KR900003379A - 표적 핵산 서열의 증폭 및 검정법 - Google Patents

표적 핵산 서열의 증폭 및 검정법 Download PDF

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Abstract

내용 없음

Description

표적 핵산 서열의 증폭 및 검정법
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음
제1도는 각각의 프라이머가 반응성 쌍의 원(member)에 연결된 두개의 프라이머를 사용한, 본 발명의 첫번째 실시양태를 도시한 것이다.

Claims (20)

  1. (a) 각각의 표적과 이의 상보(complementary) 쇄에 올리고뉴클레오티드 프라이머(primers)(이중 하나는 반응성 쌍의 환원(member)에 접합되고, 다른 하나는 검정가능한 잔기에 접합되거나 이 잔기와 반응할 수 있다)를 하이브리드화하고;(b) 각 프라이머로부터, 각 핵산 쇄에 대한 상보적인 연장 서열을 합성시키면, 각 프라이머의 연장 서열은 이 서열이 이의 보체(complement)로부터 분리될때 다른 프라이머로 부터 연장서열을 합성하기 위한 주형(template)을 형성시키고;(c) 프라이머 연장 서열이 합성되기 시작하여 일본- 쇄(single-stranded) 분자를 형성할 때 이 연장 서열을 주형으로부터 부리시키며;(d) 단계(c)로부터 생성된 일본-쇄 분자들, 프라이머 연장 서열을 주형으로서 단계(c)에서 생성된 각각의 일본 쇄를 사용하여 합성시켜 이본-쇄(double-stranded)서열을 수득하는 조건하에서, 단계(a)의 프라이머로 처리시키고; (e)단계(c)로부터의 상기 이본-쇄 서열을, 적어도 하나의 상기 반응성 쌍중 한 원이 결합된 고체상에 포획시켜, 상기 이본-쇄 서열이 상기 반응성 쌍으로 고체사엥 연결되게 하며;(f)이 고체상에 결합된 겸정가능한 잔기를 검정함을 특징으로 하여, 샘물중의 표적 핵산 서열을 증폭시키고(amplifying)검정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계(a)의 다른 프라이머가 검정 가능한 잔기에 직접 접합되는 방법.
  3. 제1항에 있어서,단계(a)의 두개중 다른 하나의 프라이머가 두번째 반응성 쌍의 첫번째 원에 접합되는 (이때, 상기 두번쩨 쌍의 두번째 원은 검정 가능한 잔기에 적합되며, 단계(f) 이전의 방법은 상기 이본 - 쇄 서열을 상기 두번째 쌍의 두번째 원으로 처리시킴을 추가로 포함한다)방법.
  4. 제3항에 있어서, 반응성 쌍이 항체 및 항원, 바이오틴 및 아비딘, 효소 및 효소 수용체, 탄수화물 및 렉틴, 바이오틴 및 안티바이오틴, 및 상조 DNA쇄의 쌍중에서 선택되는 방법.
  5. (a) 증폭된 표적의 상보쇄에 한쌍의 제2롤리고뉴클레오티드 프라이머를 하이브리드화하면, 제2프라이머 각각 은 상이한 반응성 쌍의 첫번째 원에 연결되고,(b) 각각의 제 2프라이머로부터, 표적 핵산 쇄에 대해 상보적인 연장 서열을 합성시키면, 각 프라이머의 연장 서열은 이 서열이 이의 보체로부터 분리될때 다른 프라이머로 부터 연장 서열을 합성하기 위한 주형을 형성시키고;(c) 프라이머 연장 서열이 합성되기 시작하여 일본-쇄 분자를 형성할때 이 연장 서열을 주형으로부터 분리시키며; (d)단계(c)로부터의 일본-쇄 분자를,프라이머 연장 서열을 주형으로서 단계(c)에서의 일본-쇄를 사용하여 합성시켜 이본-쇄 서열을 수득하는 조건하에서, 단계(a)의 프라이머로 처리시키고;(e)단계(c)로부터의 상기 이본- 쇄 서열을, 상기 반응성 쌍중 하나의 두번째 원이 결합된 고체상에 포획시켜, 상기 이본-쇄 서열이 상기 반응성 쌍으로 고체상에 연결되게 하며;(f)단계(e)의 전후 또는 단계돈안, 단계(c)의 이본-쇄 서열을 검정가능한 상기 반응성 쌍중 다른 하나의 두번째 원으로 처리시키는데, 이때 두번재 원은 이본-쇄 서열상의 반응성 쌍중 다른 하나의 첫번째 원과 반응성이 있어 이와 함께 연결되고;(g) 고체 상에 결합된 검정가능한 두번째 원을 검정함으로써 증폭된 표적쇄 서열이 존재하는지의 여부를 지시함을 특징으로 하여, 샘플중의 이본-쇄 표적 핵산 서열을 추가로 증폭시키고 증폭된 상기 핵산 서열을 검정하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 첫번째 증폭을 한쌍의 제1올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄반응(PER)으로 수행하는 방법.
