JP4981197B2 - ヌクレオチドを標識付けする方法、標識ヌクレオチド及び有用な中間体 - Google Patents
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Description
本発明は(白金化合物を基材とし標識と生物有機分子との間の成分を結合した)リンカを用いてヌクレオチドを標識付けする方法に関する。
(背景技術)
白金(配位子)化合物は極めて長期間開発が求められてきた。これらの化合物及びこれらの化合物の使用についてはリージック等(構造及び結合67、ページ53−89、1987)に開示されている。特にシス白金は腫瘍予防薬として大きな期待を受けて来た。この腫瘍予防薬の白金化合物との反応性は少なくとも2の反応基(好ましくは互いにシス配向された)を有することが前提とされていて、これによりDNA分子を架橋することが可能であり、DNA分子の反復利用が禁止される。
英国特許出願第2 148 891号には6座標を有するシス白金錯体が開示されている。白金は1,2−ジアミノ−2−メチルプロパンあるいは1,2−ジアミノ−2−メチルブタンのような、白金2ハロゲンあるいはヒドロキシ基、更に2ハロゲン、及びエチレンジアミン誘導基に結合される。これらの錯体は優れた腫瘍予防効果を有するものと識知されている。
この欧州特許出願では、白金の2,3−アルキル−1,4−ブタンジアミン及び2ハロゲンに対する4−座標錯体による腫瘍予防効果が明示されている。
異なる4座標白金錯体が欧州特許出願第0 386 243号に開示される。この錯体はジアミン・ビデンテート配位子および2−アリール・アルカノイック酸、あるいは3−アリール−2−オキソアルカノイック酸配位子からなる。これらの錯体はある白血病セルに対し高い成長禁止作用をすると考えられていてオンコスタチック活動に使用される。
米国特許出願第4,207,416号には高い腫瘍予防活動および低い哺乳類有毒性を有するエチレンジアミン白金(II)2,4−ジオキソピリミジン錯体が開示されている。
白金(配位)化合物の別の使用がPCT出願(WO92/01699)に開示され、この場合(内部で基を離れるものとして示される)2反応成分のみを有する白金化合物はフルオレスセインと反応して、グアニン残分の好ましくはN-7位置でヌクレイン酸に対し(非共有)結合可能な標識白金化合物が得られる。
ヌクレオチドを標識付けする数種の方法が文献に説明されている。長期間これらの標準的な方法では放射性同位体標識を使用する。一方放射性同位体の使用に関連しては潜在的な健康への危険性、処理問題および不安定性などの多様の問題がある。
これらの問題を解決するため、デール等による生化学、14、(1975)、2447−2457によれば、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの標識付け技術として直接共有水銀処理が使用される。シトシンおよびウラシルは緩条件下でC5位置で水銀処理され得ることが判明した。更にジベヤッフ等による「ヌクレイン酸研究」、15、(1987)4513−4534には、アデニンおよびシトシンが3〜17原子の脂肪族リンカを介しビオチン誘導体で標識付けされることが報告されている。
これらの周知な方法の顕著な欠点はこれらの方法がすべての異なるヌクレオチドを標識付けするのに好適ではないことにある。例えばデール等によるこれらの共有水銀処理法によれば結果としてアデニン、チミンおよびグアニン塩基に対し不良の結果となることが報告されている。ある場合例えば、あるヌクレオチドの僅かな2−3の残分があるヌクレイン酸内に存在する場合、またはヌクレイン酸の末端基とするヌクレオチド残分を標識付けする必要であるい場合、自由にヌクレオチド残分を標識付けする方法を使用できることが望ましい。
(発明の開示)
本発明によれば、このような望ましい方法が提供される。この本発明によるヌクレオチドの標識付け方法は下記の構造式(I)のリンカの反応性成分を反応させる工程と、スペーサの反応性成分を標識と反応させる工程と、リンカの他の反応性成分をヌクレオチドと反応させる工程とを包有する。
、ここに、Xは安定化ブリッジを示し、AおよびBは同一あるいは異なる反応性成分を示し、電子はスペーサの成分を示し、スペーサは少なくとも4個の原子を有する1個の鎖及び鎖内において少なくとも1個のヘテロ原子からなり、スペーサは更に鎖の一端部に電子供与成分および鎖の他端部に反応性成分を有する。
本発明によればリンカはまずヌクレオチドに、次にスペーサに対しあるいは逆に結合され得、スペーサは先ず標識に、次にリンカにあるいは逆に結合され得る。
スペーサの反応性成分は、標識およびスペーサからなる標識付け成分が形成され、この標識付け成分が十分に安定であるように、スペーサと標識との間の反応を可能にする反応性成分にできる。
ヌクレオチドを標識付けする主な目的は、これらの標識ヌクレオチドがヌクレイン酸分子内に含ませ得ることにある。変性ヌクレオチド、特に(嵩が大の)標識が付けられたヌクレオチドと結合されるヌクレオチドは極めて低い効率でヌクレイン酸内に組み込まれる場合が多い。本発明による方法によれば、標識ヌクレオチドがこれまで入手可能な標識ヌクレオチドよってヌクレイン酸内により高い効率で組み込まれる結果になる。これは本発明による白金を基材とするリンカと組み合わせて本発明によるスペーサを選択できよう。
本発明により使用できる標識は重要ではない。原理上、ヌクレオチドと結合でき、これまで採用されるすべての標識が使用できる。これらの標識としては、放射性標識、酵素(検出対象の基質と反応する必要がある)、特定の結合対成分、例えばアビディン、スレプトアビディンあるいはビオチン、ビオシチン、イミノビオチン、コロイド塗料物質、フルオロクロム(ロダミン等)、還元物質(エオシン、エリトロシン等)(着色された)ラテックスゾル、ジグオキシゲニン、金属(ルテニウム)、金属ゾルあるいは他の微粒子ゾル(セレン、炭素等)、ダンシルリシン、プロテインA、プロテインG等を使用できる。本発明はビオシチン、アビディン、スレプトアビディン、ジグオキシゲニンあるいはその機能等価物に対し最大の利点を有する。
本発明はヌクレオチドやヌクレオシドに限らず、例えばその誘導体および機能等価物も使用できる。通常のヌクレオチドアデニン、チミディン、プリン、グアニンおよびユリディンも好ましい。特に極めて良好な編入速度を有するプリンは好適である。
スペーサを白金リンカと結合するため、電子供与成分が必要である。好ましい方法によれば、電子供与成分はアミンあるいはチオレートアニオンであり、共に極めて有効であることが判明している。イミダゾール若しくはプリンのような芳香族アミンが白金に対し極めて強い結合力を形成でき、電子供与成分として好適に使用できることが判明している。
