JPH06234787A - 修飾ヌクレオチド - Google Patents

修飾ヌクレオチド

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JPH06234787A
JPH06234787A JP5177184A JP17718493A JPH06234787A JP H06234787 A JPH06234787 A JP H06234787A JP 5177184 A JP5177184 A JP 5177184A JP 17718493 A JP17718493 A JP 17718493A JP H06234787 A JPH06234787 A JP H06234787A
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】検出が容易になるようにポリヌクレオチド等を
化学的に修飾又は標識する。 【構成】一般式Ｐ−Ｓ−Ｂ−Ｓｉｇを有するヌクレオチ
ドで、式中Ｐはリン酸部分、Ｓは糖或いは単糖部分、Ｂ
は塩基部分であり、リン酸部分は該ヌクレオチドが、デ
オキシリボヌクレオチドである場合には糖部分の３′お
よび／又は５′位に結合し、リボヌクレオチドである場
合には２′，３′および／又は５′位に結合し、該塩基
がピリミジン又はプリンである時に該塩基はそれぞれＮ
１位又はＮ９位より糖部分の１′位に結合し、式中Ｓｉ
ｇは該ヌクレオチドの塩基Ｂに共有結合する化学的部分
であり、該Ｓｉｇは該塩基Ｂと結合するとそれ自身を信
号表示することができ、該Ｓｉｇは該塩基Ｂが７−デア
ザプリンである場合にはＮ７位以外の部位で、該塩基Ｂ
がピリミジンである場合にはＣ５位以外の部位で、該塩
基Ｂがプリンである場合にはＣ８位以外の部位で該塩基
Ｂと結合している、ヌクレオチドから成るオリゴヌクレ
オチド或いはポリデオキシリボヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の要約 本発明は核酸物質に結合および／又は取り込みされた時
に容易に検出できるようにヌクレオチドおよびＤＮＡを
含むポリヌクレオチドを化学的に修飾或いは標識するこ
とに関する。
【０００２】発明の背景 例えば水素（３Ｈ）、りん（３２Ｐ）、炭素（１４Ｃ）
或いは沃素（１２５Ｉ）同位体などで放射活性標識した
核酸或いはポリ核酸を作ることは知られている。そのよ
うな放射活性標識した化合物は科学的或いは臨床的に興
味ある核酸や他の分子を検出し、追跡し、局在化し、単
離するのに有用である。しかしながら、残念なことに、
放射活性標識した物質は放射能のため災害をもたらす。
又、それらの化合物や物質を標識するのに用いた放射活
性物質の半減期が比較的短いため、作られる標識化合物
または物質は対応して比較的短い貯蔵寿命を持つことに
なる。
【０００３】放射活性標識した化合物や物質に伴なう災
害や問題点を克服し、回避するために、例えば核酸やポ
リ核酸などの興味ある科学的標識化合物も提唱されてい
る。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、
第７８巻、１１号、６６３３−６６３７頁（１９８１年
１１月）に掲載の「Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｓｙｕｔｈｅ
ｓｉｓ ｏｆ Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌａｂｅｌｅｄ Ｐｏｌ
ｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ｎｏｖｅｌ Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｒｏｂｅｓ」と題
するＰ．Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ、Ａ．Ａ．Ｗａｌｄｒｏｐお
よびＤ．Ｃ．Ｗａｒｄの論文中に、ピリミジン環のＣ−
５位にアルキルアミンの連結鎖を介してビオチン分子が
結合しているｄＵＴＰおよびＵＴＰのアナログが記載さ
れている。ビオチン標識した核酸は各種ＤＮＡおよびＲ
ＮＡポリメラーゼの試験管内反応の有効な基質である。
低割合でビオチン置換されているポリ核酸（キロベース
当り５０分子以下）は非置換の対照と同様な変性、再構
成およびハイブリダイゼーションの特性を有している。
ビオチン標識のポリ核酸は、一本鎖、二本鎖共、８モル
尿素、６モルのグアニジン塩酸、或いは９９％ホルムア
ミドで十分洗滌した後も、選択的かつ定量的にアビジン
−セファロース上に保持される。さらに、ビオチン標識
した核酸は抗ビオチン抗体およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓたん白Ａの存在下で選択的に免疫
沈降を起すことが出来る。ビオチン標識ポリ核酸のこれ
らの特有の性質からあるＤＮＡおよびＲＮＡ配列を検出
したり単離するのに有用な親和プローブとなり得る。本
論文記載の事項は保留中の米国特許出願に含まれている
ことが論文に示されている。
【０００４】上記記載の論文および上記引用の特許出願
の発表はここに包含され、本発表の一部分を成すもので
ある。
【０００５】前述論文に引用される特許出願は、１９８
１年４月１７日提出の米国特許出願Ｓｅｒｉａｌ Ｎ
ｏ．２５５，２２３である。この米国特許出願Ｓｅｒｉ
ａｌＮｏ．２５５，２２３は本特許に包含され、本発表
の一部を構成する。上記引用の保留中の米国特許出願に
は上述の論文の事項が記載され、さらに、次の構造で示
される化合物が生化学研究および組み換えＤＮＡ技術に
おいてプローブとして広く有用であることが記載されて
いる。
【化６】 但し、Ｂは糖部分のＣ１′位に共有結合したプリン、デ
アザプリン或いはピリミジンを示し、Ｂがプリンまたは
７−デアザプリンである時には糖はプリンまたはデアザ
プリンのＮ９位に結合し、Ｂがピリミジンである時には
Ｎ１位に結合し、Ａは少なくとも３個の炭素原子より成
り、二重鎖ＲＮＡ、二重鎖ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡ
ハイブリッドに取り込まれた時ポリペプチドと検出可能
な複合体を生成することの出来る部分を示し、点線はＢ
とＡを結合する化学結合を示し、Ｂがプリンであれば結
合はプリンの８位と結合し、Ｂが７−デアザプリンであ
ればデアザプリンの７位に結合し、Ｂがビリミジンであ
る場合にはピリミジンの５位に結合し、そして、ｘ、ｙ
およびｚはそれぞれ、Ｈ−、ＨＯ−、
【化７】 を示す。
【０００６】上記構造に包含される化合物で特に有用な
のはさらに次の性質の一つまたはそれ以上を有するもの
である。Ａが非芳香環である；Ａが少なくとも炭素５個
である；ＢとＡとをつなぐ結合がα−オレフィン結合を
含んでいる；Ａがビチオン或いはイミノビチオンであ
る；およびＢがピリミジン或いは７−デアザプリンであ
る。これらの化合物は以下のような方法で製造され得
る。 （ａ）下記の構造を有する化合物を、適当な
【化８】 溶媒中、適当な条件下で水銀塩と反応させ、下記構造を
有する水銀化合物を生成させる。
【化９】
【０００７】（ｂ） 該水銀化合物と、該水銀化合物の
−Ｈｇ＋部分と反応し、式…Ｎで示される化学基と反応
させ、当該反応を水溶液中、Ｋ２ＰｄＣｌ４存在下で適
当な条件下で行ない、下記構造を有する化合物を生成さ
せる。そして、
【化１０】
【０００８】但し、Ｎは反応性の末端官能基或いはＡで
ある。 （ｃ） ＮがＡである場合には該修飾ヌクレオチドとし
て化合物を回収し、或いはＮが反応性の末端官能基の場
合には該化合物をＭ−Ａの構造を有する化合物と反応さ
せて修飾ヌクレオチドを生成し、それを回収する。但
し、Ｍは水溶液中適当条件下でＮと反応性のある官能基
を表わす。本発明はまた下記構造を有する化合物も提供
する。
【化１１】
【０００９】但し、Ｂ、Ｂ′およびＢ″のそれぞれは糖
部分のＣ１′位に共有結合したプリン、７−デアザプリ
ン或いはピリミジン部分を表わし、Ｂ、Ｂ′或いはＢ″
がプリンまたは７−デアザプリンである時にはプリンま
たは７−デアザプリンのＮ９位に結合し、Ｂ、Ｂ′或い
はＢ″がピリミジンの場合にはＮ１位に結合し、Ａは少
なくとも３個の炭素原子より成り、相補ＲＮＡまたはＤ
ＮＡ分子と形成した二重鎖に取り込まれるとポリペプチ
ドと検出可能な複合体を形成することができる成分を表
わし、点線はＢとＡをつなぐ化学結合を表わし、Ｂがプ
リンである時は結合はプリンの８位につき、Ｂが７−デ
アザプリンの時には結合はデアザプリンの７位に結合
し、そして、Ｂがピリミジンならば結合はピリミジンの
５位に結合し、ｚはＨ−或いはＨＯ−を表わし、そし
て、ｍおよびｎは０からおよそ１００，０００までの整
数を表わす。
【００１０】これらの化合物は本発明に係る修飾ヌクレ
オチドを含むヌクレオチドの混合物の酵素的重合により
調製され得る。別の方法としては、オリゴーまたはポリ
ヌクレオチドとして存在するヌクレオチドを化学法を用
いて修飾することも出来る。本発明の実施に従って修飾
されたヌクレオチドおよび該修飾ヌクレオチドから生成
するオリゴーおよびポリヌクレオチドは生化学研究、臨
床診断および組換えＤＮＡ技術におけるプローブとして
用いられる。これらの種々の利用は分子がポリペプチド
と安定な複合体を形成しそれがポリペプチド固有の性質
またはポリペプチドに結合した、或いはポリペプチドと
反応する検出可能な成分によって検出され得るという能
力に基づいている。利用例としては例えばバクテリアや
ウイルスのような核酸含有病因物質の検出と同定；抗生
物質耐性細菌のスクリーニング；例えば地中海貧血およ
び鎌状赤血球貧血症などの遺伝病の診断；染色体の核型
決定；および癌細胞の同定などがある。
【００１１】修飾ヌクレオチドが天然存在ヌクレオチド
の放射活性標識体の代用として一般的に適するにはいく
つか必須基準を満たさねばならない。第一に修飾ヌクレ
オチドは特有の、即ち、通常ヌクレオチドやポリヌクレ
オチドと結合して見られないような置換基或いはプロー
ブを含有していなければならない。第二に、そのプロー
ブは化学試薬或いは生化学試薬と特異的に反応して感度
の高い検出系を提供しなければならない。第三に、多く
の実用応用では同族体が酵素的に代謝されることが要求
される、即ち、同族体が核酸ポリメラーゼの基質として
作用しなければならないから、同族体は通常研究される
核酸酵素に対して比較的効率よい基質でなければならな
い。この目的のため、プローブ部分は塩基の通常ワトソ
ン−クリック水素結合ポテンシャルを立体的或いはその
他で阻害するような環位置の上についてはならない。さ
もないと、置換物質はポリメラーゼ基質として不活性な
化合物を形成することになる。通常の“ａｎｔｉ”ヌク
レオチド配座を変えるような環位置の置換も避けねばな
らない。それはそのような配座変化は普通ポリメラーゼ
基質として受け入れられないようなヌクレオチド誘導体
を与えるからである。通常このような考慮から置換の位
置がピリミジンの５位およびプリン或いは７−デアザプ
リンの７位に制限される。
【００１２】第四番目に、核酸のハイブリダイゼーショ
ン法に用いるために検出方法が一重鎖、二重鎖両方のポ
リヌクレオチドに取り込まれたプローブ置換基と反応す
ることが出来るものでなくてはならない。この基準を満
たすために、プローブ部分はプリン或いはピリミジンと
化学結合または“リンカー鎖”を通して結合するのが好
ましく、そうすることにより、抗体、他の検出たん白或
いは化学試薬と容易に反応することができる。第五番目
に、現行の放射活性ハイブリダイゼーションプローブを
用いる方法を大きく変更する必要がないように、少数の
プローブ置換を有するポリペプチドの物理的並びに生化
学的性質が有意に変更されるべきでない。この基準はプ
ローブが酵素的に導入されても化学的に導入されても満
たされるべきである。
【００１３】最後に、プローブ部分をつける結合は、通
常のヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが極って受け
る全ゆる実験条件、例えば高温に於いての長時間のハイ
ブリダイゼーション、フェノールおよび有機溶媒抽出、
電気泳動、その他、に耐えられなければならない。本願
に記載の修飾ヌクレオチドはこれら全ての基準を満たし
ている。これらの修飾ヌクレオチドは下記の構造を有
す。
【化１２】 但し、Ｂは糖部分のＣ１′位に共有結合したプリン、７
−デアザプリンまたはピリミジンを表わし、Ｂがプリン
或いは７−デアザプリンの時は糖はプリン或いは７−デ
アザプリンのＮ９位に結合し、Ｂがピリミジンの時はＮ
１位に結合する。Ａは少なくとも３個の炭素原子より成
り、二重鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ二重鎖或いはＤＮＡ−ＲＮＡ
ハイブリッドに取り込まれるとポリペプチドと検出可能
な複合体を形成する成分を表わす。点線はＢとＡをつな
ぐ結合グループを表わし、Ｂがプリンであれば結合はプ
リンの８位につき、Ｂが７−デアザプリンであれば結合
はデアザプリンの７位につき、もしＢがピリミジンであ
れば結合はピリミジンの５位につく。
【００１４】そしてｘ、ｙおよびｚのそれぞれはＨ−、
ＨＯ−、
【化１３】 を表わす。これらの化合物は生化学研究およびＤＮＡ組
換え技術のプローブとして広く有用である。基本的には
上記構造式に包含される全ての化合物が本発明の実施例
に従って調製され、使用されるが、ある化合物がより容
易に調製されるか使用され、或いは調製使用され、従っ
て現在好ましい。このように、基本的にはプリン類、ピ
リミジン類および７−デアザプリン類が使用され得る
が、プリンの８位の置換はポリメラーゼの基質として効
力のないヌクレオチドにする傾向があるため、ピリミジ
ンおよび７−デアザプリンがより好ましい。従って、修
飾プリンはある点で有用ではあるが、一般にピリミジン
および７−デアザプリンのように有用ではない。さらに
本発明で有用なピリミジンおよび７−デアザプリンはそ
れぞれ５位および７位に天然置換があってはいけない。
その結果、チミン、５−メチルシトシン、および５−ヒ
ドロキシメチルシトシンなどのようなある塩基は有用で
ない。現在のところ好ましい塩基はシトシン、ウラシ
ル、デアザアデニンおよびデアザグアニンである。
【００１５】Ａは少なくとも３個の炭素原子を有し、修
飾ヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを含む
二重鎖に取り込まれた時ポリペプチドと検出可能な複合
体を形成することの出来る成分である。従って、Ａは上
記性質を有するいかなるリガンドでもよく、適当な担体
と結合した時のみ免疫性があり、適当な抗体と相互反応
を起して複合体を生成することが出来るハプテンを含
む。有用な成分の例は以下のとおりです。
【化１４】 である。これらの中で好ましいＡとしてはビオチンおよ
びイミノビオチンである。さらに芳香成分は塩基対のら
線構造内に入り込む傾向があるので成分Ａは非芳香であ
ることが好ましい。また小さい成分はポリペプチドと十
分に分子相互作用をし得ないので、Ａは安定な複合体を
形成させるのに十分な相互作用が起こるように、少なく
ともＣ５であることが望ましい。ビオチンおよびイミノ
ビオチンはこれらの両方の基準を満たしている。
【００１６】Ａ部分と塩基Ｂを連結する結合またはグル
ープは、炭素−炭素一重結合、炭素−炭素二重結合、炭
素−窒素単結合または炭素−酸素単結合を含むよく知ら
れているいかなる結合でもよい。しかし、一般にはＢに
対してα−位にオレフィン結合を含む化学結合が望まし
い。α位のオレフィン結合の存在は、よく知られる二重
ら線構造中塩基が他の塩基と対を成す時、Ａ成分をその
塩基から離す役目をもつ。これはポリペプチドとの相互
作用を起すのを容易にし、その結果、複合体形成を促進
する。さらに、回転自由度のより大きい一重結合は、ポ
リペプチドによる認識とポリペプチドとの複合体形成を
可能にするほどＡ部分をら線から必ずしも離さない。さ
らに望ましいのは化学結合グループが一級アミンから誘
導され、−ＣＨ２−ＮＨ−の構造を有することで、この
ような結合はよく知られるアミン修飾反応を利用して形
成される。アリルアミンおよびアリル−（３−アミノ−
２−ヒドロキシ−１−プロピル）エーテルグループから
誘導される好ましい結合の例としては、それぞれ
【化１５】 がある。これらの結合が望ましいのであるが、特にチオ
ール、カルボン酸およびエポキシド官能基のような他の
修飾官能基をもつオレフィン結合鎖を含む他の結合も使
用される。結合グループは特異的な位置、即ち、ピリミ
ジンの５位、プリンの８位或いはデアザプリンの７位、
に結合する。前述のとおり、プリンの８位における置換
は本明細書に述べる全ての方法で有用な修飾ヌクレオチ
ドを生成しない。窒素原子となっているプリンの７位が
結合位置となり得るかも知れない。しかし、今日まで採
用され、本件で述べられる化学置換方法はこの目的には
適してしない。ｘ、ｙ、ｚの文字は糖の５′位、３′位
および２′位に結合するグループを表わす。これらの結
合は、
【化１６】 のいずれかである。考えとしてはあるが、ｘ、ｙおよび
ｚの全てが同時に同じグループであることはないだろ
う。より適当なのは、ｘ、ｙ、およびｚの少なくとも一
つがモノ−、ジ−或いはトリりん酸のいずれかりん酸含
有基であり、少なくとも一つがＨＯ−またはＨ−である
ことだ。容易に判断できるだろうが、ｚがＨＯ−又はＨ
−である、即ち、それぞれリボヌクレオチド又はデオキ
シリボヌクレオチドであるのが最も適当であろう。その
ようなヌクレオチドの例としては、５′−リボヌクレオ
シドモノフォスフェート、５′−リボヌクレオシドジフ
ォスフェート、５′−リボヌクレオシドトリフォスフェ
ート、５′−デオキシリボヌクレオシドモノフォスフェ
ート、５′−デオキリボヌクレオシドジフォスフェー
ト、５′−デオキシリボヌクレオシドトリフォスフェー
ト、５′−ｐ−リボヌクレオシド−５′ｐおよび５′−
ｐ−デオキシリボヌクレオシド−３′ｐがある。さらに
具体的な例としては、Ａがビオチン或いはイミノビオチ
ンであり、化学結合が
【化１７】 であり、Ｂがウラシル又はシトシンであるようなこの種
の修飾ヌクレオチドである。
【００１７】塩基にリンカー鎖およびプローブ部分を導
入するのに採用される一般的な合成手段は既に述べられ
ている。（特に：Ｊ．Ｌ．ＲｕｔｈおよびＤ．Ｅ．Ｂｅ
ｒｇｓｔｒｏｍ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４３巻、２８
７０頁〔１９８７年〕；Ｄ．Ｅ．Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍお
よびＭ．Ｋ．Ｏｇａｗａ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．１００巻、８１０６頁〔１９７８年〕；および
Ｃ．Ｆ．Ｂｉｇｇｅ、Ｐ．Ｋａｌａｒｉｔｉｓ、Ｊ．
Ｒ．Ｄｅｃｋ、およびＭ．Ｐ．Ｍｅｒｔｅｓ、Ｊ．Ａｍ
ｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０２巻、２０３３頁〔１９
８０年〕）しかしながら、本発明で採用されるオレフィ
ン置換は過去に用いられていない。プローブ部分Ａの結
合を促進するため、アリルアミン〔ＡＡ〕またはアリル
−（３−アミノ−２−ヒドロキシ−１−プロピル）エー
テル〔ＮＡＧＥ〕のような一級アミン官能基をもつオレ
フィンを採用することが特に望ましく、それにより以下
のような標準アミン修飾反応によりプローブ結合が可能
である。
【化１８】 調製が容易であるためプローブ添加にはＮＨＳ−エステ
ルを用いるのが好ましいことがわかっている。しかし、
他の修飾可能な官能基、例えばチオール、カルボン酸、
エポキシド等を有するオレフィンリンカー鎖も利用可能
である。さらに、もし望むならリンカー鎖とプローブの
両方を一段階で導入することができる。
【００１８】具体的には、次の構造を有する修飾ヌクレ
オチドを以下に示す方法で調製することが出来る。
【化１９】 但し、Ｂは糖のＣ１′位に共有結合するプリン、７−デ
アザプリン又はピリミジン部分を表わし、Ｂがプリン又
は７−デアザプリンである時は糖はプリン又はデアザプ
リンのＮ９位に結合し、Ｂがピリミジンである時はＮ１
−位に結合し、Ａは少なくとも３個の炭素原子より成
り、化合物が二重鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ二重鎖、ＤＮＡ−Ｒ
ＮＡハイブリッドに取り込まれると、ポリペプチドと検
出可能な複合体を形成することが出来る成分を表わし、
点線はＢとＡを連結する化学結合を表わし、Ｂがプリン
であれば結合はプリンの８位につき、７−デアザプリン
であればデアザプリンの７位に結合し、Ｂがピリミジン
であれば結合はピリミジンの５位につき、ｘ、ｙ、およ
びｚのそれぞれはＨ−、ＨＯ−、
【化２０】 を表わす。反応は；
【００１９】（ａ） 次の構造を有する化合物と水銀と
を適当な溶媒中、適当条件下で反応させ、
【化２１】 以下の構造を有する水銀化合物を形成し、
【化２２】 （ｂ） 上記水銀化合物を該水銀化合物の−Ｈｇ＋と反
応性があり、式…Ｎで表わされる化学成分と反応させ、
該反応は水溶液中、Ｋ２ＰｄＣｌ４存在下、適当な条件
下で行ない、次の構造式を有する化合物を生成させ、そ
して、
【化２３】 但し、Ｎは反応性の末端官能基或いはＡである。 （ｃ） 上記構造中ＮがＡである時は該化合物を修飾ヌ
クレオチドとして回収し、或いはＮが反応性の末端基で
ある時は該化合物をＭ−Ａなる構造を有する化合物と反
応させて修飾ヌクレオチドを形成し、それを回収する。
但し、上記Ｍ−Ａ中のＭは水溶液中適当条件下でＮと反
応性のある官能基を示す。以下の図で実例を示す。
【化２４】
【００２０】反応は水素イオン濃度ｐＨ１の低濃度、或
いはｐＨ１４の高濃度で行なうことも出来るが、約４か
ら８の範囲で行なうのが好ましい。これは特に、ヌクレ
オシドポリフォスフェート、ポリヌクレオチドおよびヌ
クレオチド補酵素などのような上記範囲以外のｐＨでは
加水分解されるような不安定な化合物を扱う場合にそう
である。同様に、不安定な有機化合物の分解を避けるた
め約２０℃から３０℃の範囲内の温度で行なうことが望
ましい。しかし、反応は約５℃から１００℃の温度で行
なうことが可能である。化学反応で一般に普通であるよ
うに、高温では反応速度が促進され、低温では反応が遅
れる。従って反応温度が５℃から１００℃の間で、最適
反応時間も約１０分から９８時間と変化する。望ましい
温度範囲内で反応時間は通常３〜２４時間である。ｐＨ
を望む範囲内に保持する好ましい方法は緩衝液の使用に
よるものである。各種緩衝液が使用可能である。例え
ば、酢酸ナトリウムまたはカリウム、トリス酢酸および
ほう酸−水酸化ナトリウム緩衝液などである。使用する
際の緩衝液の濃度は約２．０モル濃度までの広い範囲に
亘る。
【００２１】水銀化およびパラジウム触媒の添加反応の
利点は特に、反応を水の中で行なうことができる点であ
るが、溶解性助剤として少量の有機溶媒を加えることも
有効である。通常選択される有機溶媒は水と混和できる
ものである。それらはメタノール、エタノール、プロパ
ノール、グリセリン、ジオキサン、アセトン、ピリジン
およびジメチルホルムアミドなどのエーテル類、アルコ
ール類、エステル類、ケトン類、アミド類等から選ばれ
る。しかし、メタノールなどのアルコールの存在でオレ
フィン二重結合にアルコキシ添加が時には見られるの
で、溶解性助剤として使用する有機溶媒は慎重に選ばね
ばならない。α−位又はβ−位環外炭素原子へのアルコ
キシ置換の導入はしばしば酵素基質としてより効率悪く
利用される化合物を生成する。各種水銀塩が利用され得
るが現在望ましい塩は酢酸水銀である。また既に述べた
ように化合物は先ずリンカー鎖を添加し、次にＡ部分を
加えるか或いは既にＡが添加されたものにリンカー鎖を
添加することで調製される。従って式…Ｎにより表わさ
れる化学成分は最終的に望む化合物を形成することの出
来る多くの物質のいずれでもよい。その例としては、
【化２５】 イミノビオチンがある。
【００２２】これらの反応に採用される反応物の量は広
い範囲に亘る。しかし、通常、非水銀化合物、水銀化合
物およびパラジウム含有化合物の量は実質的に化学量論
的なものであり、一方、水銀塩および化合物…Ｎは過剰
モル濃度、即ち、それぞれ水銀化合物又は非水銀化合物
のモル当り５〜２０モルの…Ｎ又は水銀塩、で存在す
る。実際には量は反応条件の差および反応物の詳細差異
に依って変化する。酵素基質として機能することの出来
るヌクレオチド誘導体にビオチンプローブが直接結合し
ていることにより、実施する実験プロトコールおよび分
析に用いる検出方法（顕微鏡的および非顕微鏡的）の両
方に於いてかなり多様性が出来る。例えば、ビオチンヌ
クレオチドは細胞或いは細胞抽出物により合成されてい
る最中のポリヌクレオチド中に導入することが出来、そ
の結果、初期の（生成中の）ポリヌクレオチド鎖を検出
および／または単離することが可能になる。このような
方法は他のどんな直接化学修飾法によっても行なうこと
が出来ない。さらに、ビオチンのようなプローブをポリ
ヌクレオチドの位置に高度に選択的に或いは特異的箇所
に導入するには酵素が試薬として用いられ得る。同じよ
うなプローブで修飾した生成物を化学合成で達成するの
は極度に困難であろう。ビオチン或いはイミノビオチン
を含有するヌクレオチドの合成は以下に詳細に述べる実
施例に従って達成された。これらのプローブのいずれか
をＣ５位炭素原子に結合して有するピリミジンヌクレオ
シドトリフォスフェートは原核細胞および真核細胞の両
方の精製核酸ポリメラーゼの広い種類に対し良好乃至優
秀な基質であった。これらはＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリ
メラーゼＩ、バクテリオファージＴ４のＤＮＡポリメラ
ーゼ、ネズミ（Ａ−９）およびヒト（ＨｅＬａ）細胞か
らのＤＮＡポリメラーゼαおよびβおよびヘルペスシン
プレックスウイルスのＤＮＡポリメラーゼである。Ｅ．
ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩについて確認データを
Ｒｉｇｂｙらのニックトランスレーション条件（Ｐ．
Ｗ．Ｊ．Ｒｉｇｂｙ，Ｍ．Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ，Ｃ．Ｒ
ｈｏｄｅｓおよびＰ．Ｂｅｒｇ；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．１１３巻、２３７頁：１９７７年）或いはＢｏｕｒ
ｇｕｉｇｎｏｎらにより記載されたギャップ修復反応
（Ｇ．Ｊ．Ｂｏｕｒｇｕｉｇｎｏｎ，Ｐ．Ｊ．Ｔａｔｔ
ｅｒｓａｌｌおよびＤ．Ｃ．Ｗａｒｄ；Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．２０巻２９０頁：１９７６年）を用いて得ている。
ビオチン−ｄＵＴＰはまたｍｉｌｌｅｒらの方法（Ｍ．
Ｒ．ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｃ．Ｃａｓｔｅｌｌｏｔ，Ｊ
ｒ．およびＡ．Ｂ．Ｐａｒｄｅｅ；Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ
Ｒｅｓ．１２０巻、４２１頁：１９７９年）に従ってリ
ゾレシチン処理により透過させたＣＨＯ細胞中およびヘ
ルペスシンプレックスウイルスを感染したＢＨＫ細胞か
ら調製した核複製系の両方でポリメラーゼの基質として
機能することもわかっている。ビオチンリボヌクレオチ
ドトリフォスフェートはＥ．ｃｏｌｉ．およびバクテリ
オファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼの基質として働く
ことがわかっているが、対応するデオキシリボヌクレオ
チドトリフォスフェートのように効率よく利用されな
い。事実、これらは調べた真核細胞ＲＮＡポリメラーゼ
（ＨｅＬａ細胞ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、仔牛胸腺Ｒ
ＮＡポリメラーゼＩＩおよびマウス細胞ＲＮＡポリメラ
ーゼＩＩ）による取り込みがあるとしても非常に低い。
この基質作用の範囲が限られていることは生体内或いは
試験管内転写実験における利用性を制限するが、ピオチ
ン標識ＲＮＡプローブはＥ．ｃｏｌｉ又はＴ７ ＲＮＡ
ポリメラーゼを用いてＤＮＡ鋳型から、或いはＲＮＡリ
ガーゼを用いてビオチニル‐ｐＣｐのような化合物との
３′末端標識法により酵素的に調製することが出来る。
しかし、ＵＴＰのＡＡ−およびＮＡＧＥ−誘導体は上述
の真核細胞ＲＮＡポリメラーゼの基質となる。これらの
アナログの抗体が入手できれば初期の転写物の単離が免
疫法或いはアフィニティー法により可能である。
【００２３】ビオチン又はイミノビオチン置換を有する
ヌクレオチドの酵素的ポリメリゼーションは、これらの
いずれのプローブも放射標識されていなかったので追跡
出来なかった。しかし、二つの実験的証拠からビオチン
−ヌクレオチドが確かに取り込まれたことが明かであ
る。一つはビオチン−ヌクレオチド存在下で合成された
ポリヌクレオチドはアビジン或いはストレプトアビジン
アフィニティカラムでクロマトグラフを行なうと選択的
に吸着すること。（第１表および第２表）例えば、３２
Ｐ−ｄＡＭＰでニック修復した通常のＤＮＡは０．５Ｍ
食塩の添加で定量的に溶出するのに対し、大部分のビオ
チニルＤＮＡ又はイミノビオチニルＤＮＡは高濃度の
塩、尿素、グアニジン塩酸、ホルムアミドまたは５０ｍ
Ｍ水酸化ナトリウムで十分洗った後も樹脂に結合したま
まである。これらの洗滌条件下で溶出した僅かの放射標
識区分は再び樹脂に吸着させても結合していないことか
ら、放射活性はビオチン置換のないＤＮＡ断片に関連し
ていると思われる。二つ目の証拠は、精製抗ビオチンＩ
ｇＧおよび続いてのホルマリン固定Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓによる処理によりビオチン標
識ポリヌクレオチドのみが免疫沈澱をすることである。
（第３表）これらの表のデータよりこの方法によると非
常に少量のビオチンが検出可能であることが明確であ
る。これらの結果はまた、ビオチン分子がＤＮＡがまだ
天然の二重鎖である時にアビジン、ストレプトアビジン
或いは特異抗体により認識され得ることを示している。
このことは、ハイブリダイゼーション技法を用いてプロ
ーブの検出を行なうのに抗体結合またはアビジンアフィ
ニティ−法を有効に利用するためには絶対的に必須な条
件である。
【表１】
【表２】
【表３】 このように、以下に示す構造を有する新規化合物を製造
することが可能である。
【化２６】
【００２４】但し、Ｂ，Ｂ′およびＢ″のそれぞれは糖
部分のＣｌ′−位に共有結合するプリン、デアザプリン
或いはピリミジン部を表わし、Ｂ，Ｂ′又はＢ″がプリ
ン或いは７−デアザプリンである場合には糖はプリン或
は７−デアザプリンのＮ９位に結合し、Ｂ，Ｂ′或いは
Ｂ″がピリミジンである場合にはＮ１位に結合し、Ａは
少なくとも３個の炭素原子より成り、相補ＲＮＡ又はＤ
ＮＡ分子より成る二重鎖ら線に取り込まれるとポリペプ
チドと検出可能な複合体を形成することのできる成分を
表わし、点線はＢとＡを連結する結合グループを表わ
し、Ｂがプリンの時は結合はプリンの８位に連結し、Ｂ
が７−デアザプリンの時は結合はデアザプリンの７位に
連結し、Ｂがピリミジンである時には結合はピリミジン
の５位に連結し、ＺはＨ−またはＨＯ−を示し、そし
て、ｍおよびｎは０からおよそ１００，０００までの整
数を表わす。勿論、一般にｍとｎが同時に０となること
がないのは容易に理解できよう。それは、もしそうなる
と化合物は単に前述のような修飾ヌクレオチドとなるか
らである。一般にＢ′とＢ″は同じオリゴー又はポリヌ
クレオチドの中を変化し、交互にウラシル、シトシン、
チミン、グアニン、アデニン等々を示す。又、一般にそ
の変化はよく知られる遺伝暗号に従ったペプチド合成を
コードするヌクレオチドの整った配列に対応する。しか
し、示した構造はまた、仔牛ＤＮＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ又は
酵母のリボゾームＲＮＡ、バクテリオファージのＲＮＡ
およびＤＮＡ（Ｒ１７，ｆｄ）、動物ウイルス（ＳＶ
４０ ＤＮＡ）、染色体ＤＮＡなどと共にｐｏｌｙＣ，
ｐｏｌｙＵ，ｐｏｌｙ（Ａ−Ｕ）およびｐｏｌｙｄ（Ａ
−Ｕ）などのポリヌクレオチドをも、それらが本発明に
従って修飾されている限り、包含する。又、本構造はオ
リゴマーまたはポリマー中一個以上の修飾ヌクレオチド
を含むもの、例えば、２個から３０個の修飾ヌクレオチ
ドを含むものも包含する。これに関して限界要因は修飾
が多すぎてポリヌクレオチドが目的の利用に対し効果な
くならないということである。
【００２５】最後に、修飾オリゴーおよびポリーヌクレ
オチドは結合し、同じ構造を有し、末端基が両立し、或
いは反応性を示す限りより大きい物質を形成することも
出来る。これらの化合物は適当な条件下で合成を指示す
る核酸鋳型の存在下、適当なヌクレオチド、特にヌクレ
オチドトリフォスフェート、の酵素的重合により作製さ
れ得る。そのような条件は使用する酵素、存在するヌク
レオチドの量および他の要因により広く変わる。酵素の
実例としてはＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩ、バ
クテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、、ネズミお
よびヒト（ＨｅＬａ）細胞からのＤＮＡポリメラーゼα
