層がアンプリコンと共に取り出されないようにする。
(a) アンプリコン取り出しステップ(a)−(c)と同時に、前記分析貯槽を空にし、前記分析貯槽の下のヒーターの温度を50℃にあげて前記膜を加熱する。
(b) それぞれの増幅リアクタについて3回分ポンプしてそれぞれのリアクタの内容物をいくらかを前記分析膜へポンプする。
(c) 前記分析貯槽の内容物を、時計回り及び反時計回りに15分間循環させてインキュベートする。前記反応を改善するためにカバーされた分析貯槽を用いることが最も好ましい。その後前記内容物を廃棄へ空にする。
(d) 80μlのSS緩衝液を前記分析試薬貯槽へ分配し、それを前記分析フィルタへポンプし、その後15分間時計回り及び反時計回りに循環させてその後廃棄へポンプする。これを2回繰り返す。
(e) 前記分析貯槽の温度を下げて30℃未満とする。
(f) 80μlのSS緩衝液を前記分析試薬貯槽に分配し、それを前記分析フィルタへポンプし、その後1回循環し、その後それを、1分間に1回循環させて5分間インキュベートし、その後それを廃棄へポンプする。
(a) 80μlのHRPを前記分析試薬貯槽へ分配し、それを分析膜へポンプし、10分間、時計回り及び反時計回りに循環させ、その後廃棄へポンプする。
(b) 80μlのSS緩衝液を前記分析試薬貯槽に分配し、それを前記分析フィルタへポンプし、その後時計回り及び反時計回りに15回循環させその後廃棄へポンプする。
(a) 80μlのTMBを前記分析試薬貯槽に分配し、それを前記分析膜へポンプし、時計回り及び反時計回りに5分間循環し、その後廃棄へポンプする。
(b) 80μlの水を前記分析試薬貯槽へ分配し、それを分析膜にポンプし、時計回り及び反時計回りに15回循環させて、廃棄へポンプする。これを2回繰り返す。
(a) カメラを前記分析膜の上に位置させ、画像を記録する。
(b) 画像を制御システムへ処理のために送る。
(c) 結果を記録する。
イントロダクション
この実施例は、臨床生サンプルを分析するための低コストのCARD技術を組み込んだ先進分子診断業界のための前記CARDの使用を示すものである。生の試験片が前記CARDに導入されると、細胞溶解、核酸精製、多重PCR及びエンドポイント分析の全てのアッセイ機能が自動的に実行される。
分子診断の使用は、1980年代に、特に成長の遅い又は感染性疾患の原因となる選好性細菌の検出を可能とする手段として認められて依頼、大きく拡張されてきた。ウイルス性病原体の検出はまた、ウイルス負荷試験を含み、分子診断により大きく改善されてきた。ヒトゲノムについてのデータがより利用可能になるにつれて、ゲノム薬理学、コンパニオン診断及びその他の個人化された医薬の応用での分子診断の使用はますます大きくなってきている。その潜在能力と有用性にも拘わらず、しかしながら、高度に訓練された人員と高価な装置が必要なために、分子診断は、適切な装置と人員を持つ専門研究室又は中央実験室での使用に制限されている。
アッセイ
「ベチトップ」アッセイは種々のパラメータを確立するために最適化され、それらは前記CARDの自動化プラットフォームに変換された。例えば増幅及びキャプチャのためのプライマ及びプローブは、本技術分野で知られる方法を用いて設計された。これにはまた、分析される有機体が強すぎて溶解されない場合に標準化学溶解及び核酸精製プロトコルの最適化が含まれ得る。
口腔スワブを内容説明の上でボランティアから得た。それを溶解しDNAを中有出した。DNAは前記CARDで増幅の対象とした。使用プライマは、ワルファリン感受性について知られる3つの個々のSNPの回りの領域CYP2C9*2、CYP2C9*3及びVKORCl*2(27−32)を増幅するように設計された。CYP2C9*2及びCYP2C9*3SNPはチトクロームP450遺伝子の変異に対応し、VKORCl*2はビタミンKエポキシドリダクターゼ複合体サブユニット1遺伝子の変異に対応する。
前記CARDで実施されたこのアッセイは、ワルファリンの代謝に影響することが知られている3つの別のSNPを識別することで遺伝子タイプ分析(ワルファリン感受性アッセイ)を実行するように設計された。この単一(VKORCl*2)及び多重(CYP2C9*2及びCYP2C9*3)PCRアッセイは、それぞれのSNP周りの領域を増幅し、その後変性されたアンプリコンをプライマ伸長反応の対象としてそれぞれのアレル体遺伝子タイプをアッセイするものである。
この実施例は、ヒトパリローマウイルス(HPV)アッセイの具体的な実施態様を示し、前記CARDに完全に組み込まれている。以下説明するプロトコルが当業者により、増幅のためのプライマ選択及びアレイのためのプローブの選択により、対象となる他の核酸配列のアッセイに容易に適合させることができる。
(a) オペレーターがサンプル(例えば膣スワブ)をサンプルインプット貯槽に挿入する。
(b) 30μlのプロテインキナーゼK及び溶解緩衝液の混合物を前記試薬インプット貯槽に分配し、それを前記サンプルインプット貯槽へポンプし、5分間インキュベートする。
(c) 30μlのエタノールを前記試薬インプット貯槽へ分配し、それを前記サンプルインプット貯槽へポンプする。
(d) 前記サンプルインプット貯槽の全内容物を前記精製貯槽内の前記フィルタ上にポンプし、その後前記内容部をフィルタを通じて吸引しそれを廃棄へポンプする。
(e) 40μlのエタノールを前記試薬インプット貯槽内に分配し、それを前記精製貯槽内の前記フィルタ上にポンプし、その後前記内容物を前記フィルタを通じて吸引し、それを廃棄へポンプする。
(f) 70μlの洗浄緩衝液1を前記試薬インプット貯槽に分配し、それを前記精製貯槽内の前記フィルタ上にポンプし、その後前記内容物を前記フィルタを通じて吸引し、それを廃棄へポンプする。
(g) 70μlの洗浄緩衝液2を前記試薬インプット貯槽内に分配し、それを前記精製貯槽内の前記フィルタ上にポンプし、その後前記内容物を前記フィルタを通じて吸引し、それを廃棄へポンプする。
(h) 90μlの水を前記試薬インプット貯槽内に分配し、それを廃棄へポンプする。
(i) 70μlの溶出緩衝液を前記試薬インプット貯槽内に分配し、それを前記精製貯槽内の前記フィルタ上にポンプし、その後それを通ってきたチャンネルを通して廃棄へポンプして戻す。その後全ての残留流体を前記フィルタを通じて吸引し、それを廃棄へポンプする。
