JP4377810B2 - アスペルギルス種の分子的同定方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2002年5月17日に出願された米国仮特許出願第60/381,463号の恩典を主張するものである。
本発明は、アスペルギルス(Aspergillus)の検出および種同定のための方法、および具体的には、アスペルギルス種もしくは種の菌株を同定または検出するための内部転写スペーサー1(internal transcribed spacer 1:ITS1)核酸配列の使用に関する。
衰弱した内科および外科の患者の管理および治療における進歩は、不運にも、病原性および日和見性真菌による生命を危うくする感染の数における増加を伴った(McNeilら、Clin. Infect. Dis. 33:641-647、2001)。エイズ(AIDS)、癌の化学療法および高用量の副腎皮質ステロイド治療は、すべて、免疫無防備状態の個人の数の増加の一因となっている。環境中に見出され、本来、低毒性であるとみなされていた、アスペルギルス種のような腐生性繊維状真菌での日和見感染を多くの免疫無防備状態の患者は発現する(Latge、Clin. Microbiol. Rev. 12:310-350、1999)。これらの感染は、免疫無防備状態の患者において、しばしば、劇症かつ致死的である。例えば、肺および脳のアスペルギルス症は、十分に処置された場合でさえも、それぞれ、86%および99%の死亡率をもつ(Denning、Clin. Infect. Dis. 23:608-614、1996)。
真菌の種同定への新規の方法が本明細書に開示されている。一つの態様において、方法は、真菌のリボソームDNAのITS1がこれらの種に渡ってあまり保存されていないという発見を利用している。本発明者らは、アスペルギルスの異なる種が、過去において種同定のために用いられていたrDNA ITS2よりも、rDNA ITS1核酸配列のより高度に非保存的な領域を有することを見出した。この驚くべき発見は、ITS1におけるこれらの配列の差異を利用することにより、アスペルギルスの異なる種を検出する、より特異的な方法の開発を可能にした。この方法で検出されうる特定のアスペルギルス種は、限定されるものではないが、A. クラバタス(A. clavatus)、A. グラヌロサス(A. granulosus)、A. シドウィ(A. sydowii)、A. フラビペス(A. flavipes)、A. レストリクタス(A. restrictus)、A. ベルシコロル(A. versicolor)、A. ウェンティ(A. wentii)、A. ケバリエリ(A. chevalieri)、およびA. ウスタス(A. ustus)、またはこれらの種の任意の組み合わせもしくはサブセット(A. グラヌロサス、A. クラバタスおよびA. シドウィのような)を含む。
(a)アスペルギルス・クラバタスを同定するための配列番号:1またはその縮重変異体;
(b)アスペルギルス・グラヌロサスを同定するための配列番号:2、配列番号:3またはそれらの縮重変異体;
(c)アスペルギルス・シドウィを同定するための配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、またはそれらの縮重変異体。
(a)A. フラビペスを同定するための配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12またはそれらの縮重変異体;
(b)A. レストリクタスを同定するための配列番号:13、配列番号:14またはそれらの縮重変異体;
(c)A. ベルシコロルを同定するための配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:18またはそれらの縮重変異体;
(d)A. ウェンティを同定するための配列番号:19またはそれらの縮重変異体;
(e)A. ケバリエリを同定するための配列番号:20、配列番号:21またはそれらの縮重変異体。
I. 用語の説明
他に断りがない限り、技術用語は、通常の用法に従って用いられる。分子生物学における一般用語の定義は、Oxford University Pressにより出版されたBenjamin Lewin、Genes VII、1999;Blackwell Science Ltd.により出版された、Kendrewら(編)、The Encyclopedia of Molecular Biology、1994;およびVCH Publishers, Inc.に出版された、Robert A. Meyers(編)、Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference、1995に見出されうる。
開示は、アスペルギルス種由来の単離されたITS1核酸分子を提供し、アスペルギルスの検出および種同定のために用いられうる。開示は、A. クラバタス、A. グラヌロサス、A. シドウィ、A. フラビペス、A. レストリクタス、A. ベルシコロル、A. ウェンティ、A. ケバリエリ、およびA. ウスタス由来の単離されたITS1核酸分子を含む。特異的な核酸分子は以下のものを含む:
A. クラバタス(菌株ATCC 9192):
A. グラヌロサス(菌株CBS 119.5A):
A. グラヌロサス(菌株NRRL 1932):
A. シドウィ(菌株NRRL 250):
A. シドウィ(菌株NRRL 4768):
A. シドウィ(菌株CUH1):
A. シドウィ(菌株CUH2):
A. シドウィ(菌株CUH7):
A. シドウィ(菌株CUH8):
A. フラビペス(菌株ATCC 11013):
A. フラビペス(菌株ATCC 16805):
A. フラビペス(菌株ATCC 24487):
A. レストリクタス(菌株NRRL 148):
