KR20140130506A - 사탕수수 바실루스형 바이러스 (scbv) 인핸서 및 식물 기능성 유전체학에서의 이의 용도 - Google Patents

사탕수수 바실루스형 바이러스 (scbv) 인핸서 및 식물 기능성 유전체학에서의 이의 용도 Download PDF

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멀로 패트리시아 앤 오웬스
코리 라센
스코트 에이 베번
존 피 데이비스
바카 에스 레디
윌리엄 마이클 에인리
마크 앨렌 톰슨
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다우 아그로사이언시즈 엘엘씨
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Abstract

새로운 인핸서 서열의 확인은 식물 기능성 유전체학에서 유의하게 유용하다. 사탕수수 바실루스형 바드나바이러스 (SCBV)의 전사 인핸서가 확인되었다. 이러한 인핸서는 유전자 프로모터로부터의 전사율을 증가시키기 위해, 그리고 활성화 태그부착 실험에서 사용될 수 있다. SCBV 인핸서의 4x 어레이(array)가 말단절단(truncated) 형태의 옥수수 알콜 데히드로게나제(dehydrogenase) 최소 프로모터의 상류에 놓였을 때 전사의 10배 증가가 관찰되었다. SCBV 전사 인핸서를 사용하는 방법, 및 이러한 인핸서의 하나 이상의 카피를 포함하는 키메라 전사 조절 영역, 구축물, 세포, 조직, 및 생물이 기술된다.

Description

사탕수수 바실루스형 바이러스 (SCBV) 인핸서 및 식물 기능성 유전체학에서의 이의 용도{SUGARCANE BACILLIFORM VIRAL (SCBV) ENHANCER AND ITS USE IN PLANT FUNCTIONAL GENOMICS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2012년 2월 29일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/605,147의 이익을 청구하고, 이는 본원에 그의 전문이 포함된다.
분야
본 개시내용은 식물 분자 생물학 및 유전 공학, 특히 식물에서의 유전자 발현 및/또는 단백질 생산을 조정 (예를 들어, 강화)하는데 유용한 폴리뉴클레오티드 분자의 분야에 관한 것이다.
공동 연구 협약 당사자
본 출원은 유효일이 2007년 9월 4일인 아그리제네틱스, 인크(Agrigenetics, Inc.), 마이코젠 코포레이션(Mycogen Corporation), 엑셀릭시스 플랜트 사이언시즈, 인크(Exelixis Plant Sciences, Inc.), 및 엑셀릭시스, 인크(Exelixis, Inc.)의 공동 연구 협약 서류 하에 개발된 특정 내용을 기술 및 청구한다.
배경
예를 들어 유전자 조작 생물, 예컨대 식물에서 사용하기 위한, 전사가능한 핵산 (예를 들어, 트랜스진(transgene))의 발현을 지시하거나, 제어하거나, 또는 다른 방식으로 조절하는 유전자 조절 요소에 대한 요구가 계속되고 있다. 전형적으로 유전자 조절 요소는 5' 비번역 서열, 예컨대 전사 인자 및 RNA 폴리머라제(polymerase) 결합 부위(들)를 함유하는 전사 개시 영역, 인핸서(enhancer)/사일런서(silencer) 요소, TATA 박스 및 CAAT 박스 + 3' 폴리아데닐화 서열, 전사 정지 신호, 번역 시작 및 정지 신호, 스플라이스(splice) 도너(donor)/어셉터(acceptor) 서열 등을 함유한다.
유전 공학의 목적을 위해, 전형적으로 유전자 조절 요소가 발현 벡터 또는 기타 조작 구축물 내에 포함되어, 조절 요소에 작동가능하게 연결된 트랜스진의 발현을 조절한다. 이러한 방식으로 사용되는 프로모터의 잘 알려진 예는 CaMV35S 프로모터 (문헌 [Nagy et al. In: Biotechnology in plant science: relevance to agriculture in the eighties. Eds. Zaitlin et al. Academic Press, Orlando, 1985]), 옥수수 유비퀴틴 프로모터 (Ubi; 문헌 [Christensen & Quail, Transgenic Research 5:213, 1996]) 및 Emu 프로모터 (문헌 [Last et al., Theor. Appl. Genet. 81 581, 1991])이지만, 다수의 다른 것들이 당업자에게 공지될 것이다. 또한, 유전 공학에서 사용하기 위해 다양한 공급원으로부터 인핸서들이 단리되었다: 이는 콜리플라워 모자이크 바이러스 (35S CaMV) 인핸서, 현삼 모자이크 바이러스 (FMV) 인핸서, 땅콩 황백화 줄무늬 콜리모바이러스 (PClSV) 인핸서, 또는 미라빌리스(mirabilis) 모자이크 바이러스 (MMV) 인핸서를 포함한다.
예를 들어 벡터 및 기타 조작 구축물과 같은 이종 핵산 분자에서, 자신에게 작동가능하게 연결된 서열의 발현을 제어하도록 활용될 수 있는 유전자 조절 요소, 예컨대 인핸서 도메인을 확인하는 것이 계속 요구되고 있다.
개시내용의 개요
본 개시내용은 인핸서 도메인, 및 이러한 인핸서 도메인의 제어가 강화되어 있는 전사 조절 도메인을 포함하는 신규 전사 조절 영역을 기술한다. 이러한 인핸서 도메인은 직렬로 배열된, 천연이지만 이전에는 인지되지 않은 SCBV 인핸서의 다수 (예를 들어, 2개 내지 4개 또는 이를 초과하는 개수)의 카피를 포함한다. 본 개시내용의 전사 조절 영역 (프로모터)은 인핸서 도메인의 부재 하의 프로모터와 비교하여 강화된 전사를 제공한다. 한 예에서, 서열 1의 위치 337 내지 위치 618에 제시된 SCBV 인핸서 요소의 하나 이상의 카피(copy); 및 여기에 작동가능하게 연결된, RNA 폴리머라제 결합 부위 및 mRNA 개시 부위를 포함하는 프로모터를 포함하는 키메라 전사 조절 영역이고, 관심 뉴클레오티드 서열이 이러한 키메라 전사 조절 영역의 조절 제어 하에 전사될 때, 프로모터를 포함하지만 SCBV 인핸서 서열은 포함하지 않는 키메라 전사 조절 영역으로 수득된 전사 생성물의 양과 비교하여 전사 생성물의 양이 강화되는 키메라 전사 조절 영역이 개시된다.
기술된 전사 조절 영역 및 전사될 DNA 서열을 포함하는 DNA 구축물이 또한 제공된다. 한 예에서, DNA 구축물은 3' 전사 종결 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 개시된 전사 개시 영역을 포함한다. 이러한 DNA 구축물은 전사될 DNA 서열의 전사 강화를 제공한다. 개시된 구축물로 형질전환된 트랜스제닉(transgenic) 식물, 식물 세포 또는 조직 (예컨대 쌍떡잎 또는 외떡잎 식물, 식물 세포 또는 조직)이 또한 개시된다. 개시된 트랜스제닉 식물로부터 유래될 수 있는, 식물 종자, 열매, 잎, 뿌리, 슈트(shoot), 꽃, 절단물(cutting) 및 유성 또는 무성 번식에서 유용한 기타 생식 물질, F1 하이브리드(hybrid)를 포함하는 자손 식물, 웅성-불임 식물, 및 모든 기타 식물 및 식물 생성물이 또한 제공된다. 개시된 트랜스제닉 식물, 식물 세포 또는 조직을 생산하는 방법이 또한 본원에서 제공된다.
본 개시내용의 상기 및 기타 특징들이 하기의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이고, 이는 첨부된 도면을 참조로 진행된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 SCBV 프로모터의 서열 (2010년 4월 15일에 온라인에 게재된 바와 같이 전문이 본원에 참조로 포함된 진뱅크(GenBank) 등록 번호 AJ277091.1, "Sugarcane bacilliform IM virus complete genome, isolate Ireng Maleng"의 위치 6758-7596에 상응함)을 나타낸다; 이러한 서열은 서열 1에서 또한 제시된다. 본 연구에서 규정된 인핸서 서열은 -222에서 -503까지에 걸쳐지고, 도면에서 밑줄이 그어진다 (서열 1의 위치 337 내지 위치 618에 상응함).
도 2a 및 2B는 SCBV 프로모터의 분석 결과를 도해한다. 도 2a는 루시퍼라제(luciferase) (LUC) 리포터 유전자에 융합된 전사 시작 부위의 -839 bp, -576 bp 및 -333 bp 상류부터 전사 시작 부위의 106 bp 하류까지의 서열을 함유하는 SCBV 프로모터의 단편들을 나타낸다. 도 2b는 상기 플라스미드 및 UBI::GUS 리포터 구축물로 공동-형질전환된 HiII 세포로부터의 LUC/GUS 활성비의 막대그래프를 나타낸다. 결과는 전사 시작 부위의 -576 bp 상류로부터의 서열을 함유하는 프로모터 단편이 시작 부위의 839 bp 상류를 함유하는 프로모터 단편의 활성의 60％를 지녔음을 나타낸다. 대조적으로, 시작 부위의 -333 bp 상류로부터의 서열을 함유하는 프로모터 단편은 전장 프로모터 (전사 시작 부위의 -839 bp 상류부터)의 활성의 10％만을 지녔다. 따라서, 프로모터 활성에서 수반되는 서열이 -333 bp의 상류에 존재한다.
도 3은 본원에 기술된 SCBV 인핸서 요소가 옥수수 Adh1 프로모터로부터의 전사를 강화시킨다는 것을 도해한다. -503에서 -222까지의 SCBV 프로모터 서열의 카피 1개, 2개 및 4개를 말단절단형(truncated) 옥수수 Adh1 프로모터의 상류에 클로닝하고, 반딧불이 루시퍼라제 유전자에 융합시켰다. 비교를 위해, MMV 인핸서 서열의 카피 4개 및 MMV 인핸서의 카피 2개 및 SCBV 프로모터의 카피 2개를 말단절단형 옥수수 Adh1 프로모터의 상류에 클로닝하고, 반딧불이 루시퍼라제 유전자에 융합시켰다. 이러한 구축물들을 UBI::GUS 리포터 구축물과 함께 옥수수 Hi-II 현탁 세포 내로 포격하였다. SCBV 인핸서의 카피 1개, 2개 및 4개를 함유하는 구축물은 어떠한 인핸서도 없는 말단절단형 Adh1 구축물이 포격된 세포보다 각각 5배, 6배 및 10배 더 활성이 많았다. 4X MMV 구축물은 말단절단형 Adh1 구축물보다 활성이 2.5배였고, 2X MMV 2X SCBV 구축물은 말단절단형 Adh1 구축물보다 활성이 6배였다.
도 4는 비-트랜스제닉 (W) 대조군 식물과 비교된 트랜스제닉 (T) 식물에서의 4XSCBV의 통합 부위에 가까운 전사물 ("플랭킹(flanking) 유전자")의 축적을 나타내고, 이는 역전사 및 PCR (RT-PCR)을 사용하여 분석되었다. 비교를 위해 하우스키핑(housekeeping) 유전자 GAPDH의 수준이 제시된다. 4XSCBV 인핸서는 자신이 통합된 곳 근처의 유전자의 전사물의 축적 증가를 야기하였다; 이러한 전사물 축적 증가는 아마도 증가된 전사율로부터 초래될 것이다.
도 5는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)에서 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 아실-CoA 델타 9 디새츄라제(desaturase) 트랜스진을 구동시키는데 사용된 4XSCBV::LfKCS3 프로모터 융합물을 함유하는 pDAB3892를 나타낸다.
도 6은 아라비돕시스 탈리아나에서 아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타 9 디새츄라제 트랜스진을 구동시키는데 사용된 LfKCS3 프로모터를 함유하는 pDAB1757을 나타낸다.
도 7은 아라비돕시스 탈리아나에서 아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타 9 디새츄라제 트랜스진을 구동시키는데 사용된 Pv 파세올린(Phaseolin) 프로모터를 함유하는 pDAB1759를 나타낸다.
도 8은 아라비돕시스 탈리아나에서 황색 형광 단백질 트랜스진을 구동시키는데 사용된 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴(Ubiquitin) 10 프로모터를 함유하는 pDAB9381을 나타낸다.
도 9는 구축물의 트랜스제닉 삽입을 함유하는 트랜스제닉 식물에 대한 포화 지방산 표현형에서의 감소 백분율을 나타낸다.
서열 목록
하기 서열 목록에서 열거된 핵산 및/또는 아미노산 서열은 37 C.F.R. 1.822에 규정된 바와 같이 뉴클레오티드 염기에 대한 표준 문자 약어 및 아미노산에 대한 3문자 코드를 사용하여 제시된다. 각각의 핵산 서열의 1개의 가닥만 제시되지만, 표시된 가닥을 참조함으로써 상보적 가닥이 포함된 것으로 이해된다. 핵산 서열 (서열 목록 또는 본원의 다른 곳)은 표준 5' → 3' 방향으로 제시되고, 단백질 서열은 표준 아미노 (N) 말단 → 카르복시 (C) 말단 방향으로 제시된다.
서열 1은 SCBV 프로모터의 핵산 서열 (2010년 4월 15일에 온라인에 게재된 바와 같이 전문이 본원에 참조로 포함된 진뱅크 등록 번호 AJ277091.1, "Sugarcane bacilliform IM virus complete genome, isolate Ireng Maleng"의 위치 6758-7596에 상응함)을 나타낸다. 본원에서 기술된 인핸서 요소는 서열 1의 위치 337 내지 위치 618이다.
서열 2는 pDAB3892로부터의 아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타 9 디새츄라제 식물 전사 단위 (PTU)에 대한 핵산 서열을 나타낸다.
서열 3은 pDAB3892로부터의 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제(transferase) PTU에 대한 핵산 서열을 나타낸다.
서열 4는 pDAB1757로부터의 아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타 9 디새츄라제 PTU에 대한 핵산 서열을 나타낸다.
서열 5는 pDAB1757로부터의 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU에 대한 핵산 서열을 나타낸다.
서열 6은 pDAB1759로부터의 아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타 9 디새츄라제 PTU에 대한 핵산 서열을 나타낸다.
서열 7은 pDAB1759로부터의 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU에 대한 핵산 서열을 나타낸다.
서열 8은 pDAB9381로부터의 황색 형광 단백질 PTU에 대한 핵산 서열을 나타낸다.
서열 9는 pDAB9381로부터의 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU에 대한 핵산 서열을 나타낸다.
서열 10은 가수분해 프로브 검정법을 사용하는 분자적 확인을 위해 pat를 증폭시키는데 사용된 전방향 프라이머에 대한 핵산 서열을 나타낸다.
서열 11은 가수분해 프로브 검정법을 사용하는 분자적 확인을 위해 pat를 증폭시키는데 사용된 역방향 프라이머에 대한 핵산 서열을 나타낸다.
서열 12는 가수분해 프로브 검정법을 사용하는 분자적 확인을 위해 pat를 증폭시키는데 사용된 프로브에 대한 핵산 서열을 나타낸다.
서열 13은 가수분해 프로브 검정법을 사용하는 분자적 확인을 위해 TAFFII를 증폭시키는데 사용된 전방향 프라이머에 대한 핵산 서열을 나타낸다.
서열 14는 가수분해 프로브 검정법을 사용하는 분자적 확인을 위해 TAFFII를 증폭시키는데 사용된 역방향 프라이머에 대한 핵산 서열을 나타낸다.
서열 15는 가수분해 프로브 검정법을 사용하는 분자적 확인을 위해 TAFFII를 증폭시키는데 사용된 프로브에 대한 핵산 서열을 나타낸다.
상세한 설명
I. 약어
3' UTR 3'-비번역 영역
5' UTR 5'-비번역 영역
Adh1 알콜 데히드로게나제(dehydrogenase) 1
LfKCS 3 레스퀘렐라 펜들레리(Lesquerella fendleri) KCS 프로모터
asRNA 안티센스 RNA
cDNA 상보적 DNA
dsRNA 이중-가닥 RNA
GAPDH 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제
KB 킬로바이트
kbp 킬로 염기쌍
LUC 루시퍼라제
miRNA 마이크로RNA
nt 뉴클레오티드
ORF 오픈 리딩 프레임
PCR 폴리머라제 연쇄 반응
PAT 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제
RT-PCR 역전사 및 PCR
SCBV 사탕수수 바실루스형 바이러스
siRNA 소형 간섭 RNA
ssRNA 단일 가닥 RNA
Tm 열 융점
UTR 비번역 영역
II . 용어
달리 언급되지 않는 한, 기술 용어들은 통상적인 용법에 따라 사용된다. 분자 생물학에서의 통상적인 용어의 정의를 문헌 [Benjamin Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994] (ISBN 0-19-854287-9); [Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994] (ISBN 0-632-02182-9); 및 [Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995] (ISBN 1-56081-569-8)에서 확인할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시양태의 리뷰를 용이하게 하기 위해, 하기의 특정 용어 설명이 제공된다:
5' 및/또는 3': 핵산 분자 (예컨대 DNA 및 RNA)는 "5' 끝부분" 및 "3' 끝부분"이 있는 것으로 일컬어지는데, 1개의 모노뉴클레오티드 펜토스 고리의 5' 포스페이트가 이의 이웃의 3' 산소에 포스포디에스테르 결합을 통해 한 방향으로 부착되는 방식으로 모노뉴클레오티드들이 반응하여 폴리뉴클레오티드가 제조되기 때문이다. 따라서, 5' 포스페이트가 모노뉴클레오티드 펜토스 고리의 3' 산소에 연결되지 않았을 때 폴리뉴클레오티드의 한쪽 끝부분이 "5' 끝부분"으로 지칭된다. 폴리뉴클레오티드의 다른 쪽 끝부분은 이의 3' 산소가 또 다른 모노뉴클레오티드 펜토스 고리의 5' 포스페이트에 연결되지 않았을 때 "3' 끝부분"으로 지칭된다. 하나의 모노뉴클레오티드 펜토스 고리의 5' 포스페이트가 이의 이웃의 3' 산소에 부착됨에도 불구하고, 내부 핵산 서열 또한 5' 및 3' 끝부분이 있다고 할 수 있다.
선형 또는 원형 핵산 분자에서, 개별적인 내부 요소들은 "하류" 또는 3' 요소의 "상류" 또는 5'인 것으로 지칭된다. DNA와 관련하여, 이러한 용어는 전사가 DNA 가닥을 따라 5' → 3' 방향으로 진행된다는 것을 반영한다. 연결된 유전자의 전사를 지시하는 프로모터 및 인핸서 요소는 일반적으로 코딩 영역의 5' 또는 상류에 위치한다. 그러나, 프로모터 요소 및 코딩 영역의 3'에 위치할 때에도 인핸서 요소가 이의 효과를 발휘할 수 있다. 전사 종결 및 폴리아데닐화 신호는 코딩 영역의 3' 또는 하류에 위치한다.
작물 형질: 식물 형태학, 생리학, 성장 및 발달, 수율, 영양 강화, 질병 또는 해충 저항성, 또는 환경적 또는 화학적 내성을 포함하지만 이에 한정되지 않는 식물 특성이 작물 형질이다. "강화된 작물 형질"은 수율 증가 (비-스트레스 조건 하에서의 수율 증가 및 환경적 스트레스 조건 하에서의 수율 증가를 포함함)를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 작물 형질에서의 측정가능한 개선을 지칭한다. 스트레스 조건은, 예를 들어, 가뭄, 그늘, 진균성 질병, 바이러스성 질병, 박테리아성 질병, 곤충 감염, 선충류 감염, 저온 노출, 고온 노출, 삼투압 스트레스, 질소 영양소 이용가능성 감소, 인 영양소 이용가능성 감소 및 높은 식물 밀도를 포함할 수 있다. "수율"은 비제한적으로 식물 신장, 꼬투리 수, 식물 상에서의 꼬투리 위치, 마디사이 수, 꼬투리 파편 발생률, 곡물 크기, 마디 생성 및 질소 고정 효율, 영양소 동화 효율, 생물적 및 비생물적 스트레스에 대한 저항성, 탄소 동화, 식물 구조, 도복(lodging) 저항성, 종자 발아 백분율, 묘목 생장력, 및 연소 형질을 포함하는 다수의 성질에 영향을 받을 수 있다. 수율은 발아 효율 (스트레스를 받는 조건 하에서의 발아 포함), 성장률 (스트레스를 받는 조건 하에서의 성장률 포함), 이삭 수, 이삭 당 종자 개수, 종자 크기, 종자 조성 (전분, 오일, 단백질), 및 종자 내용물의 특성에 의해서도 영향을 받을 수 있다. 수율 증가는 주요 생화학적 화합물, 예컨대 질소, 인 및 탄수화물의 개선된 활용, 또는 환경적 스트레스, 예컨대 저온, 고온, 가뭄, 염 및 해충 또는 병원체의 공격에 대한 개선된 응답으로부터 초래될 수 있다. 본 개시내용에서 사용된 재조합 DNA는 식물 성장 조절인자의 변형된 발현 또는 세포 주기 또는 광합성 경로의 변형의 결과로서, 성장 및 발달이 개선된 식물, 궁극적으로는 개선된 수율을 제공하는데 사용될 수 있다. 작물 형질의 추가적인 예, 및 식물에서 이같은 형질을 변경시키는 것이 본원에서 제공되고/되거나 당업자가 이를 인지할 것이다.
변경: 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 본 개시내용의 핵산이 코딩하는 폴리펩티드)에서의 변경은, 이러한 용어가 본원에서 사용될 때, 폴리뉴클레오티드 서열에서의 임의의 결실, 삽입 및 점 돌연변이를 포함한다. 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA 서열에 대한 변경이 이러한 정의에 포함된다. 또한, 용어 "변경"은 폴리펩티드 서열에서의 결실, 삽입 및 기타 돌연변이를 지칭하는데 사용될 수 있다.
생산 또는 발현 수준의 변경: 생산 또는 발현의 대조군 수준과 비교하여, 핵산 분자 또는 아미노산 분자 (예를 들어 siRNA, miRNA, mRNA, 유전자, 폴리펩티드, 펩티드)의 생산 또는 발현 수준을 증가 또는 감소시키는 것에 의해 변화시키는 것.
증폭: 핵산과 관련하여 사용되는 경우, 이는 샘플 또는 시험편 내의 핵산 분자의 카피수를 증가시키는 기술을 지칭한다. 증폭의 예는 프라이머가 샘플 내의 핵산 주형에 혼성화되게 하는 조건 하에 대상체로부터 수집된 생물학적 샘플이 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 접촉되는 폴리머라제 연쇄 반응이다. 적절한 조건 하에 프라이머가 연장되고, 주형으로부터 해리된 후, 다시 어닐링(annealing)되고, 연장되고, 해리되어, 핵산의 카피 수를 증폭시킨다. 표준 기술을 사용하여 전기영동, 제한 효소 절단 패턴, 올리고뉴클레오티드 혼성화 또는 결찰, 및/또는 핵산 시퀀싱(sequencing)에 의해 시험관내 증폭 생성물을 특성화할 수 있다. 시험관내 증폭 기술의 다른 예로는 가닥 전치 증폭 (미국 특허 번호 5,744,311 참조); 무전사(transcription-free) 등온 증폭 (미국 특허 번호 6,033,881 참조); 수리 연쇄 반응 증폭 (WO 90/01069 참조); 리가제(ligase) 연쇄 반응 증폭 (EP-A-320 308 참조); 갭 필링(gap filling) 리가제 연쇄 반응 증폭 (미국 특허 번호 5,427,930 참조); 커플링(coupled) 리가제 검출 및 PCR (미국 특허 번호 6,027,889 참조); 및 NASBA™ RNA 무전사 증폭 (미국 특허 번호 6,025,134 참조)이 포함된다.
안티센스 , 센스 및 안티진 ( antigene ): DNA는 플러스 가닥으로 지칭되는 5' → 3' 가닥, 및 마이너스 가닥으로 지칭되는 3' → 5' 가닥인 2개의 역평행한 가닥이 있다. RNA 폴리머라제는 핵산을 5' → 3' 방향으로 부가하기 때문에, DNA의 마이너스 가닥이 전사 동안 RNA에 대한 주형으로서의 역할을 한다. 따라서, RNA 전사물의 서열은 마이너스 가닥에 상보적일 것이고, 플러스 가닥과 동일할 것이다 (U가 T를 치환하는 것은 제외).
