CN116848268A - 用于检测与细菌性和念珠菌阴道病相关的细菌和真菌的组合物和方法 - Google Patents
用于检测与细菌性和念珠菌阴道病相关的细菌和真菌的组合物和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本公开描述了用于快速检测生物学或非生物学样品中多种细菌性阴道病相关(BV相关)细菌和/或外阴阴道念珠菌病(VVC)相关念珠菌的存在或不存在的方法。所述方法可以包括进行扩增步骤、杂交步骤和检测步骤。此外，提供了经设计用于检测BV相关细菌和VVC相关念珠菌的靶向特异性基因的引物和探针以及试剂盒。
Description
技术领域
本公开涉及分子诊断领域，并且更具体地涉及检测细菌性和念珠菌阴道病相关各种细菌性和真菌性菌株。
背景技术
在美国，阴道炎占所有妇科就诊的50％，并且是医疗保健费用的主要贡献者。归因于细菌性阴道病(BV)、外阴阴道念珠菌病(VVC)和滴虫病的感染性阴道炎占这些病例的高达90％。与滴虫病不同，BV和VVC都可归因于若干病原体。对于VVC，白色念珠菌的过度生长占主导地位，尽管其他念珠菌属物种(包括光滑念珠菌)也可能是原因之一。BV更难诊断，因为发病机制涉及乳酸杆菌属细菌的降低的水平，伴随BV相关细菌(诸如阴道加德纳氏菌、动弯杆菌属物种和阴道阿托波氏菌)的增加的浓度。
各种诊断方法可用于确定阴道炎的根本原因。在临床医生的办公室，常规使用pH、氢氧化钾(KOH)测试和新鲜阴道分泌物样本的显微镜检查的组合，尽管它们的性能相对较差。对于BV，诊断通常依赖于使用临床Amsel标准或革兰氏染色以及Nugent评分(被认为是诊断BV的金标准实验室方法)。用KOH制剂和/或针对念珠菌的阴道培养物检查湿片是针对VVC最常见的诊断工具。推荐使用高度敏感和特异性的核酸扩增试验(NAAT)来检测阴道毛滴虫，但临床实践中仍普遍使用湿片制剂进行检查。然而，一些障碍与使用非分子方法相关，包括临床中设备的缺乏、所用临床终点的主观性和从业者之间的不一致雇佣、显微镜检查中适当培训的缺乏以及测试的总体敏感性差。由于针对BV、VVC和毛滴虫病报告的常见症状、混合感染或合并感染的发生以及阴道症状的复发，阴道炎的根本原因的诊断进一步复杂化。
因此，需要开发更有效和更快速的用于检测外阴阴道念珠菌病和细菌性阴道病的方法，例如允许在单一测定中检测两种阴道病症的方法，以便有效地向患者提供适当的治疗。
发明内容
在一个方面，公开了一种检测生物学样品中的多种BV相关细菌的方法，其中多种BV相关细菌包括乳酸杆菌属物种、阴道加德纳氏菌和选自以下各项的至少一种：阴道阿托波氏菌、1型巨球型菌、伊格尔兹氏菌属物种、普雷沃氏菌属物种和与细菌性阴道病相关的细菌BVAB-2。在本文中，该方法包括进行扩增步骤，该扩增步骤包括使样品与一组引物接触以产生扩增产物，如果来自BV相关细菌的核酸存在于样品中的话；进行杂交步骤，该杂交步骤包括使每种扩增产物与一种或多种可检测探针接触；以及检测每种扩增产物的存在情况，其中扩增产物的存在指示样品中的BV相关细菌的存在；其中从乳酸杆菌属物种产生扩增产物的该组引物包含正向引物，该正向引物包含SEQ ID NO：38、41或44的寡核苷酸序列或由其组成；和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO：39、42或45、47或73的寡核苷酸序列或由其组成；并且该一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：40、43、46和74的寡核苷酸序列或由其组成；其中从阴道加德纳氏菌产生扩增产物的该组引物包含正向引物，该正向引物包含SEQ ID NO：1、4、5、8或11的寡核苷酸序列或由其组成；和反向引物，该反向引物包含SEQ ID NO：2、6、9或12的寡核苷酸序列或由其组成；并且该一种或多种可检测寡核苷酸探针包含SEQ ID NO：3、7、10和13的寡核苷酸序列或由其组成；其中从阴道阿托波氏菌产生扩增产物的该组引物包含正向引物，该正向引物包含SEQ ID NO：14、17、20、67或70的寡核苷酸序列或由其组成；和反向引物，该反向引物包含SEQ ID NO：15、18、21、68或71的寡核苷酸序列或由其组成；并且该一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：16、19、22、66、69和72的寡核苷酸序列或由其组成；其中从1型巨球型菌产生扩增产物的该组引物包含正向引物，该正向引物包含SEQ ID NO：23、26或27的寡核苷酸序列或由其组成；和反向引物，该反向引物包含SEQ ID NO：24或28的寡核苷酸序列或由其组成；并且该一种或多种可检测探针包含SEQIDNO：25和29的寡核苷酸序列或由其组成；其中从伊格尔兹氏菌属物种产生扩增产物的该组引物包含正向引物，该正向引物包含SEQ ID NO：84或87的寡核苷酸序列或由其组成；和反向引物，该反向引物包含SEQ ID NO：85或88的寡核苷酸序列或由其组成；并且该一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：86和89的寡核苷酸序列或由其组成；其中从普雷沃氏菌属物种产生扩增产物的该组引物包含正向引物，该正向引物包含SEQ ID NO：90、95、96或97的寡核苷酸序列或由其组成；和反向引物，该反向引物包含SEQ ID NO：91、92、93、98、99或100的寡核苷酸序列或由其组成；并且该一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：94、101和102的寡核苷酸序列或由其组成；其中从BVAB-2产生扩增产物的该组引物包含正向引物，该正向引物包含SEQ ID NO：30或33的寡核苷酸序列或由其组成；和反向引物，该反向引物包含SEQ ID NO：31、34或36的寡核苷酸序列或由其组成；并且该一种或多种可检测探针包含SEQID NO：32、35和37的寡核苷酸序列或由其组成。
在一些实施例中，多种BV相关细菌为乳酸杆菌属物种、阴道加德纳氏菌和阴道阿托波氏菌；其中从乳酸杆菌属物种产生扩增产物的该组引物包含正向引物，该正向引物包含SEQ ID NO：38、41或44的寡核苷酸序列或由其组成；以及反向引物，该反向引物包含SEQID NO：39、42或45、47或73的寡核苷酸序列或由其组成；并且该一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：40、43、46和74的寡核苷酸序列或由其组成；其中从阴道加德纳氏菌产生扩增产物的该组引物包含正向引物，该正向引物包含SEQ ID NO：1、4、5、8或11的寡核苷酸序列或由其组成；和反向引物，该反向引物包含SEQ ID NO：2、6、9或12的寡核苷酸序列或由其组成；并且该一种或多种可检测寡核苷酸探针包含SEQ ID NO：3、7、10和13的寡核苷酸序列或由其组成；其中从阴道阿托波氏菌产生扩增产物的该组引物包含正向引物，该正向引物包含SEQ ID NO：14、17、20、67或70的寡核苷酸序列或由其组成；和反向引物，该反向引物包含SEQ ID NO：15、18、21、68或71的寡核苷酸序列或由其组成；并且该一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：16、19、22、66、69和72的寡核苷酸序列或由其组成。在一些实施例中，从乳酸杆菌属物种产生扩增产物的该组引物包含正向引物，该正向引物包含SEQ ID NO：44的寡核苷酸序列或由其组成；和反向引物，该反向引物包含SEQ ID NO：45的寡核苷酸序列或由其组成；并且该一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：46的寡核苷酸序列或由其组成；从阴道加德纳氏菌产生扩增产物的该组引物包含正向引物，该正向引物包含SEQ ID NO：11的寡核苷酸序列或由其组成；和反向引物，该反向引物包含SEQ ID NO：12的寡核苷酸序列或由其组成；并且该一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：13的寡核苷酸序列或由其组成；从阴道阿托波氏菌产生扩增产物的该组引物包含正向引物，该正向引物包含SEQ ID NO：20的寡核苷酸序列或由其组成；和反向引物，该反向引物包含SEQ ID NO：21的寡核苷酸序列或由其组成；并且该一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：72的寡核苷酸序列或由其组成。在其他实施例中，本方法的杂交步骤包括使扩增产物与可检测探针接触，该可检测探针用供体荧光部分和对应的受体部分进行标记；并且检测步骤包括检测该探针的供体荧光部分和受体部分之间的荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在，其中荧光的存在或不存在指示样品中的BV相关细菌的存在或不存在。在又一实施例中，本方法的扩增步骤采用具有5′至3′核酸酶活性的聚合酶。在一些实施例中，“接触”步骤进一步包括使所述生物学样品和所述引物与DNA聚合酶、多个游离核苷酸(包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤)和/或缓冲剂接触以产生反应混合物。从生物学样品提取的核酸可包含双链DNA或由其组成。反应混合物可以任选地进一步包含二价阳离子、单价阳离子钾离子、一种或多种可检测地标记的探针和/或其任何组合。在一些实施例中，“产生扩增子”步骤包括(a)将反应混合物加热至第一预定温度持续第一预定时间段以分离存在于生物学样品或核酸中的双链DNA的链，(b)在允许引物与其互补序列杂交并且允许DNA聚合酶延伸引物的条件下将反应混合物冷却至第二预定温度持续第二预定时间，以及(c)重复步骤(a)和(b)至少10到12次。在一些实施例中，重复步骤(a)和(b)至少15、20、22或25次。在一些实施例中，样品为生物学样品。在一些实施例中，生物学样品是从尿道、阴茎、肛门、喉咙、子宫颈或阴道收集的。在一些实施例中，生物学样品是从临床标本提取的DNA、RNA或总核酸。在一些实施例中，杂交步骤包括使扩增产物与可检测基因探针接触，该可检测基因探针用供体荧光部分和对应的受体部分标记；并且检测步骤包括检测探针的供体荧光部分与受体部分之间荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在，其中荧光的存在或不存在指示样品中的BV相关细菌的存在或不存在。在一些实施例中，重复扩增和杂交步骤。在本文中，重复次数取决于例如样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物，则将需要更多的扩增和杂交步骤来扩增足以进行检测的靶序列。在一些实施例中，重复扩增和杂交步骤至少约20次，但可重复多达至少25、30、40、50、60次或甚至100次。此外，可在每个扩增和杂交步骤期间或之后、在每隔一个扩增和杂交步骤期间或之后、在特定扩增和杂交步骤期间或之后或者在特定扩增和杂交步骤期间或之后检测扩增产物的存在或不存在，其中如果存在，预期有足够的扩增产物用于检测。在一些实施例中，扩增步骤使用具有5′至3′核酸酶活性的聚合酶。在一些实施例中，供体荧光部分和对应的受体部分在探针上彼此相距不超过8-20个核苷酸。在一些实施例中，受体部分为猝灭剂。在一些实施例中，寡核苷酸包含选自以下各项的的核苷酸序列：SEQ ID NO：1-47、66-74和84-102或其互补序列或由其组成，具有100个或更少的核苷酸、50个或更少的核苷酸、40个或更少的核苷酸或30个或更少的核苷酸。