およびβ、Ｅ．ｃｏｌｉのＲＮＡポリメラーゼ、バクテ
リオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼ、ＨｅＬａ細胞
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩを含む真核細胞ＲＮＡポリメ
ラーゼ、仔牛ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび，ネズミ細
胞ＲＮＡポリメラーゼＩＩがある。化合物はまたオリゴ
ーおよびポリヌクレオチドに末端付加してその付加が
５′側か３′位かによりｍ又はｎが０である化合物を生
成することで調製可能である。さらに、塩基がビオチン
化されたｐＣｐ又はｐＵｐのような化合物を酵素ＲＮＡ
リガーゼを使用して既存分子に付加することも出来る。
修飾オリゴおよびポリヌクレオチドはまた既に個々のヌ
クレオチド修飾としてて述べられた方法を用い、既にあ
るオリゴ又はポリヌクレオチドの化学修飾により調製で
きる。本発明の種々の修飾ヌクレオチド、オリゴヌクレ
オチドおよびポリヌクレオチドは、該化合物を、複合体
を形成するような適当な条件下でそれと複合体を形成す
ることのできるポリペプチドと接触することにより検出
される。但し、ポリペプチドは複合体を形成すると一般
に既知の検出方法により検出され得る成分を一つ以上有
しているものとする。ビオチン型のプローブ用のポリペ
プチド検出体はアビジンである。アビジン−ビオチン相
互作用は天然に見られる最も強い非共有結合定数（Ｋｄ
ｉｓ＝１０−１５）を示す。もしアビジンを潜在的表示
指示分子、例えば螢光染料（フルオレセイン、ロダミ
ン）、電子密度試薬（フェリチン、ヘモシアニン、コロ
イド金）或いは不溶性反応生成物を放出できる酵素（ペ
ルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）と連結す
るとビオチンプローブの存在、位置および／又は量が決
定できる。
【００２６】残念ながらアビジンは核酸又はクロマチン
と共に用いるとビオチン指示たん白として望ましくない
性質が一つある。報告によると（Ｍ．Ｈ．Ｈｅｇｇｅｎ
ｅｓｓ；Ｓｔａｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２巻１６５
頁、１９７７年；Ｍ．Ｈ．Ｈｅｇｇｅｎｅｓｓおよび
Ｊ．Ｆ．Ａｓｈ；Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７３巻、７
８３頁、１９７７年；Ｅ．Ａ．ＢａｙｅｒおよびＭ．Ｗ
ｉｌｃｈｅｋ；ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ２６巻、１頁、１９８０
年）アビジンは縮合クロマチンや核酸を多量に含む細胞
分画とビオチン結合とは別の結合で強く結合する。アビ
ジンはｐＩが１０．５である塩基性糖たん白であるの
で、そのヒストン様特質又はその糖部分がこの非特異的
相互作用に関係していると思われる。ビオチン含有ヌク
レオチドおよびその誘導体の望ましいプローブはストレ
プトアビジンで、これは土壌分離菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉにより合成されるアビジン様
たん白である。本物質の調製と精製はＨｏｆｆｍａｎ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７巻、
４６６６頁（１９８０年）に記載されている。ストレプ
トアビジンはより低いＰＩ値（５．０）を有し、糖がつ
いてなく、ＤＮＡに対する非特異的結合がアビジンより
低く、従って核酸検出の方法に関する応用の潜在的利点
を有する。ビオチン様プローブ検出のための最も好まし
いたん白は単特異性ウサギＩｇＧ、抗ビオチン免疫グロ
ブリンである。本化合物は既に報告されているように
（Ｍ．Ｂｅｒｇｅｒ，ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ，６２巻３１９頁：１９７９年）ウサギを
ウシ血清アルブミン結合ビオチンで免疫して調製し、ア
フィニティークロマトグラフィーにより精製する。免疫
グロブリン−ハプテンの会合定数はＫａｓｓｎ１０６か
ら１０１０という値でアビジン−ビオチン複合体に対す
るよりかなり低いが、アビジン−イミノビオチン複合体
で観察されるものと実質的に同等である。さらに、抗ビ
オチン抗体はクロマチン物質との非特異的結合があると
しても少ないのでその場所でのハイブリダイゼーション
による染色体上の特定ポリヌクレオチド配列を検出する
のに非常に有用であることがわかった。
【００２７】本発明の修飾ポリヌクレオチドはハイブリ
ッド形成プローブとしての使用と両立する条件下で変性
および再生することができる。いくつかのビオチン置換
ＤＮＡおよびＲＮＡポリマーの熱変性プロフィルおよび
ハイブリダイゼーション特質の分析がこれを明確に示し
ている。例えば、キロベース当りおよそ１０〜１００個
のビオチン残基を導入して修復されたｐＢＲ３２２ＤＮ
ＡまたはλＤＮＡはビオチン非含有の対照ＤＮＡと本質
的に同じＴｍ値を有する。さらに、３２Ｐ−標識のビオ
チン置換ｐＢＲ３２２ＤＮＡはこのプラズミドを含む細
胞コロニーを検出するハイブリダイゼーションプローブ
として用いた時チミジン含有の対照ＤＮＡと同じ程度の
比活性とオートラジオグラフィー信号強度とを示した。
一方の鎖の全てのチミジン残基（全体として５ｋｂ当り
１２５０）をビオチンヌクレオチドで置換した例えばＭ
ＶＭ ＲＦ ＤＮＡのような二重鎖ＤＮＡに於いて、Ｔ
ｍ値は非置換の対照ＤＮＡのＴｍより５℃低いだけであ
る。各塩基対がビオチン−ｄＵＭＰ残基を含むポリｄ
（Ａ−ビオチンＵ）のＴｍはポリｄ（Ａ−Ｔ）対照より
１５℃低いが、変性および再生中に観察される共同性の
程度および深色化の度合は２つのポリマーで同じであっ
た。二重鎖ＲＮＡおよびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの
比較分折でポリマー中のビオチン含量が増加するにつれ
てＴｍ値は低下することがわかる。しかし、ポリマーの
ハイブリッド形成化の特質を有意に変えることなくかな
りの数のビオチン分子を導入することが出来るのは明か
である。これらの結果はビオチン置換ポリヌクレオチド
が染色体、固定細胞或いは組織分画中の特定ポリヌクレ
オチド配列を検出しそして／または位置を定めるための
プローブとして利用できることを強く示唆している。ビ
オチン置換プローブの検出のための一般的プロトコール
を以下に図示する。コロニーハイブリダイゼーションま
たはノーザン／サザンハイブリダイゼーション法による
プローブ検出のプロトコール
【化２７】 この一般スキームは遺伝子マッピング（細胞遺伝学）お
よび組換えＤＮＡ技術に用いられる手法のみを示してい
る。しかし、これは臨床サンプル中のバクテリア、ウイ
ルス或いは病原菌由来の核酸配列の検出にも同様に十分
応用できるもので、これは放射性同位元素に依存しない
臨床診断の強力な新しいアプローチの基本を成す。ビオ
チン検出のための免疫学的および組織化学的方法は、そ
の場のハイブリッド形成化による遺伝子地図作成の迅速
法およびブロットハイブリダイゼーション法による特異
核酸配列検出のための非放射活性法に使用し得る基本的
アプローチを提供する。本技術を用いて新しい臨床診断
方法の開発もできよう。本アプローチを用いて特異ＤＮ
Ａ又はＲＮＡ分子、特に例えば細菌、カビ、ウイルス、
酵母または哺乳類など生物から由来する分子の存在を決
定することが可能である。
【００２８】さらに、細菌の抗生物質耐性を決定する検
索のための方法も提供する。即ち、例えば、Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはｎｅｉｓｓ
ｅｒｉｓ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのペニシリン耐
性、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，Ｃ
ａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｒｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ又はｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏ
ｎｏｒｒｈｏｅａｅのテトラサイクリン耐性およびｍｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの
アミノグリコシド耐性を決定することが出来る。これら
の方法では、その生物の抗生物質耐性を支配する核酸配
列に相補的であり、さらに本発明による修飾ヌクレオチ
ドを１個又はそれ以上含むポリヌクレオチドを調製す
る。このポリヌクレオチドを検査している微生物から得
られる核酸とハイブリッド形成する。ハイブリッド形成
をしないということはその微生物或いは耐性特質を欠い
ていることを示す。ハイブリッド形成した核酸二重鎖は
検出可能成分をもつ適当なポリペプチドと複合体を形成
させて同定し、適当な検出方法を用いてその複合体の存
在を検出する。陽性で検出されるということは複合体
が、二重鎖が、従って注目している核酸配列が、存在す
ることを示す。このアプローチは地中海貧血および鎌状
赤血球貧血症のような遺伝病の診断にも拡大され得る。
その存在、非存在（地中海貧血の場合）がその疾患に関
連するＤＮＡ遺伝子配列を本発明によるポリヌクレオチ
ドプローブとハイブリダイズした後適当な検出可能なポ
リペプチドと複合体形成することに基づく検出を行なう
ことができる。
【００２９】遺伝子の地図作成および遺伝子の染色体上
の特定位置決定はこれまで厭な時間のかかる仕事で主に
細胞融合と融合細胞の遺伝学の技術を用いるものであっ
た。その場のハイブリダイゼーションはＤｒｏｓｏｐｈ
ｉｌａのような染色体が多系性の種の単コピー遺伝子配
列の地図作成への使用は成功しているが、ほとんどの高
等真核細胞染色体での特有配列遺伝子の検出は標準ハイ
ブリダイゼーション法を用いて、不可能でないとしても
非常に困難であった。ハイブリダイゼーションの箇所を
効率よくオートラジオグラフィーにより位置決定するに
は非常に高い放射比活性を持つポリヌクレオチドプロー
ブが必要であり、その結果、プローブの放射分解が速
く、同時に銀粒子の付着による地のノイズが増加する。
低比活性乃至中庸の比活性の放射活性を有するハイブリ
ダイゼーションプローブを用いるとリボゾームＲＮＡ遺
伝子や付随ＤＮＡのような多コピー配列を検出するので
さえ多くの日数、或いは週の露出時間が必要である。組
み換えＤＮＡ技術により真核細胞に存在する実際上全て
の単コピー配列の分子クローン化が可能となったためそ
のクローンの遺伝子断片の染色体上の由来を地図作成す
るための迅速かつ鋭敏な方法を持つことは非常に有利で
ある。修飾ヌクレオチドはその場のハイブリダイゼーシ
ョンによる遺伝子地図作成の方法に利用され、これは放
射性同位元素の使用に代わるものである。本法はニック
トランスレーションによりＤＮＡプローブ中に酵素的に
取り込まれ得るビオチン含有チミジンアナログの利点を
利用している。ハイブリッド形成の後、ビオチン分子は
アフィニティー精製ウサギ抗ビオチン抗体のための抗原
として作用する。螢光標識した山羊抗ウサギＩｇＧとで
作成した免疫螢光抗体サンドイッチによりクローン遺伝
子配列の迅速かつ特異的細胞遺伝的位置決定が緑黄帯と
して可能となる。本法は従来のその場の遺伝子位置決定
のオートラジオグラフィー法に比して４つの主な利点が
ある。それは地のノイズの減少；バンド間の分解能の増
加：プローブハイブリッド形成の位置決定のために必要
な時間の短縮；およびハイブリッド形成プローブの化学
的安定性である。本法はＤｒｏｓｏｐａｉｌａ ｍｉｌ
ａｎｏｇａｓｔｅｒの多糸性染色体のくり返しの特有Ｄ
ＮＡ配列およびマウスの中期染色体の付随ＤＮＡの位置
決定にうまく応用されている。
【００３０】このように間接免疫螢光により検出する本
発明による修飾ヌクレオチドをその場の遺伝子地図作成
に用いてプローブの効率を確立する試験システムに多糸
性染色体を用いることが出来るということがわかった。
プローブとしてはＯｔｔｏＳｃｈｍｉｄｔおよびＤｉｅ
ｔｅｒ Ｓｏｅｌｌにより得られたショウジョウバエの
各種クローン配列、例えば約５から約２２キロベースに
亘る大きさの挿入をもつプラズミッドベクターにクロー
ンされたｔＲＮＡの遺伝子等、が含まれた。これらのク
ローンの多くは放射同位元素を用いた従来のハイブリダ
イゼーション法によりショウジョウバエ染色体地図上の
特定バンドに既に決定されている。ＤＮＡプローブはビ
オチン−ｄＵＴＰ存在でニックトランスレーションされ
る。場合によってはニックトンスレーション反応液中に
３Ｈ−ｄＡＴＰおよび／又は３ＨｄＣＴＰを加えた。こ
れにより一つの染色体展開でオートラジオグラフィーお
よび免疫螢光法の両者による配列の位置決定が可能であ
る。その場のハイブリダイゼーションはＭ．Ｌ．Ｐａｒ
ｄｕｅおよびＪ．Ｇ．Ｇａｌｌ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０巻、１頁（１９７５年）に
記載されているように行なった。ハイブリダイズしなか
ったプローブの２×ＳＳＣによる最後の洗滌の後スライ
ドをＰＢＳ（りん酸緩衝生理食塩水）で洗い、１０ｍｇ
／ｍｌＢＳＡ加ＰＢＳ中２．５μｇ／ｍｌのウサギ抗ビ
オチンと３７℃、２〜１６時間反応させる。その後、ス
ライドをＦＩＴＣ標識のヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｍｉｌｅ
ｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳ
Ａ加ＰＢＳ中１：１００に希釈する。）と１〜４時間イ
ンキュベートする。染色体を螢光発色で見るために赤色
平衡色素としてエバンスブルーを時々必要とする。それ
ぞれ５キロベースおよび２２キロベースの挿入を含むプ
ラスミッドｐＢＲ１７ＤおよびｐＰＷ５３９をこの方法
によりハイブリダイズすると、ハイブリッド形成のパタ
ーンは展開毎に再現性があり一つのスライドで染色体展
開の９０％以上で明白に観察される。
【００３１】クローン化された転化可能な因子ｐＡＣ１
０４はショウジョウバエのゲノム上で多くの位置にマッ
プすることが知られる。本プローブのその場のハイブリ
ダイゼーションにより得られるオートラジオグラフと螢
光像とを比較すると、本法の主な利点がわかる。即ち、
オートラジオグラフでは銀粒子の拡散部がみられるのに
対し、免疫螢光標識によると二重線又はいくつかのバン
ドが識別できる。本法の他の直接的はっきりした利点
は、間接の免疫螢光により行なう遺伝子の割当てに要す
る時間が非常に軽減することである。ＤＮＡ断片の特定
バンドへの割付けは６時間以内のハイブリッド形成で行
なうことができる。これはオートラジオグラフィー露出
の何日、何週間に匹敵する。この要因と分解能の増加と
により間接免疫螢光により検出される修飾ヌクレオチド
の利用が古典的方法よりも直ちにより好ましいものとし
ている。この免疫法はまた哺乳動物染色体にも用いられ
ることがわかっており、付随ＤＮＡがマウス中期染色体
の動原体地域に位置づけられている。その結果はヒトお
よび他の哺乳動物染色体の単コピー（特異）配列を簡単
に遺伝子マッピングする方法開発のための基礎を提供す
る。そのような方法により染色体の遺伝的構成の理解が
大いに深まり、臨床細胞遺伝的診断がより迅速でかつ実
用的になる。
【００３２】染色体展開にハイブリッド形成後にウサギ
抗ビオチンＩｇＧを反応させる一般抗体サンドウイッチ
法は成功かもしれないがこのプロトコールははっきりし
た遺伝子割付けに十分な蛍光を発生しないかも知れな
い。しかし、１９７２年Ｌａｍｍらにより又１９７４年
Ｗｏｆｓｙらにより記載される“ハプテン−抗体サンド
イッチ法”を用いることによりより強い蛍光信号を達成
することができる。この手法では一次抗体、我々の例で
は単一特異性のウサギ抗ビオチンＩｇＧ、を例えば２，
４−ジニトロフルオロベンゼンのようなハプテン化試薬
で、好ましくは免疫グルブリンが抗原親和カラム（ビオ
チン−セファロースＴＭ）に結合している間に、化学的
修飾を行なう。１５〜２０もの多くのハプテン（ＤＮ
Ｐ）基が抗原結合の親和性や特異性を低下することなく
一次抗体に連結され得る（ＷａｌｌａｃｅおよびＷｏｆ
ｓｙ（１９７９年））。もし試験サンプルの一次抗体処
理の後、蛍光標識した抗ＩｇＧでなく蛍光標識した抗−
ハプテンＩｇＧを反応させると、５〜７倍増加した蛍光
信号が達成できる。単一特異性のモルモット抗−ＤＮＰ
ＩｇＧも又入手可能であるのでこの二次抗体もビオチン
とハプテン化することが出来、その結果、ＤＮＰ−標識
抗ビオチンＩｇＧおよびビオチン標識抗ＤＮＰＩｇＧの
２つの抗ハプテンＩｇＧ集団を得る。もしこれらを交代
に用いてハプテン−抗体サンドイッチの何回かを行な
い、続いて多くの哺乳動物種からのＩｇＧと特異的に結
合するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓか
らの蛍光標識たん白Ａと行なうと一次抗体信号の莫大な
増幅と同時に利用性の増加となる。
【００３３】Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎ
ｉから得られるたん白ストレプトアビジンは連結可視化
システム〔たとえば蛍光プローブ或いは組織化学的試
薬〕をハイブリッド形成したビオチン含有ポリヌクレオ
チドの位置まで特異的に導く運搬役として抗ビオチンＩ
ｇＧの代りとなり得る。ストレプトアビジンの抗ビオチ
ンＩｇＧに対する利点の一つはビオチンに対する親和性
がＫａｓｓｎ＝１０１５であり、一方ハプテン−ＩｇＧ
との相互作用の会合定数は１０７から１０１０である点
である。反応速度が速いことと親和性が非常に高いとい
うのはビオチン化したプローブを局在させるのに要する
時間が免疫試薬で数時間であるのに対してストレプトア
ビジンで数分であることを示す。ストレプトアビジン検
出システムの最初の評価は現在進行中である。ビオチン
化ＤＮＡプローブとハイブリッド形成したポリテン染色
体をストレプトアビジンと反応させ、続いてビオチンと
ＦＩＴＣで二重標識したウシ血清アルブミン（ＦＩＴ
Ｃ、ビオチン−ＢＳＡ）とインキュベートする。ストレ
プトアビジンの４個のサブユニットの内１個のみが各ビ
オチン化ＤＮＡ部位との結合に関与しているらしいため
ストレプトアビジン−ビオチンヌクレオチド複合体の残
りの３個の非結合サブユニットのそれぞれに１個の標識
ＢＳＡ分子が潜在的には結合可能である。この１個のス
トレプトアビジン＋ＦＩＴＣ、ビオチンＢＳＡ層からの
蛍光シグナルを前述の基本的“抗体サンドイッチ法”を
用いて対照と比較する。
【００３４】もし“抗体サンドイッチ法”とストレプト
アビジン＋ＦＩＴＣ、ビオチンＢＳＡ検出の強度が匹敵
するものであれば、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ、ビ
オチンＢＳＡシステムを多重“ハプテン−抗体サンドイ
ッチ”アプローチと同じような方法で単一コピー感度を
高める試みが出来る。ＢＳＡ上のビオチン基のいくつか
はストレプトアビジンの第一層と結合しないので、十分
なシグナルが得られるまでストレプトアビジンの第二層
を加える。例えば、もし第二層でただ２個のストレプト
アビジンサブユニットが各第一層ＢＳＡと結合し、これ
らのストレプトアビジンサブユニットのそれぞれが３個
のＦＩＴＣ−ビオチンＢＳＡ分子と結合するなら、第二
層の強度は第一層のシグナルの２倍の強さとなり、第三
層は類似の結合化学量論で蛍光強度は第一層の１２倍に
なる。従って総強度は連続に加えた層に従って急速に増
加する。結合する蛍光およびビオチンプローブの量を最
大にするためにＢＳＡでなく甲状腺グロブリンのような
より大きい担体たん白を使用する計画もある。さらに、
ビオチンプローブと担体たん白の間により長いリンカー
鎖を使用することも必要かも知れない。長いリンカー鎖
はビオチン化蛍光担体分子をストレプトアビジンの各非
結合サブユニットへの理論的移動を立体的に最適化し、
次の層でビオチン化蛍光担体と結合するストレプトアビ
ジンのサブユニットの数を最大とする。以前と同様に、
担体たん白の蛍光プローブおよびビオチンでの置換が溶
解性および／または非特異的結合の問題を起こさないよ
う適当な調整が成される。ストレプトアビジン担体たん
白の運搬システムはその運搬速度に加えて免疫蛍光法に
くらべて２つの有意な利点を有している。第一に、層形
成にたった２つのたん白成分が必要であること。第二に
担体たん白のみが修飾される必要があり、ビオチン基が
ストレプトアビジンに接触可能である限り、機能上或い
は全構造的完全を維持する必要がない。
【００３５】ハイブリッド形成したプローブの可視化の
ための蛍光法の代用としてペルオキシダーゼ、アルカリ
フォスターゼ又はβ−ガラクトシダーゼのような酵素を
ハイブリッド形成の部位に導き、そこで可溶性基質を不
溶性の着色沈でんに酵素的に変換して光学顕微鏡で見え
るようにすることができる。この技法の重要な利点は組
織化学法が蛍光検出より１０乃至１００倍感度が高いこ
とである。その上、着色沈でん物は過激な露光でも退色
せず、従って蛍光顕微鏡での一般的欠点の一つを避ける
ことができる。これらの酵素は“ハプテン抗休サンドイ
ッチ”法で蛍光プローブの代りに最終抗体と共役し、そ
の際グルタルアルデヒドのような二官能試薬を用い、或
いはペルオキシダーゼの場合にはペルオキシダーゼの炭
水化物部分をアルデヒドに酸化し、そしてこれらの残基
を望むたん白のε−アミノ基と共役させる。ストレプト
アビジン−ビオチン化担体たん白法では、ビオチン基と
共役した酵素は蛍光−ビオチン化担体システムと置き代
えることが出来た。代りとして、酵素はビオチンを通し
てストレプトアビジンの最終層と共役し、ビオチン化Ｂ
ＳＡ或いは甲状腺グロブリンを用いてそれ以前の層でス
トレプトアビジンの部位の増幅ができる。近い将来、必
要な組織化学試薬と、その場のハイブリッド形成の基底
値のない可視化のための適当な基質／不溶性産物の組み
合わせの開発を始める。シグナル増幅の組織化学的アプ
ローチは従って１９８１年の夏には試験できる筈であ
る。非常の低レベルの蛍光を検出しそして／または像形
成することは現在入手可能な像増強装置或いはレーザー
と光電子増倍装置より成るシステムを用いることにより
可能である。これらの方法により個々の光子のレベルも
の低い光の検出が可能である。適合した数字処理システ
ムにより像の各点、即ち、各図がその物の点から放出す
る光子の数に完全に相関しているような像を形成するこ
とが出来る。このようなシステム或いはセル又はセルの
部分がレーザー光線を通って流れるようなフローシステ
ムを用いることにより目で検出できるよりも１００〜１
０００倍で蛍光物質の感度を増加することが出来る。こ
の増加は単コピー遺伝子の蛍光を検出するのに十分なも
のである。望ましい修飾としてピリミジン環のＣ５位に
アリルアミンの連結鎖を通してビオチン分子が共有結合
しているｄＵＴＰおよびＵＴＰのアナログが合成されて
いる。これらのビオチン化ヌクレオチドは試験管内で各
種ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼの基質として効率よ
く働く。低レベルのビオチン置換を有するＤＮＡ（キロ
ベース当り５０分子以下）は非置換の対照ＤＮＡを区別
出来ない変性、再会合およびハイブリッド形成の特性を
有する。
【００３６】さらに本発明は染色体の核型分析の方法を
も提供する。本法ではわかっている遺伝子に対応し、修
飾ヌクレオチドを含む修飾ポリヌクレオチドを調製す
る。出来たポリヌクレオチドを染色体ＤＮＡとハイブリ
ッド形成させ、生成する二重鎖を適当な条件下で特定の
ポリペプチドと接触させて複合体形成をさせる。ポリペ
プチドは検出可能な部分を含有し、そのため複合体の位
置が決定でき、それにより特定遺伝子の位置が決定でき
る。本発明の他の実例としてはウラシル塩基のいくつか
をプローブを含有するように修飾してあるポリＵを用い
てポリＡ含有配列を検出することが挙げられる。さらに
他の実例として環状修飾ヌクレオチドがあり、該環状修
飾ヌクレオチドでｘ，ｙ，ｚの中の２つは次に示す環状
部を形成するように反応する。
【化２８】 このような環状修飾ヌクレオチドは細胞表層のホルモン
受容体の検出に用いられ、またガン或いは腫瘍細胞検出
法としても利用できる。最後に、本発明により修飾さ
れ、α−胎児たん白或いは発がん抗原のようなその存在
がある腫瘍細胞の診断となるポリペプチド合成に関与し
ているＤＮＡ遺伝子配列から合成されるｍＲＮＡに相補
性のポリヌクレオチドを調製することにより腫瘍細胞を
診断することができる。このようにしてハイブリッド二
重鎖のハイブリッド形成と検出により腫瘍細胞の検出法
を提供できる。
【００３７】以下に記載する実施例は本発明のいろいろ
な局面の実例を示すものであるが、特許請求の範囲に特
に述べた範囲を決して制限するものではない。
【００３８】実施例１及び２ ビオチニル−ＵＴＰ及びビオチニル−ｄＵＴＰの合成 ａ） 水銀化ヌクレオチド類の調製 ＵＴＰ（５７０ｍｇ、１．０ｍ ｍｏｌｅ）又はｄＵＴ
Ｐ（５５４ｍｇ、１．０ｍ ｍｏｌｅ）を１００ｍｌの
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０に溶解し、酢
酸水銀（１．５９ｇｍ、５．０ｍ ｍｏｌｅｓ）を添加
した。溶液を５０℃で４時間加熱し、次いで氷上にて冷
却した。塩化リチウム（３９２ｍｇ、９．０ｍ ｍｏｌ
ｅｓ）を加え、溶液を等量の酢酸エチルで６回抽出し、
過剰のＨｇＣｌ２を除いた。抽出操作の効率を、４，
４′−ビス（ジメチルアミノ）−チオベンゾフェノン
（Ａ．Ｎ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｅｒ、Ａｎａｌｙｓｔ、９
４、３９２（１９６９））を用いて有機溶媒層中の水銀
イオン濃度を概算することによりモニターした。Ｄａｌ
ｅ等（Ｒ．Ｍ．Ｋ．Ｄａｌｅ、Ｄ．Ｃ．Ｗａｒｄ、Ｄ．
Ｃ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ、ａｎｄ Ｅ．Ｍａｒｔｉ
ｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２、９１５
（１９７５））の記載にある如く水溶液の一部のヨード
化の後、分光光度計で決定した、ヌクレオチド、水銀化
の程度は、通常９０から１００％の間であった。しばし
ば、酢酸エチル抽出中に濁って来る、水層中のヌクレオ
チド産物を、三倍量の氷冷エタノールを添加して沈澱さ
せ、遠沈により集めた。沈澱を冷無水アルコールで二
回、エチルエーテルで一回洗滌し、次いで風乾した。こ
れら、この様にして調製した、水銀化ヌクレオチド類
を、さらに精製せずに、アリルアミン−ヌクレオチド類
の合成に使用した。ｂ） アリルアミン−ｄＵＴＰ及びアリルアミン−ＵＴ
Ｐの合成 水銀化ヌクレオチド類（方法ａ）の）を、０．１Ｍ酢酸
ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０に溶解し、濃度を２０ｍＭ
（２６７ｎｍで２００ ＯＤ／ｍｌ）になるように調整
した。新らしい、酢酸水溶液中の酢酸アリルアミン２．
０Ｍ溶液を、８．５ｍｌの氷冷４Ｍ酢酸に１．５ｍｌの
アリルアミン（１３．３ｍ ｍｏｌｅｓ）をゆっくり加
えることにより調製した。３ｍｌ（６．０ｍ ｍｏｌｅ
ｓ）の中和したアリルアミン貯蔵液を２５ｍｌ（０．５
ｍ ｍｏｌｅ）のヌクレオチド溶液に添加した。４ｍｌ
の水に溶解した、１ヌクレオチド等量のＫ２ＰｄＣｌ４
（１６３ｍｇ、０．５ｍ ｍｏｌｅ）を、次いで加え、
反応を開始した。バラジウム塩（Ａｌｆａ−Ｖｅｎｔｒ
ｏｎ）の添加に伴って、溶液は、反応容器壁に析出し始
める金属（ＨｇとＰｄ）で、次第に黒色を呈するように
なった。室温で１８〜２４時間放置後、反応液を、０．
４５ｍｍメンブレンフィルター（ｎａｌｇｅｎｅ）に掛
け残留する大部分の金属沈澱を除いた。黄色の濾過液を
５倍稀釈し、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＴＭＡ−２
５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の１００ｍｌカラムにかけ
た。１カラム等量の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
５．０で洗滌後、産物を、酢酸ナトリウムｐＨ〜８〜
９、又はトリエチルアンモニウムバイカーボネート（Ｔ
ＥＡＢ）ｐＨ７．５の１リットル直線勾配法（リニアー
・グラジエント）で溶出した。目的の産物は０．３０と
０．３５Ｍ間の塩濃度で溶出して来る、主要紫外部吸収
部分に存在した。分光分析の結果、このピークには幾つ
かの産物が含まれていて、最終的精製を、Ｐａｒｔｉｓ
ｉｌ−ＯＤＳ２カラムの逆相−ＨＰＬＣクロマトグラフ
ィーで、０．５Ｍ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４緩衝液ｐＨ３．３
（分析用分離）、又は０．５Ｍ酢酸トリエチルアンモニ
ウムｐＨ４．３（調製用分離）を溶出溶媒として、行っ
た。５−（３−アミノプロペン−１−イル）ウリジン
（ウリジンのアリルアミン付加物）の５′−三燐酸化物
が、ＨＰＬＣカラムから溶出されて来る最終部分であ
り、それらは、未同定の三つの汚染物質からは、はっき
りと分離していた。これらのヌクレオチドを、陽子核磁
気共鳴元素分析で特性ずけを分光及びクロマトグラフ法
により行った〔ＡＡ−ｄＵＴＰ（Ｃ１２Ｈ１６Ｎ３Ｏ
１４Ｐ３Ｎａ４・１Ｈ２Ｏ）：理論値Ｃ，２２．９１；
Ｈ，２．８８；Ｎ，６．６８；Ｐ，１４．７７。実測値
Ｃ，２３．１０；Ｈ，２．８５；Ｎ，６．４９；Ｐ，１
４．７５。 ＡＡ−ＵＴＰ（Ｃ１２Ｈ１６Ｎ３Ｏ１５Ｐ３Ｎａ４・４
Ｈ２Ｏ）：理論値Ｃ，２０．６１；Ｈ，３．４６；Ｎ，
６．０１；Ｐ，１３．３。実測値Ｃ，２０．６７；Ｈ，
４．１１；Ｎ，５．３９；Ｐ，１３．５４〕。ｃ） ＡＡ−ｄＵＴＰ又はＡＡ−ＵＴＰのビオチン化 ビオチニル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（Ｎ
ＨＳＢ）を前述の方法に従って（Ｈ．Ｈｅｉｔｚｍａｎ
ｎ ａｎｄ Ｆ．Ｍ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７１、３５３７
〔１９７４〕）ビオチン（Ｓｉｇｍａ）より調製した。
ＡＡ−ｄＵＴＰ・Ｈ２Ｏ（６３ｍｇ、０．１ｍ ｍｏｌ
ｅ）又はＡＡ−ＵＴＰ・４Ｈ２Ｏ（７０ｍｇ、０．１ｍ
ｍｏｌｅ）を２０ｍｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩
衝液ｐＨ８．５に溶かし、２ｍｌのジメチルフォルムア
ミドに溶かしたＮＨＳＢ（３４．１ｍｇ、０．１ｍ ｍ
ｏｌｅ）を添加した。反応混液を４時間室温に放置し、
次いで前もって、０．１Ｍ ＴＥＡＢ ｐＨ７．５で平
衡化しておいたＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＴＭ Ａ
−２５の３０ｍｌカラムに直接充てんした。カラムを４
００ｍｌのＴＥＡＢの直線勾配（０．１−０．９Ｍ）法
で溶出した。０．５５と０．６５Ｍ ＴＥＡＢの所で溶
出して来た、ビオチニル−ｄＵＴＰ又はビオチニル−Ｕ
ＴＰを含む画分を、メタノールと再留水の存在下に回転
蒸発を行って脱塩した。時折やや白濁した溶液が得られ
た：或るＴＥＡＢ溶液中の夾雑物に由来する、この濁り
を０．４５ｍｍフィルタを通す濾過により除去した。長
期保存用には、ヌクレオチド類を、Ｄｏｗｅｘ ＴＭ５
０（Ｎａ＋型）の存在下に短時間攪拌することによりナ
トリウム塩に変換した。濾過後、ヌクレオチドを、３倍
量の冷エタノール添加で沈澱させ、エチルエーテルで洗
い、水酸化ナトリウムペレット上で減圧下乾燥し、−２
０℃で、デシケーターに貯蔵した。すぐに使用する場合
は、ヌクレオチド溶液をトリス−塩酸ｐＨ７．５中で２
０ｍＭとし、最終ヌクレオチド濃度を５ｍＭになるよう
調整した。貯蔵液は、−２０℃で凍結保存した。ビオ−
ｄＵＴＰとビオ−ＵＴＰ産物の元素分析結果は以下の通
りであった。ビオ−ｄＵＴＰ（Ｃ２２Ｈ３０Ｎ５Ｏ１８
Ｐ３Ｓ１Ｎａ４・１Ｈ２Ｏ）。理論値：Ｃ，２９．８
０；Ｈ，３．３８；Ｎ，７．８９；Ｐ，１０．４７；
Ｓ，３．６１。実測値；Ｃ，３０．１４；Ｈ，３．２
２；Ｎ，７．６３；Ｐ，１０．３１；Ｓ，３．７０。 ビオ−ＵＴＰ（Ｃ２２Ｈ３０Ｎ５Ｏ１９Ｐ３Ｓ１Ｎａ４
・３Ｈ２Ｏ）；理論値；Ｃ，２９．１５；Ｈ，３．１
９；Ｎ，７．４５；Ｐ，９．８９；Ｓ，３．４１。実測
値；Ｃ，２８．７６；Ｈ，３．３５；Ｎ，７．６８；
Ｐ，９．８１；Ｓ，３．３２。 ｐＨ７．５下のビオ−ｄＵＴＰ及びビオ−ＵＴＰのスペ
クトル特性〔λｍａｘ、２８９ｎｍ（ε＝７，１０
０）；λｍａｘ、２４０ｎｍ（ε＝１０，７００）；λ
ｍｉｎ、２６２ｎｍ（ε＝４，３００）〕はピリジン環
と共役した、環外二重結合の存在を反映している。これ
らヌクレオチド類は、ビオチン定量に使う方法（Ｄ．
Ｂ．ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ａｎｄ Ｊ．Ａ．Ｒｏｔｈ、
Ａｒａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３４、３２６、１９７
０）である、エタノール性硫酸中、ｐ−ジメチルアミノ
シンナムアルデヒドで処理すると、強い陽性反応（橙−