안티센스 분자는 RNA 또는 DNA의 플러스 가닥에 특이적으로 혼성화할 수 있거나 또는 특이적으로 상보적일 수 있는 분자이다. 센스 분자는 DNA의 마이너스 가닥에 특이적으로 혼성화할 수 있거나 또는 특이적으로 상보적일 수 있는 분자이다. 안티진 분자는 DNA 표적에 대해 지시된 안티센스 또는 센스 분자이다. 안티센스 RNA (asRNA)는 센스 (코딩) 핵산 분자에 대해 상보적인 RNA 분자이다.
안티센스 억제: 이러한 용어는 번역되는 mRNA의 적어도 일부분에 대해 상보적인 RNA 분자가 세포 내에 존재하는 것으로 인한 유전자 발현 (예를 들어, 숙주 세포 게놈 또는 바이러스와 같은 병원체의 게놈에 대한 발현)의 세포질, 핵, 또는 세포소기관 억제를 기초로 하는 일군의 유전자 조절을 지칭한다.
cDNA (상보적 DNA ): 내부의 비-코딩 절편 (인트론(intron)) 및 전사 조절 서열이 결여된 DNA 조각. cDNA는 상응하는 RNA 분자의 번역 제어를 담당하는 비번역 영역 (UTR)을 함유할 수도 있다. 일반적으로 cDNA는 세포 또는 기타 샘플로부터 추출된 메신저 RNA로부터 역전사에 의해 실험실에서 합성된다.
키메라: 2개 이상의 상이한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 분자의 일부분의 융합 생성물. 예를 들어, "키메라 서열" 또는 "키메라 유전자"라는 구절은 2개 이상의 이종 부분으로부터 유래된 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 키메라 서열은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다.
키메라 전사 조절 영역: 상이한 폴리뉴클레오티드 공급원들로부터 조립된, 자신에게 작동가능하게 연결된 핵산의 전사를 지시하는 핵산 제어 또는 조절 서열의 어레이. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 키메라 전사 조절 영역은 공지된 프로모터 또는 기타 폴리뉴클레오티드 분자의 조작을 통해 생산될 수 있다. 예를 들어, 제1 천연 프로모터로부터의 이종 인핸서 도메인을 이의 부분적 또는 완전한 조절 요소(들) 세트와 함께 제2 프로모터에 융합시킴으로써, 키메라 전사 조절 영역은 하나 이상의 인핸서 도메인과 하나 이상의 프로모터를 조합할 수 있다. 본 개시내용은, 특히, 식물(들)에서 활성인 프로모터에 융합된 (즉, 작동가능하게 연결된) 하나 이상의 SCBV 인핸서 도메인을 함유하는 키메라 전사 조절 영역을 제공한다.
구축물: 하나 이상의 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자가 작동가능하게 연결되어 있는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는, 게놈 통합 또는 자가 복제가 가능한, 임의의 공급원으로부터 유래된 임의의 재조합 폴리뉴클레오티드 분자, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 자가 복제성 폴리뉴클레오티드 분자, 파지, 또는 선형 또는 원형 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드 분자.
대조군 식물: 예를 들어 트랜스제닉 식물에서의 강화 또는 변경된 작물 형질을 확인하기 위해, 트랜스제닉 식물에서 (예를 들어) 강화 또는 변경된 작물 형질을 부여하는 재조합 DNA를 함유하지 않는 식물이 비교를 위한 기준선으로서 사용된다. 적절한 대조군 식물은 트랜스제닉 식물을 생성시키는데 사용된 모계의 비-트랜스제닉 식물, 또는 시험 중인 특정 형질에 대해 적어도 비-트랜스제닉인 식물일 수 있다 (즉, 다른 이종 서열 또는 재조합 DNA 분자를 함유하도록 대조군 식물이 조작되었을 수 있다). 따라서, 일부 경우에 대조군 식물은 테스트 식물 내에 빈 벡터 또는 마커 유전자를 포함하지만, 재조합 DNA를 함유하지 않거나 또는 모든 재조합 DNA를 함유하지 않는 트랜스제닉 식물일 수 있다.
공동억제: 내인성 유전자에 대해 실질적으로 상동성인 외래 (이종) 유전자의 발현으로 외래 및 내인성 유전자 양쪽 모두의 발현 억제가 초래됨.
DNA ( 데옥시리보핵산 ): DNA는 대부분의 생물의 유전 물질을 포함하는 장쇄 중합체이다 (일부 바이러스는 리보핵산 (RNA)을 포함하는 유전자를 지닌다). DNA 중합체 내의 반복 단위는 4개의 상이한 뉴클레오티드이고, 이들 각각은 포스페이트 기가 부착된 데옥시리보스 당에 결합된 4개의 염기 (아데닌, 구아닌, 사이토신 및 티미딘) 중 하나를 포함한다. 뉴클레오티드 3중자 (코돈으로 지칭됨)가 폴리펩티드 내의 각각의 아미노산 또는 정지 신호를 코딩한다. 코돈이라는 용어는 DNA 서열이 전사되는 mRNA 내의 3개의 뉴클레오티드의 상응하는 (그리고 상보적인) 서열에 대해서도 사용된다.
달리 상술되지 않는 한, DNA 분자에 대한 임의의 언급은 이러한 DNA 분자의 역 상보물을 포함한다. 본원에서 문서에 의해 단일 가닥성이 요구되는 경우를 제외하고는, DNA 분자는 단일 가닥만 서술하도록 기재되었더라도 이중 가닥 DNA 분자의 양쪽 가닥을 포함한다.
디새츄라제: 본원에서 사용되는 경우에, 용어 "디새츄라제"는 관심 지방산 또는 전구체가 생산되도록 하나 이상의 지방산을 탈포화시킬 수 있는 (즉, 이중 결합을 도입할 수 있는) 폴리펩티드를 지칭한다. 식물-가용성 지방산 디새츄라제 효소는 포화 아실-ACP 기질 내로 구역-특이적으로 이중 결합을 도입할 수 있다. 아실-CoA 디새츄라제는 포화 지방 아실-CoA 기질 내로 구역-특이적으로 이중 결합을 도입한다. 이러한 반응은 디새츄라제 구조의 코어(core)를 형성하는 4-나선 다발에 의해 배위된 2-전자 환원 2철 센터에 의한 분자 산소의 활성화를 수반한다. 아실-CoA 델타-9 디새츄라제가 일부 실시양태에서 특히 흥미롭다.
지방산: 본원에서 사용되는 경우에, 용어 "지방산"은 다양한 사슬 길이, 예를 들어, 더 긴 사슬 길이 및 더 짧은 사슬 길이의 산이 공지되어 있지만 약 C12 내지 C22의 장쇄 지방족 산 (알칸산)을 지칭한다. 지방산의 구조는 x:yΔz 표기법으로 표시되고, 식 중, "x"는 특정 지방산 내의 탄소 (C) 원자의 총 개수이고, "y"는 산의 카르복실 끝부분으로부터 계수되는 위치 "z"에서의 탄소 사슬 내의 이중 결합의 개수이다.
코딩: 천연 상태에서 또는 당업자에게 공지된 방법으로 조작되었을 때 폴리뉴클레오티드 분자가 mRNA 및/또는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 생산하도록 전사 및/또는 번역될 수 있으면 폴리뉴클레오티드가 폴리펩티드를 코딩한다고 한다. 안티센스 가닥은 이같은 핵산의 상보물이고, 코딩 서열이 이로부터 추론될 수 있다.
인핸서 도메인: 유전자 발현의 전반적인 제어 측면을 부여하는 시스(cis)-작용 전사 조절 요소 (이전의 시스-요소). 인핸서 도메인은 전사를 조절하는 트랜스(trans)-작용 단백질 인자인 전사 인자에 결합하는 기능을 할 수 있다. 일부 인핸서 도메인은 1개를 초과하는 전사 인자에 결합하고, 전사 인자들은 1개를 초과하는 인핸서 도메인과 상이한 친화력으로 상호작용할 수 있다. 결실 분석 (프로모터의 5' 끝부분 또는 내부로부터 하나 이상의 뉴클레오티드를 결실시킴), DNase I 풋 프린팅(foot printing)을 사용하는 DNA 결합 단백질 분석, 메틸화 간섭, 전기영동 이동성-시프트(shift) 검정법, 결찰-매개 PCR에 의한 생체내 게놈 풋 프린팅, 및 기타 통상적인 검정법을 포함하는 다수의 기술에 의해; 또는 통상적인 DNA 서열 비교 방법을 사용하는 공지된 시스-요소 모티프와의 DNA 서열 비교에 의해 인핸서 도메인이 확인될 수 있다. 하나 이상의 뉴클레오티드의 돌연변이유발 (또는 치환)에 의해 또는 기타 통상적인 방법에 의해 인핸서 도메인의 미세 구조를 추가로 연구할 수 있다. 화학적 합성에 의해 또는 이같은 요소를 포함하는 프로모터로부터의 단리에 의해 인핸서 도메인을 수득할 수 있고, 이는 후속 조작을 용이하게 하기 위한 유용한 제한 효소 부위를 함유하는 추가적인 플랭킹 뉴클레오티드와 함께 합성될 수 있다.
(유전자) 발현: 전사된 RNA 분자로의 DNA 분자의 전사. 더욱 일반적으로, 유전자의 코딩 정보가 세포 내에서 존재하고 작동하는 구조로 전환되는 프로세스. 발현된 유전자는 mRNA로 전사된 후 단백질로 번역되는 것들 및 RNA로 전사되지만 단백질로 번역되지 않는 것들 (예를 들어, siRNA, 전송 RNA 및 리보솜 RNA)을 포함한다. 따라서, 표적 서열, 예컨대 유전자 또는 유전자의 프로모터 영역의 발현은 mRNA, 단백질 또는 양쪽 모두의 발현을 초래할 수 있다. 표적 서열의 발현이 억제 또는 강화 (감소 또는 증가)될 수 있다. 유전자 발현은 시간적, 공간적, 발생적, 또는 형태학적 품질, 뿐만 아니라 정량적 또는 정성적 지표와 관련되는 것으로 기술될 수 있다.
유전자 조절 활성: 작동가능하게 연결된 전사가능 또는 번역가능한 폴리뉴클레오티드 분자의 전사 또는 번역에 영향을 미치는 폴리뉴클레오티드의 능력. 유전자 조절 활성이 있는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자는 작동가능하게 연결된 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자의 시간적 또는 공간적 발현을 제공할 수 있거나, 또는 이의 수준 또는 속도를 조정할 수 있다. 유전자 조절 활성이 있는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자는 프로모터, 인트론, 리더(leader), 또는 3' 전사 종결 영역을 포함할 수 있다.
유전자 침묵화: 유전자 침묵화는 염색질 재구성과 같은 게놈 (DNA) 수준에서의 효과, 또는 전사물 안정성 또는 번역에 대한 효과를 통한 전사후 수준에서의 효과 (이에 한정되지는 않음)의 결과로서의 유전자 발현의 결여 (또는 감소)를 지칭한다. 현재의 증거는 RNA 간섭 (RNAi)이 전사 및 전사후 유전자 침묵화에서 수반되는 주요 프로세스임을 시사한다.
RNAi는 전사 및/또는 전사후 수준에서 이의 효과를 발휘하기 때문에, RNAi가 동일한 유전자로부터의 별법적인 전사물을 특이적으로 억제하는데 사용될 수 있을 것으로 여겨진다.
이종성: 정상적으로는 (예를 들어, 야생형 서열에서는) 제2 서열에 인접하여 발견되지 않는 서열 유형. 한 실시양태에서, 이러한 서열은 제2 서열과 상이한 유전자 공급원, 예컨대 바이러스 또는 생물 또는 종으로부터의 것이다.
혼성화: 올리고뉴클레오티드 및 이의 유사체는 상보적인 염기들 간의 왓슨-크릭, 후그스틴 또는 역-후그스틴 수소 결합을 포함하는 수소 결합에 의해 혼성화한다. 일반적으로, 핵산은 피리미딘 (사이토신 (C), 우라실 (U), 및 티민 (T)) 또는 퓨린 (아데닌 (A) 및 구아닌 (G))인 질소성 염기로 이루어진다. 이러한 질소성 염기들은 피리미딘과 퓨린 사이에 수소 결합을 형성하고, 피리미딘에 대한 퓨린의 결합은 염기 쌍형성으로 지칭된다. 더욱 구체적으로, A는 T 또는 U에 수소 결합할 것이고, G는 C에 결합할 것이다. RNA 분자에서, G는 U에 또한 결합할 것이다. 상보적은 2개의 별개의 핵산 서열 또는 동일한 핵산 서열의 2개의 별개의 영역 사이에서 발생하는 염기 쌍형성을 지칭한다.
특정 엄격도를 초래하는 혼성화 조건은 선택된 혼성화 방법의 성질 및 혼성화되는 핵산 서열들의 조성 및 길이에 따라 변할 것이다. 일반적으로, 혼성화 온도 및 혼성화 완충제의 이온 강도 (특히 Na+ 농도)가 혼성화의 엄격성을 결정할 것이다. 특정 엄격도를 달성하는데 요구되는 혼성화 조건에 관한 계산이 본원에 참고로 포함된 문헌 [Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]의 9장 및 11장에 논의되어 있다.
하기는 혼성화 조건의 예시적인 세트이고, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
매우 높은 엄격성 (90％ 서열 동일성을 공유하는 서열들을 검출함)
혼성화: 65℃에서 16시간 동안 5x SSC
2회 세정: 각각 실온 (RT)에서 15분 동안 2x SSC
2회 세정: 각각 65℃에서 20분 동안 0.5x SSC
높은 엄격성 (80％ 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열들을 검출함)
혼성화: 65℃-70℃에서 16-20시간 동안 5x-6x SSC
2회 세정: 각각 RT에서 5-20분 동안 2x SSC
2회 세정: 각각 55℃-70℃에서 30분 동안 1x SSC
낮은 엄격성 (50％ 초과의 서열 동일성을 공유하는 서열들을 검출함)
혼성화: RT 내지 55℃에서 16-20시간 동안 6x SSC
2회 이상 세정: 각각 RT 내지 55℃에서 20-30분 동안 2x-3x SSC
시스: 2개의 서열이 RNA 또는 DNA의 동일한 조각에 위치함을 가리킴.
트랜스: 2개의 서열이 RNA 또는 DNA의 상이한 조각에 위치함을 가리킴.
산업 작물: 주로 인간 또는 동물의 소비를 위해 또는 산업 공정에서의 용도 를 위해 (예를 들어, 제조용 지방산 또는 알콜 생산용 당의 공급원으로서) 성장되는 작물. 다수의 경우에 식물 또는 식물로부터 생산된 산물 (예를 들어, 감미료, 오일, 가루, 또는 박(meal))이 소비될 수 있는 것으로 이해될 것이다; 따라서, 산업 작물의 하위집합은 식품 작물이다. 식품 작물의 예는 옥수수, 대두, 쌀, 밀, 유채, 목화, 귀리, 보리 및 감자 식물을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 산업 작물 (식품 작물 포함)의 기타 예가 본원에서 열거된다.
간섭 또는 억제 (표적 서열 발현의 간섭 또는 억제): 이러한 구절은 표적 서열을 보유하는 분자의 발현 및/또는 안정성을 측정가능하게 감소시키는 소형 RNA, 예컨대 siRNA 또는 miRNA, 또는 기타 분자의 능력을 지칭한다. 표적 서열은 DNA 서열, 예컨대 유전자 또는 유전자의 프로모터 영역, 또는 RNA 서열, 예컨대 mRNA를 포함할 수 있다. 발현의 "간섭 또는 억제"는 유전자 또는 서열의 최종 생성물의 감소, 예를 들어, 코딩된 단백질 또는 단백질, 핵산, 기타 생체분자의 발현 또는 기능, 또는 표적 서열에 영향을 받는 생물학적 기능의 감소를 고려하고, 따라서 mRNA 전사물 또는 기타 표적 서열의 양 또는 수명의 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 소형 RNA 또는 기타 분자는 표적 서열의 발현을 억제하는 염색질 변형을 안내한다. 이러한 구절은 상대적이고, 서열의 절대적인 억제 (저해)를 요구하지 않는 것으로 이해된다. 따라서, 특정 실시양태에서, 표적 서열의 발현을 간섭 또는 억제하는 것은 소형 RNA 또는 기타 분자 (예컨대 하나 이상의 소형 RNA를 코딩하는 벡터 또는 기타 구축물)의 적용 후에 서열이 적용 전보다 적어도 5％ 적게, 적어도 10％ 적게, 적어도 15％ 적게, 적어도 20％ 적게, 적어도 25％ 적게, 또는 그 이상으로 감소되어 발현되는 것을 필요로 한다. 따라서, 일부 특정 실시양태에서, 소형 RNA 또는 기타 분자의 적용은 표적 서열의 발현을 약 30％, 약 40％, 약 50％, 약 60％ 또는 이를 초과하는 값만큼 감소시킨다. 특정 예에서, 소형 RNA 또는 기타 분자가 특히 효과적인 경우에, 70％, 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 이를 초과하는 값만큼 발현이 감소된다.
단리된: "단리된" 생물학적 성분 (예컨대 핵산, 펩티드 또는 단백질)은 이러한 성분들이 천연적으로 존재하는 생물의 세포 내의 다른 생물학적 성분, 예를 들어, 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 및 단백질로부터 실질적으로 분리되거나, 떨어져서 생산되거나, 또는 정제된다. 따라서 "단리된" 핵산, 펩티드 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질을 포함한다. 이러한 용어는 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산, 펩티드 및 단백질, 뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산 또한 포함한다.
대사체 ( metabolome ): 단일 생물, 샘플, 조직, 세포, 또는 기타 구획이 분할된 곳 내에 존재하는 비교적 낮은 분자량의 분자 (대사산물) 전체. 예를 들어, 대사체는 대사 중간체, 호르몬 및 기타 신호전달 분자, 및 2차 대사산물을 포함할 수 있다. 대표적인 대사체는 생물학적 샘플, 예컨대 식물, 식물 일부분, 또는 식물 샘플 내에서, 또는 이의 현탁액 또는 추출물에서 발견되는 대사산물 전체를 포함한다. 이같은 분자의 예는 산 및 관련 화합물; 모노-, 디- 및 트리-카르복실산 (포화, 불포화, 지방족 및 고리형, 아릴, 알크아릴); 알도-산, 케토-산; 락톤 형태; 지베렐린; 아브시스산; 알콜, 폴리올, 유도체, 및 관련 화합물; 에틸 알콜, 벤질 알콜, 메탄올; 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 피톨; 이노시톨, 푸르푸릴 알콜, 멘톨; 알데히드, 케톤, 퀴논, 유도체, 및 관련 화합물; 아세트알데히드, 부티르알데히드, 벤즈알데히드, 아크롤레인, 푸르푸랄, 글리옥살; 아세톤, 부타논; 안트라퀴논; 탄수화물; 단당류, 이당류, 삼당류; 알칼로이드, 아민, 및 기타 염기; 피리딘 (니코틴산, 니코틴아미드 포함); 피리미딘 (사이티딘, 티민 포함); 퓨린 (구아닌, 아데닌, 크산틴/하이포크산틴, 키네틴 포함); 피롤; 퀴놀린 (이소퀴놀린 포함); 모르피난, 트로판, 신코난; 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 유도체, 및 관련 화합물; 구아노신, 사이토신, 아데노신, 티미딘, 이노신; 아미노산, 올리고펩티드, 유도체, 및 관련 화합물; 에스테르; 페놀 및 관련 화합물; 헤테로고리형 화합물 및 유도체; 피롤, 테트라피롤 (코리노이드 및 포르핀/포르피린, w/w/o 금속-이온); 플라보노이드; 인돌; 지질 (지방산 및 트리글리세리드 포함), 유도체, 및 관련 화합물; 카로티노이드, 피토엔; 및 스테롤, 이소프레노이드 (테르펜 포함)을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
마이크로 RNA ( miRNA ): 뉴클레오티드 약 21개 길이이고 동물 및 식물이 포함되는 다양한 생물에서 발견되는 소형의 비-코딩 RNA 유전자 생성물. miRNA 유전자로부터 유래된 구조화된 폴드백(foldback)-형성 전구체 전사물로부터 발생하는 것을 제외하고는, miRNA는 구조적으로 siRNA와 유사하다. miRNA 유전자의 1차 전사물은 헤어핀 구조를 형성하고, 이는 miRNA 듀플렉스가 산출되도록 멀티도메인 RNaseIII-유사 뉴클레아제(nuclease) DICER 및 DROSHA (동물) 또는 DICER-LIKE1 (DCL1; 식물)에 의해 프로세싱된다. 듀플렉스가 풀린 후에 성숙형 miRNA가 RISC 복합체 내로 혼입된다. 식물 miRNA는 완벽하거나 거의 완벽한 상보성이 있는 이의 RNA 표적과 상호작용한다.
뉴클레오티드: 용어 뉴클레오티드는 당에 연결된 염기, 예컨대 피리미딘, 퓨린 또는 이의 합성 유사체, 또는 펩티드 핵산 (PNA)에서와 같이 아미노산에 연결된 염기를 포함하는 단량체를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드 내의 1개의 단량체이다. 뉴클레오티드 서열은 올리고뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드 내의 염기의 서열을 지칭한다.
DNA의 주요 뉴클레오티드는 데옥시아데노신 5'-트리포스페이트 (dATP 또는 A), 데옥시구아노신 5'-트리포스페이트 (dGTP 또는 G), 데옥시사이티딘 5'-트리포스페이트 (dCTP 또는 C) 및 데옥시티미딘 5'-트리포스페이트 (dTTP 또는 T)이다. RNA의 주요 뉴클레오티드는 아데노신 5'-트리포스페이트 (ATP 또는 A), 구아노신 5'-트리포스페이트 (GTP 또는 G), 사이티딘 5'-트리포스페이트 (CTP 또는 C) 및 우리딘 5'-트리포스페이트 (UTP 또는 U)이다. 이노신 또한 뉴클레오티드에서 DNA 또는 RNA 내로 통합될 수 있는 염기이다 (각각 dITP 또는 ITP).
오일-생산 종 (식물): 특정 기관, 주로 종자에서 트리아실글리세롤을 생산 및 저장하는 식물 종. 이같은 종은 대두 (글리신 막스(Glycine max)), 평지씨 및 캐놀라 (예컨대 브라시카 나푸스(Brassica napus), 브라시카 라파(Brassica rapa) 및 브라시카 캄페스트리스(Brassica campestris)), 해바라기 (헬리안투스 아누스(Helianthus annus)), 목화 (고시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum)), 옥수수 (제아 마이스(Zea mays)), 코코아 (테오브로이나 카카오(Theobroina cacao)), 홍화 (카르타무스 틴크토리우스(Carthamus tinctorius)), 기름 야자 (엘라에이스 구이네엔시스(Elaeis guineensis)), 코코넛 야자 (코코스 누시페라(Cocos nucifera)), 아마 (리눔 우시타티시무인(Linum usitatissimuin)), 캐스터 (리시누스 콤미우니스(Ricinus commiunis)) 및 땅콩 (아라키스 히포가에아(Arachis hypogaea))을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
올리고뉴클레오티드: 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 약 6개 내지 약 300개 길이의 포스포디에스테르 결합으로 연결된 다수의 뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드 유사체는 올리고뉴클레오티드와 유사하게 기능하지만 비-천연 발생 부분이 있는 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 유사체는 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드와 같이 비-천연 발생 부분, 예컨대 변경된 당 모이어티(moiety) 또는 당 사이 결합을 함유할 수 있다. 천연 발생 폴리뉴클레오티드의 기능성 유사체는 RNA 또는 DNA에 결합할 수 있다.
작동가능하게 연결됨: 이러한 용어는 성분들의 정상적인 기능이 수행될 수 있도록 성분들, 특히 뉴클레오티드 서열들이 병치되는 것을 지칭한다. 따라서, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적인 관계로 놓이는 경우에 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치면 프로모터가 이러한 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된 DNA 서열들은 인접하고, 2개의 단백질-코딩 영역을 연결시키기 위해 필요한 경우에는 동일한 리딩 프레임 내에 존재한다. 조절 서열(들)에 "작동가능하게 연결된" 코딩 서열은 조절 서열의 조절 제어 (예를 들어, 전사 및/또는 번역 제어) 하에 코딩 서열이 발현될 수 있는 뉴클레오티드 서열들의 배치를 지칭한다.