本公开还提供了一种用于检测样品中的细菌性阴道病相关(BV相关)细菌的试剂盒，该试剂盒包含：正向引物，该正向引物包含选自由SEQ ID NO：1、4、5、8、11、14、17、20、23、26、27、30、33、38、41、44、67、70、84、87、90、95、96和97组成的组的第一寡核苷酸序列或由其组成；反向引物，该反向引物包含选自由SEQ ID NO：2、6、9、12、15、18、21、24、28、31、34、36、39、42、45、47、68、71、73、85、88、91、92、93、98、99和100组成的组的第二寡核苷酸序列或由其组成；以及探针，该探针包含选自由SEQ ID NO：3、7、10、13、16、66、69、19、22、72、25、29、32、35、37、40、43、46、74、86、89、94、101和102，或其互补序列组成的组的第三可检测地标记的寡核苷酸序列或由其组成，该探针被配置为与正向引物和反向引物所产生的扩增子杂交。在一些实施例中，第三可检测地标记的寡核苷酸序列包含供体荧光部分和对应的受体部分。在一些实施例中，该试剂盒进一步包括核苷三磷酸、核酸聚合酶以及核酸聚合酶功能所必需的缓冲剂。在又其它实施例中，第一寡核苷酸序列、第二寡核苷酸序列和第三寡核苷酸序列中的至少一者包含至少一个经修饰的核苷酸。在一个实施例中，BV相关细菌包括乳酸杆菌属物种、阴道加德纳氏菌、阴道阿托波氏菌、1型巨球型菌、伊格尔兹氏菌属物种、普雷沃氏菌属物种和BVAB-2。在一些实施例中，试剂盒包含引物和探针，引物和探针能够与乳酸杆菌属物种的23s rRNA或D-LDH基因杂交，包含SEQ ID NO：38-47和73-74的寡核苷酸序列或由其组成。在一些实施例中，试剂盒包含引物和探针，引物和探针能够与阴道加德纳氏菌的tuf基因或23s rRNA基因或16s rRNA基因杂交，包含SEQ ID NO：1-13的寡核苷酸序列或由其组成。在一些实施例中，试剂盒包含引物和探针，引物和探针能够与阴道阿托波氏菌的23s rRNA基因或tufA基因杂交，包含SEQ ID NO：14-22和66-72的寡核苷酸序列或由其组成。在一些实施例中，试剂盒包含引物和探针，引物和探针能够与1型巨球型菌的16srRNA基因杂交，包含SEQ ID NO：23-29的寡核苷酸序列或由其组成。在一些实施例中，试剂盒包含引物和探针，引物和探针能够与伊格尔兹氏菌属物种的16s rRNA基因杂交，包含选自以下各项的寡核苷酸序列：SEQ ID NO：84-89或由其组成。在一些实施例中，试剂盒包含引物和探针，引物和探针能够与普雷沃氏菌属物种的16srRNA基因杂交，包含SEQ ID NO：90-102的寡核苷酸序列或由其组成。在一些实施例中，试剂盒包含引物和探针，引物和探针能够与BVAB-2的16srRNA基因杂交，包含SEQ ID NO：30-37的寡核苷酸序列或由其组成。
在另一个方面，本公开提供一种检测生物学样品中的与外阴阴道念珠菌病(VVC)相关的念珠菌属物种的方法，其中VVC相关念珠菌属物种包括白色念珠菌、热带念珠菌、都柏林念珠菌和近平滑念珠菌(统称为念珠菌属物种)。在一些实施例中，VVC相关物种进一步包括克柔念珠菌和/或光滑念珠菌。在本文中，该方法包括进行扩增步骤，该扩增步骤包括使样品与一组引物接触以产生扩增产物，如果来自VVC相关念珠菌的核酸存在于样品中的话；进行杂交步骤，该杂交步骤包括使每种扩增产物与一种或多种可检测探针接触；以及检测每种扩增产物的存在情况，其中扩增产物的存在指示样品中VVC相关念珠菌的存在；其中从念珠菌属物种产生扩增产物的该组引物包含正向引物，该正向引物包含SEQ ID NO：48、51、54、57或76的寡核苷酸序列或由其组成；和反向引物，该反向引物包含SEQ ID NO：49、52、55、58或77的寡核苷酸序列或由其组成；并且该一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：50、53、56、59、75和78的寡核苷酸序列或由其组成；其中从克柔念珠菌产生扩增产物的该组引物包含正向引物，该正向引物包含SEQ ID NO：60、79或82的寡核苷酸序列或由其组成；和反向引物，该反向引物包含SEQ ID NO：61、80或83的寡核苷酸序列或由其组成；并且该一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：62和81的寡核苷酸序列或由其组成；其中从光滑念珠菌产生扩增产物的该组引物包含正向引物，该正向引物包含SEQ ID NO：63的寡核苷酸序列或由其组成；和反向引物，该反向引物包含SEQ ID NO：64的寡核苷酸序列或由其组成；并且该一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：65的寡核苷酸序列或由其组成。在一些实施例中，其中从念珠菌属物种产生扩增产物的该组引物包含正向引物，该正向引物包含SEQ ID NO：76的寡核苷酸序列或由其组成；和反向引物，该反向引物包含SEQ ID NO：77的寡核苷酸序列或由其组成；并且该一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：78的寡核苷酸序列或由其组成；并且从克柔念珠菌产生扩增产物的该组引物包含正向引物，该正向引物包含SEQ IDNO：79的寡核苷酸序列或由其组成；和反向引物，该反向引物包含SEQ ID NO：80的寡核苷酸序列或由其组成；并且该一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：81的寡核苷酸序列或由其组成。在其他实施例中，杂交步骤包括使扩增产物与可检测探针接触，该可检测探针用供体荧光部分和对应的受体部分进行标记；并且检测步骤包括检测探针的供体荧光部分和受体部分之间的荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在，其中荧光的存在或不存在指示样品中的VVC相关念珠菌的存在或不存在。在又一实施例中，扩增步骤采用具有5′至3′核酸酶活性的聚合酶。在一些实施例中，“接触”步骤进一步包括使所述生物学样品和所述引物与DNA聚合酶、多个游离核苷酸(包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤)和/或缓冲剂接触以产生反应混合物。从生物学样品提取的核酸可包含双链DNA或由其组成。反应混合物可以任选地进一步包含二价阳离子、单价阳离子钾离子、一种或多种可检测地标记的探针和/或其任何组合。在一些实施例中，“产生扩增子”步骤包括(a)将反应混合物加热至第一预定温度持续第一预定时间段以分离存在于生物学样品或核酸中的双链DNA的链，(b)在允许引物与其互补序列杂交并且允许DNA聚合酶延伸引物的条件下将反应混合物冷却至第二预定温度持续第二预定时间，以及(c)重复步骤(a)和(b)至少10到12次。在一些实施例中，重复步骤(a)和(b)至少15、20、22或25次。
本公开还提供一种用于检测样品中的外阴阴道念珠菌病(VVC)相关念珠菌属物种的试剂盒，该试剂盒包含正向引物，该正向引物包含选自由SEQ ID NO：48、51、54、57、76、60、79、82和63组成的组的第一寡核苷酸序列或由其组成；反向引物，该反向引物包含选自由SEQ ID NO：49、52、55、58、77、61、80、83和64组成的组的第二寡核苷酸序列或由其组成；以及探针，该探针包含选自由SEQ ID NO：50、53、75、56、59、78、62、81和65，或其互补序列组成的组的第三可检测地标记的寡核苷酸序列或由其组成，该探针被配置为与正向引物和反向引物所产生的扩增子杂交。在一些实施例中，第三可检测地标记的寡核苷酸序列包含供体荧光部分和对应的受体部分。在一些实施例中，该试剂盒进一步包括核苷三磷酸、核酸聚合酶以及核酸聚合酶功能所必需的缓冲剂。在又其它实施例中，第一寡核苷酸序列、第二寡核苷酸序列和第三寡核苷酸序列中的至少一者包含至少一个经修饰的核苷酸。在一些实施例中，VVC相关念珠菌属物种包括白色念珠菌、热带念珠菌、都柏林念珠菌和近平滑念珠菌(统称为念珠菌属物种)，克柔念珠菌以及光滑念珠菌。在一些实施例中，试剂盒包含引物和探针，引物和探针能够与念珠菌属物种的核糖体RNA(rRNA)基因或25s rRNA杂交，包含SEQID NO：48-59和75-78的寡核苷酸序列或由其组成。在一些实施例中，试剂盒包含引物和探针，引物和探针能够与克柔念珠菌的rRNA基因的内部转录间隔区(ITS)杂交，包含SEQ IDNO：60-62和79-83的寡核苷酸序列或由其组成。在一些实施例中，试剂盒包含引物和探针，引物和探针能够与光滑念珠菌的rRNA基因的内部转录间隔区(ITS)杂交，包含SEQ ID NO：63-65的寡核苷酸序列或由其组成。在一些实施例中，样品为生物学样品。在一些实施例中，生物学样品是从尿道、阴茎、肛门、喉咙、子宫颈或阴道收集的。在一些实施例中，生物学样品是从临床标本提取的DNA、RNA或总核酸。
此外，本公开提供一种寡核苷酸，该寡核苷酸包括与SEQ ID NO：1-102中的一者具有至少70％序列同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％或95％等)的核酸或其互补序列，该寡核苷酸具有100个或更少的核苷酸、50个或更少的核苷酸、40个或更少的核苷酸或30个或更少的核苷酸。一般来讲，这些寡核苷酸可以为引物核酸、探针核酸等。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸，例如以相对于未经修饰的核苷酸改变核酸杂交稳定性。在一些实施例中，该至少一个经修饰的核苷酸选自由N6-苄基-dA、N4-苄基-dC、N6-对叔丁基-苄基-dA和N4-对叔丁基-苄基-dC组成的组。任选地，寡核苷酸包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂部分。在一些实施例中，寡核苷酸包括至少一种保守修饰的变异。特定核酸序列的“保守修饰的变异”或简称为“保守变异”是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者在核酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本上相同的序列。本领域技术人员将认识到，在编码的序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或小部分的氨基酸(通常小于5％，更通常小于4％、2％或1％)的个别取代、缺失或添加是“保守修饰的变异”，其中这些改变导致缺失氨基酸、添加氨基酸或用化学上类似的氨基酸取代氨基酸。在一些实施例中，第一和第二靶基因引物和可检测靶基因探针中的至少一者包含至少一个经修饰的核苷酸。
在另一个方面，本发明提供一种同时检测样品中的乳酸杆菌属物种、阴道加德纳氏菌、阴道阿托波氏菌和选自下组中的至少一者的方法，所述组选自：念珠菌属物种、克柔念珠菌和光滑念珠菌，该方法包括进行扩增步骤，该扩增步骤包括使样品与一组引物接触以产生扩增产物，如果来自乳酸杆菌属物种、阴道加德纳氏菌、阴道阿托波氏菌和选自下组中的至少一者的核酸存在于样品中的话，所述组选自：念珠菌属物种、克柔念珠菌和光滑念珠菌；进行杂交步骤，该杂交步骤包括使每种扩增产物与一种或多种可检测探针接触；并且检测每种扩增产物的存在情况，其中该扩增产物的存在指示该样品中的乳酸杆菌属物种、阴道加德纳氏菌、阴道阿托波氏菌和选自下组中的至少一者的存在，所述组选自：念珠菌属物种、克柔念珠菌和光滑念珠菌。在此，可以使用如上所述的该组引物和对应的探针。在一个实施例中，从乳酸杆菌属物种产生扩增产物的该组引物包含正向引物，该正向引物包含SEQ ID NO：44的寡核苷酸序列或由其组成；和反向引物，该反向引物包含SEQ ID NO：45的寡核苷酸序列或由其组成；并且该一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：46的寡核苷酸序列或由其组成；并且从阴道加德纳氏菌产生扩增产物的该组引物包含正向引物，该正向引物包含SEQ ID NO：11的寡核苷酸序列或由其组成；和反向引物，该反向引物包含SEQ IDNO：12的寡核苷酸序列或由其组成；并且该一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：13的寡核苷酸序列或由其组成；并且从阴道阿托波氏菌产生扩增产物的该组引物包含正向引物，该正向引物包含SEQ ID NO：20寡核苷酸序列或由其组成；和反向引物，该反向引物包含SEQID NO：21的寡核苷酸序列或由其组成；并且该一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：72的寡核苷酸序列或由其组成；和/或其中从念珠菌属物种产生扩增产物的该组引物包含正向引物，该正向引物包含SEQ ID NO：76的寡核苷酸序列或由其组成；和反向引物，该反向引物包含SEQ ID NO：77的寡核苷酸序列或由其组成；并且该一种或多种可检测探针包含SEQ IDNO：78的寡核苷酸序列或由其组成；并且从克柔念珠菌产生扩增产物的该组引物包含正向引物，该正向引物包含SEQ ID NO：79的寡核苷酸序列或由其组成；和反向引物，该反向引物包含SEQ ID NO：80的寡核苷酸序列或由其组成；并且该一种或多种可检测探针包含SEQ IDNO：81的寡核苷酸序列或由其组成；并且从光滑念珠菌产生扩增产物的该组引物包含正向引物，该正向引物包含SEQ ID NO：63的寡核苷酸序列或由其组成；和反向引物，该反向引物包含SEQ ID NO：64的寡核苷酸序列或由其组成；并且该一种或多种可检测探针包含SEQ IDNO：65的寡核苷酸序列或由其组成。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语所具有的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。尽管在本主题的实践或测试中，可使用与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。此外，材料、方法和实例仅是说明性的，而不旨在限制。
