JP2007211025A - オリゴヌクレオチド類似体 - Google Patents

Abstract

この発明は、新規な2環式および3環式ヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体ならびにそのような成分からなるオリゴヌクレオチドに関する。ヌクレオチド類似体、LNA (ロックされたヌクレオシド類似体)、は、相補的な RNA および DNA オリゴマーに対する親和性および特異性に関して、オリゴヌクレオチドに価値ある向上をもたらすことができる。新規なタイプのLNA 修飾オリゴヌクレオチド、ならびにLNA 自体は、診断適用ならびに治療適用の広い範囲において、有用である。これらのうち、アンチセンス適用、PCR 適用、鎖置換オリゴマー、核酸ポリメラーゼの基質として、ヌクレオチドべースの医薬として等が挙げられる。この発明はまた、そのような適用に関している。
【選択図】図２

Description

（発明の分野）
この発明は、２環式および３環式ヌクレオシド類似体の分野および、１本鎖および２本鎖核酸と、核塩基（nucleobase）特異性な２重らせんおよび３重らせんを形成しうる合成オリゴヌクレオチド類の製造において有用な、そのようなヌクレオシド類似体の合成に関する。これら複合体は普通の核酸とから形成された対応する複合体よりも高い熱安定性を示す。この発明はまた、２環式および３環式ヌクレオシド類似体の分野、および治療薬として用いることができかつ、鋳型依存性核酸ポリメラーゼによりオリゴヌクレオチドに組み込むことができる、そのようなヌクレオシド類の製造にも関する。

（発明の背景）
合成オリゴヌクレオチド類は、分子生物学およびDNAベースの診断と治療のような異種の分野で広く用いられている化合物である。

（治療）
治療においては例えば、オリゴヌクレオチド類は、特定のmRNA(メッセンジャーRNA)の生体内での翻訳をブロックしそれによって細胞/有機体にとって望ましくないかあるいは有害であるタンパク質の合成を妨げるのに、有効に用いられてきた。このオリゴヌクレオチド媒介の翻訳ブロックの概念は、"アンチセンス"アプローチとして知られている。機構的には、このハイブリッド化するオリゴヌクレオチドは、翻訳プロセスに対して物理的なブロックを作るかあるいは２重らせんのmRNA部分を特異的に退化させる細胞酵素(RNAseH)をリクルート（recruit）することによって、その効果を惹起すると考えられる。

さらに最近では、RNAse触媒活性と、相補的RNAターゲット(リボザイム)と配列特異的に相互作用する能力とを合わせ有するオリゴリボヌクレオチド類およびオリゴデオキシリボヌクレオチド類およびそれらの類似体が、アンチセンスのプローブとして多くの注目を集めている。これまで、リボザイムは、生体ターゲットおよび腫瘍遺伝子の両方に対して細胞培養において有効であると報告されている。

所定のタンパク質の合成をアンチセンスアプローチによって完全に阻止するためには、その特定のタンパク質をエンコードする全てのmRNAをブロック／破壊する必要があるが、多くの場合、これらのmRNAはかなりの数に上る。通常、特定のタンパク質をエンコードするmRNAは、１あるいは２、３個の遺伝子から転写される。したがって、mRNA生成物よりむしろ遺伝子をターゲットにする("アンチ遺伝子"アプローチ)ことによって、それを同起源とするタンパク質の生成をより効率的に阻害しうるかあるいは所望の効果を惹起するのに必要とされるオリゴヌクレオチドの量を大幅に低減しうるはずである。転写を阻害するために、オリゴヌクレオチドは、特異的に２本鎖DNAへ、配列をハイブリッド化し得なくてはならない。１９５３年、WatsonとCrickは、デオキシリボ核酸 (DNA)が、２つの鎖中の対向する相補的核塩基間に形成された水素結合によってらせん状に組み合わされた２つの鎖で構成されていることを示した(Nature, 1953, 171, 737)。その4つの核塩基は、DNAに共通して見い出されるものであり、グアニン(G)、アデニン(A)、チミン(T)およびシトシン(C)である。このうち、核塩基Gは核塩基Cと対になり、核塩基Aは核塩基Tと対になる。RNAでは、核塩基チミンは核塩基ウラシル(U)と置きかえられ、核塩基Uは核塩基Tと同様に、核塩基Aと対になる。標準的な２重らせん形成に関係する核塩基の化学基は、ワトソン・クリックフェイス （Watson-Crick face）を形成する。１９５９年、フーグスティーン（Hoogsteen）は、プリン核塩基 （GおよびA)が、ワトソン・クリックフェイスに加え、２重らせんの外側から認識され、水素結合を介してピリミジンオリゴヌクレオチドに結合するのに用いられるフーグスティーンフェイス（Hoogsteen face）を有し、それによって三重らせん構造を形成することを示した。三重らせんを形成するオリゴマーは、"アンチ遺伝子"アプローチを概念上可能にするとはいえ、その実用性は、現在のところ、ターゲット遺伝子におけるホモプリン配列モティーフの要件および複合体を安定化させるための生理的に正常でないほどの高いイオン強度と低いｐHの必要性を含む、いくつかの要因によって制限されている。

アプタマーとして知られるオリゴヌクレオチドの用途も、精力的に研究されている。この有望な新しいクラスの治療用オリゴヌクレオチドは、例えばリガンド受容体のような高い親和性を有する所定のターゲットに特異的に結合するように試験管内で選択される。その結合特性は、分子内の核塩基対合により一緒になっている三次元構造を形成するオリゴヌクレオチドの能力を反映しているとみられる。

同様に、ヌクレオシドおよびヌクレオシド類似体は、多数のウイルス感染症や癌の化学療法において有効であることがわかっている。

また、種々のタイプの２本鎖RNAは、いくつかのタイプの癌の成長を有効に抑制することも示されている。

（診断）
分子生物学において、オリゴヌクレオチドは、例えば(i)ターゲット核酸の捕捉、同定および定量におけるハイブリダイゼーションプローブとして、 (ii)ターゲット核酸の精製の親和性プローブとして、(iii)配列決定反応およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のようなターゲット増幅プロセスにおけるプライマーとして、(iv)核酸をクローンし、突然変異化させるものとして、(vi)巨大分子構造集合体での基礎単位として種々の目的に日常的に用いられる。

診断では、上記のオリゴヌクレオチドベースの技術の多く、特に簡便な自動化に適し高感度の再現可能な成果を生みだし易くする技術が利用される。この分野の目標は、例えば(i) 人間、動物および食物における病原性微生物の存在を検査し、(ii)遺伝子学的な疾病素質を検査し、(iii)生得的なあるいは後天的な遺伝学的疾患を特定し、(iv)生物学的沈着物を刑事裁判の容疑者に結びつけ、(v)食物および飲料の生産に関与する微生物の存在を評価する手段として、オリゴヌクレオチドベースの技術を用いることである。

（一般的な考察）
上に概説した様々の広範な適用において有用であるためには、オリゴヌクレオチドは種々の多くの要件を満たさなくてはならない。アンチセンス治療法では例えば、有用なオリゴヌクレオチドであるためには、細胞膜を貫通することができ、細胞外および細胞内ヌクレアーゼに対する耐性が良好であり、好ましくはRNAseHのような内在性酵素をリクルートする能力を備えていなくてはならない。DNAベースの診断および分子生物学では、他の性質、例えば、天然の核酸に作用するように進化した種々の広範な酵素、例えばポリメラーゼ、キナーゼ、リガーゼおよびホスファターゼに対する効率のよい基質として作用するオリゴヌクレオチドの能力が重要である。しかしながら、全ての用途の基礎になるオリゴヌクレオチドの根本的な性質は、ワトソン・クリック水素結合(A-T およびG-C)あるいはフーグスティーンモードのような他の水素結合系を用いて、配列を認識し、特異的にハイブリッド化して相補的１本鎖核酸にする能力である。重要な２つの用語である親和性と特異性は、所定のオリゴヌクレオチドのハイブリッド化特性を特徴づけるのに共通して用いられる。親和性は、オリゴヌクレオチドの、その相補的ターゲット配列に対する結合強度の尺度である（２重らせんの熱安定性（T_m）として表わされる）。２重らせんの各核塩基対によって熱安定性が増し、したがってオリゴヌクレオチドのサイズ（核塩基のNo.）が大きいほど親和性が高くなる。特異性は、完全に相補的ターゲット配列とミスマッチのターゲット配列とを区別するオリゴヌクレオチドの能力の尺度である。換言すると、特異性は、ターゲットにおけるミスマッチの核塩基対に関連した親和性損失の尺度である。オリゴヌクレオチドが一定のサイズの場合、オリゴヌクレオチドとそのターゲットとの間でのミスマッチの数が増すにつれて（すなわち、ミスマッチのパーセンテージが大きくなる）、特異性が大きくなる。反対に、ミスマッチが一定の数の場合、オリゴヌクレオチドのサイズが大きくなるにつれて（すなわち、ミスマッチのパーセンテージが小さくなる）、特異性は小さくなる。別の言い方をすると、オリゴヌクレオチドの親和性の増大は特異性を犠牲にして生じ、逆もまた同じである。

このオリゴヌクレオチドの性質によって、その実用化には多くの問題が生じる。冗長な診断手法では例えば、検査での適切な感度を確保するための高い親和性と、誤った決定的な結果を避けるための高い特異性との両方をオリゴヌクレオチドが有することが必要である。同様に、アンチセンスプローブとして用いられるオリゴヌクレオチドでは、そのターゲットmRNAの翻訳を効率よく阻害するための高い親和性と、他のタンパク質の発現を誤ってブロックするのを避けるための高い特異性との両方を有することが必要である。PCR増幅のような酵素反応では、酵素が活性を発揮する温度範囲でプライマー／ターゲット２重らせんが安定化するに足るだけのオリゴヌクレオチドプライマーの親和性の高さ、および正しいターゲット配列だけが増幅されるに足るだけの特異性の高さが必要がある。

天然のオリゴヌクレオチドのこの欠点を当然のこととすれば、特異性と親和性を高める新しいアプローチは、DNAベースの治療と診断および分子生物学分野での技術全般に非常に有用であるだろう。

（立体配座制限されたヌクレオシド）
オリゴヌクレオチド類は、ターゲット配列へハイブリッド化する過程で、１本鎖の状態の比較的ランダムなコイル構造から、２重らせんの状態の整列された構造へと立体配置が移行することが知られている。

２環式および３環式ヌクレオシド類似体を含む、多数の立体配座制限されたオリゴヌクレオチド(図1Aおよび図1B、そこではB＝核塩基)が合成され、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体に組みこまれ、そのハイブリッド化とその他の性質について分析されている。

付加的なC-3',C-5'-エタノ- 橋かけを有する２環式[3.3.0]オリゴヌクレオシド(bcDNA) (AおよびB)は、５つの核塩基 (G、A、T、CおよびU)全てと合成され、(C)は、T核塩基およびA核塩基とだけ合成されている(M. Tarkoy, M. Bolli, B. Schweizer および C. Leumann, Helv. Chim. Acta, 1993, 76, 481; Tarkoy および C. Leumann, Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 1993, 32, 1432; M. Egli, P. Lubini, M. Dobler および C. Leumann, J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 5855; M. Tarkoy, M. Bolli および C. Leumann, Helv. Chim. Acta, 1994, 77,
716; M. Bolli および C. Leumann, Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 1995, 34, 694; M. Bolli, P. Lubini および C. Leumann, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 2077; J. C. Litten, C. Epple および C. Leumann, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1995, 5, 1231; J. C. Litten および C. Leumann, Helv. Chim. Acta, 1996, 79, 1129; M. Bolli, J. C. Litten, R. Schultz および C. Leumann, Chem.
Biol., 1996, 3, 197; M. Bolli, H. U. Trafelet および C. Leumann, Nucleic Acids Res., 1996, 24, 4660)。これらの類似体の２、３個を含むかあるいはこれらの類似体から全てを構成されているDNAオリゴヌクレオチド類は、ほとんどの場合、相補的DNAオリゴヌクレオチドおよびRNAオリゴヌクレオチドと、ワトソン・クリック型結合の２重らせんを形成することができる。しかしながら、得られた２重らせんの熱安定性は、天然のDNA対およびRNA対の熱安定性よりも顕しく低い(C)、少し低い（A)、同程度である(B)かのいずれかである。全てのbcDNAオリゴマーは、天然の対に比べ、ハイブリッド化媒体のイオン強度に対して著しく高い感度を示した。α-２環式-DNA (B) は、3'-エクソヌクレアーゼ ヘビ毒ホスホジエテラーゼに対してβ-２環式-DNA (A)よりも安定であり、β-２環式-DNA (A)は、修飾されていないオリゴヌクレオチドよりも少しだけより安定である。

シクロペンタン環に付加的C-1',C-6'- あるいはC-6',C-4'-メタノ-橋かけを有するビカルボシクロ[3.1.0]ヌクレオシド （それぞれD および E)は、５つの核塩基(Ｔ、Ａ、Ｇ、ＣおよびＵ)全てと合成されている。しかしながら、T-類似体だけがオリゴマーに組み込まれている。混合ポリピリミジンDNA オリゴヌクレオチドに１あるいは１０個のモノマーDを組み込まれた結果、修飾されていない参照オリゴヌクレオチドに比べ、DNA オリゴヌクレオチドとRNA オリゴヌクレオチドとの両方に対する親和性が実質的に減少した。この減少はssRNA（１本鎖RNA）の場合よりもssDNA(１本鎖DNA)の場合のほうが著しかった。２個の異なるポリ−ピリミジンDNAオリゴヌクレオチドに１個のモノマーEが組み込まれると、修飾されていない参照２重らせんに比べ、ssRNAに対する２重らせんのTmが0.8℃および2.1℃だけ上昇した。１０個のT-類似体がもっぱらホスホロチオエート（phosphorothioate）ヌクレオシド間（internucleoside）結合を有する15量体オリゴヌクレオチドに組み込まれると、相補的RNAオリゴヌクレオチドに対する Tmが、同様の修飾されていないホスホロチオエート配列に比べ、１つの修飾につき約1.3℃上昇した。参照配列とは反対に、２環式ヌクレオシドEを含むオリゴヌクレオチドは、RNAseHの開裂の媒介とならなかった。ＥのＧ、Ａ、ＣおよびＵ−類似体を含むオリゴヌクレオチドのハイブリッド化特性は報告されていない。 また、この類似体の化学的性質は、完全修飾オリゴヌクレオチドに関するいっそうの鋭意な研究には適していない(K.-H. Altmann, R. Kesselring, E. Francotte および G. Rihs, Tetrahedron Lett., 1994, 35, 2331; K.-H. Altmann, R. Imwinkelried, R. Kesselring および G. Rihs, Tetrahedron Lett., 1994, 35, 7625; V. E. Marquez, M. A. Siddiqui, A. Ezzitouni, P. Russ, J. Wang, R. W. Wagner および M. D. Matteucci, J. Med. Chem., 1996, 39, 3739; A. Ezzitouni および V. E. Marquez, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1997, 1073)。

付加的なC-2',C-3'-ジオクサレイン（dioxalane）環を含む２環式[3.3.0]ヌクレオシドは、修飾されていないヌクレオシドとの２量体として合成されているが、ここで、付加的な環は、天然のホスホジエステル結合(F)に代わるヌクレオシド間結合の一部である。この類似体は、チミン−チミンブロックあるいはチミン-5-メチルシトシンブロックのいずれかとして合成されるだけであった。これらの２量体ブロックを７個含むとともにホスホジエステル結合およびリボアセタール結合を交互に有する15量体ポリピリミジン配列では、もっぱら天然のホスホジエステルヌクレオシド間結合を有する参照配列に比べ、相補的ssRNA に対するTmが実質的に低くなった (R. J. Jones, S. Swaminathan, J. F. Millagan, S. Wadwani, B. S. Froehler および M. Matteucci, J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 9816)。

アセタール型のヌクレオシド間結合において付加的な２環式[4.3.0]システムを形成する、付加的なC-2',C-3'-ジオキサン環を有する２個の２量体(ＧおよびＨ)は、Ｔ-Ｔ２量体として合成され、１２量体ポリピリミジンオリゴヌクレオチドの中間に一度組み込まれる。ＧまたはＨのいずれかを含むオリゴヌクレオチドはいずれも、修飾されていない参照オリゴヌクレオチドに比べ、相補的ssRNA および ssDNAに対して安定性の非常に低い２重らせんを形成した (J. Wang および M. D. Matteucci, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1997, 7, 229)。

アミド型およびスルホンアミド型(ＩおよびＪ)ヌクレオシド間結合の一部としてC-2',C-3'-メタノ−橋かけを有する２環式[3.1.0]ヌクレオシドを含む２量体が、合成されオリゴヌクレオチドに組み込まれている。これらの類似体の１個以上を含むオリゴヌクレオチドは、修飾されていない天然の参照オリゴヌクレオチドに比べ、Tmが非常に低下した (C. G. Yannopoulus, W. Q. Zhou, P. Nower,
D. Peoch, Y. S. Sanghvi および G. Just, Synlett, 1997, 378)。

中間にホルムアセタール結合および２環式[3.3.0]グルコース誘導ヌクレオシド類似体(K)を有する３量体は、合成され、オリゴヌクレオチドの3'-末端に連結される。相補的ssRNAに対するTmは、参照配列に比べると4℃低く、3'-末端に２個の2',5'-ホルムアセタール結合を有する配列に比べると1.5℃低かった (C. G. Yannopoulus, W. Q. Zhou, P. Nower, D. Peoch, Y. S. Sanghvi および G. Just, Synlett, 1997, 378)。

ごく最近、３環式ヌクレオシド類似体からなるオリゴマー(L)において、天然のDNAに比べ、２重らせん安定性が増大したことが報告されている(R. Steffens および C. Leumann (Poster SB-B4), Chimia, 1997, 51, 436)。

付加的なC-2',C-3'に結合した６員環(ＭおよびＮ)あるいは５員環(Ｏ)を有する３個の２環式 ([4.3.0] および [3.3.0]) ヌクレオシドがＴ-類似体として合成されている。２環式ヌクレオシドM および N は、１４量体オリゴ−T配列に一度および二度組み込まれる。相補的ssRNA および ssDNA に対するTmは、修飾されていない参照配列に比べ、１つの修飾につき6〜10℃低下した。類似体Ｏの完全に修飾されたオリゴヌクレオチドでは、参照DNAオリゴヌクレオチドに比べ、相補的RNAオリゴヌクレオチドに対して１つの修飾につき約1.0 ℃Tm が上昇した。また、完全に修飾された配列は、修飾されていない参照配列に比べ、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ加水分解に対して実質的により安定であった。しかしながら、Ｏの類似体が最大で４個まで組み込まれた、部分的に修飾されたオリゴヌクレオチドは、対応する修飾されていないオリゴヌクレオチドよりも熱安定性が低かった。類似体O を含む全てのオリゴヌクレオチド（完全に修飾されたオリゴヌクレオチドおよび部分的に修飾されたオリゴヌクレオチドの両方）が、修飾されていないオリゴヌクレオチドに比べ、相補的DNAオリゴヌクレオチドに対して実質的に低い熱安定性を示した(P. Nielsen, H. M. Pfundheller, J. Wengel, Chem. Commun., 1997, 826; P. Nielsen, H. M. Pfundheller, J. Wengel, XII International Roundtable: Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Applications; La Jolla, California, September 15-19, 1996; Poster PPI 43)。

4'-C-ヒドロキシメチルヌクレオシドPから開始して、２環式ウリジンヌクレオシド類似体Qに付加的なO-2',C-4'-五員環を含有させる試みは、失敗した (K. D.
Nielsen, Specialerapport (Odense University, Denmark), 1995)。

現在までのところ、ハイブリッド化特性の非常に高められた合成オリゴヌクレオチド類の製造において有用な立体配座制限されたヌクレオシドの研究はほとんど成功していない。大多数の場合に、これらの類似体を含むオリゴヌクレオチドは、修飾されていないオリゴヌクレオチドに比べ、相補的核酸とより安定性の低い２重らせんを形成する。他の場合には、２重らせんの安定性が少し認められるが、これはDNAターゲットあるいは RNAターゲットにだけ関係するか、あるいは部分的ではなく完全に修飾されたオリゴヌクレオチドに関係するか、もしくは逆もまた同じである。報告されている類似体のほとんどの評価は、G、 A および C核塩基との類似体に関するデータの不足および特異性とハイブリッド化のモードを示すデータの不足によってさらに複雑になっている。 多くの場合には、報告されているモノマー類似体の合成は非常に複雑であり、ある場合には、完全に修飾されたオリゴヌクレオチドの合成は、広く用いられているホスホロアミダイト（phosphoramidite）の化学水準と相容れていない。

発明の要旨
以前に知られているヌクレオシド類似体の欠点から、本発明者はここに新規なヌクレオシド類似体（LNA）を提供し、かつオリゴヌクレオチド類はその中に LNA
ヌクレオシド類似体を含有する。新規な LNA ヌクレオシド類似体は、全ての一般に使用される核塩基を備えており、それによりオリゴヌクレオチド類への組み込み用のヌクレオシド類似体の完全なセットを提供する。以下から明らかなように、LNA ヌクレオシド類似体および LNA 修飾オリゴヌクレオチドは、診断および治療の分野において使用されるオリゴヌクレオチド類に対し広範な改善を提供するものである。さらに、LNA ヌクレオシド類似体および LNA 修飾オリゴヌクレオチドはまた、ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチドをベースとした診断および治療において、完全に新しい前途を提供する。

従って、本発明は、一般式Ｉ:

[式中、Xは -O-、-S-、-N(R^N*)-、-C(R⁶R^6*)-、-O-C(R⁷R^7*)-、-C(R⁶R^6*)-O-、-S-C(R⁷R^7*)-、-C(R⁶R^6*)-S-、-N(R^N*)-C(R⁷R^7*)-、-C(R⁶R^6*)-N(R^N*)- および -C(R⁶R^6*)-C(R⁷R^7*)- から選択され;

B は水素、ヒドロキシ、任意に置換されたC_1-4-アルコキシ、任意に置換されたC_1-4-アルキル、任意に置換されたC_1-4-アシルオキシ、核塩基類、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから選択され;

P は継続するモノマーへのヌクレオシド間結合のためのラジカル位置、または 5'-末端基を意味し、そのようなヌクレオシド結合または5'-末端基は任意に置換基 R⁵ を含有し;

置換基 R²、R^2*、R³ および R^3* の一つは、先行するモノマーへのヌクレオシド間結合または3'-末端基を意味する基 P^* であり、;