スペーサは本発明の重要な実施態様であり、スペーサにより標識とリンカとが最大に容易に結合できる。ヌクレオチドをヌクレイン酸内に組入れする際の立体障害を避けるため、長さが少なくとも4原子である必要があり、好ましくは長さが少なくとも4炭素原子であり、炭素鎖内に少なくとも1ヘテロ原子を有する。ヘテロ原子はスペーサにある量の剛性を付与する。この剛性により、立体因子がヌクレオチドおよび標識の好適な結合を妨げないことを更に保証される。少なくとも1ヘテロ原子は酸素原子であり、この原子はスペーサの親水性に影響を与えることが好ましい。
好ましくはスペーサは鎖に20炭素原子のみからなり、この鎖は実質的に分岐のない鎖であるので、立体障害が生じない。この理由は明らかであろう。
極めて好ましいスペーサはここにダドーと呼ばれる1,8−ジアミノ−3,6−ジオキサオクタンである。ダドーは極めて柔軟な化合物であり、第1アミン基を有し本発明によるスペーサとして極めて好適に使用可能なサイズを有している。
本発明による別の極めて好適なスペーサはオリゴリシンまたはポリリシンである。これらの構造および立体配座のため、これらの分子は実際の標識、ヌクレオチド及び白金間で最適な相互作用のための最高の好適な環境を作る。スペーサとしてリシン鎖を使用する別の利点は、鎖内のリシン構造単位の数を変えることにより、特定の標識およびヌクレオチド、あるいはヌクレイン酸に最適な環境が得られることにある。ある用途では当業者が最適な結果を得るに必要なリシン構造単位の数を容易に決定できよう。
標識及びスペーサからなる特に注目する標識付け成分は以下のような構造式(II)あるいは(III)を有している。
ここにXは安定化ブリッジであり、ZおよびZ’は非離脱配位子であり、nは2〜10の整数である。
従って、構造式(II)あるいは(III)の標識成分を有するリンカ/スペーサ/標識システムあるいは標識物質は以下の構造式(IV)あるいは(V)を有している。
ここにA、X、Z、Z’およびnは上述したものと同一の意味を有する。
非離脱配位子Zおよび/あるいはZ’は好ましくはNH3, NH2R, NHR2あるいはNR3基であり、ここに配位子は他の非離脱配位子より一層小さな離脱基特性を有するので、Rは1〜6個の炭素原子である。
構造式(II),(III)を有する標識成分を使用する注目すべき特徴は、ヌクレオチドおよび実際の標識は共に白金原子に対し直結され同時にこれら成分は立体障害を避けるべく十分に離されることにある。
本発明によるリンカは好ましくは白金化合物であり、この場合Xは脂肪族ジアミンである。本発明の好ましい実施例によれば、脂肪族ジアミンの窒素原子の1あるいは両方がシールドされる。窒素原子を好適にシールドする方法によれば、1〜6個の炭素原子の1あるいは2個のアルキル基と好ましくはメチル基と置換される。これはヌクレオチドの三重リン酸塩基と安定化ブリッジとの間の水素結合会うが防止さえるという点で望ましい。好適な2〜6個の炭素原子を有するジアミンが使用され、最適にはエチレンジアミン基が使用され、これはこのクラスの白金化合物に対し安定化効果があることは周知である。この場合リンカは以下の構造式(VI)を有する。
ここにGは1〜6個の炭素原子の水素あるいはアルキル基を示し、A及びBは同じあるいは異なる反応性成分を示している。
結合性の、即ち反応性の成分A及びBは好ましくは同一あるいはNO3 -, SO3 -, Cl-, I-あるいは他のハロゲンからなる群から選択される。
本発明は無論、上述した方法により得られる標識ヌクレオチドを含む。
更に本発明は上述した方法によりヌクレオチドを標識付けするする標識物質をも含む。本発明の標識物質は以下の構造式(VII)を有する。
ここに、X及びAは上述と同じ意味を有しており、標識成分は上述したように標識とスペーサからなる。無論標識ヌクレオチド以外に標識付けするために本発明の標識物質も使用可能である。多くの(生物)有機化合物、即ち反応しやすい(accessible)硫黄若しくは窒素原子を含むほぼすべての生物有機分子、例えばプロテインが本発明の白金化合物で標識付けできることが判明している。
本発明の顕著な利点は、本発明による標識ヌクレオチドを作成する方法にリンカとして構造式(I)を有する白金化合物を使用することから生じる。これらのリンカは極めて好適、且つ信頼性の高い方法により作成可能である。
WO92/01699では標識白金化合物を作成するために開示された出発化合物は白金(II)(エチレンジアミン)ジクロリドおよび白金(II)(エチレンジアミン)(Me2SO)Clである。最初のものは市販から入手でき、二番目のもの(好ましいもの)は合成化する必要がある。ジクロリド化合物の場合、Cl-イオンは標識あるいはヌクレオチドと各々、さ程容易にではないが置換され得る。後者の場合ヌクレオチドの標識付けする全時間は数分ではなく相当に長く、最長は数時間になる。
本発明によるヌクレオチドを標識付けする方法に使用されるリンカを作成する方法は、構造式PtE4の好適な出発化合物を選択することに基づく、ここにEは電気陰性基であり、好ましくはハロゲン若しくはNO3 -あるいはSO3 -である。例えばエチレンジアミンを有する出発化合物の、実験例で説明する反応は極めて簡単であり、高効率である。一方この反応により標識ヌクレオチドの作成のため極めて好適な対称中間化合物が得られる。これらの化合物を使用する大きな利点は、結果としての白金化合物の安定化ブリッジを結合する必要があるとき、不粘着試薬を使用する必要がないことにある。別の利点は結果としての中間化合物が再び不粘着試薬を用いる事なく標識付けできることにある。従って不粘着試薬を除去する工程が完全に除去できる。更にこれら反応の発生率は極めて高い。対称出発化合物を使用する更に別の利点は、結果として得られる異なる化合物は混合されないことにある(混合される場合、混合物が次の反応と干渉して余分の別個工程が必要となり発生率を減少させる)。
本発明による極めて好適な中間化合物は白金(II)(エチレンジアミン)(NO3)2である。この物質には好適なスペーサおよび標識基を極めて容易に具有させ得、この結果残りのNO3基の置換を経て標識物質が極めて容易にヌクレオチドと結合される。更にこれらの化合物および結果としての化合物を作成する方法はDMSOのような極めて毒性の高い物質を伴わない。
中間化合物は上記で開示したスペーサを介し好適な標識(マーカとも言われる)で標識付けできる。また(例えばWO92/01699からの)周知の利点は無論本発明の方法および化合物により得られる。白金化合物の別の利点はこれらの化合物が核として白金を用い銀若しくは他の金属決勝を沈着させることによりほぼ直接的に検出可能である。