A. レストリクタス(菌株NRRL 151):
A. ベルシコロル(菌株ATCC 10072):
A. ベルシコロル(菌株NRRL 238):
A. ベルシコロル(菌株NRRL 239):
A. ベルシコロル(菌株CUH3):
A. ウェンティ(菌株3650):
A. ケバリエリ(菌株ATCC 16443):
A. ケバリエリ(菌株ATCC 24546):
A. ウスタス(菌株ATCC 14417):
A. ウスタス(菌株ATCC 16801):
A. ウスタス(菌株NRRL 275):
A. ウスタス(菌株NRRL 5077):
A. ウスタス(菌株CUH4):
A. ウスタス(菌株CUH5):
試料内のアスペルギルスの存在は、本明細書に記載されるITS1配列を用いて検出されうる。アスペルギルスDNAは、これらのITS1配列を用いて、直接的に検出されうる、またはそのDNAが生じたアスペルギルス種の検出および同定の前に増幅されうる。一つの態様において、試料におけるアスペルギルスの種は、配列分析により決定される。本明細書に記載される方法は、実験室および臨床的設定においてのような、診断的および予後的適用を含む、アスペルギルスの検出が望ましいところにおいて任意の目的のために用いられうる。
本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドプライマーは、アスペルギルスの検出用のキットの形態で供給されうる。そのようなキットにおいて、1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーは、1つまたは複数の容器において供給される。オリゴヌクレオチドプライマーは、水溶液に懸濁されて、または凍結乾燥された粉末として、供給されうる。オリゴヌクレオチドが供給される容器は、供給形状(例えば、ミクロチューブ、アンプル、またはビン)を保つことができる任意の通常の容器でありうる。いくつかの適用において、プライマー対は、典型的には使い捨ての、チューブまたは同等の容器の個々において、あらかじめ測定された一回使用の量で供給されうる。そのような準備をして、アスペルギルス核酸の存在について検査される試料は、個々のチューブに添加され、増幅が直接的に行われ、続いて、配列分析が行われうる。
以下の実施例は、特定の態様の詳細な特徴を例証するために提供されるが、特許請求の範囲は、例証されたそれらの特徴に限定されるべきではない。
材料および方法
真菌DNAの単離
アスペルギルス単離物を、それらの純粋性を確立する、形態学的および他の伝統的特徴に基づいて種を同定する、かつDNA抽出のために真菌の増殖を生じるために、Czapek-Dox寒天(Difco Laboratories、デトロイト、MI)上で、25℃および37℃で、10〜14日間、増殖した。
1 mlの生物学的試料を、室温で30分間、振盪機上で1 mlの溶解溶液(1 N NaOH、0.2 M クエン酸ナトリウム、0.4 M N-アセチルシステイン)と共にインキュベートした。その後、試料を微量遠心管において12,000 rpmで10分間、遠心分離した。上清を除去し、2 mlの溶解溶液を添加し、ペレットを、30秒間ボルテックスすることにより再懸濁した。試料を再び、微量遠心管において12,000 rpmで10分間、遠心分離した。上清を除去し、ペレットを、2 mlの20 mM トリス-HCl(pH 8.3)において再懸濁し、続いて、微量遠心管において12,000 rpmで10分間、遠心分離した。上清を除去し、300 μlのソルビトール緩衝液(1 M ソルビトール、100 mM EDTA)、10 μlのβ-メルカプトエタノール、および200ユニットのザイモリエイス(zymolyase)を添加し、ペレットを、数回、短時間、ボルテックスすることにより再懸濁した。混合物を振盪機上で、35℃で1.5時間、インキュベートし、続いて、微量遠心管において6,000 rpmで15分間、遠心分離した。上清を除去し、ペレットを2 mlのソルビトール緩衝液に再懸濁した。試料を再び、微量遠心管において6,000 rpmで15分間、遠心分離した。上清を除去し、ペレットを180 μlのATL溶解緩衝液(Qiagen, Inc.)に再懸濁した。20 μlのプロテイナーゼK溶液(Qiagen, Inc.)の添加後、試料を振盪機上で、55℃で1.5時間、インキュベートした。その後、試料を微量遠心管において8,000 rpmで20分間、遠心分離した。上清を除去し、ペレットを、200 μlの20 mM トリス-HCl(pH 8.3)に再懸濁し、続いて、水浴で40分間、煮沸した。その後、DNAを、製造会社の使用説明書に従い、QIAamp DNAカラム(Qiagen, Inc.)を用いて精製した。
すべてのプライマーおよびプローブは、394または迅速自動化DNA合成機(PE Applied Biosystems、フォスターシティー、CA)を用いるβ-シアノエチルホスホラミダイト化学により合成された。
PCR反応混合物は、50 mM KClを含む10 mM トリス-HCl緩衝液、pH 8.0(Roche)、1.5 mM MgCl2(Roche)、0.2 mM dNTP(Roche)および1.25 U Taqポリメラーゼ(Roche)からなった。プライマーITS5およびITS2、またはITS5およびITS4を各20 pMの最終濃度まで添加した。鋳型DNAを、50 μl 反応混合物あたり1 ngの最終濃度において添加した。各実験について、少なくとも1つの反応チューブは、陰性対照として、鋳型DNAの代わりに水を入れた。増幅をGeneAmp PCR System 9700(PE Applied Biosystems)において行った。鋳型DNAの最初の変性は、95℃で5分間、加熱することにより達成された。これに続いて、95℃で30秒間、58℃で30秒間、および72℃で1分間の30サイクルで行った。最終伸長段階は、72℃で5分間行った。適切な対照を含み、PCR汚染予防措置は、Fujitaら、J. Clin. Microbiol. 33:962-967、1995に従った。