赤色）を示す。しかしながら、それらは出発物質ＡＡ−
ｄＵＴＰやＡＡ−ＵＴＰに特有の反応である、ニンヒド
リンとは、最早反応しない。
【００３９】実施例３及び４ ビオチニル−ＣＴＰ及びビオチニル−ｄＣＴＰの合成 ＣＴＰ及びｄＣＴＰを、特に実施例１に述べた如く、
ａ）水銀化し、ｂ）アリルアミンと反応させ、そして
ｃ）ＮＨＳ−ビオチンでビオチン化した。ＣＴＰ（５
６．３ｍｇ、０．１ｍ ｍｏｌｅ）又はｄＣＴＰ（５
９．１ｍｇ、０．１ｍｍｏｌｅ）を、２０ｍｌの０．１
Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０に溶解し、酢酸水銀
（０．１５９ｇｍ、０．５ｍ ｍｏｌｅｓ）を添加し
た。溶液を５０℃で４．５時間加熱し、次いで氷上で冷
却した。塩化リチウム（３９．２ｍｇ、０．９ｍ ｍｏ
ｌｅｓ）を加え、その溶液を酢酸エチルで６回抽出し
た。水層のヌクレオチド産物を三倍量の冷エタノールの
添加で沈澱させ、沈澱を遠沈により集めた。沈澱を無水
エタノール、エチルエーテルで洗滌し、次いで乾燥し
た。これら生成物は、それぞれＡＡ−ＣＴＰ及びＡＡ−
ｄＣＴＰの合成に更に精製することなしに使用した。水
銀化ヌクレオチド類を、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ５．０に溶かし、濃度を１０ｍＭ（２７５ｎｍで９
２ ＯＤ／ｍｌ）に調整した。０．６ｍｌ（１．２ｍ
ｍｏｌｅ）の２．０Ｍ酢酸アリルアミン貯蔵液（実施例
１に記載した如く調製）を、１０ｍｌのヌクレオチド溶
液（０．１ｍ ｍｏｌｅ）に加え、次いで１．０ｍｌの
水に溶かしたＫ２ＰｄＣｌ４（３２．６ｍｇ、０．１ｍ
ｍｏｌｅ）を添加した。２４時間室温放置後、溶液を
０．４５ｍＭメンブレンで濾過し、金属沈澱物を除い
た。濾液を５−倍稀釈し、前もって５０ｍＭ ＴＥＡＢ
ｐＨ７．５で平衡化した、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ａ−２５の５０ｍｌカラムに充てんした。ヌクレオチ
ド産物を、ＴＥＡＢ ｐＨ７．５の５００ｍｌ直線勾配
（０．０５−０．６Ｍ）法で分画した。目的の産物は、
０．２８と０．３８Ｍ間の塩濃度で溶出する主要紫外部
吸収部分に含まれていた。プールした試料を回転蒸発で
脱塩、０．５Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ４．２
に溶かし、最終的精製を、０．５Ｍ酢酸トリエチルアン
モニウムを溶出液として、Ｐａｒｔｉｓｉｌ ＯＤＳ−
２のカラムを用いたＨＰＬＣクロマトグラフィーで行っ
た。適当な画分をプールし、凍結乾燥し、そして生成物
をＨ２Ｏに溶解した。ヌクレオチド類を、Ｄｏｗｅｘ
ＴＭ５０（Ｎａ＋型）の存在下で短時間攪拌し、Ｎａ＋
塩に変換した。濾過してＤｏｗｅｘ樹脂を除去後、ヌク
レオチド類を３倍量の冷エタノールを加えて沈澱させ
た。沈澱をエーテルで洗い、次いで風乾した。分析結
果：ＡＡ−ｄＣＴＰ（Ｃ１２Ｈ１７Ｎ４Ｏ１３Ｐ３Ｎａ
４・２Ｈ２Ｏ）：理論値、Ｃ，２２．２９；Ｈ，２．６
３；Ｎ，８．６７；Ｐ，１４．４０。実測値Ｃ，２２．
１６；Ｈ，２．８９；Ｎ，８．７７；Ｐ，１４．１８。 ＡＡ−ＣＴＰ（Ｃ１２Ｈ１７Ｎ４Ｏ１４Ｎａ４・２Ｈ２
Ｏ）：理論値Ｃ，２１．７５；Ｈ，２．５７；Ｎ，８．
４６；Ｐ，１４．０１。実測値，Ｃ，２２．０３；Ｈ，
２．４７；Ｎ，８．６９；Ｐ，１３．８１；０．１Ｍホ
ウ酸緩衝液ｐＨ８．０中でのスペクトル特性、λｍａｘ
３０１ｎｍ（ε＝６，４００）、λｍｉｎ２７１ｎｍ
（ε＝３，９５０）、λｍａｘ２５０ｎｍ（ε＝９，７
００）。ＡＡ−ｄＣＴＵとＡＡ−ＣＴＰは両者共ニンヒ
ドリン試験陽性だった。 ＡＡ−ＣＴＰ（６．６ｍｇ、０．０１ｍ ｍｏｌｅ）又
はＡＡ−ｄＣＴＰ（６．４ｍｇ、０．０１ｍ ｍｏｌ
ｅ）を５ｍｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
８．５に溶かし、０．２ｍｌのジメチルフォルムアミド
に溶かした。ＮＨＳ−ピオチン（３．４ｍｇ、０．０１
ｍ ｍｏｌｅ）を加えた。４時間室温放置後、試料を、
ＴＥＡＢ ｐＨ７．５を溶出液とした１５０ｍｌ直線勾
配（０．１−０．９Ｍ）法を用いて、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘ Ａ−２５の１０ｍｌカラムでクロマトグラ
フを行った。０．５０と０．６０Ｍ ＴＥＡＢ間に溶出
して来たビオチニル−ＣＴＰ又はビオチニル−ｄＣＴＰ
を含む画分を、回転蒸発で脱塩し、そして０．０２Ｍト
リス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５中に、最終濃度が５ｍＭに
なる様に調整した後、−２０℃で凍結した。生成物は、
エタノール性硫酸中でｐ−ジメチルアミノシンナムアル
デヒドを用いたビオチン検出反応に強い陽性を示した
が、ニンヒドリンを噴霧した際の第１級アミン試験には
陰性を示した。この生産物のより詳細な構造上の特性に
つき目下検討中である。
【００４０】実施例５及び６ イミノビオチニル−ＵＴＰとイミノビオチニル−ｄＵＴ
Ｐの合成 イミノビオチンを既報の通り（Ｋ．Ｈｏｆｍａｎｎ、
Ｄ．Ｂ．Ｍｅｌｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｖ．ｄｕ Ｖｉｇ
ｎｅａｕｄ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１４１２０７
−２１１、１９４１；Ｋ．Ｈｏｆｍａｎｎ ａｎｄ
Ａ．Ｅ．Ａｘｅｌｒｏｄ、Ｉｂｉｄ．、１８７、２９−
３３、１９５０）ビオチンから調製した。イミノビオチ
ンのＮ−ヒドロキシサクシニミド（ＮＨＳ）エステル
を、ＮＨＳ−ビオチンの合成法に関する既報（Ｈ．Ｈｅ
ｉｔｚｍａｎｎ ａｎｄ Ｆ．Ｍ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７１、
５５３７、１９７４）のプロトコールを用いて調製し
た。実施例１（ｂ部分）に詳細を述べた方法で調製し
た、ＡＡ−ＵＴＰ（７．０ｍｇ、０．０１ｍ ｍｏｌ
ｅ）又はＡＡ−ｄＵＴＰ（６．３ｍｇ、０．０１ｍ ｍ
ｏｌｅ）を、５ｍｌのホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．
５に溶解し、ジメチルフォルムアミド０．５ｍｌに溶か
したＮＨＳ−イミノビオチン（３．５ｍｇ、０．０１ｍ
ｍｏｌｅ）を加えた。反応混液を１２時間室温に放置
し、次いで前もって０．０５Ｍ ＴＥＡＢ ｐＨ７．５
で平衡化しておいた、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ
−２５の１０ｍｌカラムに直接充てんした。カラムをＴ
ＥＡＢの１５０ｍｌ直線勾配法（０．０５−０．６Ｍ）
により溶出した。ＴＥＡＢ０．３５と０．４０Ｍの間で
溶出して来た、イミノビオチン−ＵＴＰ又はイミノビオ
チン−ｄＵＴＰを、メタノールの存在下で回転蒸発によ
り脱塩し、Ｈ２Ｏに溶解した。生産物は、ニンヒドリン
試験で弱い陽性を示す結果から判断して、少量のアリル
アミン−ヌクレオチド付加物を不純物として含んでい
た。最終的精製は、アビデイン−セファロースの親和
（アフィニティ）クロマトグラフィーにより行った。ホ
ウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．５中、０．１Ｍにした、
不純物を含む画分をアヴィディン−セファロースの５ｍ
ｌカラムにかけ、２５ｍｌの同緩衝液で洗滌した。次い
でカラムを５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ４．０
で洗滌し、目的のイミノビオチン−ヌクレオチド産物
を、鋭いピークとして溶出した。ヌクレオチドを３倍量
の冷エタノール添加で沈澱させ、エチルエーテルで洗
い、水酸化ナトリウムペレット上で減圧下に乾燥し、−
２０℃でデシケーターに保存した。生産物を元素分析、
スペクトル及びクロマトグラフよりの性質より、特性化
した。
【００４１】実施例７及び８ ＮＡＧＥ−ＵＴＰ及びＮＡＧＥ−ｄＵＴＰの合成 アリル（３−アミノ−２−ヒドロキシ−）プロピルエテ
ール、ＮＡＧＥと略記、をアリルグリシディルエーテル
（Ａｇｅ）（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ
より入手）から調製した。１０ｍｌのＡｇｅ（８４ｍ
ｍｏｌｅ）を９Ｍ水酸化アンモニウムに徐徐に添加（ド
ラフト中で）し、混合液を、６時間、室温に放置した。
余剰アンモニアを減圧下回転蒸発で除去し、粘ちょうな
黄色油状物質を得た。この生産物を陽子核磁気共鳴で分
析した結果、目的の構造を有することが示された。５−
水銀−ｄＵＴＰ（０．１ｍ ｍｏｌｅ）又は５−水銀−
ＵＴＰ（０．２ｍｍｏｌｅ）を２−４ｍｌの０．２Ｍ酢
酸ナトリウム緩衝液に溶かし、使用前酢酸で、ｐＨ５．
０に調整した、１６倍モル濃度過剰のＮＡＧＥを添加し
た。最終的な反応液量（４．３及び８．４ｍｌ）中のヌ
クレオチド濃度はそれぞれ、４３及び４２ｍＭであっ
た。１当量のＫ２ＰｄＣｌ４（０．１又は０．２ｍ ｍ
ｏｌｅｓ）を、反応を開始するために添加した。１８時
間室温放置後、反応混液を０．４５μｍＭメンブレンを
通して濾過し、試料を５倍稀釈し、酢酸ナトリウムの直
線勾配法（０．１−０．６Ｍ）を用いて、ＤＥＡＥ−Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５のカラムでクロマトグラフィ
ーを行った。ＵＶスペクトル及びＰａｒｔｉｓｉｌ Ｏ
ＤＳ−２での特徴的なＨＰＬＣ溶出像（プロフィール）
から判定した、目的生産物を含む画分をプールし、稀釈
し、ｐＨ８．５のアンモニウムビカーボネートの皮相
（シャロー）勾配（０．１−０．５Ｍ）を用いたＤＥＡ
Ｅ−Ｓｅｐｈａｄｅｘでの再クロマトグラフィーによ
り、更に精製した。この条件下でＮＡＧＥ−ｄＵＴＰ
（又はＮＡＧＥ−ＵＴＰ）の大部分を、残りの不純物か
らきれいに分離出来た。陽子核磁気共鳴スペクトルを、
この精製段階でヌクレオチドを凍結乾燥し、Ｄ２Ｏに再
溶解後、得た。元素分析のため、生産物を相当するナト
リウム塩型に変換した。 典型的分析結果：Ｎａｇｅ−ｄＵＴＰ（Ｃ１５Ｈ２２Ｎ
３Ｏ１６Ｐ３Ｎａ４・２Ｈ２Ｏ）、理論値，Ｃ，２４．
９９；Ｈ，３．６３；Ｎ，５．８３；Ｐ，１２．８８：
実測値，Ｃ，２５．３９；Ｈ，３．７１；Ｎ，５．６
３；Ｐ，１２．８８。
【００４２】実施例９ 標識ＤＮＡ配列の利用 Ｉ 核型分析 （ａ） 人間遺伝子ライブラリーから、約１００から２
００のクローンを選択する。それらを前述の如く標識
し、各クローンには、そのハイブリダイゼーション部位
を視覚的に、或いは低光レベルのヴィディオ系で位置決
めをする。特異的配列遺伝子に相当するクローンでは、
これが特定の人間染色体上のクローン化ＤＮＡの位置を
決定する。各染色体につき幾つかのクローンを得る。そ
れぞれ標識したクローンを特定の染色体の同定に使用出
来る。これらを又共同して、４６染色体のそれぞれを、
２２常染色体ペアの１つか又はＸかＹかを同定するのに
使用出来る。標識した一組のクローンを染色体と交配
（ハイブリダイズ）させ、次いで標識に蛍光着色を施す
ことにより、そのクローンセットとその位置を視覚化で
き、特定の色と蛍光を発するようになる。次いで、標識
クローンの第二のセットを使って、第二の蛍光染料を反
応させることが出来る。同じ工程を何回も繰返すことが
できる。この様にしても、もし希望すれば、染色体のそ
れぞれの上の異った、しかし特定の位置の細胞ＤＮＡに
幾組もの蛍光標識を付けることが出来る。これらの標識
を、視覚的、或いはコンピュータ化した自動核型分析に
利用出来る。 （ｂ） 自動核型分析には核染色体上の標識部位の数に
相当するスポットのセットを見出すことにより、４６染
色体のそれぞれの、おおよその位置を同定する目的で、
或るセットのクローンを利用出来る。この様にして、も
し染色体が適当に広がって、さらに解析可能なら、ディ
ジタル化した像のコンピューター解析により、決定する
ことが出来る。もし染色体が適度に広がっていれば、次
いでコンピューター解析を使って、各染色体上の標識し
たスポットの位置ぎめと、配置により、個個の染色体の
それぞれを同定出来る。蛍光スポットを各染色体の特定
の位置に付けることが出来る事実を利用して、その様な
標識のない場合に比し極めて効果的に、手動又は自動核
型分析を行うことが出来る。ＩＩ． 遺伝的疾患の診断 特定の染色体、例えば第２３番目、に特異的に結合する
クローンを選択することにより、例え染色体が中期（メ
タフェース）に濃縮されていなくても、細胞中の特定の
染色体のコピー数を、数えることが出来る。この様に、
胎児細胞を、トリソミ−２１の出生前診断用に取得すれ
ば、万一染色体が中期に濃縮されていなくても診断出来
る。もし必要なら、二組の標識を利用出来る−１つは染
色体２３に特異的で他はその外の、ある染色体というよ
うに。多分、色の違う、二つの標識の比を各細胞で測定
することにより、異常な数の染色体第２３番を示す細胞
を同定出来る。この方法を低光レベルヴィデオ系を用い
たスライド上でも、又はレーザー励起を利用した流動血
球計算器にも利用出来る。如何なる異常染色体数の決定
にも利用出来る。ＩＩＩ． 微生物検出及び同定 上述の如く、ＤＮＡの特定の配列を標識することにより
各細菌の同定と計数が可能である。特定のＤＮＡ切片が
ハイブリダイゼーションする個々の細菌を同定するに
は、感度が単一の標識構造を検出できるほどでなければ
ならない。このことは低光レルビデオ系と像のコンピュ
ーター集計、又は光像を増強する何らかの他の装置を使
って行うことができる。流動系も又、もし感度を充分大
きく出来れば利用可能である。もし細菌をスライド上に
固定すれば、それらの位置を定め、その様な蛍光スポッ
トの計数が出来る。このことから用いた特定のクローン
とハイブリダイズ出来るＤＮＡを含む細菌の計数が可能
である。もしクローンを特定の細菌株に特異的なものと
して選定すれば、その菌株数を数えることが出来る。更
に特定の遺伝子が同定されている様な抗生物質耐性菌株
の性質を、抗生物質耐性遺伝子に含まれているＤＮＡ配
列を、プローブとして使い、同様の方法で特性づけるこ
とができる。更に、１つか又は多くの耐性遺伝子を含ん
でいる耐性プラスミドで、どれが特異的な耐性遺伝子か
を調らべるのにプローブを利用出来る。個々の細菌に加
えて、もしそれらが小さいスポットとして局在し、その
スポット中でハイブリダイズしたＤＮＡに特異的な全蛍
光体を測定出来れば特定菌株の細菌細胞群を検出し菌数
の概算も可能である。
【００４３】このようにして、特定のＤＮＡ配列を含む
微生物の数を細菌の混合物中で測定可能である。上述で
確認したＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
ＡのＬａｎｇｅｒ等の論文のビオチン−ポリヌクレオチ
ドの利用に関する背景として、“Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ
多糸性染色体上の遺伝子マッピングのための免疫学的方
法”の題でＧｅｎｅｔｉｃｓに発表のあるＰ．Ｒ．Ｌａ
ｎｇｅｒ−Ｓａｆｅｒ、Ｍ．Ｌｅｖｉｎｅ及びＤ．Ｃ．
Ｗａｒｄによる報告は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ多糸性染
色体にその場でハイブリダイズしたＤＮＡ配列の位置決
定にビオチン化したヌクレオチドをプローブとして利用
する方法を記載している。この応用例では、これらのプ
ローブを、アフィニティクロマトグラフィーで精製した
うさぎの抗ビオチン抗体を一次の抗体として、又蛍光化
したひつじの抗うさぎ抗体を二次抗体として用いて、検
出している。このＬａｎｇｅｒ−Ｓａｆｅｒ等のＧｅｎ
ｅｔｉｃｓの文献発表もまた、この公告に含まれ、一部
分を成している。アビジン又は酵素標識したアビジン試
薬と共にビオチン標識試薬を用いる、他の技法が、液体
培地中で、配位子（リーガンド）の検出及び決定法とし
て知られている。米国特許４，２２８，２３７参照。
又、アビジン−ビオチン相互作用に基づき遺伝子濃縮
（エンリッチメント）を行うことが、特にＤｒｏｓｏｐ
ｈｉｌａ（しょうじょうばえ）のリボゾームＲＮＡ遺伝
子に応用されている様に、知られている。Ｊ．Ｍａｎｎ
ｉｎｇ、Ｍ．Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ及びＮ．Ｄａｖｉｄ
ｓｏｎのＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．１６、Ｎ
ｏ．７、１３６４−１３６９頁（１９７７）の発表文献
参照。本発明の実施に関連した背景として重要な他の文
献は、Ｄ．Ｊ．ＥｃＫｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｒ．Ｈ．
Ｓｙｍｏｎｓの論文で、題は「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｔ
ｔｈｅ ｓｉｔｅ ｏｆ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏ
ｆ ａｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ−Ｌａｂｅｌ Ｄｅｒｉｖ
ａｔｉｖｅ ｏｆ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｍ ｏｎ２３−Ｓ
Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ」、Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ ８２、２２５−２３４（１９７８）；Ｓ．
Ｂ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ、Ｓ．Ｒ．Ｋｏｒｎｂｅｒｇ
ａｎｄＡ．Ｋｏｒｎｂｅｒｇの論文で、題は「Ｇｌｕｃ
ｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄ−ＩＩ−Ｇｌｕｃｏｓｙｌ Ｔｒａｎ
ｓｆｅｒａｓｅｓ ｆｒｏｍ Ｔ２− ａｎｄ Ｔ６−
ＩｎｆｅｃｔｅｄＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ．２３７、Ｎｏ．２、２月
号、１９６２、並びにＪ．Ｊｏｓｓｅ ａｎｄ Ａ．Ｋ
ｏｒｎｂｅｒｇの論文で「ＩＩＩ、α−ａｎｄ β−Ｇ
ｌｕｃｏｓｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ｆｒｏｍ
Ｔ４−ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ」、これもＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ．２３７、Ｎ
ｏ．６、６月号、１９６２に出たものである。本発明と
関連し更に重要なものは、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、
ｖｏｌ、２３６、Ｎｏ．５、５月号１９６１、１４８７
−１４９３頁に出た発表文献、同じ雑誌のｖｏｌ、２３
７、Ｎｏ．４、１２５１−１２５９頁（１９６２）、同
じ雑誌のｖｏｌ、２３９、Ｎｏ．９、２９５７−２９６
３頁（１９６４）である。特に重要なのはＪｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃ
ｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ、２７、Ｎｏ．８
１１３１−１１３９頁（１９７９）並びにＮｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ、５、Ｎ
ｏ．９、１９７７、２９６１−２９７３頁に出た論文で
ある。同じく重要なものは、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｌ
ｅｔ ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａにＡ Ｄｅ Ｗａ
ａｒｄにより発表された「ＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙＤｉ
ｆｆｅｒｅｎｃｅ Ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ Ｈｙｄｒ
ｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｆｏｓｉｎｅ β−Ｇｌｕｃｏ
ｓｙｌ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ Ｉｎｄｕｃｅｄ
ｂｙ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ Ｔ２、Ｔ４ ａ
ｎｄ Ｔ６」と題する論文の２８６−３０４頁、そして
又、Ｔ．Ｗ．Ｎｏｒｔｈ ａｎｄＣ．Ｋ．Ｍａｔｈｅｗ
ｓによる、「Ｔ４ Ｐｈａｇｅ−Ｃｏｄｅｄ Ｄｅｏｘ
ｙｃｙｔｉｄｙｌａｔｅ Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ
ａｓｅ：Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｕｄ
ｉｅｓ ｉｎ Ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔ
ｅｒａｃｔｉｏｎｓ」と題する、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓより出版された論文、１９７７、８９８−９０
４頁、そしてＥ．Ａ．Ｂａｙｅｒ ａｎｄＭ．Ｗｉｌｃ
ｈｅｋによる「Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｖｉｄｉｎ−
Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ ａｓ ａ Ｔｏｏｌ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」と題する
論文でＭｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ａｎａｌｙｓｉｓ、ｖｏｌ、２６、１−４５頁（１９
８０）に発表されたものである。本発明の実施に有用な
他の技術としては、ＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ
のニックトランスレーションを含む。ニックトランスレ
ーションを実施する技法はＰ．Ｗ．Ｒｉｇｂｙ、Ｍ．Ｄ
ｉｅｃｋｍａｎｎ、Ｃ．Ｒｈｏｄｅｓ及びＰ．Ｂｏｒｇ
による「Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｔｏ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｃｉｆｉ
ｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏｂｙ Ｎｉｃ
ｋ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＤＮＡ Ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅ」と題する、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
（１９７７）、１１３、２３７−２５１に発表されてい
る。ストレプトアビジンの回収、例えばＳｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉの培養液からの回収に関
しては、Ｋ．Ｈｏｆｍａｎｎ、Ｓ．Ｗ．Ｗｏｏｄ、Ｃ．
Ｃ．Ｂｒｉｎｔｏｎ、Ｊ．Ａ．Ｍｏｎｉｂｅｌｌｅｒ
ａｎｄ Ｆ．Ｍ．Ｆｉｎｎによる「Ｉｍｉｎｏｂｉｏｔ
ｉｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｏｌｕｍｎｓａｎｄ ｔｈ
ｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｒｅｔｒｉｅ
ｖａｌ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ」と題する、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、ｖｏ
ｌ ７７、Ｎｏ．８、４６６６−４６６８頁（１９８
０）の論文に、ストレプトアビジン−含有物質、例えば
培養液、からストレプトアビジンを回収するための適当
な研究方法が発表されている。ストレプトアビジンは本
発明の実施例の或るものに試薬として有用である。前述
の発表文献類は本発明に取入れられており、その一部を
成している。
【００４４】
【発明の概要】本発明の実施に伴い、ヌクレオチド、例
えば、ピリミジンの５位、又はプリンの７位、を修飾
し、これはＤＮＡ又は他の核酸材料へ付加、又は取り込
ませるのに適したヌクレオチドプローブを調製する予備
段階である。本発明の実施にあたり、ヌクレオチド、即
ち核酸を、好ましくは、非解裂的方法で修飾し、出来た
修飾ヌクレオチドが核酸に取込まれ、一旦、核酸に取込
まれた後では、修飾ヌクレオチドがこの修飾ヌクレオチ
ドを含む核酸の二重らせん構造の形成又は安定化に著し
い妨げにならないようにする。ヌクレオチドの非解裂的
修飾及びその様な修飾ヌクレオチドを取り込んだ核酸を
作ることは、解裂的修飾として特性づけされるヌクレオ
チドの修飾方法とは対照的である。解裂的に修飾したヌ
クレオチドとそれを含む核酸は適当な二重らせん形成を
阻害する。本発明の実施にあたっては、ヌクレオチド類
を、ピリミジンの５位、又はプリンの７位を修飾するの
が望ましい。そのように修飾されたヌクレオチド類は、
非解裂的に修飾を受けていて、その様なヌクレオチドを
含む核酸は二重らせん配列を形成出来る。本発明の広
く、他の実施分野として、種々の方法を、非解裂的方法
でＤＮＡのタッグ付け又は標識化に利用出来る。例え
ば、ビオチンを、ＤＮＡ又はＲＮＡの末端に付加する。
ビオチンの付加はリボヌクレオチドの付加で行う。
３′，４′ビシナル水酸基を過沃素酸酸化で酸化し、次
いで、ビオチンヒドラジドの存在下で、水素化ホウ素で
還元する。他の可能性として、カルボジイミドも、又ビ
オチンをアルデヒド基と結合するために利用する。ＤＮ
ＡやＲＮＡの様な核酸材料にタッグ付けをする他の技術
としては、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子の末端に大きなマーカ
ーを付加する方法がある。この技術の一例としてアミノ
基にビオチンのタグを付けた、リシルグリシンの様な分
子の付加がある。他の例は上述の方法に従うが、カルボ
ジイミドを橋架結合剤として使用することである。更に
この技術を使う他の例としては、ビオチン化したｄＡ：
ｄＵ二重らせんポリマーを作り、本発明に従って、この
ポリマーをプローブに結合させることを挙げられる。
【００４５】非解裂的方法でＤＮＡにタグを付ける他の
技術としては、ＰＳ１６又はファージ感染細胞から、５
位にプトリシン又はスペルミジンを持ったｄＰｙｒＴＰ
を分離することを挙げられる。望むならば、ｄＰｙｒＴ
ＰをファージＤＮＡより調製し、ｄＰｙｒＴＰにリン酸
化し、通常の求核性試薬ＮＨＳ−ビオチンで、ポリアミ
ン側鎖の修飾をする。
【００４６】非解裂的方法でＤＮＡにタグを付ける他の
技術としては、Ｔ４ファージグリコシル化酵素を用いて
ＤＮＡ中の５−ヒドロキシ−メチルシトシン（５ＨＭ
Ｃ）にグルコースを付加し、レクチンに基づいた分析で
スクリーニングすることがある。更に、非解裂的方法で
ＤＮＡにタグを付ける他の技術としては、Ｔ４−ＤＮＡ
の加水分解後５ＨＭＣＭＰを５ＨＭＣＴＰにリン酸化し
て調製した５−ＨＭＣ−３リン酸を用いることがある。
次いで５ＨＭＣＴＰをポリメラーゼ１を利用してＤＮＡ
中に取り込ませる。この様にして、如何なるＤＮＡで
も、５ＨＭＣをその中に、非解裂的に取込んだ形に修飾
出来る。温和に解裂的方法でＤＮＡにタグを付ける方法
としては、二重らせん形の中の核酸を、例えばベンゾピ
レンジオールエポキシド又はアフラトキシンの様なアル
キル化剤と反応させる事をあげられる。適当な条件下
で、グアニンのＮ２基、アデニンのＮ４基、又はシトシ
ンのＮ４基をアルキル化する。これら修飾ヌクレオチド
類を、抗体で直接検出出来るし、又、ビオチンの如きレ
ポーター分子を付加する結合腕として利用出来る。
【００４７】以下の実施例は、本発明実施に係る種種の
具体化した例をあげたものである。
【実施例】実施例Ｉ ビオチニル−Ｎ−ヒドロキシサクシニドエステル（ＢＮ
ＨＳ）をＢｅｃｋｅｒ等Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．６８ ２６
０４（１９７１）の方法に従って調製した。ビオチン
（０．２４ｇ、１．０ｍ ｍｏｌ）を脱水ジメチルホル
ムアミド５ｍｌに溶かした。ジシクロヘキシルカルボジ
イミド（０．２１ｇ、１．０ｍ ｍｏｌ）とＮ−ヒドロ
キシサクシニミド（０．１２ｇ、１．０ｍ ｍｏｌ）を
加え、溶液を１５時間室温で攪拌した。得られる沈澱を
濾過後、濾液を減圧下で蒸発し、残渣をエタノールで二
回洗浄し熱イソプロピルアルコールから回収し融点２１
６−２１８℃の白色結晶製品を得た。実施例ＩＩ ビオチニル−１，６−シアミノヘキサンアミドを以下の
如く調製した。１，６−ジアミノヘキサン（３２０ｍ
ｇ、２．０ｍ ｍｏｌ）溶液を５０ｍｌの水に溶かした
ものを、二酸化炭素の添加でｐＨ８．５に調整した。１
０ｍｌのジメチルフォルムアミドに溶かした、ビオチニ
ル−Ｎ−ヒドロキシ−サクシニミドエステル（１００ｍ
ｇ、０．２９ｍ ｍｏｌ）を加えた。室温で１８時間放
置後、混合液を蒸発し、残渣をエーテルで洗い、次いで
デシケーター中で乾燥した。
【００４８】実施例ＩＩＩ ポリビオチン化したポリ−Ｌ−リジンを次の方法で調製
した。２ｍｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．５
に溶かしたポリリジン（１００μ ｍｏｌリジン）を、
０．５ｍｌのジメチルフォルムアミドに溶かしたビオチ
ニル−Ｎ−ヒドロキシサクシミドエステル（１７．５ｍ
ｇ、５０μ ｍｏｌ）に加えた。室温で１８時間攪拌
後、混合液を１０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．５に対し
透析を行った。
【００４９】実施例ＩＶ オリゴデオキシリボヌクレオチド類を、下記の如く、シ
チジン−５′−３リン酸及び末端トランスフェラーゼを
用いて末端標識した。０．２Ｎ水酸化ナトリウムでアル
カリ切断し、カコデイル酸カリウム（０．１Ｍ）、トリ
ス塩基（ベース）（２５ｍｍ）、塩化コバルト（１ｍ
Ｍ）及びジチオスレイトール（０．２Ｍ）中で２Ａ
２６０ユニット／ｍｌに稀釈した、精製ファージＤＮＡ
を用いた。このＤＮＡ溶液に対し、シチジン−５′−３
リン酸（１０ｍ ｍｏｌ）及び末端トランスフェラーゼ
（２００ユニット）を加えた。３７°で５〜８時間イン
キュベート（温置）後、中和したフェノール（１００μ
ｌ）。０．５Ｍ ＥＤＴＡ（１００μｌ）及び１％ドデ
シル硫酸ナトリウムを添加して反応を停止した。ＤＮＡ
をエタノール沈澱後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００を
通すゲル濾過クロマトグラフィーで精製した。実施例Ｖ ビオチンとポリビオチン化したポリ−Ｌ−リジンをＨａ
ｌｌｏｒａｎ ａｎｄＰａｒｋｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．、９６ ３７３（１９６６）記載のカルボジミドカ
ップリング法を用いて結合しオリゴリボヌクレオチドに
した。一例として、０．１Ｎ水酸化ナトリウムで切断し
たトリス緩衝液ｐＨ８．２中のＤＮＡ（１μｇ／ｍｌ、
１ｍｌ）を１０分間煮沸してた後、氷浴中で急冷して変
性した。ビオチニル−１，６−ジアミノヘキサンアミド
（２ｍｇ、６μ ｍｏｌ）又はポリビオチン化したポリ
−Ｌ−リジン（２ｍｇ）と１−エチル−３−ジイソプロ
ピルアミノカルボイミド塩酸（１０ｍｇ、６４μ ｍｏ
ｌ）を添加し、ｐＨを、８．２に再調整した。室温、暗
所で２４時間放置後、混合物を生理食塩水を基にして調
製した１０ｍＭトリス緩衝液に対して透析した。ＤＮＡ
をエタノールで沈澱した。
【００５０】実施例ＶＩ チトクロームＣに結合したビオチンを次の方法で調製し
た。０．１Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．５、１ｍｌ中
に、チトクロームＣ（１０ｍｇ）溶けた溶液に、１ｍｌ
ジメチルフォルムアミドに溶かしたビオチニル−Ｎ−ヒ
ドロキシサクシニミドエステル（１０ｍｇ、２９μ ｍ
ｏｌ）を添加した。室温で４時間放置後、ビオチン化し
たたん白をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラムを通すゲ
ル濾過クロマトグラフィーで精製した。実施例ＶＩＩ チトクロームＣ−ビオチンとポリビオチン化ポリ−Ｌ−
リジンをフォルムアルデヒドカップリング法で結合して
オリゴデオキシリボヌクレオチドを作る事をＭａｎｎｉ
ｎｇ等がＣｈｒｏｍｏｓｏｍａ、５３、１０７（１９７
５）に記載したと同様の方法を用いて行なった。精製Ｄ
ＮＡ（１０ｍＭトリエタノールアミン、ｐＨ７．８中で
１００μｇ／ｍｌ）の水酸化ナトリウム切断により調製
