CN103439273A - 用金属有机配合物对葡萄糖进行比色检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用金属有机配合物对葡萄糖进行比色检测的方法，包括如下步骤：（1）配制可变价金属的无机盐溶液为溶液Ⅰ；（2）配制2‐甲基咪唑溶液为溶液Ⅱ；（3）将溶液Ⅰ和溶液Ⅱ混合，制成金属有机配合物溶液；（4）将葡萄糖氧化酶水溶液加入到待测葡萄糖样品中，用缓冲溶液稀释，在37℃培养，加入过氧化物酶色源底物的二甲基亚砜溶液与所述金属有机配合物溶液，用缓冲溶液稀释，得到溶液A，测定溶液A在可见光区的吸光光度值，比色检测出葡萄糖的浓度。本发明的方法可以极大的缩短检测所用的时间，操作简单、成本低廉，避免了使用金属纳米粒子的高成本缺点，避免使用金属氧化物等模拟酶时需要长时间反应的缺点。
Description
技术领域
本发明属于生物医学检测领域，涉及一种用金属有机配合物对葡萄糖进行比色检测的方法。
背景技术
葡萄糖是重要的生物分子，其在血液中的含量是人体健康程度的指示剂。因此，葡萄糖含量的快速、准确检测对于监测人体健康程度（区别健康与亚健康）、对某些疾病，如糖尿病等做出早期预警及诊断都具有重要意义
葡萄糖的检测方法主要是电化学方法，如中国发明专利（200910067282）报道了一种基于镍纳米粒子/碳纤维复合材料的非酶电化学葡萄糖传感器，中国发明专利（200810124404.6）公开了一种基于管状金属材料的非酶电化学生物传感器。电化学传感器的检测灵敏度高，但是易受干扰，而且检测需要过程需要消耗一定的能量。比色检测是近年来兴起的一种检测方法，它利用反应体系颜色及色度的变化实现对目标物的检测。由于可以用肉眼直接观测比色检测的结果，因此比色检测方法具有结果直观、操作简单等特点。比色法已经成功的用于检测DNA、蛋白以及有害重金属离子等。一些金属纳米粒子、金属氧化物已经被用于比色检测葡萄糖。虽然这些材料表现出很好的葡萄糖检测性能，但是缺点也很明显。比如，贵金属纳米粒子成本高，难以推广。金属氧化物的反应活性较低，检测时间长。因此，需要寻找新的材料克服上述材料的缺点，推动葡萄糖比色检测的市场化发展。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种快速、准确、低成本的用金属有机配合物对葡萄糖进行比色检测的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种用金属有机配合物对葡萄糖进行比色检测的方法，包括如下步骤：
（1）配制浓度为1μM～饱和的可变价金属的无机盐溶液为溶液Ⅰ；
（2）配制浓度为1μM～饱和的2-甲基咪唑溶液为溶液Ⅱ或浓度为1μM～饱和的4,4’-联吡啶溶液为溶液Ⅱ；
所述溶液Ⅰ和溶液Ⅱ的溶剂为水、甲醇或乙醇；
（3）将溶液Ⅰ和溶液Ⅱ按体积比为1:100～100:1的比例混合，制成金属有机配合物溶液；
（4）将10～50微升浓度为20毫克/毫升的葡萄糖氧化酶水溶液加入到200微升待测葡萄糖样品中，用0.02M pH值为6～8的缓冲溶液稀释至500微升，在37℃培养15～60分钟，加入2～100微升浓度为50毫摩尔/升的过氧化物酶色源底物的二甲基亚砜溶液与10～100微升所述金属有机配合物溶液，用0.2M pH值为2～4的缓冲溶液稀释至1毫升，得到溶液A，测定溶液A在可见光区的吸光光度值，比色检测出葡萄糖的浓度。
另一种用金属有机配合物对葡萄糖进行比色检测的方法，包括如下步骤：
（1）配制浓度为1μM～饱和的可变价金属的无机盐溶液为溶液Ⅰ；
（2）配制浓度为1μM～饱和的2-甲基咪唑溶液为溶液Ⅱ或浓度为1μM～饱和的4,4’-联吡啶溶液为溶液Ⅱ；
所述溶液Ⅰ和溶液Ⅱ的溶剂为水、甲醇或乙醇；
（3）将溶液Ⅰ和溶液Ⅱ按体积比为1:100～100:1的比例混合，制成金属有机配合物溶液；
（4）用下述两种方法之一种制备金属有机配合物薄膜：
方法一：将步骤（3）获得的金属有机配合物溶液中的所述金属有机配合物收集、烘干、压制成膜；
方法二：在固体基底材料表面原位生长金属有机配合物薄膜，步骤为：
a将固体基底材料浸泡于0.1～2mg/mL聚乙烯吡咯烷酮水溶液中1分钟～1天，使所述固体基底材料表面吸附聚乙烯吡咯烷酮分子；
b将步骤a制备的材料反复依次浸泡于所述步骤（1）获得的溶液I中1分钟～1小时和步骤（2）获得的溶液II中1分钟～1小时；在固体基底材料表面原位生长出金属有机配合物薄膜，直到金属有机配合物薄膜的厚度为0.5～10μm为止；