プライマー対ITS5およびITS2、ITS5およびITS4、ITS1およびITS2、またはITS1およびITS4のいずれかで生じたPCR産物を、製造会社の使用説明書に従い、QIAquick PCR精製キット(Qiagen, Inc.)を用いて精製した。精製された産物を、PCR増幅のために最初に用いたのと同じプライマー、およびBigDye Termination Cycle Sequencing Ready Reactionキット(PE Applied Biosystems)を製造会社により推奨されているように用いて、両方の鎖について配列決定した。GeneAmp PCR System 9700におけるサイクル配列決定は、96℃で5分間の最初の変性、続いて、96℃で10秒間、50℃で5秒間、および60℃で4分間の30サイクルからなる。配列決定産物をDye-Ex Spinキット(Qiagen, Inc.)を用いて精製し、減圧遠心機において乾燥させ、ホルムアミドに再懸濁した。配列決定産物を、製造会社の使用説明書に従って、自動化キャピラリーDNAシーケンサー(ABI Prism 310 Genetic Analyzer、PE Applied Biosystems)において分析した。GenBank検索および比較配列解析は、BLAST検索ツール、Genetics Computer Groupソフトウェアパッケージ(University of Wisconsin、マディソン)、およびClustal Wアラインメントプログラム(Thompsonら、Nucleic Acids Research 22:4673-4680、1994)により援助された。
アスペルギルスITS1共通配列の比較解析
142ヌクレオチド長(A. ケバリエリ)から187ヌクレオチド長(A. クラバタス)までの範囲の合計46個のITS1共通配列を編集した(表1)。全体的にみて、長さおよび配列において有意な種間の可変性をもつ5つの領域が認識された(図2)。これらの高可変性領域は、以下のように限定された:ITS1-V1、8位〜30位(12〜21ヌクレオチド長);ITS1-V2、50位〜67位(13〜14ヌクレオチド長);ITS1-V3、81位〜141位(12〜54ヌクレオチド長);ITS1-V4、151位〜181位(23〜28ヌクレオチド長);およびITS1-V5、192位〜215位(17〜21ヌクレオチド長)。A. ニガーのITS1-V3配列(54ヌクレオチド)と比較して、著しくより短い対応する配列が、A. ケバリエリ(12ヌクレオチド)、A. グラヌロサス(21ヌクレオチド)、A. ウスタス(21〜30ヌクレオチド)、A. シドウィ(22ヌクレオチド)、A. ベルシコロル(22ヌクレオチド)、およびA. ニドゥランス(21〜22ヌクレオチド)について見出された。通常、種間の多様性は、非常に多様なA. ウスタス配列を除いて、≦5ヌクレオチドであり、主として、ITS1-V3領域に存在した。それらは、ITS1-V1、-V3、-V4および-V5内の合計33地点において互いに異なり、それらにより、185位、202位〜204位および215位において特徴的なヌクレオチドをもつA. ウスタスITS1配列の2つの主要な型を明らかにした。
a ATCC、American Type Culture Collection、マナッサス、バージニア;CBS、Centraalbureau voor Schimmelcultures、ユトレヒト、オランダ;CDC、Centers for Disease Control and Prevention、アトランタ、ジョージア;NRRL、Agricultural Research Service (ARS) Culture Collection、ピオリア、イリノイス。
b 配列分析により決定されたヌクレオチドの数。
c J. H. Shin博士、Department of Clinical Pathology, Chonnam University Medical School、光州、韓国の好意により提供された臨床的単離物。
d A. フラバスとしてATCCに寄託されている。
a 図2への説明文において列挙されている菌株。
b 類似性は、GAPアルゴリズム(GCG)を用いて、図2に示されているような完全ITS1配列について決定された。
ポリメラーゼ連鎖反応-酵素免疫測定法(EIA)
PCR産物の酵素免疫測定法(EIA)の同定は、Elieら、J. Clin. Microbiol. 36:3260-3265、1998およびFujitaら、J. Clin. Microbiol. 33:962-967、1995に記載されているように、軽微な改変をもって行われる。
DNA配列に基づいたアスペルギルス種の同定
この実施例は、どのようにしてDNAに基づいた配列同定がアスペルギルスの異なる種を同定するために用いられうるかを例証する。生物学的試料を感染した対象から得て、真菌をアスペルギルスの増殖に適した条件下で培養し、続いて、実施例1において真菌DNAの単離に記載されているように真菌DNAの単離を行う。または、真菌DNAは、実施例1において生物学的試料からのアスペルギルスDNAの抽出に記載されているように、生物学的試料から直接的に抽出することができる。混合物に存在する真菌DNAを増幅するために、ユニバーサルプライマー対ITS5およびITS2、ITS5およびITS4、ITS1およびITS2、またはITS1およびITS4を反応混合物へ添加し、続いて、実施例1に記載されているように配列分析を行う。
ITSまたはD1/D2領域による所定の種間の塩基対の差異