したオリゴデオキシリボヌクレオチド断片（フラグメン
ト）を、１０分間煮沸後氷中で急冷により変性した。チ
トクロームＣビオチン０．０５ｇ ｍｌ又は１ｍｌの１
０ｍＭトリエタノールアミンｐＨ７．８に溶かした３ｍ
ｇのポリビオチン化：ポリ−Ｌ−リジン溶液（０．０５
ｍｌ）を、１０ｍＭトリエタノールアミン、ｐＨ７．８
中で６％ホルムアルデヒド溶液の０．１ｍｌと共に、１
ｍｌの変性オリゴデオキシリボヌクレオチド溶液に加え
た。４０°で３０分間攪拌後、混合液を同じ緩衝液に対
して透析した。オリゴデオキシリボヌクレオチド−ビオ
チン複合体を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００のゲル濾
過クロマトグラフィーで最後の精製を行い、次いでエタ
ノールより沈澱させた。
【００５１】実施例ＶＩＩＩ 二重鎖ポリデオキシアデニン酸：ポリビオチン化デオキ
シウリジン酸を以下の如く合成した。トリス−塩酸ｐＨ
８．０（７０ｍＭ）；塩化マグネシウム（１．０ｍＭ）
及びジチオスレイトール（１０ｍＭ）を含む、２００μ
ｌエキソヌクレアーゼＩＩＩ緩衝液に溶解した、３００
塩基対の長さの、二重鎖オリゴヌクレオチドポリデオキ
シアデニン酸：ポリチミジル酸（２０μｇ）を、１００
単位のエキソヌクレアーゼＩＩＩと、２０分間、２０℃
でインキュベートした。一部分分解したオリゴヌクレオ
チドを、フェノールで直ちに抽出し、ＤＮＡを７０％水
性エタノールで沈澱した。部分分解したオリゴヌクレオ
チドを、２０μｌの５ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．６に再
溶解し、２′−デオキシ−アデノシン−５′−３リン酸
（１５μＭ）チミジン−５′−３リン酸（置換度を決定
する量）及びビオチン化５−（３−アミノ−１−プロペ
ン）２′−デオキシウリジン−５′−３リン酸（５μ
Ｍ）、０．１ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８．０に０．２
単位１μｌの濃度になるように調整したＫｌｅｎｏｗ
ＤＮＡポリメラーゼＩ（２００単位）を含む反応液中で
２０℃２時間インキュベートした。ビオチン化ポリｄ
Ａ：ポリｄＴ、ビオチニルｄＵをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ
−１００のゲル濾過クロマトグラフィーで精製した。Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱し、酢酸ナトリウムｐＨ４．６
（３０ｍＭ）、塩化ナトリウム（５０ｍＭ）、硫酸亜鉛
（１ｍＭ）及びグリセロール（５％）を含む、２０μｌ
の溶液に再溶解した。Ｓ１ヌクレアーゼ（２００単位）
を添加し、反応液を３７℃で１０分間インキュベートし
た。反応を、１ｍｌの酢酸アンモニウムと６ｍｌのエタ
ノールを加えて止めた。ＤＮＡをＧ−１００ゲル濾過ク
ロマトグラフィー及びエタノール沈澱で再精製した。実施例ＩＸ ポリｄＡ：ポリｄＴ、ビオチニルｄＵのオリゴデオキシ
リボヌクレオチドへの結合を次の様にして行った。アル
カリ切断した精製ＤＮＡ（実施例ＶＩＩＩで述べた如
く）のＤＮＡ切片をＳ１ヌクレアーゼで分解し、フェノ
ール抽出とエタノール沈澱で再精製した。切断末端（ｂ
ｌｕｎｄ ｅｎｄ）を持ったＤＮＡ切片（１μｇ）とポ
リｄＡ：ポリｄＴ、ビオチニルｄＵ（２μｇ）を、塩化
マグネシウム（６．６ｍＭ）、アデノシン３リン酸（２
４ｍＭ）及びジチオスレイトール（１．０ｍＭ）を含む
トリス−塩酸ｐＨ７．４（６６ｍＭ）緩衝液、６μｌに
溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（５０単位）を加え、全量
を水で２０μｌとした。反応液を３７℃で３時間インキ
ュベートした。ＤＮＡをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００
を通すゲル濾過クロマトグラフィー精製し、エタノール
で沈澱した。
【００５２】実施例Ｘ ５−ヒドロキシメチル−２′−デオキシシチブル酸を、
非グリコシル化ファージＴ４ＤＮＡの酵素的加水分解に
より調製した。１ｍｌの５０ｍＭトリスｐＨ７．４及び
１０ｍＭ塩化マグネシウムに溶解した、精製ファージＤ
ＮＡ（２ｍｇ）を、デオキシリボネクレアーゼＩと３７
°で２０時間インキュベートした。ｐＨを９．０に調整
し、塩化ナトリウム（２０ｍＭ）を加えた。蛇毒液フォ
スフォジエステラーゼ（０．５ｍｌの水に０．０５ｇ単
位を含む）を加え、３７°で５時間インキュベートを継
続した。更に０．０５単位のフォスフォジエステラーゼ
を添加し、インキュベーションを１８時間続けた。ヌク
レオチドをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０のゲル濾過クロ
マトグラフィーで分離した。５−ヒドロキシメチル−
２′−デオキシシチゲル酸を、逆相高速液体クロマトグ
ラフィーで精製した。実施例ＸＩ ５−（４−アミノブチルアミノメチル）−２′−デオキ
シウリジル酸を、ファージφＷ−１４由来ＤＮＡの酵素
加水分解で取得した。ファージを、Ｋｒｏｐｉｎｓｋｉ
ａｎｄ Ｗａｒｒｅｎ，Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６、８
５（１９７０）記載の方法に従ってＰｓｅｎｄｏｍｏｎ
ａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ ２９に生育させ、Ｋｒ
ｏｐｉｎｓｋｉ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２、１５１（１
９７３）の方法に従って、ファージＤＮＡを精製した。
ＤＮＡをデオキシリボヌクレアーゼＩ及び蛇毒液フォス
フォジエステラーゼで、他に（実施例Ｘ）記述の方法を
用いて、酵素的に加水分解した。５−（４一アミノブチ
ルアミノメチル）−２′−デオキシウリジル酸を逆相高
速液体クロマトグラフィーで精製した。実施例ＸＩＩ ビオチニル化−５−（４−アミノブチルアミノメチル）
−２′−デオキシ−ウリジル酸を以下の如く調整した：
１ｍｌのジメチルフォルムアミドに溶かした、ビオチニ
ル−ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（７０ｍｇ、
０．２ｍ ｍｏｌ）を２０ｍｌの０．１Ｍホウ酸ナトリ
ウムｐＨ８．５中の５−（４−アミノブチルアミノメチ
ル）−２′−デオキシウリジル酸に添加した。４時間
後、溶液を蒸発で０．５ｍｌまで濃縮し、ビオチニル化
ヌクレオチドを逆相高速液体クロマトグラフィーで精製
した。
【００５３】実施例ＸＩＩＩ Ｍｅｒｔｅｓ ａｎｄ Ｓｈｉｐｃｈａｎｄｌｅｒ、
Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ １、７５１
（１９７０）の方法に従って、５−フォルミル−２′−
デオキシウリジンを調製した。５−ヒドロキシメチルウ
ラシル（１ｍ ｍｏｌ）を２０ｍｌのジメチルスルフォ
ネートに溶かし、二酸化マンガンと共に１００℃で１５
分間加熱した。溶媒を減圧下で蒸発した。残渣熱エタノ
ールに取り、５−フォルミルウラシルをエタノールより
再結晶化した。５−フォルミルウラシル（０．１０ｇ）
をシリル化し、脱水アセトニトリル（２．５ｍｌ）、２
−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−Ｐ−トリイル−Ｄ−リボ
フラノシルクロリド（Ｂｈａｔ、Ｓｙｎ．Ｐｒｏｃ．ｉ
ｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍ．、Ｖｏｌ．
１、５２１頁（１９６８）（０．２２ｇ）と分子ふるい
（０．２ｇ）を加え、混合物を無水条件下、２５℃で４
０時間攪拌した。混合物を濾過し蒸発した。生成する油
状物質を、無水エタノール（２ｍｌ）で処理し、シリカ
ゲルのクロマトグラフィーを行うと部分的に純粋なアノ
マーが得られ、これをエタノールから再結晶化した（融
点１９５−１９６℃）。トルイル基を、生成物をメタノ
ールベンゼン中、メトキシドナトリウムと反応させるこ
とにより除去した。混合物をＤｏｗｅｘ ５０（Ｈ＋）
で中和した。５−フォルミル−２′−デオキシウリジン
を、エタノールから再結晶化した、融点１７５−１７６
℃。実施例ＸＩＶ ビオチンを以下の如く、５−フォルミル−２′−デオキ
シウリジンにカップルさせた。３００ｍｌの０．０５Ｍ
ホウ酸ナトリウムに溶解した５−フォルミル−２′−デ
オキシウリジン（０．３２０ｇ、１．０ｍ ｍｏｌ）
を、ビオチニル−１，６−ジアミノヘキサンアミド
（０．７４ｇ、２ｍ ｍｏｌ）に加えた。１時間攪拌
後、ボロヒドリドナトリウム（０．２ｇ、５ｍ ｍｏ
ｌ）を加え、攪拌を更に４時間継続し、次いで８ｍｌの
１Ｍギ酸を添加した。ビオチン化化合物を、逆相ＨＰＬ
Ｃでメタノール：０．５Ｍ酢酸トリエチルアンモニウ
ム、ｐＨ４．０を溶出液として精製した。
【００５４】実施例ＸＶ ビオチンを５−アミノ−２′−デオキシウリジンに以下
の如くカップルさせた。５−アミノ−２′−デオキシウ
リジン（０．２４ｇ、１ｍ ｍｏｌ）、ビオチン（０．
２５ｇ、１ｍ ｍｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボイ
ミド（０．２１ｇ、１ｍ ｍｏｌ）を脱水ジメチルフォ
ルムアミドに溶かし、一夜室温で攪拌した。濾過と溶媒
の蒸発後、残渣をエーテルで洗滌した。ビオチンのカッ
プルした生成物を水メタノール勾配法を用いて、逆相高
速液体クロマトグラフィーにより精製した。実施例ＸＶＩ ５−（オキシ）酢酸−２′−デオキシウリジンをＤｅｓ
ｃｈａｍｐｓ ａｎｄＤｅＣｌｅｒｑ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃ
ｈｅｍ．、２１、２２８（１９７８）の方法に従って調
整した。５−ヒドロキシ−２−デオキシウリジン（２８
２ｍｇ、１．１５ｍ ｍｏｌ）を、１．１６ｍｌ、１Ｎ
水酸化カリウムに溶かし、次いで１ｍｌの水中のヨード
酢酸（６０３ｍｇ、３．４ｍ ｍｏｌ）を加えた。室温
で４８時間反応後、１Ｎ塩酸（１．０６ｍｌ）を加え
た。この溶液を濃縮しエタノールを添加して生ずる沈澱
を濾過し、冷エタノールで洗い、熱エタノールから再結
晶化した。実施例ＸＶＩＩ ビオチニル−１，６−ジアミノヘキサンアミドを、以下
の様に、５−（オキシ）酢酸−２′−デオキシウリジン
にカップルした。ビオチニル−１，５−ジアミノヘキサ
ンアミド（０．７４ｇ、０．２ｍ ｍｏｌ）、５−（オ
キシ）酢酸−２′−デオキシウリジン（０．６０ｇ、
０．２ｍ ｍｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボイミド
（０．４１ｇ、０．２ｍ ｍｏｌ）を、５ｍｌの脱水ジ
メチルフォルムアミドに溶かし、室温で一夜放置した。
次いで反応液を濾過し、溶媒を蒸発により除去した。残
渣を０．１Ｎ塩酸とエーテルで洗滌した。ビオチン化し
たウリジン誘導体を、水−メタノール勾配法を用いて、
逆相高速液体クロマトグラフィーで精製した。
【００５５】実施例ＸＶＩＩＩ ５位置換ピリミジンヌクレオチド類のリン酸化は下記に
ビオチン化−５−（オキシ）酢酸−２′−デオキシウリ
ジン用に記述した一般法により行った。ヌクレオチド
（０．１６ｇ、０．５ｍ ｍｏｌ）を脱水ピリジンから
の蒸発を繰り返えして乾燥し、１０ｍｌの脱水ピリジン
に再溶解した。モノメトキシトリチルクロリド（０．３
０ｇ、０．８ｍ ｍｏｌ）を加え、混合物を室温暗所で
１８時間攪拌した。溶液をクロロホルム（２００ｍｌ）
で希釈し、０．１Ｎ重炭酸ナトリウムで抽出した。有機
溶媒層を脱水し、蒸発した。トリチル化ヌクレオシドを
脱水ピリジン（２０ｍｌ）に再溶解し、無水酢酸（０．
１ｍｌ、２０ｍ ｍｏｌ）と室温で反応させてアセチル
化した。混合液を４℃まで冷却しメタノール（４０ｍ
ｌ）を添加した。室温で１０時間攪拌後、反応液を蒸発
濃縮した。化合物を、クロロホルム（２０ｍｌ）中、１
％ベンゼンスルフォン酸に溶解して脱トリチル化を行っ
た。溶媒の蒸発後、ヌクレオシドを、２％メタノール：
クロロホルムを溶出溶媒系としたシリカゲルのクロマト
グラフィーで精製した。３′−アセチル化したヌクレオ
シドを脱水ピリジンの蒸発を繰り返えして乾燥した。亜
リン酸フォスフォクロリド（１００μｌ、１ｍ ｍｏ
ｌ）、（１−Ｈ）。１，２，４−トリアゾイック（１４
０ｍｇ、２．２ｍ ｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２
６０μｌ、２．０ｍ ｍｏｌ）の混合物を５ｍｌの無水
ジオキサン中で１０°−１５℃で３０分間、そして室温
で１時間攪拌した。これに３′−アセチル化ヌクレオシ
ドを加えて、混合物を室温で１時間攪拌後０℃まで冷却
した。水（５ｍｌ）を加え、反応液を室温で１８時間攪
拌した。塩化バリウム（１００ｍｇ、５ｍ ｍｏｌ）を
加え、ヌクレオチドのバリウム塩を濾過により集めた。
塩を水とエーテルで洗った。バリウム塩を、Ｄｏｗｅｘ
５０（Ｎａ＋型）と、１０ｍｌの水中で室温４時間攪
拌してナトリウム塩に変換した。２Ｎ水酸化ナトリウム
（２Ｎ、１０ｍｌ）を加え、反応液を室温で１５分間攪
拌し、次いで過剰のＤｏｗｅｘ ５０（Ｈ＋）型を加え
て中和した。脱アセチル化したヌクレオチドを蒸発によ
り濃縮し、逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製
した。
【００５６】実施例ＸＩＸ ５位置換ピリミジン３リン酸を、Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．９１、
１、（１９６４）の方法を用いて、相当する５′−モノ
リン酸塩から化学的に調製した。５−ヒドロキシメチル
−２′−デオキシシチジン−５′−３リン酸の実施例を
下記に示す。他のものは、同様にして調製した。５−ヒ
ドロキシル−２′−デオキシシチジル酸（遊離酸）
（０．６３ｇ、０．２ｍ ｍｏｌ）を、メタノールに懸
濁しトリ−ｎ−オクチルアンモニウムヒドロキシド
（０．７４ｇ、０．２ｍ ｍｏｌ）添加により、相当す
るトリ−ｎ−オクチルアンモニウム塩に変換した。懸濁
液を、清澄液になるまで還流し、溶媒を減圧下で除去す
る。塩を脱水ピリジンに溶解し、次いで脱水ピリジンよ
り数度蒸発することにより乾燥した。脱水ジメチルフォ
ルムアミド（０．１ｍｌ）及びジオキサン（１ｍｌ）に
溶かした塩に、ジフェニルフォスフォクロリデート
（０．１ｍｌ）とトリ−ｎ−ブチルアミン（０．２ｍ
ｌ）を添加した。室温で２５時間放置後、溶媒を除去
し、エーテルを加えて、ヌクレオシド−５′−ジフェニ
ルピロフォスフェートを沈澱させた。この沈澱をジオキ
サン（０．５ｍｌ）に溶かし、１ｍｌピリジン中のジ
（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロフォスフェート
（０．５ｍ ｍｏｌ）溶液を加えた。室温で４５分間放
置後、混合液を減圧下で少量になるまで濃縮した。粗生
成物を、エーテルで沈澱させた。沈澱を０．１Ｍリン酸
緩衝液ｐＨ８．０に溶かした。３リン酸塩を、重炭酸ト
リエチルアンモニウムｐＨ７．５の０．１から０．６Ｍ
への勾配溶出系を用いたＤＥＡＥセルロースのクロマト
グラフィーによって精製した。
【００５７】実施例ＸＸ ＤＮＡを、適当な３リン酸の存在下に、ニックトランス
レートを行うＤＮＡにより、５位置換ピリミジン３リン
酸で標識した。以下に示すのはビオチン化５−フォルミ
ル−２′−デオキシウリジンで、精製ＤＮＡを標識した
一例を述べたものである。ＤＮＡ（２０μｇ／ｍｌ）
を、塩化マグネシューム（５ｍＭ）、２′−デオキシ−
シチジン−５′−３リン酸（１５ｍＭ）、２′−デオキ
シアデノシン−５′−３リン酸（１５μＭ）、２′−デ
オキシグアノジン−５′−３リン酸（１５μＭ）ビオチ
ン化−５−フォルミル−２′−デオキシウリジン−５′
−３リン酸（２０μＭ）、活性化膵臓デオキシリボヌク
レアーゼＩ（１３ｍｇ／ｍｌ）、大腸菌ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ（４０単位／ｍｌ）及びトリス塩酸、ｐＨ７．４
（５０ｍＭ）の存在下に１４℃でインキュベートした。
２時間後に、０．３ＭＥＤＴＡ（０．０５ｍｌ）を添加
し、次いで６５°で５分間加熱することにより、反応を
停止した。標識したオリゴヌクレオチドをＳｅｐｈａｄ
ｅｘ Ｇ−１００のゲル濾過クロマトグラフィー並びに
冷エタノールからの沈澱により精製した。
【００５８】実施例ＸＸＩ グリコシル化ＤＮＡのコンカナバリンＡによる沈澱方法 反応混合液（１．０ｍｌ）を１．５ｍｌエッペンドルフ
管に、以下の如く調製した。 リン酸ナトリウムカリウム、ｐＨ６．５ １０ｍＭ ＮａＣｌ １５０ｍＭ ＭｇＳＯ４ ５ｍＭ ＣａＣｌ２ １ｍＭ ＤＮＡ（仔牛胸腺のＴ４） ５０μｇ コンカナバリンＡ（１０ｍｇ／ｍｌ） ５０−５００μｇ 反応を、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）の添加により
開始した。溶液を混合し、室温で６０分放置した。管を
１２００ｇで１５〜２０分間遠心した。上澄液を希釈
し、Ａ２６０を測定した。Ｃｏｎ Ａは２６０ナノメー
タに吸収を示すのでＤＮＡを欠くが、ＣｏｎＡを含む標
準液を調製した。完全反応混液の吸収値より、Ｃｏｎ
Ａの吸収値を引いた。この反応の結果を、添付の第１図
に示した。実施例ＸＸＩＩ グリコシル化ＤＮＡのコンカナバリンＡへの結合 ファージＴ４ＤＮＡ及びファージＤＮＡを、Ｒｉｇｂｙ
等の方法に従って、ニックトランスレーションで、Ｈ３
−デオキシアデノシン３リン酸をＤＮＡ中に取り込ませ
ることにより、標識した。Ｔ４ＤＮＡを比活性５×１０
５ｃｐｍ／ミクログラムで、平均二重鎖サイズ５キロベ
ースになるように、ニックトランスレーションした。ラ
ムダＤＮＡを、比活性３×１０５ｃｐｍ／ミクログラム
で平均二重鎖サイズを、アガロースゲル電気泳動で測っ
て６．０キロベースになるようにニックトランスレーシ
ョンした。取込まれなかったヌクレオチド類をＢｉｏ−
Ｇｅｌ Ｐ−６０クロマトグラフィーにより、反応混液
から除去した。Ｃｏｎ Ａセファロースを、製造者（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）の記述する方法に従って調製した。
１ｍｌの調製済みゲルには１８ｍｇの結合型Ｃｏｎ Ａ
が含まれていた。滅菌パスツールピペット中に、１ｍｌ
のカラムを作り、ＰＢＳ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ：０．
０１Ｍリン酸ナトリウムカリウム、ｐＨ６．５）で平衡
化した。Ｈ３−ＤＮＡ試料を０．５ｍｌの緩衝液（実施
例ＸＸＩにＣｏｎ Ａを含まない緩衝液として記述）に
調製した。Ｔ４ＤＮＡ溶液は１７６，０００ｃｐｍ／
０．５ｍｌ含み、ＤＮＡ溶液は１０８，０００ｃｐｍ／
０．５ｍｌ含有していた。０．５ｍｌの試料をカラムに
かけた。１０．５ｍｌ量の緩衝液をカラムに通し、溶出
画分（０．３３ｍ）を採り、Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＳＣ−
１００シンチレーションカウンター、３．５ｍｌリーフ
ルアコクティル（Ｂｅｃｋｍａｎ）中で測数した。その
結果（第２Ａ及び２Ｂ図）から、非グルコシル化ＤＮＡ
は結合しないが、グルコシル化Ｔ４ＤＮＡはカラムに結
合した事がわかった。結合したＴ４ＤＮＡを、高ｐＨ緩
衝液（トリス−塩酸、ｐＨ７．２−８．２）でカラムを
洗滌することにより除去した。更に、グリコースとＣｏ
ｎ Ａの相互作用に対応して、マンノースは、ＤＮＡを
カラムに掛ける際の緩衝液中に含まれていると、グルコ
シル化ＤＮＡのＣｏｎＡセファロースへの結合を阻止す
る。同じく、マンノース含有緩衝液（０．０５６Ｍマン
ノース含有ＰＢＳ）は結合Ｔ４ＤＮＡをＣｏｎ Ａセフ
ァロースから遊離させてしまう（第３Ａ及び３Ｂ図）。
さらに非放射能的方法、又は、特定の核酸を分析する技
術を指向した本発明実施例としては、以下の例で糖−レ
クチン系を利用している。この例では、実際、グルコシ
ル化するのではなくて、これから述べる如く、ニックト
ランスレーションでＤＮＡにマルトトリオース基を付加
したＤＮＡを利用する。マルトトリオース修飾ｄＵＴＰ
及び、それに由来する修飾を受けたＤＮＡは、セファロ
ースに共有結合したコンカナバリンＡのカラムに特異的
に結合する。この技術により、そして、本発明の実施例
に従って、如何なる核酸をも糖で、特異的に標識する方
法が提示されている。前述の如く、ニックトランスレー
ションは、本発明による、修飾核酸の生産を可能にする
ための多数の技術並びに研究方法の１つに過ぎない。
【００５９】実施例ＸＸＩＩＩ ラムダＤＮＡを、本発明記述の如く、マルトトリオース
のカップルした５−（３−アミノ−１−プロペニル）−
２′−デオキシウリジン−５′−３リン酸及び３Ｈ−
２′−デオキシアデノシン−５′−３リン酸とニックト
ランスレーションした。当条件下で、ＤＮＡは、そのチ
ミジン残基の４０％まで、マルトトリオースヌクレオチ
ドで置換され、ＤＮＡミクログラムあたり、８×１０５
ｃｐｍの比活性を有していた。３Ｈ−ｄＡＴＰでのみ置
換されたＤＮＡの標準サンプルの比活性は、ＤＮＡミク
ログラム当り、６×１０５ｃｐｍだった。ニックトラン
スレーションを施したＤＮＡサンプルを、本発明記述の
如く、Ｂｉｏｇｅｌ Ｐ−６０クロマトグラフィーで精
製し、反応混液の他の成分を除去した。精製したサンプ
ルを、第２Ａ及び２Ｂ図に述べた如く、Ｃｏｎ Ａ−セ
ファロースカラムにかけた。マルトトリオース標識ＤＮ
ＡはＰＢＳで洗滌時はカラムに保持されるが、次いで、
１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．２（第４Ａ図）で溶出
すると、除去された。非置換トリチウム化ＤＮＡはｐＨ
７．４（第４Ｂ図）ではカラムに結合しなかった。実施例ＸＸＩＶ 潜在的に免疫原性のハプテン類を、既報の種々の方法に
より、ウリジンの５位に導入可能である。５−（パーフ
ルオロブチル）−２′−デオキシウリジンを、Ｃｅｃｈ
等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２、２１８３（１
９７９）の方法を用いて合成した。銅−青銅を硫酸銅
（５ｇ、２０ｍ ｍｏｌ）と亜鉛粉末（２ｇ）を２０ｍ
ｌの水中で反応させて調製した。混液をデカントし、残
渣を水で、次いで５％塩酸と水で洗滌した。使用直前
に、固体（２ｇ）を、アセトン（２０ｍｌ）中、２％ヨ
ードで活性化した。濾過後、残渣をアセトン：濃塩酸
で、次いで純アセトンで洗った。活性化銅−青銅（１３
０ｍｇ、２ｍ ｍｏｌ）及び、１−ヨード−１′，２，
２′，３，３′，４，４′−ヘプタフルオロブタン
（１．３ｍｇ、４ｍ ｍｏｌ）を３ｍｌのジメチルスル
フォキシド中で１１０℃、１時間攪拌した。冷却と濾過
後、２′−デオキシウリジン（２４５ｍｇ、１ｍ ｍｏ
ｌ）を加え、混液を１１０℃で１時間加熱した。水（５
ｍｌ）を加え、混液をエーテルで抽出した。エーテル抽
出物を乾燥し、減圧下で蒸発した。残渣をシリカゲルカ
ラムでクロマトグラフィーにかけ、酢酸エチルで溶出し
た。
【００６０】実施例ＸＸＶ ツベリジンの５位を、５−シアノ化合物、トコカマイシ
ンの誘導体を作って置換した。一例として、４−アミノ
−５（テトラゾル）−５−イル−７−（β−Ｄ−リボフ
ラノシル）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジンを、Ｓｃｈ
ｒａｍ ａｎｄＴｏｗｎｓｅｎｄ、Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙ
ｄｒａｔｅ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ：Ｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅｓ １、３８（１９７４）の方法を用いて合成し
た。水（１００ｍｌ）と氷酢酸（１３ｍｌ）に溶かした
トヨカマイシン（１．０ｇ）を加熱して還流した。アジ
ド．ナトリウム（７．５ｇ）を１０時間にわたって１．
２５ｇ部分づつに分けて添加した。溶液を５℃まで冷却
し、沈澱生成物を集めた、融点２７６−２７７℃。実施例ＸＸＶＩ ５−シアノ−２′−デオキシウリジンをＢｌｅｃｋｌｅ
ｙ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２、６８３（１
９７５）の方法に従って調製した。５−ヨード−２′−
デオキシウリジン（１．０ｇ、２．８２ｍ ｍｏｌ）を
還流中のヘキサメチルジシリザン（ＨＭＤＳ）（１０ｍ
ｌ）に溶解した。過剰のＨＭＤＳを減圧下に除去し、生
ずる油状物質を脱水ピリジン（５０ｍｌ）に溶かした。
シアン化第１銅（３５０ｍｇ、３．８ｍ ｍｏｌ）を加
え、溶液を１６０℃で２０時間加熱した。ピリジンを減
圧下で除去し、残渣をトルエン中に抽出し、次いでトル
エンを蒸発させた。残渣を５０％水性エタノール中で１
００℃２時間加熱した。生産物を、逆相高速液体クロマ
トグラフィーで精製し、エタノールから再結晶化した。
融点１６１℃。
【００６１】実施例ＸＸＶＩＩ ４−アミノ−５−アミノメチレン−７−（β−Ｄ−２−
デオキシフラノシル）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン
ジヒドロクロリドを以下の如く調製した。４−アミノ−
５−シアノ−７−（β−Ｄ−２−デオキシフラノシル）
ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン（トヨカマイシン）
（０．２ｇ）を塩酸（１０ｍｌ）に溶かした。混合物を
４０ｐｓｉで室温、５時間水素化している間に、木炭
（０．１ｇ）上１０％パラジウムを添加した。濾過後水
を減圧下で蒸発した。残渣をエタノールと共に粉砕し、
生成物を５０％エタノールより再結した。実施例ＸＸＶＩＩＩ ５−アミノ−２′−デオキシウリジンを５−ブロモ−
２′−デオキシウリジンから、Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ
Ｖｉｓｓｅｒ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１４：
６６５−６６９（１９５２）の方法により調製した。液
体アンモニア（２０ｍｌ）に溶解した５−ブロモ−２′
−デオキシウリジン（２ｇ、６．２ｍ ｍｏｌ）を、ガ
ラス管にスケール（ｓｃａｌｅ）５０℃で５日間加熱し
た。管を開き、アンモニアを蒸発した。５−アミノ−
２′−デオキシウリジンを５ｍｌの水と７５ｍｌの熱イ
ソプロピルアルコールより再結した。実施例ＸＸＩＸ ５−（メチルアミノ）−２′−デオキシウリジン（０．
２ｇ）を次の如く調整した。５−シアノ−２′−デオキ
シウリジン（０．２ｇ、０．０５ｍ ｍｏｌ）を１Ｎ塩
酸（１０ｍｌ）に溶解した。木炭上１０％パラジウムを
加え、混合物を室温で１０時間４０ｐｓｉで水素化し
た。混合物を濾過し、水を減圧下で蒸発した。残渣をエ
ーテルと粉砕し、生成物を８０％エタノールから再結し
た。実施例ＸＸＸ マルトーストリオースを、以下の方法により、酸化して
相当するカルボキシル酸にした。マルトーストリオース
（０．５ｇ、０．９４ｍ ｍｏｌ）を水（５ｍｌ）に溶
かした。カルボン酸鉛（０．４２ｇ、１．１ｍ ｍｏ
ｌ）とブロミン（０．１７ｍｌ、３．３ｍ ｍｏｌ）を
加え、混合物を６日間室温で反応させた。反応後、還元
糖は少しも残存していなかった。混合物を濾過し、カル
ボン酸銀（０．２ｇ）を加えた。再濾過後、濾液をＤｏ
ｗｅｘ ５０（Ｈ＋型）を通して溶出することにより脱
イオン化を行った。水を蒸発し、５酸化亜リン酸の存在
下に乾燥して、目的とする生成物を得た。
【００６２】実施例ＸＸＸＩ マルトーストリオースを以下の方法で５−（３−アミノ
−１−プロペニル）−２′−デオキシウリジン−５′−
３リン酸にカップルした。酸化マルトース（１９０ｍ
ｇ、０．１８ｍ ｍｏｌ）をジメチルホルムアミド
（０．８ｍｌ）に溶かし、４℃に冷却した。イソブチル
クロロフォルマート（２５ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）と
トリ−ｎ−ブチルアミン（４３μｌ、０．３８ｍ ｍｏ
ｌ）を加え、溶液を４℃で１５分間反応させた。ジメチ
ルフォルムアミド（１．２ｍｌ）と、０．１Ｍホウ酸ナ
トリウムに溶かし、４℃に冷却した。５−（３−アミノ
−１−プロペニル）−２′−デオキシウリジン−５′−
３リン酸（９．０μｍｏｌ）を上記溶液に加えた。混合
液を４℃で１時間そして室温で１８時間インキュベート
した。次いで反応液をＤＥＡＥ−セルロースカラムにか
け、０．１から０．６Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウ
ム、ｐＨ７．５の勾配法により溶出した。生産物を、最
後に、逆相高速液体クロマトグラフィーで精製した。以
下は実施例ＸＸＸＩＩ及びＸＸＸＩＩＩである。実施例
ＸＸＸＩＩはアリルアミンで修飾したｄＵＴＰを、フル
オレシン置換体で標識（タグを付ける）する方法であ
る。これは核酸プローブの自己検出法の一例を示したも
のである。実施例ＸＸＸＩＩＩは、二重らせん核酸中グ
アニンのＮ２位及びアデニンのＮ６位に標識する方法で
ある。実施例ＸＸＸＶＩＩは、プローブに結合した、検
出分子を有する例である。Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ ８
４：１−１８（１９８１）及びＥｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅ
ｓ １２８：４８５−４９０には、ＲＮＡをローダミン
で末端標識する方法の発表がある。しかしながら、本発
明の方法は、解裂が少なく、内部のヌクレオチドを標識
する。
【００６３】実施例ＸＸＸＩＩ フルオレシンを以下の方法で５−（３−アミノ−１−プ
ロピル）−２′−デオキシウリジン−５′−３リン酸
（ＡＡ−ｄＵＴＰ）にカップルした。２ｍｌのホウ酸ナ
トリウム緩衝液（０．１ｍ）、ｐＨ９．０に溶かした、
ＡＡ−ｄＵＴＰ（１０μ ｍｏｌ）を、１ｍｌジメチル
フォルムアミドに溶かした、フルオレシンイソチオシア
ネートに加えた。室温に４時間放置後、混合液を、重炭
酸トリエチルアンモニウム緩衝液、ｐＨ７．５で平衡化
した、ＤＥＡＥ−セルロースカラムに充てんした。フル
オレシンのカップルしたＡＡ−ｄＵＴＰを、０．１から
０．６ｍ重炭酸、トリエチルアンモニウム、ｐＨ７．５
の勾配法により溶出、精製した。実施例ＸＸＸＩＩＩ ＤＮＡを化学的アルキル化剤と反応させて修飾可能であ
る。ラムダＤＮＡを、芳香族炭化水素、７−プロモメチ
ルベンズ〔ａ〕アントラセンと、反応させることによ
り、グアニンのＮ２位とアデニンのＮ６位にアルキル化
を行った。７−ブロモメチルベンズ〔ａ〕アントラセン
を以下の様にして取得した。二硫化炭素溶液中の７−メ
チル〔ａ〕アントラセンを凍結混液中で冷却し、モル等
量の臭素を滴下して反応させた。３０分後、懸濁した生
成物を集め、脱水エーテルで洗滌し、ベンゼンより再結
した。収量は６６％で融点は１９０．５−１９１．５℃
であった。ファージラムダより精製したＤＮＡ（１．６
ｍｇ）を５．０ｍｌの２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ
６．５に可溶化した。４．０ｍｌのＤＮＡ溶液に、脱水
アセトン中の５００ミクログラムの７−ブロモメチルベ
ンズ〔ａ〕アントラセンを加えた。２０°で３０分後、
ＤＮＡを二倍量の冷エタノールで沈澱させた。沈澱を連
続して、エタノール、アセトン、エーテルで洗い、未結
合７−ブロモメチルベンズ〔ａ〕アントラセンを除去し
た。ＤＮＡを酵素的加水分解でヌクレオシドにし、次い
で生成物のＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムを用い
たクロマトグラフィーで検討した所、ＤＮＡ中のアデニ
ンの１８％及びグアニンの４８％が、それぞれＮ６及び
Ｎ２位に修飾を受けていた。修飾したＤＮＡを次の何れ
かの方法で一重鎖にした。 （１） ＤＮＡを１００°で５分間加熱し、急冷する。 （２） ＤＮＡを等量の０．１Ｍ ＮａＯＨと１０分間
インキュベートし、次いで、０．５ｍｌのＥＤＴＡを含
む、１ｍｌのトリス−塩酸ｐＨ８．０に対し４時間、溶
液の透析を行って、ＤＮＡを一重鎖形に維持した。
【００６４】実施例 ＸＸＸＩＶ ＤＮＡプローブを大腸菌の１ａｃオペレーターＤＮＡ配
列を繰り返えして含む合成ＤＮＡに結合させた。アンチ
プローブ配列を検出するハイブリダイゼーションの後、
ハイブリダイズしたＤＮＡをビオチン化した１ａｃレプ
レッサーとの反応により検出し、ビオチン化１ａｃレプ
レッサーの方は、ビオチンと反応するやぎのアンチビオ
チン１ＧＧと、わさびのペルオキシダーゼにカップルし
た、第二の抗体とを利用した酵素結合免疫吸着検定法に
より検出した。１ａｃポリオペレーターＤＮＡに関して
は、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（Ｓｅｃｏｎｄ Ａｎｎｕａｌ
Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｆｏｒ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，
１９８２）による報告があり、１ａｃポリオペレーター
ＤＮＡを、Ｔ４リガーゼを利用した、ブラントエンド結
合で、アデノヴイールスのＤＮＡプローブに結合した。
ポリオペレーター標識プローブＤＮＡのその場所での
