JP2001503742A - ヌクレオチドを標識付けする方法、標識ヌクレオチド及び有用な中間体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明によればヌクレオチドを標識付けする改良された方法が提供される。ヌクレオチドを標識付けする本発明の方法はリンカの反応性成分をスペーサの電子供与成分と反応させる工程と、スペーサの反応性成分を標識と反応させる工程と、リンカの他の反応性成分をヌクレオチドと反応させる工程とを包有し、リンカは安定化ブリッジおよび２個の反応性成分を有する白金化合物であり、スペーサが鎖内に少なくとも４個の原子と少なくとも１個のヘテロ原子とからなり、スペーサは更に鎖の一端部に電子供与成分をまた鎖の他端部に反応性成分を有している。本発明の顕著な利点は、すべてのヌクレオチドが本発明の方法により標識付け可能になり、一方これまで標識の結合が通常は１個あるいは複数のヌクレオチドに制限されることにある。

Description

【発明の詳細な説明】 ヌクレオチドを標識付けする方法、標識ヌクレオチド 及び有用な中間体 （技術分野） 本発明は（白金化合物を基材とし標識と生物有機分子との間の成分を結合した ）リンカを用いてヌクレオチドを標識付けする方法に関する。 （背景技術） 白金（配位子）化合物は極めて長期間開発が求められてきた。これらの化合物 及びこれらの化合物の使用についてはリージック等（構造及び結合６７、ページ ５３−８９、１９８７）に開示されている。特にシス白金は腫瘍予防薬として大 きな期待を受けて来た。この腫瘍予防薬の白金化合物との反応性は少なくとも２ の反応基（好ましくは互いにシス配向された）を有することが前提とされていて 、これによりＤＮＡ分子を架橋することが可能であり、ＤＮＡ分子の反復利用が 禁止される。 英国特許出願第２ １４８ ８９１号には６座標を有するシス白金錯体が開示 されている。白金は１，２−ジアミノー２−メチルプロパンあるいは１，２−ジ アミノ−２−メチルブタンのような、白金２ハロゲンあるいはヒドロキシ基、更 に２ハロゲン、及びエチレンジアミン誘導基に結合される。これらの錯体は優れ た腫瘍予防効果を有するものと識知されている。 この欧州特許出願では、白金の２，３−アルキル−１，４ −ブタンジアミン及び２ハロゲンに対する４−座標錯体による腫瘍予防効果が明 示されている。 異なる４座標白金錯体が欧州特許出願第０ ３８６ ２４３号に開示される。 この錯体はジアミン・ビデンテート配位子および２−アリール・アルカノイック 酸、あるいは３−アリール−２−オキソアルカノイック酸配位子からなる。これ らの錯体はある白血病セルに対し高い成長禁止作用をすると考えられていてオン コスタチック活動に使用される。 米国特許出願第４，２０７，４１６号には高い腫瘍予防活動および低い哺乳類 有毒性を有するエチレンジアミン白金(１１)２，４−ジオキソピリミジン錯体が 開示されている。 白金（配位）化合物の別の使用がＰＣＴ出願（ＷＯ９２／０１６９９）に開示 され、この場合（内部で基を離れるものとして示される）２反応成分のみを有す る白金化合物はフルオレスセインと反応して、グアニン残分の好ましくはN-7位 置でヌクレイン酸に対し（非共有）結合可能な標識白金化合物が得られる。 ヌクレオチドを標識付けする数種の方法が文献に説明されている。長期間これ らの標準的な方法では放射性同位体標識を使用する。一方放射性同位体の使用に 関連しては潜在的な健康への危険性、処理問題および不安定性などの多様の問題 がある。 これらの問題を解決するため、デール等による生化学、１４、（１９７５）、 ２４４７−２４５７によれば、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの標識付け 技術として直接共有 水銀処理が使用される。シトシンおよびウラシルは緩条件下でC5位置で水銀処理 され得ることが判明した。更にジベヤッフ等による「ヌクレイン酸研究」、１５ 、（１９８７）４５１３−４５３４には、アデニンおよびシトシンが３〜１７原 子の脂肪族リンカを介しビオチン誘導体で標識付けされることが報告されている 。 これらの周知な方法の顕著な欠点はこれらの方法がすべての異なるヌクレオチ ドを標識付けするのに好適ではないことにある。例えばデール等によるこれらの 共有水銀処理法によれば結果としてアデニン、チミンおよびグアニン塩基に対し 不良の結果となることが報告されている。ある場合例えば、あるヌクレオチドの 僅かな２−３の残分があるヌクレイン酸内に存在する場合、またはヌクレイン酸 の末端基とするヌクレオチド残分を標識付けする必要であるい場合、自由にヌク レオチド残分を標識付けする方法を使用できることが望ましい。 （発明の開示） 本発明によれば、このような望ましい方法が提供される。この本発明によるヌ クレオチドの標識付け方法は下記の構造式（Ｉ）のリンカの反応性成分を反応さ せる工程と、スペーサの反応性成分を標識と反応させる工程と、リンカの他の反 応性成分をヌクレオチドと反応させる工程とを包有する。 、ここに、Ｘは安定化ブリッジを示し、ＡおよびＢは同一あるいは異なる反応性 成分を示し、電子はスペーサの成分を示し、スペーサは少なくとも４個の原子を 有する１個の鎖及び鎖内において少なくとも１個のヘテロ原子からなり、スペー サは更に鎖の一端部に電子供与成分および鎖の他端部に反応性成分を有する。 本発明によればリンカはまずヌクレオチドに、次にスペーサに対しあるいは逆 に結合され得、スペーサは先ず標識に、次にリンカにあるいは逆に結合され得る 。 