（5）将10～50微升浓度为20毫克/毫升的葡萄糖氧化酶水溶液加入到200微升待测葡萄糖样品中，用0.02M pH值为6～8的缓冲溶液稀释至500微升，在37℃培养15～60分钟，加入2～100微升浓度为50毫摩尔/升的过氧化物酶色源底物的二甲基亚砜溶液，用0.2M pH值为2～4的缓冲溶液稀释至1毫升，得溶液B；
（6）取1～100微升溶液B滴在所述金属有机配合物薄膜的表面，放置5～15分钟，观察液滴颜色，比色检测出葡萄糖的浓度。
所述可变价金属为铁、铜、金或银。
所述无机盐为盐酸盐、硫酸盐或硝酸盐；
所述过氧化物酶色源底物为3,3'，5,5'-四甲基联苯胺或2,2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐。
所述0.02M pH值为6～8的缓冲溶液为磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠–磷酸二氢钠缓冲液或磷酸氢二钠–磷酸二氢钾缓冲液。
所述0.2M pH值为2～4的缓冲溶液为磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液，柠檬酸–氢氧化钠-盐酸缓冲液，柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液或乙酸–乙酸钠缓冲液。
所述固体基底材料为聚乙烯，聚苯乙烯，玻璃或纤维素薄膜。
本发明的方法用具有高的催化过氧化物反应活性的金属有机配合物作为过氧化物模拟酶，可以极大的缩短检测所用的时间，操作简单、成本低廉，避免了使用金属纳米粒子的高成本缺点，避免使用金属氧化物等模拟酶时需要长时间反应的缺点。
实验测得的葡萄糖的检测范围为0.05～20mM，检测限为0.01mM。实验测试结果重现性好，可用于临床及环境中葡萄糖的检测。
附图说明
图1为实施例26中所用金属有机配合物（实施例17配制）的扫描电镜图。
具体的实施方式
本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好的理解本发明，但不以任何方法限制本发明。
溶液Ⅰ的配制：
溶液Ⅱ的配制：
金属有机配合物溶液配制：
实施例26
一种用金属有机配合物对葡萄糖进行比色检测的方法，包括如下步骤：
（1）建立工作曲线
将20微升浓度为20毫克/毫升的葡萄糖氧化酶水溶液分别加入到不同浓度的200微升葡萄糖溶液中（不同浓度的葡萄糖溶液是用0.02M的磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液（pH=7.4）将1M的葡萄糖溶液稀释获得）用0.02M pH值为7.4的磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液稀释至500微升，在37℃培养30分钟，加入20微升浓度为50毫摩尔/升3,3'，5,5'-四甲基联苯胺的二甲基亚砜溶液和20微升实施例17制备的金属有机配合物溶液，用0.2M pH=3.4的磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液稀释至1毫升，记录不同葡萄糖浓度与溶液颜色的关系，测定各溶液在可见光区的吸光光度值，建立工作曲线，用于检测样品葡萄糖浓度。
（2）比色检测葡萄糖
将20微升浓度为20毫克/毫升的葡萄糖氧化酶水溶液加入到200微升待测葡萄糖样品中，用0.02M pH值为7的磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液稀释至500微升，在37℃培养30分钟，加入20微升浓度为50毫摩尔/升的3,3'，5,5'-四甲基联苯胺的二甲基亚砜溶液和20微升实施例17制备的金属有机配合物溶液，用0.2M pH值为3.4的磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液稀释至1毫升，得到溶液A，测定溶液A在可见光区的吸光光度值，比色检测出葡萄糖的浓度。
以下各实施例在对葡萄糖进行比色检测之前可以参照实施例26中建立工作曲线的方法，即用测试未知葡萄糖样品的步骤测试若干已知浓度的葡萄糖样品，通过记录颜色变化程度与浓度的关系，获取相应的工作曲线。
实施例27
一种用金属有机配合物对葡萄糖进行比色检测的方法，包括如下步骤：