本发明的一个或多个实施例的细节在附图和下面的说明书中阐述。本发明的其他特征、目的和优点将从附图和详细描述以及权利要求中显而易见。
附图说明
图1A显示如实例2所述的用于扩增和检测阴道阿托波氏菌的PCR实验的生长曲线。图1B显示同一实验的计算的Ct值。
图2显示如实例3所述的用于扩增和检测阴道加德纳氏菌的PCR实验的计算的Ct值。
图3显示如实例4所述的用于扩增和检测BVAB-2的PCR实验的计算的Ct值。
图4显示如实例5所述的用于扩增和检测1型巨球型菌的PCR实验的计算的Ct值。
图5显示如实例6所述的用于扩增和检测乳酸杆菌属物种的PCR实验的计算的Ct值。
图6显示如实例9所述的用于扩增和检测念珠菌属物种的CAPT_rRNA_1测定中的PCR实验的计算的Ct值。
图7显示如实例9所述的用于扩增和检测念珠菌属物种和光滑念珠菌的CVS_rRNA_1测定中的PCR实验的计算的Ct值。
图8显示如实例10所述的在多重PCR测定中的用于检测阴道加德纳氏菌的16srRNA的通道1中的生长曲线。T1-4Ab：含阴道加德纳氏菌16s、卷曲乳酸杆菌LDH、阴道阿托波氏菌tufA、白色念珠菌25srRNA序列和人类基因组DNA的质粒库。T1-4Gb：含阴道加德纳氏菌16s、卷曲乳酸杆菌LDH、阴道阿托波氏菌tufA、光滑念珠菌ITS序列和人类基因组DNA的质粒库。HIVD：样品稀释剂。
图9显示如实例10所述的在多重PCR测定中的用于检测乳酸杆菌属物种的D-LDH基因的通道2中的生长曲线。T1-4Ab：含阴道加德纳氏菌16s、卷曲乳酸杆菌LDH、阴道阿托波氏菌tufA、白色念珠菌25srRNA序列和人类基因组DNA的质粒库。T1-4Gb：含阴道加德纳氏菌16s、卷曲乳酸杆菌LDH、阴道阿托波氏菌tufA、光滑念珠菌ITS序列和人类基因组DNA的质粒库。HIVD：样品稀释剂。
图10显示如实例10所述的在多重PCR测定中的用于检测阴道阿托波氏菌的tufA基因的通道3中的生长曲线。T1-4Ab：含阴道加德纳氏菌16s、卷曲乳酸杆菌LDH、阴道阿托波氏菌tufA、白色念珠菌25srRNA序列和人类基因组DNA的质粒库。T1-4Gb：含阴道加德纳氏菌16s、卷曲乳酸杆菌LDH、阴道阿托波氏菌tufA、光滑念珠菌ITS序列和人类基因组DNA的质粒库。HIVD：样品稀释剂。
图11显示如实例10所述的在多重PCR测定中的用于检测念珠菌属物种的25s rRNA的通道4中的生长曲线。T1-4Ab：含阴道加德纳氏菌16s、卷曲乳酸杆菌LDH、阴道阿托波氏菌tufA、白色念珠菌25srRNA序列和人类基因组DNA的质粒库。T1-4Gb：含阴道加德纳氏菌16s、卷曲乳酸杆菌LDH、阴道阿托波氏菌tufA、光滑念珠菌ITS序列和人类基因组DNA的质粒库。HIVD：样品稀释剂。
具体实施方式
本文提供了用于检测外阴阴道念珠菌病(VVC)和细菌性阴道病(BV)的方法和组合物。例如，可以结合与VVC和BV相关细菌相关的念珠菌属物种的特异性基因的引物和探针被提供以确定样品(诸如生物学样品)中的VVC相关念珠菌属物种和BV相关细菌的存在或不存在。在一些实施例中，可进行多重核酸扩增以允许检测单一测定中的VVC相关念珠菌属物种和BV相关细菌。
所公开的方法可包括进行至少一个循环步骤，该循环步骤包括使用一对或多对引物从样品扩增核酸分子基因靶标的一个或多个部分。如本文所用的“引物”是指在与细菌性物种或念珠菌属物种中的靶基因特异性退火并在适当条件下从其启动DNA合成从而产生相应扩增产物的寡核苷酸引物。所讨论的引物中的每一种与对应的靶核酸分子内或邻近的靶标退火，使得每种扩增产物的至少一部分含有对应于靶标的核酸序列。如果样品中存在靶基因核酸中的一种或多种，则产生一种或多种扩增产物，因此靶基因扩增产物中的一种或多种的存在指示样品中的细菌性或念珠菌属物种的存在。扩增产物应含有与靶基因的一种或多种可检测探针互补的核酸序列。如本文所用的“探针”是指与编码靶基因的核酸序列特异性退火的寡核苷酸探针。每个循环步骤包括扩增步骤、杂交步骤和检测步骤，其中使样品与一种或多种可检测探针接触以检测样品中的细菌性物种或念珠菌属物种的存在或不存在。
如本文所用，术语“扩增”是指合成与模板核酸分子的一条或两条链互补的核酸分子的过程。扩增核酸分子通常包括使模板核酸变性，在低于引物解链温度的温度将引物与模板核酸退火，以及从引物酶促延伸以产生扩增产物。扩增通常需要存在三磷酸脱氧核糖核苷、DNA聚合酶(例如Taq)以及用于优化聚合酶活性的适当缓冲剂和/或辅因子(例如MgCl2和/或KCl)。
如本文所用的术语“引物”是本领域技术人员已知的，是指能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发”DNA合成的寡聚化合物，主要是指寡核苷酸，但也指经修饰的寡核苷酸，即例如寡核苷酸的3′-端提供游离3′-OH基团，另外的“核苷酸”可通过模板依赖性DNA聚合酶附接到该基团，从而建立3′至5′磷酸二酯键，由此使用三磷酸脱氧核苷并由此释放焦磷酸根。因此，除了可能的预期功能之外，“引物”、“寡核苷酸”或“探针”之间没有根本区别。
术语“杂交”是指一种或多种探针与扩增产物的退火。杂交条件通常包括低于探针解链温度但避免探针非特异性杂交的温度。
术语“5′到3′核酸酶活性”是指核酸聚合酶的活性，通常与核酸链合成相关，由此从核酸链的5′末端去除核苷酸。
术语“热稳定聚合酶”是指热稳定的聚合酶，即该酶催化与模板互补的引物延伸产物的形成，并且在经受升高的温度持续实现双链模板核酸变性所需的时间时不会不可逆地变性。通常，合成在每个引物的3′末端处起始，并且沿着模板链以5′至3′方向前进。已从黄栖热菌(Thermus flavus)、红栖热菌(T.ruber)、嗜热栖热菌(T.thermophilus)、水生栖热菌(T.aquaticus)、乳栖热菌(T.lacteus)、红色栖热菌(T.rubens)、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)和炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)分离出热稳定的聚合酶。然而，并非热稳定的聚合酶也可用于PCR测定中，条件是补充该酶。
术语“其互补序列”是指与给定核酸具有相同长度并且与其完全互补的核酸。
当用于核酸时，术语“延伸”或“伸长”是指额外的核苷酸(或其他类似分子)掺入核酸时。例如，核酸任选地被掺入核苷酸的生物催化剂延伸，例如通常在核酸的3′末端添加核苷酸的聚合酶。
在两个或更多个核酸序列的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指当进行比较和比对以获得最大对应性(例如，如使用技术人员可用的序列比较算法中的一种或通过视觉检查所测量的)时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同核苷酸。适于测定序列同一性百分比和序列相似性的示例性算法是在例如以下文献中描述的BLAST程序：Altschul等人(1990)“Basic local alignment search tool”J.Mol.Biol.215：403-410；Gish等人(1993)“Identification of protein codingregions by database similarity search”Nature Genet.3：266-272；Madden等人(1996)“Applications of network BLAST server”Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul等人(1997)“Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database searchprograms”Nucleic Acids Res.25：3389-3402；以及Zhang等人(1997)“PowerBLAST：A newnetwork BLAST application for interactive or automated sequence analysis andannotation”Genome Res.7：649-656中。
寡核苷酸上下文中的“修饰的核苷酸”是指这样的改变，其中寡核苷酸序列的至少一个核苷酸被不同的核苷酸替换，为寡核苷酸提供所需的特性。可在本文所述的寡核苷酸中被取代的示例性经修饰的核苷酸包括例如C5-甲基-dC、C5-乙基-dC、C5-甲基-dU、C5-乙基-dU、2，6-二氨基嘌呤、C5-丙炔基-dC、C5-丙炔基-dU、C7-丙炔基-dA、C7-丙炔基-dG、C5-炔丙基氨基-dC、C5-炔丙基氨基-dU、C7-炔丙基氨基-dA、C7-炔丙基氨基-dG、7-脱氮-2-脱氧黄苷、吡唑并嘧啶类似物、假-dU、硝基吡咯、硝基吲哚、2′-O-甲基核糖-U、2′-O-甲基核糖-C、N4-乙基-dC、N6-甲基-dA、N6-苄基-dA、N4-苄基-dC、N6-对叔丁基-苄基-dA、N4-对叔丁基-苄基-dC等。可以在寡核苷酸中取代的许多其他修饰的核苷酸在本文中提及或在本领域中另外已知。在某些实施例中，经修饰的核苷酸取代相对于对应的未经修饰的寡核苷酸的解链温度修饰寡核苷酸的解链温度(Tm)。为了进一步说明，在一些实施例中，某些经修饰的核苷酸取代可减少非特异性核酸扩增(例如，最小化引物二聚体形成等)，增加预期的靶扩增子的产量等。这些类型的核酸修饰的实例描述于例如美国专利号6,001,611中。
细菌和真菌的检测
如本文所述，可进行核酸扩增以确定样品中的念珠菌属物种和/或BV相关细菌的存在、不存在和/或水平。一些念珠菌属物种已知与VVC相关，包括但不限于白色念珠菌、热带念珠菌、都柏林念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌。许多细菌也已知与BV相关，包括但不限于乳酸杆菌属物种(例如卷曲乳酸杆菌(L.crispatus)、詹氏乳酸杆菌(L.jensenii)和格氏乳酸杆菌(L.gasseri))、阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)、阴道阿托波氏菌、1型巨球型菌(Megasphaera-1)以及BVAB-2。在一些实施例中，VVC相关念珠菌属物种和BV相关细菌的存在、不存在和/或水平通过使用本领域已知的方法(诸如DNA扩增)以检测目标生物体中的每个目标生物体的一个或多个靶基因来确定。在一些实施例中，可以进行多重PCR以检测目标念珠菌属物种和/或BV相关细菌中的每一者的存在、不存在或水平。在一些实施例中，进行多重PCR以检测目标VVC相关念珠菌属物种、卷曲乳酸杆菌、詹氏乳酸杆菌、阴道加德纳氏菌、阴道阿托波氏菌、1型巨球型菌以及BVAB-2中的每一者的存在、不存在和/或水平。在一些实施例中，VVC相关念珠菌属物种是白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌。
在另一个实施例中，可以在同一样品中进行核酸扩增以确定阴道毛滴虫(TV)的存在、不存在和/或水平。美国专利申请公开号2017/0342508中描述了用于快速检测生物学或非生物学样品中的阴道毛滴虫的存在或不存在的组合物和方法。
可以使用DNA扩增中的单独通道检测目标VVC相关念珠菌属物种和BV相关细菌中的每一者。在一些情况下，可能需要使用单个荧光通道来检测VVC相关念珠菌属物种和BV相关细菌中的两者或更多者的存在、不存在和/或水平。例如，可以使用单个荧光通道来检测两种BV相关细菌(例如BVAB-2和1型巨球型菌)的存在、不存在和/或水平。在一些实施例中，此类组合可以减少进行实验所需的试剂量，并提供准确的定性指标，可以根据定性指标来评估BV确定。不受任何特定理论的束缚，据信组合标志物的使用可增加测定的灵敏度和特异性。在一些实施例中，单独的荧光通道用于检测乳酸杆菌属物种(例如卷曲乳酸杆菌、詹氏乳酸杆菌和格氏乳酸杆菌)、阴道加德纳氏菌以及阴道阿托波氏菌中的一者的存在、不存在和/或水平；并且单荧光通道用于检测BVAB-2、1型巨球型菌、伊格尔兹氏菌属物种以及普雷沃氏菌属物种的存在、不存在和/或水平。