スペーサの反応性成分は、標識およびスペーサからなる標識付け成分が形成さ れ、この標識付け成分が十分に安定であるように、スペーサと標識との間の反応 を可能にする反応性成分にできる。 ヌクレオチドを標識付けする主な目的は、これらの標識ヌクレオチドがヌクレ イン酸分子内に含ませ得ることにある。変性ヌクレオチド、特に（嵩が大の）標 識が付けられたヌクレオチドと結合されるヌクレオチドは極めて低い効率でヌク レイン酸内に組み込まれる場合が多い。本発明による方法によれば、標識ヌクレ オチドがこれまで入手可能な標識ヌクレ オチドよってヌクレイン酸内により高い効率で組み込まれる結果になる。これは 本発明による白金を基材とするリンカと組み合わせて本発明によるスペーサを選 択できよう。 本発明により使用できる標識は重要ではない。原理上、ヌクレオチドと結合で き、これまで採用されるすべての標識が使用できる。これらの標識としては、放 射性標識、酵素（検出対象の基質と反応する必要がある）、特定の結合対成分、 例えばアビディン、スレプトアビディンあるいはビオチン、ビオシチン、イミノ ビオチン、コロイド塗料物質、フルオロクロム（ロダミン等）、還元物質（エオ シン、エリトロシン等）（着色された）ラテックスゾル、ジグオキシゲニン、金 属（ルテニウム）、金属ゾルあるいは他の微粒子ゾル（セレン、炭素等）、ダン シルリシン、プロテインＡ、プロテインＧ等を使用できる。本発明はビオシチン 、アビディン、スレプトアビディン、ジグオキシゲニンあるいはその機能等価物 に対し最大の利点を有する。 本発明はヌクレオチドやヌクレオシドに限らず、例えばその誘導体および機能 等価物も使用できる。通常のヌクレオチドアデニン、チミディン、プリン、グア ニンおよびユリディンも好ましい。特に極めて良好な編入速度を有するプリンは 好適である。 スペーサを白金リンカと結合するため、電子供与成分が必要である。好ましい 方法によれば、電子供与成分はアミンあるいはチオレートアニオンであり、共に 極めて有効であることが判明している。イミダゾール若しくはプリンのような芳 香族アミンが白金に対し極めて強い結合力を形成でき、電子供与成分として好適 に使用できることが判明している。 スペーサは本発明の重要な実施態様であり、スペーサにより標識とリンカとが 最大に容易に結合できる。ヌクレオチドをヌクレイン酸内に組入れする際の立体 障害を避けるため、長さが少なくとも４原子である必要があり、好ましくは長さ が少なくとも４炭素原子であり、炭素鎖内に少なくとも１ヘテロ原子を有する。 ヘテロ原子はスペーサにある量の剛性を付与する。この剛性により、立体因子が ヌクレオチドおよび標識の好適な結合を妨げないことを更に保証される。少なく とも１ヘテロ原子は酸素原子であり、この原子はスペーサの親水性に影響を与え ることが好ましい。 好ましくはスペーサは鎖に２０炭素原子のみからなり、この鎖は実質的に分岐 のない鎖であるので、立体障害が生じない。この理由は明らかであろう。 極めて好ましいスペーサはここにダドーと呼ばれる１，８−ジアミノ−３，６ −ジオキサオクタンである。ダドーは極めて柔軟な化合物であり、第１アミン基 を有し本発明によるスペーサとして極めて好適に使用可能なサイズを有している 。 本発明による別の極めて好適なスペーサはオリゴリシンまたはポリリシンであ る。これらの構造および立体配座のため、これらの分子は実際の標識、ヌクレオ チド及び白金間で最適な相互作用のための最高の好適な環境を作る。スペーサと してリシン鎖を使用する別の利点は、鎖内のリシン構造単位 の数を変えることにより、特定の標識およびヌクレオチド、あるいはヌクレイン 酸に最適な環境が得られることにある。ある用途では当業者が最適な結果を得る に必要なリシン構造単位の数を容易に決定できよう。 標識及びスペーサからなる特に注目する標識付け成分は以下のような構造式（ II）あるいは（III）を有している。 ここにＸは安定化ブリッジであり、ＺおよびＺ’は非離脱配位子であり、ｎは２ 〜１０の整数である。 従って、構造式（II）あるいは（III）の標識成分を有するリンカ／スペーサ ／標識システムあるいは標識物質は以下の構造式（IV）あるいは（Ｖ）を有して いる。ここにＡ、Ｘ、Ｚ、Ｚ’およびｎは上述したものと同一の意味を有する。 非離脱配位子Ｚおよび／あるいはＺ’は好ましくはNH₃，NH₂R，NHR₂あるいはN R₃基であり、ここに配位子は他の非離脱配位子より一層小さな離脱基特性を有す るので、Ｒは１〜６個の炭素原子である。 構造式（II），（III）を有する標識成分を使用する注目すべき特徴は、ヌク レオチドおよび実際の標識は共に白金原子に対し直結され同時にこれら成分は立 体障害を避けるべく十分に離されることにある。 本発明によるリンカは好ましくは白金化合物であり、この場合Ｘは脂肪族ジア ミンである。本発明の好ましい実施例によれば、脂肪族ジアミンの窒素原子の１ あるいは両方がシー ルドされる。窒素原子を好適にシールドする方法によれば、１〜６個の炭素原子 の１あるいは２個のアルキル基と好ましくはメチル基と置換される。これはヌク レオチドの三重リン酸塩基と安定化ブリッジとの間の水素結合会うが防止さえる という点で望ましい。好適な２〜６個の炭素原子を有するジアミンが使用され、 最適にはエチレンジアミン基が使用され、これはこのクラスの白金化合物に対し 安定化効果があることは周知である。この場合リンカは以下の構造式（VI）を有 する。