JP5256026B2 - ヌクレオチド−遷移金属錯体触媒 - Google Patents
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Description
また、特開2003−267990号公報(特許文献2)には、塩基部分としてペプチド基を有するデオキシリボヌクレオチド残基を構成単位として含む新規なオリゴヌクレオチドよりなるデオキシリボザイムが開示されている。このデオキシリボザイムは、部位特異的RNA切断を触媒する。
特表2003−506078号公報(特許文献3)には、転写因子NF-κBのサブユニットをコードするmRNA分子に対して標的化して、RelA(p65) mRNAを特異的に切断するデオキシリボザイムが開示されている。
また、三次元構造を認識するDNAアプタマーに、プロトポルフィリン骨格を持つヘミンを認識させたものを作製し、ヘミンのパーオキシダーゼ様触媒活性を調べた報告がされている(非特許文献7、8)。しかし、ヘミンは鉄にプロトポルフィリンが配位子として周囲に結合している構造であり、DNAと錯体を形成しているわけではない。しかも、ヘミン分子はパーオキシダーゼ活性の基質となるルミノールにそもそも反応するので、DNAの反応というより、ヘミンの触媒反応というべきものである。
RNAのリボヌクレアーゼA(RNaseA)による加水分解は12位のヒスチジン残基によって開始され、ヒスチジン残基は2'-OH基からプロトンを求引し、リンとともに5配位遷移状態中間体を形成することによって塩基触媒として働くことが報告されている(非特許文献9)。また、119位のヒスチジン残基は環外P-(5'-O)結合切断後、プロトンを脱離5'−酸素に供給することによって酸触媒として働くことが明らかとなっている。
しかしながら、遷移金属錯体と結合したRNAが、RNA単独、遷移金属錯体単独、及び該錯体の配位子単独では示さない触媒活性を示すことは、これまで報告されていない。
更には、遷移金属錯体と結合した単量体又はオリゴマー(例えば5〜20量体程度)のヌクレオチドが、当該ヌクレオチド単独、遷移金属錯体単独、及び該錯体の配位子単独では示さない酵素活性を示すことは、これまで報告されていない。
しかしながら、従来のタンパク質からなる酵素を用いると、化学的安定性が低いために長期保存の間に触媒活性が失活したり、或いは高温での反応には不適切であったりするという問題があった。
したがって、本発明によれば、遷移金属と単量体若しくは多量体のヌクレオチド又はそれらのアナログとの錯体からなる触媒が提供される。
本発明の触媒は、人工的に大量に合成可能であるので、天然由来酵素と比較して安価に製造できる。加えて、容易に高純度品として取得できる。
本発明の触媒は、その触媒活性を保持したままで、タンパク質や核酸のような他の物質に容易に結合させることができる。
上記錯体においては、少なくとも1つの配位子が単量体若しくは多量体のヌクレオチド又はそのアナログであればよく、残りの配位子はヌクレオチドに限定されない。
同一の遷移金属(中心金属)に2つ以上のヌクレオチド又はそのアナログが配位子として結合している場合、それらのヌクレオチドは、別個の単量体又は多量体ヌクレオチドであってもよいし、同一の多量体ヌクレオチド中の異なるヌクレオチドであってもよい。
また、配位子が多量体のヌクレオチド又はそのアナログである場合、同一の多量体ヌクレオチド中の異なるヌクレオチドが、それぞれ異なる遷移金属(中心金属)に配位子として結合していてもよい。
白金は、例えば、錯体中で-PtCl2-、-PtCl3、-PtCl(H2O+)-、-Pt(H2O+)2-、-PtCl2(H2O+)、-PtCl(H2O+)2、-Pt(H2O+)3、-PtCl(NH3)2、-Pt(NH3)2-又は-Pt(H2O+)(NH3)2の形態でヌクレオチド又はそれらのアナログと結合している。
多量体ヌクレオチド中のヌクレオチドの上限は、特に限定されないが、例えば10万以下であり得る。
多量体ヌクレオチドは核酸であり得、より好ましくは一本鎖核酸である。核酸は、デオキシリボ核酸(DNA)及びリボ核酸(RNA)のいずれであってもよい。核酸(特にDNA)中のホスホジエステル結合は、タンパク質中のペプチド結合と比べて加水分解に対して100倍以上安定であるので、核酸(特にDNA)と遷移金属との錯体からなる触媒は、タンパク質酵素より化学的に安定であり、長期間の貯蔵を経ても失活し難い。また、高温下でも活性を維持し得る。DNAはRNAと比べても安定性が高いので特に好ましい。