ORF (오픈 리딩 프레임): 어떠한 종결 코돈도 없이 아미노산을 코딩하는 일련의 뉴클레오티드 3중자 (코돈). 이러한 서열은 일반적으로 펩티드로 번역될 수 있다.
서열 동일성 백분율: (전체적으로 비교창 전반에 걸쳐 기준 서열의 20％ 미만의 적합한 뉴클레오티드 삽입, 결실 또는 갭(gap)이 있으면서) 2개의 서열이 최적으로 정렬되었을 때, 테스트 ("대상체") 폴리뉴클레오티드 분자 (또는 이의 상보적 가닥)에 비교된 기준 ("질의") 폴리뉴클레오티드 분자 (또는 이의 상보적 가닥)의 선형 폴리뉴클레오티드 서열 내의 동일한 뉴클레오티드의 백분율. 비교창을 정렬하기 위한 서열들의 최적 정렬은 당업자에게 주지되어 있고, 스미스(Smith) 및 워터만(Waterman)의 국소 상동성 알고리즘, 니들만(Needleman) 및 원취(Wunsch)의 상동성 정렬 알고리즘, 피어슨(Pearson) 및 리프만(Lipman)의 유사성 검색 방법과 같은 도구를 사용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 알고리즘의 컴퓨터 실행, 예컨대 GCG® 위스콘신 패키지(Wisconsin Package)® (액설리스 인크(Accelrys Inc.), 미국 매사추세츠추 버링톤 소재)의 일부로서 이용가능한 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA를 사용하여 이같은 비교가 수행된다. 테스트 서열 및 기준 서열의 정렬된 분절들에 대한 "동일성 분율"은 2개의 정렬된 서열들이 공유하는 동일한 성분의 개수를 기준 서열 분절 (즉, 전체 기준 서열 또는 기준 서열의 더 작은 한정된 부분) 내의 성분의 총수로 나눈 것이다. 서열 동일성 백분율은 동일성 분율 × 100으로 표현된다. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열의 비교는 전장 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부분에 대한 것일 수 있거나, 또는 더 긴 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 것일 수 있다. 실질적인 서열 동일성 백분율은 약 80％ 이상의 서열 동일성, 약 90％ 이상의 서열 동일성, 또는 이보다 훨씬 더 높은 서열 동일성, 예컨대 약 98％ 또는 약 99％ 서열 동일성이다.
식물: 임의의 식물 및 이의 자손. 이러한 용어는 종자, 절단물, 덩이줄기, 열매, 꽃 등을 포함하는 식물의 일부분을 또한 포함한다. 다양한 실시양태에서, 식물이라는 용어는 재배된 식물 종, 예컨대 옥수수, 목화, 캐놀라, 해바라기, 대두, 수수, 알팔파, 밀, 벼, 유실수 및 채소, 및 잔디 및 장식용 식물 종을 지칭한다. 식물 세포라는 용어는, 본원에서 사용될 때, 원형질 및 주위의 세포벽으로 이루어지는 식물의 구조적 및 생리학적 단위를 지칭한다. 식물 기관이라는 용어는, 본원에서 사용될 때, 식물의 명료하고 시각적으로 구별되는 부분, 예컨대 뿌리, 줄기, 잎 또는 씨눈을 지칭한다.
더욱 일반적으로, 식물 조직이라는 용어는 식물 내이거나 배양 중인 임의의 조직을 지칭한다. 이러한 용어는 전체 식물, 식물 세포, 식물 기관, 원형질, 세포 배양물, 또는 구조적 및 기능적 단위로 조직화된 임의의 식물 세포 군을 포함한다.
폴리뉴클레오티드 분자: 게놈 또는 합성 기원의 단일- 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA; 즉, 5' (상류) 끝부분 → 3' (하류) 끝부분으로 판독되는, 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 중합체.
폴리펩티드 분자: 아미드 결합을 통해 함께 연결된 아미노산 잔기들이 단량체인 중합체. 아미노산이 알파-아미노산인 경우, L-광학 이성질체 또는 D-광학 이성질체가 사용될 수 있고, L-이성질체가 바람직하다. 폴리펩티드 또는 단백질이라는 용어는, 본원에서 사용될 때, 임의의 아미노산 서열을 포괄하고, 당단백질과 같은 변형된 서열을 포함한다. 폴리펩티드라는 용어는 천연 발생 단백질, 뿐만 아니라 재조합에 의해 또는 합성에 의해 생산된 것을 포함하도록 명확하게 의도된다.
전사후 유전자 침묵화 ( PTGS ): 억제 메커니즘이 전사 후에 발생하는 유전자 침묵화의 형태. 이는 특이적인 RNA 표적의 항정 상태 수준의 감소 또는 번역 억제를 초래할 수 있다 (문헌 [Tuschl, ChemBiochem, 2: 239-245, 2001]). 이러한 문헌에서, RNA 간섭 (RNAi) 및 전사후 공동억제라는 용어가 전사후 유전자 침묵화를 가리키는데 종종 사용된다.
프로모터: 예를 들어, RNA 폴리머라제 II 및 기타 단백질 (트랜스-작용 전사 인자)의 인식 및 결합에 의해 전사를 지시하여 전사를 개시시키는 핵산 제어 서열의 어레이. 프로모터는 전사 시작 부위 근처의 필수 핵산 서열, 예컨대 폴리머라제 II형 프로모터의 경우의 TATA 요소를 포함한다. 최소한으로, 프로모터는 전형적으로 적어도 RNA 폴리머라제 결합 부위를 함께 포함하고, 전사 인자에 의한 점유에 응답하여 전사를 조정하는 하나 이상의 전사 인자 결합 부위를 또한 포함할 수 있다. 프로모터 (및 프로모터를 생산하도록 조립될 수 있는 요소)의 대표적인 예가 본원에서 기술된다. 프로모터는 이의 시간적, 공간적, 또는 발생적 발현 패턴에 의해 규정될 수 있다.
식물 프로모터는 식물 세포에서 기능성인 천연 또는 비-천연 프로모터이다.
조직-특이적이고 발생적으로 조절되는 프로모터는 β-콘글리시닌 7Sα 프로모터 및 종자-특이적 프로모터를 포함한다. 종자 색소체에서의 우선적인 발현에 유용한 식물의 기능성 프로모터는 오일 종자에서의 지방산 생합성에서 수반되는 단백질 및 식물 저장 단백질로부터의 것을 포함한다. 이같은 프로모터의 예는 파세올린, 나핀, 제인, 대두 트립신 억제제, ACP, 스테아로일-ACP 디새츄라제, 및 올레오신과 같은 전사가능한 핵산 분자 서열로부터의 5' 조절 영역을 포함한다. 또 다른 예시적인 조직-특이적 프로모터는 종자 조작에 특이적인 렉틴 프로모터이다.
단백질: 유전자에 의해 발현되고 아미노산으로 이루어지는, 생물학적 분자, 예를 들어 폴리펩티드.
원형질체: 세포 배양물 또는 전체 식물로의 형질전환 및/또는 재생에 대한 잠재력이 있는, 세포벽이 없는 단리된 식물 세포.
정제됨: 정제됨이라는 용어는 절대적인 순도를 요구하지 않는다; 그보다는, 이는 상대적인 용어로서 의도된다. 따라서, 예를 들어, 정제된 융합 단백질 제제는 단백질이 이의 생성 환경, 예를 들어 세포 내 또는 생화학적 반응 챔버에 있는 것보다 융합 단백질이 더욱 강화된 것이다. 바람직하게는, 융합 단백질이 제제의 총 단백질 함량의 50％ 이상을 나타내도록 융합 단백질 제제가 정제된다.
재조합: 재조합 핵산은 천연 발생이 아닌 서열을 지니거나 또는 인공적으로 조합되지 않은 경우에는 2개의 분리된 서열 분절의 인공적인 조합에 의해 제조된 서열을 지니는 것이다. 이러한 인공적인 조합은 종종 화학적 합성에 의해, 또는 더욱 통상적으로는 예를 들어 유전 공학 기술에 의한 단리된 핵산 절편들의 인공적인 조작에 의해 달성된다.
유사하게, 재조합 단백질은 재조합 핵산 분자에 의해 코딩되는 것이다.
조절가능한 프로모터: 작용제, 예컨대 전사 인자, 화학적 화합물, 환경 조건 또는 핵산 분자에 의해 (직접적으로 또는 간접적으로) 활성이 조절되는 프로모터.
유전자 발현 조절: 유전자 발현에 영향을 미치는 작용제의 발현, 생산 또는 활성을 증가시키거나 감소시킴으로써 유전자 발현을 제어하는 프로세스. 작용제는 단백질, 예컨대 전사 인자, 또는 핵산 분자, 예컨대 miRNA 또는 siRNA 분자일 수 있고, 이들은 유전자 또는 이의 상류의 조절 서열, 또는 유전자가 코딩하는 mRNA와 접촉되었을 때, 유전자 발현을 증가 또는 감소시킨다.
조절 서열 또는 요소: 일반적으로 이러한 용어는 작동가능하게 연결된 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자의 전사 또는 번역, 및 이에 따른 유전자 발현에 영향을 미치거나 이를 제어하는 일군의 폴리뉴클레오티드 분자 (예컨대 DNA 서열을 지니는 DNA 분자)를 지칭한다. 프로모터, 인핸서, 리더, 인트론, 유전자좌 제어 영역, 경계 요소/인슐레이터(insulator), 사일런서, 매트릭스 부착 영역 (스캐폴드(scaffold) 부착 영역으로 또한 지칭됨), 리프레서(repressor), 전사 종결자 (기존의 전사 종결 영역), 복제 기원, 동원체, 및 감수분열 재조합 핫스팟(hotspot)이 이러한 용어에 포함된다. 프로모터는 RNA 폴리머라제의 결합 부위로서 작용하고 이로부터 전사가 개시되는 유전자의 5' 끝부분에 인접한 DNA의 서열이다. 인핸서는, 일반적으로 인핸서의 배향 또는 프로모터로부터의 거리와 독립적으로, 프로모터로부터의 전사 수준을 상승시키는 제어 요소이다. 유전자좌 제어 영역 (LCR)은 자신이 연결된 유전자에 조직-특이적으로 일시적으로 조절되는 발현을 부여한다. LCR은 유전자와 관련된 이의 위치와 독립적으로 기능하지만, 카피수에 의존적이다. 이는 다른 인자들이 DNA에 결합할 수 있도록 뉴클레오솜 구조를 개방시키는 기능을 하는 것으로 여겨진다. LCR은 복제 시기 및 기원 용법에도 영향을 미칠 수 있다. 인슐레이터 (경계 요소로 또한 공지됨)는 주변 염색질의 효과를 차단함으로써 유전자 전사 활성화 (또는 불활성화)를 방지하는 DNA 서열이다. 사일런서 및 리프레서는 유전자 발현을 억제하는 제어 요소이다; 이들은 이의 배향 또는 유전자로부터의 거리와 독립적으로 유전자에 작용한다. 스캐폴드 부착 영역으로 또한 공지된 매트릭스 부착 영역 (MAR)은 핵 스캐폴드에 결합하는 DNA 내의 서열이다. 이는 가능하게는 염색체를 조절 도메인 내로 분리함으로써 전사에 영향을 미칠 수 있다. MAR이 염색체 내의 더 높은 차수의 고리 구조를 매개하는 것으로 여겨진다. 전사 종결자는 RNA 폴리머라제가 주형으로부터 방출되는 부근의 유전자 내의 영역이다. 복제 기원은 세포 분열의 DNA 합성 또는 복제 단계 동안 DNA의 복제 프로세스를 시작하는 게놈 영역이다. 감수분열 재조합 핫스팟은 감수분열 동안 평균보다 더욱 빈번하게 재조합되는 게놈 영역이다. 조절 영역 내의 특정 뉴클레오티드가 다중 기능을 수행할 수 있다. 예를 들어, 특정 뉴클레오티드가 프로모터의 일부분일 수 있고, 전사 활성화제 단백질의 결합에 참여할 수 있다.
세포 (예를 들어, 식물 또는 식물 세포)에서 기능하는 단리된 조절 요소는, 예를 들어, 유전 공학을 통해, 식물 표현형을 변형시키는데 유용하다.
RNA: 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 리보핵산 단량체들의 전형적으로 선형인 중합체. 천연 발생 RNA 분자는 3가지 일반적인 부류에 속한다: 메신저 RNA (mRNA, 단백질을 코딩함), 리보솜 RNA (rRNA, 리보솜의 성분), 및 운반 RNA (tRNA, 단백질 합성 동안 아미노산 단량체를 리보솜으로 운반하는 것을 담당하는 분자). 메신저 RNA는 이핵성 (hnRNA) 및 막-회합 폴리솜 RNA (조면 소포체에 부착됨)를 포함한다. 총 RNA는 모든 유형의 RNA 분자의 비균질 혼합물을 지칭한다.
RNA 간섭 ( RNAi ): 소형 RNA (miRNA 및 siRNA 포함)를 수반하는 유전자 침묵화 메커니즘이 광범위한 용어 RNAi 하에 빈번하게 지칭된다. RNAi의 천연 기능은 이동성 유전 요소 예컨대 트랜스포손(transposon) 및 바이러스의 침입에 대한 게놈 보호, 및 유전자 발현의 조절을 포함한다.
RNA 간섭은 생물 내의 유전자의 발현의 불활성화 또는 억제를 초래한다. RNAi는 2가지 일반적인 경로 중 하나로 촉발될 수 있다. 먼저, 억제 표적인 RNA에 대한 서열 상보성이 있는 짧은 간섭 RNA (siRNA, 일반적으로 뉴클레오티드 ~21개 길이이고, 각각의 3' 끝부분에 2개의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드가 있는 dsRNA 듀플렉스 형태로 전달됨)의 직접적인 세포 전달에 의해 촉발될 수 있다. 두 번째로, 다양한 유형의 디자인된 발현된 유전자로부터 생체 내에서 siRNA가 형성되는 여러 방법 중 하나에 의해 RNAi가 촉발될 수 있다. 전형적으로 이러한 유전자들은 siRNA를 형성하도록 천연 효소 (DICER 또는 DCL)에 의해 프로세싱되는 분자내 또는 분자간 듀플렉스 (dsRNA)를 형성하는 RNA 분자를 발현한다. 일부 경우에, 이러한 유전자들은 완전하거나 거의 완전한 염기 쌍이 있는 "헤어핀"-형성 RNA 전사물을 발현한다; 불완전한 헤어핀-형성 전사물 중 일부로 마이크로RNA (miRNA)로 명명되는 특별한 유형의 소형 RNA가 산출된다. 양쪽의 일반적인 방법에서, RNA-분해 효소 (RISC로 명명됨)가 표적 RNA를 절단하거나 침묵화시키도록 지시하는 "가이드 서열"로서 기능하는 것이 siRNA (또는 miRNA)이다. 일부 경우에, RNAi-유도 유전자를 트랜스제닉 생물의 게놈 내로 통합시키는 것이 이롭다. 예는 RNAi-유도 트랜스진에 의해 특정 유전자를 억제하도록 변형된 식물일 것이다. 현재 실행 중인 대부분의 방법에서, dsRNA (분자내 또는 헤어핀, 또는 2개의 전사물이 어닐링하여 dsRNA를 형성하는 분자간)를 발현하는 트랜스진에 의해 트랜스제닉 식물에서 RNAi가 촉발된다.
RNA 침묵화: RNA-기반 유전자 침묵화 또는 RNAi를 가리키도록 사용되는 일반적인 용어.
서열 동일성: 2개의 핵산 서열, 또는 2개의 아미노산 서열 간의 유사성이 다르게는 서열 동일성으로 지칭되는 서열들 간의 유사성의 관점에서 표현된다. 서열 동일성은 동일성 (또는 유사성 또는 상동성) 백분율의 관점에서 종종 측정된다; 백분율이 더 높을수록, 2개의 서열이 더욱 유사하다. 이중특이적 융합 단백질의 상동체는 표준 방법을 사용하여 정렬되었을 때 비교적 높은 정도의 서열 동일성을 보유할 것이다.
비교를 위한 서열 정렬 방법이 업계에 주지되어 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이 문헌 [Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981)]; [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443, 1970)]; [Pearson and Lipman (PNAS. USA 85: 2444, 1988)]; [Higgins and Sharp (Gene, 73: 237-244, 1988)]; [Higgins and Sharp (CABIOS 5: 151-153, 1989)]; [Corpet et al. (Nuc. Acids Res. 16: 10881-90, 1988)]; [Huang et al. (Comp. Appls Biosci. 8: 155-65, 1992)]; 및 [Pearson et al. (Methods in Molecular Biology 24: 307-31, 1994)]에 기술되어 있다. 문헌 [Altschul et al. (Nature Genet., 6: 119-29, 1994)]은 서열 정렬 방법 및 상동성 계산의 상세한 고려사항을 제시한다.
정렬 도구 ALIGN (문헌 [Myers and Miller, CABIOS 4: 11-17, 1989]) 또는 LFASTA (문헌 [Pearson and Lipman, 1988])를 사용하여 서열 비교를 수행할 수 있다 (Internet Program ⓒ 1996, W. R. Pearson and the University of Virginia, "fasta20u63" version 2.0u63, 1996년 12월 배포). ALIGN은 서로에 대해 전체 서열을 비교하는 한편, LFASTA는 국소적인 유사성의 영역들을 비교한다. 이러한 정렬 도구 및 이들 각각의 지침서가 인터넷 http://biology.ncsa.uiuc.edu 상에서 입수가능하다.
개시된 이중특이적 융합 단백질의 오르토로그(ortholog)는 디폴트 파라미터로 설정된 ALIGN을 사용하여 이중특이적 융합 단백질의 아미노산 서열과의 전장 정렬에 걸쳐 계수된 75％ 초과의 서열 동일성을 전형적으로 특징으로 한다. 기준 서열에 대한 유사성이 더욱 더 높은 단백질은 이러한 방법에 의해 평가되었을 때 증가되는 백분율의 동일성, 예컨대 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 92％ 이상, 95％ 이상, 또는 98％ 이상의 서열 동일성을 나타낼 것이다. 또한, 개시된 융합 단백질의 결합 도메인 1개 또는 양쪽 모두의 전장에 걸쳐 서열 동일성이 비교될 수 있다. 이같은 경우에, 동일성 백분율은 본질적으로 전장 서열 동일성에 대해 논의된 것과 유사할 것이다.
전체 서열보다 유의하게 더 적은 서열이 서열 동일성에 대해 비교되는 경우, 상동체는 전형적으로 아미노산 10-20개의 짧은 창에 걸쳐 80％ 이상의 서열 동일성을 보유할 것이고, 기준 서열에 대한 이의 유사성에 따라 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 또는 99％ 이상의 서열 동일성을 보유할 수 있다. LFASTA를 사용하여 이같은 짧은 창에 걸친 서열 동일성을 결정할 수 있다; 월드와이드웹 주소 //biology.ncsa.uiuc.edu에서 방법을 확인할 수 있다. 당업자는 이러한 서열 동일성 범위가 지침용으로만 제공된다는 것을 이해할 것이다; 제공된 범위 밖에 속하는 강하게 유의한 상동체가 수득될 수 있는 것이 전적으로 가능하다. 본 개시내용은 상기 기술된 펩티드 상동체 뿐만 아니라, 이같은 상동체를 코딩하는 핵산 분자를 또한 제공한다.
2개의 핵산 분자가 밀접하게 관련된다는 것을 별법적으로 나타내는 것은 2개의 분자가 엄격한 조건 하에 서로 혼성화한다는 것이다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고, 상이한 환경 파라미터 하에 상이하다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 및 pH 하에서의 특정 서열에 대한 열 융점 (Tm)보다 약 5℃ 내지 20℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은 표적 서열의 50％가 완전하게 매칭되는 프로브에 혼성화하는 온도 (규정된 이온 강도 및 pH 하에서의 온도)이다. 핵산 혼성화 조건 및 엄격성 계산을 문헌 [Sambrook et al. (In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989)] 및 [Tijssen (Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Part I, Ch. 2, Elsevier, New York, 1993)]에서 확인할 수 있다. 개시된 이중특이적 융합 단백질 서열에 엄격한 조건 하에 혼성화하는 핵산 분자들은 전형적으로 0.2 x SSC, 0.1％ SDS, 65℃의 세정 조건 하에 전체 융합 단백질 코딩 서열, 전체 결합 도메인 또는 코딩 서열의 기타 선택된 부분을 기초로 하는 프로브에 혼성화할 것이다.
고도의 동일성을 나타내지 않는 핵산 서열들이 그럼에도 불구하고 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여 유사한 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 이러한 축퇴성을 사용하여 각각 실질적으로 동일한 단백질을 코딩하는 다중 핵산 서열을 생산하도록 핵산 서열에서의 변화가 이루어질 수 있는 것으로 이해된다.
소형 간섭 RNA ( siRNA ): DICER 효소 (동물) 또는 DCL 효소 (식물)에 의해 dsRNA로부터 프로세싱된 뉴클레오티드 약 21-25개의 RNA. 초기의 DICER 또는 DCL 생성물은 이중 가닥이고, 이때 2개의 가닥은 전형적으로 뉴클레오티드 21-25개의 길이이고, 각각의 3' 끝부분에 2개의 쌍을 이루지 않은 염기를 함유한다. 이중 가닥 siRNA 구조 내의 개별적인 가닥들이 분리되고, 그 후 전형적으로 siRNA 중 하나가 다중-서브유닛 복합체인 RNAi-유도 침묵화 복합체 (RISC)와 회합된다. siRNA의 전형적인 기능은 염기-쌍 상보성을 기초로 RISC를 표적으로 안내하는 것이다.
전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자: RNA 분자로 전사될 수 있는 임의의 폴리뉴클레오티드 분자. 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자가 번역되고 따라서 단백질 생성물로서 발현되는 기능성 mRNA 분자로 전사되는 방식으로 구축물을 세포 내로 도입하기 위한 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 특정 관심 RNA 분자의 번역을 억제하기 위해, 안티센스 RNA 분자를 발현할 수 있도록 구축물을 구축할 수도 있다. 구축물의 제조 및 사용을 위한 통상적인 조성물 및 방법 및 숙주 세포가 당업자에게 주지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition Volumes 1, 2, and 3. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000] 참조).
전사: DNA 서열의 상보적인 카피로서의 RNA 폴리머라제에 의한 RNA 분자의 생산.
전사 종결 영역: 전사물의 3' 끝부분의 형성을 제어하는 서열. 자가-절단 리보자임 및 폴리아데닐화 서열이 전사 종결 서열의 예이다.
전사 유전자 침묵화 ( TGS ): 유전자 프로모터 영역 및 때때로 코딩 영역과 상동성인 dsRNA의 형성에 의해 촉발되는 현상. TGS는 RNA 분해보다는 DNA 및 히스톤 메틸화 및 염색질 리모델링을 초래함으로써 전사 억제를 야기한다. TGS 및 PTGS 양쪽 모두 소형 (뉴클레오티드 21-25개) 간섭 RNA로 절단되는 dsRNA에 좌우된다 (문헌 [Eckhardt, Plant Cell, 14:1433-1436, 2002]; [Aufsatz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 99:16499-16506, 2002]).
트랜스제닉: 이러한 용어는 정상적으로는 이러한 유형/종의 실체에서 발견되지 않는 재조합 유전 물질 (즉, 이종 유전 물질)로서 인간 조작에 의해 해당 실체 내로 (또는 실체의 선조 내로) 도입된 재조합 유전 물질을 함유하는 식물/진균/세포/기타 실체 또는 생물을 지칭한다. 따라서, 재조합 DNA가 형질전환에 의해 도입된 식물 세포 (형질전환된 식물 세포)로부터 성장된 식물이 트랜스제닉 식물이고, 도입된 트랜스진을 함유하는 이러한 식물의 모든 후손도 그러하다 (유성 또는 무성 여부와 관계없음).