ここにＧは１〜６個の炭素原子の水素あるいはアルキル基を示し、Ａ及びＢは同 じあるいは異なる反応性成分を示している。 結合性の、即ち反応性の成分Ａ及びＢは好ましくは同一あるいはNO₃ ^-，SO₃ ^-， Cl^-，I^-あるいは他のハロゲンからなる群から選択される。 本発明は無論、上述した方法により得られる標識ヌクレオチドを含む。 更に本発明は上述した方法によりヌクレオチドを標識付けするする標識物質を も含む。本発明の標識物質は以下の構造 式（VII）を有する。 ここに、Ｘ及びＡは上述と同じ意味を有しており、標識成分は上述したように 標識とスペーサからなる。無論標識ヌクレオチド以外に標識付けするために本発 明の標識物質も使用可能である。多くの（生物）有機化合物、即ち反応しやすい (accessible)硫黄若しくは窒素原子を含むほぼすべての生物有機分子、例えばプ ロテインが本発明の白金化合物で標識付けできることが判明している。 本発明の顕著な利点は、本発明による標識ヌクレオチドを作成する方法にリン カとして構造式（Ｉ）を有する白金化合物を使用することから生じる。これらの リンカは極めて好適、且つ信頼性の高い方法により作成可能である。 ＷＯ９２／０１６９９では標識白金化合物を作成するために開示された出発化 合物は白金（II）（エチレンジアミン）ジクロリドおよび白金（II）（エチレン ジアミン）(Me₂SO)Clである。最初のものは市販から入手でき、二番目のもの（ 好ましいもの）は合成化する必要がある。ジクロリド化合物の場合、Cl^-イオン は標識あるいはヌクレオチドと各々、さ程容易にではないが置換され得る。後者 の場合ヌクレオチドの 標識付けする全時間は数分ではなく相当に長く、最長は数時間になる。 本発明によるヌクレオチドを標識付けする方法に使用されるリンカを作成する 方法は、構造式PtE₄の好適な出発化合物を選択することに基づく、ここにEは電 気陰性基であり、好ましくはハロゲン若しくはNO₃ ^-あるいはSO₃ ^-である。例えば エチレンジアミンを有する出発化合物の、実験例で説明する反応は極めて簡単で あり、高効率である。一方この反応により標識ヌクレオチドの作成のため極めて 好適な対称中間化合物が得られる。これらの化合物を使用する大きな利点は、結 果としての白金化合物の安定化ブリッジを結合する必要があるとき、不粘着試薬 を使用する必要がないことにある。別の利点は結果としての中間化合物が再び不 粘着試薬を用いる事なく標識付けできることにある。従って不粘着試薬を除去す る工程が完全に除去できる。更にこれら反応の発生率は極めて高い。対称出発化 合物を使用する更に別の利点は、結果として得られる異なる化合物は混合されな いことにある（混合される場合、混合物が次の反応と干渉して余分の別個工程が 必要となり発生率を減少させる）。 本発明による極めて好適な中間化合物は白金（II）（エチレンジアミン)(NO₃)₂ である。この物質には好適なスペーサおよび標識基を極めて容易に具有させ得 、この結果残りのNO₃基の置換を経て標識物質が極めて容易にヌクレオチドと結 合される。更にこれらの化合物および結果としての化合物を作成する方法はＤＭ ＳＯのような極めて毒性の高い物質を伴わ ない。 中間化合物は上記で開示したスペーサを介し好適な標識（マーカとも言われる ）で標識付けできる。また（例えばＷＯ９２／０１６９９からの）周知の利点は 無論本発明の方法および化合物により得られる。白金化合物の別の利点はこれら の化合物が核として白金を用い銀若しくは他の金属決勝を沈着させることにより ほぼ直接的に検出可能である。 標識物質をヌクレオチド残分と結合することにより、単一ストランドであれ、 他の形態であれDNAやRNA分子が容易に検出できるが、また標識付けされてないDN A/RNA分子が標識プローブに対し混成する混成技術でのプローブが生成される。 ヌクレオチドで標識付けされた白金リンカは混成とは殆んど干渉しない。またこ の技術により、プローブ作成の際変質ヌクレオチドの使用が除去される。 本発明の実施により変質されたヌクレオチド、および変質されたヌクレオチド が編入されたオリゴ若しくはポリヌクレオチド、あるいはこれらの新規な白金化 合物を用いて直接変質されたオリゴあるいはポリヌクレオチドが、生物医学研究 、臨床診断および再結合DNA技術でのプローブとして使用できる。 本発明の他の利点および実施例は以下の実験例の説明から明らかになろう。 （発明を実施するための最良の形態）実施態様 中間白金化合物の合成： これらの化合物、即ち構造式（Ｉ）を有するリンカは以下の工程（ａ）〜（ｆ ）を含む方法により作成できる。 （ａ） 以下の構造式（１）を有する化合物を好適な条件下で好適な溶剤内のKI と反応させて構造式（２）を有するヨウ素置換された(iodated)白金化合物を形 成する工程、（ｂ） 好適な溶剤内のエチレンジアミンと反応させて式Pt(en)I₂で表され構造 式（３）を有するジエチレンミンでヨウ素置換された白金化合物を形成する工程 、 （ｃ） 上記化合物をAgNO₃と反応させる工程、この反応は好適な条件下で好適 な溶剤内で実行され構造式（４）を有する化合物を形成する工程、 （ｄ） 好適な条件下で好適な溶剤内のKClと上記化合物を反応させ構造式（５ ）を有する化合物を形成する工程、（ｅ） 好適な条件下で好適な溶剤内のAgNO₃と上記化合物を反応させ構造式（ ６）を有する化合物を形成する工程、 （ｆ） DNAおよび／あるいはRNA標識としての使用のためのハプテン結合Pt(en) 化合物の合成のため変質された白金出発化合物として上記化合物を回収する工程 。 