提供了可以特异性杂交至(例如，在标准核酸扩增条件，例如标准PCR条件下，和/或严格杂交条件下)VVC相关念珠菌属物种、卷曲乳酸杆菌、詹氏乳酸杆菌和格氏乳酸杆菌、阴道加德纳氏菌、阴道阿托波氏菌、1型巨球型菌(Megasphaera-1)以及BVAB-2中的靶基因区域或其互补序列的寡核苷酸(例如扩增引物和探针)。在一些实施例中，样品(例如，阴道拭子样品)中的生物体的靶基因区域的扩增可以指示样品中的生物体的存在、不存在和/或水平。
靶基因区域可以变化。在一些实施例中，提供了能够在生物体中特异性杂交(例如，在标准核酸扩增条件下，例如，标准PCR条件和/或严格杂交条件下)编码16S核糖体RNA(16S rRNA)的基因区域的寡核苷酸(例如，扩增引物和探针)。在一些实施例中，生物体是阴道加德纳氏菌。在一些实施例中，生物体是BVAB-2。在一些实施例中，生物体是1型巨球型菌。可以特异性杂交至阴道加德纳氏菌、1型巨球型菌和BVAB-2中的16s rRNA基因区域的寡核苷酸的实例包括但不限于分别如表I中所提供的SEQ ID NO：11-13、如表III中所提供的SEQ ID NO：23-29，以及如表IV中所提供的SEQ ID NO：30-37。
在一些实施例中，23s rRNA基因用作DNA扩增的靶基因以检测样品中的阴道加德纳氏菌、阴道阿托波氏菌和乳酸杆菌属物种的存在、不存在和/或水平。可以特异性杂交至阴道加德纳氏菌、阴道阿托波氏菌和乳酸杆菌属物种中的23s RNA基因区域的寡核苷酸的实例包括但不限于分别如表I中所提供的SEQ ID NO：5-10、如表II中所提供的SEQ ID NO：14-16，以及如表V中所提供的SEQ ID NO：38-43。
在一些实施例中，提供了可以特异性杂交至(例如，在标准核酸扩增条件，例如，标准PCR条件下，和/或严格杂交条件下)编码阴道加德纳氏菌中的延伸因子Tu蛋白(tuf基因)和阴道阿托波氏菌中的tufA基因的基因区域的寡核苷酸(例如，扩增引物和探针)。在一些实施例中，tuf(或tufA)基因用作DNA扩增的靶基因以检测样品中的阴道加德纳氏菌和阴道阿托波氏菌的存在、不存在和/或水平。在一些实施例中，能够特异性结合阴道加德纳氏菌的tuf基因区域和阴道阿托波氏菌中的tufA基因区域的引物和探针用于检测生物学样品中的阴道加德纳氏菌和阴道阿托波氏菌的存在、不存在和/或水平。可以特异性杂交至阴道加德纳氏菌中的tuf基因区域的寡核苷酸的实例包括但不限于如表I中所提供的SEQ ID NO：1-4，并且可以特异性杂交至阴道阿托波氏菌中的tufA基因区域的寡核苷酸的实例包括但限于如表II中所提供的SEQ ID NO：17-22。
在一些实施例中，核糖体RNA(rRNA)基因用作DNA扩增的靶基因以检测样品中的VVC相关念珠菌属物种的存在、不存在和/或水平。在一些实施例中，VVC相关念珠菌属物种包括白色念珠菌、热带念珠菌、都柏林念珠菌和近平滑念珠菌(统称为念珠菌属物种)。在一些实施例中，VVC相关念珠菌属物种是克柔念珠菌。在一些实施例中，VVC相关念珠菌属物种是光滑念珠菌。在一些实施例中，VVC相关念珠菌属物种是白色念珠菌、热带念珠菌、都柏林念珠菌、近平滑念珠菌或其组合。可以特异性杂交至光滑念珠菌中的rRNA基因区域的寡核苷酸的实例包括但不限于如表VII中所提供的SEQ ID NO：63-65。可以特异性杂交至白色念珠菌、热带念珠菌、都柏林念珠菌和近平滑念珠菌(统称为念珠菌属物种)中的rRNA基因区域的寡核苷酸的实例包括但不限于如表VI中所提供的SEQ ID NO：48-59。可以特异性杂交至克柔念珠菌中的rRNA基因区域的寡核苷酸的实例包括但不限于如表VII中所提供的SEQID NO：60-62。
表I：用于检测阴道加德纳氏菌的引物和探针
表II用于检测阴道阿托波氏菌的引物和探针
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表III用于检测1型巨球型菌的引物和探针
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表IV用于检测BVAB-2的引物和探针
表V用于检测乳酸杆菌属物种的引物和探针
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表VI用于检测念珠菌属物种的引物和探针
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表VII用于检测克柔念珠菌和光滑念珠菌的引物和探针
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表VIII用于检测伊格尔兹氏菌属物种的引物和探针
表IX用于检测普雷沃氏菌属物种的引物和探针
/>
在一个实施例中，使用上述组引物和探针，以便提供与怀疑含有此类细菌和念珠菌属物种的生物学样品中的阴道病相关细菌和念珠菌属物种的检测。该组引物和探针可包含对相应细菌和念珠菌属靶基因具有特异性的引物和探针或由其组成，其包含以下核酸序列：SEQ ID NO：1-102或由其组成。在另一个实施例中，靶基因的引物和探针含有以下引物和探针中的任何引物和探针的功能活性变体：SEQ ID NO：1-102或由其组成。
可通过在所公开的方法中使用引物和/或探针来鉴定SEQ ID NO：1-102的任何引物和/或探针的功能活性变体。SEQ ID NO：1-102中任一者的引物和/或探针的功能活性变体涉及与SEQ ID NO：1-102的相应序列相比在所描述的方法或试剂盒中提供相似或更高特异性和灵敏度的引物和/或探针。
变体可例如由于一个或多个核苷酸添加、缺失或取代(诸如SEQ ID NO：1-102的相应序列的5′端和/或3′端的一个或多个核苷酸添加、缺失或取代)而与SEQ ID NO：1-102的序列不同。如上所述，引物(和/或探针)可以是经化学修饰的，即引物和/或探针可包含经修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。探针(或引物)则是经修饰的寡核苷酸。“经修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)与天然“核苷酸”的不同之处在于一些修饰，但仍由碱基或碱基样化合物、戊呋喃糖基糖或戊呋喃糖基糖样化合物、磷酸部分或磷酸样部分或它们的组合组成。例如，可将“标记”附接到“核苷酸”的碱基部分，由此获得“经修饰的核苷酸”。“核苷酸”中的天然碱基也可被例如7-脱氮嘌呤替换，由此也获得“经修饰的核苷酸”。术语“经修饰的核苷酸”或“核苷酸类似物”在本申请中可互换使用。“经修饰的核苷”(或“核苷类似物”)与天然核苷的不同之处在于以如上文针对“经修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)概述的方式进行的一些修饰。
可使用例如计算机程序诸如OLIGO(Molecular Biology Insights Inc.，Cascade，Colo.)来设计扩增编码靶基因的核酸分子的寡核苷酸，包括经修饰的寡核苷酸和寡核苷酸类似物。当设计用作扩增引物的寡核苷酸时，重要特征包括但不限于适当大小的扩增产物以便于检测(例如，通过电泳)、一对引物的成员的相似解链温度以及每个引物的长度(即，引物需要足够长以与序列特异性退火并启动合成，但不能太长以至于在寡核苷酸合成过程中保真度降低)。通常，寡核苷酸引物的长度为8至50个核苷酸(例如，长度为8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48个或50个核苷酸)。在一些实施例中，寡核苷酸引物的长度为40个或更少的核苷酸。
除了一组引物之外，这些方法还可使用一种或多种探针以便检测靶细菌性和念珠菌属物种的存在或不存在。术语“探针”是指合成或生物产生的核酸(DNA或RNA)，其通过设计或选择而包含特定核苷酸序列，允许它们在定义的预定严格性下特异性(即优先性地)杂交到“靶标核酸”，在本例中为靶基因核酸。“探针”可以称为“检测探针”，意思是它检测靶核酸。
在一些实施例中，所述靶基因探针可用至少一种荧光标记物进行标记。在一个实施例中，靶基因探针可用供体荧光部分(例如荧光染料)和对应的受体部分(例如猝灭剂)标记。在一个实施例中，探针包含荧光部分或由其组成，并且核酸序列包含SEQ ID NO：3、7、10、13、16、19、22、25、29、32、35、37、40、43、46、50、53、56、59、62或65或由其组成。
设计用作探针的寡核苷酸可以以类似于设计引物的方式进行。实施例可以使用单个探针或一对探针来检测扩增产物。根据实施例，使用的探针可包含至少一种标记和/或至少一种猝灭剂部分。与引物一样，探针通常具有相似的解链温度，并且每个探针的长度必须足以发生序列特异性杂交，但不能太长以至于在合成过程中保真度降低。寡核苷酸探针的长度通常为15至40(例如，16、18、20、21、22、23、24或25)个核苷酸。
构建体可包括各自含有靶基因引物和探针核酸分子中的一种的载体。构建体可用作例如对照模板核酸分子。适用的载体是市售的和/或通过本领域常规的重组核酸技术方法产生的。靶基因核酸分子可例如通过化学合成、从CA直接克隆或通过PCR扩增获得。
除了靶基因核酸分子(例如，含有SEQ ID NO：1-3中的一个或多个序列的核酸分子)外，适用于方法中的构建体通常还包括编码用于选择所需构建体和/或转化体的可选择标志物(例如，抗生素抗性基因)的序列以及复制起点。载体系统的选择通常取决于若干因素，包括但不限于宿主细胞的选择、复制效率、选择性、诱导性和回收的容易性。
含有靶基因核酸分子的构建体可在宿主细胞中繁殖。如本文所用，术语宿主细胞意在包括原核生物和真核生物，诸如酵母、植物和动物细胞。原核宿主可包括大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。真核宿主包括酵母(诸如酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、毕赤酵母(Pichia pastoris))、哺乳动物细胞(诸如COS细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)、昆虫细胞和植物细胞(诸如拟南芥(Arabidopsis thaliana)和烟草(Nicotiana tabacum))。可使用本领域普通技术人员公知的任何技术将构建体引入宿主细胞中。例如，磷酸钙沉淀、电穿孔、热激、脂质转染、显微注射和病毒介导的核酸转移是将核酸引入宿主细胞中的常用方法。另外，可将裸DNA直接递送到细胞(参见例如美国专利号5,580,859和5,589,466)。
聚合酶链式反应(PCR)
美国专利号4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188公开了常规的PCR技术。PCR通常采用与所选核酸模板(例如DNA或RNA)结合的两种寡核苷酸引物。在一些实施例中有用的引物包括能够作为所描述的靶NG基因核酸序列内核酸合成起始点的寡核苷酸。引物可以通过常规方法从限制性消化物中纯化，或它可以合成产生。为了扩增中的最大效率，引物优先为单链的，但引物可以是双链的。首先使双链引物变性(即对其进行处理)以分离链。使双链核酸变性的一种方法是通过加热。
如果模板核酸是双链的，则必须在它可以用作PCR中的模板前分离两条链。链分离可以通过任何合适的变性方法完成，包括物理、化学或酶促方法。一种分离核酸链的方法涉及加热核酸直到其大部分变性(例如，大于50％、60％、70％、80％、90％或95％变性)。使模板核酸变性所需的加热条件将取决于例如缓冲盐浓度以及被变性的核酸的长度和核苷酸组成，但通常在约90℃至约105℃的范围内持续一段时间，这取决于反应的特征诸如温度和核酸长度。变性通常进行约30秒至4分钟(例如，1分钟至2分钟30秒，或1.5分钟)。
如果通过加热使双链模板核酸变性，则使反应混合物冷却至促进每个引物与所描述的靶NG基因核酸分子上的靶序列退火的温度。用于退火的温度通常为约35℃至约65℃(例如，约40℃至约60℃；约45℃至约50℃)。退火时间可为约10秒至约1分钟(例如，约20秒至约50秒；约30秒至约40秒)。然后将反应混合物调节至促进或优化聚合酶活性的温度，即足以从退火的引物发生延伸以生成与模板核酸互补的产物的温度。温度应足以从与核酸模板退火的每个引物合成延伸产物，但不应高到使延伸产物从其互补模板变性(例如，用于延伸的温度通常在约40℃至约80℃的范围内(例如，约50℃至约70℃；约60℃))。延伸时间可为约10秒至约5分钟(例如，约30秒至约4分钟；约1分钟至约3分钟；约1分钟30秒至约2分钟)。