将10微升浓度为20毫克/毫升的葡萄糖氧化酶水溶液加入到200微升待测葡萄糖样品中，用0.02M pH值为6的磷酸氢二钠–磷酸二氢钠缓冲液稀释至500微升，在37℃培养15分钟，加入2微升浓度为50毫摩尔/升的3,3'，5,5'-四甲基联苯胺的二甲基亚砜溶液和10微升实施例16制备的金属有机配合物溶液，用0.2M pH值为3的柠檬酸–氢氧化钠-盐酸缓冲液稀释至1毫升，得到溶液A，测定溶液A在可见光区的吸光光度值，比色检测出葡萄糖的浓度。
实施例28
一种用金属有机配合物对葡萄糖进行比色检测的方法，包括如下步骤：
将20微升浓度为20毫克/毫升的葡萄糖氧化酶水溶液加入到200微升待测葡萄糖样品中，用0.02M pH值为7的磷酸氢二钠–磷酸二氢钾缓冲液稀释至500微升，在37℃培养40分钟，加入100微升浓度为50毫摩尔/升的2,2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐的二甲基亚砜溶液和100微升实施例18制备的金属有机配合物溶液，用0.2M pH值为2的柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液稀释至1毫升，得到溶液A，测定溶液A在可见光区的吸光光度值，比色检测出葡萄糖的浓度。
实施例29
一种用金属有机配合物对葡萄糖进行比色检测的方法，包括如下步骤：
将50微升浓度为20毫克/毫升的葡萄糖氧化酶水溶液加入到200微升待测葡萄糖样品中，用0.02M pH值为8的磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液稀释至500微升，在37℃培养60分钟，加入20微升浓度为50毫摩尔/升的2,2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐的二甲基亚砜溶液和50微升实施例19制备的金属有机配合物溶液，用0.2M pH值为4的乙酸–乙酸钠缓冲液稀释至1毫升，得到溶液A，测定溶液A在可见光区的吸光光度值，比色检测出葡萄糖的浓度。
实施例30
一种用金属有机配合物对葡萄糖进行比色检测的方法，包括如下步骤：
（1）制备金属有机配合物薄膜：
将实施例20获得的金属有机配合物溶液中的所述金属有机配合物收集、烘干、压制成膜；（2）将10微升浓度为20毫克/毫升的葡萄糖氧化酶水溶液加入到200微升待测葡萄糖样品中，用0.02M pH值为6的磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液稀释至500微升，在37℃培养15分钟，加入2微升浓度为50毫摩尔/升的3,3'，5,5'-四甲基联苯胺的二甲基亚砜溶液，用0.2M pH值为2的磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液稀释至1毫升，得溶液B；
（3）取1微升溶液B滴在金属有机配合物薄膜的表面，放置15分钟，观察液滴颜色，比色检测出葡萄糖的浓度。
实施例31
一种用金属有机配合物对葡萄糖进行比色检测的方法，包括如下步骤：
（1）制备金属有机配合物薄膜：
将实施例21获得的金属有机配合物溶液中的所述金属有机配合物收集、烘干、压制成膜；（2）将30微升浓度为20毫克/毫升的葡萄糖氧化酶水溶液加入到200微升待测葡萄糖样品中，用0.02M pH值为7的磷酸氢二钠–磷酸二氢钠缓冲液稀释至500微升，在37℃培养30分钟，加入50微升浓度为50毫摩尔/升的3,3'，5,5'-四甲基联苯胺的二甲基亚砜溶液，用0.2MpH值为3的柠檬酸–氢氧化钠-盐酸缓冲液稀释至1毫升，得溶液B；
（3）取50微升溶液B滴在金属有机配合物薄膜的表面，放置10分钟，观察液滴颜色，比色检测出葡萄糖的浓度。
实施例32
一种用金属有机配合物对葡萄糖进行比色检测的方法，包括如下步骤：
（1）制备金属有机配合物薄膜：
将实施例22获得的金属有机配合物溶液中的所述金属有机配合物收集、烘干、压制成膜；（2）将50微升浓度为20毫克/毫升的葡萄糖氧化酶水溶液加入到200微升待测葡萄糖样品中，用0.02M pH值为8的磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液稀释至500微升，在37℃培养60分钟，加入100微升浓度为50毫摩尔/升的2,2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐的二甲基亚砜溶液，用0.2M pH值为4的柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液稀释至1毫升，得溶液B；
（3）取100微升溶液B滴在金属有机配合物薄膜的表面，放置5分钟，观察液滴颜色，比色检测出葡萄糖的浓度。