実験例１Ａ．Pt(en)-ジアミン出発材料の作成 白金エチレンジアミン(NO₃)₂の作成： 出発材料、Pt(en)(NO₃)₂ すべての反応は暗室内で実行 １gのカリウム・テトラクロロアチネート、K₂PtCl₄(シグマ社、２．４mmol)を ５０mlのミリポア(millipore)（フィルタを通した水）内で溶解し室温で攪拌し た。１０等量のカリウム・ヨージドKI(２４mmo1，３，９９９ｇ，シグマ社）を 加えた。この溶液の色は直ちにオレンジ色から暗い赤色へ変わった。５分間攪拌 した。 極めてゆっくり５mlのミリポア内で１６１μlのエチレンジアミンを希釈した 後１等量のエチレンジアミン（２．４mmol，１６０．８７４３μl，Merck １１ ＝０．９kg）を白金溶液に対し加え、この溶液を室温で１時間の間混合した。 黄色／茶色の沈殿物、Pt(en)I₂が形成され上の定常状態の液は透明にする必要 がある。 １．０μmの膜フィルタを通してこの溶液をフィルタ処理し、ミリポア、エタ ノールおよびジエーテルで沈殿物を（個の順序で）洗浄する。３７℃で少なくと も４時間の間真空ドライオーブン内でPt(en)I₂を乾燥した。 乾燥したPt(en)I₂（〜１．０７ｇ）を秤量し４５mlミリ ポア／５mlのアセトン内で懸濁液する。溶液は曇っていた。１．９５等量のAgNO₃ (M＝１６９．９,シグマ社）を加え、室温で一晩中この反応を攪拌した。 この溶液を１．０μmの膜フィルタを経てフィルタ処理し、沈殿物は銀ヨージ ドAgIであった。 濾液は透明である必要があるから、０．５mlの濾液,Pt(en)(NO₃)₂を加え、余 分のKClやNaClを加えた直後余分のKClあるいはNaClにより白い沈殿物が確実に形 成されないようにした。白い沈殿物（ただ黄色いもの）が形成されないときは、 全濾液に対し余分のKClやNaClを加えた。黄色い沈殿物が形成された後、その溶 液をフィルタ処理し、沈殿物(Pt(en)Cl₂)をミリポア、エタノールおよびジエー テルで洗浄した。 沈殿物を少なくとも時間の間３７℃で真空ドライオーブン内で乾燥した。乾燥 Pt(en)Cl₂(M=３２６，１)を秤量し、４５mlのミリポア／５mlのアセトン内で懸 濁し、曇った懸濁液を攪拌した。１．９５等量のAgNO₃を加え、室温で一晩中こ の溶液を攪拌する。溶液の色はAgClが形成されるので白くなった。 この溶液を暗室でフィルタ処理し、濾液を蒸発し、２５mlの濾液が残るまで回 転蒸発によりアセトンを除去した。濾液は次にフリーズドライされた。この製品 はNMRあるいは赤外線吸収分光法によりチェックした。Ｂ．Pt(tmen)-ジアミン出発材料の作成 白金-N，N，N'，N'-テトラメチルエチレンジアミン(NO₃)₂: 出発材料、Pt(tmen)(NO₃)₂ すべての反応は暗室で実行 実験例1Ａの全手順を反復するが、エチレンジアミンの代わりにN，N，N'，N'- テトラメチルエチルエネジアミンを使用した。 実験例２Ａ．[Pt(en)(生物ダドー-NH₂)(NO₃)](NO₃)の作成 １０mｌのミリポア水内にPt(en)(NO₃)₂(１８．２mg，０．０４８mmol)を溶解 し、溶解するまで加熱した。生物ダドー(２０mg，０．０５３mmol、ボエリンジ ャ マンヘーム社から購入)を５mlのミリポア水内に溶解した。２溶液を共に加 え、０．１NのNAOHによりペーハーを８に調整し、５０℃で少なくとも３時間の 間反応させた。フリーズドライにより最終製品を単離した。Ｂ．[Pt(tmen)(生物ダドー-NH₂)(NO₃)](NO₃)の作成 １２．５mlのミリポア水内にPt(tmen)(NO₃)₂(３5mg，０．０８mmol)を溶液し 、溶液するまで加熱した。生物ダドー（３２mg，０．０８５mmol)を１０mlのミ リポア水内に溶解する。２溶液を共に加え、０．１NのNaOHによりペーハーを調 整し、５０℃で少なくとも４時間の間反応させた。フリーズドライにより最終製 品を単離した。Ｃ．[Pt(en)(ディグダドー-NH₂)(NO₃)](NO₃)の作成 ５mlのミリポア水内にPt(en)(NO₃)₂(５mg，０．０１３mmol)を溶解し、溶解す るまで加熱した。ディグダドー（９mg,０．０１６mmol，ボーリング マンヘー ム社から購入）を５ mlのミリポア水内で溶解した。２溶液を共に加え５０℃で少なくとも４時間反応 させた。最終製品をフリーズドライにより単離した。 実験例３Ａ．標識dGTPの作成 [Pt(en)(生物ダドー−NH₂)(NO₃)](NO₃)(９mg，０．０１２mmol)を２mlのミリ ポア水内で溶液した。２’−ジオキシグアシン−５’−トリフォスフェート(２ ．３mg，０．００４mmol)を加え、ペーハーを６に調整した。５０℃で２４時間 培養し、フリーズドライしミリポア水（１ml）内で再び溶解し、膜フィルタを介 しフィルタ処理した。この混合液をMonoQでFPLCに加え、１００％ミリポア水か ら１００％1MのNH₄HCO₃へ線形傾きとなるよう純化し、好適な留分を回収し蓄え て、フリーズドライにより単離した。トリエチルアミンアンモニウムアセテート （TEAA）の１００mM溶液(１ml)内に製品を溶解し、１００％100mMのTEAAから５ ０％100mMのTEAA/５０％１００mMのTEAA/アセトニトリル(１／１ v/v)へ線形傾 きになるように逆相HPLC(C１８)に加え、好適な留分を回収し蓄えて、真空内で 反復蒸発により溶剤を除去した。