R^1*、R^4*、R⁵、R^5*、R⁶、R^6*、R⁷、R^7*、R^N* の存在する置換基から選択される非ジェミナル置換基および P^* を意味しない R²、R^2*、R³ および R^3* の存在する置換基から選択される非ジェミナル置換基の１または２の対は各々、-C(R^aR^b)-、-C(R^a)=C(R^a)-、-C(R^a)=N-、-O-、-Si(R^a)₂-、-S-、-SO₂-、-N(R^a)- および >C=Z ［式中、Z は -O-、-S- および -N(R^a)- から選択され、R^a および R^b は各々独立して水素、任意に置換された C_1-12-アルキル、任意に置換された C_2-12-アルケニル、任意に置換された C_2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C_1-12-アルコキシ、C_2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C_1-12-アルコキシカルボニル、C_1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ- および ジ(C_1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ- およびジ(C_1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノ- およびジ(C_1-6-アルキル)アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、C_1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C_1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C_1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C_1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは任意に置換されてもよく、ここで２つのジェミナル置換基 R^a および R^b は、一緒になって任意に置換されたメチレン（=CH₂）を意味してもよく、ここで R^a、R^b ならびに存在していて P、P^* またはビラジカルに含まれていない置換基 R^1*、R²、R^2*、R³、R^3*、R^4*、R⁵、R^5*、R⁶ および R^6*、R⁷ および R^7* のいずれかから選択される２つの非ジェミナルまたはジェミナル置換基は、一緒になって上記と同じ種類のビラジカル類から選択された結合したビラジカルを形成してもよい］から選択される１〜８の基／原子を含有するビラジカルを意味し;
非ジェミナル置換基の該対は、それにより（ｉ）該非ジェミナル置換基が結合している原子および（ii）いずれかの介在原子と一緒になって単環式またはニ環式のものを形成し;かつ

存在していて P、P^* またはビラジカルに含まれていない置換基 R^1*、R²、R^2*、R³、R^4*、R⁵、R^5*、R⁶ ならびに R^6*、R⁷ および R^7* の各々は、水素、任意に置換された C_1-12-アルキル、任意に置換された C_2-12-アルケニル、任意に置換された C_2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C_1-12-アルコキシ、C_2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C_1-12-アルコキシカルボニル、C_1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ- およびジ(C_1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ- およびジ(C_1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノ- およびジ(C_1-6-アルキル)アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、C_1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C_1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C_1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C_1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから独立して選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは任意に置換されていてもよく、ここで、２つのジェミナル置換基は一緒になってオキソ、チオオキソ、イミノまたは任意に置換されたメチレンを意味してもよく、または任意に -O-、-S- および -(NR^N)- から選択される１以上のヘテロ原子／基により割り込まれかつ／または末尾をなしている1-5の炭素原子アルキレン鎖からなるスピロビラジカルを一緒になって形成してもよく、ここで
R^N は水素および C_1-4-アルキルから選択され、かつここで２つの隣接した（非ジェミナルな）置換基は二重結合を生じる付加的な結合を意味し; かつ R^N* は存在するがビラジカル中に含有されないとき、水素および C_1-4-アルキルから選択され；

ただし、
(i) LNA がニ環式ヌクレオシド類似体であるとき、R² および R³ は一緒になって -O-CH₂-CH₂- および -O-CH₂-CH₂-CH₂- から選択されるビラジカルを意味せず;
(ii) LNA がニ環式ヌクレオシド類似体であるとき、R³ および R⁵ は一緒になって -CH₂-CH₂- 、-O-CH₂- から選択されるビラジカルを意味せず;
(iii) LNA が３環式ヌクレオシド類似体であるとき、R³、R⁵ および R^5* は一緒になってトリラジカル -CH₂-CH(-)-CH₂- を意味せず;
(iv) LNA がニ環式ヌクレオシド類似体であるとき、R^1* および R^6* は一緒になってビラジカル -CH₂- を意味せず; かつ
(v) LNA がニ環式ヌクレオシド類似体であるとき、R^4* および R^6* は一緒になってビラジカル -CH₂- を意味しない］

のヌクレオシド類似体（以後、「LNA」と称する）ならびにその塩基性塩および酸付加塩の少なくとも一つからなるオリゴマー類に関する。

さらにこの発明は、一般式II：

［式中、置換基 B は核塩基、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから選択
され;

X は -O-、-S-、-N(R^N*)- および -C(R⁶R^6*)- から選択され;

置換基 R²、R^2*、R³ および R^3* の一つは基 Q^* であり;

Q および Q^* の各々は、水素、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Prot-O-、Act-O-、メルカプト、Prot-S-、Act-S-、C_1-6-アルキルチオ、アミノ、Prot-N(R^H)-、Act-N(R^H)-、モノ- またはジ(C_1-6-アルキル)アミノ、任意に置換された C_1-6-アルコキシ、任意に置換された C_1-6-アルキル、任意に置換された C_2-6-アルケニル、任意に置換された C_2-6-アルケニルオキシ、任意に置換された C_2-6-アルキニル、任意に置換された C_2-6-アルキニルオキシ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基、リガンド、カルボキシ、スルホノ、ヒドロキシメチル、Prot-O-CH₂-、Act-O-CH₂-、アミノメチル、Prot-N(R^H)-CH₂-、Act-N(R^H)-CH₂-、カルボキシメチル、スルホノメチル（ここで、Prot はそれぞれ -OH、-SH および -NH(R^H) のための保護基であり、Act はそれぞれ -OH、-SH および -NH(R^H) のための活性化基であり、R^H は水素および C_1-6-アルキルから選択される）から独立して選択され;

(i) R^2* および R^4* は一緒になって、-O-、-(CR^*R^*)_r+s+1-、-(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s-、-O-(CR^*R^*)_r+s-O-、-S-(CR^*R^*)_r+s-O-、-O-(CR^*R^*)_r+s-S-、-N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-O-、-O-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-、-S-(CR^*R^*)_r+s-S-、-N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-、-N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-S- および -S-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)- から選択されるビラジカルを意味し;
(ii) R² および R³ は一緒になって、-O-、-(CR^*R^*)_r+s-、-(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s- および -(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s- から選択されるビラジカルを意味し;
(iii) R^2* および R³ は一緒になって、-O-、-(CR^*R^*)_r+s-、-(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s- および -(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s- から選択されるビラジカルを意味し;
(iv) R³ および R^4* は一緒になって、-(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s- および -(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s- から選択されるビラジカルを意味し;
(v) R³ および R⁵ は一緒になって、-(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s- および -(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s- から選択されるビラジカルを意味し;
または
(vi) R^1* および R^4* は一緒になって、-(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s- および -(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s- から選択されるビラジカルを意味し;
(vii) R^1* および R^2* は一緒になって、-(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s- および -(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s- から選択されるビラジカルを意味し;

ここで、各 R^* は水素、ハロゲン、アジド、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、モノ- またはジ(C_1-6-アルキル)アミノ、任意に置換された C_1-6-アルコキシ、任意に置換された C_1-6-アルキル、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから独立して選択され、かつ/または２つの隣接する（非ジェミナルな) R* は、一緒になって二重結合を意味してもよく、かつ r および s の各々は 0 〜 3 であり、ただし r+s の合計は 1 〜 4であり;

Q、Q^* またはビラジカル中に含有されない置換基 R^1*、R²、R^2*、R³、R^4*、R⁵ および R^5* の各々は、水素、任意に置換された C_1-12-アルキル、任意に置換された C_2-12-アルケニル、任意に置換された C_2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C_1-12-アルコキシ、C_2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C_1-12-アルコキシカルボニル、C_1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ- およびジ(C_1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ- およびジ(C_1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノ- およびジ(C_1-6-アルキル)アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、C_1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C_1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C_1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C_1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから独立して選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは任意に置換されてもよく、ここで、２つのジェミナル置換基は一緒になってオキソ、チオオキソ、イミノまたは任意に置換されたメチレンを意味してもよく、または -O-、-S-、および -(NR^N)- から選択される１以上のヘテロ原子／基により任意に割り込まれかつ／または末尾をなしている 1〜5の炭素原子アルキレン鎖からなるスピロビラジカルを一緒になって形成してもよく、ここで R^N は水素および C_1-4-アルキルから選択され、ここで２つの隣接する（非-ジェミナルな）置換基は二重結合を生じる付加的な結合を意味してもよく; かつ R^N* は、存在するがビラジカル中に含有されないときは、水素および C_1-4-アルキルから選択され;

ただし、第１の条付として、
(i) R² および R³ は一緒になって -O-CH₂-CH₂- および -O-CH₂-CH₂-CH₂- から選択されるビラジカルを意味せず; かつ
(ii) R³ および R⁵ は一緒になって -CH₂-CH₂-、-O-CH₂- および -O-Si(ⁱPr)₂-O-Si(ⁱPr)₂-O- から選択されるビラジカルを意味せず;
ただし、第２の条件として、オリゴヌクレオチド合成で普及している条件下で反応性ないかなる化学基（核塩基を含む）も、任意に保護された官能基である］
のヌクレオシド類似体（以後、LNA）ならびにそれらの塩基性塩および酸付加塩に関する。

この発明は、オリゴマー製造用ヌクレオシド類似体(LNA)の使用ならびに診断、分子生物学研究および治療におけるオリゴマーおよびヌクレオシド類似体(LNA)の使用にも関する。

（この発明の詳細な説明）
ここで使用されるとき、用語「LNA」 (ロックされたヌクレオシド類似体) は、この発明のオリゴマー（一般式Ｉ）に組みこまれたか、または分離した化学種（一般式II）として、この発明の２環式または３環式ヌクレオシド類似体を意味する。用語「モノマー性 LNA」は、特に後者の場合を意味する。

（オリゴマーおよびヌクレオシド類似体）
上述のとおり、この発明は、i.a.１またはそれ以上の２環式、３環式または多環式ヌクレオシド類似体（これ以後、「LNA」と称する）からなる新規オリゴマー類（オリゴヌクレオチド類）に関する。例えば公知ヌクレオシドの代わりに、または追加として、そのような LNA の組み込みにより、オリゴヌクレオチドに興味深い非常に有益な物性を与えることが見出されている。２環式および３環式、特に２環式、LNA は、この発明の範囲内で特に興味深いようである。

オリゴマー（オリゴヌクレオチド）中に組みこまれた可能な LNA の各々は、一般式Ｉ

［ここで、X は、-O- (フラノースモチーフ)、-S-、-N(R^N*)-、-C(R⁶R^6*)-、-O-C(R⁷R^7*)-、-C(R⁶R^6*)-O-、-S-C(R⁷R^7*)-、-C(R⁶R^6*)-S-、-N(R^N*)-C(R⁷R^7*)-、-C(R⁶R^6*)-N(R^N*)- および -C(R⁶R^6*)-C(R⁷R^7*)-（ここで、R⁶、R^6*、R⁷、R^7* および R^N* は以下に定義するとおりである）から選択される］
を有する。従って、オリゴマー中に組みこまれた LNA は、２環式、３環式または多環式構造の必須部位として、５員または６員環のいずれかからなってもよい。5-員環 (X = -O-、-S-、-N(R^N*)-、-C(R⁶R^6*)-) は、それらが天然で生じるヌクレオシドの天然のフラノース環として（しかし、１以上のビラジカル（以下参照）の導入によりロックされ）本質的に同じ配座を占めることができるという点において特に興味深いと、考えられる。可能な 5-員環の中で、X が -O-、-S- および -N(R^N*)- を意味する情況が特に興味深いようであり、X が -O- である情況が特に興味深いようである。

置換基 B は、オリゴマーが DNA または RNA と複合体を形成するとき、DNA または RNA 、特に DNA または RNA の核塩基と相互作用（例えば水素結合または共有結合または電子的相互作用により）しうる基を意味する。代わりとして、置換基 B は標識またはレポーターとして行動する基を意味するか、または置換基 B は DNA または RNA と相互作用を有さないか、ほとんど有さないと予想される基（例えば水素）を意味してもよい。従って、置換基 B は、水素、ヒドロキシ、任意に置換された C_1-4-アルコキシ、任意に置換された C_1-4-アルキル、任意に置換された C_1-4-アシルオキシ、核塩基、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから選択されるのが好ましい。

本文中で、用語「核塩基」は、天然で生じる核塩基および非天然で生じる核塩基をカバーする。以前は「非天然で生じる」と思われていた様々な核塩基が、自然界でその後見出されていることは当該分野の当業者には明らかなはずである。従って、「核塩基」には、公知のプリンおよびピリミジンヘテロ環のみならず、そのヘテロ環式類似体および互変異性体も含む。核塩基の実例としては、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、プリン、キサンチン、ジアミノプリン、8-オキソ-N⁶-メチルアデニン、7-デアザキサンチン、7-デアザグアニン、N⁴,N⁴-エタノシトシン、N⁶,N⁶-エタノ-2,6-ジアミノプリン、5-メチルシトシン、5-(C³-C⁶)-アルキニルシトシン、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、プソイドイソシトシン、2-ヒドロキシ-5-メチル-4-トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシンおよび米国特許第 5,432,272 号（Benner ら）に記載の「非天然で生じる」核塩基である。用語「核塩基」は、これらのすべておよびいずれの例ならびにその類似体および互変異性体をカバーするものである。特に興味深い核塩基は、アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシルである。これらは、ヒトの治療および診断適用に関連して天然に存在する核塩基として考えられている。

ここで使用するとき、用語「DNA インターカレーター」は、DNA または RNA らせん、二重らせんまたは三重らせん内にインターカレートし得る基を意味する。 DNA インターカレーターの官能基部分の例としては、アクリジン、アントラセン、アントラキノンのようなキノン、インドール、キノリン、イソキノリン、ジヒドロキノン、アントラサイクリン、テトラサイクリン、メチレンブルー、アントラサイクリノン、プソラレン、クマリン、エチジウム-ハライド、ダインマイシン（dynemicin）、1,10-フェナントロリン-銅のような金属錯体、カルケアマイシン（calcheamicin）のようなトリス(4,7-ジフェニル-1,10-フェナントロリン)ルテニウム-コバルト-エンジイン、ポルフィリン、ディスタマイシン（distamycin）、ネトロプシン（netropcin）、ビオローゲン、ダウノマイシンである。特に興味深い例は、アクリジン、アントラキノンのようなキノン、メチレンブルー、プソラレン、クマリンおよびエチジウム-ハライドである。

本文中で、用語「光化学的に活性な基」は、光による照射によって化学反応が進行し得る化合物をカバーする。そのような官能基の実例としては、キノン、特に 6-メチル-1,4-ナフトキノン、アントラキノン、ナフトキノン および 1,4-ジメチル-アントラキノン、ジアジリン、芳香族アジド、ベンゾフェノン、プソラレン、ジアゾ化合物ならびにジアジリノ化合物である。

本文中で、「熱化学的に反応性な基」は、熱化学的に誘導された、他の基との共有結合形成が進行し得る官能基として定義される。熱化学的に反応性な基の官能基部分の実例は、カルボン酸、活性化エステルのようなカルボン酸エステル、酸フロオライド、酸クロライド、酸ブロマイドおよび酸アイオダイドのようなカルボン酸ハライド、カルボン酸アジド、カルボン酸ヒドラジド、スルホン酸、スルホン酸エステル、スルホン酸ハライド、セミカルバジド、チオセミカルバジド、アルデヒド、ケトン、第１級アルコール、第２級アルコール、第３級アルコール、フェノール、アルキルハライド、チオール、ジスルフィド、第１級アミン、第２級アミン、第３級アミン、ヒドラジン、エポキシド、マレイミドならびにボロン酸（boronic acid）誘導体である。

本文中で、用語「キレート基」とは、１以上の結合部位を含み、同時に１以上の結合部位で別の分子、原子またはイオンとしばしば結合する分子を意味する。キレート基の官能部分の例としては、イミノジ酢酸、ニトリロトリ酢酸、エチレンジアミンテトラ酢酸 (EDTA)、アミノホスホン酸等である。

本文中で、用語「リポーター基」は、それ自体によりまたは検出シリーズの一部として検出可能な基を意味する。リポーター基の官能基部分の例としては、ビオチン、ジゴキシゲニン（digoxigenin）、蛍光基［ある波長の電磁照射、例えば光またはＸ−線を吸収することが可能で、その後、より長波長な放射線として吸収されたエネルギーを再放射する基；実例としては、ダンシル(5-ジメチルアミノ)-1-ナフタレンスルホニル)、DOXYL (N-オキシ-4,4-ジメチルオキサゾリジン)、PROXYL (N-オキシル-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン)、TEMPO (N-オキシル-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン)、ジニトロフェニル、アクリジン、クマリン（coumarines）、Cy3 および Cy5 (バイオロジカル・ディテクション・システム・インクの商標)、エリトロシン（erytrosine）、クマリン酸（coumaric acid）、ウンベリフェロン（umbelliferone）、テキサスレッド、ローダミン、テトラメチルローダミン、ロックス（Rox）、7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1-ジアゾール (NBD)、ピレン、フルオレセイン、ユウロピウム、ルテニウム、サマリウムおよび他の希土類金属である］、放射性同位体標識、化学ルミネセンス標識 (化学反応中に光の放出により検出可能な標識)、スピン標識 ［フリーラジカル（例えば、置換された有機ニトロキシド）または電子スピン共鳴分光法の使用により検出可能な生物分子に結合した他の常磁性プローブ（例えば、Cu²⁺、Mg²⁺）］、酵素( ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼおよびグルコースオキシダーゼのような)、抗原、抗体、ハプテン(抗体と結合することができる基、しかしそれ自体は免疫応答を開始させることはできない、ペプチドおよびステロイドホルモンのようなもの)、脂肪酸残基、ステロイド部分(コレステリル)、ビタミン A、ビタミン D、ビタミン E、特定なレセプター用葉酸ペプチド、エンドサイトーシスを媒介する基、表皮成長因子 (EGF)、ブラジキニンおよび血小板由来増殖因子 (PDGF)のような細胞膜透過用輸送システムである。特に興味深い例は、ビオチン、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、ルテニウム、ユウロピウム、Cy5、Cy3 等である。

本文中で、「リガンド」は結合するものを意味する。リガンドは、芳香族基（ベンゼン、ピリジン、ナフタレン、アントラセンおよびフェナントレンのような)、ヘテロ芳香族基(チオフェン、フラン、テトラヒドロフラン、ピリジン、ジオキサンおよびピリミジンのような)、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸ハライド、カルボン酸アジド、カルボン酸ヒドラジド、スルホン酸、スルホン酸エステル、スルホン酸ハライド、セミカルバジド、チオセミカルバジド、アルデヒド、ケトン、第１級アルコール、第２級アルコール、第３級アルコール、フェノール、アルキルハライド、チオール、ジスルフィド、第１級アミン、第２級アミン、第３級アミン、ヒドラジン、エポキシド、マレイミド、酸素原子、窒素原子および／または硫黄原子のような１以上のヘテロ原子で任意に割り込まれるかまたは末尾をなすか、芳香族またはモノ／ポリ不飽和炭化水素、ポリエチレングリコールのようなポリオキシエチレン、ポリ-β-アラニン、ポリグリシン、ポリリジンのようなオリゴ／ポリアミド、ペプチド、オリゴ/ポリサッカライド、オリゴ/ポリホスフェート、毒素、抗生物質、細胞毒（cell poisons）およびステロイドを任意に含有する C₁-C₂₀ アルキル基ならびに 「親和性リガンド」、すなわち、特定のタンパク質、抗生物質、ポリ-およびオリゴサッカライドならびに他の生体分子に関して部位に特定な親和性を有する官能基または生体分子のような官能基からなってもよい。

DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドの上述の特定な例が、該基の「活性な／官能基」部分に相当することは、当該分野の当業者には明らかであろう。当該分野の当業者にとって、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドは、M-K-の形態［式中、M は該基の「活性な／官能基」部分であり、K は「活性な／官能基」部分がそれにより 5- または 6- 員環に結合するスペーサーである］で典型的に表されることは、さらに明らかである。したがって、B が DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから選択される場合、基 B は、M-K- の形態［M は DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドそれぞれの「活性な／官能基」部分であり、K は 5- または 6-員環と「活性な／官能基」部分の間の、1〜50 原子、好ましくは 1〜30 原子、特に 1〜15 原子からなる任意なスペーサーである］を有することが理解されるであろう。

本文中において、用語「スペーサー」は、熱化学的および光化学的に不活性な距離形成（distance-making）基を意味し、上記で定義した種類の２以上の異なる部分に結合するために使用される。スペーサーは、その疎水性、親水性、分子柔軟性および長さを含む様々な特徴を基にして選択される(例えば、Hermanson ら、"Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, San Diego,
California (1992), p. 137-ff参照)。通常、スペーサーの長さは、約 400 Å より短く、ある適用においては 100 Å より短いのが好ましい。スペーサーは、したがって、１以上の酸素原子、窒素原子および／または硫黄原子のようなへテロ原子で任意に割り込まれるかまたは末尾をなす炭素原子鎖からなる。従って、スペーサー K は１以上のアミド、エステル、アミノ、エーテルおよび／またはチオエーテル官能性、および任意に芳香族またはモノ／ポリ不飽和な炭化水素、ポリエチレングリコールのようなポリオキシエチレン、ポリ-β-アラニン、ポリグリシン、ポリリジンのようなオリゴ/ポリアミド、ならびに一般のペプチド、オリゴサッカライド、オリゴ/ポリホスフェートからなってもよい。さらに、スペーサーはそれらの組み合わせた単位からなってもよい。スペーサーの長さは5-
または 6- 員環に関連して、該基の「活性な／官能基」部分の望ましいまたは必要な位置および空間的な配向を考慮にいれて、異なっていてもよい。特に興味深い具体例においては、スペーサーは化学的に開裂できる基を含む。そのような化学的に開裂できる基の例には、還元的条件下で開裂可能なジスルフィド基、ペプチダーゼにより開裂可能なペプチドフラグメントなどを含む。

この発明の具体例の一つにおいて、該基の「活性な／官能基」部分が 5- または 6- 員環に直接結合できるように、K は単結合を意味する。

好ましい具体例において、一般式Ｉおよび II 中の置換基 B は、核塩基、特にアデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシルから選択されるのが好ましい。

この発明のオリゴマー（式 I) において、P は、継続するモノマーへ結合するヌクレオシド間のラジカル位、または 5'-末端基を意味する。該 LNA が5'-末端「モノマー」でないときに第１の可能性があてはまり、一方該 LNA が 5'- 末端「モノマー」であるとき後者の可能性があてはまる。そのようなヌクレオシド間結合または 5'-末端基には置換基 R⁵ (または置換基 R^5* を等しく適用可能である)を含んでもよく、それにより基 P に結合する二重結合が形成することは(また、以下のヌクレオシド間結合および 5'- 末端基の定義からも明らかである)理解されるべきである。 (5'-末端とは、ヌクレオシド中のリボース部分の 5' 炭素原子に相当する位置を意味する。)

一方、先行するモノマーへのヌクレオシド間結合または3'-末端基 (P^*)は、置換基 R²、R^2*、R³ および R^3* の一つにより定義される位置から、好ましくは置換基 R³ および R^3* の一つにより定義される位置から開始してもよい。同様に、該 LNA が 3'-末端「モノマー」でないとき、第１の可能性があてはまり、一方、該 LNA が 3'-末端「モノマー」であるとき後者の可能性があてはまる。(3'-末端とは、ヌクレオシド中のリボース部位の 3' 炭素原子に相当する位置を意味する。）

本文中で、用語「モノマー」は、天然に存在するヌクレオシド、天然には存在しないヌクレオシド、PNA等および LNAに関している。従って、用語「継続するモノマー」は、5'-末端方向での隣接するモノマーに関連し、「先行するモノマー」は、3'-末端方向での隣接するモノマーに関連する。そのような継続するモノマーおよび先行するモノマーは、LNA モノマーの位置から見られ、天然に存在するヌクレオシドまたは天然には存在しないヌクレオシドまたはさらに LNA モノマーでさえあってもよい。