형질전환: 외인성 DNA가 진입하여 수용자 세포를 변화시키는 프로세스. 이는 천연 조건, 또는 업계에 주지된 다양한 방법을 사용하여 인공 조건 하에 발생할 수 있다. 형질전환은 외래 핵산 서열을 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포 내로 삽입하기 위한 임의의 공지된 방법에 의존할 수 있다. 방법 선택은 형질전환되는 숙주 세포에 영향을 받고, 바이러스 감염, 전기천공, 리포펙션(lipofection) 및 입자 포격을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
형질전환됨: 형질전환된 세포는 분자 생물학 기술에 의해 핵산 분자가 도입되어 있는 세포이다. 형질전환된 세포는 삽입된 DNA가 자가 복제 플라스미드로서 또는 숙주 염색체의 일부로서 복제될 수 있는 안정적으로 형질전환된 세포를 포함한다. 이는 삽입된 DNA 또는 RNA를 제한된 기간 동안 일시적으로 발현하는 세포를 또한 포함한다. 본원에서 사용되는 경우에, 형질전환이라는 용어는 바이러스 벡터로의 형질전환, 플라스미드 벡터로의 형질전환, 및 전기천공, 리포펙션 및 입자 총 가속화에 의한 네이키드(naked) DNA의 도입을 포함하여, 핵산 분자가 이같은 세포 내로 도입될 수 있는 모든 기술을 포함한다.
트랜스포손: 유전자, 염색체 또는 게놈 내에서 위치를 옮기거나 이동할 수 있는 뉴클레오티드 서열 예컨대 DNA 또는 RNA 서열.
트랜스제닉 식물: 자신의 핵 게놈 또는 세포소기관 게놈 내로 삽입된 외래 (이종) 뉴클레오티드 서열을 함유하는 식물.
트랜스진: 형질전환 기술에 의해 숙주 세포 또는 숙주 세포들 내로 삽입된 핵산 서열.
벡터: 숙주 세포 내로 도입됨으로써 형질전환된 숙주 세포를 생산하는 핵산 분자. 벡터는 숙주 세포에서 복제되게 하는 핵산 서열, 예컨대 복제 기원을 포함할 수 있다. 벡터는 하나 이상의 치료제 및/또는 선별성 마커 유전자 및 업계에 공지된 기타 유전 요소를 또한 포함할 수 있다. 벡터는 세포에 형질을 도입시키거나, 세포를 형질전환시키거나 또는 감염시킴으로써 세포가 이러한 세포에게 천연인 것 이외의 핵산 및/또는 단백질을 발현하게 할 수 있다. 벡터는 세포 내로의 핵산 진입을 달성하는 것을 보조하는 물질, 예컨대 바이러스 입자, 리포솜, 단백질 코팅물 등을 임의적으로 포함한다.
달리 설명되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 의미가 동일하다. 단수형 용어 "a", "an", 및 "the"는 문맥적으로 명백하게 달리 지시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 유사하게, 단어 "또는"은 문맥적으로 명백하게 달리 지시되지 않는 한 "및"을 포함하도록 의도된다. 따라서, "A 또는 B를 포함함"은 A, 또는 B, 또는 A 및 B를 포함하는 것을 의미한다. 핵산 또는 폴리펩티드에 대해 주어진 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자 질량 값은 근사값이고, 설명을 위해 제공된다는 것을 또한 이해하여야 한다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 물질들이 본 발명의 실행 또는 테스트에서 사용될 수 있지만, 적절한 방법 및 물질이 하기에서 기술된다. 본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참조문헌은 본원에 그의 전문이 참고로 포함된다. 충돌되는 경우, 용어 설명을 포함하여 본 명세서가 제어할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 예는 예시적일 뿐이고, 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
III . 여러 실시양태의 개관
본 개시내용은 인핸서 도메인, 및 이러한 인핸서 도메인의 제어가 강화되어 있는 전사 조절 도메인을 포함하는 신규 전사 개시 영역을 기술한다. 이러한 인핸서 도메인은 직렬로 배열된, 천연이지만 이전에는 인지되지 않은 SCBV 인핸서의 다수 (예를 들어, 2개 내지 4개 또는 이를 초과하는 개수)의 카피를 포함한다. 본 개시내용의 전사 조절 영역 (프로모터)은 인핸서 도메인의 부재 하의 프로모터와 비교하여 강화된 전사를 제공한다. 한 실시양태에서, 서열 1의 위치 337 내지 위치 618에 제시된 SCBV 인핸서 요소의 하나 이상의 카피; 및 여기에 작동가능하게 연결된, RNA 폴리머라제 결합 부위 및 mRNA 개시 부위를 포함하는 프로모터를 포함하는 키메라 전사 조절 영역이고, 관심 뉴클레오티드 서열이 이러한 키메라 전사 조절 영역의 조절 제어 하에 전사될 때, 프로모터를 포함하지만 SCBV 인핸서 서열(들)은 포함하지 않는 키메라 전사 조절 영역으로 수득된 전사 생성물의 양과 비교하여 전사 생성물의 양이 강화되는 키메라 전사 조절 영역이 개시된다. 일부 실시양태에서, 키메라 전사 조절 영역은 식물 바이러스 유전자, 박테리아 유전자, 진균 유전자, 식물 핵 유전자, 식물 핵외 유전자, 무척추동물 유전자, 또는 척추동물 유전자의 상류 영역으로부터 수득된 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 종자-특이적이다.
기술된 전사 조절 영역 및 전사될 DNA 서열을 포함하는 DNA 구축물이 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 3' 전사 종결 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 전사 개시 영역을 포함하는 DNA 구축물이 개시된다. 한 실시양태에서, 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자는 자신이 발현되는 식물에 작물 형질을 부여한다. 또 다른 실시양태에서, 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자는 자신이 발현되는 식물에 지방산 프로파일 변형을 부여한다. 마지막 실시양태에서, 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자는 자신이 발현되는 식물에 포화 지방산 프로파일 저하를 부여한다.
트랜스제닉 식물이 또한 제공된다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 개시된 DNA 구축물로 안정적으로 형질전환된다. 일부 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 쌍떡잎식물이다. 기타 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 외떡잎식물이다. 한 특정 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 옥수수 식물이다. 두 번째 특정 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 아라비돕시스 탈리아나 식물이다.
개시된 트랜스제닉 식물의 종자가 추가로 제공된다. 한 실시양태에서, 종자는 개시된 DNA 구축물을 포함한다.
트랜스제닉 식물 세포 또는 조직이 추가로 제공된다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 식물 세포 또는 조직은 개시된 키메라 전사 조절 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 쌍떡잎식물로부터 식물 세포 또는 조직이 유래된다. 기타 실시양태에서, 식물 세포 또는 조직은 외떡잎식물로부터의 것이다. 한 특정 실시양태에서, 식물 세포 또는 조직은 옥수수 식물로부터의 것이다. 두 번째 특정 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 아라비돕시스 탈리아나 식물이다.
개시된 트랜스제닉 식물, 식물 세포, 종자 또는 조직을 생산하는 방법이 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 식물 세포 또는 조직을 개시된 DNA 구축물로 형질전환시키는 것을 포함한다.
개시된 트랜스제닉 식물로부터 유래될 수 있는 식물 세포, 열매, 잎, 뿌리, 슈트, 꽃, 종자, 절단물 및 유성 또는 무성 번식에서 유용한 기타 생식 물질, F1 하이브리드를 포함하는 자손 식물, 웅성-불임 식물, 및 모든 기타 식물 및 식물 생성물이 추가로 제공된다.
서열 1의 위치 337 내지 위치 618에 제시된 SCBV 인핸서 요소의 하나 이상의 카피를 포함하는 옥수수 식물 세포 또는 아라비돕시스 탈리아나 식물 세포, 조직 또는 식물이 또한 개시된다. 한 실시양태에서, 옥수수 식물 세포 또는 아라비돕시스 탈리아나 식물 세포, 조직 또는 식물이 서열 1의 위치 337 내지 위치 618에 제시된 SCBV 인핸서 요소의 하나 이상의 카피를 포함하고, 이때 SCBV 인핸서 요소의 하나 이상의 카피가 옥수수 식물 세포 또는 아라비돕시스 탈리아나 세포, 조직 또는 식물의 게놈 내로 무작위 위치에서 삽입된다. 일부 실시양태에서, SCBV 인핸서는, SCBV 인핸서의 부재 하의 관심 뉴클레오티드 서열의 전사와 비교하여, SCBV 인핸서의 조절 제어 하에 있는 관심 뉴클레오티드 서열의 전사 강화를 부여한다.
IV . SCBV 인핸서 및 이의 용도
본 개시내용은 사탕수수 바실루스형 바드나바이러스 (SCBV) 게놈으로부터의 이전에 인지되지 않은 인핸서 영역을 제공하고, 이러한 인핸서는 전사 효율을 강화하는데 유용하며, 이는 인핸서의 제어 하에서의 DNA 서열의 전사 강화를 초래할 수 있다. 천연 발생 서열 (센스 및 안티센스 배향 양쪽 모두)이든 또는 합성에 의해 제조된 서열이든 숙주와 유전자 기원이 동일할 수 있거나 또는 외래 기원인 유전자 서열의 강화된 전사가 특히 흥미롭다. 대상체 인핸서는 이전에 인지되지 않은 천연 SCBV 인핸서 도메인 (서열 1, 위치 337 내지 618에서 이의 서열이 제공됨)의 2개 이상의 다수의 카피를 포함한다. 인핸서는 인핸서 도메인 서열의 2개 이상의 카피를 포함하고, 일부 실시양태에서는 직렬로 배열된 3개 또는 4개 또는 이를 초과하는 개수의 카피를 포함한다.
동종 인핸서가 또한 구상된다. 어떠한 방식으로도 제한되는 것으로 의도하지 않으면서, 대표적인 동종 서열은 다른 SCBV 프로모터, 예를 들어 상이한 SCBV 단리물로부터의 것, 예컨대 문헌 [Braithwaite et al. (Plant Cell Rep. 23:319-326, 2004; 본원에 그의 전문이 참고로 포함됨)] 또는 미국 특허 번호 5,994,123 (본원에 전문이 참고로 포함됨)에 기술된 것들을 포함할 수 있다.
천연 인핸서는 이의 천연 환경에서 프로모터로부터 상류이고 프로모터에서 약 600 bp 이내인 DNA 서열을 포함한다. mRNA의 최초의 뉴클레오티드를 0이라 했을 때, 인핸서를 함유하는 서열은 약 -50 내지 약 -1,000 bp, 보통 약 -50 내지 -950 bp이고, 일반적으로 약 -100 내지 -800 bp를 포함한다. 인핸서 도메인은 시스-작용성이고, 바람직하게는 강화될 전사 개시 서열에서 약 10,000 bp, 일반적으로는 약 2,000 bp 이내에 위치하며, 더욱 일반적으로는 이에 인접하거나 또는 약 1,000 bp 이내이다. 인핸서는 전사 개시 서열과 관련하여 어느 한쪽 배향일 수 있고, 자신이 강화하는 프로모터와 관련하여 상류 또는 하류에 위치할 수 있지만, 일반적으로는 상류이다.
본 개시내용의 인핸서 도메인은 인핸서의 제어 하에서, 예를 들어, 시스 위치 (인접 및 동종)에서 천연적으로 발견되는 프로모터, 뿐만 아니라 특정 인핸서 (예를 들어, 이종)와 정상적으로는 회합되지 않는 것을 포함하여 광범위한 개시 서열에 대한 용도가 발견된다. 인핸서 도메인 및 전사 개시 도메인은 동일하거나 상이한 계, 과 또는 종으로부터의 것일 수 있다. 관심 종은 원핵생물 및 진핵생물, 예컨대 박테리아, 식물, 곤충, 포유동물 등을 포함한다. 조합은 기술된 SCBV (바이러스) 인핸서 도메인(들)과 SCBV에 대한 숙주 (예를 들어, 사탕수수로부터의 것), 또 다른 식물 종 (예를 들어, 동일하거나 상이한 과의 것), 곤충, 척추동물, 박테리아, 진균 등의 구조 유전자의 전사 개시 영역의 조합을 포함한다.
본 개시내용은 대상체 전사 개시 영역 및 전사 개시 영역의 제어 하의 전사될 DNA 서열을 포함하는 DNA 구축물을 또한 구상한다. DNA 서열은 전사된 5' 및 3' 플랭킹 서열을 포함하는 천연 오픈 리딩 프레임을 포함할 수 있다. 별법적으로, 이는 RNA 분자 또는 이의 일부분의 상보물을 코딩한다는 점에서 안티센스 서열을 포함할 수 있다. 구축물이 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 경우, 강화된 전사 개시율이 수득되어, 일반적으로 유전자의 폴리펩티드 발현 생성물을 증가된 양으로 제공한다. 구축물이 안티센스 서열을 포함하는 경우, 야생형에 대해 상보적인 RNA의 전사 강화는 야생형 mRNA의 발현을 억제하고, 이에 의해 폴리펩티드 발현 생성물의 양을 감소시킨다; 해당 야생형 mRNA가 숙주 세포의 천연 mRNA 또는 병원체, 예컨대 바이러스 또는 진균의 mRNA에 상응할 수 있는 것으로 구상된다.
다양한 실시양태에서, 전사될 DNA 서열은 유전자의 단백질 코딩 서열(들) (예를 들어, 식물, 동물, 박테리아, 바이러스 또는 진균으로부터의 것)을 포함하고, 이는 단백질 생성물을 코딩하는 천연 오픈 리딩 프레임(들); 유전자에 의해 코딩되는 mRNA로부터 유래된 상보적 DNA (cDNA); 원하는 코딩 서열(들)을 제공하는 합성 DNA; 천연 유전자의 엑손으로부터 유래된 단백질 코딩 서열(들), 예컨대 엑손 결찰에 의해 생산된 오픈 리딩 프레임(들); 및/또는 이들 중 임의의 2가지 이상의 조합을 포함할 수 있다. 적합한 전사 종결/폴리아데닐화 서열; 엑손 및 인트론으로 이루어지는, 1차 RNA 생성물을 코딩하는 천연 유전자로부터의 서열 (예를 들어, 식물, 동물, 박테리아, 바이러스 또는 진균으로부터의 것) (예를 들어, 진핵생물의 천연 폴리머라제 II 및 폴리머라제 III-전사 유전자); 특정 RNA 또는 단백질 생성물을 코딩하는 합성 DNA 서열; 돌연변이유발 (예컨대 부위 특이적 돌연변이유발) 및/또는 기타 유전 공학 기술에 의해 공지된 코딩 서열 (예를 들어, 천연 유전자 서열)로부터 변형된 DNA; 융합 단백질을 코딩하는 키메라를 포함하여, DNA 단편들의 결찰에 의해 달성된 상기의 것들 중 임의의 것의 키메라; 및/또는 RNA 분자 또는 이의 일부분의 상보물을 코딩하는 DNA가 이러한 서열들에 부착된다.
식물에서의 강화된 전사는 식물의 특징적인 단백질 (내인성 - 즉, 야생형 숙주에서 정상적으로 발견됨) 또는 다른 유전 공급원으로부터의 단백질 (외인성 - 즉, 야생형 숙주에서 정상적으로 발견되지 않음)의 생산을 강화하는 것에서 용도를 발견할 수 있다. 본원에서 기술된 인핸서 및 키메라 전사 조절 영역으로부터 발현될 서열 유형의 예로는 지방산 변형 단백질; 안티센스 또는 소형 억제 RNA (유전자 억제용); 영양상 중요한 단백질; 성장 촉진 인자; 특정 환경 조건 하에 식물에 보호를 제공하는 단백질, 예를 들어, 금속, 염 또는 기타 독성에 대한 저항성을 부여하는 단백질; 극한 온도, 동결 등에 대한 내성을 제공하는 스트레스 관련 단백질; 해충 또는 감염-관련 보호를 식물에 부여하는 단백질, 예를 들어, 박테리아, 진균 또는 기타 미생물 감염에 대한 저항성, 또는 곤충에 의한 포식 (예를 들어, 비. 투린기엔시스(B. thuringiensis) 독소) 또는 기타 무척추동물 또는 척추동물에 대한 저항성을 제공하는 단백질; 식물 외부에서 의학적으로 중요한 화합물, 예를 들어, 항-미생물제, 항종양제 등; 특정한 상업 가치가 있는 단백질 또는 기타 화합물; 단백질, 예를 들어, 대사 경로 (예를 들어, 폴리페놀계 화합물 또는 기타 2차 대사산물의 생산을 위한 경로)의 효소의 수준 증가; 식물 숙주에 대한 구조적 가치가 있는 생성물의 수준 증가 등이 포함된다. 전사되는 관심 서열은 약 8 bp 이상, 약 12 bp 이상, 약 20 bp 이상일 것이고, 길이가 1 킬로염기쌍(kbp) 이상일 수 있다.
V. 구축물
본 개시내용의 구축물은 프로모터 (일반적으로 적어도 RNA 폴리머라제 결합 부위 및 mRNA 개시 부위를 함유함)에 작동가능하게 연결된 제공된 SCBV 인핸서 요소의 하나 이상의 카피를 포함하는 키메라 전사 조절 영역을 전형적으로 함유하고, 이러한 영역은 3' 전사 종결 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된다. 또한, 구축물은 식물 유전자의 3'-비번역 영역 (3' UTR) (예를 들어, mRNA의 mRNA 안정성을 증가시키기 위한 3' UTR, 예컨대 감자의 PI-II 종결 영역 또는 옥토핀 또는 노팔린 신타제(synthase) 3' 종결 영역)으로부터의 추가적인 조절 폴리뉴클레오티드 분자를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 구축물은 번역 개시에서 중요한 역할을 할 수 있고 또한 식물 발현 구축물에서의 유전 성분일 수 있는 mRNA 폴리뉴클레오티드 분자의 5'-비번역 영역 (5' UTR)을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, 열 충격 단백질 유전자로부터 유래된 비-번역 5' 리더 폴리뉴클레오티드 분자가 식물에서의 유전자 발현을 강화하는 것으로 실연되었다 (예를 들어, 각각 전문이 참고로 포함된 미국 특허 번호 5,659,122 및 5,362,865 참조). 구축물 내에 존재하는 바와 같은 이같은 추가적인 상류 및 하류 조절 폴리뉴클레오티드 분자들은 구축물 내에 존재하는 다른 요소들에 대해 천연이거나 이종인 공급원으로부터 유래될 수 있다.
따라서, 한 실시양태는 식물 세포 내로 구축물을 도입했을 때 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자의 전사를 원하는 수준으로 및/또는 원하는 조직 또는 발달 패턴에서 지시하도록 전사가능한 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된, 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열 1의 위치 337 내지 위치 618에 제시된 SCBV 인핸서 요소의 1개 이상의 카피 (예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 이를 초과하는 개수의 카피)를 포함하는 키메라 전사 조절 영역 자체를 포함하는 구축물이다. 일부 예에서의 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자는 유전자의 단백질-코딩 영역을 포함하고, 키메라 전사 조절 영역은 구축물로부터 단백질 생성물로서 번역 및 발현되는 기능성 mRNA 분자의 전사를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자는 유전자의 안티센스 영역을 포함하고, 키메라 전사 조절 영역은 표적 숙주 세포에서의 관심 대상인 특정 RNA 분자의 발현을 억제하기 위해 안티센스 RNA 분자 또는 기타 소형 억제 RNA의 전사에 영향을 미친다.
본 개시내용의 또 다른 예시적인 구축물은 T-DNA를 포함하는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로부터 단리된 Ti 플라스미드의 우측 경계 (RB 또는 AGRtu.RB) 및 좌측 경계 (LB 또는 AGRtu.LB) 영역이 있는 이중 Ti 플라스미드 경계 DNA 구축물을 포함하고, 이는 아그로박테리움 세포가 제공하는 전달 분자와 함께 식물 세포의 게놈 내로의 T-DNA의 통합을 가능하게 한다. 구축물은 박테리아 세포에서 복제 기능 및 항생제 선별을 제공하는 플라스미드 골격 DNA 절편, 예를 들어, 에세리키아 콜라이(Escherichia coli) 복제 기원, 예컨대 ori322, 숙주 범위가 광범위한 복제 기원, 예컨대 oriV 또는 oriRi, 및 선별성 마커에 대한 코딩 영역, 예컨대 스펙티노마이신 또는 스트렙토마이신에 대한 저항성을 부여하는 Tn7 아미노글리코시드 아데닐트랜스퍼라제 (aadA)를 코딩하는 Spec/Strp, 또는 젠타마이신 (Gm, Gent) 선별성 마커 유전자를 또한 함유할 수 있다. 식물 형질전환을 위해, 대표적인 숙주 박테리아 균주에는 아그로박테리움 투메파시엔스 ABI, C58, 또는 LBA4404가 포함된다; 그러나, 식물 형질전환 업계의 당업자에게 공지된 기타 균주가 사용될 수 있다.
종자 특이적 조직에서 아실-CoA 델타-9 디새츄라제 효소를 높은 수준으로 발현시킬 수 있는 프로모터의 확인이 요망된다. 식물 아실-CoA 델타-9 디새츄라제 효소는 가용성이다. 이는 색소체 스트로마(stroma) 내에 위치하고, ACP, 주로 스테아릴-ACP로 에스테르화된 새롭게 합성된 지방산을 기질로 사용한다. 이는 다른 델타-9 디새츄라제 효소들과 대조적인데, 이들은 소포체 막 (ER, 또는 마이크로솜) 내에 위치하고, Co-A로 에스테르화된 지방산을 기질로 사용하며, 포화 지방산인 팔미테이트 및 스테아레이트 양쪽 모두를 탈포화시킨다. 미국 특허 5,723,595 및 6,706,950는 식물 디새츄라제에 관한 것이다.
식물 내에서의 미생물 델타-9 디새츄라제 유전자의 발현이 업계에 공지되어 있다. 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 델타-9 디새츄라제 유전자가 담배 잎 조직 내로 도입되었고 (문헌 [Polashcok, J. et al., FASEB J 5:A1157 (1991)]), 이러한 조직에서 발현되는 것 같았다. 추가로, 이러한 유전자가 토마토에서 발현되었다. 문헌 [Wang et al., J. Agric Food Chem. 44:3399-3402 (1996)]; 및 [C. Wang et al., Phytochemistry 58:227-232 (2001)] 참조. 특정 불포화물의 약간의 증가 및 특정 포화물의 약간의 증가가 담배 및 토마토 양쪽 모두에 대해 보고되었지만, 담배 및 토마토는 오일 작물이 아니다. 이러한 효모 유전자가 브라시카 나푸스(Brassica napus) 내로 또한 도입되었다 (미국 특허 번호 5,777,201 참조). 아스페르길루스 니둘란스로부터의 또 다른 진균 델타-9 디새츄라제가 캐놀라 내로 도입되어 종자 오일에서의 포화 지방산 감소가 달성되었다 (미국 20080260933A1 참조). 이러한 경우에, 종자 오일 내의 더 풍부한 팔미테이트 지방산 (36-49％)에 비하여 더 큰 스테아레이트 고갈 (61-90％)이 있었다. 따라서, 포화물에 우선적으로 작용하는 아실-CoA 델타-9 디새츄라제는 총 포화물에서의 추가적인 감소를 달성할 것이다.
식물성 기원이든 동물성 기원이든, 오일의 특성은 탄소 및 수소 원자의 개수, 뿐만 아니라 지방산 사슬을 이루는 이중 결합의 개수 및 위치에 의해 우세하게 결정된다. 식물로부터 유래된 오일 대부분은 다양한 양의 팔미트 (16:0), 스테아르 (18:0), 올레 (18:1), 리놀레 (18:2) 및 리놀렌 (18:3) 지방산으로 구성된다. 통상적으로, 팔미트산 및 스테아르산은 "포화"로 지정되는데, 이는 이들의 탄소 사슬이 수소 원자로 포화되고, 따라서 이중 결합이 없기 때문이다; 이들은 최대로 가능한 개수의 수소 원자를 함유한다. 그러나, 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산은 내부에 각각 1개, 2개 및 3개의 이중 결합이 있는 18-탄소 지방산 사슬이다. 올레산은 전형적으로 단일불포화 지방산으로 간주되는 한편, 리놀레산 및 리놀렌산은 다중불포화 지방산으로 간주된다. 미국 농무부는 조합된 포화 지방산이 3.5 중량％ 미만인 산물로서 "포화물 없는(no saturates 또는 no sat)" 제품을 정의한다 (지방산의 총량에 비교됨).