生体由来のDNAとしては、例えば、ウシ胸腺由来のDNA、サケ精子由来のDNA、サケ精子由来の一本鎖DNA、大腸菌由来のDNA、ラムダファージDNA、ヒト細胞由来DNA等が挙げられる。生体由来のDNAは、生体組織から抽出等により得ることができるが、市販のものを用いてもよい。
本発明においてはDNAは塩基数が1から10万までのものが利用できる。
同一配列を有するDNAは、鋳型のDNAをPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法で増幅させることにより簡便に大量に製造することができる。
生体由来のRNAとしては、例えば、イースト菌由来のRNA、イースト菌由来の転写RNA等が挙げられる。生体由来のRNAは、生体組織から抽出等により得ることができるが、市販のものを用いてもよい。
本発明において、RNAは塩基数が1から10万までのものが利用できる。
白金錯体としては、ヌクレオチド又はそのアナログの塩基と反応し得る配位子を少なくとも1つ持つ錯体を使用することができるが、配位子交換反応によってヌクレオチド又はそのアナログの塩基と反応し得る遊離配位子として、例えば、Cl、H2O、NO3、CN、N3、(CH3)2SO、PO4、CO3などを持つ白金錯体が使用できる。例えば、テトラクロロ白金カリウム(II)(K2[PtCl4])、シス−ジクロロジアミン白金(II)(CDDP:シスプラチン)、ブリプラチン、カルボプラチン(CBDCA)、パラプラチン、アクプラ(Nedaplatin;254-S)、トランス-ジクロロジアミン白金、テトラクロロジアミン白金、イプロプラチン、マロナト白金、DACCP、Pt(dien)Cl、ジクロロ(N-エチルエチレンジアミン)白金(II)(非特許文献11中の図1参照)、ジクロロ(N-プロピルエチレンジアミン)白金(II)(非特許文献11中の図1参照)等を挙げることができる。
水性反応媒体は、ヌクレオチド又はそのアナログと遷移金属の錯体との反応に干渉しない任意の水性反応媒体であり得るが、例えば、リン酸緩衝溶液、ホウ酸緩衝溶液及びリン酸水素二ナトリウム-水酸化ナトリウム緩衝溶液からなる群より選択できる。
反応時間は、反応温度に依存する。反応温度を室温程度とする場合(例えば遷移金属錯体がテトラクロロ白金カリウム(II)である場合)には、反応時間は1時間以上が望ましい。反応温度をより高く設定できれば反応時間をより短く設定できる。例えば、80〜98℃の反応温度(例えば遷移金属錯体がシス−ジクロロジアミン白金(II)の場合)では、例えば10分間以上とすることができる。
上記の本発明の触媒はまた、タンパク質酵素による触媒反応を利用する従来の検出・定量法及びそのための試薬において、該酵素の代替品として使用することができる。
ここで、検出対象物質に特異的に結合し得る物質は、例えば、抗体(例えばIgG抗体、IgM抗体など)若しくは抗体フラグメント、アビジン、プロテインA、プロテインG、レクチンなどのような分子認識能を持つタンパク質、又はヌクレオチドプローブ(核酸プローブ)である。
本発明の触媒は、タンパク質にマレイミド誘導体を反応させることにより、また金コロイドやデキストラン、ポリエチレングリコール、セラミック製ビーズ、プラスチック製樹脂ビーズなどの介在物質を介してタンパク質と結合させることができる。
上記試薬はまた、サンプルと接触させ、未結合の試薬を除去した後に触媒活性を測定し、測定値を予め決定した標準曲線と比較することによって、サンプルにおける検出対象物質の存在量を定量するために使用することができる。
本発明の使用は、50℃以上で行われる高温の酸化反応おいても好ましい。
酸化触媒としての使用の態様には、例えば、酸化触媒反応を検出/定量に利用する標識としての使用、検出用又は定量用の試薬の製造における使用も包含される。
TE緩衝液を以下に示す方法で調製した:トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(121.14g/mol)1.21g(10mmol)とエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物(372.2g/mol)0.37g(1mmol)を1Lの純水に溶解した。この水溶液をオートクレーブで一時間滅菌した後、冷却した。このTE緩衝液のpHを8.0に0.1MのNaOH水溶液又は0.1MのHCl水溶液にて調製した。