实施例33
一种用金属有机配合物对葡萄糖进行比色检测的方法，包括如下步骤：
（1）将固体基底材料聚乙烯浸泡于0.1mg/mL聚乙烯吡咯烷酮水溶液中1天，使固体基底材料表面吸附聚乙烯吡咯烷酮分子；
（2）将步骤（1）制备的材料反复依次浸泡于实施例2获得的溶液I中20分钟，和实施例11获得的溶液II中20分钟；在固体基底材料表面原位生长出金属有机配合物薄膜，直到金属有机配合物薄膜的厚度为1μm为止；
(3)将10微升浓度为20毫克/毫升的葡萄糖氧化酶水溶液加入到200微升待测葡萄糖样品中，用0.02M pH值为6的磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液稀释至500微升，在37℃培养15分钟，加入2微升浓度为50毫摩尔/升的3,3'，5,5'-四甲基联苯胺的二甲基亚砜溶液，用0.2MpH值为2的磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液稀释至1毫升，得溶液B；
（4）取1微升溶液B滴在金属有机配合物薄膜的表面，放置15分钟，观察液滴颜色，比色检测出葡萄糖的浓度。
实施例34
一种用金属有机配合物对葡萄糖进行比色检测的方法，包括如下步骤：
（1）将固体基底材料聚苯乙烯浸泡于0.5mg/mL聚乙烯吡咯烷酮水溶液中12小时，使固体基底材料表面吸附聚乙烯吡咯烷酮分子；
（2）将步骤（1）制备的材料反复依次浸泡于实施例3获得的溶液I中30分钟，和实施例13获得的溶液II中30分钟；在固体基底材料表面原位生长出金属有机配合物薄膜，直到金属有机配合物薄膜的厚度为5μm为止；
（3）将30微升浓度为20毫克/毫升的葡萄糖氧化酶水溶液加入到200微升待测葡萄糖样品中，用0.02M pH值为7的磷酸氢二钠–磷酸二氢钠缓冲液稀释至500微升，在37℃培养30分钟，加入50微升浓度为50毫摩尔/升的3,3'，5,5'-四甲基联苯胺的二甲基亚砜溶液，用0.2M pH值为3的柠檬酸–氢氧化钠-盐酸缓冲液稀释至1毫升，得溶液B；
（4）取50微升溶液B滴在金属有机配合物薄膜的表面，放置10分钟，观察液滴颜色，比色检测出葡萄糖的浓度。
实施例35
一种用金属有机配合物对葡萄糖进行比色检测的方法，包括如下步骤：
（1）将固体基底材料玻璃浸泡于1.5mg/mL聚乙烯吡咯烷酮水溶液中1小时，使固体基底材料表面吸附聚乙烯吡咯烷酮分子；
（2）将步骤（1）制备的材料反复依次浸泡于实施例4获得的溶液I中1小时，和实施例15获得的溶液II中1小时；在固体基底材料表面原位生长出金属有机配合物薄膜，直到金属有机配合物薄膜的厚度为10μm为止；
（3）将50微升浓度为20毫克/毫升的葡萄糖氧化酶水溶液加入到200微升待测葡萄糖样品中，用0.02M pH值为8的磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液稀释至500微升，在37℃培养60分钟，加入100微升浓度为50毫摩尔/升的2,2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐的二甲基亚砜溶液，用0.2M pH值为4的柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液稀释至1毫升，得溶液B；
（4）取100微升溶液B滴在金属有机配合物薄膜的表面，放置5分钟，观察液滴颜色，比色检测出葡萄糖的浓度。
实施例36
一种用金属有机配合物对葡萄糖进行比色检测的方法，包括如下步骤：
（1）将固体基底材料纤维素薄膜浸泡于2mg/mL聚乙烯吡咯烷酮水溶液中1分钟，使固体基底材料表面吸附聚乙烯吡咯烷酮分子；
（2）将步骤（1）制备的材料反复依次浸泡于实施例1获得的溶液I中1分钟，和实施例12获得的溶液II中1分钟；在固体基底材料表面原位生长出金属有机配合物薄膜，直到金属有机配合物薄膜的厚度为0.5μm为止；
（3）将50微升浓度为20毫克/毫升的葡萄糖氧化酶水溶液加入到200微升待测葡萄糖样品中，用0.02M pH值为8的磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液稀释至500微升，在37℃培养60分钟，加入100微升浓度为50毫摩尔/升的2,2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐的二甲基亚砜溶液，用0.2M pH值为4的柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液稀释至1毫升，得溶液B；