(a) 50μlの溶出緩衝液を前記溶出貯槽内に分配し、それを他の溶出貯槽へポンプし、その後残りを前記精製貯槽内の前記フィルタの底部を通してポンプして上げ、その後前記精製貯槽を少なくとも2回交互に満たしたり空にしたりしてフラフィングさせる。
(a) 12μlのPCRマスタ混合物1を前記マスタ混合物貯槽の1つに分配し、その後繰り返して12μlのPCRマスタ混合物2を他のマスタ混合物貯槽に分配する。
(b) 前記精製貯槽の内容物の少量(ダイヤフラムの3回分)を溶出緩衝液がポンプされる前記第2の溶出貯槽へポンプする。
(c) 前記ダイヤフラムの1回フレックス分を、前記精製貯槽から前記材料の少量を増幅貯槽の1つに移動させるためにポンプし、その後その同じ増幅貯槽を前記増幅貯槽と同じ側のマスタ混合貯槽からの前記マスタ混合物で満たす。前記第2の増幅貯槽も繰り返し満たす。
(a) 10分間、37℃、
(b) 2分間、95℃、
(c) 次のサイクル10回
(i) 30秒、95℃、
(ii) 30秒、46℃
(iii) 30秒、72℃、
(d) 次のサイクル30回
(i) 15秒、95℃、
(ii) 30秒、49℃、
(iii) 30秒、72℃
(iv) 3分間、72℃。
(a) 前記PCR熱サイクルの間に逆ドットブロット(RDB)フィルタブロックを開始し、2つのステップが前記増幅反応の完了に調整される。
(b) 150μlの0.1NのNaOHを前記分析試薬貯槽内に分配し、それを前記分析フィルタの上部にポンプしそれを前記膜の上部から前記穴付きリングを通じて膜の上部へ戻る循環を5回させ、その後廃棄へポンプされる。
(c)90μlの水を前記分析試薬貯槽内に分配し、それを前記分析フィルタ上にポンプし、その後それを前記膜の上部から前記穴付きリングを通じて膜の上部へ戻る循環を3回させ、その後廃棄へポンプされる。このステップを1回以上繰り返す。
(a) 70μlのハイブリダイゼーション緩衝液(0.15MのNaCl+0.01Mのリン酸ナトリウム+0.001MのEDTA+0.1%のSDS+15%のホルムアルデヒド、最終pH7.25−7.50)を前記分析貯槽内に分配し、それを前記分析フィルタ上にポンプし、それを前記膜の上部から前記穴付きリングを通じて前記膜の上部へ戻る循環を5回行い、その後廃棄へポンプする。
(a) 70μlのハイブリダイゼーション緩衝液を前記分析試薬貯槽内に分配し、それを前記分析フィルタ上にポンプする。
(b) 70μlのハイブリダイゼーション緩衝液を前記分析貯槽に分配し、それを増幅リアクタの1つにポンプする。他の増幅リアクタについて繰り返す。
(c) 増幅反応ヒーターを切り、増幅リアクタを冷却し、シーリング層のワックス/シリコーンを硬化させ、アンプリコンを移動させる際に液状層ワックス/シリコーン層が前記アンプリコンと共に動かされないようにする。
(a) それぞれの増幅リアクタの内容物を前記分析膜上にポンプする。
(b) 前記分析貯槽内の内容物を、12.5分間、循環(前記分析膜の上部から穴付きリングを通じて前記分析膜の上部へ戻る循環)させてインキュベートする。
(c)90μlの洗浄緩衝液を前記分析試薬貯槽内に分配し、それを前記分析フィルタ上部にポンプしその後前記分析膜の上部から前記穴付きリングを通じて前記分析膜の上部へ戻る循環を3回させてその後廃棄へポンプする。これを2回繰り返す。
(a) 120μlのHRPを前記分析試薬貯槽へ分配し、それを前記分析膜の上部にポンプする。それを前記膜の上部から前記穴付きリングを通じて前記分析膜に上部へ戻る循環を4分間行い、その後廃棄へポンプする。
(b) 90μlの洗浄緩衝液を前記分試薬貯槽へ分配し、それを前記分析フィルタ上にポンプする。その後前記分析膜上部から前記穴付きリングを通じて前記分析膜の上部へ戻る循環を3回行い、それぞれ廃棄へポンプする。これを3回繰り返す。
(a) 120μlのTMBを前記分析試薬貯槽内に分配し、それを前記分析膜上にポンプし、前記膜上から前記穴付きリングを通じて前記分析膜上に戻る循環を10分間行い、その後廃棄へポンプする。
(b) 90μlの水を前記分析試薬貯槽内に分配し、それを前記膜上にポンプする。その後前記分析膜上から前記穴付きリングを通じて前記分析膜上に戻る循環を15分間行いその後廃棄へポンプする。これを3回繰り返す。
(a) カメラを前記分析膜上に配置し、画像を記録する。
(b) 前記画像を前記制御装置へ処理のために送る。
(c) 結果を報告する。
この実施例は、実施例3で説明されたプロトコルを用いて、前記CARDで臨床サンプルから直接ヒトパピローマウイルス(HPV)に臨床的に関連する少なくとも20のタイプを、迅速に、容易に、自動的に検出し識別するための方法を示す。
子宮頸癌は低所得国の女性の間で癌に関連する死亡の主な原因であり、世界的な規模では女性の癌に関する死亡の第2の原因である。現在FDA承認分子診断においては、種々のHPVの識別を、「高リスク」又は「低リスク」と分類する以上にはできない。
ゲノムDNAの調製、希釈及び貯蔵
C−33ヒト子宮頸癌細胞株はAmerican Type Culture Collection(ATCC、Manassas、VA)から購入し、10%ウシ胎児血清を含むイーグルスの最小必須媒体を37℃でCO2水ジャケット培養装置で増幅させ、保持された。細胞はコンフルエンスになるまで成長させ、直接PBSに掻き取るか、又はトリプシン処理して細胞を計数した。約5百万細胞(10百万ゲノムに等しい)を集めて溶解し、Qiagen DNeasy kit(Qiagen、Valencia、CA)を用いてゲノムDNAを精製した。核酸濃度は260nmでの吸収により決定された。精製核酸は−20℃で保存された。
HPVゲノムを含むキメラプラスミドDNAはAmerican Type Culture Collection(ATCC、Manassas、VA)から購入し、DH5αE.coli大腸菌を形質転換させた。培地を拡大し、プラスミドDNAをQiagen Plasmid Mini Kit(Qiagen、Valencia、CA)を用いて精製した。DNAの濃度は260nmの吸収により決定され、かつDNAを1μl当たり1E6コピーに希釈した。プラスミドDNAを−20度で保存した。