製品をカチオン交換器(Dowex)にリチウム状で 通過させ、製品をフリーズドライにより単離した。Ｂ．標識された5-AA-dUTPの作成 [Pt(en)(生物ダドー−NH₂)(NO₃)](NO₃)(６mg，０．００８mmol)を２mlのミリ ポア水内に溶解した。２’−ジオキシウリジン−５−アミノアリル−５’−トリ フォスフェート(２ mg，０．００４mmol)を加え、ペーハーを８に調整した。５０℃で２４時間培養 し、フリーズドライしミリポア水(１ml)内で再び溶解し、膜フィルタを介しフィ ルタ処理した。混合液をMonoQでFPLCに加え、１００％ミリポア水から１００％1 MのNH₄HCO₃へ線形傾きとなるように純化し、好適な留分を回収し蓄えて、フリー ズドライにより単離した。トリエチルアミンアンモニウムアセテート(TEAA)(１m l)の１００mMの溶液内に製品を溶解し、１００％１００mM TEAAから５０％１０ ０mM TEAA/５０％１００mM TEAA/アセトニトリル(１／１ v/v)へ線形傾きとな るように逆相HPLC(C１８)に加え、好適な留分を回収し蓄え、真空内で反復蒸発 により溶媒を除去した。製品をカチオン交換器（ドオウェクス）にリチウム状で 通過させ、製品をフリーズドライにより単離した。 実験例４Pt(en)- 化合物をDNAと結合するための反応 本発明によるpt化合物でDNA分子を標識付けするための代表的な反応を行った ５μgのダブルストランドのDNAを超音波処理し、ドナーズ処理して３００〜５ ００bpの留分を得、６μgのPt(en)化合物が加えて、溶液が脱イオン化された水 で５０μlに調整した。反応混合液を１時間６５℃で培養した。非結合Pt(en)化 合物が１００μlのNADDTC溶液を加えることによりブロック化された。DNA標識さ れたPt(en)−化合物はソファデックスG−５０コラム上で純化した。容易に標識 付けされ純化されたDNAを−20℃で保存されあるいはDNAプロー ブを基材とする試金内で直接使用した。DNAプローブと標識付けされたPt(en)化 合物は活性損失および／あるいは特異性なく−２０℃で少なくとも２年間保管可 能である。上述のすべての応用はこの手順にしたがって標識付けしたプローブで 実行した。 実験例５ [Pt(en)(生物ダドー−NH₂)(NO₃)](NO₃)でDNAプローブのビオチン標識付け、(生 物ダドーULS) 先ず： DNAプローブを現場混成(ISH)用のビオチンで標識付けするするためにこの標識 付け法を使用した。この実験例の場合品質管理手順用の手順およびデータを含む 標識付け法が提示された。ビオチン標識付けでは、ヒューマン パピロマ ビラ ス タイプ６（HPV−６，４０％GCベースパイアーズ）のプラスミド・クローン 化された全DNAを使用した。 実験手順 プラスミドDNA作成 ヒューマン パピロマ ビラス タイプ６の全DNAがベクターpSp−６４にクロ ーン化された。プラスミドDNAはイー．コリイ(C−６６)内に移動し、LBプレート を含むアムピシーリン上にプレート化した。単一のコロニーを大量培養で一晩中 成長させた。 プラスミドDNAはビエアンボイム・ドーリイ法に従って単離し、制限酵素分析 により挿入体に対しチェックした。プラスミドDNA濃度はＡ２６０／２８０吸収 法により決定した。 エタノール沈殿後、このDNAは１０mM TRIS／HCl Ph７．２，０．３mM EDTA内で １μg/μl(バッチ＃：１５０８９４)の最終濃度まで再構成した。次にこのDNAは 氷上で１０分間３度超音波処理した（ソニプル１５０．，MSE）。 結果としてのDNA留分のサイズは２％アガロースゲル電気泳動法により決定し 、２００〜４００バセペイア（バッチ＃：０５１０９４）の間にあることが判明 した。 プラスミドDNA標識付けおよび純化： プラスミドHPV−６ DNAを次の試薬（１），（２），（３）を混合することに よりビオダドー−ULSで標識付けした。 （１） プラスミドHPV−６DNA ５μl（1μg/μl） （バッチ＃：０５１０９４） （２） ビオダド−ULS標識付け試薬 ８μl(1μg/μl) （バッチ＃：ＢＸ９４０８３０） （３）脱イオン化した水(＜０．２/μS/cm) ３７μl ５０μlの反応混合液は８５℃で１５分間培養した。 ５０μlのジテイルデイシオカーバメイト溶液（脱イオン化された水内で２％ 液）を加え室温で３０分間培養することにより培養した。 非結合ビオダドー−ULSがS３００HRマイクロスピン コラム(パルマシア)を用 いサイズエクスクルージョンクロマトグラフ法により除去した。溶離剤容積は５ ００μlにし、１０ng/μlビオチンHPV−６プローブ濃度（バッチ＃：０６１０９ ４）にした。 検出限度の品質管理： 本発明のビオチンプローブの検出限度は次の手順に従い直接スポットブロト法 および逆フィルタ混成法により決定した。 直接スポットブロト： 本発明によりビオチンで標識付けされたHPV−６(バッチ＃：０６１０９４)は ９００mM塩化ナトリウム、９００mMナトリウムシトレイト、２００μg/mlの単一 ストランドのサロムスパームDNAからなるスポットバッファ内に１０倍順次希釈 し、希釈をul当たり１０００〜０．１pgビオチンプローブ順次変化した。１μl スポットはニトロセルローズ膜上にかけ、８０℃で２時間培養してDNAが結合し た。 ビオチンプローブは次の手順Ａ），Ｂ），Ｃ），Ｄ）に従いnbt/bcip沈殿基質液 (シグマ社)と組み合わせてスレプトアビディン-アルカリン・フォスファターゼ ・コンジュゲート液（シグマ社）を用いて可視化した。 