標識物質をヌクレオチド残分と結合することにより、単一ストランドであれ、他の形態であれDNAやRNA分子が容易に検出できるが、また標識付けされてないDNA/RNA分子が標識プローブに対し混成する混成技術でのプローブが生成される。ヌクレオチドで標識付けされた白金リンカは混成とは殆んど干渉しない。またこの技術により、プローブ作成の際変質ヌクレオチドの使用が除去される。
本発明の実施により変質されたヌクレオチド、および変質されたヌクレオチドが編入されたオリゴ若しくはポリヌクレオチド、あるいはこれらの新規な白金化合物を用いて直接変質されたオリゴあるいはポリヌクレオチドが、生物医学研究、臨床診断および再結合DNA技術でのプローブとして使用できる。
本発明の他の利点および実施例は以下の実験例の説明から明らかになろう。
(発明を実施するための最良の形態)
実施態様
中間白金化合物の合成:
これらの化合物、即ち構造式(I)を有するリンカは以下の工程(a)〜(f)を含む方法により作成できる。
(a) 以下の構造式(1)を有する化合物を好適な条件下で好適な溶剤内のKIと反応させて構造式(2)を有するヨウ素置換された(iodated)白金化合物を形成する工程、
(b) 好適な溶剤内のエチレンジアミンと反応させて式Pt(en)I2で表され構造式(3)を有するジエチレンミンでヨウ素置換された白金化合物を形成する工程、
(c) 上記化合物をAgNO3と反応させる工程、この反応は好適な条件下で好適な溶剤内で実行され構造式(4)を有する化合物を形成する工程、
(d) 好適な条件下で好適な溶剤内のKClと上記化合物を反応させ構造式(5)を有する化合物を形成する工程、
(e) 好適な条件下で好適な溶剤内のAgNO3と上記化合物を反応させ構造式(6)を有する化合物を形成する工程、
(f) DNAおよび/あるいはRNA標識としての使用のためのハプテン結合Pt(en)化合物の合成のため変質された白金出発化合物として上記化合物を回収する工程。
実験例1
A.Pt(en)-ジアミン出発材料の作成
白金エチレンジアミン(NO3)2の作成:
出発材料、Pt(en)(NO3)2
すべての反応は暗室内で実行
1gのカリウム・テトラクロロアチネート、K2PtCl4(シグマ社、2.4mmol)を50mlのミリポア(millipore)(フィルタを通した水)内で溶解し室温で攪拌した。10等量のカリウム・ヨージドKI(24mmol, 3,999g,シグマ社)を加えた。この溶液の色は直ちにオレンジ色から暗い赤色へ変わった。5分間攪拌した。
極めてゆっくり5mlのミリポア内で161μlのエチレンジアミンを希釈した後1等量のエチレンジアミン(2.4mmol, 160.8743μl, Merck 11=0.9kg)を白金溶液に対し加え、この溶液を室温で1時間の間混合した。
黄色/茶色の沈殿物、Pt(en)I2が形成され上の定常状態の液は透明にする必要がある。
1.0μmの膜フィルタを通してこの溶液をフィルタ処理し、ミリポア、エタノールおよびジエーテルで沈殿物を(個の順序で)洗浄する。37℃で少なくとも4時間の間真空ドライオーブン内でPt(en)I2を乾燥した。
乾燥したPt(en)I2(〜1.07g)を秤量し45mlミリポア/5mlのアセトン内で懸濁液する。溶液は曇っていた。1.95等量のAgNO3(M=169.9,シグマ社)を加え、室温で一晩中この反応を攪拌した。
この溶液を1.0μmの膜フィルタを経てフィルタ処理し、沈殿物は銀ヨージドAgIであった。
濾液は透明である必要があるから、0.5mlの濾液,Pt(en)(NO3)2を加え、余分のKClやNaClを加えた直後余分のKClあるいはNaClにより白い沈殿物が確実に形成されないようにした。白い沈殿物(ただ黄色いもの)が形成されないときは、全濾液に対し余分のKClやNaClを加えた。黄色い沈殿物が形成された後、その溶液をフィルタ処理し、沈殿物(Pt(en)Cl2)をミリポア、エタノールおよびジエーテルで洗浄した。
沈殿物を少なくとも時間の間37℃で真空ドライオーブン内で乾燥した。乾燥Pt(en)Cl2(M=326,1)を秤量し、45mlのミリポア/5mlのアセトン内で懸濁し、曇った懸濁液を攪拌した。1.95等量のAgNO3を加え、室温で一晩中この溶液を攪拌する。溶液の色はAgClが形成されるので白くなった。
この溶液を暗室でフィルタ処理し、濾液を蒸発し、25mlの濾液が残るまで回転蒸発によりアセトンを除去した。濾液は次にフリーズドライされた。この製品はNMRあるいは赤外線吸収分光法によりチェックした。
B.Pt(tmen)-ジアミン出発材料の作成
白金-N, N, N’, N’-テトラメチルエチレンジアミン(NO3)2:
出発材料、Pt(tmen)(NO3)2
すべての反応は暗室で実行
実験例1Aの全手順を反復するが、エチレンジアミンの代わりにN, N, N’, N’-テトラメチルエチルエネジアミンを使用した。
実験例2
A.[Pt(en)(生物ダドー-NH 2 )(NO 3 )](NO 3 )の作成
10mlのミリポア水内にPt(en)(NO3)2(18.2mg, 0.048mmol)を溶解し、溶解するまで加熱した。生物ダドー(20mg, 0.053mmol、ボエリンジャ マンヘーム社から購入)を5mlのミリポア水内に溶解した。2溶液を共に加え、0.1NのNAOHによりペーハーを8に調整し、50℃で少なくとも3時間の間反応させた。フリーズドライにより最終製品を単離した。
B.[Pt(tmen)(生物ダドー-NH 2 )(NO 3 )](NO 3 )の作成
12.5mlのミリポア水内にPt(tmen)(NO3)2(35mg, 0.08mmol)を溶液し、溶液するまで加熱した。生物ダドー(32mg, 0.085mmol)を10mlのミリポア水内に溶解する。2溶液を共に加え、0.1NのNaOHによりペーハーを調整し、50℃で少なくとも4時間の間反応させた。フリーズドライにより最終製品を単離した。
C.[Pt(en)(ディグダドー-NH 2 )(NO 3 )](NO 3 )の作成
5mlのミリポア水内にPt(en)(NO3)2(5mg, 0.013mmol)を溶解し、溶解するまで加熱した。ディグダドー(9mg, 0.016mmol, ボーリング マンヘーム社から購入)を5mlのミリポア水内で溶解した。2溶液を共に加え50℃で少なくとも4時間反応させた。最終製品をフリーズドライにより単離した。
実験例3
A.標識dGTPの作成