지방산 합성의 주요 생성물은 팔미테이트 (16:0)이고, 이는 스테아레이트 (18:0)로 효율적으로 신장되는 것으로 보인다. 여전히 색소체 내에 있으면서, 그 후 이러한 포화 지방산이 아실-ACP 델타-9 디새츄라제로 공지된 효소에 의해 탈포화되어 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합이 도입될 수 있다. 구체적으로, 스테아레이트가 색소체 델타-9 디새츄라제 효소에 의해 신속하게 탈포화되어 올레에이트 (18:1)가 산출될 수 있다. 실제로는, 팔미테이트가 색소체 델타-9 디새츄라제에 의해 팔미트올레에이트 (16:1)로 또한 탈포화될 수 있지만, 이러한 지방산은 대부분의 식물성 오일에서 미량 (0-0.2％)으로만 나타난다. 따라서, 색소체에서의 지방산 합성의 주요 생성물은 팔미테이트, 스테아레이트, 및 올레에이트이다. 대부분의 오일에서, 포화 지방산들은 훨씬 더 낮은 비율로 존재하기 때문에, 올레에이트가 합성된 주요 지방산이다.
이어지는 세포질에서의 색소체 외부에서의 식물 지방산의 탈포화는 올레에이트에 한정되는 것으로 보이고, 이는 포스파티딜 콜린 (PC)으로 에스테르화된 올레오일 또는 리놀레오일 기질 상에 작용하는 마이크로솜 디새츄라제에 의해 리놀레에이트 (18:2) 및 리놀레네이트 (18:3)로 탈포화될 수 있다. 또한, 식물에 따라, 올레에이트가 신장 (20:1, 22:1, 및/또는 24:1로의 신장)에 의해, 또는 관능기의 부가에 의해 추가로 변형될 수 있다. 그 후, 이러한 지방산들은, 포화 지방산인 팔미테이트 및 스테아레이트와 함께, 트리글리세리드로 조립(assembly)될 수 있다.
따라서, 한 실시양태는 아실-CoA 델타-9 디새츄라제를 포함하는 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된, 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열 1의 위치 337 내지 위치 618에 제시된 SCBV 인핸서 요소의 4개의 카피를 포함하는 키메라 전사 조절 영역 자체를 포함하는 구축물이다. 이때, 상기 식물 세포 내로의 구축물의 도입 시 아실-CoA 델타-9 디새츄라제가 원하는 수준으로 및/또는 원하는 조직 또는 발달 패턴에서 발현되고, 이에 의해 식물 세포 및/또는 원하는 조직 내의 포화 지방산의 백분율을 저하시킨다.
1개 이상의 SCBV 인핸서 요소 (임의적으로, 키메라 전사 조절 영역의 환경 내)를 포함하는 구축물로서, 활성화 태그부착 구축물인 구축물이 또한 구상된다. 활성화 태그부착은 게놈 전반에 걸친 규모로 유전자가 무작위로, 그리고 강하게 상향조절되는 방법으로, 그 후에 특정 표현형을 스크리닝 및 선별할 수 있다. 다양한 유형의 활성화 태그부착 구축물에 유용한 성분들이 공지되어 있다; 예를 들어, 문헌 [Walden et al., Plant Mol. Biol. 26: 1521-8, 1994] (담배 세포 배양에서 유전자를 활성화시켜 세포가 식물 성장 호르몬의 부재 하에 성장하게 하는데 사용된 활성화 T-DNA 태그부착 구축물이 기술됨); [Miklashevichs et al., Plant J. 12: 489-98, 1997]; [Harling et al., EMBO J. 16: 5855-66, 1997]; [Walden et al., EMBO J. 13: 4729-36, 1994] (T-DNA 태그에 플랭킹되고 식물 성장 호르몬 응답에서 추정적으로 수반되는 식물 게놈 서열로부터 단리된 유전자의 리포트); [Schell et al., Trends Plant Sci. 3: 130, 1998] (일군의 관련 연구의 조사가 논의됨); [Kardailsky et al., Science 286: 1962-1965, 1999] (조기 개화 표현형에 대한 식물의 활성화 T-DNA 태그부착 및 스크리닝이 기술됨); [Koncz et al., Proc Natl Acad Sci U S A 86(21):8467-71, 1989] (증식 중인 세포에서만 활성이고 식물 유전자의 발현에 영향을 미치기 위하여 이에 직접적으로 인접하여 삽입되어야 하는 아그로박테리움 유전자 5 프로모터 (pg5)를 사용하는 활성화 태그부착이 기술됨); [Wilson et al., Plant Cell 8: 659-671, 1996] (CaMV 35S 프로모터 및 nos::hpt 선별 카세트를 보유하는 변형된 Ds 트랜스포손을 활용하는 활성화 태그부착) 및 [Schaffer et al., Cell 93: 1219-1229, 1998] (인접한 식물 유전자를 상향조절하하여 우성 기능 획득 돌연변이를 초래하는데 사용된 동일한 시스템을 설명함 1996); 및 [Weigel et al., Plant Physiology, 122:1003-1013, 2000] (형태학적 표현형에 대해 수만개의 형질전환된 식물을 스크리닝하는데 유용한 활성화 태그부착 벡터를 설명함) 참조.
VI . 전사 강화를 위한 뉴클레오티드 서열
본원에서 제공되는 바와 같은 구축물 내로의 혼입에 의한 전사 강화를 위한 예시적인 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자는, 예를 들어, 표적 종 이외의 종으로부터의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 유전자, 또는 동일한 종으로부터 유래되거나 동일한 종 내에 존재하지만 고전적인 생식 또는 육종 기술보다는 유전 공학 방법에 의해 수용자 세포 내로 혼입되는 유전자를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 분자의 유형은 표적 식물 세포 내에 이미 존재하는 폴리뉴클레오티드 분자, 또 다른 식물로부터의 폴리뉴클레오티드 분자, 상이한 생물로부터의 폴리뉴클레오티드 분자, 또는 외부적으로 생성된 폴리뉴클레오티드 분자, 예컨대 유전자의 안티센스 메시지를 함유하는 폴리뉴클레오티드 분자, 또는 인공, 합성 또는 다른 방식으로 변형된 버전의 트랜스진을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
한 실시양태에서, 기술된 SCBV 인핸서 서열 (또는 2개 이상의 이같은 서열의 시리즈)이 작물학적 관심 대상인 유전자 또는 기타 발현 서열 (더욱 일반적으로, 관심 뉴클레오티드 서열)인 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결되도록, 서열 1의 위치 337 내지 618에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 분자 (또는 이의 2개 이상의 카피) (예를 들어, 키메라 전사 개시 영역의 환경 내)가 구축물 내로 혼입된다. 본원에서 사용되는 경우에, "작물학적 관심 대상인 유전자"라는 용어는 식물 형태학, 생리학, 성장 및 발달, 수율, 영양 강화, 질병 또는 해충 저항성, 또는 환경적 또는 화학적 내성과 연관된 바람직한 특성을 제공하는 유전자를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 작물학적 관심 대상인 유전자의 발현은, 예를 들어, 작물학적으로 중요한 형질을 부여하기 위해 바람직하다. 이로운 작물 형질을 작물 식물에 제공하는 작물학적 관심 대상인 유전자는, 예를 들어, 유전자를 발현하는 식물에 하기를 부여하는 하나 이상의 서열일 수 있다: 제초제 저항성 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,803,501; 6,448,476; 6,248,876; 6,225,114; 6,107,549; 5,866,775; 5,804,425; 5,633,435; 5,463,175; 및 미국 공보 US20030135879 및 US20030115626 참조), 수율 증가 (예를 들어, 미국 특허 USRE38,446; 미국 특허 번호 6,716,474; 6,663,906; 6,476,295; 6,441,277; 6,423,828; 6,399,330; 6,372,211; 6,235,971; 6,222,098; 5,716,837 참조), 곤충 방제 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,809,078; 6,713,063; 6,686,452; 6,657,046; 6,645,497; 6,642,030; 6,639,054; 6,620,988; 6,593,293; 6,555,655; 6,538,109; 6,537,756; 6,521,442; 6,501,009; 6,468,523; 6,326,351; 6,313,378; 6,284,949; 6,281,016; 6,248,536; 6,242,241; 6,221,649; 6,177,615; 6,156,573; 6,153,814; 6,110,464; 6,093,695; 6,063,756; 6,063,597; 6,023,013; 5,959,091; 5,942,664; 5,942,658, 5,880,275; 5,763,245; 5,763,241 참조), 진균 질병 저항성 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,653,280; 6,573,361; 6,506,962; 6,316,407; 6,215,048; 5,516,671; 5,773,696; 6,121,436; 6,316,407; 6,506,962 참조), 바이러스 저항성 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,617,496; 6,608,241; 6,015,940; 6,013,864; 5,850,023; 5,304,730 참조), 선충류 저항성 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,228,992 참조), 박테리아 질병 저항성 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,516,671 참조), 식물 성장 및 발달 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,723,897; 6,518,488 참조), 전분 생산 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,538,181; 6,538,179; 6,538,178; 5,750,876; 6,476,295 참조), 오일 생산 변형 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,444,876; 6,426,447; 6,380,462 참조), 높은 오일 생산 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,495,739; 5,608,149; 6,483,008; 6,476,295 참조), 지방산 함량 변형 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,828,475; 6,822,141; 6,770,465; 6,706,950; 6,660,849; 6,596,538; 6,589,767; 6,537,750; 6,489,461; 6,459,018 참조), 섬유 생산 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,576,818; 6,271,443; 5,981,834; 5,869,720 참조), 높은 단백질 생산 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,380,466 참조), 열매 숙성 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,512,466 참조), 소화성 개선 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,531,648 참조), 풍미 개선 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,011,199 참조), 낮은 라피노스 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,166,292 참조), 동물 및/또는 인간 영양 강화 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,723,837; 6,653,530; 6,541,259; 5,985,605; 6,171,640 참조), 환경 스트레스 저항성 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,072,103 참조), 바람직한 펩티드 (예를 들어, 제약 또는 분비성 펩티드) (예를 들어, 미국 특허 번호 6,812,379; 6,774,283; 6,140,075; 6,080,560 참조), 프로세싱 형질 개선 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,476,295 참조), 산업적 효소 생산 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,543,576 참조), 질소 고정 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,229,114 참조), 하이브리드 종자 생산 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,689,041 참조), 바이오폴리머 (예를 들어, 미국 특허 번호 USRE37,543; 미국 특허 번호 6,228,623; 5,958,745 및 미국 공보 번호 US20030028917 참조) 및 생물연료 생산 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,998,700 참조). 상기 열거된 특허 및 출원 공보에 기술된 유전 요소, 방법 및 트랜스진은 본원에 참고로 포함된다.
별법적으로, 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자는, 예를 들어 안티센스, 억제성 RNA (RNAi) 또는 공동억제-매개 메커니즘을 통해, 내인성 유전자의 발현의 표적화된 억제를 야기하는 안티센스 또는 RNA 분자를 코딩함으로써 상기 언급된 (또는 기타) 식물 특성 또는 표현형에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 RNA는 원하는 내인성 mRNA 생성물을 절단하도록 조작된 촉매성 RNA 분자 (리보자임)일 수도 있다. 따라서, 관심 대상인 표현형, 생화학적 또는 형태학적 변화에 영향을 미치는 전사된 RNA 분자를 코딩하는 임의의 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 본원에서 제공되는 서열 및 구축물에 의해 가능한 전사 강화가 이로울 수 있다.
기술된 SCBV 인핸서 또는 이의 하나 이상의 카피를 포함하는 키메라 전사 조절 영역이 하나 이상의 마커 유전자 (어떤 방식으로든 발현을 스크리닝 또는 채점할 수 있는 임의의 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자)와 함께 구축물 내로 도입될 수 있고, 일시적이거나 안정적인 식물 분석에서 테스트되어, 안정적인 트랜스제닉 식물에서의 조절 요소의 유전자 발현 패턴을 표시할 수 있다. 이같은 실시양태의 실행에서 사용하기 위한 마커 유전자는 β-글루쿠로니다제(glucuronidase) (미국 특허 번호 5,599,670에 기술된 GUS) 및 녹색 형광 단백질 (미국 특허 번호 5,491,084 및 6,146,826에 기술된 GFP), 항생제 저항성을 부여하는 단백질 또는 제초제 내성을 부여하는 단백질을 코딩하는 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 카나마이신 (nptII), 히그로마이신 B (aph IV), 스트렙토마이신 또는 스펙티노마이신 (aad, spec/strep) 및 젠타마이신 (aac3 및 aacC4)에 대한 저항성을 부여하는 단백질을 코딩하는 것들을 포함하여, 유용한 항생제 저항성 마커들이 업계에 공지되어 있다. 트랜스제닉 식물 내성이 실연되어 있고 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 제초제는 글리포세이트, 글루포시네이트, 술포닐우레아, 이미다졸리논, 브로목시닐, 델라폰, 시클로헤잔디온, 프로토포르피리오노겐 옥시다제 억제제, 및 이속사스플루톨 제조체를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 제초제 내성에서 수반되는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자는 업계에 공지되어 있고, 2,4-D 분해 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자 (WO 2007/053482 A2 또는 미국 특허 번호 7,838,733에 기술된 aad-12); 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자 (글리포세이트 내성에 대해 미국 특허 번호 5,627,061, 5,633,435, 6,040,497, 및 미국 특허 번호 5,094,945에 기술되어 있는 EPSPS); 글리포세이트 옥시도리덕타제(oxidoreductase) 및 글리포세이트-N-아세틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자 (미국 특허 번호 5,463,175에 기술된 GOX 및 미국 공보 번호 20030083480에 기술된 GAT); 브로목시닐 니트릴라제(nitrilase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자 (브로목시닐 내성에 대해 미국 특허 번호 4,810,648에 기술된 Bxn); 노르플루라존 내성에 대해 문헌 [Misawa et al. (Plant J. 4:833-840, 1993)] 및 [Misawa et al. (Plant J. 6:481-489, 1994)]에 기술된 피토엔 디새츄라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자 (crtI); 술포닐우레아 제초제에 대한 내성에 대해 문헌 [Sathasiivan et al. (Nucl. Acids Res. 18:2188-2193, 1990)]에 기술된 아세토히드록시산 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자 (AHAS, 기존의 ALS); 디캄바-분해 옥시게나제(oxygenase) 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자 (디캄바 내성에 대해 미국 특허 공보 US20030135879 및 US20030115626에 기술됨); 및 글루포시네이트 및 비알라포스 내성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자 (문헌 [DeBlock et al. (EMBO J. 6:2513-2519, 1987)]에 기술된 bar 유전자, 문헌 [Wohlleben et al., (1988) Gene 70: 25-37]에 기술된 pat 유전자, 또는 미국 특허 출원 번호 2007/086813에 기술된 DSM-2 유전자)를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 개시내용의 조절 요소는 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제, 글리포세이트 저항성 EPSPS, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제, 히드록시페닐 피루베이트 데히드로게나제, 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제, 달라폰 데할로게나제(dehalogenase), 브로목시닐 저항성 니트릴라제, 안트라닐레이트 신타제, 글리포세이트 옥시도리덕타제 및 글리포세이트-N-아세틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자를 발현할 수 있다.
마커 유전자 또는 기타 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 1개 이상의 SCBV 인핸서 (예를 들어, 키메라 전사 조절 영역의 환경 내)를 함유하는 구축물이 조직에 전달될 수 있고 (예를 들어, 형질전환됨), 전사되는 마커 또는 서열에 따라 적합한 메커니즘에 의해 조직을 분석할 수 있다. 이같은 정량적 또는 정성적 분석은 안정적인 식물에서 작물학적 관심 대상인 유전자에 작동가능하게 연결되었을 때 조절 요소의 잠재적인 발현 프로파일을 평가하는 도구로서 사용될 수 있다. 일시적인 검정법에서 마커 유전자가 사용될 수 있다; 일시적인 검정법에서 마커 유전자 발현을 테스트하는 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 다양한 식물, 조직, 및 DNA 전달 시스템을 사용하여 마커 유전자의 일시적인 발현이 보고되었다. 예를 들어, 일시적인 분석 시스템은 임의의 관심 식물 종을 사용하는 임의의 일시적인 식물 검정법에서의 조직의 전기천공 또는 입자 포격을 통한 직접적인 유전자 전달을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이같은 일시적인 시스템은 다양한 조직 공급원으로부터의 원형질체의 전기천공 또는 특정 관심 조직의 입자 포격을 포함할 것이지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 개시내용은 마커 유전자 또는 작물학적 관심 대상인 유전자를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 조절 요소를 평가하기 위한 임의의 일시적인 발현 시스템의 용도를 포함한다. 적합한 전달 시스템을 통해 일시적인 것에서 테스트하기 위해 구상되는 식물 조직의 예는 잎 베이스 조직, 캘러스, 떡잎, 뿌리, 씨젖, 씨눈, 꽃 조직, 꽃가루 및 표피 조직을 포함할 것이지만, 이에 한정되지는 않는다.
VII . 식물 형질전환
본원에 기술된 바와 같은 인핸서 요소 (또는 이의 다중 카피) 또는 키메라 전사 조절 영역을 함유하는 식물 형질전환 구축물을 임의의 식물 형질전환 방법을 사용하여 식물 내로 도입할 수 있다. 본 발명의 실행에서 식물 발현 구축물을 식물 게놈 내로 도입함으로써 식물을 형질전환시키기 위한 방법 및 물질은 전기천공 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,384,253), 미세발사체 포격 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,015,580; 5,550,318; 5,538,880; 6,160,208; 6,399,861; 및 6,403,865), 아그로박테리움-매개 형질전환 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,824,877; 5,591,616; 5,981,840; 및 6,384,301), 및 원형질체 형질전환 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,508,184)을 포함하여 임의의 주지되고 실연된 방법을 포함할 수 있다. 다수의 형질전환 방법이 많은 관심 표적 작물로부터의 안정적인 트랜스제닉 식물의 생산을 위해 사용 및 변형될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
쌍떡잎식물을 형질전환시키는 특정 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 아라비돕시스 탈리아나, 목화 (고시피움 히르수툼), 대두 (글리신 막스), 땅콩 (아라키스 히포가에아), 및 브라시카(Brassica) 속의 구성원을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 작물에 대해 형질전환 및 식물 재생 방법이 기술되어 있다.
마찬가지로, 외떡잎식물을 형질전환시키는 구체적인 방법이 당업자에게 또한 공지되어 있다. 예를 들어, 보리 (호르데움 불가라에(Hordeum vulgarae)); 옥수수 (제아 마이스); 귀리 (아베나 사티바(Avena sativa)); 오리새 (닥틸리스 글로메라타(Dactylis glomerata)); 벼 (인디카(indica) 및 자포니카(japonica) 품종을 포함하는 오리자 사티바(Oryza sativa)); 수수 (소르굼 비칼라(Sorghum bicolor)); 사탕수수 (사카룸(Saccharum) 종); 톨 페스큐(tall fescue) (페스투카 아룬디나세아(Festuca arundinacea)); 터프그래스(turfgrass) 종 (예를 들어 아그로스티스 스톨로니페라(Agrostis stolonifera), 포아 프라텐시스(Poa pratensis), 스테노타프룸 세쿤다툼(Stenotaphrum secundatum)); 밀 (트리티쿰 아에스티붐(Triticum aestivum)), 및 알팔파 (메디카고 사티바(Medicago sativa))를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 작물에 대해 형질전환 및 식물 재생 방법이 기술되어 있다.
형질전환된 식물을 관심 유전자(들)의 존재 및 본원에 기술된 키메라 전사 조절 영역에 의해 부여되는 발현 수준 및/또는 프로필에 대해 분석할 수 있다. 형질전환된 식물의 분석을 위해 수많은 방법이 당업자에게 입수가능하다. 예를 들어, 식물 분석 방법은 서던(Southern) 및 노던(northern) 블롯 분석, PCR-기반 (또는 기타 핵산 증폭-기반 방법, 예컨대 인베이더(Invader)® 또는 택맨(Taqman)® 검정법) 접근법, 생화학적 분석, 표현형 스크리닝 방법, 야외 평가, 및 면역진단 검정법 (예를 들어, 단백질 검출, 국소화 및/또는 정량용)을 포함한다.
기술된 SCBV 인핸서를 사용하는 유전자 발현 강화가 옥수수 및 아라비돕시스 탈리아나에서 실연되었지만, 이러한 인핸서는 쌍떡잎식물뿐만 아니라 외떡잎식물을 포함할 수 있는 다른 식물 종에서 기능할 것으로 예상된다. SCBV 상류 영역의 4개의 카피가 있는 인핸서 요소가 본원에서 연구된 조합물의 가장 높은 발현 수준을 제공하였다. 더 적거나 더 많은 상류 영역 카피, 뿐만 아니라 다른 공급원으로부터의 인핸서 요소와의 조합물이 유전자 발현을 조정하는 것에 장점을 또한 제공할 수 있다. 동일한 활성화제, 구축물 및 접근법이 게놈 서열이 입수가능하거나 진행 중이기 때문에 유전자를 확인할 수 있는 다른 작물 종 (수수 (소르굼 비칼라), 밀 (트리티쿰 아에스티붐), 보리 (호르데움 불가라에), 조(Foxtail millet) (세타리아 이탈리카(Setaria italica)), 사탕수수 (사카룸 오피시나룸(Saccharum officinarum)), 미스칸투스 기간테우스(Miscanthus giganteus)가 포함됨) 또는 '활성화된 유전자'가 미래의 게놈 시퀀싱 시도 또는 아마도 염색체 신터니(synteny)에 의해 확인될 수 있는 다른 작물 종 (귀리 (아베나 사티바), 호밀 (세칼레 세레알레(Secale cereale)), 펄 밀렛(Pearl millet) (페니세툼 글라우쿰(Pennisetum glaucum)), 핑거 밀렛(Finger millet) (엘루에신 코라카나(Eluesine coracana)), 프로소 밀레(Proso millet) (파니쿰 밀리아세움(Panicum miliaceum)), 테프 밀레(Teff millet) (에라그로스티스 테프(Eragrostis tef))가 포함됨), 또는 게놈 서열이 입수가능하거나 진행 중인 모델 그래스(model grass) 종 (퍼플 폴스 브롬(Purple False Brome) (브라키포디움 디스타키온(Brachypodium distachyon)), 녹색 강아지풀(Green bristlegrass) (세타리아 비리디스(Setaria viridis))가 포함됨)에 유용할 수 있다.
하기의 실시예는 특정 특징 및/또는 실시양태를 설명하기 위해 제공된다. 이러한 실시예들은 본 발명을 기술된 특정 특징 또는 실시양태에 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1
사탕수수 바실루스형 바이러스 ( SCBV ) 프로모터의 인핸서 요소를 포함하는 서열의 확인
본 실시예는 SCBV 프로모터 인핸서 요소를 포함하는 서열의 확인을 실연한다.