その結果、本文中で(上記定義から導き出されるように)、用語「オリゴマー」は１以上の LNA(類)の組込みにより修飾されたオリゴヌクレオチドを意味する。

本発明の重要な部分は、一般式 Iで表される 5- または 6- 員環に縮合した１以上の環の存在である。従って、R^1*、R^4*、R⁵、R^5*、R⁶、R^6*、R⁷、R^7*、R^N* の存在する置換基から選択される非ジェミナル置換基および P^* を意味しない R²、R^2*、R³ および R^3* の存在する置換基から選択される非ジェミナル置換基の１または２の対は各々、1〜8 の基/原子、好ましくは 1〜4 の基/原子からなり、-C(R^aR^b)-、-C(R^a)=C(R^a)-、-C(R^a)=N-、-O-、-Si(R^a)₂-、-S-、-SO₂-、-N(R^a)- および >C=Z から独立して選択されるビラジカルを意味する。(用語「存在する」は、置換基、すなわち R⁶、R^6*、R⁷、R^7*、R^N* の幾つかの存在が、Xがそのような置換基を含むかどうかに依存することを示す。)

ビラジカル(類)を構成する基において、Z は -O-、-S- および -N(R^a)- から選択され、R^a および R^b は各々 水素、任意に置換された C_1-12-アルキル、任意に置換された C_2-12-アルケニル、任意に置換された C_2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C_1-12-アルコキシ、C_2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C_1-12-アルコキシカルボニル、C_1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、C_1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C_1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C_1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C_1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンド(ここで、後者の基には置換基 B 用に定義されたようなスペーサーを含んでもよい)［ここでアリールおよびヘテロアリールは任意に置換されてもよい］から独立して選択される。そのうえ、２つのジェミナル置換基 R^a および R^b は一緒になって任意に置換されたメチレン (アリール用の任意な置換基として定義された置換基で１または２回任意に置換された =CH₂ )を意味してもよく、R^a、R^b、ならびに置換基 R^1*、R²、R^2*、R³、R^3*、R^4*、R⁵、R^5*、R⁶ および R^6*、R⁷、および R^7* ［それらは存在し、 P、P^* またはビラジカル(類)に含まれない］のいずれかから選択された２つの非ジェミナルなまたはジェミナル置換基は一緒になって、上記で定義したのと同じ種類のビラジカル類から選択された結合したビラジカルを形成してもよい。非ジェミナル置換基の対の各々は、それによって、(i)非ジェミナル置換基が結合している原子および(ii)いずれかの介在原子と一緒になって単環式または２環式のものを形成することは明らかであろう。

5- または 6-員環の環原子と結合しているビラジカルは、置換基 R⁵ および R^5* の包含によりヌクレオシド間結合と望ましくない立体的相互作用を生じるのが好ましいと考えられる。従って、１または２のビラジカル(類)をそれぞれ構成する、非ジェミナル置換基の１または２の対が、R^1*、R^4*、R⁶、R^6*、R⁷、R^7*、R^N* の存在する置換基ならびに R²、R^2*、R³ および R^3* ［ P^* を意味しない］の存在する置換基から選択されるのが好ましい。

オリゴマー中に組み込まれたLNA が、(２の) 非ジェミナル置換基の１対よりなる１つのビラジカルのみからなるのが好ましい。特に、R^3* が P^* を意味し、かつビラジカルが R^2* と R^4* の間または R² と R³ の間に形成されるのが好ましい。

これにより、本発明は、以下:
(i) R² および R³ は一緒になって、LNA が２環式ヌクレオシド類似体であるとき、-O-CH₂-CH₂- および -O-CH₂-CH₂-CH₂- から選択されるビラジカルを意味し;(ii) R³ および R⁵ は一緒になって、LNA が２環式ヌクレオシド類似体であるとき、-CH₂-CH₂-、-O-CH₂- から選択されるビラジカルを意味し;
(iii) R³、R⁵ および R^5* は一緒になって、LNA が3環式 ヌクレオシド類似体であるとき、トリラジカル -CH₂-CH(-)-CH₂- を意味し;
(iv) R^1* および R^6* は一緒になって、LNA が２環式 ヌクレオシド類似体であるとき、ビラジカル -CH₂- を意味し; または
(v) R^4* および R^6* が一緒になって、LNA が２環式ヌクレオシド類似体であるとき、ビラジカル -CH₂- を意味する
［ただし、そのような2-または3-環式ヌクレオシド類似体がここで定義された新規な LNA の１またはそれ以上と組み合わさったものを除く］；
の2-または3-環式ヌクレオシド類似体からなるオリゴマー類に関しないことは、(特に、公知な 2-または3-環式ヌクレオシド類似体を充分考慮した上で - 「発明の背景」 参照)理解されるであろう。

本文中で、すなわちこの記載および請求項において、ビラジカルの配向は、左手側が少ない数の置換基を表し、右手側が大きい数の置換基を表すようになる、従って R³ および R⁵ が一緒になってビラジカル「 -O-CH₂- 」を意味するとき、酸素原子は R³ を表し、従って酸素原子は、例えばR³の位置に結合しており、メチレン基は R⁵ を表すと考えられる。

この発明によるオリゴマー中に組みこまれた LNA（類） 中のビラジカル(類)の構造の数多くの興味深い可能性を考慮すると、非ジェミナル置換基の対により構成されるビラジカル（類）は、-(CR^*R^*)_r-Y-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-Y-(CR^*R^*)_s-Y-、-Y-(CR^*R^*)_r+s-Y-、-Y-(CR^*R^*)_r-Y-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r+s-、-Y-、-Y-Y-［ここで、各 Y は -O-、-S-、-Si(R^*)₂-、-N(R^*)-、>C=O、-C(=O)-N(R^*)- および -N(R^*)-C(=O)- から独立して選択され、各 R^* は、水素、ハロゲン、アジド、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、モノ-またはジ(C_1-6-アルキル)アミノ、任意に置換された C_1-6-アルコキシ、任意に置換された C_1-6-アルキル、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから独立して選択され、かつ/または２つの隣接した (非ジェミナルな) R^* は一緒になって二重結合を意味してもよい; かつ r と s の各々は 0〜4 であり、ただし r+s の合計は 1〜5 である］から選択されるのが好ましいと考えられる。特に興味深い関係は、各ビラジカルが -Y-、-(CR^*R^*)_r+s-、-(CR^*R^*)_r-Y-(CR^*R^*)_s- および -Y-(CR^*R^*)_r+s-Y- から独立して選択され、r および s の各々は 0〜3 であり、ただし r+s の合計は 1〜4 であるものである。

LNA（類）中でのビラジカルの位置を考慮すると、以下の関係、すなわち: R^2*
および R^4* は一緒になって、-Y-、-(CR^*R^*)_r+s+1-、-(CR^*R^*)_r-Y-(CR^*R^*)_s- および -Y-(CR^*R^*)_r+s-Y- から選択されるビラジカルを意味し; R² および R³ は一緒になって -Y-、-(CR^*R^*)_r+s-、-(CR^*R^*)_r-Y-(CR^*R^*)_s- および -Y-(CR^*R^*)_r+s-Y- から選択されるビラジカルを意味し; R^2* および R³ は一緒になって -Y-、-(CR^*R^*)_r+s-、-(CR^*R^*)_r-Y-(CR^*R^*)_s- および -Y-(CR^*R^*)_r+s-Y- から選択されるビラジカルを意味し; R³ および R^4* は一緒になって -Y-、-(CR^*R^*)_r+s-、-(CR^*R^*)_r-Y-(CR^*R^*)_s- および -Y-(CR^*R^*)_r+s-Y- から選択されるビラジカルを意味し; R³ および R⁵ は一緒になって -Y'-、-(CR^*R^*)_r+s+1-、-(CR^*R^*)_r-Y-(CR^*R^*)_s- および -Y-(CR^*R^*)_r+s-Y- から選択されるビラジカルを意味し; R^1* および R^4* は一緒になって-Y'-、-(CR^*R^*)_r+s+1-、-(CR^*R^*)_r-Y-(CR^*R^*)_s- および -Y-(CR^*R^*)_r+s-NR^*- から選択されるビラジカルを意味し;または R^1* および R^2* は一緒になって -Y-、-(CR^*R^*)_r+s-、-(CR^*R^*)_r-Y-(CR^*R^*)_s- および -Y-(CR^*R^*)_r+s-Y- から選択されるビラジカルを意味する; ここで、r および sの各々は 0〜3 であり、ただし r+s の合計が 1〜4 であり、Y は上記のとおりであり、かつ Y' は -NR^*-C(=O)- および -C(=O)-NR^*- から選択されることが特に興味深いことが（予備的な所見（実施例参照）をもとに）考えられる。

特に興味深いオリゴマーは、以下の特徴の一つがオリゴマー中の少なくとも１つのLNA に適用されるものである: R^2* および R^4* は一緒になって、-O-、-S-、-N(R^*)-、-(CR^*R^*)_r+s+1-、-(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s-、-O-(CR^*R^*)_r+s-O-、-S-(CR^*R^*)_r+s-O-、-O-(CR^*R^*)_r+s-S-、-N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-O-、-O-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-、-S-(CR^*R^*)_r+s-S-、-N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-、-N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-S- および -S-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)- から選択されるビラジカルを意味し; R² および R³ は一緒になって -O-、-(CR^*R^*)_r+s-、-(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s- および -(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s- から選択されるビラジカルを意味し; R^2* および R³ は一緒になって -O-、-(CR^*R^*)_r+s-、-(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s- および -(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s- から選択されるビラジカルを意味し; R³
および R^4* は一緒になって -(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s- および -(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s- から選択されるビラジカルを意味し; R³ および R⁵ は一緒になって -(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s- および -(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s- から選択されるビラジカルを意味し; R^1* および R^4* は一緒になって -(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s- および -(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s- から選択されるビラジカルを意味し; または R^1* および R^2* は一緒になって -(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s-
および -(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s- から選択されるビラジカルを意味する; ここで、r および s の各々は 0〜3 である、ただし r+s の合計は 1〜4 であり、R^H は水素または C_1-4-アルキルを意味する。

R^* の一つが、水素、ヒドロキシ、任意に置換された C_1-6-アルコキシ、任意に置換された C_1-6-アルキル、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから選択されるのがさらに好ましく、残りの置換基 R^* はいずれも水素である。

好ましい具体例の一つにおいて、少なくとも一つの LNA 中のビラジカル中の一つの基 R^* は、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンド(ここで後者の基は置換基 B 用に定義されたようなスペーサーを含んでもよい)から選択される。

存在するが P、P* またはビラジカル(類)中に含まれない置換基 R^1*、R²、R^2*、R³、R^4*、R⁵、R^5*、R⁶ ならびに 置換基 R^6*、R⁷ および R^7* に関して、これらは、水素、任意に置換された C_1-12-アルキル、任意に置換された C_2-12-アルケニル、任意に置換された C_2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C_1-12-アルコキシ、C_2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C_1-12-アルコキシカルボニル、C_1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、C_1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C_1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C_1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C_1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンド(後者の基は置換基 B用に定義したようなスペーサーを含んでもよい)［ここで、アリールおよびヘテロアリールは、任意に置換されていてもよく、ここで２つのジェミナル置換基は一緒になってオキソ、チオキソ、イミノまたは任意に置換されたメチレンを意味するか、または一緒になって、-O-, -S- および -(NR^N)- ［ここで R^N は水素および C_1-4-アルキルから選択される］から選択される１以上のヘテロ原子/基で、任意に割り込まれかつ／または末尾をなされた 1〜5 の炭素原子アルキレン鎖からなるスピロビラジカルを形成してもよく、ここで、２つの隣接した(非ジェミナルな)置換基は二重結合を生じさせる付加的な結合を意味してもよく; かつここで、存在するがビラジカル中に含まれないとき、R^N* は水素および C_1-4-アルキルから選択される］から独立して選択される。

存在するが P、P* またはビラジカル中に含まれない、LNA の置換基 R^1*、R²、R^2*、R³、R^3*、R^4*、R⁵、R^5*、R⁶、R^6*、R⁷ および R^7* の各々は、水素、任意に置換された C_1-6-アルキル、任意に置換された C_2-6-アルケニル、ヒドロキシ、C_1-6-アルコキシ、C_2-6-アルケニルオキシ、カルボキシ、C_1-6-アルコキシカルボニル、C_1-6-アルキルカルボニル、ホルミル、アミノ、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、C_1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、アジド、C_1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、スルファニル、C_1-6-アルキルチオ、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドならびにハロゲン［ここで、２つのジェミナル置換基は、一緒になってオキソを意味してもよく、ここで、R^N* は存在するがビラジカル中に含まれないとき、水素および C_1-4-アルキルから選択される］から独立して選択されるのが好ましい。

この発明の好ましい具体例においては、X は、-O-、-S- および -NR^N*- から選択され、特に -O- であり、存在するが P、P* またはビラジカル中に含まれない、LNA の置換基 R^1*、R²、R^2*、R³、R^3*、R^4*、R⁵、R^5*、R⁶、R^6*、R⁷ および
R^7* の各々は水素を意味する。

この発明のより好ましい具体例においては、オリゴマー中に組みこまれた LNA
の R^2* および R^4* は一緒になって、ビラジカルを意味する。X は O であり、R² は水素、ヒドロキシおよび任意に置換された C_1-6-アルコキシから選択され、R^1*、R³、R⁵ および R^5* は水素を意味するのが好ましく、より詳細には、ビラジカルは -O-、-(CH₂)_0-1-O-(CH₂)_1-3-、-(CH₂)_0-1-S-(CH₂)_1-3-、-(CH₂)_0-1-N(R^N)-(CH₂)_1-3- および -(CH₂)_2-4- から選択され、特に -O-CH₂-、-S-CH₂- および -NR^H-CH₂- から選択される。通常、これまでに得られた結果に関しては、R^2* および R^4* を構成するビラジカルは、２つの炭素原子橋を形成する、すなわちビラジカルはフラノース環（X=O）を有する５員環を形成するのが好ましい。

本発明の別の具体例において、オリゴマー中に組みこまれる LNA の R² および R³ は一緒になってビラジカルを意味する。 X は O であり、R^2* は水素、ヒドロキシおよび任意に置換された C_1-6-アルコキシから選択され、R^1*、R^4*、R⁵
および R^5* は水素を意味するのが好ましく、さらに詳細にはビラジカルは -(CH₂)_0-1-O-(CH₂)_1-3-、-(CH₂)_0-1-S-(CH₂)_1-3-、-(CH₂)_0-1-N(R^H)-(CH₂)_1-3- および -(CH₂)_1-4- から選択され、特に -O-CH₂-、-S-CH₂-、-N(R^H)-CH₂- から選択される。後者の場合、アミノおよびチオ変形体が特に興味深いようである。

本発明のさらなる具体例において、オリゴマー中に組みこまれる LNA の R^2* および R³ は一緒になって、ビラジカルを意味する。 X は O であり、R² は水素、ヒドロキシおよび任意に置換された C_1-6-アルコキシから選択され、R^1*、R^4*、R⁵ および R^5* は水素を意味するのが好ましく、より詳細には、ビラジカルは -(CH₂)_0-1-O-(CH₂)_1-3- および -(CH₂)_2-4- から選択される。

この発明のさらなる具体例において、オリゴマー中に組みこまれた LNA の R³
および R^4* は、一緒になってビラジカルを意味する。 X は O であり、R^2* は水素、ヒドロキシおよび任意に置換された C_1-6-アルコキシから選択され、R^1*、R²、R⁵ および R^5* は水素を意味するのが好ましく、より詳細にはビラジカルは -(CH₂)_0-2-O-(CH₂)_0-2- である。

この発明のさらなる具体例において、オリゴマー中に組みこまれた LNA の R³
および R^5* は、一緒になってビラジカルを意味する。 X は O であり、R^2* は水素、ヒドロキシおよび任意に置換された C_1-6-アルコキシから選択され、R^1*、R²、R⁴ および R⁵ は水素を意味するのが好ましく、より詳細にはビラジカルは -O-(CHR^*)_2-3- および -(CHR^*)_1-3-O-(CHR^*)_0-3- から選択される。

この発明のさらなる具体例において、オリゴマー中に組みこまれた LNA の R^1* および R^4* は一緒になってビラジカルを意味する。 X は O であり、R^2* は水素、ヒドロキシおよび任意に置換された C_1-6-アルコキシから選択され、R²、R³、R⁵ および R^5* は水素を意味するのが好ましく、より詳細にはビラジカルは
-(CH₂)_0-2-O-(CH₂)_0-2- である。

これらの具体例において、オリゴマー中に組みこまれた LNA の少なくとも１つが、アデニンおよびグアニンから選択される核塩基(置換基 B)を含むのがさらに好ましい。特に、オリゴマーが、組みこまれた LNA を有し、そのうち両方がチミン、ウラシルおよびシトシンから選択された少なくとも１つの核塩基と、アデニンおよびグアニンから選択された少なくとも１つの核塩基を含有するのが好ましい。 LNA モノマーには、核塩基がアデニンおよびグアニンから選択されるのが特に好ましい。

これらの好ましい具体例には、LNA(類) が一般式 Ia (以下参照)を有するのも好ましい。

オリゴヌクレオチドの全モノマーが LNA モノマーであるのは、これらの興味深い具体例の変形内である。

一般式 I (オリゴマー中の LNA(類))(および一般式 II (単量体の LNA) - 以下参照) およびそれと関連した定義から明らかなように、置換基や可能なビラジカルの性質によってオリゴマー (および単量体の LNA) 中に１または幾つかの不斉炭素原子が存在しうる。以下参照。この発明の方法に従って製造されたオリゴマーおよびオリゴマー自体は、個々のモノマーフラグメントおよびそれらの混合物、ラセミ混合物も含むいずれの全アイソマーの存在により生じる全ての立体異性体を含むことを意図する。 5- または 6- 員環を考慮すると、しかしながら、一定の立体化学配置、例えば、以下

［式中、波線は該２つの置換基の入れ替わりから生じる両方のジアステレオマーの可能性を表す］
が特に興味深いと考えられる。

特に興味深い立体異性体の表現は、LNA(類)が以下の式 Ia

を有するものである。

また、式 Ia の変形［式中、B が「α-配置」にある］が本発明の別の観点として興味深い。

これらの場合、通常と同様に、R^3* は P^* を意味するのが好ましい。

本発明に従ったオリゴマーは、一般式 I(またはより詳細には一般式 Ia)のLNA(類)1〜10000ならびに天然に存在するヌクレオシドおよびヌクレオシド類似体から選択されるヌクレオシド0〜10000から典型的になる。ヌクレオシドの数と LNA(類) の数の合計は、少なくとも 2 であり、好ましくは少なくとも 3 であり、特に少なくとも 5 であり、とりわけ少なくとも 7 であり、2〜15000 の範囲であり、好ましくは 2〜100、3〜100 のような範囲であり、特に 2〜50 の、3〜50
または 5〜50 または 7〜50 のような範囲である。

少なくとも一つの LNA は置換基 B のような核塩基からなるのが好ましい。

本文中で、用語「ヌクレオシド」はヘテロ環式塩基のグリコシドを意味する。用語「ヌクレオシド」は、天然には存在しないヌクレオシド、天然に存在するヌクレオシド、および他のヌクレオシド類似体を含むように広く使用される。ヌクレオシドの実例は、リボース部分からなるリボヌクレオシドおよびデオキシリボース部分からなるデオキシリボヌクレオシドである。そのようなヌクレオシドの塩基に関しては、これは、天然に存在する塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルならびにそれらの修飾された変形、または可能な非天然塩基のいずれかであってもよいことが理解されるであろう。

定義ならびに公知ヌクレオシド(天然に存在するものおよび天然には存在しないもの)およびヌクレオシド類似体(公知2-および3-環式類似体を含む)を考慮すると、オリゴマーが１以上の LNA(類)(それらは、置換基の選択に関してと、ビラジカルの選択に関しての両方が同一または異なっていても良い)および１以上のヌクレオシドおよび/またはヌクレオシド類似体からなってもよいことが明らかである。本文中で「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオシド間結合により結合したヌクレオシドの連続鎖を意味し、しかし、オリゴマー (オリゴヌクレオチド)中の１以上のヌクレオチド単位（モノマー）中の核塩基は、上記のような置換基 B で修飾されていてもよいことが理解されるであろう。

オリゴマーは、直鎖状、分岐状または環式であってもよい。分岐状オリゴマーの場合、分岐点は、ヌクレオシド中、ヌクレオシド間結合中、または興味をそそる具体例として LNA 中に位置してもよい。後者の場合、置換基 R²、R^2*、R³ および R^3* は２つの基 P^* を意味してもよく、それぞれは先行するモノマーへのヌクレオシド間結合を意味し、特に、R² および R^2* の１つは P^* を意味し、R³
および R^3* の１つはさらに P* を意味すると考えられている。

上述のように、オリゴマーの LNA(類)は、ヌクレオシド間結合によって他のモノマーと結合する。 本文中で、用語「ヌクレオシド間結合」は、-CH₂-、-O-、-S-、-NR^H-、>C=O、>C=NR^H、>C=S、-Si(R'')₂-、-SO-、-S(O)₂-、-P(O)₂-、-PO(BH₃)-、-P(O,S)-、-P(S)₂-、-PO(R'')-、-PO(OCH₃)- および -PO(NHR^H)- ［式中、R^H は水素および C_1-4-アルキルから選択され、R'' は C_1-6-アルキル およびフェニルから選択される］から選択された、2 〜 4、好ましくは 3 の基/原子からなる結合を意味する。そのようなヌクレオシド間結合の実例は、-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-CO-CH₂-、-CH₂-CHOH-CH₂-、-O-CH₂-O-、-O-CH₂-CH₂-、-O-CH₂-CH= (継続するモノマーへの結合として使用されるとき、R⁵ を含む)、-CH₂-CH₂-O-、-NR^H-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-NR^H-、-CH₂-NR^H-CH₂-、-O-CH₂-CH₂-NR^H-、-NR^H-CO-O-、-NR^H-CO-NR^H-、-NR^H-CS-NR^H-、-NR^H-C(=NR^H)-NR^H-、-NR^H-CO-CH₂-NR^H-、-O-CO-O-、-O-CO-CH₂-O-、-O-CH₂-CO-O-、-CH₂-CO-NR^H-、-O-CO-NR^H-、-NR^H-CO-CH₂-、-O-CH₂-CO-NR^H-、-O-CH₂-CH₂-NR^H-、-CH=N-O-、- CH₂-NR^H-O-、-CH₂-O-N= (継続するモノマーへの結合として使用されるとき、R⁵ を含む)、-CH₂-O-NR^H-、-CO-NR^H-CH₂-、-CH₂-NR^H-O-、-CH₂-NR^H-CO-、-O-NR^H-CH₂-、-O-NR^H-、-O-CH₂-S-、-S-CH₂-O-、-CH₂-CH₂-S-、-O-CH₂-CH₂-S-、-S-CH₂-CH= (継続するモノマーへの結合として使用されるとき、R⁵ を含む)、-S-CH₂-CH₂-、-S-CH₂-CH₂-O-、-S-CH₂-CH₂-S-、-CH₂-S-CH₂-、-CH₂-SO-CH₂-、-CH₂-SO₂-CH₂-、-O-SO-O-、-O-S(O)₂-O-、-O-S(O)₂-CH₂-、-O-S(O)₂-NR^H-、-NR^H-S(O)₂-CH₂-、-O-S(O)₂-CH₂-、-O-P(O)₂-O-、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)₂-O-、-S-P(O)₂-O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S)₂-O-、-O-P(O)₂-S-、-O-P(O,S)-S-、-O-P(S)₂-S-、-S-P(O)₂-S-、-S-P(O,S)-S-、-S-P(S)₂-S-、-O-PO(R'')-O-、-O-PO(OCH₃)-O-、-O-PO(OCH₂CH₃)-O-、-O-PO(OCH₂CH₂S-R)-O-、-O-PO(BH₃)-O-、-O-PO(NHR^N)-O-、-O-P(O)₂-NR^H-、-NR^H-P(O)₂-O-、-O-P(O,NR^H)-O-, -CH₂-P(O)₂-O-、-O-P(O)₂-CH₂- および -O-Si(R'')₂-O-であり;このうち、-CH₂-CO-NR^H-、-CH₂-NR^H-O-、-S-CH₂-O-、-O-P(O)₂-O-、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)₂-O-、-NR^H-P(O)₂-O-、-O-P(O,NR^H)-O-、-O-PO(R'')-O-、-O-PO(CH₃)-O- および -O-PO(NHR^N)-O-［ 式中、R^H は水素および C_1-4-アルキルから選択され、R''がC_1-6-アルキルおよびフェニルから選択される］が特に好ましい。さらに、実例としては Mesmaeker ら、Current Opinion in Structural Biology 1995, 5, 343〜355 中に挙げられている。ヌクレオシド間結合の左手側は、置換基 P^* として 5- または 6- 員環に結合しており、一方、右手側は先行するモノマーの 5'- 位に結合している。