この実施例における情報は、本発明者らが、ITS2領域と比較してITS1領域におけるアスペルギルス種間に実質的多様性があることを見出したことを例証する。このより高い多様性は、DNA配列情報がより優れた種の同定を提供することを可能にする。例えば、ITS1領域においてA. ウスタスとA. ニドゥランスの間に約48個の塩基対の差異があるが、ITS2領域においてはこれらの種間にたった6個の塩基対の差異しかない。
配列番号:1は、A. クラバタス(菌株ATCC 9192)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:2は、A. グラヌロサス(菌株CBS 119.5A)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:3は、A. グラヌロサス(菌株NRRL 1932)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:4は、A. シドウィ(菌株NRRL 250)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:5は、A. シドウィ(菌株NRRL 4768)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:6は、A. シドウィ(菌株CUH1)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:7は、A. シドウィ(菌株CUH2)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:8は、A. シドウィ(菌株CUH7)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:9は、A. シドウィ(菌株CUH8)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:10は、A. フラビペス(菌株ATCC 11013)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:11は、A. フラビペス(菌株ATCC 16805)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:12は、A. フラビペス(菌株ATCC 24487)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:13は、A. レストリクタス(菌株NRRL 148)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:14は、A. レストリクタス(菌株NRRL 151)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:15は、A. ベルシコロル(菌株ATCC 10072)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:16は、A. ベルシコロル(菌株NRRL 238)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:17は、A. ベルシコロル(菌株NRRL 239)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:18は、A. ベルシコロル(菌株CUH3)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:19は、A. ウェンティ(菌株3650)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:20は、A. ケバリエリ(菌株ATCC 16443)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:21は、A. ケバリエリ(菌株ATCC 24546)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:22は、A. ウスタス(菌株ATCC 14417)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:23は、A. ウスタス(菌株ATCC 16801)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:24は、A. ウスタス(菌株NRRL 275)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:25は、A. ウスタス(菌株NRRL 5077)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:26は、A. ウスタス(菌株CUH4)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:27は、A. ウスタス(菌株CUH5)のITS1領域の核酸配列を示す。
配列番号:28は、真菌ユニバーサルフォワードプライマーITS5の核酸配列を示す。
配列番号:29は、真菌ユニバーサルリバースプライマーITS2の核酸配列を示す。
配列番号:30は、真菌ユニバーサルリバースプライマーITS4の核酸配列を示す。
配列番号:31は、真菌ユニバーサルフォワードプライマーITS1の核酸配列を示す。
配列番号:32は、真菌ユニバーサルフォワードプライマーITS3の核酸配列を示す。