[Pt(en)(生物ダドー−NH2)(NO3)](NO3)(9mg, 0.012mmol)を2mlのミリポア水内で溶液した。2’−ジオキシグアシン−5’−トリフォスフェート(2.3mg, 0.004mmol)を加え、ペーハーを6に調整した。50℃で24時間培養し、フリーズドライしミリポア水(1ml)内で再び溶解し、膜フィルタを介しフィルタ処理した。この混合液をMonoQでFPLCに加え、100%ミリポア水から100%1MのNH4HCO3へ線形傾きとなるよう純化し、好適な留分を回収し蓄えて、フリーズドライにより単離した。トリエチルアミンアンモニウムアセテート(TEAA)の100mM溶液(1ml)内に製品を溶解し、100%100mMのTEAAから50%100mMのTEAA/50%100mMのTEAA/アセトニトリル(1/1v/v)へ線形傾きになるように逆相HPLC(C18)に加え、好適な留分を回収し蓄えて、真空内で反復蒸発により溶剤を除去した。製品をカチオン交換器(Dowex)にリチウム状で通過させ、製品をフリーズドライにより単離した。
B.標識された5-AA-dUTPの作成
[Pt(en)(生物ダドー−NH2)(NO3)](NO3)(6mg, 0.008mmol)を2mlのミリポア水内に溶解した。2’−ジオキシウリジン−5−アミノアリル−5’−トリフォスフェート(2mg, 0.004mmol)を加え、ペーハーを8に調整した。50℃で24時間培養し、フリーズドライしミリポア水(1ml)内で再び溶解し、膜フィルタを介しフィルタ処理した。混合液をMonoQでFPLCに加え、100%ミリポア水から100%1MのNH4HCO3へ線形傾きとなるように純化し、好適な留分を回収し蓄えて、フリーズドライにより単離した。トリエチルアミンアンモニウムアセテート(TEAA)(1ml)の100mMの溶液内に製品を溶解し、100%100mM TEAAから50%100mM TEAA/50%100mM TEAA/アセトニトリル(1/1v/v)へ線形傾きとなるように逆相HPLC(C18)に加え、好適な留分を回収し蓄え、真空内で反復蒸発により溶媒を除去した。製品をカチオン交換器(ドオウェクス)にリチウム状で通過させ、製品をフリーズドライにより単離した。
実験例4
Pt(en)-化合物をDNAと結合するための反応
本発明によるPt化合物でDNA分子を標識付けするための代表的な反応を行った
5μgのダブルストランドのDNAを超音波処理し、ドナーズ処理して300〜500bpの留分を得、6μgのPt(en)化合物が加えて、溶液が脱イオン化された水で50μlに調整した。反応混合液を1時間65℃で培養した。非結合Pt(en)化合物が100μlのNADDTC溶液を加えることによりブロック化された。DNA標識されたPt(en)−化合物はソファデックスG−50コラム上で純化した。容易に標識付けされ純化されたDNAを−20℃で保存されあるいはDNAプローブを基材とする試金内で直接使用した。DNAプローブと標識付けされたPt(en)化合物は活性損失および/あるいは特異性なく−20℃で少なくとも2年間保管可能である。上述のすべての応用はこの手順にしたがって標識付けしたプローブで実行した。
実験例5
[Pt(en)(生物ダドー−NH2)(NO3)](NO3)でDNAプローブのビオチン標識付け、(生物ダドーULS)
先ず:
DNAプローブを現場混成(ISH)用のビオチンで標識付けするするためにこの標識付け法を使用した。この実験例の場合品質管理手順用の手順およびデータを含む標識付け法が提示された。ビオチン標識付けでは、ヒューマン パピロマ ビラス タイプ6(HPV−6,40% GCベースパイアーズ)のプラスミド・クローン化された全DNAを使用した。
実験手順
プラスミドDNA作成
ヒューマン パピロマ ビラス タイプ6の全DNAがベクターpSp−64にクローン化された。プラスミドDNAはイー.コリイ(C−66)内に移動し、LBプレートを含むアムピシーリン上にプレート化した。単一のコロニーを大量培養で一晩中成長させた。
プラスミドDNAはビエアンボイム・ドーリイ法に従って単離し、制限酵素分析により挿入体に対しチェックした。プラスミドDNA濃度はA260/280吸収法により決定した。
エタノール沈殿後、このDNAは10mM TRIS/HCl Ph7.2,0.3mM EDTA内で1μg/μl(バッチ#:150894)の最終濃度まで再構成した。次にこのDNAは氷上で10分間3度超音波処理した(ソニプル150.,MSE)。
結果としてのDNA留分のサイズは2%アガロースゲル電気泳動法により決定し、200〜400バセペイア(バッチ#:051094)の間にあることが判明した。
プラスミドDNA標識付けおよび純化:
プラスミドHPV−6 DNAを次の試薬(1),(2),(3)を混合することによりビオダドー−ULSで標識付けした。
(1) プラスミドHPV−6DNA 5μl(1μg/μl)
(バッチ#:051094)
(2) ビオダド−ULS標識付け試薬 8μl(1μg/μl)
(バッチ#:BX940830)
(3) 脱イオン化した水(<0.2/μS/cm) 37μl
50μlの反応混合液は85℃で15分間培養した。
50μlのジテイルデイシオカーバメイト溶液(脱イオン化された水内で2%液)を加え室温で30分間培養することにより培養した。
非結合ビオダドー−ULSがS300HRマイクロスピン コラム(パルマシア)を用いサイズエクスクルージョンクロマトグラフ法により除去した。溶離剤容積は500μlにし、10ng/μlビオチンHPV−6プローブ濃度(バッチ#:061094)にした。
検出限度の品質管理:
本発明のビオチンプローブの検出限度は次の手順に従い直接スポットブロト法および逆フィルタ混成法により決定した。
直接スポットブロト:
本発明によりビオチンで標識付けされたHPV−6(バッチ#:061094)は900mM塩化ナトリウム、900mMナトリウムシトレイト、200μg/mlの単一ストランドのサロムスパームDNAからなるスポットバッファ内に10倍順次希釈し、希釈をul当たり1000〜0.1pgビオチンプローブ順次変化した。1μlスポットはニトロセルローズ膜上にかけ、80℃で2時間培養してDNAが結合した。
ビオチンプローブは次の手順A),B),C),D)に従いnbt/bcip沈殿基質液(シグマ社)と組み合わせてスレプトアビディン-アルカリン・フォスファターゼ・コンジュゲート液(シグマ社)を用いて可視化した。
A) 膜は0.5〜20%(TBST)を含むTBS溶液内に5分間侵浸した。
B) 膜は37℃で15分間TBSTでStrep−AP(3DEAU/ml)dで培養した。
C) NC膜はTBS溶液内で5分間3度洗浄し、次に脱イオン化された水で5分間洗浄した。
D) 膜は37℃で15分間NBT/BCIP基質溶液で培養し、次に脱イオン化された水で洗浄され空気中で乾燥した。
結果:
この方法を行うことにより、本発明によるビオチンDNAプローブの検出限界が1pgより低いことが判明した。