サケ精子由来の単鎖DNA(D-7656、分子量468,000、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入)又はアデニン[A]とグアニン[G]とが交互に繰り返す配列AGAGAを有する5量体DNAを純水に溶解させて1000ppmのDNA溶液を調製した。
1.5mLのエッペンドルフチューブ中に、70μLのリン酸緩衝溶液(pH7.0)、5μLの白金錯体溶液と25μLのDNA溶液をそれぞれ加え、アルミホイルで遮光した後、室温(25℃)で24時間、pH7.0の条件で反応させてDNA-白金錯体複合体を調製した。同様に120時間反応させたDNA-白金錯体複合体も調製した。
20量体のDNA(アデニン20量体(A)20、グアニン20量体(G)20、シトシン20量体(C)20、チミン20量体(T)20、アデニン+グアニンの10量体((AG)10、全20量体 シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入、カートリッジ精製品、各1.0μmol))を用いた以外は実施例1と同様にして、精製DNA-白金錯体複合体を調製した。
調製したDNA-白金錯体複合体の触媒活性を計測するために、過酸化酵素(パーオキシダーゼ)活性を以下に測定した。
以上より、DNA-白金錯体複合体には、過酸化酵素活性があることが明らかとなった。
DNA-白金錯体複合体の代わりに、20量体のDNA(アデニン[A]20量体、グアニン[G]20量体、シトシン[C]20量体、チミン[T]20量体、アデニン[A]とグアニン[G]が連結した[A−G]の10量体((AG)10、全20量体 、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入、カートリッジ精製品、各1.0μmol)を用いた以外は、実施例2と同様にして、過酸化酵素(パーオキシダーゼ)活性を以下に測定した。
DNA-白金錯体複合体の代わりに、テトラクロロ白金(II)酸カリウム(K2[PtCl4]=415.9g/mol、N.E. Chemicat株式会社)を用いた以外は、実施例2と同様にして、過酸化酵素(パーオキシダーゼ)活性を以下に測定した。
上記のテトラクロロ白金(II)酸カリウムをTE緩衝液(pH8.0)0.2mlに溶解させて、500nmol/Lの溶液とした後に、24穴プレートの各穴に0.18mLずつ入れた。さらに、24穴プレートの各穴に過酸化水素酵素の基質である3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン溶液(TMB過酸化酵素基質溶液A、フナコシ株式会社製、50-76-01)と過酸化水素溶液(0.02%過酸化酵素基質溶液B、フナコシ株式会社製、50-76-00)を等量に混合した溶液0.18mLを加え、アルミホイルで遮光したのち、20分間マイクロ振とう器にかけた。その後、リン酸(和光純薬工業株式会社、特級)1mol/L溶液を、TMB反応停止薬として、TMB反応後の各24穴プレート中の混合溶液に0.18mLずつ加えて反応を停止させた。
サケ精子由来の単鎖DNA(D-7656、分子量468,000、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入)及びサケ精子由来の二本鎖DNA(D-1626、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入)を用いて72時間反応させた以外は、実施例1と同様にして精製DNA-白金錯体複合体を調製した。さらに、5pmolの精製DNA-白金錯体複合体又は5pmolのホースラディッシュパーオキシダーゼ(1000 unit/mg、D-7656、分子量40,000、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入)を用いた以外は、実施例2と同様にして、DNA-白金錯体複合体及びホースラディッシュパーオキシダーゼの酵素(触媒)活性を測定した。その結果を図4に示す。分子量の大きなサケ精子由来のDNAを用いても、DNA-白金錯体複合体には、酵素活性があることが明らかとなった。さらに、二本鎖DNA(図4中、二本鎖DNAの分子量は、936,000として記載)を用いて調製されたDNA-白金錯体複合体よりも一本鎖DNAを用いて調製されたDNA-白金錯体複合体の方が酵素活性が高いことが明らかとなった。また、pH11の反応条件で調製したDNA-白金錯体複合体は、市販の酵素(ホースラディッシュパーオキシダーゼ)と、同等の酵素(触媒)活性を示すことが明らかとなった。