配列番号:33は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:34は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:35は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:36は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:37は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:38は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:39は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:40は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:41は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:42は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:43は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:44は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:45は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:46は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:47は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:48は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:49は、例示的なA. グラヌロサスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:50は、例示的なA. ニドゥランスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:51は、例示的なA. ニドゥランスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:52は、例示的なA. ニドゥランスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:53は、例示的なA. ニドゥランスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:54は、例示的なA. ニドゥランスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:55は、例示的なA. ニドゥランスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:56は、例示的なA. ニドゥランスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:57は、例示的なA. ニドゥランスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:58は、例示的なA. ニドゥランスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:59は、例示的なA. ニドゥランスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:60は、例示的なA. ニドゥランスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:61は、例示的なA. ウスタスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:62は、例示的なA. ウスタスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:63は、例示的なA. ウスタスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:64は、例示的なA. ウスタスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:65は、例示的なA. ウスタスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:66は、例示的なA. ウスタスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
配列番号:67は、例示的なA. ウスタスITS1プライマー/プローブの核酸配列を示す。
Claims (36)
- アスペルギルスのITS1-V1、ITS1-V2、ITS1-V3、ITS1-V4およびITS1-V5核酸配列の2つまたはそれ以上における差異を検出する工程を含む、互いからアスペルギルスの種を識別する方法であって、
ITS1-V1は配列番号:68〜92から成る群より選択され、
ITS1-V2は配列番号:93〜117から成る群より選択され、
ITS1-V3は配列番号:118〜142から成る群より選択され、
ITS1-V4は配列番号:143〜167から成る群より選択され、および
ITS1-V5は配列番号:168〜192から成る群より選択される、方法。 - 差異の検出工程が、ITS1-V1、ITS1-V2、ITS1-V3、ITS1-V4およびITS1-V5核酸配列の3つまたはそれ以上における差異を検出する工程を含む、請求項1記載の方法。
- 差異の検出工程が、ITS1-V1、ITS1-V2、ITS1-V3、ITS1-V4およびITS1-V5核酸配列のすべてにおける差異を検出する工程を含む、請求項2記載の方法。