全てのサンプルは、最初膣スワブとしてDigene 貯蔵媒体中に収集した。サンプルの一部をまた、Digene変性溶液で前処理した。サンプルの200μlをQiagen DNAeasyでの核酸精製の対象とし又は他で説明されるインハウス精製試薬で精製した。精製された核酸は−20℃で保存した。
HPVL1遺伝子プライマセットは、L2遺伝子の3’末端及びL1遺伝子の5’末端に対応する前記HPV領域にもとづいて設計された。これは最初Yoshikawaにより記載されその後他者により精緻化された方法である(Yoshikawa H、Kawana T、Kitagawa K、Mizuno M、Yoshikura H、Iwamoto A:Detection and typing of multiple genital human papillomaviruses by DNA amplification with consensus primers.Jpn J Cancer Res 1991、82(5):524−531;Jeney C、Takacs T、Sebe A、Schaff Z:Detection and typing of 46 genital human papillomaviruses by the L1F/L1R primer system based multiplex PCR and hybridization.J Virol Methods 2007、140(l−2):32−42;Takacs T、Jeney C、Kovacs L、Mozes J、Benczik M、Sebe A:Molecular beacon−based real−time PCR method for detection of 15 high−risk and 5 low−risk HPV types.J Virol Methods 2008、149(1):153−162)。それぞれの特定のHPVタイプの配列は、National Center for Biotechnology information (www.ncbi.nlm.nih.gov)から得られた。前記HPVタイプ及び対応する受け入れ番号(accession number)は次のとおりである:6:NC_000904;11:M14119;16:NC_001526;18:NC_001357;31:J04353;33:M12732;35:M74117;39:M62849 M38185;42:M73236;43:AJ620205;44:U31788;45:X74479;5LM62877;52:X74481;53:NC_001593;56:EF177177;58:D90400;59:X77858;66:U31794;68:DQ080079。
ヒトベータグロビン遺伝子は、内部ポジティブコントロールとして選択され、これは臨床サンプルからの核酸増幅が成功したかどうかを確認するために必要である。前方及び後方プライマは次のように設計された:即ちそれぞれ、5’−GAATAACAGTGATAATTTCTGGG−3’及び5’−GAAGATAAGAGGTATGAACATGA−3’ (配列番号NO:21)である。アミノ末端ベータグロビンキャプチャプローブは、5’−ATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAA−3’(配列番号NO:22)であった。
拡張PCR最適化プロトコルが、高リスクサブタイプとしての顕著性に基づくHPV16及びHPV18について完全長ウイルスDNAを含むプラスミドを用いて実施された。予備実施例は、HPV16は18よりも増幅することが難しいことを示し、従って最適化はHPV16増幅に焦点を合わせた。Jeneyら(Jeney C、Takacs T、Sebe A、Schaff Z:Detection and typing of 46 genital human papillomaviruses by the L1F/L1R primer system based multiplex PCR and hybridization.J Virol Methods 2007、140(1−2):32−42)に記載された条件と類似の熱サイクル条件が実施され、PCRは低温で10サイクルアニーリングし、及び残り25から35サイクルをより高温でアニーリングして実施された。PCRは、32ngのC33精製核酸と最適化MgCl2濃度、プライマ濃度、緩衝液構成物のバックグラウンドに重ねてプラスミドを含むHPV16の1000コピーを用いて、前記2つのアニーリング温度のそれぞれのアニーリング温度で実施された。PCRは最終的に次の条件で最適化された:10mMのTris−HCl、pH9、50mMのKCl、100μg/mlBSA、1.5mMのMgCl2、0.2mMのdATP、0.2mMのdGTP、0.2mMのdCTP、0.075mMのdTTP、0.125mMのdUTP、0.2μMのそれぞれのプライマ、0.002ユニット/μl熱安定ウラシル−DNAグリコシラーゼ、UDG、(USB Corp.、Cleveland、OH)及び0.05ユニット/μlGoTaqホットスタートポリメラーゼ(Hot Start Polymerase)(Promega Corp.、Madison WI)。熱サイクル条件は次のとおりであった:37℃で10分(UDG活性化)、95℃で2分、10サイクルの95℃で30秒、46℃で30秒、72℃で30秒、25−35サイクルの95℃で30秒、49℃で30秒、72℃で30秒及び最後に72℃で3分で拡張。この同じ条件が、ベータグロビン増幅について有効であることが検証された。PCR最適化は、MJ Mini Gradient Thermal Cycler(Biorad、Hercules、CA)で行い、さらにMultigene II Thermal Cycler(Labnet、Woodbridge、NJ)で確認された。