実施例1と同様にして、1量体(アデノシン一リン酸(AMP)、アデノシン三リン酸(ATP))、アデニン10量体、アデニン15量体、アデニン20量体DNA(アデニン10量体、15量体、20量体はシグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入、カートリッジ精製品、各1.0μmol)及びサケ精子由来の単鎖DNA(D-7656、分子量468,000、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入)を用いて、pH9の条件で、24時間反応させて、精製DNA-白金錯体複合体を調製した。5nmol/Lの精製DNA-白金錯体複合体を用いた以外は、実施例2と同様にして、DNA-白金錯体複合体の酵素(触媒)活性を測定した。その結果を図5に示す。ATP及びAMPは1量体であるために、反応性が高いためか、10〜15量体とほぼ同様の酵素活性を示していたが、10量体以上のDNAを用いて調製されたDNA-白金錯体複合体における単位分子鎖当たりの酵素活性は、DNAが長鎖になるほど高くなることが明らかとなった。アデニン10量体、15量体、20量体のDNAでは1残基あたり、それぞれ0.014、0.014、0.013ユニット/Lの酵素(触媒)活性を示していた。すなわち、pH9の条件で、24時間反応させて調製された上記の精製DNA-白金錯体複合体は、0.014±0.001ユニット/Lの酵素(触媒)活性を示すことが明らかとなった。
同様な実験をアデニン2量体および5量体(いずれもシグマアルドリッチシグマカスタム合成依頼カートリッジ精製製品)で行った。5量体は10量体のほぼ半分の活性を示した。2量体はATPに匹敵する活性を示した。
実施例1と同様にして、サケ精子由来の単鎖DNA(D-7656、分子量468,000、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入)を用いて、pH9、11の条件で、72時間反応させて、精製DNA-白金錯体複合体を調製した。精製DNA-白金錯体複合体又はホースラディッシュパーオキシダーゼ(1000 unit/mg、D-7656、分子量40,000、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入)を用いた以外は、実施例2と同様にして、DNA-白金錯体複合体及びホースラディッシュパーオキシダーゼの酵素活性を測定した。その結果を図6に示す。いずれの場合においても、DNA-白金錯体複合体又はホースラディッシュパーオキシダーゼ濃度が高くなるにつれて、酵素活性は上昇することが明らかとなった。特にpH11の条件で、72時間反応させて調製したDNA-白金錯体複合体は、ホースラディッシュパーオキシダーゼと同等の酵素(触媒)活性を示すことが明らかとなった。また、DNA-白金錯体複合体濃度の増加とともに、酵素(触媒)活性は、ホースラディッシュパーオキシダーゼと同様に増加することから、ホースラディッシュパーオキシダーゼが使用されている酵素免疫法に基づく医療診断キットにおいて、DNA-白金錯体複合体をホースラディッシュパーオキシダーゼの代わりに用いることが可能であることが明らかとなった。
実施例1と同様にして、サケ精子由来の単鎖DNA(D-7656、分子量468,000、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入)を用いて、pH9の条件で、72時間反応させて、精製DNA-白金錯体複合体を調製した。0.5nmol/Lの精製DNA-白金錯体複合体水溶液及び0.5nmol/Lのホースラディッシュパーオキシダーゼ(1000 unit/mg、D-7656、分子量40,000、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入)水溶液をそれぞれ20、30、40、50、60、70、80℃の恒温槽中に30分加熱した。その後、室温に空冷した後に、実施例2と同様にして、DNA-白金錯体複合体及びホースラディッシュパーオキシダーゼの酵素(触媒)活性を測定した。その結果を図7に示す。ホースラディッシュパーオキシダーゼの場合には、高温で熱処理をすることにより、酵素(触媒)活性が著しく減少するのに対して、高温熱処理してもDNA-白金錯体複合体の酵素(触媒)活性は、維持されていることが明らかとなった。