逆フィルタ処理混成法:
HPV−6 DNA(バッチ#:051094)は0.1N NaOH内で(1in 10)希釈し、100℃で5分間培養し、5分間氷上に直接置いてDNA単一ストランドを形成した。
10倍順次希釈が冷たい0.1N NaOH内で行い、μl当り10,000〜1pg DNAと順次変化した。1μlスポットがナイロン膜(Boehringer Mannheim)上に置かれ空気乾燥した。
本発明によりビオチンで標識付けされたHPV−6 DNAプローブが5xSSPE 0.5% SDS溶液で希釈して濃度が200ng/mlとなった。この溶液は100℃で5分間培養し、5分間氷上に直接置いた。
目標のDNAを含むナイロン膜は5分間2x SSC内に侵浸し、次に37℃で2時間単一ストランドのプローブ溶液で培養した。
余分のビオチンプローブを37℃で10分間2x SSPE 0.1% SDS内で3回変更して除去し、次に5分間TBST培養した。
本発明のビオチンプローブは直接スポットブロト法で説明したと同じ手順を行うことにより可視化した。
結果:
この手順で行うことにより、本発明によるビオチンプローブの検出限界が10pgより低いことが判明した。
現場混成法の性能:
テスト材料はオーガノシレンが被覆されたガラススライド上に装着したHPV−6正カービカル コンデイロマの6μmパラフィンセクションでなっていた。
次の手順を実施した(特に指定に従い室温で行った)。
1.パラフィンセクションは3回キシレンで脱蝋され等級エタノールで水和化した。
2.セクションは5分間TBSTで洗浄した。
3.セクションは37℃で30分間0.1N HCl内に0.25%ペプシンで蒸解し、等級エタノールで脱水し空気乾燥した。
4.10μlのプローブ溶液をセクションにかけ、カバースリップで被覆された。
プローブ溶液は0.6M NaCl、0.06Mナトリウムシトレイト、35%フォーマミッド、10%デクストランスフェイト、2,5xデンハーデイットおよび10μg/ml単一ストランドサロン スパームDNAからなる混成混合液内に溶解された2ng/μlの濃度で本発明により標識付けしたビオチンHPV−6 プローブDNA(バッチ#:061094)からなっていた。
5.スライドを5分間95℃に設定し、ホットプレート上に置いて、プローブおよび目標であるDNAが同時に変性した。
6.混成はスライドを37℃で加湿チャンバ内で2時間置くことにより行った。
7.カバースリップは除去し、スライドは15mM NaCl、1.5mMナトリウムシトレイトおよび5%フォーマミドで3回変え、37℃で10分間洗浄した。
8.スライドはTBSTで洗浄した。
9.セクションは37℃で15分間スレプトアビディンAPコンジュゲート液(TBST内で3DEA U/ml)で培養した。
10.スライドはTBST(3x)および脱イオン化された水内で洗浄した。
11.セクションは37℃で15分間NBT/BCIP基質液で培養した。
12.スライドは脱イオン化した水(3x)内で1分間洗浄し、セクションはグリセロール/ジェラチン内に装着した。
結果:
これらのセクションを使用することにより、HPV−6感染された細胞および残りの組織内の小さなバックグラウンドの場所に青/紫色の沈殿物が見られた。
結論:
この結果本発明により標識付けしたDNAは良好な検出限界を有していることを示している。本発明の方法は、実行が迅速、容易で感度が高く、酵素工程を含まず、再生性が極めて高く、低コストでの製造に適しているので、研究、定常作業、標識核酸の産業的生産に極めて良好に使用できる。また本発明の方法は従来の非等方性標識付け法に匹敵する有用な別途の方法を提供し得る。
参考文献:
1.マニアティク ティー.、サムブロック ジエイ.、フリッチ イー.エフ.、モルキュラ クローニングによるコールド スプリング ハーバー研究所発行,ISBN 0-8769-309-6第2版
2.ケラー ジー.エイチ.、マナック エム.エム.によるDNAプローブ、ストックトン発行のISBN 0-333-47659-X
用途:
1.本発明のPt-DNAリンカをいわゆるLIDIA技術に使用、リンクDNAイムノ試金(Assay)
LIDIA技術により、例えば出発材料のPCR増幅後少量のDNA(あるいはRNA)が定量分析できる。この技術は本発明の迅速DNA(RNA)Pt標識付け工程のため特定のDNA(RNA)プローブを本発明により容易に実行できるので、感度が高く独特の特徴を持つことになる。
技術の説明:
この技術では、本発明の迅速白金(Pt)標識化合物を使用してDNA(RNA)プローブを標識付けする。
この技術は3つの異なる方法(1),(2),(3)で可能となる。
(1) プラスチック、ナイロンあるいはニオセルローズに対し非可逆的にDNA分子を架橋する本発明による白金化合物を用いることにより、DNAプローブ分子を面に対し結合する。次に目標の検出は古典的標識DNA/RNAプローブを用いることにより達成できる(ニックトランスレイションあるいは化学的変性、ランダムプライミング)。
(2) 検出可能な基をDNAに対し結合し、DNA分子を、いわゆるDNAプローブ内に溶出させる。次にDNA化合物の面に対する結合は、化学では周知な古典的な技術を用い(特殊処理されたマイクロティタ・プレートに対し共有結合)、ニトロセルローズ上でDNAプローブを焼成したりあるいはナイロン膜に対しDNA分子を結合することにより、達成できる。
(3) 技術(1),(2)の組み合わせ。
アプローチ1:
不動化されたDNAプローブは混成技術を用いサンプル内の特定の目標分子を捕獲するのに使用できる。形成された混成物の検出は、異なる技術を用いることにより可能であり、例えば第2の標識DNAプローブを用いて、目標DNA分子上の別の場所で混成してサンドイッチ混成物を形成する。次に標識は最新技術の免疫学的検出/着色技術を用いることにより、検出可能である。
アプローチ2:
(増幅され)検出可能なDNA(RNA)を含む溶液は本発明による手順により直接標識付けされる。
余分な標識はNaDDTCあるいはチオ尿素(Thioureum)を加えることにより急冷される。このアプローチは、他の試金が標識付けされる場合に比べ目標分子が標識付けされ、DNA(RNA)プローブがその目標を検出するために使用されるという点で、他の技術と異なる。本発明の白金標識化合物が迅速に結合可能であるので、診断テスト手順のルーチン工程としてDNA結合工程が可能である(通常の結合時間は65℃で60分である)。
第2の工程は目標特定プローブで予め被覆されたマイクロティタ・プレートで実行される。培養により安定した“標識目標”及びプローブ混成物が形成される。目標分子を直接標識付けすることにより、1プローブを目標を捕獲するのに使用し別の標識プローブを不動化された目標を検出するために使用するような煩雑なダブル混成技術を省略できる。