該 LNA が 5'-末端モノマーである場合、基 P も 5'-末端基を意味するのは上記からも明らかである。そのような 5'-末端基の例は、水素、ヒドロキシ、任意に置換された C_1-6-アルキル、任意に置換された C_1-6-アルコキシ、任意に置換された C_1-6-アルキルカルボニルオキシ、任意に置換されたアリールオキシ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェートおよび -W-A' ［式中、W は -O-、-S- および -N(R^H)-［ここで、R^H は水素および C_1-6-アルキルから選択される］から選択され、かつ式中 A' は DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンド(ここで、後者の基は置換基 B 用に定義したようなスペーサーを含んでもよい)から選択される］である。

この明細書および特許請求の範囲において、用語「モノホスフェート」、「ジホスフェート」および「トリホスフェート」は、それぞれ式: -O-P(O)₂-O^-、-O-P(O)₂-O-P(O)₂-O^- および -O-P(O)₂-O-P(O)₂-O-P(O)₂-O^- の基を意味する。

特に興味深い具体例において、基 P はモノホスフェート、ジホスフェートおよびトリホスフェートから選択された 5'-末端基を意味する。特に、トリホスフェート変形体は基質として興味深い。

同様に、基 P^* は該 LNA が 3'-末端モノマーであるとき、3'-末端基を意味してもよい。そのような 3'-末端基の例は、水素、ヒドロキシ、任意に置換された
C_1-6-アルコキシ、任意に置換された C_1-6-アルキルカルボニルオキシ、任意に置換されたアリールオキシおよび -W-A' ［式中、W は -O-、-S- および -N(R^H)- ［ここで、R^H は水素および C_1-6-アルキルから選択される］から選択され、式中、A' は DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンド(ここで後者の基は置換基 B 用に定義したようなスペーサーを含んでもよい)から選択される］である。

本発明の好ましい具体例において、オリゴマーは以下の式 V:

G-[Nu-L]_n(0)-[[LNA-L]_m(q)-[Nu-L]_n(q)]_q-G^* V

［式中、
q は 1〜50 であり;
n(0)、..、n(q) の各々は独立して 0〜10000 であり;
m(1)、..、m(q) の各々は独立して 1〜10000 である;
ただし、n(0)、..、n(q) および m(1)、..、m(q) の合計は 2〜15000 である;
G は 5'-末端基を意味し;
各 Nu は天然に存在するヌクレオシドおよびヌクレオシド類似体から選択されたヌクレオシドを独立して意味し;
各 LNA はヌクレオシド類似体を独立して意味し;
各 L は Nu および LNA から選択された２つの基の間のヌクレオシド間結合を独立して意味するか、または L は G^* と一緒になって 3'-末端基を意味し;かつ
各 LNA-L は上記のような一般式Ｉ、または好ましくは一般式Ｉａのヌクレオシド類似体を独立して意味する］
を有する。

この具体例の中で、および通常、本発明は LNA を、異なる核塩基、特に、チミン、シトシンおよびウラシルから選択される核塩基と、アデニンおよびグアニンから選択される核塩基の両方と含めるという興味深い可能性を提供する。

本発明の別の具体例において、オリゴマーは更に式

［式中、B は式Ｉ用に上記で定義されたとおりであり、AASC は水素またはアミノ酸側鎖を意味し、t は 1〜5 であり、w は 1〜50 である］
の PNA モノ- またはオリゴマーセグメントからなる。

本文中で、用語「アミノ酸側鎖」は、α-アミノ酸、すなわち、グリシン部分を除く該α-アミノ酸に相当する、好ましくは天然に存在するかまたは用意に入手可能なα-アミノ酸のα-原子に結合した基を意味する。実例としては、水素(グリシン自体)、重水素(重水素化グリシン)、メチル(アラニン)、シアノメチル(β-シアノ-アラニン)、エチル、1-プロピル(ノルバリン)、2-プロピル(バリン)、2-メチル-1-プロピル(ロイシン)、2-ヒドロキシ-2-メチル-1-プロピル(β-ヒドロキシ-ロイシン)、1-ブチル(ノルロイシン)、2-ブチル(イソロイシン)、メチルチオエチル(メチオニン)、ベンジル(フェニルアラニン)、p-アミノ-ベンジル (p-アミノ-フェニルアラニン)、p-ヨード-ベンジル(p-ヨード-フェニルアラニン)、p-フルオロ-ベンジル(p-フルオロ-フェニルアラニン)、p-ブロモ-ベンジル (p-ブロモ-フェニルアラニン)、p-クロロ-ベンジル(p-クロロ-フェニルアラニン)、p-ニトロ-ベンジル(p-ニトロ-フェニルアラニン)、3-ピリジルメチル (β-(3-ピリジル)-アラニン)、3,5-ジヨード-4-ヒドロキシ-ベンジル(3,5-ジヨード-チロシン)、3,5-ジブロモ-4-ヒドロキシ-ベンジル(3,5-ジブロモ-チロシン)、3,5-ジクロロ-4-ヒドロキシ-ベンジル(3,5-ジクロロ-チロシン)、3,5-ジフルオロ-4-ヒドロキシ-ベンジル(3,5-ジフルオロ-チロシン)、4-メトキシ-ベンジル (O-メチル-チロシン)、2-ナフチルメチル (β-(2-ナフチル)-アラニン)、1-ナフチルメチル (β-(1-ナフチル)-アラニン)、3-インドリルメチル (トリプトファン)、ヒドロキシメチル(セリン)、1-ヒドロキシエチル(トレオニン)、メルカプトメチル(システイン)、2-メルカプト-2-プロピル(ペニシラミン)、4-ヒドロキシベンジル(チロシン)、アミノカルボニルメチル(アスパラギン)、2-アミノカルボニルエチル(グルタミン)、カルボキシメチル(アスパラギン酸)、2-カルボキシエチル(グルタミン酸)、アミノメチル (α,β-ジアミノプロピオン酸)、2-アミノエチル(α,γ-ジアミノ酪酸)、3-アミノ-プロピル (オルニチン)、4-アミノ-1-ブチル(リジン)、3-グアニジノ-1-プロピル(アルギニン)および4-イミダゾリルメチル(ヒスチジン)である。

PNA モノ- またはオリゴマーセグメントは、欧州特許出願第 EP 0672677 A2 号に記載のようにオリゴマー中に組みこまれてもよい。

本発明のオリゴマーはまた、キメラオリゴマーを包含することを意図する。「キメラオリゴマー」は、直接またはスペーサーを介して、異なる起源のモノマー類と結合した２以上のオリゴマー類を意味する。結合されてもよい、そのようなオリゴマーの実例は、ペプチド、PNA-オリゴマー類、オリゴマー含有 LNA's オリゴマー類およびオリゴヌクレオチドオリゴマー類である。

上記で定義したオリゴマーとは別に、本発明は、（例えば核酸ポリメラーゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ、ターミナルトランスフェラーゼの）基質として、および治療剤として有用な（例えばオリゴマーの製造において）単量体の LNA を提供する。以下、参照。単量体の LNA は、全体の構造中(特に可能なビラジカルに関して)において、オリゴマー中の構成要素として定義されたLNA に相当し、しかし、基 P および P^* に関して、単量体の LNA は以下に説明するように、わずかに異なる。さらに、単量体の LNA は、特に単量体の LNA が化学合成によってオリゴマー中に組みこまれる場合には、官能基保護基からなってもよい。

可能な単量体の LNA の興味深い部分群は、一般式 II

［式中、置換基 B は核塩基、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから選択され; X は -O-、-S-、-N(R^N*)- および -C(R⁶R^6*)- から選択され、-O-、-S- および -N(R^N*)- が好ましく; 置換基 R²、R^2*、R³ および R^3* の一つは基 Q^* であり;

Q および Q^* の各々は、水素、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Prot-O-、Act-O-、メルカプト、Prot-S-、Act-S-、C_1-6-アルキルチオ、アミノ、Prot-N(R^H)-、Act-N(R^H)-、モノ-またはジ(C_1-6-アルキル)アミノ、任意に置換された C_1-6-アルコキシ、任意に置換された C_1-6-アルキル、任意に置換された C_2-6-アルケニル、任意に置換された C_2-6-アルケニルオキシ、任意に置換された C_2-6-アルキニル、任意に置換された C_2-6-アルキニルオキシ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基、リガンド、カルボキシ、スルホノ、ヒドロキシメチル、Prot-O-CH₂-、Act-O-CH₂-、アミノメチル、Prot-N(R^H)-CH₂-、Act-N(R^H)-CH₂-、カルボキシメチル、スルホノメチル[ここで、Prot はそれぞれ -OH、-SH および -NH(R^H) の保護基であり、Act はそれぞれ -OH、-SH および -NH(R^H) の活性基であり、R^H は水素および C_1-6-アルキルから選択される］から独立して選択され;

R^2* および R^4* は、-O-、-S-、-N(R^*)-、-(CR^*R^*)_r+s+1-、-(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s-、-O-(CR^*R^*)_r+s-O-、-S-(CR^*R^*)_r+s-O-、-O-(CR^*R^*)_r+s-S-、-N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-O-、-O-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-、-S-(CR^*R^*)_r+s-S-、-N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-、-N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-S- および -S-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)- から選択されるビラジカルを一緒になって意味し; R² および R³ は -O-、-(CR^*R^*)_r+s-、-(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s- および -(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s- から選択されるビラジカルを一緒になって意味し; R^2* および R³ は -O-、-(CR^*R^*)_r+s-、-(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s- および -(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s- から選択されるビラジカルを一緒になって意味し; R³ および R^4* は -(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s- および -(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s- から選択されるビラジカルを一緒になって意味し; R³ および R⁵ は -(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s- および -(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s- から選択されるビラジカルを一緒になって意味し; R^1* および R^4* は -(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s- および -(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s- から選択されるビラジカルを一緒になって意味し; または R^1* および R^2* は、-(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s- および -(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s- から選択されるビラジカルを一緒になって意味する;［ここで、R^* はオリゴマー用に上記で定義されたとおりであり; 置換基 R^1*、R²、R^2*、R³、R^4*、R⁵ および R^5* の各々は、それらは Q、Q^* またはビラジカルに含まれず、オリゴマー用に上記で定義されたとおりである］］
の 2環式ヌクレオシド類似体 (LNA)からなる。

公知の２環式ヌクレオシド類似体を充分に考慮すると、R² および R³ は一緒になって -O-CH₂-CH₂- および -O-CH₂-CH₂-CH₂- から選択されるビラジカルを意味せず; R³ および R⁵ は一緒になって -CH₂-CH₂-、-O-CH₂- および -O-Si(ⁱPr)₂-O-Si(ⁱPr)₂-O- から選択されるビラジカルを意味しないことは、さらに理解できるであろう。

単量体の LNA もまた、それらの塩基性塩および酸付加塩からなる。さらに、化学的なオリゴヌクレオチド合成において普及している条件下で反応性などのような化学基(どのような核塩基も含む)は、当該分野で公知なように任意に官能基保護されることは理解されるであろう。これは、単量体の LNAのヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、スルホノおよびメルカプト基、ならびに核塩基のような基が任意に官能基保護されていることを意味する。保護(および脱保護)は当該分野の当業者に公知の方法により行われる(参照、例えば Greene, T. W. および Wuts,
P. G. M., "Protective Groups in Organic Synthesis", 2nd ed., John Wiley, N.Y. (1991), および M.J. Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, 1984)。

ヒドロキシ保護基の実例は、4,4'-ジメトキシトリチル (DMT)、4-モノメトキシトリチル (MMT)およびトリチルのような任意に置換されたトリチル、任意に置換された 9-(9-フェニル)キサンテニル(pixyl)、任意に置換されたエトキシカルボニルオキシ、p-フェニルアゾフェニルオキシカルボニルオキシ、テトラヒドロピラニル(thp)、9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)、メトキシテトラヒドロピラニル(mthp)、トリメチルシリル (TMS)、トリイソプロピルシリル(TIPS)、tert-ブチルジメチルシリル(TBDMS)、トリエチルシリルおよびフェニルジメチルシリルのようなシリルオキシ、2-ブロモベンジルオキシカルボニルのようなベンジルオキシカルボニルまたは置換されたベンジルオキシカルボニルエーテル、tert-ブチルエーテル、メチルエーテルのようなアルキルエーテル、アセタール(２つのヒドロキシ基を含む)、アセチルまたはハロゲン置換されたアセチルのようなアシルオキシ（例えば、クロロアセチルまたはフルオロアセチル）、イソブチリル、ピバロイル、ベンゾイルおよび置換されたベンゾイル、メトキシメチル(MOM)、2,6-ジクロロベンジル (2,6-Cl₂Bzl)のようなベンジルエーテルまたは置換されたベンジルエーテルである。代わりとして、ヒドロキシ基は任意にリンカーによって、固形支持体への付着により保護されてもよい。

アミノ保護基の実例は、Fmoc(フルオレニルメトキシカルボニル)、BOC (tert-ブチルオキシカルボニル)、トリフルオロアセチル、アリルオキシカルボニル (alloc、AOC)、ベンジルオキシカルボニル(Z、Cbz)、2-クロロベンジルオキシカルボニル ((2-ClZ)のような置換されたベンジルオキシカルボニル、モノメトキシトリチル(MMT)、ジメトキシトリチル(DMT)、フタロイルおよび 9-(9-フェニル)キサンテニル(pixyl)である。

カルボキシ保護基の実例は、アリルエステル、メチルエステル、エチルエステル、2-シアノエチルエステル、トリメチルシリルエチルエステル、ベンジルエステル(Obzl)、2-アダマンチルエステル(O-2-Ada)、シクロヘキシルエステル(OcHex)、1,3-オキサゾリン、オキサゾーラ（oxazoler）、1,3-オキサゾリジン、アミドまたはヒドラジンである。

メルカプト保護基の実例は、トリチル(Trt)、アセタミドメチル(acm)、トリメチルアセタミドメチル(Tacm)、2,4,6-トリメトキシベンジル(Tmob)、tert-ブチルスルフェニル(StBu)、9-フルオレニルメチル(Fm)、3-ニトロ-2-ピリジンスルフェニル(Npys)および 4-メチルベンジル (Meb)である。

さらに、単量体の LNA 中に含まれる核塩基のいずれも、特に、単量体の LNA が本発明のオリゴマー中に組みこまれるときには、保護するのが必要または望ましいであろう。本文中で、用語「保護された核塩基」は、該核塩基が当該分野の当業者に公知の基から選択される保護基を有することを意味する(例えば、Protocols for Oligonucleotides and Analogs, vol 20, (Sudhir Agrawal, ed.), Humana Press, 1993, Totowa, NJ; S. L. Beaucage および R. P. Iyer, Tetrahedron, 1993, 49, 6123; S. L. Beaucage および R. P. Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223; ならびに E. Uhlmann および A. Peyman, Chem. Rev., 90, 543. を参照)。実例としては、ベンゾイル、イソブチリル、tert-ブチル、tert-ブチルオキシカルボニル、4-クロロ-ベンジルオキシカルボニル、9-フルオレニルメチル、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル、4-メトキシベンゾイル、4-メトキシトリフェニルメチル、任意に置換されたトリアゾール、p-トルエンスルホニル、任意に置換されたスルホニル、イソプロピル、任意に置換されたアミジン、任意に置換されたトリチル、フェノキシアセチル、任意に置換されたアシル、pixyl、テトラヒドロピラニル、任意に置換されたシリルエーテルおよび4-メトキシベンジルオキシカルボニルである。「Protocols for oligonucleotide conjugates」, Methods in Molecular Biology, vol 26, (Sudhir Agrawal, ed.), Humana Press, 1993, Totowa, NJ. の第１章ならびに S. L. Beaucage および R. P. Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223 には更なる適当な例が開示されている。

好ましい具体例において、単量体の LNA 中の基 B は、核塩基および保護された核塩基から選択されるのが好ましい。

この発明の単量体の LNA の具体例において、Q および Q^* の１つ、好ましくは Q^* は、Act-O-、Act-S-、Act-N(R^H)-、Act-O-CH₂-、Act-S-CH₂-、Act-N(R^H)-CH₂- から選択される基を意味し、Q および Q^* の他方、好ましくは Q は、水素、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Prot-O-、メルカプト、Prot-S-、C_1-6-アルキルチオ、アミノ、Prot-N(R^H)-、モノ-またはジ(C_1-6-アルキル)アミノ、任意に置換された C_1-6-アルコキシ、任意に置換された C_1-6-アルキル、任意に置換された C_2-6-アルケニル、任意に置換された C_2-6-アルケニルオキシ、任意に置換された C_2-6-アルキニル、任意に置換された C_2-6-アルキニルオキシ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基、リガンド、カルボキシ、スルホノ、ヒドロキシメチル、Prot-O-CH₂-、アミノメチル、Prot-N(R^H)-CH₂-、カルボキシメチル、スルホノメチル［ R^H は水素および C_1-6-アルキルから選択される］から選択される基を意味する。

上記の場合、基 Prot はそれぞれ -OH、-SH および -NH(R^H)の保護基を意味する。そのような保護基は、しかし、安定で可逆的な保護基の必要性を考慮にいれながら、ヒドロキシ保護基、メルカプト保護基およびアミノ保護基用に上記で定義されたのと同じものからそれぞれ選択される。しかし、-OH 用のどのような保護基も、ジメトキシトリチル (DMT)、モノメトキシトリチル (MMT)およびトリチルのような任意に置換されたトリチル、ならびに 9-(9-フェニル)キサンテニル (pixyl)、任意に置換された、テトラヒドロピラニル(thp) (ホスホルアミダイトオリゴヌクレオチド合成のための更に適当なヒドロキシ保護基は、Agrawal, ed.
"Protocols for Oligonucleotide Conjugates"; Methods in Molecular Biology, vol. 26, Humana Press, Totowa, NJ (1994) および Protocols for Oligonucleotides and Analogs, vol 20, (Sudhir Agrawal, ed.), Humana Press, 1993, Totowa, NJ に記載されている) から選択されるかまたはアセタールとして保護され; -SH 用のどのような保護基もジメトキシトリチル (DMT)、モノメトキシトリチル(MMT) およびトリチルのようなトリチル、ならびに 9-(9-フェニル)キサンテニル (pixyl)、任意に置換された、テトラヒドロピラニル(thp) (ホスホルアミダイトオリゴヌクレオチド合成のための更に適当なメルカプト保護基もまた、Agrawal (上記参照)に記載されている）から選択され; かつ -NH(R^H) 用のどのような保護基もジメトキシトリチル (DMT)、モノメトキシトリチル (MMT)およびトリチルのようなトリチル、ならびに 9-(9-フェニル)キサンテニル (pixyl)、任意に置換された、テトラヒドロピラニル(thp) (ホスホルアミダイトオリゴヌクレオチド合成のための更に適当なアミノ保護基もまた、Agrawal (上記参照)に記載されている）から選択されることが好ましい。

上記具体例において、ここで定義したいずれの単量体の LNA の具体例と同様、Act はそれぞれ -OH、-SH および -NH(R^H) の活性基を意味する。そのような活性基は、例えば任意に置換された O-ホスホルアミダイト、任意に置換された O- ホスホトリエステル（phosphortriester）、任意に置換された O-ホスホジエステル（phosphordiester）、任意に置換された H-ホスホネートおよび任意に置換された O-ホスホネート から選択される。

本文中で、用語「ホスホルアミダイト」は、式 -P(OR^x)-N(R^y)₂ ［式中、R^x は 任意に置換されたアルキル基、例えばメチル、2-シアノエチルまたはベンジルを意味し、R^y の各々は任意に置換されたアルキル基、例えばエチルもしくはイソプロピルを意味するかまたは基 -N(R^y)₂ はモルホリノ基 (-N(CH₂CH₂)₂O) を形成する］の基を意味する。 R^x は 2-シアノエチルを意味するのが好ましく、２つの R^y は同一でイソプロピルを意味するのが好ましい。従って、特に適切なホスホルアミダイトは、N,N-ジイソプロピル-O-(2-シアノエチル)ホスホルアミダイトである。

ただ一つの単量体の LNA または幾つかの単量体の LNA 用にここで使用される保護基は、この/これらの LNA(類) が本発明のオリゴマー中に組みこまれるときに、官能基の同時に起こる脱保護または連続して起こる脱保護を行うことができるように、選択されてもよいことが理解されるであろう。後者の状況は、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドのような１または幾つかの「活性な／官能」基を位置選択的に導入する可能性を残している［ここで、そのような基は上記したスペーサーにより結合してもよい］。

好ましい具体例において、Q は水素、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Prot-O-、メルカプト、Prot-S-、C_1-6-アルキルチオ、アミノ、Prot-N(R^H)-、モノ-またはジ(C_1-6-アルキル)アミノ、任意に置換された C_1-6-アルコキシ、任意に置換された C_1-6-アルキル、任意に置換された C_2-6-アルケニル、任意に置換された C_2-6-アルケニルオキシ、任意に置換された C_2-6-アルキニル、任意に置換された C_2-6-アルキニルオキシ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基、リガンド、カルボキシ、スルホノ、ヒドロキシメチル、Prot-O-CH₂-、アミノメチル、Prot-N(R^H)-CH₂-、カルボキシメチル、スルホノメチル［式中、Prot はそれぞれ -OH、-SH および -NH(R^H) の保護基であり、 R^H は水素および C_1-6-アルキルから選択される］から選択され; Q^* は水素、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Act-O-、メルカプト、Act-S-、C_1-6-アルキルチオ、アミノ、Act-N(R^H)-、モノ-またはジ(C_1-6-アルキル)アミノ、任意に置換された C_1-6-アルコキシ、任意に置換された C_1-6-アルキル、任意に置換された C_2-6-アルケニル、任意に置換された C_2-6-アルケニルオキシ、任意に置換された C_2-6-アルキニル、任意に置換された C_2-6-アルキニルオキシ、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基、リガンド、カルボキシ、スルホノ［式中、Act はそれぞれ -OH、-SH および -NH(R^H) の活性基であり、R^H は水素および
C_1-6-アルキルから選択される］から選択される。