増幅に続いて、2μlの6x色素を10μlに加えて最終容積12μlとする。サンプルは、1/100000容積のGelGreen(Biotium、Hayward、CA)が添加された0.5XTAE(50XTAEは2MのTrisアセテート、100mMのEDTA;0.5XTAEは20mMのTrisアセテート、1mMのEDTAである)緩衝液中に溶解させた3%アガロースゲルで分析された。サンプルは、VWR mini Electrophoresis System (VWR、West Chester、PA)を用いて100ボルトで30−60分間電気泳動された。ウェルは、17レーン(4mm幅)又は24レーン(3mm幅)コムで生成され、そこへ色素を含む5μl又は3μlそれぞれのサンプルが負荷された。
HPVL1増幅領域が臨床サンプルから精製されたDNAからの特定のタイプにつきクローンされた。これを行うために、HPVタイプは、増幅及び逆ドッロブロっとハイブリダイゼーションを介して識別された。HPVL1領域が単一感染を含むサンプルからクローン化された。前方及び後方プライマは、BamH1及びEcoR1制限サイトそれぞれが隣接するタイプ特異的L1配列(図31参照、表2(配列番号NO:23から46)を用いて設計された。消化断片は、その後ゲル精製され、消化BamH1/EcoR1とゲル精製されたpBS IIKS+(Bluescript)クローニングベクターへ連結された。HPV挿入物の増幅の達成は、HPVプライマ混合物を用いて確認され、特異的タイプは、RDB及びApplied Biosystems Automated 3730 DNA AnalyzerをBig Dye Terminator chemistry and Ampli−Taq−FS DNA Polymerase(Applied Biosystems、Inc.、Foster City、CA)とともに用いて確認された。
RDBフィルタのスポッティング制御は次のように設計された:/5AmMC6/AAAAAAAAAAAAAAAAAA/3Bio/(配列番号NO:47)。
膜フィルタは、Zhang等(Zhang Y、Coyne MY、Will SG、Levenson CH、Kawasaki ES:Single−base mutational analysis of cancer and genetic diseases using membrane bound modified oligonucleotides.Nucleic Acids Res 1991、19(14):3929−3933)の記載する方法に従い調製された。即ち、負に荷電されたナイロン、0.45μm、Biodyne C membranes(Pall Corporation)を0.1NのHClで前湿潤化させ、続いて10%のN−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩化水素(EDC)で15分間活性化させた。膜を水ですすぎ、空気乾燥させた。アミノ末端核酸プローブは、0.1%Tweenを含む0.5Mの炭酸水素ナトリウム中に再分散され、かつBioRobotics Biogrid(Boston、MA)を用いて前記膜上にスポットされた。膜を空気乾燥し、使用するまでデシケータ中に保存した。使用直前に、膜は0.1NのNaOHでインキュベートして全ての残留非結合活性化サイトをクエンチされた。
PCRプライマの設計
図32(表3A、配列番号NO:50−77)及び図33(表3B、配列番号NO:78−105)はHPVL1遺伝子増幅のためのプライマを示し、材料及び方法に記載したルールに沿って設計された。3’末端で開始する整列に続いて、最大10の3’ヌクレオチド内にミスマッチがなく、プライマにつき最大2つの縮重を用いることで合計8前方及び8後方プライマ配列が設計された。これにより、Jeney等(Jeney C、Takacs T、Sebe A、Schaff Z:Detection and typing of 46 genital human papillomaviruses by the L1F/L1R primer system based multiplex PCR and hybridization.J Virol Methods 2007、140(1−2):32−42)により合成された個々のプライマの半数に低減され、従って、PCRアッセイに合計コストを節約できた。合計で、これらの縮重配列から13の前方及び21の後方プライマとなった。この戦略に続いて、その中に含まれるプライマ混合物は、高リスクタイプの1つ以外の術店を含む20のHPVターゲットの16と正確に一致する。さらに、できるだけ多くのプライマ配列をカバーするように試みられたが、ミスマッチは低リスクタイプで懸念されるほど多くはなかった。その理由は、全ての関連するタイプがこれらのプライマで増幅され得ることは予想されるが、低リスクが増幅されないという可能性の低い場合に、これらの条件下で偽陰性は高リスクの偽陽性ほど重要ではない、とされるからである。前方プライマセットでのミスマッチは、低リスク42、43については単一のミスマッチであり、低リスク44については3ミスマッチである。後方プライマセットでのミスマッチは低リスク11と44及び高リスク66では単一ミスマッチである。HPV44前方配列での1つ以外の全てのミスマッチは、プライマの5’末端内であった。
前記HPVL1プライマセットは、最初に完全又は部分長HPV配列を含むキメラプラスミドで試験された。図34は、種々のHPVタイプについてプラスミドDNAの増幅の結果を示す。HPV6、11、16、18、52について完全長のDNA配列を含むプラスミド又はHPV35について部分配列のいずれかを100コピー/μl含む反応混合物を40サイクルの増幅の対象とされた。全ての場合において、HPVは、1.6ng/μlC33A核酸の存在で増幅された。全てのプラスミドが前記プライマセットで増幅された。前記プラスミドには、テンプレートとしてどの程度好ましく作用するかに関して違いがあり、HPV18が他と比較して非常に好ましいテンプレートであった。