Ａ） 膜は０．５〜２０％(TBST)を含むTBS溶液内に５分間侵浸した。 Ｂ） 膜は３７℃で１５分間TBSTでStrep−AP(３ DEA U/ml)dで培養した。 Ｃ） NC膜はTBS溶液内で５分間３度洗浄し、次に脱イオン化された水で５分間 洗浄した。 Ｄ） 膜は３７℃で１５分間NBT/BCIP基質溶液で培養し、次に脱イオン化された 水で洗浄され空気中で乾燥した。 結果： この方法を行うことにより、本発明によるビオチンDNAプ ローブの検出限界が１pgより低いことが判明した。 逆フィルタ処理混成法： HPV−６ DNA（バッチ＃：０５１０９４）は０．１N NaOH内で（１in １０） 希釈し、１００℃て５分間培養し、５分間氷上に直接置いてDNA単一ストランド を形成した。 １０倍順次希釈が冷たい０．１N NaOH内で行い、μl当り１０，０００〜１pg DNAと順次変化した。１μlスポットがナイロン膜(Boehringer Mannheim)上に置 かれ空気乾燥した。 本発明によりビオチンで標識付けされたHPV−６ DNAプローブが5xSSPE０．５ ％ SDS溶液で希釈して濃度が２００ng/mlとなった。この溶液は１００℃で５分 間培養し、５分間氷上に直接置いた。 目標のDNAを含むナイロン膜は５分間2x SSC内に侵浸し、次に３７℃で２時間 単一ストランドのプローブ溶液で培養した。 余分のビオチンプローブを３７℃で１０分間2x SSPE ０．１％SDS内で３回変 更して除去し、次に５分間TBST培養した。 本発明のビオチンプローブは直接スポットブロト法で説明したと同じ手順を行 うことにより可視化した。 結果： この手順で行うことにより、本発明によるビオチンプローブの検出限界が１０ pgより低いことが判明した。 現場混成法の性能： テスト材料はオーガノシレンが被覆されたガラススライド上に装着したHPV− ６正カービカル コンデイロマの６μmパラフィンセクションでなっていた。 次の手順を実施した（特に指定に従い室温で行った）。 １．パラフィンセクションは３回キシレンで脱蝋され等級エタノールで水和化し た。 ２．セクションは５分間TBSTで洗浄した。 ３．セクションは３７℃で３０分間０．１N HCl内に０．２５％ペプシンで蒸解 し、等級エタノールで脱水し空気乾燥した。 ４．１０μlのプローブ溶液をセクションにかけ、カバースリップで被覆された 。 プローブ溶液は０．６M NaCl、０．０６M ナトリウムシトレイト、３５％フ ォーマミッド、１０％デクストランスフェイト、２，５xデンハーデイットおよ び１０μg/ml単一ストランドサロン スパームDNAからなる混成混合液内に溶解 された２ng/μlの濃度で本発明により標識付けしたビオチンHPV−６ プローブD NA(バッチ＃：０６１０９４）からなっていた。 ５．スライドを５分間９５℃に設定し、ホットプレート上に置いて、プローブお よび目標であるDNAが同時に変性した。 ６．混成はスライドを３７℃で加湿チャンバ内で２時間置くことにより行った。 ７．カバースリップは除去し、スライドは１５mM NaCl、１．５mM ナトリウムシ トレイトおよび５％フォーマミドで３回 変え、３７℃で１０分間洗浄した。 ８．スライドはTBSTで洗浄した。 ９．セクションは３７℃で１５分間スレプトアビディンAPコンジュゲート液(TBS T内で３DEA U/ml)で培養した。 １０．スライドはTBST(3x)および脱イオン化された水内で洗浄した。 １１．セクションは３７℃で１５分間NBT/BCIP基質液で培養した。 １２．スライドは脱イオン化した水(3x)内で１分間洗浄し、セクションはグリセ ロール／ジェラチン内に装着した。 結果： これらのセクションを使用することにより、HPV−６感染された細胞および残 りの組織内の小さなバックグラウンドの場所に青／紫色の沈殿物が見られた。 結論： この結果本発明により標識付けしたDNAは良好な検出限界を有していることを 示している。本発明の方法は、実行が迅速、容易で感度が高く、酵素工程を含ま ず、再生性が極めて高く、低コストでの製造に適しているので、研究、定常作業 、標識核酸の産業的生産に極めて良好に使用できる。また本発明の方法は従来の 非等方性標識付け法に匹敵する有用な別途の方法を提供し得る。 参考文献： １．マニアティク ティー．、サムブロック ジエイ．、フリッチ イー．エフ ．、モルキュラ クローニングによるコ ールド スプリング ハーバー研究所発行，ISBN 0-8769-309-6第２版 ２．ケラー ジー．エイチ．、マナック エム．エム．によるDNAプローブ、ス トックトン発行のISBN 0-333-47659-X用途： １．本発明のPt-DNAリンカをいわゆるLIDIA技術に使用、リンクDNAイムノ試金(A ssay) LIDIA技術により、例えば出発材料のPCR増幅後少量のDNA（あるいはRNA)が定 量分析できる。この技術は本発明の迅速DNA(RNA)Pt標識付け工程のため特定のDN A(RNA)プローブを本発明により容易に実行できるので、感度が高く独特の特徴を 持つことになる。 技術の説明： この技術では、本発明の迅速白金(pt)標識化合物を使用してDNA(RNA)プローブ を標識付けする。 この技術は３つの異なる方法（１），（２），（３）で可能となる。 （１） プラスチック、ナイロンあるいはニオセルローズに対し非可逆的にDNA 分子を架橋する本発明による白金化合物を用いることにより、DNAプローブ分子 を面に対し結合する。