一般式 II の単量体の LNA は、オリゴマーに組みこまれる LNA として、様々な立体異性体を表してもよい。従って、オリゴマーに組みこまれた LNA 用に上記で記載した立体化学異性体は、単量体の LNA の場合に等しく適用可能と考えられる(しかし、P はそのとき Q と置きかえられることに注目されたし)。

本発明の好ましい具体例において、単量体の LNA は 一般式 IIa

［式中、置換基は上記のとおりである］
を有する。

さらに、置換基、ビラジカル、R^* 等の定義に関しては、本発明に従ったオリゴマー用に上記で定義したのと同じ好ましい具体例が、また単量体の LNA の場合にも適用される。

この発明の単量体の LNA の特に興味深い具体例において、B は核塩基、好ましくはチミン、シトシン、ウラシル、アデニンおよびグアニン(特にアデニンおよびグアニン)から選択される核塩基を意味し、X は -O- であり、R^2* および R^4* は、-(CH₂)_0-1-O-(CH₂)_1-3-、-(CH₂)_0-1-S-(CH₂)_1-3- および -(CH₂)_0-1-N(R^N)-(CH₂)_1-3-、特に -O-CH₂-、-S-CH₂- および -R^N-CH₂- ［ここで R^N は水素および C_1-4-アルキルから選択される］から選択されるビラジカルを一緒になって意味し、Q は Prot-O- を意味し、R^3* は Act-OH を意味するQ^* であり、R^1*、R²、R³、R⁵ および R^5* はそれぞれ水素を意味する。この具体例において、R^N もまたDNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから選択されてもよい。

本発明の単量体の LNA の更に特に興味深い具体例において、B は、核塩基、好ましくはチミン、シトシン、ウラシル、アデニンおよびグアニン(特にアデニンおよびグアニン)から選択される核塩基を意味し、X は -O- であり、R^2* および R^4* は一緒になって、-(CH₂)_0-1-O-(CH₂)_1-3-、-(CH₂)_0-1-S-(CH₂)_1-3- および -(CH₂)_0-1-N(R^N)-(CH₂)_1-3-、特に -O-CH₂-、-S-CH₂- および -R^N-CH₂-［ここで、R^N は水素および C_1-4-アルキルから選択される］から選択されるビラジカルを意味し、Q は、ヒドロキシ、メルカプト、C_1-6-アルキルチオ、アミノ、モノ-またはジ(C_1-6-アルキル)アミノ、任意に置換された C_1-6-アルコキシ、任意に置換された C_2-6-アルケニルオキシ、任意に置換された C_2-6-アルキニルオキシ、モノホスフェート、ジホスフェートおよびトリホスフェートから選択され、R^3* は水素、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、メルカプト、C_1-6-アルキルチオ、アミノ、モノ-またはジ(C_1-6-アルキル)アミノ、任意に置換された C_1-6-アルコキシ、任意に置換された C_1-6-アルキル、任意に置換された C_2-6-アルケニル、任意に置換された C_2-6-アルケニルオキシ、任意に置換された C_2-6-アルキニルおよび任意に置換された C_2-6-アルキニルオキシから選択される Q^* であり、R³ は水素、任意に置換された C_1-6-アルキル、任意に置換された C_2-6-アルケニルおよび任意に置換された C_2-6-アルキニルから選択され、R^1*、R²、R⁵ および R^5* はそれぞれ水素を意味する。ここでまた、R^N もまた
DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから選択されてもよい。

本発明の単量体の LNA のさらに特に興味深い具体例において、B は核塩基を意味し、X は -O- であり、R² および R³ は一緒になって、-(CH₂)_0-1-O-CH=CH-、-(CH₂)_0-1-S-CH=CH- および -(CH₂)_0-1-N(R^N)-CH=CH- ［ここで R^N は水素および C_1-4-アルキルから選択される］から選択されるビラジカルを意味し、Q はヒドロキシ、メルカプト、C_1-6-アルキルチオ、アミノ、モノ-またはジ(C_1-6-アルキル)アミノ、任意に置換された C_1-6-アルコキシ、任意に置換された C_2-6-アルケニルオキシ、任意に置換された C_2-6-アルキニルオキシ、モノホスフェート、ジホスフェートおよびトリホスフェートから選択され、R^3* は水素、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、メルカプト、C_1-6-アルキルチオ、アミノ、モノ-またはジ(C_1-6-アルキル)アミノ、任意に置換された C_1-6-アルコキシ、任意に置換された C_1-6-アルキル、任意に置換された C_2-6-アルケニル、任意に置換された C_2-6-アルケニルオキシ、任意に置換された C_2-6-アルキニルおよび任意に置換された C_2-6-アルキニルオキシから選択された Q^* であり、R^1*、R^2*、R^4*、R⁵ および R^5* はそれぞれ水素を意味する。

本発明の一つの観点は、固相および/または溶液相のオリゴマー中への組み込み用 LNA の様々な誘導体を提供することである。実例として、ホスホルアミダイトアプローチ、ホスホトリエステル アプローチおよび H-ホスホネートアプローチをそれぞれ使用する、(1S,3R,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-3-(チミン-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン、(1S,3R,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-3-(シトシン-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン、(1S,3R,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-3-(ウラシル-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン、(1S,3R,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-3-(グアニン-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタンおよび (1S,3R,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-3-(アデニン-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタンの組み込みに適したモノマーは、(1R,3R,4R,7S)-7-(2-シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノキシ)-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-3-(チミン-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン、(1R,3R,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-3-(チミン-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン-7-O-(2-クロロフェニルホスフェート)ならびに (1R,3R,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-3-(チミン-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン-7-O-(H-ホスホネート) およびそれぞれその 3-(シトシン-1-イル)、3-(ウラシル-1-イル)、3-(アデニン-1-イル) および 3-(グアニン-1-イル)
類似体である。さらに、モノマーのメチレンオキシビラジカルがメチレンチオ、メチレンアミノまたは 1,2-エチレンビラジカルで置換された類似体は、また本発明の特に興味深い変形体を構成すると期待される。メチレンチオおよびメチレンアミノ類似体は、メチレンオキシ類似体として等しく適用可能であると考えられ、その結果、(1S,3R,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-3-(チミン-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン、(1S,3R,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-3-(シトシン-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン、(1S,3R,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-3-(ウラシル-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン、(1S,3R,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-3-(グアニン-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタンおよび (1S,3R,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-3-(アデニン-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタンの組み込み用に記載されたものに相当する特定の試薬はまた、本発明内の特に興味深い反応性モノマーとして、考えられる。メチレンアミン類似体としては、第２級アミンは、メチルおよびベンジルのような任意に置換された C_1-6-アルキル、トリフルオロアセチルのような任意に置換された C_1-6-アルキルカルボニル、任意に置換されたアリールカルボニルならびに任意に置換されたヘテロアリールカルボニルから選択された置換基を有してもよいことに注目されたい。

特に興味深い具体例において、本発明は、一般式 Ia

［式中、X は -O- であり; B は核塩基、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから選択され; P は、継続するモノマーへのヌクレオシド間結合のためのラジカル位、または5'-末端基を意味し、そのようなヌクレオシド間結合または 5'-末端基は任意に置換基 R⁵ を含む; R^3* は、先行するモノマーへのヌクレオシド間結合、または 3'-末端基を意味する基 P^* であり; R^2* および R^4* は一緒になって、-O-、-S、-N(R^*)-、-(CR^*R^*)_r+s+1-、-(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s-、-O-(CR^*R^*)_r+s-O-、-S-(CR^*R^*)_r+s-O-、-O-(CR^*R^*)_r+s-S-、-N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-O-、-O-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-、-S-(CR^*R^*)_r+s-S-、-N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-、-N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-S- および -S-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)- から選択されるビラジカルを意味し; 式中、各 R^* は水素、ハロゲン、アジド、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、モノ-またはジ(C_1-6-アルキル)アミノ、任意に置換された C_1-6-アルコキシ、任意に置換された C_1-6-アルキル、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから独立して選択され、かつ/または２つの隣接した(非ジェミナルな) R^* は一緒になって二重結合を意味してもよく、かつ r および s の各々は 0〜3 であり、ただし r+s の合計は 1〜4 であり; 各置換基 R^1*、R²、R³、R⁵ および R^5* は、水素、任意に置換された C_1-6-アルキル、任意に置換された C_2-6-アルケニル、ヒドロキシ、C_1-6-アルコキシ、C_2-6-アルケニルオキシ、カルボキシ、C_1-6-アルコキシカルボニル、C_1-6-アルキルカルボニル、ホルミル、アミノ、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、C_1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、アジド、C_1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、スルファニル、C_1-6-アルキルチオ、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンド、ならびにハロゲン［ここで、２つのジェミナル置換基は一緒になって、オキソを意味してもよい］から独立に選択される］
の LNA ならびにその塩基性塩および酸付加塩の少なくとも１つからなるオリゴマーに関する。特に、一つの R^* は、水素、ヒドロキシ、任意に置換された C_1-6-アルコキシ、任意に置換された C_1-6-アルキル、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから選択され、残りの置換基 R^* は、水素である。特に、ビラジカルは -O-、-(CH₂)_0-1-O-(CH₂)_1-3-、-(CH₂)_0-1-S-(CH₂)_1-3-、-(CH₂)_0-1-N(R^N)-(CH₂)_1-3-、および -(CH₂)_2-4- から選択される。

さらに興味深い具体例において、本発明は、一般式 IIa

［式中、X は -O- であり; B は核塩基、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから選択され; R^3* は基 Q^* であり; Q および Q^* の各々は、水素、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Prot-O-、Act-O-、メルカプト、Prot-S-、Act-S-、C_1-6-アルキルチオ、アミノ、Prot-N(R^H)-、Act-N(R^H)-、モノ-またはジ(C_1-6-アルキル)アミノ、任意に置換された C_1-6-アルコキシ、任意に置換された
C_1-6-アルキル、任意に置換された C_2-6-アルケニル、任意に置換された C_2-6-アルケニルオキシ、任意に置換された C_2-6-アルキニル、任意に置換された C_2-6-アルキニルオキシ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基、リガンド、カルボキシ、スルホノ、ヒドロキシメチル、Prot-O-CH₂-、Act-O-CH₂-、アミノメチル、Prot-N(R^H)-CH₂-、Act-N(R^H)-CH₂-、カルボキシメチル、スルホノメチル［ここで、Prot はそれぞれ-OH、-SH および -NH(R^H) の保護基であり、Act はそれぞれ -OH、-SH および -NH(R^H) の保護基であり、R^H は水素 および C_1-6-アルキルである］から独立に選択され; R^2* および
R^4* は一緒になって、 -O-、-S、-N(R^*)-、-(CR^*R^*)_r+s+1-、-(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s-、-O-(CR^*R^*)_r+s-O-、-S-(CR^*R^*)_r+s-O-、-O-(CR^*R^*)_r+s-S-、-N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-O-、-O-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-、-S-(CR^*R^*)_r+s-S-、-N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-、-N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-S- および -S-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)- から選択されるビラジカルを意味し; ここで各 R^* は、水素、ハロゲン、アジド、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、モノ-またはジ(C_1-6-アルキル)アミノ、任意に置換された C_1-6-アルコキシ、任意に置換された C_1-6-アルキル、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから独立して選択され、および/または２つの隣接した(非ジェミナルな) R^* は一緒になって、二重結合を意味してもよく、かつ r および s の各々は、 0〜3 であり、ただし r+s の合計は 1〜4 である; 各置換基 R^1*、R²、R³、R⁵ および R^5* は、水素、任意に置換された C_1-6-アルキル、任意に置換された C_2-6-アルケニル、ヒドロキシ、C_1-6-アルコキシ、C_2-6-アルケニルオキシ、カルボキシ、C_1-6-アルコキシカルボニル、C_1-6-アルキルカルボニル、ホルミル、アミノ、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、C_1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、アジド、C_1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、スルファニル、C_1-6-アルキルチオ、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基、およびリガンド、ならびにハロゲン［ここで、２つのジェミナル置換基は一緒になってオキソを意味してもよい］から独立して選択され；］の LNA ならびにその塩基性塩および酸付加塩［ただし、オリゴヌクレオチド合成において普及している条件下で反応性な、いずれの化学基(いずれの核塩基も含む)も任意に官能基は保護される］に関する。好ましくは、一つの R^* が水素、ヒドロキシ、任意に置換された C_1-6-アルコキシ、任意に置換された C_1-6-アルキル、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから選択され、残りのいずれの置換基
R^* も水素である。特に、ビラジカルは -O-、-(CH₂)_0-1-O-(CH₂)_1-3-、-(CH₂)_0-1-S-(CH₂)_1-3-、-(CH₂)_0-1-N(R^N)-(CH₂)_1-3- および -(CH₂)_2-4- から選択される。

通常、本発明は、親和性および特異性に関して良好なハイブリッド化特性を驚いたことに有するオリゴマーを提供する。従って、本発明は、ヌクレオシド類似体を全く含まない相当する非修飾な参照オリゴヌクレオチドのよりも、少なくとも 2.5 ℃高い、好ましくは少なくとも 3.5 ℃高い、特に少なくとも 4.0 ℃高い、ことのほか少なくとも 5.0 ℃高い、オリゴマーに、相補的な DNA オリゴヌクレオチドとの Tm を与える少なくとも一つのヌクレオシド類似体からなるオリゴマーを提供する。特にオリゴマーの Tm は少なくとも 2.5 x N ℃高く、好ましくは少なくとも 3.5 x N ℃高く、特に少なくとも 4.0 x N ℃高く、ことのほか少なくとも 5.0 x N ℃高い［N はヌクレオシド類似体の数である］。

相補的な RNA オリゴヌクレオチドとのハイブリッド化の場合、少なくとも一つのヌクレオシド類似体は、ヌクレオシド類似体を全く含まない相当する非修飾な参照オリゴヌクレオチドのよりも、少なくとも 4.0 ℃高い、好ましくは少なくとも 5.0 ℃高い、特に少なくとも 6.0 ℃高い、ことのほか少なくとも 7.0 ℃高い、オリゴマーに、相補的な DNA オリゴヌクレオチドとの Tm を与える。特に、オリゴマーの Tm は少なくとも 4.0 x N ℃高く、好ましくは少なくとも 5.0 x N ℃高く、特に少なくとも 6.0 x N ℃高く、ことのほか少なくとも 7.0 x N ℃高い［N はヌクレオシド類似体の数である］。

用語「相当する非修飾な参照オリゴヌクレオチド」は、完全に同じ順序(そして同じ配向)の同じ核塩基を表す天然に存在するヌクレオチドのみからなるオリゴヌクレオチドを意味することを意図している。

Tm は以下の条件(すなわち実施例129に説明したものと本質的に同じに):
a) 10 mM Na₂HPO₄、pH 7.0、100 mM NaCl、0.1 mM EDTA;
b) 10 mM Na₂HPO₄ pH 7.0、0.1 mM EDTA; または
c) 3M テトラメチルアンモニウムクロライド (TMAC)、10 mM Na₂HPO₄、pH 7.0、0.1 mM EDTA;
の一つの下、
好ましくは条件 a) の下、オリゴマーおよび相補的な DNA オリゴヌクレオチドの等量(典型的には 1.0 μM) で測定する。

少なくとも一つのヌクレオシド類似体が式 I［式中、 B は核塩基である］を有するオリゴマーは、上記で定義したとおりが好ましい。特に興味深いのは、少なくとも一つのヌクレオシド類似体がアデニンおよびグアニンから選択される核塩基を含む場合である。

さらに、特異性および親和性に関して、部分的に相補的な DNA オリゴヌクレオチドまたは部分的に相補的な RNA オリゴヌクレオチドとハイブリッド化するとき、該オリゴマーと１以上のミスマッチを有するオリゴマーは、該ミスマッチの結果、ヌクレオシド類似体を全く含まない、相当する非修飾な参照オリゴヌクレオチドでみられる減少と同じかまたはより大きい減少を Tm において生じるであろう。また、オリゴマーは、相当する非修飾な参照オリゴヌクレオチドのと実質的に同じ、ハイブリッド化緩衝液のイオン強度に対する Tm の感度を有するであろう。

ここで定義されたオリゴマーは、典型的に少なくとも 30 % 修飾され、好ましくは少なくとも 50 % 修飾され、特に 70 % 修飾され、およびある興味深い適用においては 100 % 修飾される。

本発明のオリゴマーは、相当する非修飾な参照オリゴヌクレオチドよりも実質的により高い 3'-エキソヌクレオリティック（exonucleolytic）安定性を有している。この重要な物性は実施例 136 において記載されているように試験される。

（定義）
本文中で、用語「C_1-12-アルキル」は、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、シクロプロピル、ブチル、tert-ブチル、イソ-ブチル、シクロブチル、ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、およびドデシルのような1 〜 12 の炭素原子を有する直鎖状、環状または分岐状炭化水素基を意味する。類似して、用語「C_1-6-アルキル」は、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシルのような1 〜 6 の炭素原子を有する直鎖状、環状または分岐状炭化水素基を意味し、用語「C_1-4-アルキル」は、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、シクロプロピル、ブチル、イソ-ブチル、tert-ブチル、シクロブチルのような 1 〜 4 の炭素原子を有する直鎖状、環状または分岐状炭化水素基を含めることを意図する。

「C_1-6-アルキル」の好ましい例はメチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、ブチル、tert-ブチル、イソ-ブチル、ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、特にメチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、tert-ブチル、イソ-ブチルおよびシクロヘキシルである。「C_1-4-アルキル」の好ましい例は、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、ブチル、tert-ブチルおよびイソ-ブチルである。

同様に、用語「C_2-12-アルケニル」も2 〜 12 の炭素原子を有し、１つの不飽和結合からなる直鎖状、環状または分岐状炭化水素基を含む。アルケニル基の例としては、ビニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ドデカエニルである。類似して、用語「C_2-6-アルケニル」は、2 〜 6 の炭素原子を有し、１つの不飽和結合からなる直鎖状、環状または分岐状炭化水素基を含むことを意図する。アルケニルの好ましい例は、ビニル、アリル、ブテニルであり、特にアリルである。

同様に、用語「C_2-12-アルキニル」は、2 〜 12 の炭素原子を有し、１つの三重結合を有する直鎖状または分岐状炭化水素基を意味する。その例は、エチニル、プロピニル、ブチニル、オクチニルおよびドデカニルである。

本文中で、すなわち用語「アルキル」、「アルケニル」および「アルキニル」に関して、用語「任意に置換された」は、該基が、ヒドロキシ(不飽和炭素原子に結合しているとき、互変異性ケト体で存在してもよい)、C_1-6-アルコキシ(すなわち、C_1-6-アルキル-オキシ)、C_2-6-アルケニルオキシ、カルボキシ、オキソ
(ケトまたはアルデヒド官能性を形成する)、C_1-6-アルコキシカルボニル、C_1-6-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ;カルバモイル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノカルボニル、アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、C_1-6-アルキルカルボニルアミノ、シアノ、グアニジノ、カルバミド、C_1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C_1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、スルファニル、C_1-6-アルキルチオ、ハロゲン［ここで、いずれのアリールおよびヘテロアリールも、「任意に置換されたアリールおよびヘテロアリール」用に以下で特に記載されたように置換されてもよい］から選択される基で１または何回か、好ましくは1〜3回、置換されていてもよいことを意味する。

置換基は、ヒドロキシ、C_1-6-アルコキシ、カルボキシ、C_1-6-アルコキシカルボニル、C_1-6-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリール、アミノ、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノカルボニル、アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、C_1-6-アルキルカルボニルアミノ、シアノ、カルバミド、ハロゲン［ここで、アリールおよびヘテロアリールは、C_1-4-アルキル、C_1-4-アルコキシ、ニトロ、シアノ、アミノまたはハロゲンで、1〜5 回、好ましくは 1〜3 回、置換されていてもよい］から選択されるのが好ましい。特に好ましい例は、ヒドロキシ、C_1-6-アルコキシ、カルボキシ、アリール、ヘテロアリール、アミノ、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノおよびハロゲン［ここで、アリールおよびヘテロアリールは、C_1-4-アルキル、C_1-4-アルコキシ、ニトロ、シアノ、アミノまたはハロゲンで 1〜3 回置換されていてもよい］である。

本文中で用語「アリール」は、フェニル、ナフチル、1,2,3,4-テトラヒドロナフチル、アントラシル、フェナントラシル、ピレニル、ベンゾピレニル、フルオレニルおよびキサンテニルのような完全にまたは部分的に芳香族炭素環式環または環系を意味し、そのうちフェニルが好ましい例である。

用語「ヘテロアリール」は、１以上の炭素原子がヘテロ原子、例えば窒素 (=N- または -NH)、硫黄および/または酸素原子で置き換えられている、完全にまたは部分的に芳香族炭素環式環または環系を意味する。そのようなヘテロアリール基の例は、 オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピペリジニル、クマリル、フリル、キノリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾジアゾリル、ベンゾオキソゾリル、フタラジニル、フタラニル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソキノリル、アクリジニル、カルバゾリル、ジベンゾアゼピニル、インドリル、ベンゾピラゾリル、フェノキサゾニルである。

本文中で、すなわち、用語「アリール」および「ヘテロアリール」に関して、用語「任意に置換された」は、該基が、ヒドロキシ(エノール系に存在しているとき、互変異性ケト体で存在してもよい)、C_1-6-アルキル、C_1-6-アルコキシ、オキソ(互変異性エノール体で表されてもよい)、カルボキシ、C_1-6-アルコキシカルボニル、C_1-6-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ、アリールオキシカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリール、アミノ、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ; カルバモイル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノカルボニル、アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、C_1-6-アルキルカルボニルアミノ、シアノ、グアニジノ、カルバミド、C_1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C_1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、スルファニル、ジハロゲン-C_1-4-アルキル、トリハロゲン-C_1-4-アルキル、ハロゲン［ここで、置換基を表すアリールおよびヘテロアリールは、C_1-4-アルキル、C_1-4-アルコキシ、ニトロ、シアノ、アミノまたはハロゲンで1〜3回置換されていてもよい］から選択された基で、１または何回か、好ましくは１〜5回、特に１〜３回、置換されていてもよいことを意味する。好ましい例は、ヒドロキシ、C_1-6-アルキル、C_1-6-アルコキシ、カルボキシ、C_1-6-アルコキシカルボニル、C_1-6-アルキルカルボニル、アリール、アミノ、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノおよびハロゲン［ここで、アリールは、C_1-4-アルキル、C_1-4-アルコキシ、ニトロ、シアノ、アミノまたはハロゲンで1〜3回置換されていてもよい］である。