（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリディゼーションを、Ｇｅｒ
ｈａｒｄ等（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，７８，３７５５（１９８１））らの報告に従っ
て行った。ビオチン化１ａｃレプレッサーをＭａｎｎｉ
ｎｇ等（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ， ５３，１０７−１１
７（１９７５））の報告に従って調製し、ガラススライ
ドに固定した、アデノヴイルス感染細胞に、結合緩衝液
中で作用させた。結合緩衝液は、下記成分を含有する、
０．０１Ｍ ＫＣｌ、０．０１Ｍトリス（ｐＨ７．
６）、０．０１Ｍ ＭｇＳＯ４、１０−４Ｍ ＥＤＴ
Ａ、１０−４Ｍ ＤＴＴ、５％ＤＭＳＯ（ジエチルスル
フォキシド）及びＪ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅ
ｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ（１９７２）による５０μｇ／ｍｌ牛血清
アルブミン。スライドを結合緩衝液で洗滌して未結合ビ
オチン化１ａｃレプレッサーを除去し、次いでわさびペ
ルオキシダーゼ結合二重抗体法を用いてビオチンを検定
した。本法は、プローブを固定化レプレッサー蛋白に結
合し、次いで特定のインデューサー、例えば、イソプロ
ピルチオガラクトシド又は、チオメチルガラクトシド、
での溶出で除去するような、アフィニティカラムの創設
に利用できる。レプレッサーオペレーター複合物の親和
度は極めて高く、１０−１１Ｍである。特定のインデュ
ーサーがレプレッサーに結合するとオペレーターレプレ
ッサー複合体は崩解する。実施例 ＸＸＸＶ ２−ブロモ−２′−デオキシウリジン−５′−フォスフ
ェートを以下の如く調製した。２′−デオキシウリジン
−５′−フォスフェート（６．２ｇ）を６０ｍｌのピリ
ジンと３０ｍｌ酢酸の混液に懸濁した。臭素（０．８４
ｍｌ）を氷水浴槽中で攪拌し、攪拌を室温で２０時間継
続した。溶液を減圧濃縮した。最少量の水に再溶解後、
粗生成物を、エタノールを加えて沈澱させた。粗生成物
をＤｏｗｅｘ５０（Ｈ＋）でクロマトグラフィーを行
い、水で溶出した。遊離酸生成物を、溶出液を濃縮後、
エタノールを添加して沈澱させた。
【００６５】実施例 ＸＸＸＶＩ 仔牛腸アルカリフォスファターゼを以下の如くビオチン
化した。酵素（１ｍｇ、７．７ｍ ｍｏｌ）をＧ−５０
カラムでクロマトグラフィーを行い、０．１Ｍ塩化ナト
リウム含有０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ８．０で溶
出した。プールした画分を、１０ｍｌジメチルフォルム
アミドに室温で１時間溶解したＮ−ビオチニル−６−ア
ミノ−カプロイン酸−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエス
テル（０．６７５ｍｇ、０．７７μ ｍｏｌ）と反応さ
せた。過ヨード酸ナトリウム（０．１Ｍ、１２５μｌ）
を加え、２時間攪拌を続けた。混合液を４°で一夜、
０．１Ｍ ＮａＣｌと共に０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ緩衝液
ｐＨ８．０中で透析し、次いでｐＨを７．４に調整し
た。０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．４と０．１Ｍ
ＮａＣｌに溶かしたビオチンヒドラジド（０．１Ｍ、
０．５ｍｌ）を加え、反応液を室温で３０分間攪拌し
た。ｐＨを０．２Ｍ炭酸ナトリウムで８．０に調整し水
に新らしく調製した０．５ｍｌの０．１Ｍボロヒドリド
ナトリウムを加え、溶液を０．１Ｍ ＮａＣｌを含む
０．１Ｍトリス緩衝液ｐＨ８．０に対して透析した。実施例 ＸＸＸＶＩＩ ６−シアノ−２′−デオキシウリジン−５′−フォスフ
ェートをＶｅｄｅｒ等、Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｎｕ
ｃｌｅｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，５，２６
１（１９７８）記載と同様の方法で調製した。ピリジン
からの連続蒸発で乾燥した５−ブロモ−２′−デオキシ
ウリジン−５′−リン酸（２．０ｇ、１５ｍ ｍｏｌ）
を５０ｍｌのジメチルスルフィドに溶解した。シアン化
ナトリウム（４９０ｍｇ、１０ｍ ｍｏｌ）を加え、溶
液を２日間室温で攪拌した。溶液を４００ｍｌの水で稀
釈しｐＨを７．５に調整した。溶液をＤＥＡＥ−セルロ
ースカラム（ＨＣＯ３ −型）にかけ、２０００ｍｌの
０．０２Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウムで洗滌し目的
の生産物を得た。
【００６６】実施例 ＸＸＸＶＩＩＩ ６−（メチルアミノ）−２′−デオキシウリジン−５′
−リン酸を次の様にして調製した。６−シアノ−２′−
デオキシウリジン−５′−リン酸（０．２ｇ、６０ｍ
ｍｏｌ）を０．１Ｍ塩酸に溶かした。木炭（０．１ｇ）
上１０％パラジウム添加後、混合物を室温で２０時間４
０ｐｓｉで水素化した。混合液を濾過し水酸化リチウム
で中和し凍結乾燥した。生産物の残りをエタノールで抽
出した。実施例 ＸＸＸＩＸ ５ｍｌの蒸溜水に溶かしたわさびペルオキシダーゼ（２
０ｍｇ）を新らしく調製した０．１Ｍ過ヨード酸ナトリ
ウム液に加えた。室温で２０分間攪拌した後で、１ｍＭ
酢酸ナトリウムｐＨ４．４に対し４℃で一夜透析した。
０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む、０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ
緩衝液ｐＨ７．４の２ｍｌに溶かしたビオチンヒドラジ
ド（２．６ｍｇ、５×１０−２ｍ ｍｏｌ）を、０．２
Ｍ炭酸ナトリウムでｐＨ８．０にし、水に新らしく調製
した０．１Ｍボロヒドリドナトリウムを加えた。４℃で
２時間放置後、その蛋白をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０
カラムにかけ、０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓと０．１Ｍ Ｎａ
Ｃｌで溶出して精製した。
【００６７】実施例 ＸＬ 人参の酸性フォスファターゼはＢｒｕｎｎｇｒａｂｅｒ
ａｎｄ Ｃｈａｒｇａｆｆ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，（１９６７）２４２，４８３４−４８４０にフォ
スフォトランスフェラーゼ精製の際の副産物として述べ
られていて、パラニトロフェニルフォスフェートを基質
として３７℃、４６０μＭ／ｍｇ／ｍｉｎの比活性まで
精製されている。精製には次の工程が関与している。即
ち、（ａ）ＤＥＡＥセルロースによる非特異的蛋白の吸
着；（ｂ）酸性下での酵素精製；（ｃ）アセトン分画；
（ｄ）コンカナバリンＡアフィニティクロマトグラフィ
ー；（ｅ）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーそ
して（ｆ）ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１００分画。Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ−１００分画に供した酵素の比活性は、前
段階のアフィニティクロマトグラフィー工程（ｄ）での
活性減量のため１７０μＭ／ｍｇ／ｍであった。（ｄ）
段階での溶出条件を変えることにより、これらの減量
（ロス）を避け、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００分画前
の酵素の比活性を３４０μＭ／ｍｇ／ｍまで改良出来
る。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００分画工程で、比活性
８００μＭ／ｍｇ／ｍか或いはもっと高い酵素が得る必
要がある。人参酸性フォスファターゼを、Ｗｉｌｃｈｅ
ｋ等Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６、２４７（１９６
７）の方法を用いてビオチン化した。０．１Ｍ ＮａＣ
ｌ、ｐＨ５に溶かした酵素（２０ｍｇ）にビオチンヒド
ラジド（２．０ｍｇ、７×１０−３ｍ ｍｏｌ）と０．
１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５に溶かした１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジミド塩酸（１
ｍｇ、７×１０−３ｍ ｍｏｌ）を添加した。４℃にて
２時間放置後、酵素をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０でク
ロマトグラフィーを行い、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐ
Ｈ５．０で溶出した。
【００６８】本発明実施にあたり、特に重要且つ有意義
な点は、自己−信号発信、自己−指示又は自己−検出核
酸を利用することであり、しかも二重鎖ＤＮＡ及び同類
のものに取り込まれる様な核酸を利用することにある。
その様な自己−信号発信又は自己−検出核酸は、アリル
アミン置換体に共有結合で付加させ、本発明に従って、
特定のイオン類、即ち重金属、希土類とキレートする様
な分子である修飾ヌクレオチドを形成することにより作
り出すことが出来る。一般にキレートしたイオンを
（ａ）放射活性放出か又は（ｂ）そのイオンを利用して
色素形成又は蛍光発生反応を触媒させることにより検出
出来る。例として、３，４−ジニトロフェノールを還元
して３，４−ジアミノシクロヘキサンにする。
【化２９】 次いでこの物を臭素化して
【化３０】 ３，４−ジアミノ−ブロモ−シクロヘキサン（ｄＡＢＣ
Ｈ）を作る。この化合物を、ハロゲン（Ｕ，Ｂｒ，Ｉ）
に置換したカルボキシメチル化合物と反応させて、テト
ラカルボキシメチル化合物又はｄＡＢＣＨ（ＴＣＭ−ｄ
ＡＢＣＨ）を生成する：
【化３１】 この臭素を、可溶性アンモニアを用いてアミノ基と置換
する：
【化３２】 次いでこの化合物をクロロチオフォスゲンと反応させて
（ＴＣＭ−ｄＡＮＣＨ）のイソチオシアネート誘導体を
生成する。
【化３３】 最後に、この化合物をｄＵＴＰ−アリルアミン誘導体と
反応して修飾ｄＵＴＰを作る。
【化３４】 コバルトや他の重金属イオン又は他の希土類イオンを上
記第３ステップ以後で、この化合物にキレートさせるこ
とが出来る。或いは核酸を、この付加物に置き替え、次
いでイオンを付加することも出来る。（例、コバルトを
結合恒数が１０−１９ＭであるｐＨ６で付加する）。
【００６９】コバルトは放射活性で検定出来る。コバル
トは又、分子状酸素の存在下でメチレンブルーを酸化し
てロイコ（ｌｅｕｃｏ）形にする能力によっても検出で
きる。コバルトを利用して、これも分子状酸素の存在下
で可溶性スルフヒドロ基を、酸化して二硫酸結合を形成
出来る。この型の自己−信号発信分子を、如何なる核酸
のハイブリディゼーション反応のモニターにも利用出来
る。特にゲル中、（例えばシークエンシングゲル）で核
酸を検出することは特に重要である。放射活性の利用に
関しては、必要とするアイソトープを調製出来る。即
ち、もし弱い、又は強いβ又はα放射体が必要な場合、
そのアイソトープをキレートできる。
【００７０】利用出来るアイソトープの例を以下に表示
した。 アンチモン−１２４ ガドリニウム−１５３ アンチモン−１２５ 金 −１９５ 砒 素−７４ 金 −１９９ バリウム−１３３ ハフニウム−１７５ バリウム−１４０ ハフニウム−１７５＋１８１ ベリリウム−７ ハフニウム−１８１ ビスマス−２０６ 水素−３ トリチウム参照 ビスマス−２０７ 沃 素−１２５ カドミウム−１０９ 沃 素−１３１ カドミウム−１１５ｍ 沃 素−１３２ カルシウム−４５ イリジウム−１９２ 炭 素−１４ 鉄 −５５ セリウム−１３９ 鉄 −５９ セリウム−１４１ セリウム−１４４ クリプトン−８５ セシウム−１３４ セシウム−１３７ 鉛 −２１０ 塩 素−３６ ルテシウム−１７７ クロミウム−５１ コバルト−５６ マンガン−５４ コバルト−５７ 水 銀−１９７ コバルト−５８ 水 銀−２０３ コバルト−６０ モリブテン−９９ エルビウム−１６９ ユーロピウム−１５２ ネオジミウム−１４７ タンタル−１８２ ネプッニウム−２３７ テクネチウム−９９ ニッケル−６３ テルル−１２５ｍ ニオビウム−９５ テルル−１３２ テルビウム−１６０ オスミウム−１８５＋１９１ タリウム−２０４ トリウム−２２８ パラジウム−１０３ トリウム−２３２ ツリウム−１７０ プラチナ−１９５ｍ 錫 −１１３ プラセオジミウム−１４３ チタニウム−４４ プロメチウム−１４７ トリチウム プロトアクチニウム−２３３ タングステン−１８５ ラジウム−２２６ バナジウム−４８ レニウム−１８６ バナジウム−４ ルビジウム−８６ ルテニウム−１０３ イッテルビウム−１６９ ルテニウム−１０６ イットリウム−８８ イットリウム−９０ スカンジウム−４４ イットリウム−９１ スカンジウム−４６ セレニウム−７５ 亜 鉛−６５ 銀 −１１０ｍ ジルコニウム−９５ 銀 −１１１ ナトリウム−２２ ストロンチウム−８５ ストロンチウム−８９ ストロンチウム−９０ 硫 黄−３５
【００７１】Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎ
ｉｉによって生産される蛋白、ストレプトアビジンは、
相乗作用を示す一組の化合物の中の大分子量成分であ
り、両成分共に本微生物の培養濾液中に存在する。この
組のそれぞれは不活性だが、組合わせるとグラム−陰性
の微生物に対して活性を示す。この抗生物質の小さい成
分がビタミンのビオチンのｄｅ ｎｏｖｏ合成を阻害
し、従って、少くとも合成培地中では、抗菌活性を示す
ことが知られている。しかしながら、複雑な培地中で
は、同じ抗菌効果を示すには、大きな成分の存在が必要
である。この事は、複雑な培地中では外部からのビオチ
ンの持込みのためであることが示されている。大分子成
分は外部からのビオチンに結合し、卵子や産卵中の鳥の
輸卵管由来のアビジンと同様の活性を示すことが知られ
ている。ストレプトアビジンは精製し、６０，０００タ
ルトンのポリペプチドであることが示されている。アビ
ジンと同様に、ストレプトアビジンは４つのサブユニッ
トを含み、４分子のビオチンと固く結合する。しかしな
がら、アビジンとは異なり、ストレプトアビジンは、グ
リコシル化されていず、Ｐ１は、アビジンのＰ１＝１
０．５に比して５．０である。Ｐ１の差により、ストレ
プトアビジンはＤＮＡと非特異的に相互作用をしない。
【００７２】ストレプトアビジンの調製 塩、１％グルコース、０．１％アスパラギン、０．０５
％酵母抽出物及び微量元素を含む、半合成培地を調製し
た。培養物を２６℃で３日間生育させた。菌体を遠心分
離で除き、上澄液の蛋白を、１Ｍ ＨＣｌでｐＨ７．２
に調整した後、バッチ操作でＤＥＡＥ−セルロースに吸
着させた。ＤＥＡＥ−セルロースを濾別し、２８０ｎｍ
で吸収がなくなるまで、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．２）で洗滌した。ストレプトアビジンを、０．５Ｍ
ＮａＣｌ含有の２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
２）で溶出した。硫酸アンモニウム沈澱を利用して、ス
トレプトアビジンを更に濃縮した（４℃で５０％ｗ／
ｖ）。沈澱を水に溶かし、１．０Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍ
Ｍ Ｎａ２ＣＯ３に対して透析した。次のステップとし
て、イミノビオチンセファロースのアフィニティカラム
クロマトグラフィーを用いた。イミノビオチンセファロ
ースカラムから溶出したストレプトアビジンは、非−変
性アガロース−ゲル電気泳動でクロマトグラフィー的に
純粋であった。ストレプトアビジンの最終精製を、イミ
ノビオチン−セファロースカラムを通す、アフィニティ
精製で行った。イミノビオチンはビオチンの同族体（ア
ナログ）であり、ビオチンの尿素部分のカルボニルが、
イミン官能基で置換されている。イミノビオチンは、塩
基性ｐＨではアビジン及びストレプトアビジンと結合す
るが、複合体は酸性ｐＨで解離する。イミノビオチン
を、何段階かの工程でビオチンから調製する。ビオチン
を水酸化バリウムで加水分解してシス−３，４−ジアミ
ノ−２−テトラヒドロチオフェン−ヴァレリン酸にし、
それを臭化シアノジエンと反応させてイミノビオチンに
する。イミノビオチンを、その臭化水素塩のＮ−ヒドロ
キシサクシニミドエステルとしてアミノセファロースに
カップルする。ＤＥＡＥが溶出したＳｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ培養液の粗蛋白混合物を、５
０ｍＭ炭酸ナトリウムと、１．０Ｍ塩化ナトリウム（ｐ
Ｈ１１）に溶かし、当液で前処理して平衡化した、イミ
ノピオチンカラムに充てんする。カラムをｐＨ１１で溶
出する。ストレプトアビジンを次いで０．５Ｍ塩化ナト
リウムを含む、５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ４．０
で溶出する。溶出物を１ｍＭトリスｐＨ７．４に対し３
回透析し、凍結乾燥する。本発明実施に当り、アビジン
は、ビオチン標識ＤＮＡの如き、標識ＤＮＡの検出機構
として有用である。しかしながら、中性附近のｐＨ下で
は、アビジン自体がＤＮＡと複合体を形成し、その結
果、ビオチン標識ＤＮＡとアビジン間で形成されている
複合体由来の信号（シグナル）が、アビジンと標識して
いないＤＮＡ間で複合体の形成があるために、消滅する
か或いは検出不能になる可能性がある。本発明実施中、
アビジンを利用する際のこの欠点をストレプトアビジン
は持っていない、即ち、ストレプトアビジンは中性附近
のｐＨでＤＮＡと複合体を作らず、ビオチン標識ＤＮＡ
のビオチン部分と複合体を形成出来る。ＤＮＡ以外の標
識化合物の検出に巾広くアビジン及びストレプトアビジ
ンを利用する事を目的とした他の応用面では、アビジン
とストレプトアビジンが標識した蛋白類、多糖類及び脂
質類の検出機構として、特に有効だということである。
例として、固体基材（マトリックス）に特定の抗原を固
定し、この抗原にビオチン化した抗体を働かせることが
出来る。次いで、酵素、例えば、仔牛腸アルカルフォス
ファターゼ、又は蛍光分子、例えばフルオレシンを結合
して作ったアビジン又はストレプトアビジン複合体と反
応させて、このビオチン化抗体の存在を検定する。抗原
或いは抗体を検出するために、抗原−抗体系を利用する
ことは、よく知られている。これに匹敵する系として
は、グリコシル化した基質又は分子とレクチンを適合さ
せる（マッチング）か或いはレクチンを充当することに
基づく系がある。この系ではレクチンが、フルオレシン
や適当な酵素のような標識を担うことになる。このグリ
コシルーレクチン系では、標識したレクチンが、グリコ
シル部分と、抗原−抗体複合体に相当する、複合体を形
成する。グリコシル化した分子と、適当な標識をしたレ
クチンを含み、かつ必要なグリコシル又は糖部特異性を
有するこの複合体は、次いで、標識レクチンの標識部分
から目的の反応を自動的に引き出して、グリコシルーレ
クチン複合体を作りあげる。
【００７３】本発明を実施する上で特に有利な他の応用
面としては、検出されるべきＤＮＡとそのＤＮＡを検出
するプローブとの間に液相中でハイブリディゼーション
を起こさせて検出することである。この液相系では検出
されるＤＮＡも、適当なＤＮＡ検出プローブも、両者
共、如何なる不溶性基質又は不溶性化学的分子にも附着
しているわけではない。液相検出系の利点は、被検出Ｄ
ＮＡと適当なＤＮＡ検出プローブ間で、ハイブリディゼ
ーション、即ち、ハイブリド形成の起るスピードにあ
る。例えば、固相−液相系では確認とハイブリディゼー
ション形成に要する時間は、万一それが完全な液相系の
み、即ち、被検出ＤＮＡも検出ＤＮＡも共に不溶性部分
に固着していない場合に比し約１０倍もの時間が掛る。
本発明の実施方法によって調製するプローブ類は上述の
如く、液体中のヴイルスや細菌の検出に適用し利用でき
る。被検液体中に大量の蛋白が含まれていない場合、液
中のヴイルスをハイドロキシアパタイトに吸着させ、少
量のリン酸緩衝液で溶出できる。被検液に多量の蛋白が
含まれている場合には、ヴイルスを高速遠心で濃縮でき
る。もし抗体が利用可能なら、アフィニティカラムに吸
着させ酸で溶出するのが望ましい、というのも本発明の
実施により、多くのプローブを同時に処理できるからで
ある。被検細菌を通常、容易に遠心により濃縮する。本
発明実施方法に従って、分離した粒子、ヴイルスや細菌
の同定や特性化をするには、特性化する、或いは同定す
べきＤＮＡと本発明の実施方法に従って調製した特異的
単鎖ＤＮＡプローブとハイブリダイブさせることであ
る。ハイブリディゼーションの後、余剰の非ハイブリデ
ィゼーションプローブＤＮＡを、Ｓ１ヌクレアーゼのニ
ック活性を抑制するため高塩濃度下で、Ｓ１ヌクレアー
ゼと大腸菌エクソヌクレアーゼＩで分解する、Ｖｏｇ
ｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖ
ｏｌ．６５，２４８−２５５頁（１９８０）参照。この
ヌクレアーゼ処理で、余剰の非ハイブリディゼーション
単鎖ＤＮＡプローブからモノヌクレオチド類が生成する
が、二重鎖のハイブリダイズしたＤＮＡは無疵で残る。
この反応液を、次いで、高塩濃度下でＤｏｗｅｘ陰イオ
ン交換樹脂に吸着させる（ヌクレオチド類と、少量のオ
リゴヌクレオチドは、高塩濃度下では樹脂に結合しな
い）。得られる、ハイブリダイズしたＤＮＡを、次い
で、本発明実施に際し、適用可能な各種方法で、同定又
は特性づけを行う。
【００７４】本発明に係る特別なヌクレオチド類として
は、リン酸のＰ部分、糖又はモノサッカライドのＳ部
分、塩基のＢ部分、プリン又はピリミジン並びに、Ｐ，
Ｓ又はＢ部分に、共有結合で付いた、信号（シグナル）
発信する化学的部分のＳｉｇが含まれている。以下に各
種塩基Ｂ部分の構造式並びに、本発明の実施方法に従っ
て修飾を受けるヌクレオチド類を示してある。主要プリン類 アデニン グアニン （６−アミノプリン） （２−アミノ−６−オキシプリン）
【化３５】
【化３６】
【化３７】
【化３８】
【００７５】二つのマイナーピリミジン類 ５−メチルシトシン ５−ヒドロキシメチルシトシン
【化３９】
【化４０】
【化４１】
【００７６】 一般構造式 一般構造式 アデノシン５′−リン酸 デオキシアデノシン５′−リン酸 （アデニル酸；ＡＭＰ） （デオキシアデニル酸；ｄＡＭＰ） グアノシン５′−リン酸 デオキシグアノシン５′−リン酸 （グアニル酸；ＧＭＰ） （デオキシグアニル酸；ｄＧＭＰ） シチジン５′−リン酸 デオキシシチジン５′−リン酸 （シチジル酸；ＣＭＰ） （デオキシシチジル酸；ｄＣＭＰ） ウリジン５′−リン酸 デオキシチミジン５′−リン酸 （ウリジル酸；ＵＭＰ） （デオキシチミジル酸；ｄＴＭＰ）
【００７７】本発明により、上述の如く、特別のヌクレ
オチド類とは、Ｐ，Ｓ及びＢ部分の外に、Ｐ，Ｓ、及び
／又はＢ部分に共有結合で付着している化学的部分Ｓｉ
ｇを含む。本発明の実施に際し特に重要なのは、Ｐ−Ｓ
−Ｂ−Ｓｉｇの一般式で表わされるヌクレオチド類であ
る。ここでＰとはモノー、ジー、トリー、テトラリン酸
を含む、リン酸部分、Ｓは糖又はモノサッカライド部
分、Ｂは塩基部分でプリンかピリミジンを表わす。リン
酸部分のＰは、ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチ
ドの場合、Ｓ部分の３′及び／又は５′位に付き、ヌク
レオチドがリボヌクレオチドの場合、２′，３′及び／
又は５′位に付く。塩基Ｂ部分は、塩基がピリミジンの
時はＮ１位から、プリンの時はＮ９位から、それぞれＳ
部分の１′位に付いている。Ｓｉｇ部分は、ヌクレオチ
ドのＢ部分に共有結合で付いている。そして、その様な
付き方で、自己信号発信能力を有するか、自己−検出又
はその存在を明らかに出来、願わくば、又は望むらく
は、生成するヌクレオチドＰ−Ｓ−Ｂ−Ｓｉｎを二重鎖
らせんＤＮＡ又はＲＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリド
に取込ませるか又はそれらを形成することができ、そし
て／又は、そこで検出可能なことである。
【００７８】本発明に係る他の特別ヌクレオチドは一般
式
【化４２】 で特性づけられる。本発明に係るその様なヌクレオチド
類は、リボヌクレオチドとして特性づけられる。りん酸
部分は、糖Ｓ部分の２′，３′及び／又は５′位に付い
ていて、塩基Ｂは、塩基がピリミジンの時はＮ１位か
ら、プリンの場合はＮ９位から、それぞれ糖Ｓ部分の
１′位に付いている。Ｓｉｇ化学的部分は糖Ｓ部分に共
有結合で付き、そのＳｉｇ化学的部分が、そのＳ部分に
付いている時、自己信号発信能力を有するか、自己−検
出又は、その存在を明らかにでき、そして望むらくは、
そのリボヌクレオチドを相当する二重鎖ＲＮＡ又はＤＮ
Ａ−ＲＮＡハイブリドに取り込ませることができる。
【化４３】 この様なヌクレオチドでは、願わくば、Ｓｉｇ化学的部
分が、Ｓ部分のＣ２′位又はＳ部分のＣ３′位にあるこ
とが望ましい。更に、本発明実施に係る他のヌクレオチ
ドとしては、
【化４４】 式を有するヌクレオチド類を含む。ここで、Ｐはリン酸
部分、Ｓは糖部分そしてＢは塩基部分である。これら特
別のヌクレオチド類ではＰ部分が、ヌクレオチドがデオ
キシリボヌクレオチドの時は、Ｓ部分の３′及び／又は
５′位に付き、ヌクレオチドがリボヌクレオチドの時
は、２′，３′及び／又は５位に付いている。塩基Ｂは
プリン又はピリミジンで、Ｂ部分は、そのＢ部分がピリ
ミジンの時はＮ１から、プリンの時にはＮ９位から、そ
れぞれ糖部分の１′位に付いている。Ｓｉｇ化学的部分
は化学結合
【化４５】 を通してリン酸Ｐ部分に、共有結合で付いていて、当該
Ｓｉｇが、当該Ｐ部位に付いる時は、自己信号発信能力
を有するか、自己−検出又は、その存在を明らかにで
き、そして願わくば、ヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ
又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリドの様な二重鎖ポリヌクレ
オチドに取込まれることができ、そしてそのように取込
まれた時でも、まだ自己−検出能力を有する。一般式Ｐ
−Ｓ−Ｂ−Ｓｉｇで、上記の通り表わした、又は定義し
た、本発明実施に係る特別ヌクレオチド類は、又、Ｓｉ
ｇ化学部分が、Ｂ部分がアデニンの場合Ｂ部分のＮ６又
は６−アミノ基位に、或いはＢ部分がグアニンの場合に
は、Ｎ２又は２−アミノ基位、又はＢ部分がシトシンの
場合、Ｎ４又は４−アミノ基位に、共有結合で付いたヌ
クレオチド類を含む。それらに付いたＳ部分を有する、
生成ヌクレオチド類は、自己信号発信能力を有するか、
自己−検出、又は自己の存在を明らかにする能力を有
し、二重鎖又はＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイ
ブリド中で検出可能である。
【００７９】要約として、本発明記載の各種特定のヌク
レオチドの組立方に関して上述の如く、特定のヌクレオ
チド類は、リン酸部分Ｐ、糖部分Ｓ及びプリン又はピリ
ミジンである塩基部分Ｓを含有し、その結合物Ｐ−Ｓ−
Ｂは、デオキシリボヌクレオチド類及びリボヌクレオチ
ド類の両者のヌクレオチドに関して、よく知られ又、定
義づける結合様式である。次いでヌクレオチド類は、本
発明実施により化学部分Ｓｉｇを共有結合で、Ｐ部分及
び／又はＳ部分及び／又はＢ部分に付けて修飾する。ヌ
クレオチドＰ−Ｓ−Ｂに、その様に付着した化学部分Ｓ
ｉｇは、すでにＳｉｇ部分が他部分の１つ又はそれ以上
に付加したＰ−Ｓ−Ｂ構造を含む、生成ヌクレオチド
に、ポリヌクレオチド、二重鎖ＤＮＡ、二重鎖ＲＮＡ又
は二重鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリドの如き、特に二重鎖
ポリヌクレオチドに取込まれた時、自己−検出、又は信
号発信又は、それ自体、自己の存在を明らかにさせ又は
することができる。Ｓｉｇ部分は、願わくはヌクレオチ
ドが、本発明記載の特定のＳｉｇ−含有ヌクレオチドを
含む二重鎖ポリヌクレオチドを形成する能力を阻害せ
ず、又その様に取り込まれた場合には、Ｓｉｇ−含有ヌ
クレオチドは、検出、局在化及び観察が可能である。本
発明の特定のヌクレオチド類の組立てに使用するＳｉｇ
部分は、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシ
ダーゼ、わさびペルオキシダーゼ又はリボヌクレアーゼ
の如き酵素又は酵素素材を含有できる。
【００８０】Ｓｉｇ部分は、又、フルオレシン又はロー
ダミン又はダンシルの様な蛍光成分を含有できる。望む
ならばＳｉｇ部分は磁気酸化物や磁気酸化鉄の如き、磁
気成分を結合又は付着して含むことができ、この様な磁
気含有Ｓｉｇ部分を含むヌクレオチド又はポリヌクレオ
チドを、磁気的方法で検出可能にする。Ｓｉｇ部分は
又、フェリチンの如き、電子稠密な成分を含み、観察に
よる利用ができる。Ｓｉｇ部分は又、放射性コバルトの
如き、放射性同位元素成分を含み、生成するヌクレオチ
ドを放射線検出装置で観察可能にできる。Ｓｉｇ部分は
又、ハプテン成分又はそれ自体を含み、それに対する特
異的抗体と複合体を形成さすこともできる。最も有用な
のは、Ｓｉｇ部分が多糖又はオリゴ糖又は単糖でレクチ
ン即ちコンカナバリンＡの如き糖や多糖に結合する蛋白
と複合体を形成するか又は付加することである。本発明
記載のＳｉｇ成分又は特定のヌクレオチド類は又、化学
ルミネッセント成分を含有できる。
【００８１】本発明実施により示された如く、Ｓｉｇ成
分は、直接又は化学結合又は結合腕を通じて、ヌクレオ
チド例えばその中の塩基Ｂ成分、又はその中の糖Ｓ成
分、又はリン酸Ｐ成分に付着可能な如何なる化学的部分
をも包含する。本発明に記載したヌクレオチド類のＳｉ
ｇ成分及びＳｉｇ成分を含む、本発明のヌクレオチド類
を取り込んだヌクレオチド類やポリヌクレオチド類は、
上記確認の米国特許出願番号Ｎｏ．２５５，２２３記載
のヌクレオチド類と同じ目的に相当しそして有用であ
る。より明確にすると、米国特許出願番号Ｎｏ．２５
５，２２３記載の化学部分Ａは機能的にはＳｉｇ成分、
又は本発明の特定のヌクレオチドの化学的部分と同等で
ある。従ってＳｉｇ成分、或いは本発明のヌクレオチド
類の化学的部分は直接Ｐ、Ｓ又はＢ部分に共有結合で付
加し、又は米国出願番号Ｎｏ．２５５，２３３のヌクレ
オチド類のＢとＡを結ぶ点線で示される如く、米国特許
出願番号Ｎｏ．２５５，２３３に記載の如き化学結合又
は結合腕を通してそれらに付加出来る。米国出願番号Ｎ
ｏ．２５５，２３３中で確認した各種結合腕或いは結合
は、本発明の特定ヌクレオチド類に適用でき、そしてそ
の調製に有用である。
【００８２】本発明の特定ヌクレオチド類の特に重要で
有用な面は、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ類の調製にその
様なヌクレオチド類を利用することにある。その様なプ
ローブ類は、実質的にＤＮＡとマッチするヌクレオチド
配列や、局在化及び／又は同定する遺伝材料のＲＮＡ配
列を含む。プローブは１つ又はより多くの本発明の特定
ヌクレオチド類を含む。一重鎖ポリヌクレオチドの如き
目的のヌクレオチド配列を有するプローブで、ＤＮＡか
又はＲＮＡプローブは、次いで同定するＤＮＡ又はＲＮ
Ａ遺伝材料と接触させる。プローブの局在化やプローブ
を含む二重鎖ポリヌクレオチドの形成し、同定すべきＤ
ＮＡ又はＲＮＡ材料とマッチさせるに際し、生成した二
重鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ含有材料は次いで観察可能で同定
できる。本発明記載のプローブは、必要に応じて約５ヌ
クレオチドから約５００又はより多くの如何なる数のヌ
クレオチド単位をも実質的に含有できる。１２のマッチ
する、望ましくは連続したヌクレオチド単位は、もしプ
ローブの１２ヌクレオチド配列が、検査する又は同定す
べきＤＮＡ又はＲＮＡ材料中の相当する協調的配列にマ
ッチすれば検査する又は同定するＤＮＡ又はＲＮＡ材料
の大部分の同定を行うのに充分であろう。提示の如く、
その様なプローブは、本発明記載の特定Ｓｉｇ含有ヌク
レオチドを１つか又はそれ以上含み、望ましくは少くと
も、プローブ中のヌクレオチド５〜１０につき１つの特
定ヌクレオチドを含む。
【００８３】上記に提示した如く、種々の技術を本発明
の特定ヌクレオチドのＤＮＡ及び関連構造体中への取込
みのために本発明実施にあたり使用できる。上述した１
つの特に有用な技術は、ポリピリミジンの３′末端や単
鎖ＤＮＡにビオチン化したｄＵＭＰを付加するために末
端トランスフェラーゼを利用することである。３′末端
に付加したビオチン化ｄＵＭＰを有する単鎖又はクロー
ン化ＤＮＡの如き、生成する生産物をアビジンがＤＮＡ
の末端にあるビオチン化ｄＵＭＰと複合体を形成した後
回収するようなＳｅｐｈａｒｏｓｅ−アビジンカラムク
ロマトグラフィにより回収出来る。本発明実施により、
ｍＲＮＡへのハイブリディゼーションを溶液中で行なわ