次に目標の検出は古典的標識DNA／RNAプローブを用いるこ とにより達成できる（ニックトランスレイションあるいは化学的変性、ランダム プライミング）。 （２） 検出可能な基をDNAに対し結合し、DNA分子を、い わゆるDNAプローブ内に溶出させる。次にDNA化合物の面に対する結合は、化学で は周知な古典的な技術を用い（特殊処理されたマイクロティタ・プレートに対し 共有結合）、ニトロセルローズ上でDNAプローブを焼成したりあるいはナイロン 膜に対しDNA分子を結合することにより、達成できる。 （３） 技術（１），（２）の組み合わせ。 アプローチ１： 不動化されたDNAプローブは混成技術を用いサンプル内の特定の目標分子を捕 獲するのに使用できる。形成された混成物の検出は、異なる技術を用いることに より可能であり、例えば第２の標識DNAプローブを用いて、目標DNA分子上の別の 場所で混成してサンドイッチ混成物を形成する。次に標識は最新技術の免疫学的 検出／着色技術を用いることにより、検出可能である。 アプローチ２： （増幅され）検出可能なDNA(RNA)を含む溶液は本発明による手順により直接標 識付けされる。 余分な標識はNaDDTCあるいはチオ尿素(Thioureum)を加えることにより急冷さ れる。このアプローチは、他の試金が標識付けされる場合に比べ目標分子が標識 付けされ、DNA(RNA)プローブがその目標を検出するために使用されるという点で 、他の技術と異なる。本発明の白金標識化合物が迅速に結合可能であるので、診 断テスト手順のルーチン工程としてDNA結合工程が可能である（通常の結合時間 は６５℃で６０分である）。 第２の工程は目標特定プローブで予め被覆されたマイクロティタ・プレートで 実行される。培養により安定した“標識目標”及びプローブ混成物が形成される 。目標分子を直接標識付けすることにより、１プローブを目標を捕獲するのに使 用し別の標識プローブを不動化された目標を検出するために使用するような煩雑 なダブル混成技術を省略できる。 この方法ではプローブは井戸の面までマイクロティタ・プレートに対し共有的 に結合される。第２の培養工程は液体混成の特性を有しているので、極めて迅速 に実行可能である。これは定量的DNA混成技術に対するこのアプローチの主な改 良的特徴の一である。 アプローチ３： DNAプローブ若しくはDNA目標の不動化のため、且つDNAプローブおよびDNAプロ ーブと目標の標識付けのため、新たに開発された白金システムが使用可能になる 。これらの２DNA結合技術は、“キャッチャ”および“検出器”の両方が第２の 物質（ビオチン、ジオキシゲニンのような検出可能な基あうりはプラスチックス ティック、ミクロ滴定濃度プレートあるいは膜のようなキャリア面）に対し結合 される一の試金に組み合わされる。 この技術の例：人間診断でのSTDに関連した微生物の検出（クライディア，シ ンフィリス，AIDS，ハーペス，ゴノアフォイア，Hep．B,)。 ２．テストストリップ手順およびフォーマットと組み合わせての本発明の白金DN A標識の使用： DNAディップスティック技術により、少量のDNA(あるいはRNA)が例えばPCR増幅 後あるいは人体液（血、尿、汗等）のサンプルに自由に存在した後、定性的およ び半定性的分析が可能である。 本発明による迅速DNA(RNA)白金工程のため特定のDNA(RNA)プローブを使用し実 行が容易であるので、この技術は感度が高く特異である。 新たに開発し白金標識付けの汎用性のある方法の特徴は結合DNA(RNA)分子を得 るに以下の３通り（１），（２），（３）を使用できる。 （１） 検出可能なマーカー基をポリヌクレオチド序列に結合するのに使用でき る。 （２） ポリヌクレオチド序列を固相（プラスチック、膜、ラテックスビード、 ヒドロゾルあるいはマイクロティタ・プレート井戸(well))に対し結合するのに 使用できる。 （３） 上記（１）と（２）の組み合わせ。 Ad 1: 本発明の実験例では、テストサンプルでのバイオリティクス生物アナリティス を検出するに２通りの方法がある。第１の方法では、DNAプローブが新たに開発 された白金標識物化合物で標識付け可能である。次にこの標識プローブは目標DN A序列と一次プローブとの間に形成される膜上の予め形成された混成物を検出す るに使用される。この方法では一次プローブが二次白金標識プローブより目標上 の別の序列を認識することが重要である。実際上はこれはDNA混成で達成でき る。POLY AプローブはすべてのRNA(そのpolyTテイル(tails)により認識可能）を 膜に対し不動化するときに一次プローブとして使用される。 第２の方法は迅速および極めて特異な白金標識付けの特徴により、この場合目 標はテストサンプル液内で標識付け可能であるという点で僅かに異なる。このよ うな手順は好適な膜上の標識付けされていない特定の不動DNAプローブで標識目 標を捕捉する。従ってDNA(RNA)用途のディップスティックバージョンである。 Ad 2: DNAプローブあるいは目標DNAを不動化するため、非標識白金化合物（即ち２自 由結合場所を有する白金化合物）がDNAとキャリア（プラスチック、膜、マイク ロティタ・プレート等）の表面との間のブリッジとして作用すべく使用可能であ る。 DNAを容易且つ自由に結合する物質は化学的には殆ど知られていないので、診 断試金内のキャッチャ分子としてDNA序列の利用性が顕著に向上される。