サケ精子由来の単鎖DNA(D-7656、分子量468,000、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入)及び、白金錯体溶液として、シスプラチン溶液(500ppm、ブリプラチン、ブリストル・マイヤーズ社製、シスジアミンジクロロ白金PtCl2(NH3)2を用いた以外は、実施例1と同様にして精製DNA-白金錯体複合体を調製した。すなわち、1.5mLのエッペンドルフチューブ中に、10μLのpH7(リン酸緩衝溶液)、pH9(ホウ酸緩衝溶液)又はpH11(リン酸水素二ナトリウム-水酸化ナトリウム緩衝溶液)の緩衝溶液、20μLのシスプラチン溶液と10μLのDNA溶液をそれぞれ加え、アルミホイルで遮光した後、室温(25℃)で120時間、pH7、9又は11の条件で反応させた。実施例1と同様にしてエタノール沈殿を行うことにより精製DNA-白金錯体複合体を調製した。実施例2と同様にして、0.5nmol/LのDNA-白金錯体(シスプラチン)複合体の酵素(触媒)活性を測定した。比較のために、実施例1で調製した、サケ精子由来の単鎖DNA(D-7656、分子量468,000、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入)を用いて、pH9の条件で、72時間反応させて、調製した0.5nmol/Lの精製DNA-白金錯体(テトラクロロ白金(II)酸カリウム(K2[PtCl4])複合体の酵素活性、及びアデニン[A]とグアニン[G]が連結した[A−G]10量体(シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入、カートリッジ精製品、各1.0μmol))を用いて、pH9の条件で、72時間反応させて調製した0.5nmol/Lの精製DNA-白金錯体(テトラクロロ白金(II)酸カリウム(K2[PtCl4]))複合体の酵素(触媒)活性も測定した。それらの結果を表2に示す。白金錯体として、テトラクロロ白金(II)酸カリウム(K2[PtCl4])のみならず、シスプラチンを用いて調製したDNA-白金錯体複合体には、酵素(触媒)活性があることが明らかとなった。
イースト菌由来のRNA(300−500塩基対、アンビオン社製)及びイースト菌由来の転移RNA(分子量25000−30000、アンビオン社製)を純水に溶解させて1000ppmのRNA溶液を調製した。DNA溶液の代わりにRNA溶液を用いた以外は、実施例1と同様にして、pH9の条件で72時間反応させて、精製RNA―白金錯体複合体を調製した。0.5nmol/Lの精製RNA―白金錯体複合体を用いた以外は、実施例2と同様にして、RNA-白金錯体複合体及びホースラディッシュパーオキシダーゼの触媒(酵素)活性を測定した。比較のために、実施例1で調製したサケ精子由来の単鎖DNA(D-7656、分子量468,000、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入)を用いて、pH9の条件で、72時間反応させて、調製した0.5nmol/Lの精製DNA-白金錯体複合体の酵素(触媒)活性、及びアデニン[A]とグアニン[G]が連結した[A−G]の10量体((AG)10、全20量体、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入、カートリッジ精製品、各1.0μmol)を用いて、pH9の条件で、72時間反応させて、調製した0.5nmol/Lの精製DNA-白金錯体複合体の酵素(触媒)活性も測定した。それらの結果を表2に示す。DNA-白金錯体複合体のみならず、RNA―白金錯体複合体も酵素(触媒)活性があることが明らかとなった。
各2mLプラスチックチューブに、合成オリゴデオキシリボヌクレオチド(29量体、5'-TGAAGGCTTGAGTAAATTATTCCATCATAG-3') (5μg/μL・TE緩衝液)20μL、純水5μL、ほう酸緩衝液(pH9.2) 70μL、シスジアミンジクロロ白金PtCl2(NH3)2 (0.2M、ジメチルスルホキシド溶液)5μLを加えて100μLにしたものを用意した。種々の温度、時間で反応液をインキュベートした:95℃で10分間、30分間又は1時間;80℃で10分間、30分間又は1時間);60℃で1時間;45℃で1時間;37℃で1時間。反応後、実施例1と同様にして、DNA-白金錯体を沈殿させた。