먼저, SCBV (진뱅크 등록 번호 AJ277091, 및 문헌 [Geijskes et al., Arch. Virol., 147: 2393-2404, 2002]에 기술됨)의 게놈으로부터 유래된 프로모터 단편을 일시적인 발현 검정법으로 시험하여 프로모터 서열의 어떤 영역이 인핸서 요소 서열을 함유하는지를 결정하였다. 프로모터 분석 연구에서, 전사 시작 부위 (+1 위치로서 정의됨)로부터 -839 내지 +106 bp (플라스미드 pSCBV839), -576 내지 +106 bp (플라스미드 pSCBV576), 및 -333 내지 +106 bp (플라스미드 pSCBV333)의 서열을 함유하는 SCBV 프로모터 (서열 1)로부터 유래된 단편들을 반딧불이 루시퍼라제 (LUC) 리포터 단백질에 대한 코딩 영역의 상류에 클로닝하였다. 노팔린 신타제 (Nos) 3' UTR 영역 (진뱅크 등록 번호 V00087.1 (이에 의해 본원에 전문이 참고로 포함됨)의 염기 1847 내지 2103, 및 도 1에 개시된 바와 같음)의 카피에 의해 전사가 종결되었다. 이러한 구축물들의 일시적인 전사 활성을 이들을 입자 포격에 의해 옥수수 Hi-II 현탁 세포 (하기 실시예 2에서 상세하게 기술됨) 내로 형질전환시키고 LUC 리포터 유전자의 활성을 모니터링함으로써 테스트하였다. SCBV:LUC 구축물을 함유하는 플라스미드 DNA, 및 GUS (베타-글루쿠로니다제) 코딩 영역의 발현을 구동시키는 옥수수 유비퀴틴 1 (ubi1) 유전자 프로모터 (미국 특허 번호 5,510,474 (이에 의해 본원에 전문이 참고로 포함됨)에 개시된 바와 같음; 본질적으로 진뱅크 등록 번호 S94464.1 (이에 의해 본원에 전문이 참고로 포함됨)의 염기 7 내지 1990)로 이루어지고 옥수수 Per5 3' UTR 종료인자 (미국 특허 번호 6,699,984 (이에 의해 본원에 전문이 참고로 포함됨)에 개시된 바와 같음)로 종결되는 구축물 (예를 들어, 구축물 ubi1:GUS)을 보유하는 기준 플라스미드의 DNA를 등몰량으로 공동-형질전환시킴으로써 각각의 실험에서 루시퍼라제 활성을 표준화하였다. 포격 2일 후, 형질전환된 세포로부터 전체 단백질을 단리하고, LUC 효소 활성 (루시퍼라제 유닛 (LU)/단백질 mg로 표현됨) 및 GUS 효소 활성 (GUS 활성 단위 (GU)/단백질 ㎍으로 표현됨)을 예를 들어 문헌 [Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology. A Laboratory Course Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995]에서 확인되는 방법으로 측정하였다. LU/단백질 mg:GU/단백질 ㎍의 비로서 LUC 수준을 GUS 수준에 표준화함으로써 이러한 SCBV:LUC 구축물들에서의 테스트 프로모터의 상대적인 활성을 비교하였다. 일시적인 테스트의 결과는 포격된 플라스미드 DNA의 농도가 증가됨에 따라 LUC 활성이 선형으로 증가하였음을 나타냈고, 이는 LUC 활성이 전사물 수준과 상관된다는 것을 가리킨다. 추가로, 전사 시작 부위의 -576 bp 상류부터 +106 하류까지의 서열을 함유하는 SCBV 프로모터 단편의 활성이 전장 프로모터 단편 (본원에서 시작 부위의 -839 bp 상류부터 +106 하류까지의 서열을 함유하는 것으로 정의됨)의 66％ ± 2％였다. 대조적으로, 전사 시작 부위의 -333 bp 상류부터 +106 하류까지의 서열을 함유하는 프로모터 단편의 활성은 전장 프로모터의 17％ ± 1％뿐이었다. 따라서, SCBV 프로모터 활성의 대부분에 대한 서열은 전사 시작부위로부터 -333 bp의 상류에 존재한다.
이종 최소 프로모터 서열에 의해 구동되는 전사를 강화할 수 있는 SCBV 프로모터 서열의 부분을 시험하였다. 이러한 실험에서 정의되는 바와 같이, 인핸서 요소는 TATA-박스가 없는 짧은 (200 내지 300 bp) 시스-작용 DNA 서열로서, 이종 최소 프로모터 서열에 대해 5' 근위에 놓인 경우에 일시적인 또는 안정적인 형질전환 시스템에서 테스트되었을 때 재현가능하고 측정가능한 방식으로 이종 최소 프로모터 서열의 발현 활성을 증가시키는 DNA 서열로서 작동적으로 확인된다. 추가로, 인핸서 요소의 직렬(tandem) 중복은 인핸서 요소의 단일 카피보다 더욱 더 높은 수준의 이종 최소 프로모터의 발현 활성을 제공한다. 본 실시예에서 이용된 이종 최소 프로모터 요소는 옥수수 알콜 데히드로게나제1 (Adh1) 유전자 프로모터의 -100 내지 +106까지의 염기 (진뱅크 등록 번호 X04049 (이에 의해 본원에 전문이 참고로 포함됨)의 염기 997 내지 1202에 상응함)를 포함한다.
전사 시작 부위의 -503부터 -222 bp까지 및 -758부터 -222 bp까지의 서열을 포함하는, SCBV 프로모터로부터 유래된 2개의 단편을 반딧불이 루시퍼라제 (LUC) 단백질을 코딩하는 코딩 영역에 융합된 최소 옥수수 Adh1 프로모터를 포함하는 서열에 대해 5'으로 클로닝하였다. 상기 기술된 바와 같이 Nos 3'UTR에 의해 키메라 유전자의 전사가 종결되었다. 옥수수 Hi-II 현탁 배양 세포를 LUC 및 GUS 구축물을 보유하는 플라스미드의 DNA로 입자 포격에 의해 형질전환시키고, 상기와 같이 효소 활성을 측정 및 비교하였다. -503 내지 -222 서열 또는 -758 내지 -222 서열이 최소 Adh1 프로모터에 대해 5'에 놓인 LUC 구축물을 함유하는 플라스미드들은 SCBV 서열이 부가되지 않은 최소 Adh1 프로모터에 비해 각각 6배 및 4배 더 많은 LUC 활성을 나타냈다. 따라서, SCBV 프로모터의 이러한 단편 내의 서열이 이종 옥수수 프로모터에 의해 매개되는 전사 활성을 강화한다.
최소 Adh1 프로모터에 의해 매개되는 발현을 증가시키는 -503 내지 -222 bp SCBV 인핸서 영역의 다중 카피의 능력을 LUC 코딩 영역에 융합된 최소 옥수수 Adh1 프로모터에 대해 5'에 -502 내지 -222 bp 서열의 1개, 2개 또는 4개의 카피를 클로닝함으로써 테스트하였다 (도 3A). 구축물을 함유하는 플라스미드 DNA (뿐만 아니라, 기준 ubi1:GUS 구축물이 있는 플라스미드 DNA)를 옥수수 Hi-II 현탁 배양 세포 내로 포격하고, 상기와 같이 LUC 및 GUS 활성을 측정 및 비교하였다. SCBV 인핸서 서열 영역의 1개의 카피, 2개의 카피 또는 4개의 카피를 함유하는 구축물이 포격된 세포는 SCBV 인핸서 서열이 없는 유사한 최소 Adh1 프로모터 구축물이 포격된 세포보다 LUC 활성이 각각 5배, 6배 및 10배 더 많았다 (도 3B).
서열 1에서 제공된 바와 같은 SCBV 프로모터의 -502 내지 -222 bp를 포함하는 핵산 염기가 식물 프로모터에 우수한 발현 특성을 부여할 수 있는 전사 활성화 활성을 코딩한다. 추가로, 서열 1에서 제공된 바와 같은 SCBV 프로모터의 -502 내지 -222 bp를 포함하는 염기의 다중 직렬 카피를 적층시키는 것에 의해 전사 활성화 활성이 증가된다. 추가로, 본원에서 제공되는 방법 및 시약이 전사 활성화 활성을 유지하는 더 짧은 서열을 제공하도록 추가로 시험 및 활용될 수 있거나, 또는 새로운 조합으로 다른 전사 활성화제 요소 및 식물 프로모터와 조합될 수 있다.
실시예 2
옥수수 Hi - II 현탁 배양 세포에서의 SCBV : LUC 및 ub1 : GUS 구축물의 일시적인 발현 테스트
본 실시예는 옥수수 Hi-II 현탁 배양 세포에서의 SCBV:LUC 및 ub1:GUS 구축물의 일시적인 발현 테스트를 기술한다.
옥수수 Hi-II 현탁 배양 세포 (문헌 [Armstrong et al., Maize Genet. Coop. Newslett., 65:92-93, 1991])를 상기 기술된 바와 같이 구축된 LUC 및 GUS 구축물을 보유하는 플라스미드의 DNA로 입자 포격에 의해 형질전환시키고, 효소 활성을 측정 및 비교하였다. 퀴아필터™ 플라스미드 맥시 키트(QiAfilter™ Plasmid Maxi Kit) (퀴아젠(Qiagen), 미국 매릴랜드주 저먼타운 소재)를 사용하여 플라스미드 DNA의 대량 제제를 제조하였고, 표준 분자 방법을 사용하여 양 및 품질을 분석하였다.
포격용 옥수수 Hi - II 현탁 배양 세포의 제조. Hi-II 세포를 28°의 암실에서 H9CP+ 배지 중에서 125 rpm의 진탕기 상에서 유지시켰다 (H9CP 배지는 MS 염 4.3 gm/L, 수크로스 3％, 카사미노산 200 mg/L, 미오-이노시톨 100 mg/L, 2.4-D 2 mg/L, NAA 2 mg/L, 1000X MS 비타민 1 mL/L, L-프롤린 700 mg/L, 및 코코넛워터 (시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 미국 미주리주 세인트루이스 소재) 62.5 mL/L, pH 6.0으로 이루어짐). 포격 전에, 2일이 지난 Hi-II 배양물을 G-N6 배지 (CHU N6 배지 3.98 g/L, CHU N6 비타민 1 mL/L (양쪽 모두 피토테크놀러지 래버러토리즈(PhytoTechnology Laboratories)® (미국 캔자스주 레넥사 소재)로부터의 CHU 성분), 미오-이노시톨 100 mg/L, 2,4-D 2 mg/L 및 수크로스 3％, pH 6.0)로 옮기고, 24시간 동안 성장시켰다. 포격일에, G-N6에서 성장된 세포 (2.5 gm의 세포)를 0.5 M D-소르비톨 및 0.5 M D-만니톨을 함유하는 G-N6 배지 상에 놓인 무균 와트만(Whatman) 1번 필터 디스크 (55 mm)로 옮기고, 4시간 동안 인큐베이션하였다. 삼투압이 조정된 세포가 포격에 사용된다.
플라스미드 DNA 가 있는 금 입자의 제조 및 포격 검정법. 금 입자 (직경 1 ㎛, 바이오래드(BioRad), 미국 미국 캘리포니아주 허큘레스 소재 소재)를 70％ 에탄올로 10분 동안 세정한 후, 무균수로 3회 세정하였다. 입자를 50％ 글리세롤에 120 mg/mL의 농도로 분배시켰다. 전형적인 실험을 위해, 150 ㎕ (18 mg)의 금 입자, 약 5 ㎍의 플라스미드 DNA, 150 ㎕의 2.5 M CaCl2 및 30 ㎕ 0.2 M 스퍼미딘을 조합하였다. 간헐적으로 부드럽게 와동시키면서 반응물 (총부피 375 ㎕)을 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. DNA가 코팅된 금 입자를 간단히 원심분리하고, 420 ㎕의 70％ 에탄올로 세정한 후, 420 ㎕의 100％ 에탄올로 세정하였다. 최종 펠릿을 110 ㎕의 100％ 에탄올에 재현탁시키고, 브랜슨(Branson) 1450 초음파처리기로의 간단한 초음파처리에 적용하였다 (버스트(burst) 사이의 간격 1분으로 각각 3초의 버스트 3회). DNA로 코팅된 금 입자의 12.2 ㎕ 분취량을 9개의 마크로캐리어(macrocarrier) (바이오래드, 미국 캘리포니아주 허큘레스 소재) 각각에 스프레드하고, 바이오래드 PDS1000/He 시스템을 사용하는 포격 검정법에서 사용하였다. 3510 psi 디스크를 사용하여 9 ㎝의 표적 거리에서 현탁 배양 세포를 형질전환시켰고, 각각의 플레이트를 3회 포격하였다. 포격 후, 세포를 28℃의 암실에서 처음에는 12시간 동안 D-소르비톨 및 D-만니톨 배지를 함유하는 G-N6에서, 그 후에는 추가로 36시간 동안 G-N6 플레이트에서 인큐베이션하였다. 세포를 플레이트로부터 회수하고, 블롯팅하여 완충제를 제거하고, 300 ㎕의 2x CCLT LUC 추출 완충제 (프로메가 코포레이션(Promega Corporation), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)로 추출하였다. 원심분리 후, 약 600 ㎕의 단백질 추출물을 수집하였다. 브래드포드(Bradford) 검정법을 사용하여 단백질 농도를 추정하였다.
LUC 효소 활성 (루시퍼라제 유닛 (LU)/단백질 mg으로 표현됨) 및 GUS 효소 활성 (GUS 활성 유닛 (GU)/단백질 ㎍으로 표현됨)을 문헌 [Maliga et al. (Methods in Plant Molecular Biology. A Laboratory Course Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]에서 예를 들어 확인되는 방법으로 측정하였다. LUC/단백질 mg:GUS/단백질 ㎍의 비로서 LUC 수준을 GUS 수준에 표준화함으로써, SCBV:LUC 구축물에서의 테스트 프로모터의 상대적인 활성을 비교하였다.
실시예 3
옥수수 식물에서의 활성화 태그부착을 위한 플라스미드
본 실시예는 아그로박테리움 수퍼바이너리(superbinary) 플라스미드의 생성을 기술한다.
수퍼바이너리 시스템은 아그로박테리움 셔틀 벡터/동종 재조합 시스템의 특수한 예이다 (문헌 [Komari et al., Meth. Mol. Biol. 343:15-41, 2006], [Komari et al., Plant Physiol. 114:1155-1160, 2007]; 유럽 특허 번호 EP604662B1 및 미국 특허 번호 7,060,876 (각각 그의 전문이 참고로 포함됨)을 또한 참조). 수퍼바이너리 시스템과 함께 사용되는 아그로박테리움 투메파시엔스 숙주 균주는 LBA4404(pSB1)이다. 균주 LBA4404(pSB1)는 2개의 독립적으로 복제되는 플라스미드인 pAL4404 및 pSB1을 보유한다. pAL4404는 vir 유전자 (Ti 플라스미드 pTiACH5로부터의 것)의 무손상 세트를 함유하지만 T-DNA 영역이 없는 (따라서 T-DNA 좌측 및 우측 경계 반복 서열이 없는) Ti-플라스미드-유래 헬퍼 플라스미드이다. 플라스미드 pSB1은 pTiBo542로부터의 vir 유전자의 추가적인 부분적인 세트를 공급한다. 수퍼바이너리 시스템에서 사용되는 셔틀 벡터의 한 예는 pSB11이고, 이는 우측 및 좌측 T-DNA 경계 반복 영역이 플랭킹된, 식물 세포 형질전환에 예정된 유전자에 대한 도입 부위로서의 역할을 하는 클로닝 폴리링커(polylinker)를 함유한다. 셔틀 벡터 pSB11은 아그로박테리움에서 독립적으로 복제할 수 없지만, pSB1과 pSB11 상에 존재하는 공통 서열 사이의 동종 재조합에 의해 pSB1 내로 통합되었을 때 공동-통합 플라스미드로서 아그로박테리움 내에서 안정적으로 유지된다. 따라서, 변형된 pSB11 벡터 상의 LBA4404(pSB1) 내로 도입된 완전히 변형된 T-DNA 영역은 2개의 상이한 아그로박테리움 Ti 플라스미드 공급원 (pTiACH5 및 pTiBo542)으로부터 유래된 Vir 단백질에 의해 식물 세포 상에 생산적으로 작용하고 식물 세포 내로 전달된다. 수퍼바이너리 시스템은 외떡잎 식물 종의 형질전환에서 특히 유용한 것으로 입증되었다 (문헌 [Hiei et al., Plant J. 6:271-282, 1994], 및 [Ishida et al., Nat. Biotechnol. 14:745-750, 1996] 참조).
활성화 태그부착 옥수수 식물의 생산을 위한 형질전환 플라스미드는 pSB11 벡터 골격을 지니는, 수퍼바이너리 플라스미드 pSB1과 pEPP1088 사이의 동종 재조합에 의해 형성된 공동-통합 플라스미드를 포함할 수 있다 (유럽 특허 번호 EP604662B1 및 미국 특허 번호 7060876 (각각 본원에 참고로 포함됨) 참조). 이러한 공동통합 플라스미드는 pSB1::pEPP1088 또는 ZeaTAG 벡터로서 지칭된다. pEPP1088의 구조를 구축물의 선별된 영역의 제한 효소 분석 및 DNA 서열 결정에 의해 확인하였다. pEPP1088의 관련된 특징들을 도해하는 구조 지도가 도 3에서 제공된다. pEPP1088은 pSB11 플라스미드가 제공하는 좌측 (LB)과 우측 (RB) T-DNA 경계 서열 사이에 위치한, 상기 기술된 -502 내지 -222 bp SCBV 인핸서 서열의 4개의 카피, 및 인트론 1 및 5' UTR (본질적으로 진뱅크 등록 번호 EU155408.1 (본원에 전문이 참고로 포함됨)의 염기 12 내지 1411로서 개시된 바와 같음)이 회합되어 있는 벼 (오리자 사티바) 액틴 유전자 프로모터, 미국 특허 출원 번호 20090093366에 개시된 바와 같은 AAD-1 제초제 내성 단백질에 대한 코딩 서열 및 본질적으로 진뱅크 등록 번호 gb|L35913.1|MZELIPASE의 염기 921 내지 1277으로서, 그리고 미국 특허 번호 7,179,902 (각각 본원에 전문이 참고로 포함됨)에 개시된 바와 같은 옥수수 리파제(lipase) 유전자로부터의 3' UTR 종료인자 서열을 포함하는 선별성 마커 유전자를 함유한다.
아그로박테리움 매개 형질전환에 의해 옥수수 세포 내로 도입될 때, pEPP1088 (및 pSB1::pEPP1088에서 존재하는 것)의 T-DNA는 옥수수 염색체 내의 무작위 위치로 통합된다. 형질전환된 옥수수 세포의 선별은 T-DNA 내의 구성적으로 발현되는 AAD1 선별성 마커 유전자에 의해 제공된다. 강력한 -502 내지 -222 bp SCBV 전사 인핸서 활성화제 요소의 직렬 카피를 보유하는 T-DNA는 통합 부위 부근의 천연 유전자의 비정상적인 발현을 야기하고, 이에 의해, 일부 경우에는, 형질전환된 조직으로부터 재생된 식물에 새로운 확인가능한 형질을 제공한다. 어셉터 부위 근처의 영향을 받은 유전자의 단리 및 확인을 용이하게 하는 현대의 분자 생물학 방법이 입수가능하고, 따라서 추가적인 탐구를 위한 단리된 유전자를 제공한다.
실시예 4
옥수수의 아그로박테리움-매개 형질전환
본 실시예는 옥수수의 아그로박테리움-매개 형질전환을 기술한다.
미성숙 씨눈 생산. B104 근교배 라인으로부터의 종자를 선샤인 커스텀 블렌드(Sunshine Custom Blend)® 160 (선 그로 호티컬쳐(Sun Gro Horticulture), 미국 워싱턴주 벨뷰 소재)을 함유하는 4-갤런 단지 내에 심었다. 16:8시간 명:암 광주기로 고압 나트륨 및 금속 할로겐화물 램프의 조합을 사용하여 온실에서 식물을 성장시켰다. 형질전환을 위한 미성숙 씨눈을 수득하기 위해, 제어형 동기-수분(sib-pollination)을 수행하였다. 씨눈이 약 1.4 내지 2.0 ㎜ 크기였을 때 수분 후 10일 내지 13일에 미성숙 씨눈을 단리하였다.
감염 및 공동-배양. 50％ 시판 표백제 + 트윈(Tween) 20 (500 mL 당 1 또는 2 방울)에 10분 동안 함침시킴으로써 옥수수 이삭을 표면 멸균시키고, 무균수로 3회 헹궜다. 50 mg/L 스펙티노마이신, 10 mg/L 리팜피신 및 50 mg/L 스트렙토마이신을 함유하는 YEP 고체 배지 상에서 28℃에서 3일 동안 또는 25℃에서 4일 동안 성장된 박테리아의 1 또는 2 루프(loop)를 100 μM 아세토시린곤을 함유하는 5 mL의 액체 감염 배지 (MS 염, ISU 변형 MS 비타민, 3.3 mg/L 디캄바, 68.4 gm/L 수크로스, 36 gm/L 글루코스, 700 mg/L L-프롤린, pH 5.2) 내로 전달함으로써 수퍼바이너리 벡터 공동통합 플라스미드를 함유하는 아그로박테리움 세포의 현탁액을 제조하였다. 균일한 현탁액이 달성될 때까지 무균성 5 mL 피펫을 사용하여 용액을 부드럽게 상하로 피펫팅(pipetting)하였고, 울트로스펙(Ultrospec) 10 세포 밀도 측정기 (지이 헬스케어(GE Healthcare)/아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 사용하여 농도를 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600) 0.3 내지 0.5로 조정하였다. 2 mL의 감염 배지를 함유하는 마이크로 원심분리 튜브 내로 미성숙 씨눈을 직접적으로 단리하였다. 배지를 제거하고, 1 내지 2 mL의 신선한 감염 배지로 2회 교체한 후, 제거하고, 1.5 mL의 아그로박테리움 용액으로 교체하였다. 아그로박테리움 및 씨눈 용액을 5분 동안 실온에서 인큐베이션한 후, MS 염, ISU 변형 MS 비타민, 3.3 mg/L 디캄바, 30 gm/L 수크로스, 700 mg/L L-프롤린, 100 mg/L 미오-이노시톨, 100 mg/L 카세인 효소 가수분해물, 15 mg/L AgNO3, 100 μM 아세토시린곤, 및 2.3 내지 3 gm/L 젤잔(Gelzan)™ (시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트루이스 소재) (pH 5.8)을 함유한 공동-배양 배지로 옮겼다. 공동-배양 인큐베이션을 암실 또는 24시간 백색 형광 조건 (약 50 μEm-2s-1)에서 3 내지 4일 동안 25℃에서 수행하였다.
휴지 및 선별. 공동-배양 후, 씨눈을 MS 염, ISU 변형 MS 비타민, 3.3 mg/L 디캄바, 30 gm/L 수크로스, 700 mg/L L-프롤린, 100 mg/L 미오-이노시톨, 100 mg/L 카세인 효소 가수분해물, 15 mg/L AgNO3, 0.5 gm/L MES (2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 1수화물; 피토테크놀러지즈 래버러토리즈, 미국 캔자스주 레넥사 소재), 250 mg/L 카르베니실린, 및 2.3 gm/L 젤잔™ (pH 5.8)을 함유하는 비-선별 MS-기반 휴지 배지로 옮겼다. 암실 또는 24시간 백색 형광 조건 (약 50 μEm-2s-1)에서 28℃에서 7일 동안 계속 인큐베이션하였다. 7일 휴지 기간 후에, 씨눈을 선별 배지로 옮겼다. 식물에서 발현가능한 AAD1 선별성 마커 유전자를 함유하는 수퍼바이너리 플라스미드로 형질전환된 옥수수 조직을 선별하기 위해, 할록시폽(Haloxyfop)이 보충된 MS-기반 휴지 배지 (상기)를 사용하였다. 먼저 씨눈을 100 nM 할록시폽을 함유하는 선별 배지로 옮기고, 1 내지 2주 동안 인큐베이션한 후, 500 nM 할록시폽으로 옮기고, 추가로 2 내지 4주 동안 인큐베이션하였다. 형질전환된 단리물을 암실 또는 24시간 백색 형광 조건 (약 50 μEm-2s-1), 28℃에서의 약 5 내지 8주의 과정에 걸쳐 수득하였다. 회수된 단리물을 재생 및 추가 분석을 위해 1 내지 2주 간격으로 신선한 선별 배지로 옮김으로써 대량화하였다.
옥수수 형질전환 업계의 당업자는 식물에서 발현가능한 다른 선별성 마커 유전자 (예를 들어, 제초제 내성 유전자)가 사용된 경우 형질전환된 식물의 다른 선별 방법이 이용가능하다는 것을 이해할 것이다.
예비-재생. 선별 공정 후, 24시간 광 체계에 노출된 배양물을 MS 염, ISU 변형 MS 비타민, 45 gm/L 수크로스, 350 mg/L L-프롤린, 100 mg/L 미오-이노시톨, 50 mg/L 카세인 효소 가수분해물, 1 mg/L AgNO3, 0.25 gm/L MES, 0.5 mg/L 나프탈렌아세트산, 2.5 mg/L 아브시스산, 1 mg/L 6-벤질아미노퓨린, 250 mg/L 카르베니실린, 2.5 gm/L 젤잔™, 및 500 nM 할록시폽 (pH 5.8)을 함유하는 MS-기반 예비-재생 배지로 옮겼다. 24시간 백색 형광 조건 (약 50 μEm-2s-1)에서 28℃에서 7일 동안 계속 인큐베이션하였다.