せ、生成するハイブリドをＳｅｐｈａｒｏｓｅ−アビジ
ンカラムで回収しそれからｍ−ＲＮＡを回収できる。同
様の技術を使って、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリドを分離で
きる。本発明記載の特定ヌクレオチドの付加に末端トラ
ンスフェラーゼを利用するこの技術は広範に応用可能で
あり、特定のビオチン化ヌクレオチドや特定のグリコシ
ル化ヌクレオチドを含む、本発明記載の特定ヌクレオチ
ドを含む生成修飾ヌクレオチドをＳｅｐｈａｒｏｓｅ−
アビジンカラム処理でアビジンと複合体を形成するか又
はコンカナバリンＡの如き、レクチンと複合体を形成す
るか或いはセファロースーコンカナバリンＡカラムで選
択的に回収出来る。本発明実施の実例として、ビオチン
化したｄＵＴＰを末端トランスフェラーゼを利用してｄ
ＵＴＰの３′末端に付加し、生成する生産物をＧ−５０
セファロースで精製しセファロースーアビジンアフィニ
ティカラムで分離した。その結果ｄＵＴＰ分子の６９％
をビオチン化し、セファロースーアビジンカラムで回収
した。本実験の結果により、末端トランスフェラーゼが
ポリピリミジンの３′末端にビオチン化ｄＵＭＰを付加
する事実が確立された。特定の分子が共有結合で付加し
た核酸の検出を小分子が特異的に結合することが知られ
ている、天然に存在する蛋白を使って行うことが出来
る。この方法では小分子がアリルアミン側鎖を用いてヌ
クレオチドに結合する。これらのヌクレオチド類は、次
いでＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼ、又はリガーゼ反
応、又は化学結合を利用して特定のヌクレオチドに取込
ませる。このプローブを相補性アンチプローブ配列とア
ニーリングの後、プローブの存在をプローブに共有結合
したリガンドに対する蛋白の特異的結合により検出す
る。
【００８４】この様な型の検出体系に適当な蛋白−リガ
ンド反応の例としては： １．酵素とアロステリック作働子（エフェクター）又は
モジュレーター分子。この例としてはヘテロトロピック
酵素のスレオニンデヒドラターゼ酵素で、この系ではエ
フェクター分子が基質のＬ−スレオニンとは異なる、Ｌ
−イソロイシンである、Ｊ．Ｍｏｎｏｄ，Ｊ．Ｗｙｍａ
ｎ ａｎｄ Ｊ．Ｐ．ｃｈａｎｇｅｕｘ（１９６５）、
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：８８−１１８。 ２．調節に関与するエフェクター分子。この例としては
サイクリックＡＭＰ受容体に対する３′，５−サイクリ
ックアデノシンモノフォスフェートの特異的結合があ
る、Ｉ．Ｐａｓｔａｎ ａｎｄ Ｒ．Ｐｅｒｌｍａｎ，
Ｓｃｉｅｎｃｅ １６９：３３９−３４４（１９６
９）。他の例としては、乳糖レプレッサー分子と誘導物
質のイソプロピルチオガラクトシド、又はチオメチルガ
ラクトシドがある。この２つの誘導分子はそれらが誘導
する酵素により代謝されない事から無償性誘導分子と呼
ばれている、Ｗ．Ｇｉｌｂｅｒｔ ａｎｄ Ｂ．Ｍｕｌ
ｌｅｒ−Ｈｉｌｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓ
ｃｉ（ＵＳ），７０：３５８１−３５８４、（１９７
３）。 ３．ホルモン受容体、又は有機分子が特異的に結合する
細胞表面の他の受容体。この１例としてはエピネフリン
が、受容体に高い親和性を持ち立体特異的方法で結合す
るエピネフリン−エピネフリン受容体系がある。この系
では、受容体蛋白が水に不溶性なので、例えばリポゾー
ムの如きリピドの様な二層膜構造中に封埋する。適当な
検出体系としては、特異的酵素、又はリピド二層膜の内
側又は中の蛍光分子を含む。 ４．小分子の輸送に際して含まれる、特異的リガンド結
合蛋白。この例としては多くのアミノ酸、グルコース、
ガラクトース、リボース及び他の糖類に結合する、細菌
のペリプラスミック結合蛋白Ｐａｒｄｅｅ，Ａ．Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，１６２：６３２−６３７、（１９６８）；
Ｇ．Ｌ．Ｈａｚｅｌｂａｕｒ ａｎｄ Ｊ．Ａｄ１ｅ
ｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏ．２３０：１０１−
１０４、（１９７１）。
【００８５】上述の例では、核酸に結合したリガンド
は、天然に存在する蛋白と反応する。この反応の特異性
は蛋白のリガンド−結合部位に存在する。天然に存在す
る蛋白と相互作用をする小分子の更に１つの例としては
酵素に対する補酵素又は他の補欠分子の特異的結合があ
る。これら補酵素の例としてはチアミンピロリン酸、フ
ラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオ
チド、ニコチナミドアデニンジヌクレオチド、ニコチン
アデニンジヌクレオチドリン酸、コエンザイムＡ、ピリ
ドキサールリン酸、ビオチン、テトラヒドロ葉酸コエン
ザイムＢ１２、リポイック酸及びアスコルビン酸があ
る。これら分子の多くはそれらのアポ酵素と共有結合を
形成する。しかしながら或るもの例えばコエンザイム
Ａ、コエンザイムＢ１２及びテトラヒドロ葉酸は、非共
有結合だが、それらの同類のアポ酵素と特異的方法で結
合する。本系で利用する特定の補酵素−アポ酵素系とし
ては、大腸菌より分離した、フラビンアデニンジヌクレ
オチド（ＦＡＤ）とフラビンアデニンジヌクレオチドリ
ダクターゼがある。この系では、ＦＡＤの結合が充分に
強く、検出が可能である。リン酸部分Ｐ、糖又は単糖部
分Ｓ、プリン又はピリミジンの塩基部分Ｂ、そしてＰ、
Ｓ又はＢ部分に共有結合で付加した、信号発信又は自己
−検出部分、Ｓｉｇ等の成分を含む本発明の特定ヌクレ
オチドやそのようなヌクレオチド、一重鎖又は二重鎖ポ
リヌクレオチド、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含むポリヌ
クレオチドは、上述の如く、多くの利用方法や用途があ
る。例えば、本発明のヌクレオチドや、本発明のヌクレ
オチドを含むポリヌクレオチドは、免疫促進剤として、
ワクチンのアジュバントとして、リンパ球の様な感能細
胞の誘導、リンフォカイン、サイトカインやサイトキニ
ン、インターフェロンや他の細胞性生産物の生産に有用
である。
【００８６】二重鎖ポリＡ：Ｕは、活性は弱いが、イン
ターフェロン生産の促進剤又は誘導剤としてよく知られ
ている。同様に、ポリＩ：Ｃも、インターフェロン生産
の促進剤又は誘導剤として知られている。本発明記載の
１つ又はより多くのヌクレオチドを含む、二重鎖ポリヌ
クレオチドの様な、ポリヌクレオチドの利点は、実際、
この様なポリヌクレオチドが、インターフェロンや関連
物質の細胞からの生産に関しより効果的でより強力な誘
導又は促進剤であることだろう。例えば、上記の成分
Ｐ、Ｓ、Ｂ及びＳｉｇを含む、本発明記載のヌクレオチ
ドを、それから調製したヌクレオチドやポリヌクレオチ
ドがヌクレアーゼ類に対しより耐性である様に適当に調
製する。同様に上記同成分を含むヌクレオチドやポリヌ
クレオチドを、リンパ球の細胞表面や膜又は、インター
フェロンの如き、目的の細胞生産物の生産のために細胞
を刺激するような他の細胞表面や膜に、接触し、刺激
し、浸透するより強い能力を持つ様に適当に調製する。
【００８７】本発明記載の、Ｐ−Ｓ−Ｂ式で表わされる
これら特定のヌクレオチド類で格別に有用であり、特に
有用なものは、Ｓｉｇ成分が、ピリミジンの５位又はプ
リン又はデアザプリンの７位又はグアニンのＮ２位又は
アデニンのＮ６位にあるものである。その様なヌクレオ
チド及び、それを含むポリヌクレオチドで一重鎖と二重
鎖の両方のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを二重鎖らせんＤＮ
Ａ又はＲＮＡ又はそれを含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリド
の安定性を増加するため本発明に従って調製する。ヌク
レアーゼに耐性を増加することや疎水性の変更又は有利
な変化や、ヌクレオチドやそれを含むポリヌクレオチド
の電気的又は荷電性状の変化を達成出来る。又、本発明
記載のヌクレオチド及びポリヌクレオチドを、人間を投
与する際に、発熱性を減少する、或いはその他の全身毒
性反応の発現を減少せしめる様に調製する。更に、ヌク
レオチド及びポリヌクレオチドを、特定のポリペプチド
が結合してＲＮＡ複合体形成を作り出すか生むために結
合できるＳｉｇ成分の如きリガンドを提供する。従って
本発明のヌクレオチドはＰ、Ｓ、Ｂ及びＳｉｇがＰ、Ｓ
又はＢ成分に共有結合で付加するようなＳｉｇ成分を含
み、治療効果や細胞毒性効果を含む特定の生物学的効果
を有する総勢の化学的作用剤を開発又は提供する。イン
ターフェロン、リンフォカイン及び／又はサイトカイン
の如き、細胞材料や生産物の生産に刺激又は誘導剤とし
て働くことに加えて、本発明の特定のヌクレオチドと、
これらヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、又それ
らの化学療法上の効果の由に、そしてそれに基づく化学
療法剤の調製の由にしかし又、それらの細胞毒性効果と
それに基づく細胞傷害剤の生産に有用である。他の成分
即ち成分Ｐ、Ｓ、Ｂを含む、本発明の特定のヌクレオチ
ドに付加したＳｉｇ部分は、既知の化学療法、或いは細
胞毒性効果を有する特定の作用剤のＳｉｇ成分に付加す
るための場所をそれ自体で提供している。そのようなヌ
クレオチド類を体或いは細胞ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの
合成を阻害するか、癌を攻撃して、実際殺すか又はさも
なくば、不必要な細胞の生育を阻害するために、体や細
胞のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ成分に取込ませるように、
被処置体、即ち人体又は動物に導入又は投与出来る。ヌ
クレオチド及び／又はヌクレオチド含有ポリヌクレオチ
ドを体、人体や動物に投与するには幾つかの適当な方法
がある。特に有効な方法は、本発明のヌクレオチド含有
標品や適当な生理的に受け入れ可能な担体を静注して導
入することであり、又ヌクレオチドを、皮下や、経皮的
に或いは筋注、又はヌクレオチド類の化学療法的又は細
胞毒性的な効果を発揮させたい部位に直接導入すること
により投与できる。目的の化学療法的又は細胞毒性効果
を、全身的又は局所的に発現させ得るのみならず、上述
の如く、本発明の特定のＰ、Ｓ、Ｂ及びＳ−含有ヌクレ
オチド並びにそれらをヌクレオチドを含む、ポリヌクレ
オチドは免疫促進剤及びその補助剤として有用である。
従って、特定のヌクレオチド及び本発明に従ったポリヌ
クレオチド含有ワクチン類を、効果や融通性を改良して
調製出来る。
【００８８】本発明の特定のヌクレオチドを含む、改良
型ポリヌクレオチドの本発明実施に際し特に重要なのは
インターフェロンの誘導物質又は促進物質として使うこ
とである。そのようなポリヌクレオチドは一重鎖又は二
重鎖リボヌクレオチド、ｄＳＲＮＡで次の構造を有し、
【化４６】 又は
【化４７】 で、Ａ及びＢは相補的塩基対で、例えば上述の如くピリ
ミジンの５位又はプリンの７位又はグアニンのＮ２、又
はアデニンのＮ６又はシトシンのＮ４に、本発明記載の
有機部分Ｓｉｇで修飾したプリン、７−デアザプリンや
ピリミジンである。これらの部位に修飾を受けたポリヌ
クレオチド類は、会合率や融点測定結果から、比較的非
解裂的又は非解裂二重鎖核酸分子になるのがわかる。イ
ンターフェロンや、他の細胞の又は液性の因子やリンフ
ォカインやサイトカイン類の如き成分の誘導物質として
使用する本発明の特定のポリヌクレオチド類では、次の
式で示す基を付加する。
【化４８】 インターフェロン生産の誘導工程に本発明の特定ｄＳＲ
ＮＡの如き、本発明の特定ポリヌクレオチドを利用する
に際し、ＤＥＡＥ−デキストランがこの工程を促進する
ことが知られている。ＤＥＡＥ−デキストランはｄＳＲ
ＮＡと複合体を形成し、ヌクレアーゼ分解から保護し、
それによりインターフェロンの誘導を促進すると思われ
る。ポリｒｃ：ｒｌはＤＥＡＥ−デキストランと複合体
を形成するとより効率よく細胞に取り込まれることも知
られている。従って本発明の実施に際し、本発明の特定
ｄＳＲＮＡの疎水性やイオン又は荷電性状が重要な因子
であり、このものをインターフェロン生産の誘導に応用
可能にしている。インターフェロンの誘導を促進するこ
の様な条件や因子は又リンフォカインやサイトカインな
どの他の細胞性及び液性成分の誘導をし又は促進する。
従って、特定ヌクレオチドや本発明の特定のヌクレオチ
ド含有ポリヌクレオチドは単にインターフェロン生産の
誘導物質として有効というよりも免疫調節物質及び促進
物質として作用する。本発明実施に従った上記目的のた
めの優れた作用剤としてはヌクレオチドを含み、その中
のＳｉｇ部分がビオチン又はストレプトアビジン又はア
ビジンを取込む。ポリｒｌ：ポリｒｃ複合ホリレーリジ
ンは補助活性を示し、その作用は、ポリｒｌとポリｒｃ
成分が本発明に従った特定ヌクレオチドを１つかもっと
多く含む時には、本発明実施に従って、促進及び改良さ
れる。
【００８９】本発明に従ったＤＮＡプローブ調製を、本
明細書記載の特定ヌクレオチドの調製又は利用を要しな
い方法で行うことができる。例えば二重鎖ＤＮＡは発癌
物質やアルキル化剤と反応する。発癌物質が二重鎖ＤＮ
Ａと反応したり又アルキル化した後、生成した修飾ＤＮ
Ａを融かしＤＮＡと発癌物質又はアルキル化剤の反応生
成物を含むＤＮＡハイブリド形成プローブを作る。この
様に修飾又は反応したＤＮＡを、ハイブリド形成プロー
ブとして使う時には生成した二重らせん又は二重鎖ＤＮ
Ａを二重抗体法により検定又は検査する。主要抗体は抗
発癌物質で二次抗体はわさび−ペルオキシダーゼ共役抗
ペルオキシダーゼ抗体である。この技術の長所は二重鎖
ＤＮＡを標識するのが容易であるということである。こ
の方法を本発明記載の例で示し、これは一般に二重鎖又
は二重らせんＤＮＡからＤＮＡプローブを調製すること
に応用出来る。しかしながら、この方法は二重らせんデ
オキシリボヌクレオチドポリマー又はＤＮＡの修飾を伴
う解裂的方法である。本発明実施中用いた又は開発した
特定のヌクレオチド及び修飾ＤＮＡに関する記述で、モ
ノ、オリゴ、及びポリサッカライドに関し述べてきた。
モノ、オリゴ及びポリサッカライド誘導体が又本発明の
特定ヌクレオチドの調製に有用である。例えば、特定ヌ
クレオチドの組立てに使う各糖部分を修飾でき、生成す
る修飾糖部分を使って、更に多くの化学反応を起す或い
は行わせることができる。この様な修飾モノ、オリゴ及
びポリサッカライドを、本発明の特定ヌクレオチド調製
の際のＳｉｇ部分として用いれば、糖Ｓ又はそれに由来
するＳｉｇ部分として、その様な修飾サッカライドを含
むヌクレオチドや他の成分の検出に関し、融通性が追加
される。
【００９０】本発明の他の面として、Ｓｉｇ部分をヌク
レオチドに付加させる代りに、蛋白に付加しても使用で
きる。その様な蛋白をヌクレオチドやポリヌクレオチド
に付加できるのみならず、それがヌクレオチド又はポリ
ヌクレオチドに付加するかしないかに拘らず、その様な
蛋白それ自体を確認できる。本発明をこの方面に関し実
施する上で適当な上述の如き蛋白付加物としては次式の
如き式を有するものが挙げられる。
【化４９】 ここでＲ１はＯＨ又はアミノ酸又は酸、Ｒ２はアミノ酸
側鎖、そしてＲ３はＨ又はアミノ酸又は酸で、Ｓｉｇは
Ｒ１及び／又はＲ２及び／又はＲ３に付加する。
【００９１】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はグリコシル化ＤＮＡとコンカナバリンＡ
との結合による沈でん生成をコンカナバリンＡ濃度に対
して調べた結果を示す。
【図２】図２（Ａ）、（Ｂ）はラムダＤＮＡおよびＴ４
ＤＮＡのコンカナバリンＡ−セファロースとの結合の結
果を示す。
【図３】図３（Ａ）、（Ｂ）はＴ４ＤＮＡとコンカナバ
リンＡ−セファロースとの結合に対するマンノースの影
響を示す。
【図４】図４（Ａ）、（Ｂ）はマルトトリオース置換ラ
ムダＤＮＡのコンカナバリンＡ−セファロースへの結合
を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年６月３０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｚ Ｃ１２Ｎ 9/00 9359−4Ｂ 15/52 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 7055−2Ｊ // Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 7823−4Ｂ (72)発明者 スタンレイ クライン アメリカ合衆国ニユーヨーク州ブルツクリ ン，リンカーン プレース 235 (72)発明者 ジヤニス ジー．スタブリアノポウロス アメリカ合衆国ニユーヨーク州ニユーヨー ク，ウエスト フイフテイナイン ストリ ート 515 (72)発明者 ドリー カーテイカー アメリカ合衆国ニユーヨーク州エルムハー スト，エイテイ ストリート 42−72

Claims (296)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 一般式Ｐ−Ｓ−Ｂ−Ｓｉｇを有し、上記
    式中Ｐはリン酸部分であり、Ｓは糖或いは単糖部であ
    り、Ｂは塩基部分であってリン酸部分は該ヌクレオチド
    がデオキシリボヌクレオチドである場合には糖部分の
    ３′および／又は５′位に結合し、該ヌクレオチドがリ
    ボヌクレオチドである場合には２′，３′および／又は
    ５′位に結合し、該塩基はプリン又はピリミジンであっ
    て該塩基がピリミジン又はプリンである時に該塩基はそ
    れぞれＮ１位又はＮ９位より糖部分の１′位に結合し、
    上記式中Ｓｉｇは該ヌクレオチドの塩基Ｂに共有結合す
    る化学的部分であり、該Ｓｉｇは該塩基Ｂと結合すると
    それ自身を信号表示することが出来、或いはそれ自身を
    自己検出し、又はその存在を知らしめるようなヌクレオ
    チド。
  2. 【請求項２】 該ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオ
    チドである特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 該ヌクレオチドがリボヌクレオチドであ
    る特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 式中該化合物部分ＳｉｇがＢが７−デア
    ザプリンである時はＮ７位でＢと結合し、Ｂがピリミジ
    ンである時はＣ５位でまたＢがプリンである時にはＣ８
    位で結合しているような特許請求の範囲第１項記載のヌ
    クレオチド。
  5. 【請求項５】 特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチ
    ドで、式中Ｓｉｇが、該ヌクレオチド含有のオリゴヌク
    レオチド或いはポリヌクレオチドが二重鎖ＲＮＡ、二重
    鎖ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成する
    ことが出来るような部位でＢと結合し、或いは該ヌクレ
    オチドが該オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに
    取り込まれているヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 式中Ｓｉｇが、該ヌクレオチドが二重鎖
    ＲＮＡ、二重鎖ＤＮＡ或いは二重鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイ
    ブリッドに取り込まれ或いは上記二重鎖を形成するよう
    な部位でＢと結合しているような特許請求の範囲第１項
    記載のヌクレオチド。
  7. 【請求項７】 該ヌクレオチドが二重鎖ＤＮＡ又は二重
    鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに取り込ま
    れ、又は結合し、又は連結すると化学的部分Ｓｉｇがそ
    れ自身を信号表示が出来、或いはそれ自身で自己検出或
    いはその存在を知らせるような部位でＢと結合している
    ような特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチド。
  8. 【請求項８】 特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチ
    ド１個又はそれ以上から成るオリゴヌクレオチド或いは
    ポリデオキシリボヌクレオチド。
  9. 【請求項９】 特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチ
    ド１個又はそれ以上より成るオリゴヌクレオチド或いは
    ポリリボヌクレオチド。
  10. 【請求項１０】 式中該Ｓｉｇが、該塩基Ｂがピリミジ
    ンである時は、Ｃ５位で塩基Ｂに結合し、該塩基がデア
    ザプリンである時はＣ７位で結合している特許請求の範
    囲第１項記載のヌクレオチド。
  11. 【請求項１１】 式中該Ｓｉｇ化学的部分が少なくとも
    ４個の炭素原子を含む脂肪族系化学基である特許請求の
    範囲第１項記載のヌクレオチド。
  12. 【請求項１２】 式中該塩基Ｂがピリミジンであり、Ｓ
    ｉｇ化学部分がピリミジンのＮ３位に結合している特許
    請求の範囲第１項記載のヌクレオチド。
  13. 【請求項１３】 式中該Ｓｉｇ化学部分が少なくとも３
    個の炭素原子および少なくとも１個の二重結合を有する
    脂肪族系化学部分である特許請求の範囲第１項記載のヌ
    クレオチド。
  14. 【請求項１４】 式中該塩基Ｂがピリミジンであり、該
    Ｓｉｇ化学部分がピリミジンとＣ５位で結合している特
    許請求の範囲第１項記載のヌクレオチド。
  15. 【請求項１５】 式中該塩基Ｂがピリミジンであり、該
    Ｓｉｇ化学部分がピリミジンとＣ６位で結合している特
    許請求の範囲第１項記載のヌクレオチド。
  16. 【請求項１６】 式中該塩基Ｂがプリンであり、該Ｓｉ
    ｇ化学部分がプリンとＮ１位で結合している特許請求の
    範囲第１項記載のヌクレオチド。
  17. 【請求項１７】 式中該塩基Ｂがプリンであり、該Ｓｉ
    ｇ化学部分がプリンとＣ２位で結合している特許請求の
    範囲第１項記載のヌクレオチド。
  18. 【請求項１８】 式中該塩基Ｂがプリンであり、該Ｓｉ
    ｇ化学部分がプリンとＮ３位で結合している特許請求の
    範囲第１項記載のヌクレオチド。
  19. 【請求項１９】 式中該塩基Ｂがプリンであり、該Ｓｉ
    ｇ化学部分がそれぞれ少なくとも６個或いは少なくとも
    ５個の炭素原子を含有する芳香族或いは環状脂肪族基を
    含む特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチド。
  20. 【請求項２０】 式中該塩基Ｂがプリンであり、該Ｓｉ
    ｇ化学的成分がプリンとＮ７位で結合している特許請求
    の範囲第１項記載のヌクレオチド。
  21. 【請求項２１】 式中該塩基Ｂがプリンであり、該Ｓｉ
    ｇ化学的成分がプリンとＣ８位で結合している特許請求
    の範囲第１項記載のヌクレオチド。
  22. 【請求項２２】 式中該Ｓ糖がペントースである特許請
    求の範囲第１項記載のヌクレオチド。
  23. 【請求項２３】 式中該Ｓｉｇ化学的成分が多糖又はオ
    リゴ糖である特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチ
    ド。
  24. 【請求項２４】 式中該Ｓｉｇ化学的成分がトリオー
    ス、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース
    およびオクトースより成るグループから選ばれた糖であ
    る特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチド。
  25. 【請求項２５】 式中該Ｓｉｇ化学成分がグリコシド結
    合部分が連絡するかグリコシド結合を含む特許請求の範
    囲第１項記載のヌクレオチド。
  26. 【請求項２６】 式中該Ｓｉｇ化学的成分がヘキソース
    部分である特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチド。
  27. 【請求項２７】 式中塩基Ｂが７−デアザプリンであ
    り、該Ｓｉｇ化学的成分がＣ７位で７−デアザプリンと
    結合している特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチ
    ド。
  28. 【請求項２８】 式中該Ｓｉｇ化学的成分が電子高密度
    成分、磁気成分、酵素、ホルモン成分、放射活性成分、
    金属含有成分、蛍光成分および抗原又は抗体成分からな
    るグループより選択される成分から構成される特許請求
    の範囲第１項記載のヌクレオチド。
  29. 【請求項２９】 式中該Ｓｉｇ化学的成分が糖残基であ
    り、該糖が糖又は多糖結合たん白と複合体形成或いは結
    合している特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチド。
  30. 【請求項３０】 該たん白がレクチンである特許請求の
    範囲第２９項記載のヌクレオチド。
  31. 【請求項３１】 該レクチンがコンカナバリンＡである
    特許請求の範囲第３０項記載のヌクレオチド。
  32. 【請求項３２】 該Ｓｉｇ化学的成分がマンノース残基
    より成り、該マンノース残基がコンカナバリンＡと複合
    体形成するか結合している特許請求の範囲第１項記載の
    ヌクレオチド。
  33. 【請求項３３】 式中該Ｓｉｇ化学的成分がＮ−アセチ
    ルグルコサミンより成り、Ｎ−アセチルグルコサミンが
    小麦胚芽アグルチニンと複合体形成或いは結合している
    特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチド。
  34. 【請求項３４】 式中該Ｓｉｇ化学的成分が電子高密度
    成分を含む特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチド。
  35. 【請求項３５】 該レクチンがそれに結合するフェリチ
    ンを含む特許請求の範囲第３０項記載のヌクレオチド。
  36. 【請求項３６】 該コンカナバリンＡがフェリチンに接
    合している特許請求の範囲第３１項記載のヌクレオチ
    ド。
  37. 【請求項３７】 該Ｓｉｇ化学的成分が放射活性同位元
    素を含む或いは包含する特許請求の範囲第１項記載のヌ
    クレオチド。
  38. 【請求項３８】 該放射活性同位元素が放射性コバルト
    である特許請求の範囲第３７項記載のヌクレオチド。
  39. 【請求項３９】 該Ｓｉｇ化学的成分が酵素を含む、或
    いは包含する特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチ
    ド。
  40. 【請求項４０】 該酵素がアルカリフォスファターゼで
    ある特許請求の範囲第３９項記載のヌクレオチド。
  41. 【請求項４１】 該酵素がアシッドフォスファターゼで
    ある特許請求の範囲第３９項記載のヌクレオチド。
  42. 【請求項４２】 該Ｓｉｇ化学的成分が蛍光成分を結合
    して含む、或いは包含する特許請求の範囲第１項記載の
    ヌクレオチド。
  43. 【請求項４３】 該蛍光成分がフルオレセインである特
    許請求の範囲第４２項記載のヌクレオチド。
  44. 【請求項４４】 該Ｓｉｇ化学的成分が磁気成分を会合
    或いは結合して含む、又は包含する特許請求の範囲第１
    項記載のヌクレオチド。
  45. 【請求項４５】 該磁気成分が磁気酸化物より成る特許
    請求の範囲第４４項記載のヌクレオチド。
  46. 【請求項４６】 該磁気酸化物が酸化鉄である特許請求
    の範囲第４５項記載のヌクレオチド。
  47. 【請求項４７】 該Ｓｉｇ化学的部分が抗原性或いはハ
    プテン成分を含み、それらが該成分特異性の抗体と複合
    体形成できる特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチ
    ド。
  48. 【請求項４８】 特許請求の範囲第１項記載のヌクレオ
    チドを１個又はそれ以上含む一重鎖ポリヌクレオチド。
  49. 【請求項４９】 該一重鎖ポリヌクレオチドがポリデオ
    キシリボヌクレオチドである特許請求の範囲第４８項記
    載の一重鎖ポリヌクレオチド。
  50. 【請求項５０】 該一重鎖ポリヌクレオチドがポリリボ
    ヌクレオチドである特許請求の範囲第４８項記載の一重
    鎖ポリヌクレオチド。
  51. 【請求項５１】 特許請求の範囲第１項記載のヌクレオ
    チド１個又はそれ以上より成る二重鎖ポリヌクレオチ
    ド。
  52. 【請求項５２】 該二重鎖ポリヌクレオチドが二重鎖Ｄ
    ＮＡである特許請求の範囲第５１項記載の二重鎖ポリヌ
    クレオチド。
  53. 【請求項５３】 該二重鎖ポリヌクレオチドが二重鎖Ｒ
    ＮＡである特許請求の範囲第５１項記載の二重鎖ポリヌ
    クレオチド。
  54. 【請求項５４】 該二重鎖ポリヌクレオチドが二重鎖Ｄ
    ＮＡ−ＲＮＡハイブリッドである特許請求の範囲第５１
    項記載の二重鎖ポリヌクレオチド。
  55. 【請求項５５】 特許請求の範囲第１項記載のヌクレオ
    チド１個又はそれ以上を含み、ポリペプチドと共役或い
    は結合し、該ポリペプチドが１個又はそれ以上のビオチ
    ン基を結合して有するポリヌクレオチド。
  56. 【請求項５６】 該ポリペプチドがポリリジンである特
    許請求の範囲第５５項記載のポリヌクレオチド。
  57. 【請求項５７】 ポリペプチドと共役又は結合し、該ポ
    リペプチドが１個又はそれ以上のストレプトアビジンユ
    ニットを結合して有するポリヌクレオチド。
  58. 【請求項５８】 少なくとも一方の端にポリペプチドを
    つなぐか結合していて該ポリペプチドが１個又はそれ以
    上の酵素グループを結合して有するポリヌクレオチド。
  59. 【請求項５９】 ポリペプチドと共役又は結合し、該ポ
    リペプチドが１個又はそれ以上のビオチン基を結合して
    有する一重鎖ポリデオキシリボヌクレオチド。
  60. 【請求項６０】 ポリペプチドと共役又は結合し、該ポ
    リペプチドが１個又はそれ以上のビオチン基を結合して
    有する一重鎖ポリリボヌクレオチド。
  61. 【請求項６１】 少なくとも１２個のヌクレオチドより
    成り、該ヌクレオチドのうち少なくとも１個は特許請求
    の範囲第１項記載のヌクレオチドである一重鎖ポリヌク
    レオチド。
  62. 【請求項６２】 多糖と共役又は結合したポリヌクレオ
    チド。
  63. 【請求項６３】 該多糖が植物結合たん白と結合してい
    るか複合体を形成している特許請求の範囲第６２項記載
    のポリヌクレオチド。
  64. 【請求項６４】 該たん白がコンカナバリンＡである特
    許請求の範囲第６２項記載のポリヌクレオチド。
  65. 【請求項６５】 該塩基Ｂがシトシンである特許請求の
    範囲第１項記載のヌクレオチド。
  66. 【請求項６６】 該塩基Ｂがウラシルである特許請求の
    範囲第１項記載のヌクレオチド。
  67. 【請求項６７】 該塩基Ｂがチミンである特許請求の範
    囲第１項記載のヌクレオチド。
  68. 【請求項６８】 該塩基Ｂがアデニンである特許請求の
    範囲第１項記載のヌクレオチド。
  69. 【請求項６９】 該塩基Ｂがグアニンである特許請求の
    範囲第１項記載のヌクレオチド。
  70. 【請求項７０】 該塩基Ｂが２−メチルアデニンであ
    る、特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチド。
  71. 【請求項７１】 該塩基Ｂが１−メチルグアニンであ
    る、特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチド。
  72. 【請求項７２】 該塩基Ｂが５−メチルシトシンである
    特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチド。
  73. 【請求項７３】 該塩基Ｂが５−ヒドロキシメチルシト
    シンである特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチド。
  74. 【請求項７４】 該Ｓｉｇ化学的部分がキレート剤より
    成る特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチド。