（4）取100微升溶液B滴在金属有机配合物薄膜的表面，放置5分钟，观察液滴颜色，比色检测出葡萄糖的浓度。
Claims (8)
1.一种用金属有机配合物对葡萄糖进行比色检测的方法，其特征是包括如下步骤：
（1）配制浓度为1μM～饱和的可变价金属的无机盐溶液为溶液Ⅰ；
（2）配制浓度为1μM～饱和的2-甲基咪唑溶液为溶液Ⅱ或浓度为1μM～饱和的4,4’-联吡啶溶液为溶液Ⅱ；
所述溶液Ⅰ和溶液Ⅱ的溶剂为水、甲醇或乙醇；
（3）将溶液Ⅰ和溶液Ⅱ按体积比为1:100～100:1的比例混合，制成金属有机配合物溶液；
（4）将10～50微升浓度为20毫克/毫升的葡萄糖氧化酶水溶液加入到200微升待测葡萄糖样品中，用0.02M pH值为6～8的缓冲溶液稀释至500微升，在37℃培养15～60分钟，加入2～100微升浓度为50毫摩尔/升的过氧化物酶色源底物的二甲基亚砜溶液与10～100微升所述金属有机配合物溶液，用0.2M pH值为2～4的缓冲溶液稀释至1毫升，得到溶液A，测定溶液A在可见光区的吸光光度值，比色检测出葡萄糖的浓度。
2.一种用金属有机配合物对葡萄糖进行比色检测的方法，其特征是包括如下步骤：
（1）配制浓度为1μM～饱和的可变价金属的无机盐溶液为溶液Ⅰ；
（2）配制浓度为1μM～饱和的2-甲基咪唑溶液为溶液Ⅱ或浓度为1μM～饱和的4,4’-联吡啶溶液为溶液Ⅱ；
所述溶液Ⅰ和溶液Ⅱ的溶剂为水、甲醇或乙醇；
（3）将溶液Ⅰ和溶液Ⅱ按体积比为1:100～100:1的比例混合，制成金属有机配合物溶液；
（4）用下述两种方法之一种制备金属有机配合物薄膜：
方法一：将步骤（3）获得的金属有机配合物溶液中的所述金属有机配合物收集、烘干、压制成膜；
方法二：在固体基底材料表面原位生长金属有机配合物薄膜，步骤为：
a将固体基底材料浸泡于0.1～2mg/mL聚乙烯吡咯烷酮水溶液中1分钟～1天，使所述固体基底材料表面吸附聚乙烯吡咯烷酮分子；
b将步骤a制备的材料反复依次浸泡于所述步骤（1）获得的溶液I中1分钟～1小时和步骤（2）获得的溶液II中1分钟～1小时；在固体基底材料表面原位生长出金属有机配合物薄膜，直到金属有机配合物薄膜的厚度为0.5～10μm为止；
（5）将10～50微升浓度为20毫克/毫升的葡萄糖氧化酶水溶液加入到200微升待测葡萄糖样品中，用0.02M pH值为6～8的缓冲溶液稀释至500微升，在37℃培养15～60分钟，加入2～100微升浓度为50毫摩尔/升的过氧化物酶色源底物的二甲基亚砜溶液，用0.2M pH值为2～4的缓冲溶液稀释至1毫升，得溶液B；
（6）取1～100微升溶液B滴在所述金属有机配合物薄膜的表面，放置5～15分钟，观察液滴颜色，比色检测出葡萄糖的浓度。
3.根据权利要求1或2所述的一种用金属有机配合物对葡萄糖进行比色检测的方法，其特征是所述可变价金属为铁、铜、金或银。
4.根据权利要求1或2所述的一种用金属有机配合物对葡萄糖进行比色检测的方法，其特征是所述无机盐为盐酸盐、硫酸盐或硝酸盐；
5.根据权利要求1或2所述的一种用金属有机配合物对葡萄糖进行比色检测的方法，其特征是所述过氧化物酶色源底物为3,3'，5,5'-四甲基联苯胺或2,2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐。
6.根据权利要求1或2所述的一种用金属有机配合物对葡萄糖进行比色检测的方法，其特征是所述0.02M pH值为6～8的缓冲溶液为磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠–磷酸二氢钠缓冲液或磷酸氢二钠–磷酸二氢钾缓冲液。
7.根据权利要求1或2所述的一种用金属有机配合物对葡萄糖进行比色检测的方法，其特征是所述0.2M pH值为2～4的缓冲溶液为磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液，柠檬酸–氢氧化钠-盐酸缓冲液，柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液或乙酸–乙酸钠缓冲液。
8.根据权利要求2所述的一种用金属有机配合物对葡萄糖进行比色检测的方法，其特征是所述固体基底材料为聚乙烯，聚苯乙烯，玻璃或纤维素薄膜。
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Application publication date: 20131211 |