- 差異の検出工程が、2つまたはそれ以上の核酸配列を配列決定する工程を含む、請求項1記載の方法。
- 配列決定工程が、核酸配列を配列決定する前に配列を増幅する工程を含む、請求項4記載の方法。
- アスペルギルス・グラヌロサス、ウスタス、シドウィ、ベルシコロルおよびニドゥランスを識別する工程を含む、請求項1記載の方法。
- アスペルギルス・クラバタス、フラビペス、レストリクタス、およびケバリエリを識別する工程をさらに含む、請求項6記載の方法。
- 種の識別工程が、以下(a)〜(c)のITS1-V1、ITS1-V2、ITS1-V3、ITS1-V4およびITS1-V5配列を同定する工程を含む、請求項1記載の方法:
(a)アスペルギルス・クラバタスを同定するための配列番号:1またはその縮重変異体;
(b)アスペルギルス・グラヌロサスを同定するための配列番号:2、配列番号:3またはそれらの縮重変異体;
(c)アスペルギルス・シドウィを同定するための配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9またはそれらの縮重変異体。 - アスペルギルスの種の識別工程が、アスペルギルス種内部転写スペーサー1領域を増幅する工程、および増幅された領域の配列を決定する工程を含む、請求項1記載の方法。
- アスペルギルスの種の識別工程が、種の菌株を識別する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 種の菌株の識別工程が、アスペルギルス・グラヌロサス CBS 119.5AおよびNRRL 250、アスペルギルス・シドウィ NRRL、CUH1、CUH2、CUH7、およびCUH8を識別する工程を含む、請求項10記載の方法。
- 種の識別工程が、以下(a)〜(e)のITS1-V1、ITS1-V2、ITS1-V3、ITS1-V4およびITS1-V5ヌクレオチド配列を同定する工程を含む、請求項1記載の方法:
(a)A. フラビペスを同定するための配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12またはそれらの縮重変異体;
(b)A. レストリクタスを同定するための配列番号:13、配列番号:14またはそれらの縮重変異体;
(c)A. ベルシコロルを同定するための配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:18またはそれらの縮重変異体;
(d)A. ウェンティを同定するための配列番号:19またはその縮重変異体;
(e)A. ケバリエリを同定するための配列番号:20、配列番号:21またはそれらの縮重変異体。 - (a)が配列番号:1と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、(b)が配列番号:2または配列番号:3と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、および(c)が配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9と少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項8記載の方法。
- (a)が配列番号:1を含む、請求項8記載の方法。
- (b)が配列番号:2または配列番号:3を含む、請求項8記載の方法。
- (c)が配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、または配列番号:9を含む、請求項8記載の方法。
- (a)が配列番号:10、11または12を含む、請求項12記載の方法。
- (b)が配列番号:13または14を含む、請求項12記載の方法。
- (c)が配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17または配列番号:18を含む、請求項12記載の方法。
- (d)が配列番号:19を含む、請求項12記載の方法。
- (e)が配列番号:20または配列番号:21を含む、請求項12記載の方法。
- 増幅工程が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅する工程を含む、請求項5記載の方法。
- 差異の検出工程が、核酸プローブで核酸配列における差異を検出する工程を含む、請求項1記載の方法。
- 以下の工程を含む、生物学的試料においてアスペルギルス種の存在を検出する方法:
以下の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)または(h)の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマーの組を用いて、(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)および(h)のいずれか1つにおけるITS1-V1、ITS1-V2、ITS1-V3、ITS1-V4およびITS1-V5配列の2つまたはそれ以上の存在を決定するためにアスペルギルス種核酸を増幅する工程であって、ITS1-V1は配列番号:68〜92から成る群より選択され、ITS1-V2は配列番号:93〜117から成る群より選択され、ITS1-V3は配列番号:118〜142から成る群より選択され、ITS1-V4は配列番号:143〜167から成る群より選択され、およびITS1-V5は配列番号:168〜192から成る群より選択される工程:
(a)配列番号:1;
(b)配列番号:2または3;
(c)配列番号:4、5、6、7、8または9;
(d)配列番号:10、11または12;
(e)配列番号:13または14;
(f)配列番号:15、16、17または18;
(g)配列番号:19;
(h)配列番号:20または21;ならびに、