PCR测定可以使用核酸，例如RNA或DNA(cDNA)。模板核酸不需要纯化；其可以是复杂混合物的一小部分，诸如人类细胞中包含的核酸。核酸分子可通过常规技术从生物学样品中提取，诸如Diagnostic Molecular Microbiology：Principles and Applications(Persing等人(编)，1993，American Society for Microbiology，Washington D.C.)中所描述的那些技术。核酸可从许多来源获得，诸如质粒或天然来源，包括细菌、酵母、原生动物病毒、细胞器或高等生物，诸如植物或动物。
寡核苷酸引物与在诱导引物延伸的反应条件下的PCR试剂组合。例如，链延伸反应通常包括50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.3)、15mM MgCl2、0.001％(w/v)明胶、0.5-1.0μg原始变性模板DNA、每个寡核苷酸引物50pmol、2.5U Taq聚合酶和10％DMSO)。反应通常包含150至320μM dATP、dCTP、dTTP、dGTP中的每一种或者其一种或多种类似物。
新合成的链形成可用于后续反应步骤的双链分子。可根据需要重复多次链分离、退火和延伸的步骤，以产生所需数量的对应于靶核酸分子的扩增产物。反应中的限制因素是反应中存在的引物、热稳定酶和核苷三磷酸的量。优选地重复至少一次循环步骤(即变性、退火和延伸)。为了用于检测，循环步骤的次数将取决于例如样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物，则将需要更多循环步骤以扩增足以检测的靶序列。通常，循环步骤重复至少约20次，但可以重复多达40、60或甚至100次。
荧光共振能量转移(FRET)
FRET技术(参见例如美国专利号4,996,143、5,565,322、5,849,489和6,162,603)基于这样的概念：当供体荧光部分和对应的受体荧光部分位于彼此相距一定距离内时，两个荧光部分之间会发生能量转移，该能量转移可被可视化或以其他方式检测和/或定量。当供体被具有合适波长的光辐射激发时，供体通常将能量转移至受体。受体通常以具有不同的波长的光辐射的形式重新发射转移的能量。在某些系统中，非荧光能量可通过包括基本上非荧光供体部分的生物分子在供体与受体部分之间转移(参见例如美国专利号7,741,467)。
在一个示例中，寡核苷酸探针可含有供体荧光部分和对应的猝灭剂，该猝灭剂可以是或不是荧光的，并且以不同于光的形式耗散转移的能量。当探针完整时，能量转移通常发生在供体和受体部分之间，使得来自供体荧光部分的荧光发射被受体部分猝灭。在聚合酶链反应的延伸步骤期间，与扩增产物结合的探针被例如Taq聚合酶的5′至3′核酸酶活性裂解，使得供体荧光部分的荧光发射不再被猝灭。用于此目的的示例性探针在例如美国专利号5,210,015、5,994,056和6,171,785中描述。常用的供体-受体对包括FAM-TAMRA对。常用的猝灭剂是DABCYL和TAMRA。常用的黑暗猝灭剂包括BlackHole QuenchersTM(BHQ)(Biosearch Technologies，Inc.，Novato，Cal.)、Iowa BlackTM(Integrated DNA Tech.，Inc.，Coralville，Iowa)、BlackBerryTM Quencher 650(BBQ-650)(Berry&Assoc.，Dexter，Mich.)。
在另一个示例中，两个寡核苷酸探针(每个含有荧光部分)可在由寡核苷酸探针与靶核酸序列的互补性决定的特定位置与扩增产物杂交。在寡核苷酸探针在适当位置与扩增产物核酸杂交后，产生FRET信号。杂交温度可在从约35℃至约65℃的范围内，持续约10秒至约1分钟。
荧光分析可以使用例如光子计数落射荧光显微镜系统(包含适当的二向色镜和用于监测特定范围的荧光发射的滤光片)、光子计数光电倍增管系统或荧光计来进行。可利用氩离子激光器、高强度汞(Hg)弧光灯、光纤光源或其他经适当过滤以在所需范围内激发的高强度光源来进行激发以启动能量转移或允许直接检测荧光团。
如本文关于供体和对应的受体部分所用，“对应的”是指具有与供体荧光部分的发射光谱重叠的吸收光谱的受体荧光部分或黑暗猝灭剂。受体荧光部分的发射光谱的最大波长应比供体荧光部分的激发光谱的最大波长至少大100nm。因此，可以在它们之间产生有效的非辐射能量传递。
通常针对以下项选择荧光供体和对应的受体部分：(a)高效率的Forster能量转移；(b)较大的最终Stokes位移(＞100nm)；(c)尽可能将发射偏移到可见光谱的红色部分(＞600nm)；以及(d)将发射偏移到比在供体激发波长下激发所产生的Raman水荧光发射高的波长。例如，可选择以下供体荧光部分：其在激光线附近具有其激发最大值(例如，氦-镉442nm或氩488nm)，具有高消光系数、高量子产率，并且其荧光发射与对应的受体荧光部分的激发光谱良好重叠。可选择具有高消光系数、高量子产率、其激发与供体荧光部分的发射的良好重叠以及在可见光谱的红色部分(＞600nm)中的发射的对应的受体荧光部分。
可在FRET技术中与各种受体荧光部分一起使用的代表性供体荧光部分包括荧光素、荧光黄、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸酯、荧光黄VS、4-乙酰氨基-4′-异硫基-氰酸茋-2，2′-二磺酸、7-二乙基氨基-3-(4′-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素、琥珀酰亚胺1-芘丁酸酯和4-乙酰氨基-4′-异硫氰酸茋-2，2′-二磺酸衍生物。取决于所使用的供体荧光部分，代表性受体荧光部分包括LC Red 640、LC Red 705、Cy5、Cy5.5、丽丝胺若丹明B磺酰氯、四甲基若丹明异硫氰酸盐、若丹明x异硫氰酸盐、赤藓红异硫氰酸盐、荧光素、二亚乙基三胺五乙酸盐或镧系元素离子(例如铕或铽)的其他螯合物。供体和受体荧光部分可以从例如Molecular Probes(Junction City，Oreg.)或Sigma Chemical Co.(St.Louis，Mo.)获得。
供体和受体荧光部分可以通过接头臂连接到合适的探针寡核苷酸上。每个接头臂的长度很重要，因为接头臂会影响供体和受体荧光部分之间的距离。接头臂的长度是以埃为单位的从核苷酸碱基到荧光部分的距离。通常，接头臂为约/>至约/>。接头臂可以是WO 84/03285中所述的种类。WO 84/03285还公开用于将接头臂连接至特定核苷酸碱基，以及用于将荧光部分连接至接头臂的方法。
受体荧光部分(诸如LC Red 640)可与含有氨基接头的寡核苷酸(例如，可从ABI(Foster City，Calif.)或Glen Research(Sterling，VA)获得的C6-氨基亚磷酰胺)组合，以产生例如LC Red 640标记的寡核苷酸。经常使用的将供体荧光部分(诸如荧光素)偶联至寡核苷酸的接头包括硫脲接头(FITC-衍生的，例如来自Glen Research或ChemGene(Ashland，Mass.)的荧光素-CPG′s)、酰胺接头(荧光素-NHS-酯衍生的，诸如来自BioGenex(SanRamon，Calif.)的CX-荧光素-CPG)、或需要在寡核苷酸合成后偶联荧光素-NHS-酯的3′-氨基-CPGs。
通过实时PCR检测
本公开提供了用于检测生物学样品或非生物学样品中的细菌性和真菌性靶生物体的存在或不存在的方法。提供的方法避免了样品污染、假阴性和假阳性的问题。这些方法包括进行至少一个循环步骤和FRET检测步骤，该循环步骤包括使用一对或多对引物从样品扩增靶核酸分子的一部分。进行多个循环步骤，优选在热循环仪中。方法可使用检测靶生物体的存在情况的引物和探针进行，并且检测到靶基因指示样品中的靶生物体的存在。
如本文所述，可以使用利用FRET技术的标记杂交探针检测扩增产物。一种FRET形式利用技术来检测扩增产物的存在或不存在，并且因此检测CA的存在或不存在。/>技术利用一种单链杂交探针，该探针用例如一种荧光染料和一种猝灭剂标记，该猝灭剂可以是或不是荧光的。当第一荧光部分用合适波长的光激发时，吸收的能量根据FRET原理转移至第二荧光部分或暗猝灭剂。第二荧光部分通常是猝灭剂分子。在PCR反应的退火步骤期间，标记的杂交探针与靶DNA(即，扩增产物)结合并在随后的延伸阶段期间被例如Taq聚合酶的5’至3’核酸酶活性降解。因此，荧光部分和猝灭剂部分变得彼此空间上分离。因此，在不存在猝灭剂的情况下的第一荧光部分激发后，可以检测到来自第一荧光部分的荧光发射。举例来说，ABI/>7700序列检测系统(Applied Biosystems)使用技术，并且适合于进行本文所述的用于检测样品中NG的存在或不存在的方法。
也可以使用与FRET缀合的分子信标来检测使用实时PCR方法的扩增产物的存在。分子信标技术使用被第一荧光部分和第二荧光部分标记的杂交探针。第二荧光部分通常是猝灭剂，且荧光标记一般位于探针的每个末端处。分子信标技术使用具有允许形成二级结构(例如发夹)的序列的探针寡核苷酸。作为在探针内的二级结构形成的结果，当探针在溶液中时，两个荧光部分空间接近。在与靶核酸(即扩增产物)杂交以后，探针的二级结构被破坏，并且荧光部分变得彼此分离，从而使得在用合适波长的光激发后，可以检测第一荧光部分的发射。
FRET技术的另一种常见形式是使用两个杂交探针。每个探针都可以用不同的荧光部分标记，并且通常设计为在靶标DNA分子(例如，扩增产物)中彼此非常接近地杂交。供体荧光部分，例如荧光素，在470nm处被仪器的光源激发。在FRET期间，荧光素将其能量转移到受体荧光部分，例如/>-Red 640(LC Red 640)或-Red 705(LC Red 705)。然后受体荧光部分发出更长波长的光，由仪器的光学检测系统检测。只有当荧光部分直接局部接近，并且当供体荧光部分的发射光谱与受体荧光部分的吸收光谱重叠时，有效的FRET才发生。发射信号的强度可与原始靶DNA分子的数量(例如，CA基因组的数目)相关。如果靶核酸发生扩增并产生扩增产物，则杂交步骤产生基于探针对成员之间的FRET的可检测信号。
通常，FRET的存在指示样品中存在靶生物体，并且FRET的不存在指示样品中不存在靶生物体。然而，样本采集不足、运输延迟、运输条件不当或使用某些采集拭子(海藻酸钙或铝轴)都是会影响测试结果的成功和/或准确性的条件。使用本文所公开的方法，在例如45个循环步骤内检测到FRET指示靶生物体的存在。
可用于实践这些方法的代表性生物学样品包括但不限于阴道拭子、粪便标本、血液标本、皮肤拭子、鼻拭子、伤口拭子、血培养物、皮肤和软组织感染物。生物学样品的收集和储存方法是本领域技术人员已知的。可对生物学样品进行处理(例如，通过本领域已知的核酸提取方法和/或试剂盒)以释放靶核酸，或者在一些情况下，可使生物学样品直接与PCR反应组分和合适的寡核苷酸接触。
解链曲线分析是可包含在循环曲线中的附加步骤。解链曲线分析基于DNA在称为解链温度(Tm)的特征温度下解链的事实，该解链温度被定义为一半DNA双链体分离成单链时的温度。DNA的解链温度主要取决于其核苷酸组成。因此，富含G和C核苷酸的DNA分子具有丰富的A和T核苷酸的DNA分子具有更高的Tm。通过检测信号丢失的温度，可以确定探针的解链温度。类似地，通过检测产生信号的温度，可以确定探针的退火温度。来自扩增产物的探针的解链温度可证实样品中的靶生物体的存在或不存在。
在每个热循环仪运行中，也可以循环控制样品。阳性对照样品可以使用例如对照引物和对照探针扩增靶核酸对照模板(不同于所述靶标基因的扩增产物)。阳性对照样品也可以扩增，例如，含有靶核酸分子的质粒构建体。这种质粒对照可在内部扩增(例如，在样品内)或在与患者样品并行的单独样品运行中使用与用于检测预期靶标相同的引物和探针扩增。此类对照是扩增、杂交和/或FRET反应成功或失败的指标。每个热循环仪运行还可以包括一个阴性对照，例如，缺少靶标模板DNA。阴性对照可以测量污染。这确保系统和试剂不会产生假阳性信号。因此，对照反应可以很容易地确定，例如，引物以序列特异性退火和启动延伸的能力，以及探针以序列特异性杂交和发生FRET的能力。
在一个实施例中，该方法包括避免污染的步骤。例如，在美国专利号5,035,996、5,683,896和5,945,313中描述了利用尿嘧啶-DNA糖基化酶的酶促方法，以减少或消除一个热循环仪运行与下一个之间的污染。
可以使用结合FRET技术的常规PCR方法来实践这些方法。在一个实施例中，使用仪器。以下专利申请描述了如/>技术中使用的实时PCR：WO97/46707、WO 97/46714和WO 97/46712。