「ハロゲン」には、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを含む。

オリゴマー(その中に LNA が組みこまれている)および LNA それ自体には、可能なそれらの塩を含み、その医薬的に許容な塩が特に適切であると、理解されるであろう。塩には酸付加塩および塩基性塩を含む。酸付加塩の例は、塩酸塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、カリウム塩等である。塩基性塩の例は、(残りの)対イオンが、ナトリウムおよびカリウムのようなアルカリ金属、カルシウムのようなアルカリ土類金属およびアンモニウムイオン (⁺N(R^g)₃R^h ［ここで、 R^g および R^h の各々は、任意に置換された C_1-6-アルキル、任意に置換された C_2-6-アルケニル、任意に置換されたアリールまたは任意に置換されたヘテロアリールを独立して意味する］から選択される塩である。医薬的に許容な塩は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mack Publishing Company, Easton, PA, U.S.A., 1985 および より最近の版および
Encyclopedia of Pharmaceutical Technology に記載されているものである。従って、ここで用いられる用語「それらの酸付加塩または塩基性塩」は、そのような塩を含むように意図している。さらに、オリゴマーおよび LNA ならびにいずれのその中間体または出発原料もまた、水和物の形態で存在してもよい。

（モノマーの製造）
好ましい具体例において、付加的な 2'-O,4'-C-結合環を含むヌクレオシドは、以下の方法により合成された。

多数の 4'-C-ヒドロキシメチルヌクレオシドの合成は、初期に報告されていた
(R. D. Youssefyeh, J. P. H. Verheyden および J. G. Moffatt, J. Org. Chem., 1979, 44, 1301; G. H. Jones, M. Taniguchi, D. Tegg および J. G. Moffatt, J. Org. Chem., 1979, 44, 1309; C. O-Yang, H. Y. Wu, E. B. Fraser-Smith および K. A. M. Walker, Tetrahedron Lett., 1992, 33, 37; H. Thrane, J. Fensholdt, M. Regner および J. Wengel, Tetrahedron, 1995, 51, 10389; K. D. Nielsen, F. Kirpekar, P. Roepstorff および J. Wengel, Bioorg. Med.
Chem., 1995, 3, 1493)。2'-O,4'-C-結合 2環式ヌクレオシドの合成の例として、4'-C-ヒドロキシメチルフラノース誘導体 31 から出発する方法を選択した。ベンジル化、アセチル化およびアセトリシス続いて別のアセチル化により、ヌクレオシドカップリングのキー中間体であるフラノース 33 を与える。シリル化されたチミンとの立体選択的反応により、化合物 34 を与え、それを脱アセチル化してヌクレオシドジオール 35 を与えた。トシル化、引き続き塩基-誘導的閉環により 2'-O,4'-C-結合 2環式ヌクレオシド誘導体 36 を与えた。脱ベンジル化により保護されていない2環式 ヌクレオシド類似体 37 を生じ、それを 5'-O-4,4'-ジメトキシトリチル保護類似体 38 へ、および続いてオリゴヌクレオチド合成用ホスホルアミダイト誘導体 39 へ変換した。同様の方法を、実施例部分において例示したように、対応するウラシル、アデニン、シトシンおよびグアニンヌクレオシドの合成に使用した。このカップリング方法は、当該分野の当業者にとって明らかであろう幾つかの可能な方法のほんの一つである。 前もって形成された（preformed）ヌクレオシド から出発する方法も可能である。従って、例えば、ウリジン誘導体 62 の誘導体 44 への変換は、トシル化、脱イソプロピリデン化および塩基-誘導的閉環によりうまく達成された。別の例として、ヌクレオシド 67 のヌクレオシド 61B への変換は、図 34 に記載されているように達成された。2環式チミンヌクレオシド 37 の対応する 5-メチル-シトシンヌクレオシド 65 への変換は、トリアゾールおよび POCl₃ を使用する公知反応連続、引き続きベンジル化およびアンモニアによる処理により達成された。同様の方法が44 からの 57C の合成にも適用可能であろう。別の可能な方法の例としては、既に付加的な環を含む予備環化されたフラノース誘導体を、核塩基誘導体とカップリングするものが可能である。そのような方法は、さらに対応する α-ヌクレオシド類似体も合成できるであろう。保護されたメチルフラノシドとの 4-C,2-O-メチレン-D-リボフラノースのカップリングにおいて、我々は主に環の開環した生成物を得た。しかし、1-O-アセチルフラノース 207 またはチオフェニルフラノース 212 のカップリングによっては、単一生成物として、うまくα-アノマーとの LNA ヌクレオシドを生じた。そのような α-LNA ヌクレオシドの組み込みは、通常のオリゴマー化技術を使用して可能であり( Zを含有する LNA オリゴマーに関して)、α-LNA オリゴマーを生じる。加えて、環閉環用に既に活性化された 4'-C-ヒドロキシメチルフラノース (例えば4'-C-ヒドロキシメチル基にメシルまたはトシル基を含むことにより)を使用するヌクレオシドカップリングを行う合成的方法は、フラノース 78 のヌクレオシド 79 への変換、引き続いて脱保護および環閉環して 36 を与えることにより例示されるのが可能である。適当なフラノース誘導体またはヌクレオシドの化学的もしくは酵素的グリコシド変換反応またはアノマー化は、今のところ他の可能な合成的方法である。これらのおよび他の関連する方法により、他の核塩基またはそれらの類似体を含有する 2環式ヌクレオシドの合成を、これらの核塩基または類似体とカップリングするか、または予め形成されたヌクレオシド誘導体から出発することのいずれかにより、可能とする。

記載された例は、この発明の方法および実施例を説明するためのものであることを意味する。合成された化合物の構造は、1D または 2D NMR 技術、例えば、NOE 実験を用いて確認した。

本発明の付加的な具体例は、異なるサイズかつ異なる化学構造の付加的な環を含有する 2環式ヌクレオシドを提供することである。記載された方法から、他のヌクレオシドの環化が同様な方法を用いて可能であり、異なる C- 枝分かれを含有するヌクレオシドも、同様であることは、有機合成分野の当業者には明らかである。当該分野の当業者は、文献中に、例えば、国際特許出願公開第 WO 96/14329号参照、置換されたヌクレオシド類似体中間体の合成のための、示唆および手本を見出すことができるであろう。異なる化学組成の環を考慮すると、同様な方法または有機化学の分野でよく確立された方法を使用すると、例示したオキソ類似体の例えばチオ類似体の合成は、対応するアミノ類似体の合成のように可能であることは明らかである(例えば求核的置換反応または還元的アルキル化を使用して)。

実施例部分において、アミノ LNA 類似体 73〜74F の合成を記載している。 74 および 74D のオリゴマー化用標準的なビルディングブロックへの変換は、 5'-O-DMT 保護および 3'-O-ホスフィチレーション（phosphitylation）引き続いての標準的な方法により可能であった。アミノ LNA 類似体には、 2'-アミノ官能基の保護が統制された直鎖状オリゴマー化のために必要である。そのような保護は、例えば、Fmoc、トリフルオロアセチルまたは BOC のような標準的なアミノ基保護技術を使用して達成することができる。代わりに、N-アルキル基(例えば、ベンジル、メチル、エチル、プロピルまたは官能基化されたアルキル)は、ヌクレオシド変換およびオリゴマー化の間、保つことができる。図３５および３６において、 N-トリフルオロアセチルおよび N-メチル誘導体を使用する方法を示す。図３７に概要するように、ヌクレオシド 75 の 2'-チオ-LNA ヌクレオシド類似体 76D への変換は、うまく行われ、引き続いてのホスホルアミダイト誘導体 76F の合成もうまく行われた。化合物 76F は、2'-チオ-LNA オリゴヌクレオチドの自動合成用に必要な構造を有している。N-トリフルオロアセチル 2'-アミノ-LNA シントン 74A は、 2'-アミノ-LNA オリゴヌクレオチドの自動合成用に必要な構造を有している。

2'-チオおよび 2'-アミノ LNA ヌクレオシドの対応するシトシン、グアニンおよびアデニン誘導体の合成は、図３５、３６および３７に示されるものと同様の方法を使用して達成することができる。代わりに、 C-2' の立体化学は環化の前に、便利に配置された、例えばアラビノ配置、フラノールシントンを使用することにより、またはリボ-配置のヌクレオシド/フラノースから出発した C-2' 炭素原子の配置を反転させることにより反転することができる。2'-β-OH の続く活性化、例えばトシル化、上記に例示したウラシル/チミンにおけるような二重求核置換は、望ましい 2環式 2'-チオ-LNA または 2'-アミノ-LNA ヌクレオシドを提供することが可能である。そのようにして得られた適当に保護されたシトシン、グアニンおよびアデニン類似体は、他の例として上記で記載したように標準的な反応(DMT-保護およびホスフィチレーション)を使用してオリゴマー化用に合成することが可能である。

（オリゴマーの合成）
本発明の直鎖状-、分岐状- (M. Grotli および B. S. Sproat, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1995, 495; R. H. E. Hudson および M. J. Damha, J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 2119; M. Von Buren, G. V. Petersen, K. Rasmussen, G. Brandenburg, J. Wengel および F. Kirpekar, Tetrahedron, 1995, 51, 8491) および 環状- (G. Prakash および E. T. Kool, J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 3523) オリゴ- およびポリヌクレオチドは、有機化学分野の当業者によく知られた核酸化学の重合技術を使用して合成してもよい。ホスホルアミダイト化学(S. L. Beaucage および R. P. Iyer, Tetrahedron, 1993, 49, 6123; S. L. Beaucage および R. P. Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223)を使用したが、しかし例えば H-ホスホネート化学、ホスホトリエステル化学または酵素的合成もまた使用できうる。通常、標準的なカップリング条件およびホスホルアミダイトアプローチを使用したが、この発明の幾つかのモノマーについては、より長いカップリング時間および/または新鮮な試薬での繰り返しカップリングおよび/またはより濃縮されたカップリング試薬を使用した。別の可能性として、1H-テトラゾールより活性な活性化剤も、カップリング反応速度を増加させるのに使用できる。ホスホロアミダイト 39、46、53、57D、61D および 66 すべては、>95% の逐次的カップリング収率を満たして結合した。全-ホスホロチオエート LNA オリゴマー(表７)を標準的な方法を使用して合成した。従って、ホスホジエステルオリゴマーの合成で使用される通常の、例えばヨウ素/ピリジン/H₂O、酸化を、Beaucage's 試薬(市販で入手可能)を使用する酸化と交換することにより、ホスホチオエート LNA オリゴマーを効率的に合成した(逐次的カップリング収率 >= 98%)。2'-アミノ-LNA および 2'メチルアミノ-LNA オリゴヌクレオチド(表９)をアミダイト 74A および 74Fを使用して効率的に合成した(逐次的カップリング収率≧
98%)。2'-チオ-LNA オリゴヌクレオチド(表８)を、LNA オリゴヌクレオチド用に上記で記載したような、標準的なホスホルアミダイト方法を使用するアミダイト 76F を使用して、効率的に合成した。所望の配列の合成の後、後処理を標準的な条件を使用して行った(固形支持体からの開裂および55 ℃で５時間 30% アンモニアを使用する保護基の除去）。LNA オリゴヌクレオチドの精製を、使い捨ての逆相精製カートリッジおよび/または逆相 HPLC および/またはエタノールもしくはブタノールから沈殿させることを使用して行った。キャピラリーゲル電気泳動、逆相 HPLC および MALDI-MS を使用して合成したオリゴヌクレオチド類似体の純度を確認し、かつ本発明の 2環式 ヌクレオシド類似体の所望な数が予期したように組みこまれていることの確認をした。

本発明の付加的な観点は、非天然なヌクレオシド間結合により結合した LNA を含有するオリゴヌクレオチド類似体の製法を提供することである。例えば、対応するホスホロチオエートまたはホスホロアミダイト類似体の合成は、オリゴヌクレオチド化学(Protocols for Oligonucleotides and Analogs、vol 20、(Sudhir Agrawal, ed.)、Humana Press, 1993, Totowa, NJ; S. L. Beaucage および R. P. Iyer, Tetrahedron, 1993, 49, 6123; S. L. Beaucage および R. P. Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223; E. Uhlmann および A. Peyman, Chem. Rev.,
90, 543)の分野でよく確立された方法を使用することにより可能である。

従って、通常、本発明はまた、LNA 修飾 オリゴヌクレオチドの製造用にここに定義したような LNA の使用を提供する。LNA 修飾オリゴヌクレオチドは、正常なヌクレオシド(すなわち、リボヌクレオシドおよび/またはジオキシリボヌクレオシドのような天然に存在するヌクレオシド)、および一般式IIで定義されるものとは異なる修飾されたヌクレオシドからなってもよいことは理解されるであろう。特に興味深い具体例において、LNA の組み込みは、オリゴヌクレオチドの可能性を調節し、核酸活性酵素の基質としてふるまう。

さらに、任意に保護された核塩基および 任意に 5'-OH 保護された LNA がそこに固定された固形支持体材料は、LNA モノマーが 3' 末端に含まれている LNA
修飾オリゴヌクレオチド合成の材料として特に興味深い。この場合、固形支持体材料は、 CPG が好ましく、例えば容易に(市販で)入手可能な CPG 材料である。その上に、 3'-官能基化された、任意に保護された核塩基および任意に5'-OH 保護された LNA は、特定な材料用の供給者により示された条件を使用して結合される。BioGenex Universial CPG Support (BioGenex, U.S.A.) は、例えば使用することができる。 5'-OH 保護基は、例えば DMT 基であってもよい。3'-官能基は該 CPG 材料に適用可能な条件を充分考慮して選択されるべきである。

（適用）
この発明は、種々の新規な２環式オリゴヌクレオシドモノマーの誘導体(LNA)がオリゴヌクレオチドに組みこまれると、これらの修飾されたオリゴヌクレオチドが、修飾されていないオリゴヌクレオチドに比べ、相補的ssDNAおよびssRNAの両方に対して劇的に高い親和性を示すという意外な発見を開示する。この発明はまた、完全にLNA修飾オリゴヌクレオチドおよび部分的にLNA修飾オリゴヌクレオチドが、それらの相補的核酸配列に対して非常に高いハイブリッド化特性を示すという意外な発見を開示する。適用に応じてこれらのLNAを用いることによって、標準的なオリゴヌクレオチドにおいて、特異性が脅かされることなく親和性が大いに高まる（オリゴヌクレオチドの一定の大きさ）、あるいは親和性が脅かされることなく特異性が非常に高まる（オリゴヌクレオチドの大きさの縮減）かのいずれかに興味をそそる可能性が提供される。この発明はまた、LNA修飾オリゴヌクレオチドが、非常に高いハイブリッド化特性に加え、正常なDNAオリゴヌクレオチドおよびRNAオリゴヌクレオチドの有用な物理化学特性の多くを示すという意外な発見を開示する。ここに挙げる例としては、LNA修飾オリゴヌクレオチドの優れた溶解性、塩化ナトリウムおよびテトラメチルアンモニウムクロリドのような塩に対する反応性（修飾されていないオリゴヌクレオチドのそれによく似ている）、種々のポリメラーゼのプライマーとして作用するLNA修飾オリゴヌクレオチドの能力、熱安定性DNAポリメラーゼを用いたターゲット増幅反応においてプライマーとして作用するLNA修飾オリゴヌクレオチドの能力、T4 ポリヌクレオチドキナーゼの基質として作用するLNA修飾オリゴヌクレオチドの能力、ストレプタビジン（streptavidine）被覆した固形表面上にPCR アンプリコンを配列特異的に捕捉するビオチニル化された（biotinylated）LNAの能力、アンプリコンを配列特異的に捕捉する固定化されたLNA修飾オリゴヌクレオチドの能力、および鎖侵入（invasion）による、２本鎖DNAを配列特異的にターゲットするLNA修飾オリゴヌクレオチドの非常に重要な能力が含まれる。したがって、これらの新規なヌクレオシド類似体が、治療、診断および分子生物学におけるオリゴヌクレオチドベースの技術の実施全般を向上させる非常に有用な道具であることは当業者にとって明らかである。

この発明の目的は、オリゴヌクレオチドの合成での当業者に公知の手順および装置を用い、オリゴヌクレオチドに組みこまれうる、この発明によるモノマー性（単量体）LNAを提供することである。

この発明の別の目的は、相補的オリゴヌクレオチドに配列特異的にハイブリッド化し、修飾されていないオリゴヌクレオチドによって形成された対応する複合体よりも親和性が実質的に高い２重らせんあるいは３重らせんのいずれかを形成することのできる、完全にあるいは部分的にLNA修飾オリゴヌクレオチド（オリゴマー）を提供することである。

この発明の別の目的は、LNAを用い、親和性を脅かすことなく正常なオリゴヌクレオチドの特異性を高めることである。これは、正常なオリゴヌクレオチドの大きさを（したがって親和性を）小さくして、LNAを組み込むことによって生じる親和性の増大に釣り合うようにすることによって達成されうる。

この発明の別の目的は、LNA、正常なヌクレオシドおよび他のヌクレオシドを含む完全におよび部分的に修飾されたオリゴヌクレオチドを提供することである。

この発明のさらに別の目的は、LNAの高い親和性を活用し、「鎖置換」によってdsDNA分子におけるターゲット配列に結合できる非常に高い親和性を有する修飾されたオリゴヌクレオチドを作ることである。

この発明のさらに別の目的は、オリゴヌクレオチドに組み込まれると、その相補的ヌクレオシドに対する親和性が異なる種々のクラスのLNAを提供することである。この発明によると、これは、正常な核酸Ｇ、Ａ、Ｔ、ＣおよびＵを例えば改変（altered）水素結合可能性を有する誘導体で置換することによって、あるいは主鎖構造の異なるLNAを用いることによって達成される。このような種々のLNAを利用することによって、修飾されたオリゴヌクレオチドの親和性を大きく変えることができる。

この発明の別の目的は、ヌクレアーゼに対する耐性が、修飾されていないオリゴヌクレオチドよりも高いLNA修飾オリゴヌクオチドを提供することである。

この発明の別の目的は、RNAseHをリクルートすることのできるLNA修飾オリゴヌクオチドを提供することである。

この発明の別の目的は、DNAおよびRNAポリメラーゼの基質として作用し、それによって成長(growing)核酸鎖に取りこまれるか、あるいは鎖終結因子として作用することのできるLNAを提供することである。

この発明のさらに別の目的は、治療剤として作用しうるLNAを提供することである。治療用ヌクレオシド類似体の多くの例は公知のものであり、ここに開示されているヌクレオシド類似体に類似した誘導体は、以下の文献から公知の方法を用いて合成できる (E. De Clercq, J. Med. Chem. 1995, 38, 2491; P. Herdewijn および E. De Clercq: Classical Antiviral Agents and Design og New Antiviral Agents. In: A Textbook of Drug Design and Development; Eds. P. Krogsgaard-Larsen, T. Liljefors および U. Madsen; Harwood Academic Publishers, Amsterdam, 1996, p. 425; I. K. Larsen: Anticancer Agents.In: A Textbook of Drug Design and Development; Eds. P. Krogsgaard-Larsen, T. Liljefors および U. Madsen; Harwood Academic Publishers, Amsterdam, 1996, p. 460)。

２本鎖RNA は、抗ウィルス活性および腫瘍抑圧活性を有することが明らかにされている。(Sharp ら, Eur. J. Biochem. 230(1): 97-103, 1995, Lengyel-P. ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90(13): 5893-5, 1993, および Laurent-Crawford ら, AIDS Res. Hum. Retroviruses, 8(2): 285-90, 1992)。 ２本鎖LNAには、治療活性を有する２本鎖RNAの効果と同様の効果があるかもしれず、したがってこのような２本鎖LNAは治療薬としての可能性がある。

ここで用いる用語「天然の核酸」は、広い意味での核酸、例えばあらゆる由来の無傷な細胞あるいはウイルス（vira）に存在する核酸、化学的または物理的手段によってそうしたソースから放出される核酸、あるいは増幅によってそうした一次ソースから派生する核酸を称する。天然の核酸は、１本鎖、２本鎖、または部分的な２本鎖であってもよく、比較的純粋なものあるいは異なる核酸を混合したものであってもよい。また、他の核酸や他の細胞成分を含有する粗な生物学的試料の成分であってもよい。一方、「合成の核酸」は、化学的な合成によって製造されたあらゆる核酸を称する。

また、この発明は、核酸ベースの治療、診断および分子生物学におけるLNA修飾オリゴヌクレオチドの用途を提供する。LNA修飾オリゴヌクレオチドは、天然あるいは合成の核酸の検出、同定、捕捉、評価、定量およびフラグメンテーションに用いられるとともに、生体内および試験管内での翻訳および転移ブロック剤として用いられる。多くの場合、様々の分子をLNA修飾オレゴヌクレオチドに結合させるのは興味深いことであるだろう。こうした分子は、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に結合させるか、またはその内部の1つより多い位置に結合させてもよい。あるいは、5' または 3'末端に連結させたスペーサーを介してオリゴヌクレオチドに結合させてもよい。そうした分子の代表的な基としては、DNA インターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート基、リポーター基およびリガンドである。一般に、修飾されていないDNAおよびRNAオリゴヌクレオチドをこれらの分子で標識を付ける方法は全て、LNA修飾オリゴヌクレオチドに標識を付けるのに用いることができる。同様に、標識を付けたオリゴヌクレオチドを検出するのに用いる方法は全て、対応する標識を付けたLNA修飾オリゴヌクレオチドに適用できる。

（治療）
用語「鎖置換」は、オリゴヌクレオチドが、ターゲット鎖から他方の鎖を置き換えさせるように、２本鎖DNAまたはRNAにおけるその相補的ターゲット配列に結合するプロセスに関する。

この発明の１つの観点では、「鎖置換」を行いうるLNA 修飾ヌクレオチドは、「アンチ遺伝子」アプローチに基づく新規な薬剤の開発に活用される。三重らせんを形成しうるオリゴヌクレオチドとは対照的に、こうした「鎖置換」オリゴヌクレオチドでは、dsDNA中のいかなる配列をもターゲットにできかつ生理的イオン強度およびpHでのターゲットが可能である。

「鎖置換」オリゴヌクレオチドは、分子内水素結合ゆえにRNAターゲット配列にアクセスできない場合、アンチセンスアプローチにおいて有利に利用されうる。こうした分子内構造はmRNA 中に生じうるので、アンチセンスアプローチによってmRNAの翻訳を「シャットダウン」しようとする場合に大きな問題となる。

他のクラスの細胞RNA、例えばtRNA、rRNA、snRNAおよび scRNAは、その機能上重要な細胞内構造を含んでいる。これらのクラスの高度に構成されたRNAは、タンパク質をエンコードするのではなく、mRNAのスプライシング、ポリアデニル化、翻訳、校正、染色体末端の完全性の維持のような一定の範囲の細胞機能に（RNA/タンパク質粒子の形態で）関与している。その高度な構造は、正常オリゴヌクレオチドの有効なハイブリッド化を損なうかあるいは阻止するものであるため、このクラスのRNAは従来、アンチセンスターゲットとしての注目は集めていなかった。