この方法ではプローブは井戸の面までマイクロティタ・プレートに対し共有的に結合される。第2の培養工程は液体混成の特性を有しているので、極めて迅速に実行可能である。これは定量的DNA混成技術に対するこのアプローチの主な改良的特徴の一である。
アプローチ3:
DNAプローブ若しくはDNA目標の不動化のため、且つDNAプローブおよびDNAプローブと目標の標識付けのため、新たに開発された白金システムが使用可能になる。これらの2DNA結合技術は、“キャッチャ”および“検出器”の両方が第2の物質(ビオチン、ジオキシゲニンのような検出可能な基あうりはプラスチックスティック、ミクロ滴定濃度プレートあるいは膜のようなキャリア面)に対し結合される一の試金に組み合わされる。
この技術の例:人間診断でのSTDに関連した微生物の検出(クライディア,シンフィリス,AIDS, ハーペス,ゴノアフォイア,Hep. B,)。
2.テストストリップ手順およびフォーマットと組み合わせての本発明の白金DNA標識の使用:
DNAディップスティック技術により、少量のDNA(あるいはRNA)が例えばPCR増幅後あるいは人体液(血、尿、汗等)のサンプルに自由に存在した後、定性的および半定性的分析が可能である。
本発明による迅速DNA(RNA)白金工程のため特定のDNA(RNA)プローブを使用し実行が容易であるので、この技術は感度が高く特異である。
新たに開発し白金標識付けの汎用性のある方法の特徴は結合DNA(RNA)分子を得るに以下の3通り(1),(2),(3)を使用できる。
(1) 検出可能なマーカー基をポリヌクレオチド序列に結合するのに使用できる。
(2) ポリヌクレオチド序列を固相(プラスチック、膜、ラテックスビード、ヒドロゾルあるいはマイクロティタ・プレート井戸(well))に対し結合するのに使用できる。
(3) 上記(1)と(2)の組み合わせ。
Ad 1:
本発明の実験例では、テストサンプルでのバイオリティクス生物アナリティスを検出するに2通りの方法がある。第1の方法では、DNAプローブが新たに開発された白金標識物化合物で標識付け可能である。次にこの標識プローブは目標DNA序列と一次プローブとの間に形成される膜上の予め形成された混成物を検出するに使用される。この方法では一次プローブが二次白金標識プローブより目標上の別の序列を認識することが重要である。実際上はこれはDNA混成で達成できる。POLY AプローブはすべてのRNA(そのpolyTテイル(tails)により認識可能)を膜に対し不動化するときに一次プローブとして使用される。
第2の方法は迅速および極めて特異な白金標識付けの特徴により、この場合目標はテストサンプル液内で標識付け可能であるという点で僅かに異なる。このような手順は好適な膜上の標識付けされていない特定の不動DNAプローブで標識目標を捕捉する。従ってDNA(RNA)用途のディップスティックバージョンである。
Ad 2:
DNAプローブあるいは目標DNAを不動化するため、非標識白金化合物(即ち2自由結合場所を有する白金化合物)がDNAとキャリア(プラスチック、膜、マイクロティタ・プレート等)の表面との間のブリッジとして作用すべく使用可能である。
DNAを容易且つ自由に結合する物質は化学的には殆ど知られていないので、診断試金内のキャッチャ分子としてDNA序列の利用性が顕著に向上される。この白金ブリッジ分子を紹介することにより、DNA技術の広範囲な新たな分野の用途に採用可能になった。
Ad 3:実験例1と2の組合せ
一般に本発明の白金化合物をラテックスあるいはヒドロゾルにしようすることは特に注目すべきことである。この化合物によりDNA分子が小さな粒子と結合可能になる。DNA分子は目標材料に対し混成化可能である。確実な反応はDNA混成粒子化合物の架橋によって粒子の凝集により可視化される。
このようなテストは定量化でき、凝集速度は特定の波長に対し調整され測定される。特に金粒子は最適波長のシフトが凝集後に生じるという固有特性を有している。
3.銀-エンハンスメント技術による本発明の白金酸塩化されたDNAプローブの検出。
白金酸塩化されたDNA(RNA)プローブはサンプル材料内のDNA(RNA)序列を検出するのに混成法で使用可能である。所定の場所に白金化合物を導入することにより、特にイオン銀を金属銀へ還元するよう構成された化学反応で銀分子を沈殿させることができる。白金核の触媒作用のため、白金核の場所で金属銀(黒)が分解される。
イオン銀は溶液内の還元剤(例えば、Na-ボロハイブリッド、ハイドロチノン)により還元される。一定比では、白金上に沈殿された銀の量はエンハンスメント培養の長さに比例する。非可視の白金核の可視化はテストサンプル内のブラックスポットの出現を経験的に観察することにより達成可能である。
ブラックスポットは特定プローブの結合場所、従って特定の目標位置の場所を示す。この技術により各種微生物あるいは遺伝子の遷移/異常を検出する診断手順が迅速且つ容易に可能になる。
Claims (12)
- 次の構造式(I)のリンカの反応性成分を標識成分と反応させる工程と、リンカの他の反応性成分をヌクレオチドと反応させる工程とを包有する、
- 標識がビオチン、アビディン、スレプトアビディンまたはジグオキシゲニンである請求項1の方法。
- 少なくとも一のヘテロ原子が酸素原子である請求項1または2の方法。
- スペーサの鎖が実質的に分岐のない請求項1〜3のいずれか一の方法。
- スペーサが1,8−ジアミノ−3,6−ジオキサオクタンである請求項1〜4のいずれか一の方法。
- スペーサがオリゴリシン若しくはポリリシンである請求項1〜4のいずれか一の方法。
- Xがエチレンジアミン基である請求項7の方法。
- 請求項1〜8のいずれか一の方法で得られる標識付けした物質。
- 少なくとも1個のヘテロ原子が酸素原子である請求項9の標識付けした物質。
- スペーサが1,8−ジアミノ−3,6−ジオキサオクタン、オリゴリシン、またはポリリシンである請求項9の標識付けした物質。
- 標識およびスペーサが共に、請求項7に記載の標識成分を形成する請求項9〜11のいずれか一の標識付けした物質。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010166914A (ja) * | 1996-10-08 | 2010-08-05 | Kreatech Biotechnology Bv | ヌクレオチドを標識付けする方法、標識ヌクレオチド及び有用な中間体 |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6458373B1 (en) | 1997-01-07 | 2002-10-01 | Sonus Pharmaceuticals, Inc. | Emulsion vehicle for poorly soluble drugs |