同様な実験はCTの連続配列の合成オリゴデオキシリボヌクレオチド(5'-(CT)29T-3')(30量体:シグマアルドリッチ・ジャパン社カスタム合成依頼カートリッジ精製製品)でも行った。
DNA-白金錯体は、TMB、ABTSのいずれも基質とすることがわかった(図8A)。
また、95℃で1時間の反応で作成したDNA-白金錯体に高い触媒反応が得られた(図8B)。
DNA-白金錯体は、上記のCTオリゴマーの場合、上記の反応条件で作製したものはすべてTE緩衝液に溶けた。一方、上記29量体では、95℃の反応物は全て溶けたが、80℃ではわずかに不溶物がみられた。45℃、60℃では、不溶物がみられ、遠心後に多量の沈殿が得られ、上清は基質との反応後、ほとんど吸光度の変化はみられなかった。
合成オリゴデオキシリボヌクレオチド(5'-AGAGAGA-3')(7量体:シグマアルドリッチ・ジャパン社カスタム合成依頼カートリッジ精製製品)2,179μgをTE緩衝液200μLに溶解し、その25μLを取って、ほう酸緩衝溶液(pH9.2)70μLに加えた。さらにシスジアミンジクロロ白金PtCl2(NH3)2 (0.2M、ジメチルスルホキシド溶液)5μL又はテトラクロロ白金(II)酸カリウム(K2[PtCl4] (0.2M水溶液)5μLを加え、遮光下で80℃、2時間半インキュベートした。反応後、実施例1と同様に3M酢酸ナトリウムとエタノールで沈殿させ、沈殿を70%エタノール中で、よくけん濁し、洗浄、遠心の後、TE緩衝液200μLに溶解させた。
2種類のDNA-白金錯体を調製した。一方は、アミノリンカー修飾DNAを用いて作製したDNA-白金錯体であり、他方は、タンパク質のcDNAを材料にしたDNA/白金錯体である。
前者については、先ず、核酸の5'側にアミノリンカー(5'リン酸基にアミノヘキシル基NH2(CH2)6-:5'-アミノリンクリン酸)を導入した、アデニン塩基とグアニン塩基の繰り返し配列からなる合成オリゴヌクレオチドを用意した((5'-アミノリンカー(AG)29G-3')(30量体:シグマカスタム合成依頼カートリッジ精製製品)。883μgをTE緩衝液177μLに溶解し、その20μL(100μg)を取り、95℃で7分間処理し、氷浴で急冷した後、0.05Mほう酸緩衝溶液(pH9.2)140μLに加えた。さらにシスジアミンジクロロ白金PtCl2(NH3)2) (0.2M、ジメチルスルホキシド溶液)10μLを混ぜた後、遮光下で80℃にて2時間半インキュベートした。反応後、実施例1と同様に3M酢酸ナトリウムとエタノールで沈殿させ、沈殿を70%エタノール中、よくけん濁し、洗浄、遠心の後、TE緩衝液100μLに溶解させた。15,000rpm、10分間の遠心で上清に移る溶解成分をアミノリンカー修飾DNA(AG30)白金錯体として、以下の実験で用いた。
DNA-白金錯体で標識したDNAを用いて特異的配列のDNAが検出できるかどうかを調べた。
先ず、DNA-白金錯体で標識したDNAを以下のように調製した。SCFbのcDNA断片を、市販のcDNA(I.M.A.G.E)からpSP73ベクターにサブクローニングした組換えプラスミドを入手し、以下の実験に用いた。このSCFb cDNA断片の組み込まれたプラスミドをテンプレートとして、PCRにより片方の一本鎖5'端にアミノ基リンカーが導入された二本鎖cDNA断片(アミノ末端1番目から187番目に相当する断片)を以下のように調製した。cDNAの配列情報から、合成オリゴデオキシリボヌクレオチド(5' NH2-GAAGGGATCTGCAGGAATCGTG-3') (5'端をアミノリンカーで修飾した22量体、シグマアルドリッチ・ジャパン社カスタム合成依頼カートリッジ精製製品)を用意した。100μMにTE緩衝液で調製してプライマー1とした。SCFb cDNAの配列情報から, BamHIサイトを含んだ合成オリゴデオキシリボヌクレオチド(32量体、5'-CGGGATCCAGCCACAATTACACTTCTTGAAAC-3')を用意した。100μMにTE緩衝液で調製してプライマー2とした。
DNA-白金錯体プローブの触媒反応により、上記ナイロン膜上の4つのスポットの中で、SCFb cDNAのスポットが特異的に淡い赤紫色に検出された(図11)。
核酸白金錯体を標識した抗体で、サンドイッチELISA(酵素免疫測定法)を行い、抗原を検出できるかどうか調べた。