この白 金ブリッジ分子を紹介することにより、DNA技術の広範囲な新たな分野の用途に 採用可能になった。 Ad 3:実験例１と２の組合せ 一般に本発明の白金化合物をラテックスあるいはヒドロゾルにしようすること は特に注目すべきことである。この化合物によりDNA分子が小さな粒子と結合可 能になる。ＤＮＡ分子は目標材料に対し混成化可能である。確実な反応はDNA混 成粒子化合物の架橋によって粒子の凝集により可視化される。 このようなテストは定量化でき、凝集速度は特定の波長に対し調整され測定さ れる。特に金粒子は最適波長のシフトが凝集後に生じるという固有特性を有して いる。 ３．銀-エンハンスメント技術による本発明の白金酸塩化されたDNAプローブの検 出。 白金酸塩化されたDNA(RNA)プローブはサンプル材料内のDNA(RNA)序列を検出す るのに混成法で使用可能である。所定の場所に白金化合物を導入することにより 、特にイオン銀を金属銀へ還元するよう構成された化学反応で銀分子を沈殿させ ることができる。白金核の触媒作用のため、白金核の場所で金属銀（黒）が分解 される。 イオン銀は溶液内の還元剤（例えば、Na-ボロハイブリッド、ハイドロチノン ）により還元される。一定比では、白金上に沈殿された銀の量はエンハンスメン ト培養の長さに比例する。非可視の白金核の可視化はテストサンプル内のブラッ クスポットの出現を経験的に観察することにより達成可能である。 ブラックスポットは特定プローブの結合場所、従って特定の目標位置の場所を 示す。この技術により各種微生物あるいは遺伝子の遷移／異常を検出する診断手 順が迅速且つ容易に可能になる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 イエルスマ，テインカ オランダ国 1326 デーゲー アルメレ ケルセブームストラート 30 (72)発明者 ヒーテブリイ，ロブ ヨツト. オランダ国 3511 エルテー ユトレヒト ツアデルストラート ２ (72)発明者 ヴオルケルス，ヘルマン ハー. オランダ国 1141 エスエル モンニケン ダム ノールデルフエステイング ３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．次の構造式（Ｉ）のリンカの反応性成分を反応させる工程と、スペーサの反 応性成分を標識と反応させる工程と、リンカの他の反応性成分をヌクレオチドと 反応させる工程とを包有する、 こに、Ｘは安定化ブリッジを示し、ＡおよびＢは同じあるいは異なる反応性成分 を示し、電子はスペーサの成分を示し、スペーサは少なくとも４個の原子を有す る１個の鎖及び鎖内に少なくとも１個のヘテロ原子からなり、スペーサは更に鎖 の一端部に電子供与成分および鎖の他端部に反応性成分をなるヌクレオチドの標 識付け法。 ２．標識がビオチン、アビディン、スレプトアビディン、ジグオキシゲニンある いはその機能投下物である請求項１の方法。 ３． ヌクレオチドがアデニン、チミディン、シトシン、グアニンあるいはウリ ディン若しくはその誘導体である請求項１または２の方法。 ４．電子供与成分がアミン若しくはチオレートアニオンである請求項１〜３のい ずれかの方法。 ５．アミンが芳香族アミンである請求項４の方法。 ６． 少なくとも一のヘテロ原子が酸素原子である請求項１〜５のいずれか一の 方法。 ７．スペーサが鎖内に僅か２０の炭素原子からなる請求項１〜６のいずれか一の 方法。 ８．スペーサが１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタンでなる請求項７の 方法。 ９．スペーサがオリゴリシン若しくはポリリシンである請求項７の方法。 １０．リンカが標識およびスペーサからなり以下の構造式（II）あるいは（III ）を有する。 ここにＸは安定化ブリッジであり、ZおよびZ'は非離脱配 位子であり、nは２〜１０の整数でなる請求項１〜４のいずれか一の方法。 １１．Zおよび／あるいはZ'はNH₃，NH₂R，NHR₂あるいはNR₃ 基を示し、ここにRが１〜６個の炭素原子を有するアルキル基を示してなる請求 項１０の方法。 １２．Ｘが脂肪族ジアミンを表してなる請求項１〜１１のいずれか一の方法。 １３．Ｘが２〜６個の炭素原子を有する脂肪族ジアミンでなる請求項１２の方法 。 １４．Ｘがエチレンジアミン基である請求項１３の方法。 １５．脂肪族ジアミンの窒素原子の一方あるいは両方がシールドしてなる請求項 １２〜１４のいずれか一の方法。 １６．脂肪族ジアミンの窒素原子の一方あるいは両方が１〜６個の炭素原子のア ルキル基と置換されてなる請求項１５の方法。 １７．脂肪族ジアミンの窒素原子の一方あるいは両方が１あるいは２個のメチル 基で置換されてなる請求項１６の方法。 １８．Aおよび／あるいはBがNO₃ ^-，SO₃ ^-，Cl^-，I^-あるいは他のハロゲンからな る群から選択されてなる請求項１〜１７のいずれか一の方法。 １９．AおよびBが同一である請求項１〜１８のいずれか一の方法。 ２０．上記請求項の方法により得られる標識付けされたヌクレオチド。 ２１．スペーサがオリゴリシンあるいはポリリシンでなる請 求項２０の標識付けされたヌクレオチド。 ２２．以下の構造式（VII）を有する、 ここにＸは安定化ブリッジ、Ａは反応性成分、標識成分は標識およびスペーサ からなる、 スペーサが少なくとも４個の原子と少なくとも１個のヘテロ原子とからなり、 スペーサは更に標識から末端のスペーサの一端部に電子供与成分を有してなる標 識付けした物質。