可以使用PC工作站进行操作，并且可以使用Windows NT操作系统。当机器将毛细管按顺序放置在光学单元上时，可以获得来自样品的信号。软件可以在每次测量后立即实时显示荧光信号。荧光采集时间为10-100毫秒(msec)。在每个循环步骤之后，荧光与循环次数的定量显示可以针对所有样品不断更新。生成的数据可以存储以供进一步分析。
作为FRET的替代，使用双链DNA结合染料诸如荧光DNA结合染料(例如，Green或/>Gold(Molecular Probes))，可以检测扩增产物。在与双链核酸相互作用时，这样的荧光DNA结合染料在用合适波长的光激发后发射荧光信号。还可以使用双链DNA结合染料(诸如核酸)嵌入染料。当使用双链DNA结合染料时，通常进行解链曲线分析用于证实扩增产物的存在。
应当理解，本公开的实施例不受一种或多种市售仪器的配置的限制。
制品/试剂盒
本公开的实施例进一步提供检测阴道病相关细菌性和真菌性生物体的制品、组合物或试剂盒。制品可包括用于检测靶基因的引物和探针，以及合适的包装材料。组合物可以包括用于扩增靶基因的引物。在某些实施例中，组合物还可包含用于检测靶基因的探针。用于检测靶生物体的代表性引物和探针能够与靶核酸分子杂交。此外，试剂盒还可包括适当包装的DNA固定、杂交和检测所需的试剂和材料，例如固体支持物、缓冲剂、酶和DNA标准品。本文公开了设计引物和探针的方法，并且提供了扩增靶核酸分子并与之杂交的引物和探针的代表性示例。
制品还可以包括一种或多种用于标记探针的荧光部分，可替代地，可以标记随试剂盒提供的探针。例如，制品可包括用于标记探针的供体和/或受体荧光部分。上文提供了合适的FRET供体荧光部分和对应的受体荧光部分的实例。
制品还可包含包装说明书或包装标签，其上具有使用引物和探针来检测样品中的靶生物体的说明。制品和组合物可另外包括用于实施本文所公开的方法的试剂(例如，缓冲剂、聚合酶、辅因子或防止污染的试剂)。此类试剂可以专用于本文所述的市售仪器之一。
本公开的实施例将进一步在以下实例中描述，这些实例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实例
提供以下实施例、表和附图以帮助理解主题，该主题的真实范围在所附权利要求中阐述。应当理解，在不脱离本发明的精神的情况下，可对所阐述的程序进行修改。
实例1PCR测定试剂和条件
使用4800系统或/>6800/8800系统平台(Roche MolecularSystems，Inc.，Pleasanton，Ca)进行靶细菌和念珠菌属物种的实时PCR检测。扩增试剂的最终浓度如下所示：
表X PCR扩增试剂
下表示出了用于PCR扩增反应的典型温度曲线：
表XI PCR温度曲线
Pre-PCR程序包括初始变性以及在55℃、60℃和65℃下温育，以对RNA模板进行逆转录。在三种温度下温育同时具有以下有利效果：在较低温度下，轻微错配的靶序列(诸如生物体的遗传变体)也被转录，而在较高温度下，RNA二级结构的形成受到抑制，从而使转录更有效。将PCR循环分成两次测量，其中两次测量应用一步设置(结合退火和延伸)。55℃下的前5个循环允许通过预扩增轻微错配的靶序列来增加包容性，而第二次测量的45个循环通过使用58℃的退火/延伸温度提供了增加的特异性。
实例2阴道阿托波氏菌的扩增与检测
使用实例1中描述的条件进行阴道阿托波氏菌的靶基因、23s核糖体RNA和tufA的扩增和检测。对于AVAG_23s_1测定，使用了SEQ ID NO：14的正向引物、SEQ ID NO：15的反向引物和SEQ ID NO：16的探针。对于AVAG_TufA_2测定，使用了SEQ ID NO：17的正向引物、SEQID NO：18的反向引物和SEQ ID NO：19的探针。在AVAG_TufA_3测定中，使用了SEQ ID NO：20的正向引物、SEQ ID NO：21的反向引物和SEQ ID NO：22的探针。这些引物和探针用以每个PCR反应1e5、1e4和1e3拷贝的浓度存在的基因组阴道阿托波氏菌DNA进行测试。实验结果在图1A中显示为生长曲线，并且在图1B中显示为计算的Ct值。所有三种测定都证明了对阴道阿托波氏菌的检测的良好线性。
实例3阴道加德纳氏菌的扩增与检测
对于阴道加德纳氏菌的扩增和检测，使用三个靶基因进行了五种测定。在GVAG_Tuf_1测定(SEQ ID NO：1的正向引物，SEQ ID NO：2的反向引物，SEQ ID NO：3的探针)和GVAG_Tuf_2测定(SEQ ID NO：4的正向引物，SEQ ID NO：2的反向引物，SEQ ID NO：3的探针)中，tuf基因用作靶基因。23s rRNA基因是GVAG_23s_5测定(SEQ ID NO：5的正向引物，SEQID NO：6的反向引物，SEQ ID NO：7的探针)和GVAG_23s_7测定(SEQ ID NO 8的正向引物：SEQ ID NO：9的反向引物，SEQ ID NO：10的探针)的靶。对于GVAG_16s_1测定，使用了SEQ IDNO：11的正向引物、SEQ ID NO：12的反向引物和SEQ ID NO：13的探针来扩增和检测16srRNA基因。这些引物和探针用以每个PCR反应1e5、1e4和1e3拷贝的浓度存在的基因组阴道加德纳氏菌DNA进行测试，并且结果表示为Ct值，显示在图2中。
实例4 BVAB-2的扩增与检测
16s rRNA基因用作BVAB-2的扩增和检测的靶基因，并且使用以下引物和探针进行了三种测定：BVAB2_16s_1：SEQ ID NO：30的正向引物，SEQ ID NO：31的反向引物，SEQ IDNO：32的探针；BVAB2_16s_3：SEQ ID NO：33的正向引物，SEQ ID NO：34的反向引物，SEQ IDNO：35的探针；BVAB2_16s_4：SEQ ID NO：33的正向引物，SEQ ID NO：36的反向引物，SEQ IDNO：37的探针。这些测定使用16s rRNA质粒作为模板，其以每个PCR反应1e5、1e4和1e3拷贝的浓度存在，并且结果表示为Ct值，显示在图3中。
实例5 1型巨球型菌的扩增和检测
16s rRNA基因用作1型巨球型菌的扩增和检测的靶基因，并且使用以下引物和探针进行了三次测定：MEGA1_16s_2：SEQ ID NO：23的正向引物，SEQ ID NO：24的反向引物，SEQ ID NO：25的探针；MEGA1_16s_4：SEQ ID NO：26的正向引物，SEQ ID NO：24的反向引物，SEQ ID NO：25的探针；MEGA1_16s_6：SEQ ID NO：27的正向引物，SEQ ID NO：28的反向引物，SEQ ID NO：29的探针。这些测定使用16s rRNA质粒作为模板，其以每个PCR反应1e5、1e4和1e3拷贝的浓度存在，并且结果表示为Ct值，显示在图4中。
实例6乳酸杆菌属物种的扩增和检测
乳酸杆菌属物种的扩增和检测利用两个靶基因，23s核糖体RNA(23srRNA)和D-乳酸脱氢酶(LDH)以及四种测定。在每种测定中，使用了以下引物和探针：LBS_23s_1：SEQ IDNO：38的正向引物，SEQ ID NO：39的反向引物，SEQ ID NO：40的探针；LBS_23s_2：SEQ IDNO：41的正向引物，SEQ ID NO：42的反向引物，SEQ ID NO：43的探针；LBS_LDH_1：SEQ IDNO：44的正向引物，SEQ ID NO：47的反向引物，SEQ ID NO：46的探针；LBS_LDH_2：SEQ IDNO：44的正向引物，SEQ ID NO：45的反向引物，SEQ ID NO：46的探针。这些引物和探针用以每个PCR反应1e5、1e4和1e3拷贝的浓度存在的基因组乳酸杆菌属物种DNA进行测试，并且结果表示为Ct值，显示在图5中。
实例7伊格尔兹氏菌属物种的扩增和检测
来自迟缓埃格特菌的16s核糖体RNA(16s rRNA)被用作伊格尔兹氏菌属物种的DNA扩增和检测的靶。候选引物和探针序列的选择基于对迟缓埃格特菌、Eggerthellasinensis、Eggerthella timonensis和未分类的Eggerthella物种的包容性，以及对阿托波菌属物种、Coriobacteriumglomerans、阴道柯林斯菌、Slackia exigua、欧陆森氏菌属物种、Acetomicrobium faecale、乳杆菌属物种、长双歧杆菌、动弯杆菌属物种和伯克霍尔德菌的排他性。结果选择了SEQ ID NO：84、85、87和88的引物序列以及SEQ ID NO：86和89的探针序列(表VIII)。
实例8普雷沃氏菌属物种的扩增和检测
来自二路普雷沃尔菌的16s核糖体RNA(16s rRNA)用作普雷沃氏菌属物种的DNA扩增和检测的靶。候选引物和探针序列的选择基于对以下普雷沃氏菌属物种的包容性：羊膜普雷沃菌，二路普雷沃尔菌，口颊普雷沃菌，体普雷沃菌，解糖胨普雷沃菌，中间普雷沃菌。产黑普雷沃菌、变黑普雷沃菌、口普雷沃菌、Prevotella timonensis、栖牙普雷沃菌、Prevotella leoscheii、体普雷沃菌、马赛类普雷沃菌、Prevotella bergensis、口腔普雷沃菌和Prevotella lascolaii。候选引物和探针序列还基于对Rifkennellaceae、类细菌科、卟啉单胞菌属、具核梭杆菌、Sneathia amnii、生殖支原体、乳酸杆菌属物种、长双歧杆菌和伯克霍尔德菌属的排他性。结果选择了SEQ ID NO：90-93和95-100的引物序列以及SEQID NO：94、101-102的探针序列(表IX)。
实例9念珠菌属物种的扩增和检测
核糖体RNA(rRNA)基因用作DNA扩增的靶基因，以检测样品中的VVC相关念珠菌属物种的存在、不存在和/或水平。在CAPT_rRNA_1和CAPT_rRNA_6测定中，VVC相关念珠菌属物种包括白色念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌和热带念珠菌(统称为念珠菌属物种)。CAPT_rRNA_1测定使用SEQ ID NO：54的正向引物、SEQ ID NO：55的反向引物和SEQ ID NO：56的探针。CAPT_rRNA_6测定使用SEQ ID NO：57的正向引物、SEQ ID NO：58的反向引物和SEQ ID NO：59的探针。两种测定均用来自白色念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌，以每个PCR反应2.5e6、2.5e5和2.5e4拷贝的浓度的基因组DNA进行测试，并且结果表示为Ct值，显示在图6中。
rRNA基因也被用作CVS_rRNA_1和CVS_rRNA_2测定的靶基因，这些测定靶向白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌。CVS_rRNA_1测定使用SEQ ID NO：48的正向引物、SEQ ID NO：49的反向引物和SEQ ID NO：50的探针。CVS_rRNA_2测定使用SEQ ID NO：51的正向引物、SEQ ID NO：52的反向引物和SEQ ID NO：53的探针。两种测定均用白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌，以每个PCR反应2.5e6、2.5e5和2.5e4拷贝的浓度的基因组DNA进行测试，并且结果表示为Ct值，显示在图7中。
实例10多重PCR测定
使用四个不同的检测通道进行多重PCR单孔测定，多重PCR单孔测定同时检测三种BV相关细菌、乳酸杆菌属物种、阴道加德纳氏菌、阴道阿托波氏菌和念珠菌属物种(包括克柔念珠菌和光滑念珠菌)。第一个通道检测阴道加德纳氏菌的16s rRNA。第二通道检测乳酸杆菌属物种的D-LDH基因。第三个通道检测阴道阿托波氏菌的tufA基因。第四个通道检测多个念珠菌，包括念珠菌属物种的25s rRNA，以及克柔念珠菌和光滑念珠菌的rRNA ITS片段。表XII中显示了用于多重测定中的选择组合组的引物和探针。
表XII
如实例1中所述使用PCR测定试剂和条件，并且针对10,000(10K)和1,000(1K)拷贝的各种模板样品测试的实验结果分别对于通道1、2、3和4在图8、9、10和11中显示为生长曲线(仅适用于念珠菌属物种)。
虽然为了清楚和理解的目的已经相当详细地描述了上述发，但是本领域技术人员通过阅读本公开将清楚，在不脱离本发明的真实范围的情况下，可在形式和细节上进行各种改变。例如，上述所有技术和设备可以以各种组合使用。
序列表
<110> 霍夫曼-拉罗奇公司 (F. Hoffmann-La Roche AG)
罗氏诊断有限公司 (Roche Diagnostics GmbH)
罗氏分子系统公司 (Roche Molecular Systems, Inc.)