先ず、核酸の5'側にアミノ基リンカーを導入した、アデニン塩基とグアニン塩基の繰り返し配列からなる合成オリゴヌクレオチドを用意した((5'-アミノリンカー(AG)29G-3') (30量体:シグマカスタム合成依頼カートリッジ精製製品)883μgをTE緩衝液177μLに溶解し、その20μLを取り、95℃にて7分間処理し、氷浴で急冷した後、0.05Mほう酸緩衝溶液(pH9.2)140μLに加えた。さらにシスジアミンジクロロ白金PtCl2(NH3)2) (0.2M、ジメチルスルホキシド溶液)10μLを混ぜた後に、遮光下で80℃にて2時間半インキュベートした。反応後、実施例1と同様に3M酢酸ナトリウムとエタノールで沈殿させ、沈殿を70%エタノール中、よくけん濁し、洗浄、遠心の後、TE緩衝液100μLに溶解させた。15,000rpm、10分間の遠心で上清に移る溶解成分をアミノ基導入DNA白金錯体として以下の実験で用いた。
先ず、抗体Aは、上記のアミノ基導入DNA白金錯体20μLと、0.05M燐酸緩衝液(pH6.8)80μLと、ヒト免疫グロブリンE(IgE)に対するヤギ抗体(1mg/mL)(ベシル社、A80-108A)の0.1mLを混ぜた後、2.5%グルタルアルデヒド0.1mLを加え、37℃で10分反応させ、室温で30分置いて、すぐに実験に用いた。
抗体Bは、デキストランに多数のDNA白金錯体がアミノ基を介して結合したもので抗体が標識されている。
先ず、ヒト免疫グロブリンE(IgE)を認識する抗体(ベシル社、A80-108A)を炭酸緩衝液pH9.6に溶かし、96穴マイクロプレートに入れ、室温1時間置く事で穴の底面に抗体を固定した。ブロッキング試薬(1%アルブミン含有トリス緩衝食塩水溶液pH8.0)を加え、室温で30分間放置した。ブロッキング試薬を除いた後、洗浄液(0.05%Tween20含有トリス緩衝食塩水溶液pH8.0)で各穴を5回洗った後、ヒトIgEの標準液(ヘ゛シル社RC80-108)を1%アルブミン含有0.05%Tween20含有トリス緩衝食塩水溶液pH8.0で種々の濃度に調製、希釈したものを各穴に入れ、室温で1時間置いた。結合しないヒトIgEを除いた後、洗浄液(0.05%Tween20含有トリス緩衝食塩水溶液pH8.0)で5回洗浄した。
本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、適用される特許法が許す範囲内で、言及によって、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容全体が本明細書に組み込まれているものとみなされる。
Claims (10)
- 遷移金属と単量体若しくは多量体のヌクレオチド又はそれらのアナログとの錯体からなる、パーオキシダーゼ様の酸化触媒活性を示す酸化触媒。
- 等モル量のホースラディッシュパーオキシダーゼ(活性:1000 unit/mg)の1/100(0.01)倍以上の酸化触媒活性を示す請求項1に記載の触媒。
- 遷移金属が、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、オスミウム、イリジウム及び白金からなる白金族より選択される請求項1又は2に記載の触媒。
- 遷移金属が白金であり、錯体中で白金が-PtCl2-、-PtCl3、-PtCl(H2O+)-、-Pt(H2O+)2-、-PtCl2(H2O+)、-PtCl(H2O+)2、-Pt(H2O+)3、-PtCl(NH3)2、-Pt(NH3)2-又は-Pt(H2O+)(NH3)2の形態でヌクレオチド又はそれらのアナログと結合している請求項3に記載の触媒。
- 多量体ヌクレオチドが一本鎖核酸である請求項1〜4のいずれか1項に記載の触媒。
- 多量体ヌクレオチドが少なくとも5つ連続するヌクレオチドを有する請求項1〜5のいずれか1項に記載の触媒。
- ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドである請求項1〜6のいずれか1項に記載の触媒。
- 検出対象物質に特異的に結合し得る物質に標識として請求項1〜7のいずれか1項に記載の触媒が直接又はリンカーを介して結合されている、該検出対象物質の検出又は定量用試薬。
- 検出対象物質に特異的に結合し得る物質が抗体若しくは抗体フラグメント又はヌクレオチドプローブである請求項8に記載の試薬。
- 請求項8又は9に記載の試薬を含んでなる検出対象物質の検出用又は定量用キット。
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