(a)の核酸配列がアスペルギルス・クラバタスを同定し、(b)がアスペルギルス・グラヌロサスを同定し、(c)がアスペルギルス・シドウィを同定し、(d)がアスペルギルス・フラビペスを同定し、(e)がアスペルギルス・レストリクタスを同定し、(f)がアスペルギルス・ベルシコロルを同定し、(g)がアスペルギルス・ウェンティを同定し、および(h)がアスペルギルス・ケバリエリを同定する、ITS1-V1、ITS1-V2、ITS1-V3、ITS1-V4およびITS1-V5配列の2つまたはそれ以上の存在を決定するためにアスペルギルス種核酸を配列決定する工程。 - 各オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号:1の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、アスペルギルス・クラバタスを同定する、請求項24記載の方法。
- 各オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号:2または3の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、アスペルギルス・グラヌロサスを同定する、請求項24記載の方法。
- 各オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号:4、5、6、7、8または9の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、アスペルギルス・シドウィを同定する、請求項24記載の方法。
- 各オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号:10、11または12の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、アスペルギルス・フラビペスを同定する、請求項24記載の方法。
- 各オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号:13または14の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、アスペルギルス・レストリクタスを同定する、請求項24記載の方法。
- 各オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号:15、16、17または18の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、アスペルギルス・ベルシコロルを同定する、請求項24記載の方法。
- 各オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号:19の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、アスペルギルス・ウェンティを同定する、請求項24記載の方法。
- 各オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号:20および21の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、アスペルギルス・ケバリエリを同定する、請求項24記載の方法。
- アスペルギルス種の存在を検出する工程が、種の菌株の存在を検出する工程をさらに含む方法であって、ITS1-V1、ITS1-V2、ITS1-V3、ITS1-V4およびITS1-V5配列の2つまたはそれ以上の存在が以下に該当する、請求項24記載の方法。
(a)配列番号:2が菌株アスペルギルス・グラヌロサスCBS 119.5Aを同定し、および配列番号:3がアスペルギルス・グラヌロサス菌株NRRL 1932を同定する;ならびに
(b)配列番号:4がアスペルギルス・シドウィ菌株NRRL 250を同定し、配列番号:5がアスペルギルス・シドウィ菌株NRRL 4768を同定し、配列番号:6がアスペルギルス・シドウィ菌株CUH1を同定し、配列番号:7がアスペルギルス・シドウィ菌株CUH2を同定し、配列番号:8がアスペルギルス・シドウィ菌株CUH7を同定し、および配列番号:9がアスペルギルス・シドウィ菌株CUH8を同定する。 - (a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)または(h)の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む少なくとも5組のプライマーを用いてアスペルギルス種核酸を増幅する工程を含む、請求項24記載の方法。
- (a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)および(h)の各々すべての少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含むプライマーの組を用いて、(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)および(h)のすべてにおけるITS1-V1、ITS1-V2、ITS1-V3、ITS1-V4およびITS1-V5配列の2つまたはそれ以上の存在を決定するためにアスペルギルス種核酸を増幅する工程を含む、請求項24記載の方法。
- 各オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号:33〜67の配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、請求項24記載の方法。
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