高い親和性のLNAモノマーを用いることによって、このようなターゲットRNAと有効にハイブリッド化する、十分な熱安定性を有するアンチセンスプローブを構成することが容易になるはずである。したがって、好ましい実施例では、LNAを用いてオリゴヌクレオチドに十分な親和性を持たせ、これらのクラスのRNAとハイブリッド化させ、それによってRNAの含まれる粒子の機能の数および／質を調節する。

ある場合には、遺伝子の発現を抑制することが有利であり、他の場合には活性化することが有利であるかもしれない。Mollegaard らによって示されているように(Mollegaard, N. E.; Buchardt, O.; Egholm, M.; Nielsen, P. E. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994, 91, 3892)、「鎖置換」することのできるオリゴマーは、RNA転写活性化因子としても機能しうる。この発明の１つの観点では、「鎖置換」することのできるLNAは、治療目的において興味ある遺伝子を活性化するのに用いられる。

多数のウィルス感染症および癌の化学療法において、ヌクレオシドおよびヌクレオシド類似体は効果的であることがわかっている。LNAヌクレオシドは、そうしたヌクレオシドベースの薬剤として有用である可能性がある。

種々のタイプの２本鎖RNAは、いくつかのタイプの癌の成長を抑える。１個以上のLNAオリゴヌクレオチドを含む２重らせんは、そうした２本鎖の薬剤として有用である可能性がある。

この発明はまた、医薬的に許容されうるキャリヤーと組み合わされる、上に定義された医薬的に活性なLNA修飾オリゴヌクレオチドあるいは医薬的に活性なLNAモノマーからなる医薬組成物に関する。

こうした組成物は、経口投与、非経口投与（静脈投与、腹腔内投与）、筋内投与（筋肉内投与）、直腸投与、鼻腔内投与（鼻内投与）、皮膚投与、膣投与、頬側投与（頬投与）、眼球投与、肺投与（肺静脈投与）に適した形態、好ましくは経口投与に適した形態であってもよく、そのような組成物は例えば一般的に"Remington's Pharmaceutical Sciences", 17. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, U.S.A., 1985 とさらに最近の版、および "Drugs and the Pharmaceutical Sciences" series, Marcel Dekkerにおける研究論文に記載されているような、当業者に公知の方法で調製されてもよい。

（診断）
種々のオリゴヌクレオチドのパネルを利用し、同時にターゲット核酸を分析して過度の突然変異の存在している可能性を調べるためのいくつかの診断的および分子生物学的方法が開発されている。代表的には、オリゴヌクレオチドパネルは、固形支持体上にあらかじめ決められたパターンで固定されており、ターゲット核酸において特定の突然変異の存在が、その核酸がハイブリダイズする固形支持体上の位置によって明らかとなる。核酸の分析における種々のオリゴヌクレオチドのパネルがうまく用いられるための１つの重要な必要条件は、１つの適用されたハイブリッド化の条件の下で、それらがその特定のターゲット配列に全て特異的であることである。標準的オリゴヌクレオチドの、その相補的ターゲット配列に対する親和性および特異性は、その配列およびサイズに大きく依存するので、この規範を満たすのは従来、困難であった。

したがって、好ましい実施例では、LNAは、プローブの親和性および／あるいは特異性を高める手段として、および種々のオリゴヌクレオチドの、その相補的配列に対する親和性を等しくする手段として用いられる。ここに開示しているように、こうした親和性の調節は、例えばオリゴヌクレオチドにおける選択されたヌクレオシドを、同様の核塩基を保持するLNAを有するオリゴヌクレオチドに置き換えることによって達成されうる。さらにここに示すように、種々のクラスのLNAは、その相補的ヌクレオシドに対して種々の親和性を示す。例えば、T-核塩基を有する2-3橋かけLNAは、対応する2-4橋かけLNAよりもA-ヌクレオシドに対する親和性が低い。したがって、種々のクラスのLNAを用いることによって、オリゴヌクレオチドの親和性を細かく調整するための追加のレベルが提供される。

別の好ましい実施例では、LNA修飾オリゴヌクレオチドの高い親和性および特異性が、天然の核酸および合成の核酸の配列特異的捕捉および精製において活用される。一つの観点では、天然の核酸あるいは合成の核酸を、固形表面上に固定されたLNA修飾オリゴヌクレオチドに接触させる。この場合、ハイブリッド化と捕捉は同時に生じる。捕捉された核酸は例えば、当該分野において公知の様々な方法によってこの表面上で直接に検出、評価、定量、増幅されてもよい。あるいは、こうした評価あるいは増幅を行う前に、この固定した修飾オリゴヌクレオチドおよび捕捉した核酸を熱などのデハイブリッド化状態に付すこと、あるいはイオン強度の低い緩衝液を用いることによって、表面から放出されてもよい。

この固形支持体は、例えばＣＰＧ（制御された気孔ガラス）、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネートあるいはポリエチレンのような広範なポリマー材料から選択してもよく、例えばチューブ、マイクロタイタープレート、スティック、ビーズ、フィルターなどの様々な形態をとってもよい。LNA修飾オリゴヌクレオチドは、その5'末端あるいは 3' 末端を介して (あるいは 5'あるは3' 末端に結合されたリンカーの末端を介して)、オリゴヌクレオチドを固定するのに通常用いられる様々な化学的あるいは光化学的方法によって、あるいは固定されたストレプタビジンと、例えばビオチニル化LNA修飾オリゴヌクレオチドとの結合などの非共有結合によって固形支持体に固定してもよい。LNA修飾オリゴヌクレオチドを種々の固形支持体上に固定する一つの好ましい方法は、(国際特許出願公開第WO 96/31557号)に記載されているように、修飾されたオリゴヌクレオチドの 5'末端 あるいは 3'末端に（任意にリンカーを介し）共有結合によって結合された光化学的に活性なアントラキノンを光化学的に用いることである。したがって、この発明はまた、LNA修飾オレゴヌクレオチドを有する表面を提供することである。

別の観点では、LNA修飾オリゴヌクレオチドは、5' 末端あるいは 3' 末端のいずれかに共有結合によって結合された配位子を有する。この場合、LNA修飾オリゴヌクレオチドを天然の核酸あるは合成の核酸に溶液中で接触させ、一方、形成されたハイブリッドを、リガンドに特異的に結合できる分子を有する固形支持体上に捕捉する。

さらに別の観点では、「鎖置換」を行うことのできるLNA修飾オリゴヌクレオチドを、予備変性なしに、天然の核酸および合成の核酸の捕捉に用いる。このような修飾オリゴヌクレオチドは、安定した細胞内構造の急速な形成により正常なオリゴヌクレオチドがターゲット配列にアクセスすることが難しいか不可能である場合に、特に有用である。こうした構造を有する核酸の例としては、rRNA、tRNA、 snRNAおよび scRNAが挙げられる。

別の好ましい実施例では、高い特異性を目的として設計されたLNA修飾オリゴヌクレオチドが、核酸の配列決定におけるプライマーとして、およびPCR 反応のようないくつかの公知の増幅反応のいずれかにおけるプライマーとして用いられる。ここで示されるように、LNA修飾オリゴヌクレオチドの設計によって、指数ターゲット増幅あるいは直線状ターゲット増幅が維持されるか否かが決定される。通常のDNAプライマーで生成した増幅生成物の分析に適用可能な様々な方法によって、増幅反応生成物を分析することができる。直線状増幅を維持するようためにLNA修飾オリゴヌクレオチドプライマーを設計する特定な場合、得られたアンプリコンは、変性なしに相補的プローブによってターゲットされうる１本鎖末端を有するであろう。こうした末端は例えば、固形表面に取り付けた他の相補的LNA修飾オリゴヌクレオチドによってアンプリコンを捕捉するのに用いられるであろう。

別の観点では、「鎖置換」のできるLNA修飾オリゴは、直線状増幅反応あるいは指数増幅反応のいずれかにおいてプライマーとして用いることができる。このようにオリゴを用いることにより、増幅反応の後の工程におけるアンプリコン再ハイブリッド化と効果的に競争し、全アンプリコン収率が高まることが期待される。Demers ら. (Nucl. Acid Res. 1995, Vol 23, 3050-3055)は、PCR 反応の全収率を増大させる手段として、高親和性および非伸長性を有するオリゴの用途を開示している。PCRの後の工程でアンプリコン再ハイブリダイゼーションを妨げることによって、オリゴマーがこれらの効果を惹起すると考えられる。3' 末端でブロックされたLNA修飾オリゴが同様な利点を提供することが期待される。3'末端でのブロッキングは、例えば3'のヒドロキシ基を水素あるいはホスフェートへ交換するなどの多くの方法によって達成されうる。こうした3'末端でブロックされた LNA修飾オリゴはまた、Yu ら(Biotechniques, 1997, 23, 714-716)に記載の方法と同様の方法において、密接に関連した核酸配列を選択的に増幅するのに用いられうる。

近年、例えばターゲット増幅反応によって生成したアンプリコンのリアルタイムでの検出などに用いられる新規なクラスのプローブが発明された。あるそのようなクラスのプローブは、「分子標識（Molecular Beacons）」と称されている。これらのプローブは、一端に発蛍光団（fluorophor）を、他端にクエンチャー分子（quencher molecule）を含む部分的自己相補的オリゴヌクレオチドとして合成される。溶液中で遊離であるとき、プローブは、（自己相補的領域によって案内される）ヘアピン構造に折り重なり、これによってクエンチャーが発蛍光団の十分に近くに配され、その蛍光信号が消滅する。ヘアピンは、そのターゲット核酸とハイブリッド化すると、開き、それによって発蛍光団とクエンチャーを分離するとともに蛍光信号を発する。

別のクラスのプローブは「タックマン（Taqman）プローブ 」と称されている。これらのプローブはまた、発蛍光団とクエンチャー分子を含んでいる。しかしながら、分子標識とは反対に、発蛍光団から蛍光信号を消去するクエンチャーの能力は、プローブがそのターゲット配列とハイブリッド化した後も維持される。その代わり、蛍光信号は、5'に位置するプライマーからタックマンプローブの結合部位への合成を開始するポリメラーゼの５’エクソヌクレアーゼ活性によりプローブからクエンチャーあるいは発蛍光団のいずれかが物理的に離脱することによって、ハイブリッド化の後に生じる。

ターゲット部位の高い親和性は、両タイプのプローブの重要な特徴であり、このためこうしたプローブはかなり大きくなる傾向がある (代表的には30〜40量体)。その結果、高品質のプローブの作製では重大な問題が生じる。したがって、好ましい実施例では、サイズを縮減しつつ要求される親和性を維持することによってタックマンプローブおよび分子標識の作製およびその後の性能を向上させるために、LNAが用いられる。

さらに別の観点では、新しい親和性の対（完全に修飾されたオリゴヌクレオチドあるいは部分的に修飾されたオリゴヌクレオチドのいずれか）を形成するために、LNAが用いられる。親和性定数は広範囲で容易に調節することができ、非常に多くの親和性の対を設計し合成することができる。親和性の対の一部を関心のある分子（例えばタンパク質、アンプリコン、酵素、ポリサッカライド、抗体、パプテン、ペプチド、PNAなど）に標準的な方法によって結合することができ、親和性な対の他の部分は、例えば、ビーズ、膜、マイクロタイタープレート、スティック、チューブなどの固形支持体に取り付けることができる。固形支持体は、例えばポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネートあるいはポリエチレンのような広範なポリマー材料から選択してもよい。親和性な対は、上記の様々なターゲット分子の選択的分離、精製、捕捉および検出に用いてもよい。

別の相補的LNAオリゴヌクレオチド（完全に修飾したものあるいは部分的に修飾したもの）との相互作用により、LNA標識付きの分子を捕捉するという原理を用い、莫大な数の新規な親和性な対を形成することができる。

別の好ましい実施例では、LNA修飾オリゴヌクレオチドの高い親和性と特異性が、その場でのハイブリッド化において有用なプローブの形成に活用される。例えば、LNAは、従来のDNAプローブのサイズを縮減するとともに、要求される親和性を維持し、それによってプローブの動態およびサンプル試料を貫通するプローブの能力を高めるの用いられる。LNA修飾オリゴヌクレオチドが２本鎖核酸構造を「鎖侵入」する能力はまた、その場でのハイブリッド化においてかなり有利であるが、これは、ターゲットDNA／RNAの予備変性なしにハイブリッド化が容易になるからである。

別の好ましい実施例では、アンチセンス治療法に用いられるLNA修飾オリゴヌクレオチドが、親和性およびRNAseHをリクルートする能力を高めるという２つの目的で設計される。これは例えば、修飾されていないセントラルDNAセグメントの側面を固めるLNAセグメントを有することによって達成される。

この発明はまた、天然の核酸あるいは合成の核酸の分離、精製、増幅、検出、同定、定量あるいは捕捉のためのキットを提供するものであって、このキットは、反応本体と、ここで定義する１個以上のLNA修飾オリゴヌクレオチド（オリゴマー）とからなる。LNA修飾オリゴヌクレオチドは、前記反応本体上に固定されるのが好ましい。

この発明はまた、天然の核酸あるいは合成の核酸の分離、精製、増幅、検出、同定、定量あるいは捕捉のためのキットを提供するものであって、このキットは、反応本体と、ここで定義する１個以上のLNA修飾オリゴヌクレオチドとからなる。LNAは、（例えば上記の固定技術などによって）前記反応本体上に固定されるのが好ましい。

この発明によるキットに関して、反応本体は、例えばホウケイ酸ガラス、ソーダ石灰、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレングリコールテレフタレート、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリジノン、ポリメチルメタクレートおよびポリビニルクロリドから、好ましくはポリスチレンおよびポリカーボネートから選択された固形支持材料であるのが好ましい。反応本体は、試料チューブ、バイアル、スライド、シート、フィルム、ビーズ、ペレット、ディスク、プレート、リング、ロッド、ネット、フィルター、トレイ、マイクロタイタープレート、スティックあるいはマルチブレードスティックの形態であってもよい。

キットには、通常、キット使用上の最適条件を記載した指示シートを付ける。

この発明の上述の診断の観点および治療の観点を以下の実施例で説明する。

（一般）
試薬は全て製造販売業者から得、さらに精製せずに使用した。Na₂SO₄を用いて全ての有機相を乾燥した後、濾過を行った。カラムクロマトグラフィに使用したシリカゲル(0.040〜0.063 mm)はMerckより購入した。NMRスペクトルは¹H NMRには300 MHzまたは250 MHzで、¹³C NMRには62.9 MHzで、また³¹P NMRには202.33 MHzで記録した。δ値は内部標準(¹H NMRおよび¹³C NMR)としてのテトラメチルシラン、外部標準(³¹P NMR)としての85% H₃PO₄に関するppmで表す。NMRピークの帰属は標準ヌクレオシド命名法に従って行った。EI質量スペクトル、FAB質量スペクトルおよびプラズマ脱離質量スペクトルは合成した化合物の分子量に関する情報を得るために記録した。ホスホロアミダイト方法体系を用いてオリゴヌクレオチド類似体を合成した。5'-O-DMT-ONまたは5'-O-DMT-OFFオリゴヌクレオチド類似体の精製は必要に応じて使い捨ての逆相クロマトグラフィカートリッジまたは逆相HPLCを用いて行った。マトリクス補助レーザ脱離質量スペクトルは典型的なオリゴヌクレオチド試料の分子量およびモノマー組成を証明するために得た。典型的なオリゴヌクレオチド試料の純度を証明するために毛管ゲル電気泳動を行った。

下記の具体的な記載は図2〜41および表1〜10に伴うものである。以下の実施例において特に言及されない場合、「LNA」は図2の式Zに記載の2'-4'-橋かけ異性体を意味する。

（LNAモノマーの生成）
実施例1
3-C-アリル-1,2-O-イソプロピリデン-α-D-リボフラノース(0A)。
方法1: 無水THF (980 cm³)中の5-O-t-ブチルジメチルシリル-1,2-O-イソプロピリデン-α-D-リボフラン-3-ウロース溶液 (Y. Yoshimura, T. Sano, A. Matsuda および T. Ueda, Chem. Pharm. Bull., 1988, 36, 162) (17.8 g, 58.9 mmol)を0℃で攪拌し、無水エーテル(130 cm³, 130 mmol)中の1 Mアリルマグネシウムブロミドを滴加した。2時間攪拌した後、混合物に塩化アンモニウム飽和水溶液(800 cm³)を加え、ジクロロメタン(3 x 400 cm³)で抽出した。有機相をブライン(3 x 450 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣を無水THF(700 cm³)に溶解した。混合物にTHF(54.4 cm³, 59.8 mmol)中のテトラブチルアンモニウムフルオライド1.1 M 溶液を加え、室温で1時間攪拌し、蒸発乾固した。残渣をジクロロメタン(1700 cm³)に溶解し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 500 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。 溶媒を減圧下で除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィでジクロロメタン/メタノール(98:2、v/v)を溶出液として用いて精製し、白色固形物としてフラノース0Aを得た(9.42 g, 69%)。方法2:無水THF(425 cm³); 無水エーテル(130 cm³, 130 mmol)中のアリルマグネシウムブロミド1 M 溶液; 塩化アンモニウム飽和水溶液(490 cm³); 抽出用エーテル(350 + 2 x 160 cm³); ブライン(2 x 160 cm³); THF (22.3 cm³, 24.6 mmol)中の1.1 M テトラブチルアンモニウムフルオライド溶液; 無水THF(400 cm³); ジクロロメタン(1400 cm³); 炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 500 cm³); ブライン(500 cm³)および(Na₂SO₄)を用い、フラノース0Aを5-O-t-ブチルジフェニルシリル-1,2-O-イソプロピリデン-α-D-リボフラン-3-ウロース(T. F. Tam および B. Fraser-Reid, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1980, 556) (9.5 g, 22.2 mmol)から同様に合成した。

δ_H ((CD₃)₂SO) 5.84 (1 H, m, 2'-H), 5.65 (1 H, d, J 3.8, 1-H), 5.12 (1H,
d, J 6.1, 3'-H_a), 5.06 (1H, br s, 3'-H_b), 4.76 (1H, s, 3-OH), 4.64 (1H,
t, J 5.4, 5-OH), 4.16 (1 H, d, J 3.8, 2-H), 3.84 (1 H, dd, J 2.2, 8.1, 4-H), 3.56 (1 H, ddd, J 2.3, 5.6, 11.8, 5-H_a), 3.42 (1 H, m, 5-H_b), 2.16
(1 H, dd, J 6.1, 14.3, 1'-H_a), 1.98 (1 H, dd, J 8.2, 14.3, 1'-H_b), 1.46
(3 H, s, CH₃), 1.25 (3 H, s, CH₃).

δ_C (CDCl₃) 133.5 (C-2'), 117.9 (C-3'), 110.8 (C(CH₃)₂), 102.9 (C-1), 82.6, 81.0, 77.7 (C-2, C-3, C-4), 59.4 (C-5), 36.4 (C-1'), 26.4, 26.3 (CH₃)

(実測値: C, 57.4; H, 8.0; C₁₁H₁₈O₅ の理論値 C, 57.4; H, 7.9%).

実施例2
3-C-アリル-3,5-ジ-O-ベンジル-1,2-O-イソプロピリデン-α-D-リボフラノース (0B)。
無水DMF(100 cm³)中の60%水素化ナトリウム懸濁液(4.9 g, 123 mmol)を0℃で攪拌し、 無水DMF(65 cm³)中のフラノース 0A溶液(9.42 g, 40.9 mmol)を45分で滴加した。溶液を50℃で1時間攪拌し、0℃で冷却した。 臭化ベンジル(14.5 cm³, 121 mmol)および無水DMF(14.5 cm³)の混合物を滴加し、混合物を室温で18時間攪拌した。反応混合物を蒸発乾固させ、ジクロロメタン(700 cm³)中の残渣溶液を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(2 x 450 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣を石油エーテル/酢酸エチル(9:1, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、油として化合物0Bを得た(14.5 g, 86%)。

δ_H (CDCl₃) 7.39-7.21 (10H, m, Bn), 5.92 (1 H, m, 2'-H), 5.71 (1 H, d, J
3.8, 1-H), 5.17-5.09 (2 H, m, 3'-Ha, 3'-H_b), 4.67 (2 H, m, Bn), 4.60 (1
H, d, J 12.2, Bn), 4.52 (1 H, d, J 12.1, Bn), 4.43 (1 H, m, 4-H), 4.42 (1 H, d, J 3.8, 2-H), 3.73 (1 H, dd, J 3.2, 10.8, 5-H_a), 3.66 (1 H, dd, J 7.4, 10.8, 5-H_b), 2.50 (1 H, dd, J 7.7, 14.9, 1'-H_a), 2.39 (1 H, dd, J
6.5, 14.9, 1'-H_b), 1.60 (3 H, s, CH₃), 1.34 (3 H, s, CH₃).

δ_C (CDCl₃) 138.7, 138.1 (Bn), 132.6 (C-2'), 128.3, 128.2, 127.7, 127.5,
127.4, 127.4 (Bn), 118.5 (C-3'), 112.6 (C(CH₃)₂), 104.1 (C-1), 86.5, 82.1, 80.4 (C-2, C-3, C-4), 73.4, 68.6 (Bn), 67.0 (C-5), 35.8 (C-1'), 26.8, 26.6 (CH₃).

FAB-MS m/z 433 [M+Na]⁺
(実測値: C, 73.4; H, 7.4; C₂₅H₃₀O₅の理論値C, 73.2; H, 7.4%).

実施例3
3-C-アリル-1,2-ジ-O-アセチル-3,5-ジ-O-ベンジル-D-リボフラノース (0C)。
80%水性酢酸(150 cm³)中のフラノース 0B溶液(12.42 g, 30.3 mmol)を90℃で3時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をエタノール(3 x 75 cm³)、トルエン(3 x 75 cm³) および無水ピリジン(2 x 75 cm³) と共に蒸発させ、無水ピリジン(60 cm³)に再び溶解した。無水酢酸(46 cm³)を加え、溶液を室温で48時間攪拌した。氷と水の混合物(300 cm³)を加え、得られた混合物をジクロロメタン(2 x 300 cm³)で抽出した。合わせた炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 200 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を蒸発させ、残渣を石油エーテル/酢酸エチル(4:1, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、油としてアノマー混合物0C (β:α〜2:1)を得た(13.3 g, 97%)。

δ_C (CDCl₃) 169.7, 169.6 (C=O), 138.7, 138.4, 137.7, 137.6 (Bn), 132.4, 132.2 (C-2'), 128.4 128.4, 128.2, 128.2, 127.8, 127.7, 127.7, 127.6, 127.3, 127.3, 126.9, 126.8 (Bn), 118.5 (C-3'), 99.4, 93.5 (C-1), 84.8, 83.7, 83.2, 82.0, 79.1, 75.5 (C-2, C-3, C-4), 73.7, 73.5, 69.3, 68.7 (Bn), 66.1 (C-5), 35.5, 34.9 (C-1), 21.1, 21.0, 20.7, 20.6 (CH₃)

(実測値: C, 68.7; H, 6.7; C₂₆H₃₀O₇の理論値 C, 68.8; H, 6.6%).