  7. 제1항 또는 5항에 있어서,단계(c) 및 (d)가 1회 이상 반복되는 방법.
  8. 샘플중의 표적 올리고뉴클레오티드 서열을 증폭 및 검정하는 방법(여기서, 각 표적 서열에 대해 두개의 제1프라이머를 사용하는데, 이중 하나는 표적 서열과 하이브리드화시키고,다른 하나는 이의 보체와 하이브리드화시켜 표적 및 이의 보체에 대해 상보적인 제1연장 서열을 수득하며, 이때 제1연장 서열은 제1프라리머로부터 추가의 제1연장 서열을 합성시키기 위한 주형을 형성시킨다)에 있어서, 제1프라이머와 표적 서열과 반응 동안 또는 반응후, 제1연장 서열을, 적어도 하나의 제1연장 서열과 3' 위치에서 제1프라이머이 말단 위치까지 하이브라드롸 할수 있는 하나 이상의 부가의 제2프라이머로 처리시켜 제2연장 서열을 수득하는데, 이때 제2프라이머는 첫번째 반응성 쌍의 한원에 연결되과; 제2연장 서열이 형성되었는지를 검정함을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 제1연장 서열이 적어도 두개의 제2프라이머(이중 하나는 첫번째 반응성 쌍의 한원에 연결되고, 다른 하나는 두번째 반응성 쌍의 한원에 연결된다)로 처리되는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 적어도 하나의 첫번째 및 두번째 반응성 쌍이 검정가능한 잔기와 반응성이 있고, 제2연장 서열이, 상기 검정가능한 상기 반응성 쌍과 반응시켜 감정가능한 잔기를 검정함으로써 검정되는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 적어도 하나의 제2프라이머가 특이적 결합쌍중 한원과 결합되고, 제2연장 서열이, 제2서열을 상기 특이적 결합 쌍의 또다른 원이 연결된 고체상으로 분리시키고, 제2연장 서열이 상기 고체상에 포획되었는지의 여부를 검정함으로써 검정되는 방법.
  12. 제8항에 있어서, 적어도 하나의 제1프라이머가 두번째 반응성 쌍의 한원에 연결되는 방법.
  13. 제3,9 또는 12항에 있어서, 반응성 쌍의 첫번째 원에 접합된 프라이머 둘다가 공통의 두번째 원과 반응성이 있는 원의 접합되는 방법.
  14. 샘플중의 표적 올리고뉴틀레오티드 서열을 증폭 및 검정하는 방법(여기서, 각 표적 서열에 대해 적어도 두개의 프라이머를 사용하는데, 이중 하나는 표적 서열과 하이브리드화시키고, 다른 하나는 이의 보체와 하이브리드화시켜 표적 및 이의 보체에 대해 상보적인 연장 서열을 수득하며, 이때 연장 서열은 프라이머로 부터 추가의 연장 서열을 합섭하기 위한 주형을 형성시킨다)에 있어서, 적어도 하나의 상기 프라이머를 반응성 쌍의 첫번째 원에 연결시키고, 상기 반응성 쌍의 두번째 원이 결합된 고체상으로 상기 연장 서열을 상기 샘플로부터 분리시키며, 상기 프라이머중 다른 하나를 검정함을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 프라이머중 다른 하나에 이에 직접 연결된 검정가능한 표지를 제공함으로써 상기 고체상으로 분리된 연장 서열을 상기 표지로 검정할 수 있음을 추가로 포함하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 반응성 쌍이 항체 및 항원, 바이오틴 및 아비딘, 탄수화물 및 렉틴, 및 효소 및 효소 수용체중에서 선택되는 방법.
  17. (A)적어도 두개의 프라이머(이중 하나의 프라이머는 상기 표적 서열에 상보적이고, 다른 하나의 프라이머는 표적-상보적 서열에 상보적이며, 프라이머 연장 서열을 상기 프라이머로부터 합성시켜 각 연장 서열이 프라이머로부터 추가의 연장 서열을 합성하기 위한 주형을 형성시키며, 이때 적어도 하나의 상기 프라리머는 이에 연결된 반응성 쌍원을 갖는다); (B)DNA폴라머라제; 및(C) 하나의 프라이머상의 반응성 쌍원에 결합될 될 수 있는 반응성 쌍의 한원이 연결된 고체상을 포함하는, 표적 핵산 서열의 증폭 및 검정용 키트(kit)
  18. 제17항에 있어서, 두개중 다른 하나의 프라이머가 두번째 반응성 쌍의 첫번째 원에 연결되는 키트.
  19. 제18항에 있어서, 두번째 반응성 쌍의 두번째 원에 연결된 검정가능한 잔기를 포함하는 접합체를 추가로 포함하는 키트.
  20. 제17항에 있어서, 두개중 다른 하나의 프라이머가 검정가능한 표지에 연결된 키트.
    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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