EP1006199A1 (en) * | 1998-12-03 | 2000-06-07 | Kreatech Biotechnology B.V. | Applications with and methods for producing selected interstrand crosslinks in nucleic acid |
EP1218547A4 (en) * | 1999-10-15 | 2005-04-20 | Ventana Med Syst Inc | METHOD FOR DETECTING UNIQUE GENE IN SITU COPIES |
US6376669B1 (en) * | 1999-11-05 | 2002-04-23 | 3M Innovative Properties Company | Dye labeled imidazoquinoline compounds |
GB0016836D0 (en) | 2000-07-07 | 2000-08-30 | Lee Helen | Improved dipstick assays (1) |
ATE334230T1 (de) | 2001-03-02 | 2006-08-15 | Stratagene California | Zusammensetzungen und verfahren mit platinverbindungen zur nukleinsäuremarkierung |
DE60131070T2 (de) * | 2001-05-28 | 2008-08-07 | Kreatech Biotechnology B.V. | Ein Verfahren zur differentiellen Markierung mittels Platin-Komplexen |
US7166478B2 (en) * | 2002-03-12 | 2007-01-23 | Enzo Life Sciences, Inc., C/O Enzo Biochem, Inc. | Labeling reagents and labeled targets, target labeling processes and other processes for using same in nucleic acid determinations and analyses |
CA2498713A1 (en) * | 2002-09-17 | 2004-04-01 | Richard Abraham Joseph | Real-time detection of nucleic acid reactions |
US20050028450A1 (en) * | 2003-08-07 | 2005-02-10 | Wen-Qing Xu | CMP slurry |
US20060281100A1 (en) * | 2005-06-14 | 2006-12-14 | Shen Gene G | Thiotriphosphate nucleotide dye terminators |
EP1745802A1 (en) | 2005-07-20 | 2007-01-24 | Kreatech Biotechnology B.V. | Method of conjugating therapeutic compounds to cell targeting moieties via metal complexes |
JP5256026B2 (ja) * | 2006-04-27 | 2013-08-07 | 株式会社ワンセル | ヌクレオチド−遷移金属錯体触媒 |
EP2944647A1 (en) | 2007-07-26 | 2015-11-18 | Cellay, Inc. | Highly visible chromosome-specific probes and related methods |
KR101072900B1 (ko) * | 2007-12-04 | 2011-10-17 | 주식회사 파나진 | 고정화된 펩티드핵산 프로브를 사용한 표적핵산의 선택적 표지 및 검출 방법 |
CA2860528A1 (en) | 2012-01-06 | 2013-07-11 | Linxis B.V. | Method for preparing cell targeting conjugates using functional metal ion constructs |
CN109030698B (zh) * | 2018-08-06 | 2020-09-04 | 泰山医学院 | 一种液相色谱法检测固体福美钠纯度的方法 |
CN108760961B (zh) * | 2018-08-06 | 2020-09-22 | 青岛中科荣达新材料有限公司 | 一种液相色谱法检测固体福美钾纯度的方法 |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4207416A (en) * | 1974-09-05 | 1980-06-10 | Engelhard Minerals & Chemicals Corporation | Ethylenediamineplatinum(II) 2,4-dioxopyrimidine complexes |
JPS6087295A (ja) * | 1983-10-19 | 1985-05-16 | Nippon Kayaku Co Ltd | 新規白金錯体 |
ATE40572T1 (de) * | 1985-01-10 | 1989-02-15 | Molecular Diagnostics Inc | Photochemisches verfahren zum markieren von nucleinsaeuren zum nachweis in hybridisationsproben. |
JPS63203692A (ja) * | 1987-02-19 | 1988-08-23 | Nippon Kayaku Co Ltd | 新規白金錯体 |
EP0386243A4 (en) * | 1987-11-06 | 1990-10-10 | Sagami Chemical Research Center | Platinum (ii) complexes |