  75. 【請求項７５】 該塩基Ｂがデアザアデニンである特許
    請求の範囲第１項記載のヌクレオチド。
  76. 【請求項７６】 該塩基Ｂがデアザグアニンである特許
    請求の範囲第１項記載のヌクレオチド。
  77. 【請求項７７】 該Ｓｉｇ化学的部分が該塩基Ｂと化学
    結合を通して連結している特許請求の範囲第１項記載の
    ヌクレオチド。
  78. 【請求項７８】 該化学結合が塩基Ｂからα−位にオレ
    フイン結合を含む特許請求の範囲第７７項記載のヌクレ
    オチド。
  79. 【請求項７９】 該化学結合が−ＣＨ２−ＮＨ−なる部
    分を含む特許請求の範囲第７７項記載のヌクレオチド。
  80. 【請求項８０】 該化学結合が−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−
    ＮＨ−である特許請求の範囲第７７項記載のヌクレオチ
    ド。
  81. 【請求項８１】 該化学的部分が 範囲第１項記載のヌクレオチド。
  82. 【請求項８２】 ループから選ばれる部分から選択されるか部分を含む特
    許請求の範囲第１項記載のヌクレオチド。
  83. 【請求項８３】 該Ｓｉｇ化学的部分が触媒金属成分を
    含むかより成る特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチ
    ド。
  84. 【請求項８４】 該酵素がβ−ガラクトシダーゼである
    特許請求の範囲第３９項記載のヌクレオチド。
  85. 【請求項８５】 該酵素がグルコースオキシダーゼであ
    る特許請求の範囲第３９項記載のヌクレオチド。
  86. 【請求項８６】 該酵素が西洋わさびペルオキシダーゼ
    である特許請求の範囲第３９項記載のヌクレオチド。
  87. 【請求項８７】 該蛍光成分がフルオレセインである特
    許請求の範囲第４２項記載のヌクレオチド。
  88. 【請求項８８】 該蛍光成分がロダミンである特許請求
    の範囲第４２項記載のヌクレオチド。
  89. 【請求項８９】 該蛍光成分がダンシルである特許請求
    の範囲第４２項記載のヌクレオチド。
  90. 【請求項９０】 該Ｓｉｇ化学的部分が該化学結合の−
    ＮＨ−基に結合している特許請求の範囲第８０項記載の
    ヌクレオチド。
  91. 【請求項９１】 該Ｓｉｇ化学的部分が多糖より成る特
    許請求の範囲第９０項記載のヌクレオチド。
  92. 【請求項９２】 該Ｓｉｇ化学的部分がビオチンである
    特許請求の範囲第９０項記載のヌクレオチド。
  93. 【請求項９３】 該Ｓｉｇ化学的部分がストレプトアビ
    ジンである特許請求の範囲第９０項記載のヌクレオチ
    ド。
  94. 【請求項９４】 該化学結合に結合している該Ｓｉｇ化
    学的部分が単糖である特許請求の範囲第８２項記載のヌ
    クレオチド。
  95. 【請求項９５】 該化学結合に結合する該Ｓｉｇ化学的
    部分がストレプトアビジンである特許請求の範囲第８２
    項記載のヌクレオチド。
  96. 【請求項９６】 該たん白がレクチンである特許請求の
    範囲第６３項記載のポリヌクレオチド。
  97. 【請求項９７】 該ポリヌクレオチドが末端で該多糖に
    連結している特許請求の範囲第６２項記載のポリヌクレ
    オチド。
  98. 【請求項９８】 該ポリリボヌクレオチドが末端で該ポ
    リペプチドと連結又は結合している特許請求の範囲第６
    ０項記載のポリリボヌクレオチド。
  99. 【請求項９９】 該ポリデオキシリボヌクレオチドが末
    端で該ポリペプチドと連結又は結合する特許請求の範囲
    第５９項記載のポリデオキシリボヌクレオチド。
  100. 【請求項１００】 該ポリヌクレオチドが末端で該ポリ
    ペプチドと連結又は結合している特許請求の範囲第５５
    項記載のポリヌクレオチド。
  101. 【請求項１０１】 、Ｓは糖部分、Ｂは塩基部分であって、リン酸部分は糖
    の２′，３′および／又は５′位に結合し、該塩基Ｂは
    該塩基がピリミジン或いはプリンの場合にそれぞれＮ１
    位或いはＮ９位から糖の１′位に結合し、そして式中該
    Ｓｉｇは糖Ｓに共有結合する化学的部分であって該糖Ｓ
    に結合すると自己信号表示することが出来、又は自己検
    出或いはその存在を知らしめることが出来るようなリボ
    ヌクレオチド。
  102. 【請求項１０２】 該Ｓｉｇ化学的部分が該糖部分のＣ
    ２′位に結合している特許請求の範囲第１０１項記載の
    リボヌクレオチド。
  103. 【請求項１０３】 該Ｓｉｇ化学的部分が該糖部分のＣ
    ３′位に結合している特許請求の範囲第１０１項記載の
    リボヌクレオチド。
  104. 【請求項１０４】 該Ｓｉｇ化学的部分が該リボヌクレ
    オチドを含むオリゴリボヌクレオチド或いはポリリボヌ
    クレオチドが、該リボヌクレオチドが該オリゴリボヌク
    レオチド或いは該ポリリボヌクレオチドに取り込まれた
    時、二重鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形
    成することが出来るように糖部分Ｓと結合している特許
    請求の範囲第１０１項記載のリボヌクレオチド。
  105. 【請求項１０５】 特許請求の範囲第１０１項記載のリ
    ボヌクレオチドを少なくとも１個含むポリリボヌクレオ
    チド。
  106. 【請求項１０６】 該塩基Ｂがピリミジンである特許請
    求の範囲第１項記載のリボヌクレオチド。
  107. 【請求項１０７】 該塩基Ｂがプリンである特許請求の
    範囲第１０１項記載のリボヌクレオチド。
  108. 【請求項１０８】 該塩基Ｂがウラシルである特許請求
    の範囲第１０１項記載のリボヌクレオチド。
  109. 【請求項１０９】 該塩基Ｂがアデニンである特許請求
    の範囲第１０１項記載のリボヌクレオチド。
  110. 【請求項１１０】 該塩基Ｂがグアニンである特許請求
    の範囲第１０１項記載のリボヌクレオチド。
  111. 【請求項１１１】 該塩基Ｂがシトシンである特許請求
    の範囲第１０１項記載のリボヌクレオチド。
  112. 【請求項１１２】 該塩基Ｂが７−デアザプリンである
    特許請求の範囲第１０１項記載のリボヌクレオチド。
  113. 【請求項１１３】 該Ｓｉｇ化学的成分が多糖又はオリ
    ゴ糖である特許請求の範囲第１０１項記載のリボヌクレ
    オチド。
  114. 【請求項１１４】 該Ｓｉｇ化学的成分が単糖である特
    許請求の範囲第１０１項記載のリボヌクレオチド。
  115. 【請求項１１５】 該Ｓｉｇ化学的成分がトリオース、
    テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトースおよ
    びオクトースより成るグループから選ばれる単糖である
    特許請求の範囲第１０１項記載のリボヌクレオチド。
  116. 【請求項１１６】 該Ｓｉｇ化学的成分が糖残基であ
    り、該糖残基が糖或いは多糖結合たん白と複合体と形成
    するか結合している特許請求の範囲第１０１項記載のリ
    ボヌクレオチド。
  117. 【請求項１１７】 該たん白がレクチンである特許請求
    の範囲第１１６項記載のリボヌクレオチド。
  118. 【請求項１１８】 該レクチンがコンカナバリンＡであ
    る特許請求の範囲第１１７項記載のリボヌクレオチド。
  119. 【請求項１１９】 該Ｓｉｇ化学的成分が電子高密度成
    分を含む特許請求の範囲第１０１項記載のリボヌクレオ
    チド。
  120. 【請求項１２０】 該電子高密度成分がフェリチンであ
    る特許請求の範囲第１１９項記載のリボヌクレオチド。
  121. 【請求項１２１】 該Ｓｉｇ化学的成分が放射性同位元
    素を含むかより成る特許請求の範囲第１０１項記載のリ
    ボヌクレオチド。
  122. 【請求項１２２】 該放射性同位元素成分が放射性コバ
    ルトである特許請求の範囲第１２１項記載のリボヌクレ
    オチド。
  123. 【請求項１２３】 該Ｓｉｇ化学的成分が触媒金属成分
    より成る特許請求の範囲第１０１項記載のリボヌクレオ
    チド。
  124. 【請求項１２４】 該Ｓｉｇ化学的成分が酵素を含むか
    酵素より成る特許請求の範囲第１０１項記載のリボヌク
    レオチド。
  125. 【請求項１２５】 該酵素がアルカリフォスファターゼ
    である特許請求の範囲第１２４項記載のリボヌクレオチ
    ド。
  126. 【請求項１２６】 該酵素がβ−ガラクトシダーゼであ
    る特許請求の範囲第１２４項記載のリボヌクレオチド。
  127. 【請求項１２７】 該酵素がグルコースオキシダーゼで
    ある特許請求の範囲第１２４項記載のリボヌクレオチ
    ド。
  128. 【請求項１２８】 該酵素が西洋わさびペルオキシダー
    ゼである特許請求の範囲第１２４項記載のリボヌクレオ
    チド。
  129. 【請求項１２９】 該酵素がリボスクレアーゼである特
    許請求の範囲第１２４項記載のリボヌクレオチド。
  130. 【請求項１３０】 該Ｓｉｇ化学的成分がそれに結合し
    て蛍光成分を含むか蛍光成分より成る特許請求の範囲第
    １０１項記載のリボヌクレオチド。
  131. 【請求項１３１】 該蛍光成分がフルオレセインである
    特許請求の範囲第１３０項記載のリボヌクレオチド。
  132. 【請求項１３２】 該蛍光成分がロダミンである特許請
    求の範囲第１３０項記載のリボヌクレオチド。
  133. 【請求項１３３】 該蛍光成分がダンシルである特許請
    求の範囲第１３０項記載のリボヌクレオチド。
  134. 【請求項１３４】 該Ｓｉｇ化学的成分がそれと会合又
    は結合する磁気成分より成る特許請求の範囲第１０１項
    記載のリボヌクレオチド。
  135. 【請求項１３５】 該磁気成分が磁気酸化物である特許
    請求の範囲第１３４項記載のリボヌクレオチド。
  136. 【請求項１３６】 該Ｓｉｇ化学的部分が抗原性又はハ
    プテン成分を含み、それらは該成分に特異的な抗体と複
    合体形成ができる特許請求の範囲第１０１項記載のリボ
    ヌクレオチド。
  137. 【請求項１３７】 特許請求の範囲第１０１項記載のリ
    ボヌクレオチドを１個又はそれ以上含み、少なくとも該
    リボヌクレオチド３個より成る一重鎖ポリリボヌクレオ
    チド。
  138. 【請求項１３８】 少なくとも１２個のリボヌクレオチ
    ドより成り、少なくとも１個の特許請求の範囲第１０１
    項記載のリボヌクレオチドを含有する一重鎖ポリリボヌ
    クレオチド。
  139. 【請求項１３９】 ポリペプチドと共役又は結合してい
    るポリリボヌクレオチド。
  140. 【請求項１４０】 該ポリペプチドが該ポリリボヌクレ
    オチドに末端で結合又はつながっているポリリボヌクレ
    オチド。
  141. 【請求項１４１】 部分、そしてＢは塩基部分であり、該ヌクレオチドがデ
    オキシリボヌクレオチドの時はりん酸部分は糖の３′お
    よび／又は５′位に結合し、該ヌクレオチドがリボヌク
    レオチドの時は２′，３′および／又は５′位に結合
    し、該塩基Ｂはプリン又はピリミジンであって該塩基Ｂ
    は塩基Ｂがピリミジン又はプリンである時それぞれＮ１
    位又はＮ９位から糖の１′位に結合し、Ｓｉｇは化学結
    合 Ｓｉｇは該りん酸部分Ｐと結合した時自己を信号表示
    し、自己検出或いはその存在を知らせることが出来るよ
    うなヌクレオチド。
  142. 【請求項１４２】 一般式Ｐ−Ｓ−Ｂ−Ｓｉｇを有し、
    式中Ｐはりん酸部分であり、Ｓは糖および単糖部分、Ｂ
    は塩基部分であり、りん酸部分は、該ヌクレオチドがデ
    オキシリボヌクレオチドである時には糖部分の３′およ
    び／又は５′位に結合し、該ヌクレオチドがリボヌクレ
    オチドである時には２′，３′および／又は５′位に結
    合し、該塩基はプリン又はピリミジンであって、該塩基
    がピリミジン又はプリンである時該塩基はそれぞれＮ１
    位又はＮ９位より糖部分の１′位に結合し、式中Ｓｉｇ
    は該ヌクレオチドの塩基Ｂに共有結合する化学的部分で
    あり、該Ｓｉｇは塩基Ｂがアデニンである場合Ｎ６又は
    ６−アミノ基に結合し、該塩基Ｂがグアニンである場合
    はＮ２又は２−アミノ基に、該塩基Ｂがシトシンである
    場合にはＮ４又は４−アミノ基に結合し、該Ｓｉｇは該
    塩基Ｂと結合するとそれ自身を信号表示することが出
    来、或いはそれ自身を自己検出し、又はその存在を知ら
    しめるようなヌクレオチド。
  143. 【請求項１４３】 一般式Ｐ−Ｓ−Ｂを有し、式中Ｐは
    りん酸部分、Ｓは糖又は単糖部分、Ｂは塩基部分であ
    り、該ヌクレオチドがＰ又はＳ又はＢに共有結合して化
    学的部分Ｓｉｇを有し、該Ｓｉｇ化学的部分がＰ部分に
    結合している時 結合する時にはＳ部分はリボース基であって、該化学的
    部分ＳｉｇはＰ、Ｓ或いはＢと結合するとそれ自身を信
    号表示でき、それ自身を自己検出又はその存在を知らし
    めるようなヌクレオチド。
  144. 【請求項１４４】 該ヌクレオチドが二重鎖ＲＮＡ、二
    重鎖ＤＮＡ或いは二重鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに
    取り込まれ、上記二重鎖を形成することが出来る特許請
    求の範囲第１４３項記載のヌクレオチド。
  145. 【請求項１４５】 該ヌクレオチドが二重鎖ＤＮＡ又は
    二重鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドにとり込
    まれ、或いは結合すると、該化学的部分Ｓｉｇがそれ自
    身を信号表示することが出来、自己検出し、或いはその
    存在を知らしめるような特許請求の範囲第１４３項記載
    のヌクレオチド。
  146. 【請求項１４６】 特許請求の範囲第１４３項記載のヌ
    クレオチド１個又はそれ以上より成る一重鎖ポリヌクレ
    オチド。
  147. 【請求項１４７】 特許請求の範囲第１４３項記載のヌ
    クレオチド１個又はそれ以上より成る二重鎖ポリヌクレ
    オチド。
  148. 【請求項１４８】 少なくとも１２個のヌクレオチドを
    含有し、特許請求の範囲第１４３項記載のヌクレオチド
    １個又はそれ以上を含む一重鎖ポリデオキシリボヌクレ
    オチド。
  149. 【請求項１４９】 該Ｓｉｇ部分がＢ塩基部分と単糖又
    はオリゴ糖を介して結合している特許請求の範囲第１４
    ３項記載のヌクレオチド。
  150. 【請求項１５０】 該Ｓｉｇ部分が該塩基Ｂ部分と結合
    している単糖又は多糖である特許請求の範囲第１４３項
    記載のヌクレオチド。
  151. 【請求項１５１】 特許請求の範囲第１４３項記載のヌ
    クレオチドを少なくとも１個含むポリヌクレオチド。
  152. 【請求項１５２】 特許請求の範囲第１４９項記載のヌ
    クレオチドを少なくとも１個を含むポリヌクレオチド。
  153. 【請求項１５３】 特許請求の範囲第１５０項記載のヌ
    クレオチドを少なくとも１個含むポリヌクレオチド。
  154. 【請求項１５４】 該Ｓｉｇ化学的部分がインターフェ
    ロンを刺激するか誘導する薬剤より成る特許請求の範囲
    第１４３項記載のヌクレオチド又は第１４３項記載のヌ
    クレオチドを少なくとも１個含むポリヌクレオチド。
  155. 【請求項１５５】 ＤＮＡおよび／又はＲＮＡの生産又
    は合成をすることが出来るおよび／又は作用する生物
    に、効力のあるＤＮＡおよび／又はＲＮＡ合成阻害量の
    特許請求の範囲第１４３項記載のヌクレオチドを投与す
    ることより成るＲＮＡおよび／又はＤＮＡ合成阻害に適
    した化学療法の方法。
  156. 【請求項１５６】 ＤＮＡおよび／又はＲＮＡの生産又
    は合成をすることが出来、かつ／又は作用する生物に、
    効果のあるＤＮＡおよび／又はＲＮＡ合成阻害量の特許
    請求の範囲第１項記載のヌクレオチドを投与することよ
    り成るＲＮＡおよび／又はＤＮＡ合成阻害に適した化学
    療法の方法。
  157. 【請求項１５７】 ＤＮＡおよび／又はＲＮＡの生産或
    いは合成をすることが出来、かつ／又は作用する生物
    に、効果のあるＤＮＡおよび／又はＲＮＡ合成阻害量の
    特許請求の範囲第１０１項記載のヌクレオチドを投与す
    ることより成るＲＮＡおよび／又はＤＮＡ合成阻害に適
    した化学療法の方法。
  158. 【請求項１５８】 ＤＮＡおよび／又はＲＮＡの生産或
    いは合成をすることが出来、かつ／又は作用する生物
    に、効果のあるＤＮＡおよび／又はＲＮＡ合成阻害量の
    特許請求の範囲第１４１項記載のヌクレオチドを投与す
    ることより成るＲＮＡおよび／又はＤＮＡ合成阻害に適
    した化学療法の方法。
  159. 【請求項１５９】 ＤＮＡおよび／又はＲＮＡの生産或
    いは合成をすることが出来、かつ／又は作用する生物
    に、効果のあるＤＮＡおよび／又はＲＮＡ合成阻害量の
    特許請求の範囲第１４２項記載のヌクレオチドを投与す
    ることより成るＲＮＡおよび／又はＤＮＡ合成阻害に適
    した化学療法の方法。
  160. 【請求項１６０】 該ヌクレオチドのＢ塩基部分に糖鎖
    がついている特許請求の範囲第１５５項記載の化学療法
    の方法。
  161. 【請求項１６１】 該ヌクレオチドのＳｉｇ化学的部分
    に抗腫瘍又は細胞毒性剤より成る特許請求の範囲第１５
    ５項記載の化学療法の方法。
  162. 【請求項１６２】 該リンフオカイン、サイトキニンお
    よび／又はインターフェロンが生産でき、かつ／又は作
    用している細胞に、効果のあるリンフオカイン、サイト
    キニンおよび／又はインターフェロン刺激のおよび生産
    誘発の量の特許請求の範囲第１４３項記載のヌクレオチ
    ドを導き、或いは接触させることより成る、リンフオカ
    イン、サイトキニンおよび／又はインターフェロン生産
    のための細胞の刺激又は誘発の方法。
  163. 【請求項１６３】 該リンフオカイン、サイトキニンお
    よび／又はインターフェロンが生産でき、かつ／又は作
    用している細胞に、有効なリンフオカイン、サイトキニ
    ンおよび／又はインターフェロン刺激のおよび生産誘発
    の量の第１項記載のヌクレオチドを導き、或いは接触さ
    せることより成るリンフオカイン、サイトキニンおよび
    ／又はインターフェロン生産のための細胞の刺激又は誘
    発の方法。
  164. 【請求項１６４】 該リンフオカイン、サイトキニンお
    よび／又はインターフェロンが生産でき、かつ／又は作
    用している細胞に、有効なリンフオカイン、サイトキニ
    ンおよび／又はインターフェロン刺激量および生産誘発
    量の第１０１項記載のヌクレオチドを導き、或いは接触
    させることより成るリンフオカイン、サイトキニンおよ
    び／又はインターフェロン生産のための細胞の刺激又は
    誘発の方法。
  165. 【請求項１６５】 該リンフオカイン、サイトキニンお
    よび／又はインターフェロンが生産でき、かつ／又は作
    用している細胞に、有効なリンフオカイン、サイトキニ
    ンおよび／又はインターフェロン刺激量および生産誘発
    量の特許請求の範囲第１４１項記載のヌクレオチドを導
    き、或いは接触させることより成るリンフオカイン、サ
    イトキニンおよび／又はインターフェロン生産のための
    細胞の刺激又は誘発の方法。
  166. 【請求項１６６】 該リンフオカイン、サイトキニンお
    よび／又はインターフェロンが生産でき、かつ／又は作
    用している細胞に、有効なリンフオカイン、サイトキニ
    ンおよび／又はインターフェロン刺激量および生産誘発
    量の特許請求の範囲第１４２項記載のヌクレオチドを導
    き、或いは接触させることより成るリンフオカイン、サ
    イトキニンおよび／又はインターフェロン生産のための
    細胞の刺激又は誘発の方法。
  167. 【請求項１６７】 特許請求の範囲第１項或いは第１０
    １項或いは第１４１項或いは第１４２項或いは第１４３
    項記載のヌクレオチド１個又はそれ以上を含み、ポリペ
    プチドと共役又は結合し、該ポリペプチドは１個又はそ
    れ以上のＳｉｇ化学的部分を結合して有し、該Ｓｉｇは
    該ポリペプチドと結合するとそれ自身を信号表示或いは
    自己検出或いはその存在を知らしめることが出来るよう
    なポリヌクレオチド。
  168. 【請求項１６８】 該ポリペプチドが１個又はそれ以上
    のＳｉｇ化学的部分を結合して有し、該Ｓｉｇ化学的部
    分はポリペプチドと結合するとそれ自身を信号表示、或
    いは自己検出或いはその存在を知らしめることが出来る
    ような、ポリペプチドと共役或いは結合したポリヌクレ
    オチド。
  169. 【請求項１６９】 該Ｓｉｇ化学的部分がキレート剤を
    含む特許請求の範囲第１項、或いは第１０１項或いは第
    １４１項或いは第１４２項或いは第１４３項記載のヌク
    レオチド。
  170. 【請求項１７０】 該キレート剤が化学的部分 【化１】 を含み、式中ＭはＨ又は置換金属である、特許請求の範
    囲第１６９項記載のヌクレオチド。
  171. 【請求項１７１】 式中該金属がマグネシウム又はコバ
    ルトと置換し得る金属である特許請求の範囲第１７０項
    記載のヌクレオチド。
  172. 【請求項１７２】 該Ｓｉｇ化学的部分がキレート剤を
    含む特許請求の範囲第１項或いは第１０１項或いは第１
    ４１項或いは第１４２項或いは第１４３項記載のヌクレ
    オチドを１個又はそれ以上含むポリヌクレオチド。
  173. 【請求項１７３】 式中該Ｓｉｇ化学的部分が特許請求
    の範囲第１７０項記載のキレート剤を含む、特許請求の
    範囲第１項或いは第１０１項或いは１４１項或いは第１
    ４２項或いは第１４３項記載のヌクレオチドを含むポリ
    ヌクレオチド。
  174. 【請求項１７４】 該金属が触媒活性のある金属である
    特許請求の範囲第１７０項記載のヌクレオチド。
  175. 【請求項１７５】 該金属が重金属である特許請求の範
    囲第１７０項記載のヌクレオチド。
  176. 【請求項１７６】 該金属が放射活性コバルトである特
    許請求の範囲第１７０項記載のヌクレオチド。
  177. 【請求項１７７】 該金属がマグネシウムである特許請
    求の範囲第１７０項記載のヌクレオチド。
  178. 【請求項１７８】 該Ｓｉｇ化学的部分がキレート剤を
    含む特許請求の範囲第１項或いは第１０１項或いは第１
    ４１項或いは第１４２項或いは第１４３項記載のリボヌ
    クレオチド。
  179. 【請求項１７９】 該Ｓｉｇ化学的部分がキレート剤を
    含む特許請求の範囲第１項或いは第１０１項或いは第１
    ４１項或いは第１４２項或いは第１４３項に記載のデオ
    キシリボヌクレオチド。
  180. 【請求項１８０】 該金属Ｍが放射活性同位元素である
    特許請求の範囲第１７０項記載のヌクレオチド。
  181. 【請求項１８１】 該金属がプラチナである特許請求の
    範囲第１７０項記載のヌクレオチド。
  182. 【請求項１８２】 該Ｍが水素又は置換し得る金属又は
    放射性元素である特許請求の範囲第１７０項記載のヌク
    レオチド。
  183. 【請求項１８３】 式中Ｍが水素又は金属である化合物 【化２】
  184. 【請求項１８４】 式中Ｍが水素又は金属である、化合
    物 【化３】
  185. 【請求項１８５】 該ヌクレオチドがデオキシリボヌク
    レオチドである特許請求の範囲第１８４項記載の化合
    物。
  186. 【請求項１８６】 該ヌクレオチドがリボヌクレオチド
    である特許請求の範囲第１８４項記載の化合物。
  187. 【請求項１８７】 式中Ｍが水素又は金属である化合物 【化４】
  188. 【請求項１８８】 該Ｓｉｇ化学的部分が化学的成分 【化５】 より成る特許請求の範囲第１項或いは第１０１項或いは
    第１４１項或いは第１４２項或いは第１４３項記載のヌ
    クレオチド。
  189. 【請求項１８９】 特許請求の範囲第１８８項記載のヌ
    クレオチド１個又はそれ以上を含むポリヌクレオチド。
  190. 【請求項１９０】 該ポリヌクレオチドが一重鎖デオキ
    シリボヌクレオチド又は一重鎖リボヌクレオチド又は二
    重鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド
    である特許請求の範囲第１８９項記載のポリヌクレオチ
    ド。
  191. 【請求項１９１】 該Ｓｉｇ部分が糖成分、該糖成分に
    結合できるたん白成分および該たん白成分に結合できる
    糖鎖を有する酵素とを含む特許請求の範囲第１４３項記
    載のヌクレオチド。
  192. 【請求項１９２】 該糖成分が単糖である特許請求の範
    囲第１９１項記載のヌクレオチド。
  193. 【請求項１９３】 該糖成分がオリゴ糖である特許請求
    の範囲第１９１項記載のヌクレオチド。
  194. 【請求項１９４】 該糖成分が多糖である特許請求の範
    囲第１９１項記載のヌクレオチド。
  195. 【請求項１９５】 該たん白成分がレクチンである特許
    請求の範囲第１９１項記載のヌクレオチド。
  196. 【請求項１９６】 該レクチンがコンカナバリンＡ、Ｌ
    ＣＨレンズ豆レクチン、ＰＳＡマメレクチンおよびＢＦ
    Ａソラマメレクチンより成るグループから選ばれる植物
    レクチンである特許請求の範囲第１９１項記載のヌクレ
    オチド。
  197. 【請求項１９７】 該酵素成分がアルカリフォスファタ
    ーゼ、アシッドフォスファターゼおよび西洋わさびペル
    オキシダーゼより成るグループから選ばれる酵素である
    特許請求の範囲第１９１項記載のヌクレオチド。
  198. 【請求項１９８】 Ｓｉｇ部分が結合して含有している
    アミノ酸又はポリペプチド。
  199. 【請求項１９９】 該Ｓｉｇ部分が糖成分を含む特許請
    求の範囲第１９８項記載のアミノ酸又はポリペプチド。
  200. 【請求項２００】 Ｓｉｇ部分を結合して含んでいる単
    糖又は多糖。
  201. 【請求項２０１】 該Ｓｉｇ部分がキレート剤を含む特
    許請求の範囲第２００項記載の単糖又は多糖。
  202. 【請求項２０２】 を含み、式中ｎは２−１０の間の整数である、特許請求
    の範囲第１４３項記載のヌクレオチド。
  203. 【請求項２０３】 を含み、式中ｎは２−１０の間の整数である特許請求の
    範囲第１４３項記載のヌクレオチド。
  204. 【請求項２０４】 第一化合物をそれと複合体を形成す
    ることの出来る第二化合物と、該複合体を形成するよう
    な適当な条件下で接触させ、該複合体は該第一化合物と
    該第二化合物とから成り、さらに該複合体を検出するこ
    とより成る、特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチド
    を該第一化合物として含む第一化合物を検出する方法。
  205. 【請求項２０５】 該第二化合物がポリヌクレオチドで
    ある特許請求の範囲第２０４項記載の方法。
  206. 【請求項２０６】 第一化合物をそれと複合体を形成す
    ることの出来る第二化合物と該複合体を形成するような
    適当な条件下で接触させ、該複合体は該第一化合物と該
    第二化合物とから成り、さらに該複合体を検出すること
    より成る、特許請求の範囲第１０１項記載のヌクレオチ
    ドを該第一化合物として含む第一化合物を検出する方
    法。
  207. 【請求項２０７】 第一化合物をそれと複合体を形成す
    ることの出来る第二化合物と、該複合体を形成するよう
    な適当な条件下で接触させ、該複合体は該第一化合物と
    該第二化合物とから成り、さらに該複合体を検出するこ
    とより成る、特許請求の範囲第１４１項記載のヌクレオ
    チドを該第一化合物として含む第一化合物を検出する方
    法。
  208. 【請求項２０８】 第一化合物をそれと複合体を形成す
    ることの出来る第二化合物と、該複合体を形成するよう
    な適当な条件下で接触させ、該複合体は該第一化合物と
    該第二化合物とから成り、さらに該複合体を検出するこ
    とから成る、特許請求の範囲第１４２項記載のヌクレオ
    チドを該第一化合物として含む第一化合物を検出する方
    法。
  209. 【請求項２０９】 第一化合物をそれと複合体を形成す
    ることの出来る第二化合物と該複合体を形成するような
    適当な条件下で接触させ、該複合体は該第一化合物と該
    第二化合物とから成り、さらに該複合体を検出すること
    から成る特許請求の範囲第１４３項記載のヌクレオチド
    を該第一化合物として含む第一化合物を検出する方法。
  210. 【請求項２１０】 該ＤＮＡ又はＲＮＡ分子に対応す
    る、或いは該ＤＮＡ又はＲＮＡ分子に由来する一重鎖の
    ＤＮＡ又はＲＮＡおよび特許請求の範囲第１項記載のヌ
    クレオチドを含む二重鎖ハイブリッドポリヌクレオチド
    を形成し、該二重鎖を検出することより成るＤＮＡ又は
    ＲＮＡ分子の存在の決定法。
  211. 【請求項２１１】 該ＤＮＡ又はＲＮＡ分子に対応する
    或いは該ＤＮＡ又はＲＮＡ分子に由来する一重鎖のＤＮ
    Ａ又はＲＮＡおよび特許請求の範囲第１０１項記載のヌ
    クレオチドを含む二重鎖ハイブリッドポリヌクレオチド
    を形成し、該二重鎖を検出することから成るＤＮＡ又は
    ＲＮＡ分子の存在の決定法。
  212. 【請求項２１２】 該ＤＮＡ又はＲＮＡ分子に対応する
    又は該ＤＮＡ又はＲＮＡ分子に由来する一重鎖のＤＮＡ
    又はＲＮＡおよび特許請求の範囲第１４１項記載のヌク
    レオチドを含む二重鎖ハイブリッドポリヌクレオチドを
    形成し、該二重鎖を検出することから成るＤＮＡ又はＲ
    ＮＡ分子の存在の決定方法。
  213. 【請求項２１３】 該ＤＮＡ又はＲＮＡ分子に対応す
    る、或いは該ＤＮＡ又はＲＮＡ分子に由来する一重鎖の
    ＤＮＡ又はＲＮＡおよび特許請求の範囲第１４２項記載
    のヌクレオチドを含む二重鎖ハイブリッドポリヌクレオ
    チドを形成し、該二重鎖を検出することから成るＤＮＡ
    又はＲＮＡ分子の存在の決定方法。
  214. 【請求項２１４】 該ＤＮＡ又はＲＮＡ分子に対応す
    る、或いは該ＤＮＡ又はＲＮＡ分子に由来する一重鎖の
    ＤＮＡ又はＲＮＡおよび特許請求の範囲第１４３項記載
    のヌクレオチドを含む二重鎖ハイブリッドポリヌクレオ
    チドを形成し、該二重鎖を検出することから成るＤＮＡ
    又はＲＮＡ分子の存在の決定方法。
  215. 【請求項２１５】 該検体より適当なサンプルを得、該
    サンプル中の該病因物質と天然に結合するＤＮＡ又はＲ
    ＮＡの存在を特許請求の範囲第１項記載の化合物およ
    び、適当条件下で該病因物質と天然に結合する該ＤＮＡ
    又はＲＮＡに対応し、或いはそれより由来する一重鎖Ｄ
    ＮＡ又はＲＮＡを含む二重鎖ポリヌクレオチドを適当条
    件下で形成することにより検出し、該二重鎖ポリヌクレ
    オチドの存在を検出することより成る、検体中の核酸含
    有病因物質の存在検出方法。
  216. 【請求項２１６】 該検体より適当なサンプルを得、該
    サンプル中の該病因物質と天然に結合するＤＮＡ又はＲ
    ＮＡの存在を特許請求の範囲第１０１項記載の化合物お
    よび、適当条件下で該病因物質と天然に結合する該ＤＮ
    Ａ又はＲＮＡに対応し、或いはそれに由来する一重鎖Ｄ
    ＮＡ又はＲＮＡを含む二重鎖ポリヌクレオチドを適当条
    件下で形成することにより検出し、該二重鎖ポリヌクレ
    オチドの存在を検出することより成る、検体中の核酸含
    有病因物質の存在の検出方法。
  217. 【請求項２１７】 該検体より適当なサンプルを得、該
    サンプル中の該病因物質と天然に結合するＤＮＡ又はＲ
    ＮＡの存在を特許請求の範囲第１４１項記載の化合物お
    よび適当条件下で該病因物質と天然に結合する該ＤＮＡ
    又はＲＮＡに対応し、或いはそれに由来する一重鎖ＤＮ
    Ａ又はＲＮＡを含む二重鎖ポリヌクレオチドを適当条件
    下で形成することにより検出し、該二重鎖ポリヌクレオ
    チドの存在を検出することより成る、検体中の核酸含有