재생 및 묘목 단리. 재생을 위해, 배양물을 MS 염, ISU 변형 MS 비타민, 60 gm/L 수크로스, 100 mg/L 미오-이노시톨, 125 mg/L 카르베니실린, 2.5 gm/L 젤잔™, 및 500 nM 할록시폽 (pH 5.8)을 함유하는 MS-기반 1차 재생 배지로 옮겼다. 암실 또는 24시간 백색 형광 조건 (약 50 μEm-2s-1), 28℃에서의 2주 후, 500 nM 할록시폽의 존재 또는 부재 하에 MS 염, ISU 변형 MS 비타민, 30 gm/L 수크로스, 100 mg/L 미오-이노시톨, 3 gm/L 젤잔™ (pH 5.8)으로 구성된 MS-기반 2차 재생 배지로 조직을 옮겼다. 16시간 또는 24시간 백색 형광 조건 (약 50 μEm-2s-1), 28℃에서 2주 동안 재생/선별을 계속하였다. 묘목 길이가 3 내지 5 cm에 도달했을 때, 이를 잘라내고, 2차 재생 배지 (상기와 같지만 할록시폽이 없음)로 옮기고, 16시간 백색 형광 조건 (약 50 μEm-2s-1)에서 25°에서 인큐베이션하여, 슈트 및 뿌리가 추가로 성장 및 발달하게 하였다.
종자 생산. 식물을 메트로-믹스(Metro-Mix)® 360 무토양 성장 배지 (선 그로 호티컬쳐)로 이식하고, 성장실에서 추위에 길들게 하였다. 그 후, 식물을 선샤인 커스텀 블렌드 160 토양 혼합물로 이식하고, 온실에서 성장시켜 개화시켰다. 종자 생산을 위한 제어형 수분을 수행하였다.
실시예 5
안정적으로 형질전환된 옥수수 세포에서의 SCBV 인핸서 활성
형질전환된 B104 미성숙 씨눈으로부터 재생된 10개의 T0 식물으로부터 게놈 DNA를 단리하고 (퀴아젠 디엔이지 플랜트 미니 키트(Qiagen DNeasy Plant Mini Kit): 퀴아젠, 미국 매릴랜드주 저먼타운 소재), pSB1::pEPP1088로부터 전달된 통합된 T-DNA의 게놈 위치를 역 PCR 클로닝 및 역 PCR로 증폭된 생성물의 DNA 시퀀싱으로 결정하였다. 4xSCBV 인핸서로부터 10 kb 이내에 위치한 플랭킹 코딩 영역이 나타내는 유전자의 신원을 플랭킹 서열을 질의 서열로 사용하여 BLAST 검색 (문헌 [Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410], 및 [Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990])으로 결정하였다. BLAST 분석 결과는 T-DNA, 따라서 4XSCBV 인핸서가 10개의 라인 각각에서 상이한 게놈 위치에서 통합되었음을 나타냈고, 따라서 각각의 라인에서 4XSCBV 인핸서에 상이한 유전자들이 플랭킹된다 (표 1).
10개의 T0 라인의 잎 조직으로부터 전체 RNA를 단리하였다 (퀴아젠 디엔이지 플랜트 미니 키트, 퀴아젠 (미국 매릴랜드주 저먼타운 소재)). 4XSCBV 인핸서에 플랭킹된 관련 유전자에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여, 확인된 플랭킹 유전자의 전사물 축적을 역전사 및 RT-PCR (실시간 PCR)에 의해 적합한 T0 식물과 형질전환되지 않은 대조군 식물 간에 비교하였다. 대조군으로서, 내인성 GAPDH 유전자의 전사물 축적을 또한 결정하였다.
RT-PCR 생성물은 이러한 라인들에서 상이한 플랭킹 유전자들 중 3개로부터 유래되는 전사물의 축적 증가를 드러냈다. 4XSCBV 인핸서는 T0 라인 중 2개에서는 영향을 받은 플랭킹 유전자의 2.6 kb 및 2.8 kb 상류에, 제3 T0 라인에서는 영향을 받은 플랭킹 유전자의 478 bp 하류에 위치한다. 따라서, 이러한 결과들은 T-DNA에 의해 전달된 4XSCBV 인핸서가 통합 부위 부근의 유전자의 전사물의 가닥-독립적인 축적 증가를 야기한다는 것을 가리킨다. 표 1은 확인된 플랭킹 유전자 및 이들의 전사 수준의 분석 결과를 가리킨다.
Figure pct00001
옥수수 유전학 및 식물 분자 생물학 분야의 당업자는 영향을 받은 유전자의 성질에 따라 4XSCBV 인핸서에 의해 유도된 인접 유전자의 발현 증가가 일부 경우에는 트랜스제닉 식물에 새롭고 유용한 형질을 부여할 것임을 인지할 것이다. 총괄적으로, 4XSCBV 인핸서가 있는 식물은 ZeaTAG-표지 집단을 나타낸다. 이러한 형질은 영향을 받은 유전자가 코딩하는 단백질 자체의 축적 증가의 결과, 예를 들어 종자 내의 영양적으로 바람직한 단백질의 축적 증가, 또는 즉각적으로 영향을 받은 유전자의 유전자 생성물이 하나 또는 다수의 다른 유전자의 발현을 제어하는 하류 효과 (예를 들어, 전사 활성화제/리프레서 유전자의 경우에서와 같음)의 결과일 수 있다. 도입된 T-DNA의 통합 위치의 무작위 성질은, 표준 식물 육종 방법과 커플링되어, 활성화제 요소가 옥수수 게놈 내의 모든 또는 대부분의 유전자로부터 효과적인 거리 내에 위치하는 T-DNA 보유 식물의 라이브러리를 포함하는 대형 식물 집단을 확립하는데 사용될 수 있고, 따라서 모든 또는 대부분의 옥수수 유전자가 전사적으로 활성화되는 기회를 제공한다.
경제적으로 중요한 표현형에 대한 식물-수준 스크리닝이 성장 챔버, 온실 또는 야외 환경 하에 가능하다. 본원에서 제시된 바와 같이, 역 PCR과 같은 분자 생물학 방법은 바람직한 표현형을 나타내는 식물로부터 통합된 T-DNA 및 통합된 T-DNA에 플랭킹된 실질적인 길이의 게놈 DNA을 단리하는 것을 가능하게 한다. 또한, 게놈 워킹(walking) 기술과 같은 방법은 게놈 DNA 서열의 더욱 더 광범위한 영역의 결정을 허용하고, 따라서 도입된 활성화제 요소에 근접하여 존재하는 유전자의 확인을 가능하게 한다. 고처리량 방법 예컨대 마이크로어레이(microarray) 분석 및 더욱 유전자 특이적인 분석 방법은 영향을 받은 전사물 수준의 확인 및 정량을 가능하게 한다. 관련된 작물 형질에서 수반되는 후보 유전자가 확인될 수 있고, 단리될 수 있으며, 추가로 특성화 및 탐구되어, 새롭고 유용한 작물 품종을 제공할 수 있다.
역으로, 새로운 형질은 4XSCBV 인핸서가 있는 T-DNA가 옥수수 유전자의 코딩 영역 또는 발현 조절 영역 내로 통합되는 것으로 인한 옥수수 유전자 기능 파괴의 결과일 수 있다. 이같은 경우에, 4XSCBV 인핸서가 있는 T-DNA 및 주변의 게놈 영역을 단리하여 추가로 특성화할 수 있다.
실시예 6
ZeaTAG 집단의 전방향 유전자 스크리닝
본 실시예는 변경된 표현형에 대한 ZeaTAG 집단의 전방향 유전자 스크리닝을 기술한다.
가뭄 스트레스 스크린
가뭄 내성을 부여하는 돌연변이를 함유하는 ZeaTAG 라인을 확인하기 위해, 개별적인 ZeaTAG 이벤트들로부터의 식물을 야외에 심었다. 성장 사이클의 생식 기간 동안 가뭄 스트레스를 야기하도록 물을 저지하였다: 대략적으로 개화 2주 전부터 약 개화 2주 후까지. 목적은 개화 단계에서의 4주 스트레스 기간을 달성하는 것이다. 환경 모델링을 사용하여, 토양 수분 모니터링 및 날씨 데이터 (기온, 증기압 부족, 풍속, 및 순 방사선)를 기초로 정확한 옥수수 증발 증산 요구량을 예측하였다. 시각적 관찰에 의한 잎 말림, 적외선 온도계에 의한 잎 온도 증가, 클로로필 형광에 의한 광합성 감소 및 곡물 생산의 측정에 의한 수율 감소와 같이 가뭄 증상에 대해 식물을 모니터링하였다. 물 스트레스 조건 하에 유의하게 더 적은 잎 말림, 더 낮은 잎 온도, 더 높은 광합성율을 나타내거나 또는 유의하게 더 수율이 더 높은 식물을 확인하고, 후속 스크린에서 사용하였다.
가뭄 내성 표현형을 확인하기 위해, 유의하게 더 많은 가뭄 내성을 나타내는 ZeaTAG 이벤트들을 복제된 야외 시험에서 심었다. 3개 이상의 복제로 무작위로 분할된 블럭 디자인으로 이러한 이벤트들을 심었다. 1개의 블럭에는 물 스트레스를 방지하기에 충분한 물을 관개하였다. 다른 블럭은 상기 기술된 바와 같이 물이 결핍된 조건 하에 성장시켰다. 상기 기술된 바와 같이 잎 말림, 잎 온도 증가, 광합성 감소, 및 수율 감소에 대해 식물을 모니터링하였다. 형질전환되지 않은 대조군 식물보다 유의하게 잎 말림이 더 적거나, 잎 온도가 더 낮거나, 광합성이 더 많거나 또는 수율이 더 큰 식물을 2차 스크린을 통과한 것으로 간주하였다.
질소 사용 효율 스크린
비-트랜스제닉 대조군 식물보다 질소 사용 효율이 더 큰 ZeaTAG 이벤트를 확인하기 위해, 1차 스크린을 수행하였다. 약 40,000개의 ZeaTAG 함유 이벤트를 함유하는 식물을 질소 결핍 조건 하에 야외에서 성장시켰다. 식물을 에이커 당 35 lbs 미만의 N으로 야외에서 성장시켰다. 육안 관찰에 의해 백화에 대해, 적외선 온도계에 의해 잎 온도 증가에 대해, 곡물 수확에 의해 수율 감소에 대해 식물을 모니터링하였다. 이러한 파라미터들을 비-트랜스제닉 대조군 식물과 비교하였다. 비-트랜스제닉 대조군 라인보다 더 적은 백화, 더 낮은 잎 온도, 더 높은 광합성율 또는 더 큰 수율을 나타내는 ZeaTAG 라인을 2차 스크린에서 평가하였다.
2차 스크린으로서, 표현형을 확인하기 위해 유의하게 더 큰 질소 사용 효율을 나타내는 ZeaTAG 이벤트를 복제된 야외 시험에서 심었다. 3개 이상의 복제로 무작위로 분할된 블럭 디자인으로 이러한 이벤트들을 심었다. 1개의 블럭에는 질소 스트레스를 방지하도록 충분한 질소 비료를 관개하였다. 다른 블럭은 상기 기술된 바와 같이 질소 결핍 조건 하에 성장시켰다. 육안 관찰에 의해 백화에 대해, 적외선 온도계에 의해 잎 온도 증가에 대해, 곡물 수확에 의해 수율 감소에 대해 식물을 모니터링하였다. 형질전환되지 않은 대조군 식물보다 더 적은 백화, 더 낮은 잎 온도, 더 많은 광합성 또는 더 큰 수율을 나타내는 식물을 2차 스크린을 통과한 것으로 간주하였다.
2차 스크린에서 표현형이 확인되었으면, 형질전환되지 않은 모계와 ZeaTAG 라인 사이의 교배물의 자손을 스크리닝함으로서 ZeaTAG 삽입의 유전 연관에 대해 표현형을 테스트하였다. ZeaTAG 요소를 함유하는 식물은 표현형을 나타내고 ZeaTAG 요소를 함유하지 않는 식물은 그렇지 않을 때, 이러한 표현형은 삽입물과 유전적으로 연관되는 것으로 간주되고, 아마도 ZeaTAG 요소에 의해 야기될 것이다. ZeaTAG 요소에 의해 발현이 영향을 받을 수 있는 유전자를 확인하기 위해, 게놈 내에서의 ZeaTAG 요소의 위치를 결정하였다.
ZeaTAG 요소에 플랭킹된 게놈 서열을 단리하고 이러한 서열을 옥수수의 게놈 서열에 비교함으로써 ZeaTAG 요소의 게놈 위치를 결정하였다. 역 PCR (iPCR) (문헌 [Ochman et al., Genetics, 120: 621-6231988]), TAIL (문헌 [Liu et al., Plant Journal 8: 457-463, 1995]) 및 결찰-매개 PCR (LMPCR) (문헌 [Prod'hom et al., FEMS Microbiol Lett.158: 75-81, 1998])을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 분자 생물학 기술에 의해 ZeaTAG 요소에 플랭킹된 서열을 결정할 수 있다. 이러한 서열들을 BLAST와 같은 서열 정렬 도구에 의해 게놈 서열에 비교하여 게놈 내에서의 ZeaTAG 요소의 위치를 확인하였다.
주석이 달린 게놈을 시험함으로써 ZeaTAG 요소가 플랭킹되거나 ZeaTAG 요소에 의해 중단된 유전자를 결정하였다. ZeaTAG 요소에 플랭킹된 유전자의 전사가 돌연변이체 표현형을 담당할 수 있다. 이러한 유전자들이 유사한 표현형을 부여할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 야생형 옥수수에서 이러한 유전자들을 과발현시킬 수 있다. 이를 테스트하기 위해, 유전자들을 강한 프로모터에 의해 또는 전사를 강화하도록 이들에 플랭킹된 인핸서 서열과 함께 자신의 프로모터에 의해 구동되는 형질전환 벡터 내로 클로닝하였다. 이러한 벡터들을 형질전환에 의해 야생형 옥수수 내로 도입하고, 이러한 형질전환으로부터 초래된 식물을 표현형에 대해 테스트하였다.
유사하게, ZeaTAG 요소에 의해 중단된 유전자들이 표현형을 야기할 수 있다. 요소에 의해 중단된 유전자가 표현형을 담당한다는 것을 확인하기 위해, 유전자의 발현을 파괴시키고 이러한 파괴를 함유하는 식물을 표현형에 대해 테스트할 수 있다. 안티센스 RNA, 인공 마이크로 RNA, 및 TILLING에 의해 유전자 내의 돌연변이를 확인하는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 당업자에게 공지된 다수의 방법에 의해 특정 유전자의 발현의 파괴를 달성할 수 있다.
실시예 7
ZeaTAG 집단의 역방향 유전자 스크리닝
본 실시예는 돌연변이에 대한 ZeaTAG 집단의 역방향 유전자 스크리닝을 기술한다.
역방향 유전자 스크리닝은 특정 유전자에 영향을 미치는 돌연변이를 찾고, 이어서 확인된 라인을 돌연변이체 표현형에 대해 테스트하는 것이다. 집단에 대한 플랭킹 서열 태그 선집을 생성시키는 것 (문헌 [Jeong et al., The Plant Journal 45: 123-132, 2006]) 및 ZeaTAG 집단으로부터의 DNA의 풀링(pooled) 샘플의 인덱스 선집을 생성시키는 것 (문헌 [May et al., Molecular Biotechnology 20: 209-221, 2002])을 포함하지만 이에 한정되지 않는 여러 방식으로 ZeaTAG 집단을 역 유전자 분석에서 사용할 수 있다.
ZeaTAG 집단으로부터 잎 조직의 샘플을 취하고, 각각으로부터 DNA를 단리하고, 삽입물에 플랭킹된 서열을 확인하고, 자신이 유래된 이벤트에 서열이 연결되는 검색가능한 데이터베이스에 서열을 저장함으로써 플랭킹 서열 태그의 선집을 생성시켰다. 제조사가 권장하는 프로토콜을 사용하여 퀴아젠 디엔이지 플랜트 키트 (퀴아젠, 미국 매릴랜드주 저먼타운 소재)를 사용하여 게놈 DNA를 단리하였다. 삽입물에 플랭킹된 서열을 문헌 [Yephremov and Saedler (Plant Journal 21: 295-305, 2000)]에서 변형된 바와 같은 결찰 매개 PCR (문헌 [Mueller et al., Science 246: 780-786, 1989])을 사용하여 확인하였다. 간략하게, ZeaTAG 라인으로부터의 게놈 DNA를 제한 효소 소화로 단편화하고, 변성시켰다. ZeaTAG 요소의 끝부분의 서열에 대해 상보적인 비오틴화 올리고뉴클레오티드 프라이머를 단편화된 DNA에 혼성화시키고, DNA 폴리머라제로 연장시켰다. 스트렙타비딘이 코팅된 자기 비드를 혼합물에 첨가하여, 이러한 프라이머로부터 연장된 DNA 단편을 함유하는 DNA 단편에 결합시켰다. 공지된 서열의 이중 가닥 DNA 어댑터를 미지의 끝부분에 결찰시켰다. 이러한 단편들을 ZeaTAG 요소 및 다른 쪽 끝부분의 DNA 어댑터 내의 서열에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 그 후, PCR 단편의 서열을 결정하고, BLAST에 의해 옥수수 게놈 서열에 대해 지도화하였다. 이러한 서열들은 ZeaTAG 요소의 삽입 부위에 위치한다. 약 10 kbp 이내의 유전자가 ZeaTAG 요소 내의 인핸서 서열에 의해 상향-조절될 수 있다.
표현형을 야기하는 것으로 가정되는 유전자 내 또는 근처의 삽입을 함유하는 식물을 데이터베이스 검색에 의해 확인할 수 있다. 이러한 이벤트를 함유하는 식물을 표현형에 대해 테스트할 수 있다.
실시예 8
SCBV 로 강화된 종자 특이적 프로모터를 함유하는 DNA 구축물
본 실시예는 레스퀘렐라 펜들레리 KCS (LfKCS3; 미국 특허 번호 7,253,337) 종자 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 SCBV 프로모터 인핸서 요소를 포함하는 서열의 확인, 및 식물 형질전환 벡터의 디자인 및 구축을 실연한다.
SCBV (진뱅크 등록 번호 AJ277091, 및 문헌 [Geijskes et al., Arch. Virol., 147: 2393-2404, 2002]에 기술됨)의 게놈으로부터 유래된 프로모터 단편을확인하였다. 프로모터 분석 연구에서, -503부터 -222까지의 서열을 함유하는 SCBV 프로모터 (도 1; 서열 1)로부터 유래된 단편이 직렬로 4회 반복되었고, LfKCS3 종자 특이적 프로모터에 융합되었다. 4X SCBV 인핸서 LfKCS3 프로모터 융합물을 아실-CoA 델타 9 디새츄라제 코딩 영역의 상류에 클로닝하고, 단백질 발현을 구동시키는데 사용하였다.
pDAB3892 구축물 (도 5)을 다중-부위 게이트웨이(Gateway) 재조합 L-R 반응™ (인비트로젠(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)을 사용하여 구축하였다. pDAB3892는 아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타 9 디새츄라제 식물 전사 단위 (PTU), 및 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 이러한 아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타 9 디새츄라제 PTU는 Lf KCS3 유전자 프로모터에 융합된 4X SCBV 인핸서 요소로 이루어지는 키메라 프로모터 (SCBV282(-503 내지 -222)::SCBV282(-503 내지 -222)::SCBV282(-503 내지 -222)::SCBV282(-503 내지 -222)::LfKCS3 프로모터), 아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타 9 디새츄라제 (델타 9 디새츄라제; 국제 공개 번호 WO9950430)를 함유하고, 아그로박테리움 투메파시엔스 오픈 리딩 프레임 23 3' 비번역 영역 (AtuORF23 3'UTR; 유럽 특허 출원 번호 222493)으로 종결된다. 이러한 아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타 9 디새츄라제 PTU가 서열 2로서 열거된다. 선별성 마커 PTU는 카사바 잎맥 모자이크 바이러스 프로모터 (CsVMV 프로모터; 문헌 [Verdaguer et al., Plant Molecular Biology 31:1129-1139; 1996]), 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT; 문헌 [Wohlleben et al., Gene 70:25-37; 1988]) 및 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF1 3' 비번역 영역 (AtuORF1 3' UTR; 문헌 [Huang et al., J. Bacteriol. 1990 172:1814-1822])을 함유한다. 이러한 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU가 서열 3으로서 열거된다.
아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타 9 디새츄라제 PTU를 식물 형질전환 이원성 벡터의 T-가닥 DNA 경계 영역 내의 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 PTU에 대해 시스 배향 (머리-대-꼬리 배향)으로 배향시켰다. 이원성 벡터는 추가적인 조절 요소, 예컨대 오버드라이브(Overdrive) (문헌 [Toro et al., PNAS 85(22): 8558-8562; 1988]), 및 T-가닥 경계 서열 (T-DNA 경계 A 및 T-DNA 경계 B; 문헌 [Gardner et al., Science 231:725-727; 1986] 및 국제 공개 번호 WO 2001/025459)을 함유한다. 2개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 단리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
대조군 구축물인 pDAB1757 (도 6)을 다중-부위 게이트웨이 재조합 L-R 반응™ (인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)을 사용하여 구축하였다. pDAB1757은 아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타 9 디새츄라제 식물 전사 단위 (PTU), 및 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 이러한 아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타 9 디새츄라제 PTU는 Lf KCS3 유전자 프로모터 (LfKCS3 프로모터), 아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타 9 디새츄라제 (An 델타 9 디새츄라제)를 함유하고, 아그로박테리움 투메파시엔스 오픈 리딩 프레임 23 3' 비번역 영역 (AtuORF23 3'UTR)으로 종결된다. 이러한 아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타 9 디새츄라제 PTU가 서열 4로서 열거된다. 선별성 마커 PTU는 카사바 잎맥 모자이크 바이러스 프로모터 (CsVMV 프로모터), 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT) 및 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF1 3' 비번역 영역 (AtuORF1 3' UTR)을 함유한다. 이러한 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU가 서열 5로서 열거된다.
아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타 9 디새츄라제 PTU를 식물 형질전환 이원성 벡터의 T-가닥 DNA 경계 영역 내의 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 PTU에 대해 시스 배향 (머리-대-꼬리 배향)으로 배향시켰다. 이원성 벡터는 추가적인 조절 요소 예컨대 오버드라이브 (문헌 [Toro et al., PNAS 85(22): 8558-8562; 1988]), 및 T-가닥 경계 서열 (T-DNA 경계 A 및 T-DNA 경계 B; 문헌 [Gardner et al., Science 231:725-727; 1986] 및 국제 공개 번호 WO 2001/025459)을 함유한다. 2개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 단리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
대조군 구축물인 pDAB1759 (도 7)를 다중-부위 게이트웨이 재조합 L-R 반응™ (인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)을 사용하여 구축하였다. pDAB1759는 아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타 9 디새츄라제 식물 전사 단위 (PTU), 및 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 이러한 아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타 9 디새츄라제 PTU는 파세올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris) 파세올린 프로모터 (Pv Phas 프로모터; 문헌 [Slightom et al., 1983 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 1897-1901]), 아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타 9 디새츄라제 (An 델타 9 디새츄라제)를 함유하고, 아그로박테리움 투메파시엔스 오픈 리딩 프레임 23 3' 비번역 영역 (AtuORF23 3'UTR)으로 종결된다. 이러한 아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타 9 디새츄라제 PTU가 서열 6으로서 열거된다. 선별성 마커 PTU는 카사바 잎맥 모자이크 바이러스 프로모터 (CsVMV 프로모터 v2), 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT) 및 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF1 3' 비번역 영역 (AtuORF1 3' UTR)을 함유한다. 이러한 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU가 서열 7로서 열거된다.
아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타 9 디새츄라제 PTU를 식물 형질전환 이원성 벡터의 T-가닥 DNA 경계 영역 내의 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 PTU에 대해 시스 배향 (머리-대-꼬리 배향)으로 배향시켰다. 이원성 벡터는 추가적인 조절 요소, 예컨대 오버드라이브 (문헌 [Toro et al., PNAS 85(22): 8558-8562; 1988]), 및 T-가닥 경계 서열 (T-DNA 경계 A 및 T-DNA 경계 B; 문헌 [Gardner et al., Science 231:725-727; 1986] 및 국제 공개 번호 WO 2001/025459)을 함유한다. 2개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 단리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
pDAB9381 구축물 (도 8)을 다중-부위 게이트웨이 재조합 L-R 반응 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)을 사용하여 구축하였다. pDAB9381는 황색 형광 단백질 (yfp) 식물 전사 단위 (PTU), 및 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 PTU를 함유한다. 구체적으로, 이러한 황색 형광 단백질 PTU는 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴 10 유전자 프로모터 (At Ubi10 프로모터; 문헌 [Callis et al., 1990 J Biol Chem 265:12486-12493]), 황색 형광 단백질 코딩 서열 (PhiYFP; 문헌 [Shagin et al., 2004 Molecular Biology and Evolution, 21(5), 841-850]) (솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum), 광 특이적 조직 유도성 LS-1 유전자 인트론 (ST-LS1 인트론; 진뱅크 Acc No. X04753)을 함유함)을 함유하고, 아그로박테리움 투메파시엔스 오픈 리딩 프레임 23 3' 비번역 영역 (AtuORF23 3'UTR)으로 종결된다. 이러한 황색 형광 단백질 PTU가 서열 8로서 열거된다. 선별성 마커 PTU는 카사바 잎맥 모자이크 바이러스 프로모터 (CsVMV 프로모터 v2; 문헌 [Verdaguer et al., Plant Molecular Biology 31:1129-1139; 1996]), 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT; 문헌 [Wohlleben et al., Gene 70:25-37; 1988]) 및 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF1 3' 비번역 영역 (AtuORF1 3' UTR; 문헌 [Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822; 1990])을 함유한다. 이러한 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 PTU가 서열 9로서 열거된다.