US5552541A (en) * | 1990-06-20 | 1996-09-03 | Beckman Instruments, Inc. | Haptenic probes for detecting capture polynucleotides |
US5714327A (en) * | 1990-07-19 | 1998-02-03 | Kreatech Diagnostics | Platinum-containing compounds, methods for their preparation and applications thereof |
NL9001639A (nl) * | 1990-07-19 | 1992-02-17 | Amc Amsterdam | Pt-houdende verbinding, werkwijze voor de bereiding ervan, alsmede toepassing van dergelijke verbindingen. |
DE69331319T2 (de) * | 1992-06-09 | 2002-08-08 | Neorx Corp., Seattle | Biotin-DOTA Konjugate und deren Verwendung in "Pretargeting" Verfahren |
JPH0698797A (ja) * | 1992-09-22 | 1994-04-12 | Toyobo Co Ltd | 核酸検出法 |
DE4344742A1 (de) * | 1993-06-09 | 1994-12-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuren |
DE4326466A1 (de) * | 1993-08-06 | 1995-02-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | Infrarot-Farbstoff-markierte Nucleotide und ihre Verwendung in der Nucleinsäure-Detektion |
EP1019420B1 (en) * | 1995-05-09 | 2003-08-06 | Kreatech Biotechnology B.V. | Methods for the production of platinum-based linkers between labels and bio-organic molecules, for labelling bio-organic molecules, for detecting biological substances of interest |
NZ334803A (en) * | 1996-10-08 | 2000-05-26 | Kreatech Biotechnology Bv | Method for labeling nucleotides by reacting a reactive platinum compound having two reactive moieties, a labeled moiety and another moiety of a spacer with a nucleotide |
-
1997
- 1997-10-08 NZ NZ334803A patent/NZ334803A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-10-08 ES ES97943223T patent/ES2182121T3/es not_active Expired - Lifetime
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- 1997-10-08 AT AT97943223T patent/ATE221894T1/de active
- 1997-10-08 EP EP97943223A patent/EP0937090B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-08 AU AU44746/97A patent/AU726692B2/en not_active Expired
- 1997-10-08 PT PT97943223T patent/PT937090E/pt unknown
- 1997-10-08 JP JP51741498A patent/JP4981197B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-08 CA CA002267133A patent/CA2267133C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-08 DK DK97943223T patent/DK0937090T3/da active
- 1997-10-08 US US10/900,902 patent/USRE40557E1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-08 WO PCT/NL1997/000559 patent/WO1998015564A1/en active IP Right Grant
- 1997-10-08 US US09/402,707 patent/US6338943B1/en not_active Ceased
-
2002
- 2002-01-14 US US10/047,874 patent/US6797818B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-09-27 US US10/950,985 patent/US7217813B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-01-29 JP JP2010019643A patent/JP2010166914A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010166914A (ja) * | 1996-10-08 | 2010-08-05 | Kreatech Biotechnology Bv | ヌクレオチドを標識付けする方法、標識ヌクレオチド及び有用な中間体 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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