    病因物質の存在の検出方法。
  218. 【請求項２１８】 該検体より適当なサンプルを得、該
    サンプル中の該病因物質と天然に結合するＤＮＡ又はＲ
    ＮＡの存在を特許請求の範囲第１４２項記載の化合物お
    よび適当条件下で該病因物質と天然に結合する該ＤＮＡ
    又はＲＮＡに対応し、或いはそれに由来する一重鎖ＤＮ
    Ａ又はＲＮＡを含む二重鎖ポリヌクレオチドを適当条件
    で形成することにより検出し、該二重鎖ポリヌクレオチ
    ドの存在を検出することより成る、検体中の核酸含有病
    因物質の存在の検出方法。
  219. 【請求項２１９】 該検体より適当なサンプルを得、該
    サンプル中の該病因物質と天然に結合するＤＮＡ又はＲ
    ＮＡの存在を特許請求の範囲第１４３項記載の化合物お
    よび適当条件下で該病因物質と天然に結合する該ＤＮＡ
    又はＲＮＡに対応し、或いはそれに由来する一重鎖ＤＮ
    Ａ又はＲＮＡを含む、二重鎖ポリヌクレオチドを適当条
    件で形成することにより検出し、該二重鎖ポリヌクレオ
    チドの存在を検出することより成る、検体中の核酸含有
    病因物質の存在の検出方法。
  220. 【請求項２２０】 該核酸含有病因物質がバクテリア、
    ウイルス或いはカビである特許請求の範囲第２１５項記
    載の方法。
  221. 【請求項２２１】 該抗生物質に対する該バクテリアの
    耐性を示し、特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチド
    を取り込んで含む該バクテリアのＤＮＡ遺伝子配列に相
    補的ポリヌクレオチドを調製し、適当な条件下で該ポリ
    ヌクレオチドを該バクテリアから得られたＤＮＡとハイ
    ブリッド二重鎖を形成するように接触し、該二重鎖の存
    在を検出することより成りその時該二重鎖の検出は該バ
    クテリアが該抗生物質に耐性であることを示し、該二重
    鎖が検出できないのは該バクテリアが抗生物質に感受性
    であることを示すことより成るバクテリアの抗生物質耐
    性決定の試験方法。
  222. 【請求項２２２】 該抗生物質に対する該バクテリアの
    耐性を示し、特許請求の範囲第１０１項記載のヌクレオ
    チドを取りこんで含む該バクテリアのＤＮＡ遺伝子配列
    に相補的ポリヌクレオチドを調製し、適当な条件下で該
    ポリヌクレオチドを該バクテリアから得られるＤＮＡと
    ハイブリッド二重鎖を形成するように接触し、該二重鎖
    の存在を検出することより成り、その時該二重鎖の検出
    は該バクテリアが該抗生物質に耐性であることを示し、
    該二重鎖が検出できないのは該バクテリアが抗生物質に
    感受性であることを示すバクテリアの抗生物質耐性判定
    の試験方法。
  223. 【請求項２２３】 該抗生物質に対する該バクテリアの
    耐性を示し、特許請求の範囲第１４１項記載のヌクレオ
    チドを取りこんで含む該バクテリアのＤＮＡ遺伝子配列
    に相補的ポリヌクレオチドを調製し適当な条件下で該ポ
    リヌクレオチドを該バクテリアから得られるＤＮＡとハ
    イブリッド二重鎖を形成するように接触し、該二重鎖の
    存在を検出することより成り、その時該二重鎖の検出は
    該バクテリアが該抗生物質に耐性であることを示し、該
    二重鎖が検出できないのは該バクテリアが抗生物質に感
    受性であることを示すバクテリアの抗生物質耐性判定の
    試験方法。
  224. 【請求項２２４】 該抗生物質に対する該バクテリアの
    耐性を示し、特許請求の範囲第１４２項記載のヌクレオ
    チドを取り込んで含む該バクテリアのＤＮＡ遺伝子配列
    に相補的ポリヌクレオチドを調製し、適当な条件下で該
    ポリヌクレオチドを該バクテリアより得られるＤＮＡと
    ハイブリッド二重鎖を形成するように接触し、該二重鎖
    の存在を検出することより成り、その時該二重鎖の検出
    は該バクテリアが該抗生物質に耐性であることを示し、
    該二重鎖が検出できないのは該バクテリアが抗生物質に
    感受性であることを示すバクテリアの抗生物質耐性判定
    の試験方法。
  225. 【請求項２２５】 該抗生物質に対する該バクテリアの
    耐性を示し、特許請求の範囲第１４３項記載のヌクレオ
    チドを取りこんで含む該バクテリアのＤＮＡ遺伝子配列
    に相補的ポリヌクレオチドを調製し、適当な条件下で該
    ポリヌクレオチドを該バクテリアより得られるＤＮＡと
    ハイブリッド二重鎖を形成するように接触し、該二重鎖
    の存在を検出することより成り、その時該二重鎖の存在
    は該バクテリアが該抗生物質に耐性であることを示し、
    該二重鎖が検出できないのは該バクテリアが抗生物質に
    感受性であることを示すバクテリアの抗生物質耐性判定
    の試験方法。
  226. 【請求項２２６】 該バクテリアがＳｔｒｅｐｔｏｃｏ
    ｃｃｕｓ ｐｙｏｇｇｅｎｅｓおよびＮｅｉｓｓｅｒｉ
    ａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓより成るグループより選
    択され、該抗生物質がペニシリンである特許請求の範囲
    第２２１項、第２２２項、第２２３項、第２２４項或い
    は第２２５項記載の方法。
  227. 【請求項２２７】 該バクテリアがＳｔａｐｈｙｌｏｃ
    ｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉ
    ｃａｎｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏ
    ｓａ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｕｅｓ
    およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅよ
    り成るグループから選択され、該抗生物質がテトラサイ
    クリンである特許請求の範囲第２２１項記載の方法。
  228. 【請求項２２８】 該バクテリアがＭｙｃｏｂａｃｔｅ
    ｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓであり、該抗生物
    質がアミノ酸糖体である特許請求の範囲第２２１項記載
    の方法。
  229. 【請求項２２９】 該遺伝病と関連し、特許請求の範囲
    第１項記載の化合物を取り込んで含む該検体のＤＮＡ遺
    伝子配列に相補的ポリヌクレオチドを調製し、適当条件
    下で該ポリヌクレオチドを該検体より得られるＤＮＡと
    二重鎖ハイブリッドを形成するように接触させ、該二重
    鎖の存在を検出することより成って、その時該ハイブリ
    ッド二重鎖の存在又は非存在は該遺伝病の存在又は非存
    在を示す検体中の遺伝病の診断の方法。
  230. 【請求項２３０】 該遺伝病と関連し、特許請求の範囲
    第１０１項記載の化合物を取り込んで含む該検体のＤＮ
    Ａ遺伝子配列に相補的ポリヌクレオチドを調製し、適当
    条件下で該ポリヌクレオチドを該検体より得られるＤＮ
    Ａと二重鎖ハイブリッドを形成するように接触させ、該
    二重鎖の存在を検出することより成って、その時該ハイ
    ブリッド二重鎖の存在又は非存在は該遺伝病の存在又は
    非存在を示す検体中の遺伝病の診断の方法。
  231. 【請求項２３１】 該遺伝病と関連し、特許請求の範囲
    第１４１項記載の化合物を取り込んで含む該検体のＤＮ
    Ａ遺伝子配列に相補的ポリヌクレオチドを調製し、適当
    条件下で該ポリヌクレオチドを該検体より得られるＤＮ
    Ａと二重鎖ハイブリッドを形成するように接触させ、該
    二重鎖の存在を検出することより成って、その時該ハイ
    ブリッド二重鎖の存在又は非存在は該遺伝病の存在又は
    非存在を示す検体中の遺伝病の診断方法。
  232. 【請求項２３２】 該遺伝病と関連し、特許請求の範囲
    第１４２項記載の化合物を取り込んで含む該検体のＤＮ
    Ａ遺伝子配列に相補的ポリヌクレオチドを調製し、適当
    条件下で該ポリヌクレオチドを該検体より得られるＤＮ
    Ａと二重鎖ハイブリッドを形成するように接触させ、該
    二重鎖の存在を検出することより成り、その時該ハイブ
    リッド二重鎖の存在又は非存在は該遺伝病の存在又は非
    存在を示す検体中の遺伝病の診断方法。
  233. 【請求項２３３】 該遺伝病と関連し、特許請求の範囲
    第１４３項記載の化合物を取り込んで含む該検体のＤＮ
    Ａ遺伝子配列に相補的ポリヌクレオチドを調製し、適当
    条件下で該ポリヌクレオチドを該検体より得られるＤＮ
    Ａと二重鎖ハイブリッドを形成するように接触させ、該
    二重鎖の存在を検出することより成り、その時該ハイブ
    リッド二重鎖の存在又は非存在は該遺伝病の存在又は非
    存在を示す検体中の遺伝病の診断方法。
  234. 【請求項２３４】 ベータ−マイナス−地中海貧血患者
    に存在せず、特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチド
    を含むＤＮＡ遺伝子配列に相補的ポリヌクレオチドを調
    製し、適当な条件下で該ポリヌクレオチドを該患者から
    得られるＤＮＡと二重鎖ハイブリッドを形成するように
    接触し、そして該二重鎖の存在を決定することより成
    り、その時該二重鎖の非存在はベータ−マイナス−地中
    海貧血の存在を示すヒト患者に於ける地中海貧血の診断
    方法。
  235. 【請求項２３５】 ベータ−マイナス−地中海貧血患者
    に存在せず、特許請求の範囲第１０１項記載のヌクレオ
    チドを含むＤＮＡ遺伝子配列に相補的ポリヌクレオチド
    を調製し、適当な条件下で該ポリヌクレオチドを該患者
    から得られるＤＮＡと二重鎖ハイブリッドを形成するよ
    うに接触し、そして該二重鎖の存在を決定することより
    成り、その時該二重鎖の非存在はベータ−マイナス−地
    中海貧血の存在を示すヒト患者に於ける地中海貧血の診
    断方法。
  236. 【請求項２３６】 ベータ−マイナス−地中海貧血患者
    に存在せず、特許請求の範囲第１４１項記載のヌクレオ
    チドを含むＤＮＡ遺伝子配列に相補的ポリヌクレオチド
    を調製し、適当な条件下で該ポリヌクレオチドを該患者
    から得られるＤＮＡと二重鎖ハイブリッドを形成するよ
    うに接触し、そして該二重鎖の存在を決定することより
    成り、その時該二重鎖の非存在はベータ−マイナス−地
    中海貧血の存在を示すヒト患者に於ける地中海貧血の診
    断の方法。
  237. 【請求項２３７】 ベータ−マイナス−地中海貧血患者
    に存在せず、特許請求の範囲第１４２項記載のヌクレオ
    チドを含むＤＮＡ遺伝子配列に相補的ポリヌクレオチド
    を調製し、適当な条件下で該ポリヌクレオチドを該患者
    から得られるＤＮＡと二重鎖ハイブリッドを形成するよ
    うに接触し、そして該二重鎖の存在を決定することより
    成り、その時該二重鎖の非存在はベータ−マイナス−地
    中海貧血の存在を示すヒト患者に於ける地中海貧血の診
    断の方法。
  238. 【請求項２３８】 ベータ−マイナス−地中海貧血患者
    に存在せず、特許請求の範囲第１４３項記載のヌクレオ
    チドを含むＤＮＡ遺伝子配列に相補的ポリヌクレオチド
    を調製し、適当な条件下で該ポリヌクレオチドを該患者
    から得られるＤＮＡと二重鎖ハイブリッドを形成するよ
    うに接触し、そして該二重鎖の存在を決定することより
    成り、その時該二重鎖の非存在はベータ−マイナス−地
    中海貧血の存在を示すヒト患者に於ける地中海貧血の診
    断方法。
  239. 【請求項２３９】 染色体上に存在する一連の限定した
    遺伝子配列に対応する一連の修飾ポリヌクレオチドを調
    製し、該ポリヌクレオチドは特許請求の範囲第１項記載
    の化合物を１個又はそれ以上含み、該ポリヌクレオチド
    を染色体の或いはそれから得られるＤＮＡとハイブリッ
    ド二重鎖を形成するように接触し、該二重鎖を検出し、
    それにより該染色体上の該二重鎖の位置および該染色体
    上の該遺伝子配列の位置を決定することより成る染色体
    核型分析の方法。
  240. 【請求項２４０】 染色体上に存在する一連の限定した
    遺伝子配列に対応する一連の修飾ポリヌクレオチドを調
    製し、該ポリヌクレオチドは特許請求の範囲第１０１項
    記載の化合物を１個又はそれ以上含み、該ポリヌクレオ
    チドを染色体の或いはそれから得られるＤＮＡとハイブ
    リッド二重鎖を形成するように接触し、該二重鎖を検出
    し、それにより該染色体上の該二重鎖の位置および該染
    色体上の該遺伝子配列の位置を決定することより成る染
    色体核型分析の方法。
  241. 【請求項２４１】 染色体上に存在する一連の限定した
    遺伝子配列に対応する一連の修飾ポリヌクレオチドを調
    製し、該ポリヌクレオチドは特許請求の範囲第１４１項
    記載の化合物を１個又はそれ以上含み、該ポリヌクレオ
    チドを染色体の或いはそれから得られるＤＮＡとハイブ
    リッド二重鎖を形成するように接触し、該二重鎖を検出
    し、それにより該染色体上の該二重鎖の位置および該染
    色体上の該遺伝子配列の位置を決定することより成る、
    染色体核型分析の方法。
  242. 【請求項２４２】 染色体上に存在する一連の限定した
    遺伝子配列に対応する一連の修飾ポリヌクレオチドを調
    製し、該ポリヌクレオチドは特許請求の範囲第１４２項
    記載の化合物を１個又はそれ以上含み、該ポリヌクレオ
    チドを染色体の或いはそれから得られるＤＮＡとハイブ
    リッド二重鎖を形成するように接触し、該二重鎖を検出
    し、それにより該染色体上の該二重鎖の位置および該染
    色体上の該遺伝子配列の位置を決定することより成る、
    染色体核型分析の方法。
  243. 【請求項２４３】 染色体上に存在する一連の限定した
    遺伝子配列に対応する一連の修飾ポリヌクレオチドを調
    製し、該ポリヌクレオチドは特許請求の範囲第１４３項
    記載の化合物を１個又はそれ以上含み、該ポリヌクレオ
    チドを染色体の或いはそれから得られるＤＮＡとハイブ
    リッド二重鎖を形成するように接触し、該二重鎖を検出
    し、それにより該染色体上の該二重鎖の位置および該染
    色体上の該遺伝子配列の位置を決定することより成る染
    色体核型分析の方法。
  244. 【請求項２４４】 特許請求の範囲第１項又は第１０１
    項又は第１４１項又は第１４２項又は第１４３項記載の
    化合物を適当な条件下で該部位と結合し、該化合物の該
    受容体部位への結合をさせておき、そして該受容体部位
    に結合した該化合物を検出することより成る細胞表層の
    ホルモン受容体部位の同定および位置決定の方法。
  245. 【請求項２４５】 悪性細胞に関連する異常受容部位を
    検出することにより悪性細胞を特許請求の範囲第２４４
    項に従って同定し、或いは検出することより成る腫瘍又
    は癌細胞の同定或いは検出法。
  246. 【請求項２４６】 該腫瘍細胞の診断又は同定となるポ
    リペプチドの生産と関連しているＤＮＡ遺伝子配列から
    合成したｍＲＮＡに相補的な、或いは該ＤＮＡ遺伝子配
    列に相補的で特許請求の範囲第１項又は第１０１項又は
    第１４１項又は第１４２項又は第１４３項記載の化合物
    を含有するポリヌクレオチドを調製し、該ポリヌクレオ
    チドを適当な条件下で該細胞と該ポリヌクレオチドが該
    ＤＮＡ遺伝子配列又は該ｍＲＮＡとハイブリッド形成す
    るように接触させ、該ポリヌクレオチドを含む形成ハイ
    ブリッドの生成を検出することより成る腫瘍細胞診断の
    方法。
  247. 【請求項２４７】 その構成分として特許請求の範囲第
    １項、第１０１項、第１４１項、第１４２項又は第１４
    ３項記載の化合物から選択される化合物を含み、該生物
    に含まれる核酸の全て又は同定でき、明確或いは特有な
    部分に相補的なポリヌクレオチドおよびハイブリッド形
    成条件下で該ポリヌクレオチドを該生物の核酸等と接触
    させる時形成する該ポリヌクレオチドと核生物の核酸と
    のハイブリッドの存在、非存在を検出又は表現する方法
    より成る核酸含有生物等の存在を決定するための有効な
    診断キット。
  248. 【請求項２４８】 第２化合物の第１成分と複合体を形
    成するか又は結合でき、該第２化合物は該第１成分及び
    第２成分を含有し、該第２成分は該第１成分に付加又は
    複合体を形成し、該第１化合物と該第２化合物を接触さ
    せて、該第２化合物の該第１成分と該第１化合物とで複
    合体を形成させて、該第１化合物と該第２化合物を含む
    第３化合物を形成し、該生成第３化合物と、該第３化合
    物を組立てている該第２化合物の該第２成分に結合又は
    付加できる第４化合物と接触させ、第１化合物を決定又
    は確認又は診断する方法。
  249. 【請求項２４９】 多部分より成る量の該第２化合物
    を、該第１化合物と別別に接触させるか又は逆も同様で
    あるような、特許請求の範囲第２４８項に従った方法。
  250. 【請求項２５０】 該第１化合物は、第２分子に特異的
    に結合する受容体を持つ分子で、該第２化合物の該第１
    成分が該第１化合物の該受容体部位に特異的に結合で
    き、該第２化合物の該第２成分が糖、オリゴ糖、又は多
    糖であり、該第４化合物がポリペプチドである様な、特
    許請求の範囲第２４８項に従った方法。
  251. 【請求項２５１】 アミノ酸、ペプチド、又は該第１化
    合物を第２の化合物と接触させる蛋白と複合体を形成す
    るか又は結合し、該第２化合物は糖、又はオリゴ糖又は
    多糖に付加又は複合体を形成したアミノ酸、ペプチド及
    び蛋白を含み、該第２化合物は該第１化合物と複合体を
    形成するか又は付加して、該第１化合物と該第２化合物
    を含む第３化合物を形成し、生成する該第３化合物を該
    第３化合物を組立てている該第２化合物の糖やオリゴ糖
    部分と結合するか又は付加できる蛋白又はアミノ酸、又
    はペプチドと接触させて、第１化合物を決定、確認、診
    断する方法。
  252. 【請求項２５２】 第２化合物の第１成分と複合体を形
    成するか又は結合し、該第２化合物は該第１成分を含み
    第２成分が該第１成分に付加又は複合体を形成し、該第
    ２化合物はキレート剤であり、第３成分、該第３成分
    が、該第２成分にキレートしたか又は固定されたイオン
    で、該第１化合物を該第２化合物と接触させることによ
    り、該化合物の該第１成分を該第１化合物と複合体を形
    成させ、該第１化合物と該第２化合物を含む第３化合物
    を形成し、第１化合物を決定、又は確認し、診断する方
    法。
  253. 【請求項２５３】 該第３化合物を組立てている該第２
    化合物の該第３成分が、該第４化合物を伴うか或いは又
    相互作用をするような識別可能な又は検出可能な反応を
    触媒する条件下で該第３化合物を第４化合物と接触又は
    反応させるような、特許請求の範囲第２５２項に従った
    方法。
  254. 【請求項２５４】 第１成分、第２成分及び第３成分を
    含む第１化合物と該受容体部位を接触させ、該第１成分
    は該受容体部位に付加し又は複合体を形成でき、該第２
    成分は該第１成分に付加し、該第３成分は該受容体部位
    と該第１化合物との接触で該第２成分に付加した治療剤
    又は細胞毒性剤を含み、該治療剤や細胞毒性剤が該受容
    体部位に接触又は運ばれ、該第２成分が糖、オリゴ糖及
    びポリペプチドであり、該第３成分は該治療剤や細胞毒
    性剤を含み、更に該第２成分に付加又は固定したアミノ
    酸、又はペプチド、又は蛋白を含み、生物又は人間の特
    定の受容体部位に治療剤や細胞毒性剤を運ぶことを伴う
    化学療法のやり方。
  255. 【請求項２５５】 該受容体分子を含む該生物、原料又
    は組織を第２成分と接触させるような第２の分子に特異
    的に結合する受容体部位を有する受容体分子を含み、該
    第２化合物は該受容体分子と複合体を形成するか又は結
    合できる第１成分を含み、該第２化合物も又第２成分を
    含み、該第２成分は該第１成分に付加するか又は複合体
    を形成し、該第２化合物の該第１成分は該受容体分子と
    接触するとき、該受容体分子と複合体を形成して、該第
    １化合物と該第２化合物を含む、第３化合物を形成し、
    該第３化合物を組立てている該第２化合物の該第２成分
    に結合又は付加できる第４化合物と該第３化合物を接触
    させ、該第２化合物の該第１成分は、アミノ酸、ペプチ
    ド、又は蛋白を含むＡグループからか、又は糖、オリゴ
    糖、又は多糖を含むＢグループからか又はプリン、ピリ
    ミジン、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、又はポリ
    ヌクレオチドを含むＣグループから選択し、該第２化合
    物の該第２成分は糖、オリゴ糖、又は多糖であり、該第
    ４化合物はペプチド又は、ポリペプチド、レクチン、又
    は抗体を含むグループから選択し、生物、細胞性原料及
    び組織中の第１化合物を決定、又は確認、又は診断する
    方法
  256. 【請求項２５６】 該Ｓｉｇ化学的部分が、補酵素を含
    む該ヌクレオチドの塩基Ｂに共有結合しているような、
    特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチド。
  257. 【請求項２５７】 該補酵素をチアミン、ピロリン酸、
    フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレ
    オチド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコ
    チンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、コエンザイ
    ムＡ、ピリドキサールリン酸、ビオチン、テトラヒドロ
    葉酸、コエンザイムＢ１２、リポイン酸、及びアスコル
    ビン酸を含むグループから選択するような、特許請求の
    範囲第２５６項記載のヌクレオチド。
  258. 【請求項２５８】 該補酵素に対応するアポ酵素と該第
    １化合物を接触させることを含む、特許請求の範囲第２
    ５６項記載のヌクレオチドをその構成組成中に含む、第
    １成分の検出方法。
  259. 【請求項２５９】 該補酵素がフラビンアデニンジヌク
    レオチド（ＦＡＤ）で、該アポ酵素がフラビンアデニン
    ジヌクレオチドリダクターゼであるような、特許請求の
    範囲第２５８項に記載の方法。
  260. 【請求項２６０】 該Ｓｉｇ化学部分が補酵素を含むよ
    うな、特許請求の範囲第１０１項記載のリボヌクレオチ
    ド。
  261. 【請求項２６１】 該Ｓｉｇ化学部分が補酵素を含むよ
    うな、特許請求の範囲第１４１項記載のヌクレオチド。
  262. 【請求項２６２】 該Ｓｉｇ化学部分が補酵素を含むよ
    うな、特許請求の範囲第１４２項記載のヌクレオチド。
  263. 【請求項２６３】 該Ｓｉｇ化学部分が補酵素を含むよ
    うな、特許請求の範囲第１４３項記載のヌクレオチド。
  264. 【請求項２６４】 該補酵素に対応するアポ酵素と該第
    １化合物を接触させることを含む、特許請求の範囲第２
    ６３項記載のヌクレオチドを構成組成として含む、第１
    化合物の検出方法。
  265. 【請求項２６５】 該Ｓｉｇ部分が該アミノ酸や、補酵
    素を含むポリペプチドに付加した、特許請求の範囲第１
    ９８項記載のアミノ酸又はポリペプチド。
  266. 【請求項２６６】 該補酵素をチアミンピロリン酸、フ
    ラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオ
    チド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチ
    ンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、コエンザイム
    Ａ、ピリドキサールリン酸、ビオチン、テトラヒドロ葉
    酸、コエンザイムＢ１２、リポイン酸及びアスコルビン
    酸を含むグループから選択する、特許請求の範囲第２６
    ５項記載のアミノ酸又はポリペプチド。
  267. 【請求項２６７】 該補酵素に対応するアポ酵素と該第
    １化合物を接触させることを含む、特許請求の範囲第２
    ６５項記載のアミノ酸やポリペプチドをその構成組成に
    含む第１化合物の検出方法。
  268. 【請求項２６８】 該補酵素が、フラビンアデニンジヌ
    クレオチド（ＦＡＤ）で、該アポ酵素がフラビンアデニ
    ンジヌクレオチドリダクターゼであるような、特許請求
    の範囲第２６７項記載の方法。
  269. 【請求項２６９】 該Ｓｉｇ部分が補酵素を含む該単糖
    又は該多糖であるような、特許請求の範囲第２００項記
    載の単糖又は多糖。
  270. 【請求項２７０】 該補酵素をチアミンピロリン酸、フ
    ラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオ
    チド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチ
    ンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、コエンザイム
    Ａ、ピリドキサールリン酸、ビオチン、テトラヒドロ葉
    酸、コエンザイムＢ１２、リポイン酸、及びアスコルビ
    ン酸を含むグループから選択する、特許請求の範囲第２
    ６９項記載の単糖又は多糖。
  271. 【請求項２７１】 該補酵素に対応するアポ酵素と該第
    １化合物を接触させることを含む、特許請求の範囲第２
    ６９項記載の単糖又は多糖を構成組成として含む第１成
    分の検出方法。
  272. 【請求項２７２】 該補酵素が、フラビンアデニンジヌ
    クレオチド（ＦＡＤ）であり、該アポ酵素がフラビンア
    デニンジヌクレオチドリダクターゼであるような、特許
    請求の範囲第２７１項記載の方法。
  273. 【請求項２７３】 該Ｓｉｇ成分が放射性成分を含むよ
    うな、特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチド。
  274. 【請求項２７４】 該放射性成分が、それに付加した放
    射性標識アビジンを含む、特許請求の範囲第２７３項記
    載のヌクレオチド。
  275. 【請求項２７５】 該Ｓｉｇ成分が、ビオチンに付加し
    た放射性標識ストレプトアビジンを含む、特許請求の範
    囲第２７３項記載のヌクレオチド。
  276. 【請求項２７６】 該Ｓｉｇ成分が放射性であるよう
    な、特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチドを１つ又
    はより多く含む、単鎖ポリヌクレオチド。
  277. 【請求項２７７】 該Ｓｉｇ成分が放射性であるよう
    な、特許請求の範囲第１項記載のヌクレオチドを１つ又
    はより多く含む、二重鎖ポリヌクレオチド。
  278. 【請求項２７８】 該Ｓｉｇ成分が放射性部分を含む、
    特許請求の範囲第１０１項記載のヌクレオチド。
  279. 【請求項２７９】 該Ｓｉｇ部分が放射性に標識された
    特許請求の範囲第１０１項記載のリボヌクレオチドを含
    むポリヌクレオチド。
  280. 【請求項２８０】 該Ｓｉｇ部分が放射性に標識され
    た、特許請求の範囲第１４１項記載のヌクレオチド。
  281. 【請求項２８１】 該Ｓｉｇ部分が放射性に標識され
    た、特許請求の範囲第１４１項記載のヌクレオチドを１
    つ又は多数含むポリヌクレオチド。
  282. 【請求項２８２】 該Ｓｉｇ部分が放射性に標識され
    た、特許請求の範囲第１４２項記載のヌクレオチド。
  283. 【請求項２８３】 該Ｓｉｇ部分が放射性に標識され
    た、特許請求の範囲第１４２項記載のヌクレオチドを１
    つ又は多数含む、ポリヌクレオチド。
  284. 【請求項２８４】 該Ｓｉｇ部分が放射性に標識され
    た、特許請求の範囲第１４３項記載のヌクレオチド。
  285. 【請求項２８５】 該Ｓｉｇ部分が放射性に標識され
    た、特許請求の範囲第１４３項記載のヌクレオチドを１
    つ又は多数含む、ポリヌクレオチド。
  286. 【請求項２８６】 該Ｓｉｇ部分が放射性に標識され
    た、特許請求の範囲第１４３項記載のヌクレオチドを１
    つ又は多数含む単鎖ポリヌクレオチド。
  287. 【請求項２８７】 該Ｓｉｇ部分が放射性に標識され
    た、特許請求の範囲第１４８項記載の単鎖ポリデオキシ
    リボヌクレオチド。
  288. 【請求項２８８】 該Ｓｉｇ部分が放射性に標識され
    た、特許請求の範囲第１項、又は第１０１項又は第１４
    １項又は第１４２項又は第１４３項記載のヌクレオチド
    を１又は多数含むポリヌクレオチド。
  289. 【請求項２８９】 該Ｓｉｇ化学部分が放射性に標識し
    たアビジンを付加したビオチンを含む、特許請求の範囲
    第１項、第１０１項、第１４１項、又は第１４２項又は
    第１４３項記載のヌクレオチドを１つ又は多数含むポリ
    ヌクレオチド。
  290. 【請求項２９０】 該Ｓｉｇ化学部分が、放射性に標識
    したストレプトアビジンに付加したビオチンを含む、特
    許請求の範囲第１項、又は第１０１項、又は第１４１
    項、又は第１４２項、又は第１４３項記載のヌクレオチ
    ドを１つ又は多数含むポリヌクレオチド。
  291. 【請求項２９１】 該Ｓｉｇ化学部分が該ビオチンに付
    加した、ビオチンと放射性に標識したアビジン又はスト
    レプトアビジンを含む、特許請求の範囲第１項、又は第
    １０１項、又は第１４１項、又は第１４２項、又は第１
    ４３項記載のヌクレオチドを１つ又は多数含む、ポリヌ
    クレオチド。
  292. 【請求項２９２】 該ヌクレオチドの該Ｓｉｇ成分が、
    該ポリヌクレオチドと放射性標識アビジンを接触させ
    て、該ビオチンを該放射性標識アビジンに結合させるよ
    うなビオチンを含み、ビオチン結合放射性アビジンの放
    射能を検出することにより、該放射性標識アビジンに結
    合したビオチンの存在を決定する、特許請求の範囲第１
    項、又は第１０１項又は第１４１項、又は第１４２項、
    又は第１４３項記載のヌクレオチドを１つ又は多数含
    む、ポリヌクレオチドの存在を決定する方法。
  293. 【請求項２９３】 該ヌクレオチドの該Ｓｉｇ成分が、
    該ポリヌクレオチドと放射性標識ストレプトアビジンを
    接触させて、該ビオチンを、該放射性ストレプトアビジ
    ンに結合させるようなビオチンを含み、ビオチン結合放
    射性ストレプチアビジンの放射能を検出することによ
    り、該放射性標識ストレプトアビジンに結合したビオチ
    ンの存在を決定する、特許請求の範囲第１項、又は第１
    ０１項、又は第１４１項、又は第１４２項、又は第１４
    ３項記載のヌクレオチドを１つ、又は多数含む、ポリヌ
    クレオチドの存在を決定する方法。
  294. 【請求項２９４】 該Ｓｉｇ部分が放射性標識抗体を含
    む、特許請求の範囲第１項、又は第１０１項、又は第１
    ４１項、又は第１４２項、又は第１４３項記載のヌクレ
    オチドを１つ、又は多数含むポリヌクレオチド。
  295. 【請求項２９５】 該Ｓｉｇ部分が放射性標識蛋白を含
    む、特許請求の範囲第１項、又は第１０１項、又は第１
    ４１項、又は第１４２項、又は第１４３項記載のヌクレ
    オチドを１つ、又は多数含むポリヌクレオチド。
  296. 【請求項２９６】 該Ｓｉｇ部分が放射性標識レクチン
    を含む、特許請求の範囲第１項、又は第１０１項、又は
    第１４１項、又は第１４２項、又は第１４３項記載のヌ
    クレオチドを１つ、又は多数含むポリヌクレオチド。
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