황색 형광 단백질 PTU를 식물 형질전환 이원성 벡터의 T-가닥 DNA 경계 영역 내의 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 PTU에 대해 시스 배향 (머리-대-꼬리 배향)으로 배향시켰다. 이원성 벡터는 추가적인 조절 요소 예컨대 오버드라이브 (문헌 [Toro et al., PNAS 85(22): 8558-8562; 1988]), 및 T-가닥 경계 서열 (T-DNA 경계 A 및 T-DNA 경계 B; 문헌 [Gardner et al., Science 231:725-727; 1986] 및 국제 공개 번호 WO 2001/025459)을 함유한다. 2개의 PTU를 함유하는 재조합 플라스미드를 단리하고, 제한 효소 소화 및 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
실시예 9
아라비돕시스 탈리아나의 아그로박테리움-매개 형질전환
아그로박테리움 형질전환: 아그로박테리움-매개 꽃 침지 형질전환 방법을 통해 트랜스제닉 아라비돕시스 탈리아나를 생성시켰다. 상기 기술된 구축물을 보유하는 해제된(disarmed) 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 Z707를 사용하여 형질전환을 개시시켰다.
아라비돕시스 형질전환: 문헌 [Clough and Bent (1998) Plant J. 16:735-743]을 기초로 하는 꽃 침지 방법을 사용하여 아라비돕시스를 형질전환시켰다. 선별된 아그로박테리움 콜로니를 사용하여 적합한 선별용 항생제를 함유하는 YEP 브로스(broth)의 1개 이상의 30 mL 예비배양물에 접종시켰다. 배양물(들)을 220 rpm에서 일정하게 교반하면서 28℃에서 철야로 인큐베이션하였다. 각각의 예비배양물을 사용하여 선별용 항생제를 함유하는 YEP 브로스의 2개의 500 ml 배양물에 접종하고, 배양물을 일정하게 교반하면서 28℃에서 철야로 인큐베이션하였다. 그 후, 약 8700 g에서 10분 동안 실온에서 세포를 원심분리하고, 생성된 상청액을 폐기하였다. 세포 펠릿을 1/2X 무라시게 & 스쿠그(Murashige & Skoog) 염/갬보르그(Gamborg) B5 비타민, 10％ (w/v) 수크로스, 0.044 μM 벤질아미노 퓨린 (10 ㎕/리터의 DMSO 내의 1 mg/ml 모액) 및 300 ㎕/리터 실?(Silwet) L-77™을 함유하는 500 mL 침윤 배지에 부드럽게 재현탁시켰다. 약 1개월령의 식물을 배지에 15초 동안 침지시켰다; 가장 새로운 꽃차례가 함침되도록 주의하였다. 그 후, 식물을 옆으로 누이고, 24시간 동안 커버를 덮어 놓고 (투명 또는 불투명 덮개), 물로 세정하고, 세워 놓았다. 16시간 명/8시간 암의 광주기로 22℃에서 식물을 성장시켰다. 침지 약 4주 후, 종자를 수확하였다.
아라비돕시스 탈리아나 성장 조건: 신선하게 수확된 종자를 건조제의 존재 하에 7일 동안 실온에서 건조시켰다. 건조 후, 종자를 0.1％ 아가로스 (시그마 케미컬 코포레이션(Sigma Chemical Co.), 미국 미주리주 세인트루이스 소재) 용액에 현탁시켰다. 휴지 요건을 완전하게 하고 동조 종자 발아 (층화)를 확실히 하도록, 현탁된 종자를 4℃에서 2일 동안 보관하였다. 선샤인 믹스(Sunshine Mix) LP5™ (선 그로 호티컬쳐 인크, 미국 워싱턴주 벨뷰 소재)를 미세 배양토로 덮고, 젖을 때까지 호아글란(Hoaglan) 용액을 하부에서 관개하였다. 이러한 토양 믹스를 24시간 동안 배수시켰다. 층화된 종자를 토양 내에 심고, 습도 돔(humidity dome) (코드 프로덕츠 (KORD Products), 캐나다 온타리오 브라말리아 소재)을 7일 동안 덮어 놓았다. 종자가 발아되었고, 식물을 일정한 온도 (22℃) 및 습도 (40-50％) 하에 120-150 μmol/m2sec의 빛 강도로 장일 조건 (16시간 명/8시간 암) 하에 콘비론(Conviron)™ (CMP4030 및 CMP3244 모델, 컨트롤드 인바이론먼츠 리미티드(Controlled Environments Limited), 캐나다 매니토바주 위니페그 소재)에서 성장시켰다. 토양이 습하지만 젖지는 않도록 초기에는 호아글란 용액을, 이어서 탈이온수를 식물에 급수하였다. 종자 수확이 가까운 식물 (수확 1-2주 전)을 건조되게 하였다.
T 1 형질전환 식물의 선별: T1 종자를 수확하고, 10.5" x 21" 발아 트레이 (T.O. 플라스틱스 인크(T.O. Plastics Inc.), 미네소타주 클리어워터) 내의 토양에 심었다. 심고 나서 5-6일 후에 돔을 제거하였다. 심고 나서 5일 후, 그리고 심고 나서 10일 후에 다시, 적용 당 280 g/ha 글리포시네이트의 유효율을 전달하도록 데빌비스(DeVilbiss)™ 압축 공기 분무 팁(tip)을 사용하여 10 ml/트레이 (703 L/ha)의 분무 부피로 글루포시네이트 제초제 (리버티(Liberty)®, 바이엘 크랍 사이언스(Bayer Crop Science))의 0.20％ 용액을 묘목에 분무하였다. 분무될 각각의 트레이에 대한 20 mL 섬광 바이알 내로 10 mL의 글루포시네이트 제초제 용액을 피펫팅하였다. 수평 및 수직 적용 패턴을 사용하여 분무를 전달하였다. 각각의 분무 후, 제초제 명칭, 적용율 및 적용일의 분무 표지를 각각의 선별 트레이에 부가하였다. 2차 분무 4 내지 7일 후, 제초제 저항성 식물을 확인하고, 선샤인 믹스 LP5™으로 제조된 단지 내로 이식하였다.
이식된 식물을 상기 언급된 성장 조건의 온실에 놓았다. 이식하고 나서 6 내지 8주 후, 각각의 식물로부터의 T2 종자를 수확하고, 독특한 확인 번호로 별도로 보관하였다. 이러한 종자를 하기 기술된 FAME 분석을 사용하여 분석하였다.
실시예 10
분자적 확인
pDAB1757, pDAB1759, pDAB3892 및 pDAB 9381로 형질전환된 아라비돕시스 식물의 게놈 내의 pat 트랜스진의 존재 및 카피수를 가수분해 프로브 검정법으로 이루어지는 분자적 분석을 사용하여 확인하였다.
먼저 T1 아라비돕시스 식물을 TAQMAN™과 유사한 가수분해 프로브 검정법을 통해 스크리닝하여 pat 트랜스진의 존재를 확인하였다. 이러한 연구로부터 생성된 데이터를 사용하여, 트랜스진 카피수를 결정하고, 자가 수정 및 T2 생성 및 추후의 FAME 분석으로의 진행을 위한 아라비돕시스 이벤트를 확인 및 선별하였다.
하기 기술된 가수분해 프로브 검정법을 사용하여 T1 및 아라비돕시스 식물에서 카피수를 결정하였다. 단일 카피수의 트랜스진이 있는 식물을 확인하고, 추후의 글리포세이트 내성 연구를 위해 진행시켰다. 96웰 플레이트에 조직 샘플을 수집하고, 2일 동안 동결건조시켰다. 클레코(KLECO)™ 조직 분쇄기 및 텅스텐 비드 (엔바이론 메탈 인크(Environ Metal Inc.), 미국 오리건주 스윗홈 소재)로 조직 침연을 수행하였다. 조직 침연 후, 제조사가 제안한 프로토콜에 따라 바이오스프린트 96 플랜트 키트(Biosprint 96 Plant kit)™ (퀴아젠, 미국 매릴랜드주 저먼타운 소재)를 사용하여 고처리량 양식으로 게놈 DNA를 단리하였다. 퀀트-잇 피코 그린 DNA 어세이 키트(Quant-It Pico Green DNA Assay Kit)™ (몰레큘러 프로브즈(Molecular Probes), 인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)에 의해 게놈 DNA를 정량하였다. 정량된 게놈 DNA를 BIOROBOT3000™ 자동 액체 취급기 (퀴아젠, 미국 매릴랜드주 저먼타운 소재)를 사용하여 가수분해 프로브 검정법용으로 약 2 ng/μL로 조정하였다. 가수분해 프로브 검정법에 의한 트랜스진 카피수 결정을 라이트사이클러(LIGHTCYCLER)®480 시스템 (로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science), 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재)을 사용하여 실시간 PCR에 의해 수행하였다. pat 및 내부 기준 유전자 TAFII15 (진뱅크 ID: NC 003075; 문헌 [Duarte et al., (201) BMC Evol. Biol., 10:61])에 대한 검정법을 디자인하였다.
증폭을 위해, 0.1 μM의 pat에 대한 각각의 프라이머, 0.4 μM의 TAFII15에 대한 각각의 프라이머 및 0.2 μM의 각각의 프로브 (표 2)를 함유하는 10 μL 부피의 다중 반응에서 1X 최종 농도로 라이트사이클러®480 프로브 마스터 믹스 (로슈 어플라이드 사이언스, 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재)를 제조하였다. 60℃에서 40초 동안의 연장 + 형광 획득으로 2-단계 증폭 반응을 수행하였다. 모든 샘플을 실행시켰고, 평균화된 사이클 역치 (Ct) 값을 각각의 샘플의 분석에 사용하였다. 상대적인 퀀트(quant) 모듈(module)을 사용하는 라이트사이클러 소프트웨어 릴리즈(release) 1.5를 사용하여 실시간 PCR 데이터의 분석을 수행하였고, 이는 ΔΔCt 방법을 기초로 한다. 이를 위해, 단일 카피 보정물(calibrator) 및 공지된 2개의 카피 체크(check)로부터의 게놈 DNA의 샘플이 각각의 실행에 포함되었다. 가수분해 프로브 스크린의 카피수 결과를 T1 트랜스제닉 아라비돕시스 식물에 대해 결정하였다.
Figure pct00002
실시예 11
지방산 프로필의 FAME (지방산 메틸 에스테르) 분석
아라비돕시스 식물을 실시예 1에서 기술된 아그로박테리움 벡터로 형질전환시키고, pat 유전자를 함유한 식물을 가수분해 프로브 검정법 분석으로 확인하고, 자가-수정시켰다. 선별된 제초제-저항성 T1 식물로부터 T2 종자를 대량으로 수확하고, 지방산 함량을 지방산 메틸 에스테르 (FAME) 분석을 사용하여 분석하였다.
대량 종자 샘플 (10 mg)을 강철 볼 및 볼 밀(mill)을 사용하여 대용물로서 트리헵타데카노인 (누-체크 프렙(Nu-Chek Prep), 미국 미네소타주 엘리시안 소재)을 함유하는 헵탄에서 균질화시켰다. 균질화 전에, MeOH 내의 신선하게 제조된 0.25 M MeONa (시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)의 용액을 샘플에 첨가하였다. 가벼운 가열 (40℃) 및 일정한 진탕 하에 반응을 수행하였다. 메틸화 대용물의 회수에 의해 반응 완료를 확인하였다. 대량화 종자 샘플로부터의 FAME의 추출을 3회 반복하였고, 모든 헵탄 층을 풀링한 후에 분석하였다. 4차 추출/유도체화에서 FAME의 존재에 대해 점검함으로써 추출 완료를 확인하였다. 생성된 FAME을 SGE 애널리티컬 사이언스(SGE Analytical Science) (미국 텍사스주 오스틴 소재)로부터의 15 m x 0.25 mm x 0.25 ㎛ BPX 70™ 모세관 칼럼을 사용하여 애질런트(Agilent) 6890 GC-FID™ (애질런트(Agilent), 미국 캘리포니아주 산타클라라 소재)에 의해 분석하였다. 각각의 FAME을 정제된 표준물질에 대해 상대적인 이의 체류 시간에 의해 확인하였고, 보정 표준물질로서의 매트레야 엘엘씨(Matreya LLC) (미국 펜실베이니아주 플레즌트 갭 소재)로부터의 평지씨유 FAME 기준 혼합물의 주입에 의해 정량하였다.
아라비돕시스에서, 포화 지방산 (SFA)은 이중 결합이 없는 모든 탄소 사슬 길이의 지방산 (예를 들어 C14:0, C16:0, C18:0, C20:0, C22:0, C24:0)의 합계로서 정의된다. 트랜스제닉 이벤트로부터의 T2 종자의 FAME 분석은 아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타 9 디새츄라제의 발현이 종자 내의 SFA 함량을 감소시키는데 유의한 효과가 있었음을 나타냈다. 각각의 이벤트 세트의 평균 포화 지방산 함량이 표 3에서 제시되고, 포화 지방산 표현형의 감소 백분율이 도 9에서 제시된다. 표 3 및 도 9에서, JMP 통계 소프트웨어 패키지(JMP Statistical Software Package)™ (SAS 인스티튜트 인크(SAS Institute Inc.), 미국 노스캐롤라이나주 캐리 소재)에서 수행된 튜키-크래머(Tukey-Kramer) HSD 테스트를 사용하여 수치 및 부수적인 유의차를 결정하였다.
아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타 9 디새츄라제의 발현을 구동하는 LfKCS3 프로모터에 융합된 4X SCBV 인핸서의 프로모터 조합 (pDAB3892, 도 9)이 KCS 프로모터에 의해서만 아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타 9 디새츄라제가 구동된 대조군 구축물 (pDAB1757, 도 9)과 비교하여 더 낮은 평균 총 포화 지방산 함량을 초래하였다. 이러한 결과는 아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타 9 디새츄라제가 더 높은 수준으로 발현되었고, 이는 LfKCS 프로모터를 구동시키는 4X SCBV 인핸서의 부가로부터 초래되었음을 가리킨다.
Figure pct00003
개시된 발명의 원리가 적용될 수 있는 다수의 가능한 실시양태의 관점에서, 설명된 실시양태들이 본 발명의 바람직한 예일 뿐이고 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 해석되지 않아야 함을 인지하여야 한다. 그보다는, 본 발명의 범주는 하기의 청구항에 의해 정의된다. 따라서, 본 출원인은 이러한 청구항의 범주 및 취지 내에 있는 모든 것을 본 출원인의 발명으로서 청구한다.
SEQUENCE LISTING <110> Agrigenetics, Inc. Owens Merlo, Patricia Ann Larsen, Cory Bevan , Scott A Davies, John P Reddy, Vaka S Ainley, William M Thompson, Mark A <120> SUGARCANE BACILLIFORM VIRAL (SCBV) ENHANCER AND ITS USE IN PLANT FUNCTIONAL GENOMICS <130> 7896-88837-03 <150> US 61/605,147 <151> 2012-02-29 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 839 <212> DNA <213> Sugarcane bacilliform virus <400> 1 aagcttattg aatggggaaa acaaattctt gatccattcc ccaaattcaa gaaggatatg 60 tttgaaagaa ctgaacatat catgatggca acacaagagc ctacgctact atgtggatgc 120 aggaagcctg caatcatgtt aacatcagga acaaggctta atcctcgtag aagattttac 180 aagtgtgcca tgaatatctg ccactgctgg tattgggcag atttacttga agaatacgtg 240 caagagagga tcgaagattt catggttgaa aacttcgaca agaaagcaaa gctggatgaa 300 ccaagttcat caaacgttca ccatgatgat tatgaagaac accgttcgag tgtcatcgac 360 aggccaaggc caacagatga tcatttcaga ccatgggggg atgttacata ctggctgaat 420 aaagaagcag aagagtgcca cacaaggggc gacaacgtcg aaggcgcaga agacgcagtc 480 gatctcactg acgtaagcaa tgacgaccag tggaggagat cgtaagcaat gacgtatgga 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<213> Streptomyces viridochromogenes <400> 9 ccagaaggta attatccaag atgtagcatc aagaatccaa tgtttacggg aaaaactatg 60 gaagtattat gtaagctcag caagaagcag atcaatatgc ggcacatatg caacctatgt 120 tcaaaaatga agaatgtaca gatacaagat cctatactgc cagaatacga agaagaatac 180 gtagaaattg aaaaagaaga accaggcgaa gaaaagaatc ttgaagacgt aagcactgac 240 gacaacaatg aaaagaagaa gataaggtcg gtgattgtga aagagacata gaggacacat 300 gtaaggtgga aaatgtaagg gcggaaagta accttatcac aaaggaatct tatcccccac 360 tacttatcct tttatatttt tccgtgtcat ttttgccctt gagttttcct atataaggaa 420 ccaagttcgg catttgtgaa aacaagaaaa aatttggtgt aagctatttt ctttgaagta 480 ctgaggatac aacttcagag aaatttgtaa gtttgtaggt accagatctg gatcccaaac 540 catgtctccg gagaggagac cagttgagat taggccagct acagcagctg atatggccgc 600 ggtttgtgat atcgttaacc attacattga gacgtctaca gtgaacttta ggacagagcc 660 acaaacacca caagagtgga ttgatgatct agagaggttg caagatagat acccttggtt 720 ggttgctgag gttgagggtg ttgtggctgg tattgcttac gctgggccct ggaaggctag 780 gaacgcttac gattggacag ttgagagtac tgtttacgtg 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gtttaaatat ttattgataa 1680 aataacaagt caggtattat agtccaagca aaaacataaa tttattgatg caagtttaaa 1740 ttcagaaata tttcaataac tgattatatc agctggtaca ttgccgtaga tgaaagactg 1800 agtgcgatat tatggtgtaa tacatagg 1828 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 10 acaagagtgg attgatgatc tagagaggt 29 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer <400> 11 ctttgatgcc tatgtgacac gtaaacagt 29 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer <400> 12 agggtgttgt ggctggtatt gcttacgct 29 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer <400> 13 agagaagttt cgacggattt cgggc 25 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer <400> 14 gaggattagg gtttcaacgg ag 22 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer <400> 15 gagaattgag ctgagacgag g 21

Claims (27)

  1. 서열 1의 위치 337 내지 위치 618에 제시된 사탕수수 바실루스형 바이러스 (SCBV) 인핸서 요소, 또는 이의 상동체(homolog)의 하나 이상의 카피(copy); 및
    여기에 작동가능하게 연결된, 식물 종자 특이적 유전자의 상류 영역으로부터 수득되고 RNA 폴리머라제 결합 부위 및 mRNA 개시 부위를 포함하는 프로모터
    를 포함하는 키메라 전사 조절 영역으로서, 관심 뉴클레오티드 서열이 이러한 키메라 전사 조절 영역의 조절 제어 하에 전사될 때, 프로모터를 포함하지만 SCBV 인핸서 서열(들)은 포함하지 않는 키메라 전사 조절 영역으로 수득된 전사 생성물의 양과 비교하여 전사 생성물의 양이 강화되는 키메라 전사 조절 영역.
  2. 레스퀘렐라 펜들레리(Lesquerella fendleri) 3-케토아실-CoA 종자 특이적 유전자의 상류 영역으로부터 수득되는 제1항의 프로모터.
  3. 지방산 변형 뉴클레오티드 서열인 제1항의 뉴클레오티드 서열.
  4. 제3항에 있어서, 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 아실-CoA 델타 9 디새츄라제(desaturase) 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 지방산 변형 뉴클레오티드 서열.
  5. 3' 전사 종결 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 작동적으로 연결된 제1항의 키메라 전사 조절 영역을 포함하는 구축물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자가 자신이 발현되는 식물에 작물 형질을 부여하는 구축물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자가 자신이 발현되는 식물에 부가가치 또는 오일 변형 형질을 부여하는 구축물.
  8. 제5항의 구축물로 안정적으로 형질전환된 트랜스제닉(transgenic) 식물.
  9. 제8항에 있어서, 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자가 자신이 발현되는 식물에 작물 형질을 부여하는 트랜스제닉 식물.
  10. 제8항에 있어서, 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자가 식물에 부가가치 또는 오일 변형 형질을 부여하는 트랜스제닉 식물.
  11. 제5항의 구축물을 포함하는, 제8항의 트랜스제닉 식물의 종자.
  12. 제8항에 있어서, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 식물인 트랜스제닉 식물.
  13. 제1항의 키메라 전사 조절 영역을 포함하는 트랜스제닉 식물 세포.
  14. 제5항의 구축물로 식물 세포 또는 조직을 형질전환시키는 것을 포함하는, 트랜스제닉 식물을 생산하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 트랜스제닉 식물이 쌍떡잎식물인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 트랜스제닉 식물이 외떡잎식물인 방법.
  17. 제5항의 구축물로 형질전환된 식물 세포 또는 조직.
  18. 제17항에 있어서, 쌍떡잎식물로부터 유래된 식물 세포 또는 조직.
  19. 제17항에 있어서, 외떡잎식물로부터 유래된 식물 세포 또는 조직.
  20. 제8항의 트랜스제닉 식물로부터 유래될 수 있는 식물 세포, 열매, 잎, 뿌리, 슈트(shoot), 꽃, 종자, 절단물(cutting) 및 유성 또는 무성 번식에서 유용한 기타 생식 물질, F1 하이브리드(hybrid)를 포함하는 자손 식물, 웅성-불임 식물, 및 모든 기타 식물 및 식물 생성물.
  21. 서열 1의 위치 337 내지 위치 618의 사탕수수 바실루스형 바이러스 (SCBV) 인핸서 요소 또는 이의 상동체의 카피 4개를 포함하고, 이러한 4개의 SCBV 인핸서 요소 카피가 아라비돕시스 탈리아나 식물 세포, 조직 또는 식물의 게놈 내로 삽입되어 있는 아라비돕시스 탈리아나 식물 세포, 조직 또는 식물.
  22. 제21항에 있어서, SCBV 인핸서의 부재 하의 관심 뉴클레오티드 서열의 전사와 비교하여, SCBV 인핸서 요소가 SCBV 인핸서의 조절 제어 하에 있는 관심 뉴클레오티드 서열의 전사 강화를 부여하는 아라비돕시스 탈리아나 식물 세포, 조직 또는 식물.
  23. 서열 2를 포함하는 DNA 구축물을 아라비돕시스 탈리아나 식물의 게놈 내로 형질전환시키는 단계; 및
    이러한 DNA 구축물을 식물 종자에서 발현시켜, 종자 내에서 지방산 프로파일 변형을 초래하는 단계
    를 포함하는, 관심 뉴클레오티드 서열의 전사를 강화하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 지방산 프로파일 변형이 포화 지방산 백분율 저하를 포함하는 방법.
  25. 제23항에 있어서, DNA 구축물이 4개의 SCBV 인핸서 요소 카피, 레스퀘렐라 펜들레리 3-케토아실-CoA 종자 특이적 유전자의 상류 영역으로부터 수득된 프로모터, 아스페르길루스 니둘란스 아실-CoA 델타 9 디새츄라제 뉴클레오티드 서열, 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 23 3' 비번역 영역을 포함하는 방법.
  26. 형질전환시키는 것이 아그로박테리움 투메파시엔스 매개 꽃 침지(floral dip)를 포함하는 제23항의 형질전환 방법.
  27. 발현시키는 것이 종자-특이적 발현을 포함하는 제23항의 발현 방법.
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