内部コントロールベータグロビンがHPVとは別のチャンバで増幅されたが、HPVと同じ温度及びサイクル条件で実施された。従って、どのようにしてベータブロビン増幅がこれらの条件下で作用するかを確立することが重要であった。この質問に答えるために、C33A及び細胞から精製された連続的希釈核酸がベータブロビンプライマで増幅の対象とされた。増幅は、精製核酸の0.024−1.6ng/μlを、30、35又は40サイクルで実施された。これらの実験からの結果は図36に示される。PCRを40サイクルで実施された場合、アンプリコン産物はインプット核酸0.2ng/μlで完全に飽和した。対照的に、30又は35サイクルで実施された場合には、グロビンの増加はそれぞれ0.4又は0.1ng/μlでプラトーとなり、それぞれ1.6又は0.8ng/μlまでは飽和しなかった。これらのデータは異なる時間で精製されたC33A核酸を用いて種々の日で生成され、このアッセイの高い再現性が示された。
別の容器でゲノム及びHPVDNAのPCRの増幅に続いて、アンプリコンを一緒にして、単一膜フィルタ上でRDBの対象とした。図37Aには、1.6ng/μlのゲノム核酸のバックグラウンドに重ねてHPVの10コピー/μlの増幅の結果を示す。上の画像は、HPVアンプリコンのゲル画像を示し、下画像は対応するグロビンアンプリコンのゲル画像を示す。それぞれのクローンのテンプレートとしての作用を示す相対的強度は、これまでの10コピー/μlで見られたものと整合した(図37B及びデータは示されていない)。図37Bは、HPVのとグロビンのアンプリコンの組合せのRDBの結果を示す。それぞれのクローンがその特異的膜結合性プローブによりキャプチャされ、明確なスポットを生成した。一例以外の全てで、前記EDBスポットは前記アンプリコン画像の強度に拘わらず強かった。一方でHPV53キャプチャの強度は低強度増幅を真似るものではあるが、なお識別され得る。
HPV及びグロビン増幅、続いてRDB上での特異的検出の堅牢性と再現性の条件を確立したので、前記アッセイを標準的生物学的試験種を用いて検証した。117の臨床サンプルを入手し、HPV及びグロビンの核酸増幅の対象とし、RDBを介して最終的検出の対象とした。全ての117のサンプルが貯蔵移動媒体(STM、Qiagen)中に集められ保存された。前記サンプルの一部分がまた、貯蔵に先立ってアルカリ変性試薬(Qiagen)で処理された。サンプルを凍結して核酸増幅に先立って数週間貯蔵された。前記追加の変性試薬とともに貯蔵されたサンプルから精製された核酸は、STMのみで貯蔵されたサンプルに比較してやや高い収率と純度を与えた。SMTのみの溶液に対して、前記変性/STM含有溶液からの平均収率は、それぞれ11および4.6ng/μlであり、260/280nmでの吸収の比率はそれぞれ1.8と1.6であった。最初、これらのサンプルのそれぞれの0.5μlを30サイクルのPCRを介してグロビンの存在が分析され、かつ、それぞれのサンプルが、生成された核酸の濃度にかかわらず、画素強度により測定可能な検出可能なアンプリコンにつき分析され、EDB検出を介して確認された。図38に見られるように、これらの条件下で直接関連はないが、画素強度の増加の傾向はng/μl収率の増加の傾向を伴った。そこで、検出可能な核酸の不存在下(吸収による、内部スペースのドロップ制限は約1ng/μl)でも、前記アッセイは30サイクルのPCRで検出可能なグロビンアンプリコンを生成し、それにより臨床開発のためのアッセイの感度及び有用性を検証した。
本発明のシステムがHPVを、現在認められているHPV検出の方法に比較してよりよく検出することができることを示すために、全ての117臨床サンプルから精製された核酸に基づきL1プライマセットを用いたPCR、さらに得られたアンプリコンのRDBにより実施された。
この実施例は、個々の低及び高リスクHPVサブタイプを検出し識別するHPV分子診断試験の開発を示す。前記方法は、完全に自動化されたミクロ流体(CARD)プラットフォーム上で使用するように開発され、ユーザは生物学的試験片をインプットするだけが必要とされる。前記自動化プロトコルは、サンプルから核酸を遊離させ、それをグロビン及びHPV特異的プライマを用いて増幅し、及び逆ドットブロットハイブリダイゼーション及び検出を介してHPVのサブタイプを識別する。実施例は、HPVアッセイが20の異なる感染HPVタイプを、ヒト上皮細胞からのベータグロビン同様に識別することができることを示す。さらに、このアッセイの感度が、再現性とともに示された。
CARDでの使用に選択された好ましいターゲットとしての基準は:
(1) PCRの際に相当な伸長時間を必要とせず、PCRの全所要時間を低減する、短いアンプリコンの増幅、
(2) 新たなHPVサブタイプが関連ありとされる場合に新たなHPVサブタイプを含む全ての対象となるターゲットのためのキャプチャプローブの設計をするための超可変領域をターゲットとすること、
(3) 対象とする全てのHPVターゲットを増幅するために必要なプライマの数を最小化するためにターゲットサイトの隣接領域での有意な相同性、である。
この実施例は希釈ターゲットの検出を示す。この例では、希釈ターゲット核酸は水系病原体に関連する。前記希釈ターゲットの検出は給水系でのターゲットの存在を示す。かかるアッセイは、大量の液状サンプル容積中の希釈ターゲット(少数の有機体又は細胞核)を検出するために使用され得る。
クリプトスポリジウム・パルバムの磁気免疫キャプチャのための全ての試薬はDynalから入手される。容量をCARDでの自動操作のために調節された。
(a) オペレーターが1mlの前濃縮水サンプルをサンプルインプットへ導入。
(b) 100μlの緩衝液1、100μlの緩衝液2、及び10μlのビーズを前記サンプルと同じチューブに入れる。ゆっくりと撹拌又はフラフィングして30分インキュベートする。
(c) 前記サンプルインプットの下へ磁石を持ち上げ、貯槽の内容物を廃棄へポンプする。
(d) 200μlの緩衝液1を緩衝液1貯槽へ分配し、前記磁石を下げてから、サンプルインプットへポンプし、ビーズを再懸濁させる。
(e) 前記サンプルインプット貯槽の下に磁石を再度持ち上げ、内容物を廃棄へポンプする。
場合によりヒートショックを前記磁気免疫分離ステップでキャプチャされた生きている有機体の試験のために実施する(でない場合は、以下説明する標準PCR方法によりDNA増幅へ進む)。
(a) 磁石を下げる。
(b) 40μlのヌクレアーゼフリー水を前記非加熱されていない磁気分離ユニット貯槽内に分配し、全内容物を加熱された磁気分離貯槽へポンプし、ゆっくりとフラフィングしてビーズを再懸濁させる。