<120> 用于检测与细菌性和念珠菌阴道病相关的细菌和真菌的组合物和方法
<130> P36606-WO-HS
<150> 63/132,438
<151> 2020-12-30
<150> 63/263,717
<151> 2021-11-08
<160> 102
<170> 专利版本 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 GVAG_tuf_F_1
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 1
agctcccaat caacacccca 20
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 GVAG_tuf_R_1
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (25)..(25)
<223> 叔丁基苄基 dC
<400> 2
cacggagaag aagaccagtg ttatc 25
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 GVAG_tuf_Pb_1
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` 香豆素
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (10)..(11)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 3
agaccaccac cgtcacctct atcgagacct tcc 33
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 GVAG_tuf_F_2
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (23)..(23)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 4
cccaatcaac accccagttg aga 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 GVAG_23s_F_4
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (23)..(23)
<223> 叔丁基苄基 dC
<400> 5
ctgtaaggct gattccggtg atc 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 GVAG_23s_R_4
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (21)..(21)
<223> 叔丁基苄基 dC
<400> 6
cgagttcctt ggccaggatt c 21
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 GVAG_23s_Pb_4
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` 香豆素
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (10)..(11)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 7
caacgtgagg tgtgattccg ctcgtaccc 29
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 GVAG_23s_F_6
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (19)..(19)
<223> 叔丁基苄基 dC
<400> 8
agtgacgcgg gtaggtagc 19
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 GVAG_23s_R_5
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (22)..(22)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 9
gcaagcagga tcaccggaat ca 22
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 GVAG_23s_Pb_5
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` 香豆素
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (10)..(11)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 10
ctgaggcgtg atgggtaggc tgtaaggc 28
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 GVAG_F1
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (21)..(21)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 11
tgctccagaa tagctcttgg a 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 GVAG_R1
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (22)..(22)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 12
gccactaaac actttcccaa ca 22
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 GVAG_16s_Pb_1
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` 香豆素
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (10)..(11)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 13
tgctggatgc tccaacttga cgcatg 26
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 AVAG_23s_F_1
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 14
gctgagtccg gttgggataa 20
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 AVAG_23s_R_1
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (12)..(12)
<223> 7-脱氮 dG
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (23)..(23)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 15
ttgtctacaa ggggtcttac caa 23
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 AVAG_23s_Pb_1
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 16
cgggaagccc atcccaagat gagttttcct 30
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 AVAG_tufA_F_2
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (17)..(17)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 17
gcctggcgac cacgtaa 17
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 AVAG_tufA_R_2
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 18
tgtggccacc ttcacgaata 20
<210> 19
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 AVAG_tufA_Pb_2
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (8)..(9)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 19
attcacccca ttgctatgga ggaaggtctt aagttcg 37
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 AVAG_tufA_F_3
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (22)..(22)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 20
cactaaggtt ctctccgagc aa 22
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 AVAG_tufA_R_3
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (25)..(25)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 21
tcaatgtgag caacgttaat ggtaa 25
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 AVAG_tufA_Pb_3
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 22
cgacaaggct cctgaagagc gtcaacg 27
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 MEGA1_16s_F_2
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基 dC
<400> 23
ccgcgtgagt gaagaaggtc 20
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 MEGA1_16s_R_2
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (21)..(21)
<223> 叔丁基苄基 dC
<400> 24
ggtaccgtca cggacggata c 21
<210> 25
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MEGA1_16s_Pb_2
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 25
agctctgtta tacgggacga aaaagacgga tgcca 35
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 MEGA1_16s_F_4
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (21)..(21)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 26
ccgcaatgga cgaaagtctg a 21
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 MEGA1_16s_F_6
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (22)..(22)
<223> 叔丁基苄基 dC
<400> 27
tcttccgcaa tggacgaaag tc 22
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 MEGA1_16s_R_6
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (25)..(25)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 28
gcatccgtct ttttcgtccc gtata 25
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 MEGA1_16s_Pb_6
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (9)..(10)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 29
caacgccgcg tgagtgaaga aggtcttcgg 30
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 BVAB2_16s_F_1
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 30
cccgcacaag cagtggatta 20
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 BVAB2_16s_R_1
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (23)..(23)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 31
tgtctctctg tctccgaaga gaa 23
<210> 32
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 BVAB2_16s_Pb_1
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (11)..(12)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 32
accttaccag gacttgacat cctctgacga ttca 34
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 BVAB2_16s_F_3
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (27)..(27)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 33
agtgtgatgt ttaaatccaa ggcttaa 27
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 BVAB2_16s_R_3
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (28)..(28)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 34
gtgttcctcc taatatctac gcatttta 28
<210> 35
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 BVAB2_16s_Pb_3
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (11)..(12)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 35
caaactgttt agcttgagtg ctggagagga tagtgg 36
<210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 BVAB2_16s_R_4
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (28)..(28)
<223> 叔丁基苄基 dC
<400> 36
gttcctccta atatctacgc attttacc 28
<210> 37
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 BVAB2_16s_Pb_4
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (7)..(8)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 37
tcattacaaa ctgtttagct tgagtgctgg agaggatagt 40
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 LBS_23s_F_1
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (25)..(25)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 38
tcaggggtta ctgaatccag ataaa 25
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 LBS_23s_R_1
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (25)..(25)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 39
acttagcata gatttgggga cctta 25
<210> 40
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 LBS_23s_Pb_1
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` FAM
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (9)..(10)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 40
agtcagactg cgagtgataa gatccgtagt cgaaa 35
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 LBS_23s_F_2
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (21)..(21)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 41
gtgagaatcc tatccgccga a 21
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 LBS_23s_R_2
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (21)..(21)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 42
cttgccttag gtcccgactt a 21
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 LBS_23s_Pb_2
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` FAM
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (7)..(8)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 43
ttcctggggc aggctcgtcc gc 22
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 LBS_LDH_F_1
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (23)..(23)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 44
gctcgtgtat tacgtcaaga caa 23
<210> 45
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 LBS_LDH_R_2
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (27)..(27)
<223> 叔丁基苄基 dC
<400> 45
gaagatatcg taagcaataa cctttgc 27
<210> 46
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 LBS_LDH_Pb_1
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` FAM
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 46
tcgtgaccaa gttgttggtg ttgtaggtac tggtca 36
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 LBS_LDH_R_1
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基 dC
<400> 47
cctttgcgcc gaaaccttcc 20
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 CVS_rRNA_F_1
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (25)..(25)
<223> 叔丁基苄基 dC
<400> 48
caacggatct cttggttctc gcatc 25
<210> 49
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 CVS_rRNA_R_1
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (19)..(19)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 49
gggcgcaatg tgcgttcaa 19
<210> 50
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 CVS_rRNA_Pb_1
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` JA270
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (10)..(11)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 50
ctgcaattca tattacgtat cgcatttcgc tgcgtt 36
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 CVS_rRNA_F_2
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (21)..(21)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 51
gcgagagacc gatagcgaac a 21
<210> 52
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 CVS_rRNA_R_2
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (24)..(24)
<223> 叔丁基苄基 dC
<400> 52
gcccttccct ttcaacaatt tcac 24
<210> 53
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 CVS_rRNA_Pb_2
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` JA270
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (10)..(11)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 53
tttcactctc ttttcaaagt tcttttcatc tttccatcac tgtac 45
<210> 54
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 CAPT_rRNA_F_1
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (32)..(32)
<223> 叔丁基苄基 dC
<400> 54
aatgcgatac gtaatatgaa ttgcagatat tc 32
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 CAPT_rRNA_R_1
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (24)..(24)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 55
tttgagggag aaatgacgct caaa 24
<210> 56
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 CAPT_rRNA_Pb_1
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` JA270
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (10)..(11)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 56
atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgccctt tgg 33
<210> 57
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 CAPT_rRNA_F_6
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (27)..(27)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 57
aagaaaccaa cagggattgc cttagta 27
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 CAPT_rRNA_R_6
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (24)..(24)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 58
tcatctcatc gcacgggatt ctca 24
<210> 59
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 CAPT_rRNA_Pb_6
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` JA270
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (10)..(11)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 59
agttgtaatt tgaagaaggt atctttgggt ctggctcttg tcta 44
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 KRUS_rRNA_F_1
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (23)..(23)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 60
tcgtgaatca tcgagttctt gaa 23
<210> 61
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 KRUS_rRNA_R_1
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (16)..(16)
<223> 叔丁基苄基 dC
<400> 61
acacgtcgtc cgctcc 16
<210> 62
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 KRUS_rRNA_Pb_1
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` JA270
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (10)..(11)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 62
tttgagcgtc gtttccatct tgcgcg 26
<210> 63
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 GLAB_rRNA_F_1
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (25)..(25)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 63
aagtaaactc cactgtgtgt agtaa 25
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 GLAB_rRNA_R_1
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 64
agtgtgcgtg gatctctcta 20
<210> 65
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 GLAB_rRNA_Pb_1
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` JA270
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (10)..(11)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 65
agtgtcgagt cgtgtgataa aacacctcct ttgg 34
<210> 66
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 AVAG_23s_Pb_2_H_Q6
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 66
aagcatctaa gcgggaagcc catccca 27
<210> 67
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 AVAG_23S_F_5
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (19)..(19)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 67
gccccagtca aactaccca 19
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 AVAG_23S_R_5
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (3)..(3)
<223> 7-脱氮 dG
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (21)..(21)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 68