(c) ヒーターを入れて、5分間42℃とする。生きているクリプトはヒートショックタンパク質をコードするRNAを発現し始める。
全ての試薬はQiagenから入手可能である。容量をCARDの自動操作のために調節する。
(a) 100μlのQiagen溶解緩衝液RLTを前記溶解緩衝液貯蔵へ分配、それを前記サンプルインプット貯槽へポンプし、6回フラフィングして撹拌する。その後前記ヒーターの温度を60℃へ上げて10分間インキュベートする。10分間で2回フラフィングし、5分間で1回フラフィングし、その後丁度10分直前フラフィングする。
(b) 100μlのエタノールを前記エタノール貯槽に分配し、それを前記サンプルインプット貯槽へポンプし、6回フラフィングする。
(c) 前記サンプルインプット貯槽の全内容物を前記シリカフィルタの上部にポンプし、その後前記内容を前記フィルタを通して吸引し、それを廃棄へポンプする。前記真空ポートへ接続されたバルブを開いて、真空を30秒間供給して前記フィルタを通して空気を吸引する。
(d) 100μlのエタノールをエタノール貯槽へ分配し、それを前記シリカフィルタの上部へポンプし、内容物を前記フィルタを通して吸引しそれを廃棄へポンプする。前記真空ポートへ接続されたバルブを開いて、真空を30秒間供給して前記フィルタを通して空気を吸引する。
(e) 100μlの緩衝液2を緩衝液2貯槽へ分配し、それを前記シリカフィルタの上部にポンプし、内容物を前記フィルタを通して吸引し、それを廃棄へポンプする。前記真空ポートへ接続されたバルブを開いて、真空を30秒間供給して前記フィルタを通して空気を吸引する。
(f) 100μlの緩衝液3を緩衝液2貯槽へ分配し、それを前記シリカフィルタ上部へポンプし、内容物を前記フィルタを通して吸引しそれを廃棄へポンプする。前記真空ポートへ接続されたバルブを開いて、真空を30秒間供給して前記フィルタを通して空気を吸引する。
(g) 100μlのエタノールをエタノール貯槽へ分配し、それを前記シリカフィルタ上にポンプし、内容物を前記フィルタを通して吸引し、それを廃棄へポンプする。前記真空ポートへ接続されたバルブを開いて、真空を30秒間供給して前記フィルタを通して空気を吸引する。
(h) 40μlのヌクレアーゼフリーの水を、前記非加熱磁気分離貯槽へ分配し、全内容を前記シリカフィルタを通してポンプして満たし、2分間インキュベートし、その後全内容をポンプして前記加熱磁気分離貯槽へ戻す。
全ての試薬はDynalから入手される。容量はCARDで自動操作されるように調節される。
(a) 100μlの結合緩衝液及びその後20μlのビーズを前記非加熱磁気分離貯槽へ分配し、その後前記結合緩衝液を前記非加熱磁気分離貯槽へポンプする。ゆっくりと撹拌して5分間インキュベートする。
(b) 前記非加熱磁気分離貯槽の下に磁石を上げ、内容物を廃棄へポンプする。
(c)100μlの洗浄緩衝液Aを洗浄緩衝液A貯槽に分配し、それを前記非加熱磁気分離貯槽へポンプする。磁石を下げてゆっくりとフラフィングしてビーズを再懸濁させる。
(d) 磁石を前記非加熱磁気分離貯槽の下に持ち上げ、内容物を廃棄へポンプする。
(e) ステップ(c)及び(d)を繰り返す。
(f) 100μlの洗浄緩衝液Bを洗浄緩衝液B貯槽に分配し、それを前記非加熱磁気分離貯槽へポンプする。磁石を下げてゆっくりとフラフィングしてビーズを再懸濁される。
(g) 磁石を前記非加熱磁気分離貯槽の下に持ち上げ、内容物を廃棄へポンプする。
(h) ステップ(f)と(g)を繰り返す。
(i) 前記非加熱磁気分離貯槽が空の際に(ビーズ以外)、前記洗浄緩衝液B貯槽空気を逆ポンプして前記チャンネル及びダイヤフラムから全ての残留流体を除いてきれいにする。
(a) 磁石を前記非加熱磁気分離貯槽の下から下げる。
(b) 30μlのNASBAマスタ混合物を、増幅マスタ混合物貯槽へ分配し、それを前記非加熱磁気分離貯槽へポンプする。前記非加熱磁気分離貯槽の内容物をフラフィングしてビーズを再懸濁させる。
(c) 前記非加熱磁気貯槽の内容物を前記増幅マスタ混合物貯槽へポンプして戻す。
(d) 前記多目的ヒーターの温度を41℃へ上げる。
(e) 前記増幅マスタ混合物貯槽の内容物を前記増幅リアクタを通して吸引し、少量を廃棄へポンプする。このプロセスは前記増幅リアクタを完全に流体で満たす(空気の泡がない)。
(f) 前記増幅クリアクタの内容物を、41℃で90分間インキュベートする。
(a) 20μlのハイブリダイゼーション緩衝液を前記ハイブリダイゼーション緩衝液貯槽に分配し、その最初の4μl部分を廃棄へポンプして前記チャンネル及びダイヤフラムをきれいにする。
(b) 前記ハイブリダイゼーション緩衝液の4μlを前記加熱分析貯槽へポンプする。
(c) 前記増幅リアクタから最初の14μlの容量を廃棄へポンプして前記チャンネルとダイヤフラムをきれいにする。
(d) その後前記増幅リアクタから2μlを前記加熱分析貯槽へ、その後前記ハイブリダイゼーション緩衝液から6μlを前記加熱分析貯槽へポンプする。
(e) マーカー(この場合、前記アンプリコンと相同性のオリゴヌクレオチドでタグ化され、前記ラテラルフロー分析のエンドポイントで可視化され得るマーカーで満たされたリポソーム)の4μlを前記加熱分析貯槽へ分配する。ゆっくりと撹拌しながら41℃で5分間インキュベートする。
(f) 前記加熱分析貯槽の内容物の8μlを前記分析貯槽内のラテラルフローストリップへポンプする。
(g) 同時にランニング緩衝液の35μlをランニング緩衝液貯槽に分配し、それを、最初の8μl又は前記加熱分析貯槽からの溶液が前記ラテラルフローストリップにポンプされる後に、前記ラテラルフローストリップにポンプする。
(h) タグ化されたリポソームが、前記アンプリコンとハイブリダイゼーションすると、前記ラテラルフローストリップに結合された他の相補的オリゴヌクレオチドによりキャプチャされ、前記リポソームに含まれる内部色素が同じ点で可視化され得る。
(a) カメラを前記分析膜上に配置し、画像を記録する。
(b) 前記画像を制御システムへ処理のために送る。
(c) 結果を報告する。
ここで記載される全ての方法は、特に断りがなされない限り、全ての適切な順序で実施され得るものである。ここで全ての例又は例示的用語(例えば「など」、「例えば」など)は、本発明の実施態様をよりよく理解するために意図的に使用されるものであり、特に断りがなされない限り、特許請求の範囲の本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
Claims (40)
- 自己完結的生物学的アッセイ装置であり、当該装置は:
ハウジング;
前記ハウジング内に設けられる、制御可能で移動可能な試薬分注システムを含む分注プラットフォーム;
前記ハウジング内に設けられる試薬供給コンポーネント;
前記ハウジング内に前記分注プラットフォームと空間を共有して取外し可能に設けられ、流体輸送層と前記流体輸送層に流体接続された複数の貯槽とを有するミクロ流体システムに取外し可能に接続される、ニューマチックマニホールド;
前記ハウジング内に前記分注プラットフォームから空間的に離れて、前記ニューマチックマニホールドに取外し可能に接続されるニューマチック供給システム;及び
前記分注プラットフォーム及び前記ニューマチック供給システムの少なくとも1つに接続され、前記ハウジング内に設けられる制御システム;
を含み、
自己完結的な完全自動化生物学的アッセイ−実施装置であり、
前記流体輸送層、前記貯槽及びそこに導入される試験サンプルは、前記ハウジング内に 、前記分注プラットフォームから空間的に分離されて設けられ、
さらに、導入された前記試験サンプルは、前記流体輸送層中の開始位置から、いかなる他のサンプルからも分離され且つ前記ニューマチックマニホールド及び前記分注システムからも分離された分析貯槽へ輸送される、装置。 - 請求項1に記載の装置であり、前記分注プラットフォームがさらに:
前記試薬分注システムと操作的に接続される動作制御システムであって、前記試薬分注システムが、遠位分注端部を持つ試薬分注コンポーネントを含む、動作制御システム;及び
前記試薬分注システムに接続されるカメラであって、前記貯槽の対象となる選択された領域を少なくとも含む視野を持つカメラ;
を含む、装置。 - 請求項2に記載の装置であり、前記試薬分注コンポーネントが、長さL及び選択された孔サイズを持つ細長いニードル構造である、装置。
- 請求項3に記載の装置であり、前記試薬分注システムはさらに、前記試薬分注コンポーネントと流体接続される試薬貯蔵構造を含み、前記試薬貯蔵構造が、前記選択された孔サイズと操作的に一致する選択された寸法を持つ、装置。
- 請求項4に記載の装置であり、前記試薬貯蔵構造がチューブの長さである、装置。
- 請求項2に記載の装置であり、前記試薬分注コンポーネントが、複数の、異なるそれぞれ選択された孔サイズを持つ、長さLの細長いニードル構造である、装置。
- 請求項6に記載の装置であり、前記試薬分注システムがさらに、複数の試薬貯蔵構造を含み、これらはそれぞれ前記複数の試薬分注コンポーネントへ流体接続され、それぞれの試薬貯蔵構造が選択された寸法を持ち、前記それぞれ選択された孔サイズと操作的に一致する、装置。
- 請求項7に記載の装置であり、前記試薬貯蔵構造のそれぞれがチューブの長さである、装置。
- 請求項7に記載の装置であり、2つの試薬貯蔵構造のみを持ち、これらはそれぞれ2つの試薬分注コンポーネントと流体接続され、前記試薬分注コンポーネントの1つが、孔直径b1が、0.003<b1<0.018インチであり、他の試薬分注コンポーネントが、孔直径b2が、0.015<b2<0.030インチである、装置。
- 請求項1に記載の装置であり、前記ニューマチックマニホールドが、前記ミクロ流体システムとインターフェースする、装置。
- 請求項10に記載の装置であり、前記ミクロ流体システムがさらに、多層、モノリシック、ポリマー性、非弾性的ミクロ流体コンポーネントを含み、これは複数のニューマチック的に駆動されるダイヤフラムを含むミクロ構造の所定の構成を持つ、装置。
- 請求項11に記載の装置であり、
前記ニューマチックマニホールドはその下側に複数のニューマチック専用ポート、及び前記流体輸送層中の複数のバルブと前記複数のニューマチック専用ポートとに流体接続するように設けられる複数のニューマチック専用チャンネルを持ち、
前記複数のニューマチック専用ポートが固定構造を持ち、さらに、前記複数のニューマチック専用チャンネルが所定の構成を持ち、前記流体輸送層内の前記複数のニューマチック的に駆動されるダイヤフラムの所定の構成に対応する、装置。 - 請求項12に記載の装置であり、前記ニューマチック供給システムがさらに、
前記複数のニューマチック専用ポートと流体接続して、ニューマチックシグナルが通過する通路を与える複数の開口チューブを含み、
前記複数の開口チューブが、前記ニューマチックマニホールドの複数のニューマチック専用ポートの固定構造に対応する、前記ニューマチックマニホールドと取外し可能に接続された固定構造を持つ、装置。 - 請求項11に記載の装置であり、それぞれ多層の、モノリシックのミクロ流体コンポーネントがさらに:
ポリマー性、非弾性的基板であって、前記基板はそこに設けられる複数の流体チャンネルを持ち、前記流体チャンネルのそれぞれは入口端部及び出口端部を持つ、基板;
試薬材料を保持し得るタイプの少なくとも1つの試薬貯槽;
少なくとも3つの非弾性膜に基づくダイヤフラムバルブ構造を含む少なくとも1つの双方向ダイヤフラムポンプ;及び
前記少なくとも1つの試薬貯槽と前記入口端部のうち少なくとも1つとに流体結合して設けられるバルブ;
を含み、
前記バルブが、前記少なくとも1つの試薬貯槽から前記バルブと接続される前記チャンネルのうち少なくとも1つを介して複数の貯槽へ前記材料のフローを制御可能に導くように適合され、さらに、それぞれ多層の、モノリシックのミクロ流体コンポーネントが非弾性的、ポリマー性材料から形成される、装置。 - 請求項14に記載の装置であり、それぞれの基板がさらに、複数の分析貯槽を含み、それぞれの分析貯槽がそこに設けられる分析システムを含む、装置。
- 請求項15に記載の装置であり、前記分析システムが、比色、蛍光比色、化学発光、電気化学、電気泳動、ラテラルフロー、タンパク質ミクロアッセイ、核酸ミクロアッセイ、蛍光のうちの1つである、装置。
- 請求項15に記載の装置であり、さらに、複数の周縁段差を持つ保護リング構造を含み、前記保護リング構造は、前記分析貯槽内の分析膜を支持し且つ前記分析膜と操作的に協働するように設けられる、装置。