tgggagactg tgaactggag a 21
<210> 69
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 AVAG_23S_Pb_5
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (4)..(4)
<223> 7-脱氮 dG
<220>
<221> misc_特征
<222> (7)..(8)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (27)..(27)
<223> 7-脱氮 dG
<400> 69
aagggttagg atgccgaaac gtcgagggt 29
<210> 70
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 AVAG_23S_F_3
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (19)..(19)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 70
cggtcccctt cccggatta 19
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 AVAG_23S_R_6
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (23)..(23)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 71
cgtgaacctt tactgcagct tga 23
<210> 72
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 AVAG_tufA_Pb_4
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (7)..(8)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 72
aggctcctga agagcgtcaa cgtggt 26
<210> 73
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 LBS_LDH_R_3
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (28)..(28)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 73
cataaatact tgaccaatgt gaccagta 28
<210> 74
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 LBS_LDH_PB_3
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` FAM
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (8)..(9)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 74
tgaagttcgt gaccaagttg ttggtgttgt aggtac 36
<210> 75
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 CVS_rRNA_Pb_3
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` JA270
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (9)..(10)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 75
tttcactctc ttttcaaagt gcttttcatc tttccttcac agtac 45
<210> 76
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 CAPT_rRNA_F_2
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (29)..(29)
<223> 叔丁基苄基 dC
<400> 76
agtccgagtt gtaatttgaa gaaggtatc 29
<210> 77
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 CAPT_rRNA_R_2
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (23)..(23)
<223> 叔丁基苄基 dC
<400> 77
tgcattccca aacaactcga ctc 23
<210> 78
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 CAPT_rRNA_Pb_2
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` JA270
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (10)..(11)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 78
acgtcacaga gggtgagaat cccgtgcg 28
<210> 79
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 KRUS_rRNA_F_3
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (24)..(24)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 79
ggtaattcca gctccaatag cgta 24
<210> 80
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 KRUS_rRNA_R_3
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (25)..(25)
<223> 叔丁基苄基 dC
<400> 80
gcctgctttg aacactctaa tttcc 25
<210> 81
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 KRUS_rRNA_PB_3
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` JA270
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (8)..(9)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 81
taagcactgt tgcggccggg tctttcc 27
<210> 82
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 KRUS_rRNA_F_4
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (25)..(25)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 82
agttgttgca gttaaaaagc tcgta 25
<210> 83
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 KRUS_rRNA_R_4
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (33)..(33)
<223> 叔丁基苄基 dC
<400> 83
gcgtcctatt ctattattcc atgctaatat atc 33
<210> 84
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 Egg_16s_F_1
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (6)..(6)
<223> 7-脱氮 dG
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (19)..(19)
<223> 叔丁基苄基 dC
<400> 84
aactgggagg ctcgagttc 19
<210> 85
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 Egg_16s_R_1
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (23)..(23)
<223> 叔丁基苄基 dC
<400> 85
ccatcggtgt tcttcccgat atc 23
<210> 86
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 Egg_16s_Pb_1
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 86
aggcaggcgg aattcccggt gtagc 25
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 Egg_16s_F_2
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 87
ggaggctcga gttcggtaga 20
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 Egg_16s_R_2
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (21)..(21)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 88
ccatcggtgt tcttcccgat a 21
<210> 89
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 Egg_16s_Pb_2
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (7)..(8)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 89
acaccgggaa ttccgcctgc ctc 23
<210> 90
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 Prev_16s_F_1
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (6)..(6)
<223> 7-脱氮 dG
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (18)..(18)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 90
ggatggggat gcgtctga 18
<210> 91
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 Prev_16s_R_1
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (21)..(21)
<223> 叔丁基苄基 dC
<400> 91
gtttggaccg tgtctcagtt c 21
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 Prev_16s_R_2
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基 dC
<400> 92
cctcccgtag gagtttggac 20
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 Prev_16s_R_3
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 93
gcctcccgta ggagtttgga 20
<210> 94
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 Prev_16s_Pb_2
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (7)..(8)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 94
tcagtagggg ttctgagagg aaggtcccc 29
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 Prev_16s_F_4
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 95
tcaaatcagc acggccctta 20
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 Prev_16s_F_5
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 96
ccaccgtaag gtgtgaggaa 20
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 Prev_16s_F_6
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 97
ccaccgcaag gtgcgaggaa 20
<210> 98
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 Prev_16s_R_4
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (15)..(15)
<223> 叔丁基苄基 dC
<400> 98
gcacccccgg ctttc 15
<210> 99
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 Prev_16s_R_5
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (16)..(16)
<223> 叔丁基苄基 dC
<400> 99
ggcacccccg gctttc 16
<210> 100
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 Prev_16s_R_6
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (19)..(19)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 100
catggctgat gcgcgatta 19
<210> 101
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 Prev_16s_Pb_4
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> misc_特征
<222> (7)..(8)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 101
accccacgaa gctggattcg ctagtaatcg c 31
<210> 102
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 Prev_16s_Pb_5
<220>
<221> misc_特征
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_特征
<223> 3` 间隔区-C3 阻滞剂
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (1)..(1)
<223> 7-脱氮 dG
<220>
<221> misc_特征
<222> (8)..(9)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 102
ggtctgcaac ccgaccccac gaagctgga 29
Claims (18)
1.一种检测样品中的多种细菌性阴道病相关(BV相关)细菌的方法，其中所述多种BV相关细菌为乳酸杆菌属物种、阴道加德纳氏菌和下组中的至少一者，所述组选自：阴道阿托波氏菌、1型巨球型菌、伊格尔兹氏菌属物种、普雷沃氏菌属物种和细菌性阴道病相关细菌BVAB-2，所述方法包括：
a)进行扩增步骤，所述扩增步骤包括使所述样品与一组引物接触以产生扩增产物，如果来自所述BV相关细菌的核酸存在于所述样品的话；
b)进行杂交步骤，所述杂交步骤包括使每种扩增产物与一种或多种可检测探针接触；以及
c)检测每种扩增产物的存在情况，其中所述扩增产物的存在指示所述样品中所述BV相关细菌的存在；
其中从乳酸杆菌属物种产生扩增产物的所述一组引物包含正向引物，所述正向引物包含选自SEQ ID NO：38、41或44的寡核苷酸序列；和反向引物，所述反向引物包含选自SEQ IDNO：39、42或45、47或73的寡核苷酸序列；并且所述一种或多种可检测探针包含选自SEQ IDNO：40、43、46和74的寡核苷酸序列；
其中从阴道加德纳氏菌产生扩增产物的所述一组引物包含正向引物，所述正向引物包含选自SEQ ID NO：1、4、5、8或11的寡核苷酸序列；和反向引物，所述反向引物包含选自SEQID NO：2、6、9或12的寡核苷酸序列；并且一种或多种可检测寡核苷酸探针包含选自SEQ IDNO：3、7、10和13的寡核苷酸序列；
其中从阴道阿托波氏菌产生扩增产物的所述一组引物包含正向引物，所述正向引物包含选自SEQ ID NO：14、17、20、67或70的寡核苷酸序列；和反向引物，所述反向引物包含选自SEQ ID NO：15、18、21、68或71的寡核苷酸序列；并且所述一种或多种可检测探针包含选自SEQ ID NO：16、19、22、66、69和72的寡核苷酸序列；
其中从1型巨球型菌产生扩增产物的所述一组引物包含正向引物，所述正向引物包含选自SEQ ID NO：23、26或27的寡核苷酸序列；和反向引物，所述反向引物包含选自SEQ IDNO：24或28的寡核苷酸序列；并且所述一种或多种可检测探针包含选自SEQ ID NO：25和29的寡核苷酸序列；
其中从伊格尔兹氏菌属物种产生扩增产物的所述一组引物包含正向引物，所述正向引物包含选自SEQ ID NO：84或87的寡核苷酸序列；和反向引物，所述反向引物包含选自SEQID NO：85或88的寡核苷酸序列；并且所述一种或多种可检测探针包含选自SEQ ID NO：86和89的寡核苷酸序列；
其中从普雷沃氏菌属物种产生扩增产物的所述一组引物包含正向引物，所述正向引物包含选自SEQ ID NO：90、95、96或97的寡核苷酸序列；和反向引物，所述反向引物包含选自SEQ ID NO：91、92、93、98、99或100的寡核苷酸序列；并且所述一种或多种可检测探针包含选自SEQ ID NO：94、101和102的寡核苷酸序列；并且
其中从BVAB-2产生扩增产物的所述一组引物包含正向引物，所述正向引物包含选自SEQ ID NO：30或33的寡核苷酸序列；和反向引物，所述反向引物包含选自SEQ ID NO：31、34或36的寡核苷酸序列；并且所述一种或多种可检测探针包含选自SEQ ID NO：32、35和37的寡核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多种BV相关细菌为乳酸杆菌属物种、阴道加德纳氏菌和阴道阿托波氏菌；
其中从乳酸杆菌属物种产生扩增产物的所述一组引物包含正向引物，所述正向引物包含选自SEQ ID NO：38、41或44的寡核苷酸序列；和反向引物，所述反向引物包含选自SEQ IDNO：39、42或45、47或73的寡核苷酸序列；并且所述一种或多种可检测探针包含选自SEQ IDNO：40、43、46和74的寡核苷酸序列；
其中从阴道加德纳氏菌产生扩增产物的所述一组引物包含正向引物，所述正向引物包含选自SEQ ID NO：1、4、5、8或11的寡核苷酸序列；和反向引物，所述反向引物包含选自SEQID NO：2、6、9或12的寡核苷酸序列；并且所述一种或多种可检测寡核苷酸探针包含选自SEQID NO：3、7、10和13的寡核苷酸序列；并且
其中从阴道阿托波氏菌产生扩增产物的所述一组引物包含正向引物，所述正向引物包含选自SEQ ID NO：14、17、20、67或70的寡核苷酸序列；和反向引物，所述反向引物包含选自SEQ ID NO：15、18、21、68或71的寡核苷酸序列；并且所述一种或多种可检测探针包含选自SEQ ID NO：16、19、22、66、69和72的寡核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其中从乳酸杆菌属物种产生扩增产物的所述一组引物包含正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO：44的寡核苷酸序列；和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO：45的寡核苷酸序列；并且所述一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：46的寡核苷酸序列；并且
从阴道加德纳氏菌产生扩增产物的所述一组引物包含正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO：11的寡核苷酸序列；和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO：12的寡核苷酸序列；并且所述一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：13的寡核苷酸序列；并且
从阴道阿托波氏菌产生扩增产物的所述一组引物包含正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO：20的寡核苷酸序列；和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO：21的寡核苷酸序列；并且所述一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：72的寡核苷酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述杂交步骤包括使所述扩增产物与所述可检测探针接触，所述可检测探针用供体荧光部分和对应的受体部分进行标记；并且检测步骤包括检测所述探针的所述供体荧光部分和所述受体部分之间的荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在，其中荧光的存在或不存在指示所述样品中所述BV相关细菌的存在或不存在。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述扩增步骤采用具有5′至3′核酸酶活性的聚合酶。
6.一种检测样品中的外阴阴道念珠菌病(VVC)相关念珠菌属物种的方法，其中所述VVC相关念珠菌属物种包括白色念珠菌、热带念珠菌、都柏林念珠菌和近平滑念珠菌(统称为念珠菌属物种)，以及克柔念珠菌和光滑念珠菌，所述方法包括：
a)进行扩增步骤，所述扩增步骤包括使所述样品与一组引物接触以产生扩增产物，如果来自VVC相关念珠菌的核酸存在于所述样品的话；
b)进行杂交步骤，所述杂交步骤包括使每种扩增产物与一种或多种可检测探针接触；以及
c)检测每种扩增产物的存在情况，其中所述扩增产物的存在指示所述样品中所述VVC相关念珠菌的存在；
其中从念珠菌属物种产生扩增产物的所述一组引物包含正向引物，所述正向引物包含选自SEQ ID NO：48、51、54、57或76的寡核苷酸序列；和反向引物，所述反向引物包含选自SEQ ID NO：49、52、55、58或77的寡核苷酸序列；并且所述一种或多种可检测探针包含选自SEQ ID NO：50、53、56、59、75和78的寡核苷酸序列；
其中从克柔念珠菌产生扩增产物的所述一组引物包含正向引物，所述正向引物包含选自SEQ ID NO：60、79或82的寡核苷酸序列；和反向引物，所述反向引物包含选自SEQ ID NO：61、80或83的寡核苷酸序列；并且所述一种或多种可检测探针包含选自SEQ ID NO：62和81的寡核苷酸序列；并且
其中从光滑念珠菌产生扩增产物的所述一组引物包含正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO：63的寡核苷酸序列；和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO：64的寡核苷酸序列；并且所述一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：65的寡核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的方法，其中从念珠菌属物种产生扩增产物的所述一组引物包含正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO：76的寡核苷酸序列；和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO：77的寡核苷酸序列；并且所述一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：78的寡核苷酸序列；并且从克柔念珠菌产生扩增产物的所述一组引物包含正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO：79的寡核苷酸序列；和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO：80的寡核苷酸序列；并且所述一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：81的寡核苷酸序列。
8.根据权利要求6至7中任一项所述的方法，其中所述杂交步骤包括使所述扩增产物与所述可检测探针接触，所述可检测探针用供体荧光部分和对应的受体部分进行标记；并且检测步骤包括检测所述探针的所述供体荧光部分和所述受体部分之间的荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在，其中荧光的存在或不存在指示所述样品中所述VVC相关念珠菌的存在或不存在。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其中所述扩增步骤采用具有5′至3′核酸酶活性的聚合酶。
10.一种同时检测样品中的乳酸杆菌属物种、阴道加德纳氏菌、阴道阿托波氏菌和下组中的至少一者的方法，所述组选自：念珠菌属物种、克柔念珠菌和光滑念珠菌，所述方法包括：
a)进行扩增步骤，所述扩增步骤包括使样品与一组引物接触以产生扩增产物，如果来自乳酸杆菌属物种、阴道加德纳氏菌、阴道阿托波氏菌和下组中的至少一者的核酸存在于所述样品的话，所述组选自：念珠菌属物种、克柔念珠菌和光滑念珠菌；
b)进行杂交步骤，所述杂交步骤包括使每种扩增产物与一种或多种可检测探针接触；以及
c)检测每种扩增产物的存在情况，其中所述扩增产物的存在指示所述样品中乳酸杆菌属物种、阴道加德纳氏菌、阴道阿托波氏菌和下组中的至少一者的存在，所述组选自：念珠菌属物种、克柔念珠菌和光滑念珠菌；
其中从乳酸杆菌属物种产生扩增产物的所述一组引物包含正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO：44的寡核苷酸序列；和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO：45的寡核苷酸序列；并且所述一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：46的寡核苷酸序列；并且从阴道加德纳氏菌产生扩增产物的所述一组引物包含正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO：11的寡核苷酸序列；和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO：12的寡核苷酸序列；并且所述一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：13的寡核苷酸序列；并且从阴道阿托波氏菌产生扩增产物的所述一组引物包含正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO：20的寡核苷酸序列；和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO：21的寡核苷酸序列；并且所述一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：72的寡核苷酸序列；并且
其中从念珠菌属物种产生扩增产物的所述一组引物包含正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO：76的寡核苷酸序列；和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO：77的寡核苷酸序列；并且
所述一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：78的寡核苷酸序列；并且从克柔念珠菌产生扩增产物的所述一组引物包含正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO：79的寡核苷酸序列；和
反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO：80的寡核苷酸序列；并且所述一种或多种可检测探针包含SEQ ID NO：81的寡核苷酸序列；并且从光滑念珠菌产生扩增产物的所述一组引物包含正向引物，所述正向引物包含SEQ ID NO：63的寡核苷酸序列；和反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO：64的寡核苷酸序列；并且所述一种或多种可检测探针包含SEQ IDNO：65的寡核苷酸序列。
11.一种用于检测样品中细菌性阴道病相关(BV相关)细菌的试剂盒，所述试剂盒包括：
-正向引物，所述正向引物包含选自由SEQ ID NO：1、4、5、8、11、14、17、20、23、26、27、30、33、38、41、44、67、70、84、87、90、95、96和97组成的组的第一寡核苷酸序列；
-反向引物，所述反向引物包含选自由SEQ ID NO：2、6、9、12、15、18、21、24、28、31、34、36、39、42、45、47、68、71、73、85、88、91、92、93、98、99和100组成的组的第二寡核苷酸序列；以及
-探针，所述探针包含选自SEQ ID NO：3、7、10、13、16、66、69、19、22、72、25、29、32、35、37、40、43、46、74、86、89、94、101和102组成的组的第三可检测地标记的寡核苷酸序列，或其互补序列；所述探针被配置为与由所述正向引物和所述反向引物所产生的扩增子杂交。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述第三可检测地标记的寡核苷酸序列包含供体荧光部分和对应的受体部分。
13.根据权利要求11至12中任一项所述的试剂盒，其进一步包含三磷酸核苷、核酸聚合酶和所述核酸聚合酶的功能所需的缓冲剂。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸序列、所述第二寡核苷酸序列和所述第三寡核苷酸序列中的至少一者包含至少一个经修饰的核苷酸。
15.一种用于检测样品中的外阴阴道念珠菌病(VVC)相关念珠菌属物种的试剂盒，所述试剂盒包括：
-正向引物，所述正向引物包含选自由SEQ ID NO：48、51、54、57、76、60、79、82和63组成的组的第一寡核苷酸序列；
-反向引物，所述反向引物包含选自由SEQ ID NO：49、52、55、58、77、61、80、83和64组成的组的第二寡核苷酸序列；以及
-探针，所述探针包含选自由SEQ ID NO：50、53、75、56、59、78、62、81和65组成的组的第三可检测地标记的寡核苷酸序列，或其互补序列；所述探针被配置为与所述正向引物和所述反向引物所产生的扩增子杂交。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中所述第三可检测地标记的寡核苷酸序列包含供体荧光部分和对应的受体部分。
17.根据权利要求15至16中任一项所述的试剂盒，其进一步包含三磷酸核苷、核酸聚合酶和所述核酸聚合酶的功能所需的缓冲剂。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸序列、所述第二寡核苷酸序列和所述第三寡核苷酸序列中的至少一者包含至少一个经修饰的核苷酸。
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