- 請求項17に記載の装置であり、前記貯槽が、前記分析膜が設けられる少なくとも部分的に内側周辺に棚部を持つ、装置。
- 請求項17に記載の装置であり、前記保護リング構造は2つの対抗するリング構造を含み、それぞれは複数の周縁段差を持ち、さらに前記分析膜が前記2つの対抗するリング構造の中間に設けられる、装置。
- 請求項15に記載の装置であり、さらにヒーターを含む、装置。
- 請求項20に記載の装置であり、前記ヒーターは、加熱可能な、磁気的係合可能な貯槽に近接して設けられる、装置。
- 請求項14に記載の装置であり、さらに:
前記基板の底部表面へ付されるチューブ配置層であって、複数のチューブを含み、それぞれが流体チャンネルに流体接続される近位端、及び前記基板から下向き垂直に突出した遠位端を持つ、チューブ配置層;及び
それぞれ複数の増幅/反応チャンバであって、その上部領域にて前記チューブ配置層へ付され、それぞれのチューブの前記遠位端が実質的にその底部領域の近くに設けられる、増幅/反応チャンバ;
を含む装置。 - 請求項22に記載の装置であり、さらに前記増幅/反応チャンバのそれぞれに温度上昇のためのヒーターを含む、装置。
- 請求項11に記載の装置であり、さらに、貯槽又はチャンネルの下に操作可能に設けられる磁気アセンブリを含み、前記磁気アセンブリがさらに、磁石、磁石保持装置、ピストンロッド、及びニューマチックピストンアセンブリを含む、装置。
- 請求項24に記載の装置であり、さらに前記磁気アセンブリと操作可能に接続されるヒーターアセンブリを含む、装置。
- 流体試験サンプル中に存在し得る標的核酸配列を単離し、増幅し及び分析するための自動化プロセスであり、当該プロセスは:
流体輸送層とそこに設けられる流体チャンネルとを持つミクロ流体システムを操作するニューマチックマニホールド、及び前記ミクロ流体システムに付される貯槽を提供し;
少なくとも1つの試薬を少なくとも1つのそれぞれの貯槽に輸送する分注システムを分 注プラットフォーム内に提供し;
前記流体チャンネル内に前記流体試験サンプルを導入し;
少なくとも1つの試薬を、前記流体輸送層と流体接続される前記少なくとも1つのそれ ぞれの貯槽から前記チャンネルへ提供し;
前記流体輸送層、貯槽又は増幅リアクタの領域内で、前記流体試験サンプルと前記少なくとも1つの試薬とを組合せ;
前記流体試験サンプルを、前記流体輸送層と操作的に流通する温度制御された増幅/反応リアクタへ輸送し;
前記流体試験サンプルを、前記増幅/反応リアクタ中で、前記標的核酸配列が増幅されるのを可能にするために十分な条件下でインキュベートし;
前記流体試験サンプルを分析貯槽へ輸送し;及び
前記試験サンプルから前記増幅された標的核酸配列を分析し;
前記試験サンプルは前記流体輸送層中の開始位置から、他の全てのサンプルから分離され、かつ前記ニューマチックマニホールド及び前記分注システムから分離された前記分析貯槽へ輸送される、自動化プロセス。 - 請求項26に記載の自動化プロセスであり、前記輸送及び組合せステップが、前記ニューマチックマニホールドにより操作される少なくとも1つのマルチバルブダイヤフラムポンプを介して前記流体輸送層を通じて、前記流体試験サンプル及び少なくとも1つの試薬の容量をポンプすることで達成される、自動化プロセス。
- 請求項26に記載の自動化プロセスであり、前記分析ステップがさらに、前記ミクロ流体システム中のミクロアレイ分析貯槽においてミクロアレイ分析を実施することを含む、自動化プロセス。
- 請求項28に記載の自動化プロセスであり、さらに、前記ミクロアレイ分析貯槽内にミクロアレイ分析膜を提供し;前記ミクロアレイ分析膜の上部表面に流体を流し;及び前記ミクロアレイ分析膜の周縁に沿って流体出口経路を実質的に通じて前記流体を除去することを含む、自動化プロセス。
- 請求項28に記載の自動化プロセスであり、さらに、前記ミクロアレイ分析貯槽内にミクロアレイ分析膜を提供し;及び前記ミクロアレイ分析膜の上部表面に交互に前後に流体を流すことを含む、自動化プロセス。
- 請求項29又は30に記載の自動化プロセスであり、さらに、前記ミクロアレイ分析膜に熱を与えることを含む、自動化プロセス。
- 請求項26に記載の自動化プロセスであり、前記標的核酸配列が、対象となる疾患又は障害、感染源、病原体、癌の素因、又は、対象となる薬品、医薬組成物、化学物質若しくは化合物に対する感受性の素因に関連する、自動化プロセス。
- 請求項26に記載の自動化プロセスであり、前記標的核酸配列がSNPを含む、自動化プロセス。
- 請求項32の記載の自動化プロセスであり、前記疾患又は障害がHPV又は敗血症である、自動化プロセス。
- 請求項32に記載の自動化プロセスであり、前記標的核酸配列が、ワルファリン感受性の素因又はワルファリン処置に応じた抗凝固の素因に関連する、自動化プロセス。
- 請求項26に記載の自動化プロセスであり、前記分析ステップが、前記増幅された標的核酸配列と前記標的核酸配列に対するプローブとの間の相互作用を検出することを含む、自動化プロセス。
- 請求項36に記載の自動化プロセスであり、前記分析ステップが、
対象となる疾患又は障害、
感染源、
病原体、
癌、又は、
対象となる薬品、医薬組成物、化学物質若しくは化合物に対する感受性、
の存在又は素因を決定することを含む、自動化プロセス。 - 請求項26に記載の自動化プロセスであり、前記分析ステップが、前記増幅された標的核酸配列の量又はレベルを決定することを含み、当該プロセスが、さらに前記量又はレベルを前記標的核酸配列の既定の量又はレベルと比較することを含む、自動化プロセス。
- 請求項38に記載の自動化プロセスであり、前記量又はレベル及び前記既定の量又はレベルの間の差が、
対象となる疾患又は障害、
感染源、
病原体、
癌、又は、
対象となる薬品、医薬組成物、化学物質若しくは化合物に対する感受性、
の存在又は素因を示す、自動化プロセス。 - 請求項24に記載の装置であり、前記ニューマチックピストンアセンブリは、モーター により又は電磁的に駆動される、装置。
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