実施例4
1-(2-O-アセチル-3-C-アリル-3,5-ジ-O-ベンジル-β-D-リボフラノシル)チミン (1)。
無水アセトニトリル(250 cm³)中のアノマー混合物0C (β:α〜2:1, 11.8 g, 26.0 mmol) (P. Nielsen, H. M. Pfundheller および Wengel, Chem. Commun., 1997, 825; P. Nielsen, H. M. Pfundheller, C. E. Olsen および J. Wengel, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1997, 印刷中)およびチミン(6.55 g, 52.0 mmol)の攪拌溶液にN,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド(44.9 cm³, 182 mmol)を加えた。反応混合物を還流させながら1時間攪拌し、0℃に冷却した。トリメチルシリルトリフレート(8.00 cm³, 44.0 mmol)を滴加し、溶液を室温で12時間攪拌した。氷で冷却した炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(270 cm³)を加え、混合物をジクロロメタン(3 x 125 cm³)で抽出した。有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(2 x 125 cm³)およびブライン(2 x 125 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン/メタノール(98:2, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド1を得た (11.6 g, 86%)。

δ_H (CDCl₃) 8.64 (1 H, br s, NH), 7.75 (1 H, d, J 1.1, 6-H), 7.41-7.25 (10 H, m, Bn), 6.43 (1 H, d, J 8.2, 1'-H), 5.88 (1H, m, 2''-H), 5.66 (1 H, d, J 8.2, 2'-H), 5.12 (1 H, s, 3''-H_a), 5.07 (1 H, dd, J 1.5, 8.5, 3''-H_b), 4.85 (1 H, d, J 11.2, Bn), 4.64 (2 H, s, Bn), 4.63 (1 H, d, J 11.2, Bn), 4.33 (1 H, br s, 4'-H), 3.81 (1 H, dd, J 2.7, 11.1, 5'-H_a), 3.65 (1 H, m, 5'-H_b), 2.81-2.65 (2 H, m, 1''-H_a, 1''-H_b), 2.08 (3 H, s, COCH₃), 1.52 (3 H, d, J 0.8, CH₃).

δ_C (CDCl₃) 170.1 (C=O), 163.6 (C-4), 150.9 (C-2), 138.1, 136.6 (Bn), 136.0 (C-6), 131.6 (C-2''), 128.8, 128.4, 128.3, 127.6, 127.5, 127.1 (Bn),
118.5 (C-3''), 111.1 (C-5), 84.2, 83.4, 83.1, 77.4 (C-1', C-2', C-3', C-4'), 73.6, 69.2 (Bn), 65.6 (C-5'), 33.7 (C-1''), 20.8 (COCH₃), 11.9 (CH₃)

(実測値: C, 66.8; H, 6.3; N, 5.1. C₂₉H₃₂N₂O₇ の理論値 C, 66.9; H, 6.2; N, 5.4%).

実施例5
1-(3-C-アリル-3,5-ジ-O-ベンジル-β-D-リボフラノシル)チミン(2)。
メタノール(110 cm³)中のヌクレオシド1(11.6 g, 22.3 mmol)の攪拌溶液にナトリウムメトキシド(3.03 g, 55.5 mmol)を加えた。反応混合物を室温で16時間攪拌し、希塩酸で中和した。溶媒の一部を蒸発させて残渣をジクロロメタン(2 x
400 cm³)に溶解した。有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 250 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、白色固形物として2を得た(10.1 g, 95%)。

δ_H (CDCl₃) 8.77 (1 H, br s , NH), 7.58 (1 H , d, J 1.2, 6-H), 7.41-7.25
(10 H, m, Bn), 6.14 (1H, m, 2''-H), 6.12 (1 H, d, J 7.8, 1'-H), 5.23 (1
H, m, 3''-H_a), 5.17 (1 H, br s, 3''-H_b), 4.68 (1 H, d, J 10.8, Bn), 4.59 (2 H, s, Bn), 4.55 (1 H, d, J 10.9, Bn), 4.39 (1 H, br s, 4'-H), 4.26 (1 H, dd J 7.8, 10.7, 2'-H), 3.84 (1 H, dd, J 3.1, 11.0, 5'-H_a), 3.58 (1
H, dd, J 1.4, 11.0, 5'-H_b), 3.04 (1 H, d, J 10.8, 2'-OH), 2.82-2.78 (2 H, m, 1''-Ha, 1''-H_b), 1.51 (3 H, d, J 1.0, CH3).

δ_C (CDCl₃) 163.5 (C-4), 151.1 (C-2), 137.3, 136.7 (Bn), 136.0 (C-6), 132.1 (C-2''), 128.8, 128.5, 128.3, 127.9, 127.6 (Bn), 118.4 (C-3''), 111.1 (C-5), 87.4, 82.6, 81.1, 79.3 (C-1', C-2', C-3', C-4'), 73.7, 69.8 (Bn), 64.7 (C-5'), 35.1 (C-1''), 11.9 (CH₃).

(実測値: C, 67.8; H, 6.1; N, 5.5. C₂₇H₃₀N₂O₆ の理論値 C, 67.8; H, 6.3; N, 5.9%).

実施例6
1-(3-C-アリル-3,5-ジ-O-ベンジル-2-O-メタンスルホニル-β-D-リボフラノシル)チミン(3)。
無水ピリジン(23 cm³)中のヌクレオシド2 (3.50 g, 7.31 mmol)の攪拌溶液に塩化メタンスルホニル(1.69 cm³, 21.89 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を室温で1時間攪拌し、水(100 cm³)を加え、ジクロロメタン(3 x 150 cm³)で抽出した。有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 200 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。 溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン/メタノール(99:1)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物として3を得た(3.64 g, 89%)。

δ_H (CDCl₃) 8.95 (1 H, br s, NH), 7.71 (1 H, d, J 1.1, 6-H), 7.39-7.25 (10 H, m, Bn), 6.52 (1 H, d, J 8.0, 1'-H), 5.90 (1H, m, 2''-H), 5.34 (1 H, d, J 7.9, 2'-H), 5.20-5.09 (2 H, m, 3''-H_a, 3''-H_b), 4.91 (1 H, d, J 11.2, Bn), 4.68 (1 H, d, J 11.3, Bn), 4.64 (2 H, s, Bn), 4.33 (1 H, br s,
4'-H), 3.81 (1 H, dd, J 2.5, 11.1, 5'-Ha), 3.73 (1 H, dd, J 1.1, 11.1, 5'-H_b), 3.08 (1 H, dd, J 5.5, 5.7, 1''-H_a), 2.99 (3 H, s, CH₃), 2.68 (1 H, m, 1''-H_b), 1.51 (3 H, d, J 0.8, CH₃).

δ_C (CDCl₃) 163.4 (C-4), 150.8 (C-2), 137.9, 136.3 (Bn), 135.5 (C-6), 131.0 (C-2''), 128.8, 128.3, 127.5, 127.2 (Bn), 119.3 (C-3''), 111.6 (C-5), 84.1, 83.6, 82.4, 82.2 (C-1', C-2', C-3', C-4'), 73.7, 68.9 (Bn), 66.2
(C-5'), 38.7 (CH₃), 33.0 (C-1''), 11.9 (CH₃)

(実測値: C, 60.5; H, 5.8; N, 4.9. C₂₈H₃₂N₂O₈S の理論値 C, 60.4; H, 5.8; N, 5.0%).

実施例7
1-(3-C-アリル-3,5-ジ-O-ベンジル-β-D-アラビノフラノシル)チミン(4)。
エタノール(72 cm³)中のヌクレオシド3(3.59 g, 6.45 mmol)溶液、水(72 cm³)および1 M 水性水素化ナトリウム(20.6 cm³)を還流させながら18時間攪拌した。希塩酸で中和した後、溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン(3 x 150 cm³)に溶解した。有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 200 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン/メタノール(99:1, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物として4を得た(2.32 g, 74%)。

δ_H (CDCl₃) 7.60 (1 H , d, J 1.2, 6-H), 7.50-7.23 (10 H, m, Bn), 6.22 (1
H, d, J 2.9, 1'-H), 5.80 (1H, m, 2''-H), 5.15-5.08 (2 H, m, 3''-H_a, 3''-H_b), 4.86-4.33 (6 H, m, 2 x Bn, 2'-H, 4'-H), 3.82-3.71 (2 H, m, 5'-H_a, 5'-H_b), 2.72 (1 H, m, 1''-H_a), 2.52 (1 H, dd, J 7.6, 16.1, 1''-H_b), 1.70
(3 H, d, J 0.9, CH₃).

δ _C (CDCl₃) 165.1 (C-4), 150.4 (C-2), 138.4, 136.8 (Bn), 137.7 (C-6), 132.3 (C-2''), 128.77 128.4, 128.3, 128.0, 127.9, 127.6 (Bn), 118.5, (C-3''), 107.8 (C-5), 88.0, 87.8, 83.7 (C-1', C-3', C-4'), 73.7, 72.9, 69.4 (Bn, C-2'), 64.7 (C-5'), 31.1 (C-1''), 12.4 (CH₃)

(実測値: C, 67.5; H, 6.3; N, 5.3. C₂₇H₃₀N₂O₆,0.25H₂O の理論値 C, 67.1; H, 6.4; N, 5.8%).

実施例8
1-(3,5-ジ-O-ベンジル-3-C-(2-ヒドロキシエチル)-β-D-アラビノフラノシル)チミン(5)。
THF(12 cm³)中のヌクレオシド4(2.26 g, 4.68 mmol)および水(12 cm³)の攪拌溶液に過ヨウ素酸ナトリウム(3.04 g, 14.2 mmol)およびtert-ブタノール(w/w, 0.603 cm³, 40 μmol)中2.5%四酸化オスミウム溶液を加えた。溶液を室温で45分間攪拌した。水(25 cm³)を加え、溶液をジクロロメタン(2 x 50 cm³)で抽出した。有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 30 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣をTHF (12 cm³)および水(12 cm³)に再び溶解した。混合物を室温で攪拌し、水素化ホウ素ナトリウム(182 mg, 4.71 mmol)を加えた。1時間半攪拌した後、水(25 cm³)を加え、溶液をジクロロメタン(2 x 50
cm³)で抽出した。有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 30 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン/メタノール(98:2, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物として5を得た(1.13 g, 49%)。

δ_H (CDCl₃) 9.29 (1 H, br s , NH), 7.47 (1 H , d, J 1.1, 6-H), 7.38-7.25
(10 H, m, Bn), 6.22 (1 H, d, J 3.4, 1'-H), 4.62 (2 H, s, Bn), 4.60 (1 H, m, 4'-H), 4.46 (2 H, s, Bn), 4.35 (1H, dd, J 3.4, 7.5, 2'-H), 3.83-3.73 (4 H, m, 2 x 5'-H, 2 x 2''-H), 2.67 (1 H, br s, OH), 2.07-2.01 (2 H, m, 2 x 1''-H), 1.77 (3 H, d, J 0.5, CH₃).

δ_C (CDCl₃) 164.3 (C-4), 150.3 (C-2), 137.6, 137.4 (Bn, C-6), 136.7 (Bn), 128.6, 128.4, 128.2, 127.8, 127.6, 127.3, 127.1 (Bn), 108.4 (C-5), 88.0, 87.7, 81.6, 74.7 (C-1', C-2', C-3', C-4'), 73.7, 69.6 (Bn), 64.6 (C-5'), 57.7 (C-2''), 28.6 (C-1''), 12.4 (CH₃).

FAB-MS m/z 483 [M+H]⁺, 505 [M+Na]⁺
(実測値: C, 63.6; H, 6.2; N, 5.4. C₂₆H₃₀N₂O₇,0.5H₂O の理論値 C, 63.5; H 6.4; N, 5.7%).

実施例9
(1S,5R,6R,8R)-5-ヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)-8-(チミン-1-イル)-2,7-ジオキサビシクロ[3.3.0]オクタン(6)。
無水ピリジン(5.0 cm³)中のヌクレオシド5(1.08 g, 2.20 mmol)溶液を0℃で攪拌し、無水ピリジン(2.0 cm³)中の塩化p-トルエンスルホニル(462 mg, 2.47 mmol)溶液を滴加した。室温で20時間攪拌し、水と氷の混合物(70 cm³)を加えた後、ジクロロメタン(2 x 75 cm³)で抽出した。有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 50 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン/メタノール(99:1, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、中間生成物を得、それを蒸発させた後無水DMF (4.0 cm³)に溶解した。溶液を無水DMF (4.0 cm³)中60% 水素化ナトリウム(203 mg, 4.94 mmol)の攪拌懸濁液に0℃で滴加した。混合物を18時間攪拌し、水(20 cm³)を加えた。塩酸で中和した後、ジクロロメタン(75 cm³)を加えた。有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 50 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン/メタノール(98:2, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物を得た(858 mg)。エタノール(10.0 cm³)中のこの白色固形物の溶液(846 mg, 1.80 mmol)を室温で攪拌し、炭素上の水酸化パラジウム(400 mg)を20%で加えた。混合物をアルゴンで脱ガスし、水素雰囲気下に置いた。2時間混合した後、混合物をジクロロメタン/メタノール(97:3, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで直接精製し、白色固形物として6を得た(444 mg, 82%)。

δ_H ((CD₃)₂SO) 11.3 (1 H, br s, NH), 7.36 (1 H, d, J 1.1, 6-H), 5.80 (1 H, d, J 4.3, 1'-H), 5.61 (1 H, s, OH), 4.86 (1 H, m, 5'-H_a), 3.89 (1 H, d, J 4.2, 2'-H), 3.85 (1 H, m, 2''-H_a), 3.83-3.64 (3 H, m, 4'-H, 5'-H_b, 2''-H_b), 2.14 (1 H, m, 1''-H_a), 1.81 (1 H, m, 1''-H_b), 1.78 (3 H, d, J 1.0, CH₃).

δ_C (CD₃OD) 166.7 (C-4), 152.2 (C-2), 139.7 (C-6), 110.1 (C-5), 89.4, 89.1, 85.5, 85.2 (C-1', C-2', C-3', C-4'), 71.4 (C-2''), 61.6 (C-5'), 37.0
(C-1''), 12.7 (CH₃)

(実測値: C, 47.4; H, 5.7; N, 9.0. C₁₂H₁₆N₂O₆,H₂O の理論値C, 47.7; H, 6.0; N, 9.3%).

実施例10
(1S,5R,6R,8R)-6-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-5-ヒドロキシ-8-(チミン-1-イル)-2,7-ジオキサビシクロ[3.3.0]ノナン(7)。
無水ピリジン(2.5 cm³)中のヌクレオシド6(310 mg, 1.09 mmol)溶液を室温で攪拌し、4,4'-ジメトキシトリチルクロライド(593 mg, 1.83 mmol)を加えた。3時間攪拌した後、さらに4,4'-ジメトキシトリチルクロライド(100 mg, 0.310 mmol)を加えた。さらに2時間攪拌した後、メタノール(0.5 cm³)を加え、混合物を蒸発させた。残渣をジクロロメタン(5 cm³)に溶解し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 5 cm³)で洗浄した。有機相を乾燥し(Na₂SO₄)、減圧下で蒸発させた。残渣をジクロロメタン/メタノール(99:1, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物として7を得た(618 mg, 97%)。

δ_H (CDCl₃) 9.04 (1 H, br s, NH), 7.47-7.16 (10 H, m, 6-H, DMT), 6.86-6.82 (4 H, m, DMT), 6.06 (1 H, d, J 4.1, 1'-H), 4.35 (1 H, d, J 4.1, 2'-H), 4.03 (1 H, m, 4'-H), 3.89 (1 H, m, 2''-H_a), 3.79 (6 H, s, 2 x OCH₃), 3.61 (1 H, m, 5'-Ha), 3.32-3.26 (2H, m, 5'-H_b, 2''-H_b), 1.94-1.69 (2 H, m, 1''-H_a, 1''-H_b,), 1.89 (3 H, s, CH₃).

δ_C (CDCl₃) 163.4 (C-4), 158.6 (DMT), 150.1 (C-2), 144.3 (DMT), 137.2 (C-6), 135.6, 135.3, 129.9, 129.9, 128.9, 128.1, 127.9, 126.9, 125.2, 113.2 (DMT), 109.3 (C-5), 88.7, 87.3, 86.9, 83.5, 81.0 (DMT, C-1', C-2', C-3', C-4'), 69.7 (C-2''), 62.1 (C-5'), 55.1 (OCH₃), 36.5 (C-1''), 12.5 (CH₃).

実施例11
(1S,5R,6R,8R)-5-(2-シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノシ)-6-(4,4'-ジメトキシトリルオキシメチル)-8-(チミン-1-イル)-2,7-ジオキサビシクロ[3.3.0]ノナン(8)。
無水ジクロロメタン(2.2 cm³)中のヌクレオシド7(436 mg, 0.743 mmol)溶液およびジイソプロピルエチルアミン(0.62 cm³)を室温で攪拌し、2-シアノエチルN,N-ジイソプロピルホスホラミドクロリダイト(0.33 cm³, 1.46 mmol)を加えた。1時間半攪拌した後、メタノール(0.4 cm³)および酢酸エチル(5 cm³)を加え、混合物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 5 cm³)およびブライン(3 x 5 cm³)で洗浄した。有機相を乾燥し(Na₂SO₄)、減圧下で蒸発させた。残渣をジクロロメタン/トリエチルアミン(97:3, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製した。溶媒を蒸発させ、油を得、これをトルエン(1 cm³)中に溶解させた。これをヘキサンから-30℃で析出させ、白色固形物質として8を得た(517 mg,
88%)。

δ_P (CDCl₃) 142.0, 141.9.

実施例12
1-(3,5-ジ-O-ベンジル-3-C-(2-ヒドロキシエチル)-β-D-リボフラノシル)チミン(9)。
THF(5.4 cm³)および水(5.4 cm³)中のヌクレオシド2(1.00 g, 2.09 mmol)の攪拌溶液に過ヨウ素酸ナトリウム(1.34 g, 6.27 mmol)およびtert-ブタノール(w/w, 0.265 cm³, 19 μmol)中の四酸化オスミウム2.5%溶液を加えた。溶液を室温で45分間攪拌した。水(25 cm³)を加え、溶液をジクロロメタン(2 x 50 cm³)で抽出した。有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 30 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣をTHF(5.4 cm³)および水(5.4 cm³)に再び溶解した。混合物を室温で攪拌し、水素化ホウ素ナトリウム(79 mg, 2.08 mmol)を加えた。1時間半攪拌した後、水(25 cm³)を加え、溶液をジクロロメタン(2 x 50 cm³)で抽出した。有機相を炭酸水素飽和水溶液(3 x 30 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン/メタノール(98:2, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド9を得た(488 mg, 48%)。

δ_H (CDCl₃) 9.14 (1 H, br s , NH), 7.60 (1 H , d, J 1.1, 6-H), 7.40-7.22
(10 H, m, Bn), 6.25 (1 H, d, J 7.7, 1'-H), 4.59 (1 H, d, J 7.1 Bn), 4.49 (1 H, d, J 7.1 Bn), 4.39-3.30 (m, 8H, 4'-H, 2'-H, Bn, 5'-H_a, 5'-H_b, 2''-H_a, 2''-H_b), 2.23-2.00 (2 H, m, 1''-H_a, 1''-H_b), 1.49 (3 H, d, J 0.7, CH₃).

δ_C (CDCl₃) 163.5 (C-4), 151.2 (C-2), 137.1, 136.5 (Bn), 135.7 (C-6), 128.7, 128.5, 128.2, 127.8, 127.6, 127.2 (Bn), 111.3 (C-5), 87.0, 82.7, 81.1, 78.3 (C-1',C-2', C-3', C-4'), 73.7, 69.6 (Bn), 64.4 (C-5'), 57.0 (C-2''), 32.4 (C-1''), 11.8 (CH₃)

(実測値: C, 63.9; H, 6.3; N, 5.4. C₂₆H₃₀N₂O₇,0.25H₂O の理論値 C, 64.1; H
6.3; N, 5.75%).

実施例13
1-[3-C-(2-O-t-ブチルジメチルシリルオキシエチル)-3,5-ジ-O-ベンジル-β-D-リボフラノシル]チミン(10)。
ヌクレオシド9(1.80 g, 3.4 mmol)およびt-ブチルジメチルシリルクロライド(0.585 g, 3.9 mmol)の混合物を無水ピリジン(20 cm³)に溶解した。室温で2時間後、反応混合物をトルエン(2 x 10 cm³)と共に乾燥するまで2回蒸発させ、ジクロロメタン(150 cm³)に再び溶解した。溶液を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(2 x 50 cm³)で洗浄し、蒸発させて発泡体を得た。この物質を勾配溶出液(ジクロロメタン中0-3%メタノール、v/v)を用いた分取シリカゲルHPLCで精製し、白色固形物としてヌクレオシド10を得た(1.86 g, 92%)。

δ_H (CDCl₃) 7.61 (1H, d, J 1.1, 6-H), 7.35-7.20 (10H, m, Bn), 6.27 (1H, d, J 7.9, 1'-H), 4.65-4.40 (4H, m, Bn, 2'-H), 4.37 (1H, s, Bn), 4.28 (1H, t, J 7.9, 4'-H), 4.35 - 3.55 (4H, m, 2''-H_a, 2''-H_b, 5'-H_a, 5'-H_b), 2.30-2.05 (2H, m, 1''-H_a, 1''-H_b), 1.46 (3H, s, 5-CH₃), 0.90 (9H, m, CH₃-C-Si), 0.08 (6H, m, CH₃-Si).

δ_C (CDCl₃) 163.6 (C-6), 151.0 (C-2), 137.5, 136.6, 135.8 (C-5, Bn), 128.3, 128.1, 127.8, 127.2, 127.1, 126.8, 126.7 (Bn), 110.7 (C-4), 86.8, 82.5, 81.6, 78.3 (C-1', C-2', C-3', C-4'), 73.3, 69.8 (Bn), 64.46 (C-5'), 58.2 (C-2''), 32.9 (C-1''), 25.6, 25.4, 17.9, -3.9, -5.7 (TBDMS), 11.6 (CH₃).

FAB⁺-MS: m/z 597.19 [M+H]⁺, 619.18 [M+Na]⁺
(実測値: C, 64.2; H, 7.4; N, 4.2; C₃₂H₄₄O₇N₂Siの理論値 C, 64.4; H, 7.4; N, 4.7%).

実施例14
1-[3-C-(2-t-ブチルジメチルシリルオキシエチル)-3,5-ジ-O-ベンジル-β-D-エリスロ-ペントフラン-2-ウロシル]チミン(11)。
ヌクレオシド10(2.14 g, 3.59 mmol), 1.48 g (3.95 mmol)の２クロム酸ピリジニウム(1.48 g, 3.95)および活性化3Aモレキュラーシーブ粉末(4g)の混合物を無水ジクロロメタン(80 cm³)に懸濁した。混合物を-10℃に冷却した後、激しく攪拌しながら無水酢酸(10 cm³, 98 mmol)を滴加した。懸濁液を室温まで温め、1時間半攪拌を続け、トリエチルアミン(20 cm³)を加えることにより反応を停止した。混合物をジクロロメタンで300 cm³まで希釈し、水(2 x 200 cm³)で洗浄した。有機相を蒸発させ、残渣をジクロロメタン(v/v, それぞれ全容量250 cm³)中の1.0, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5%メタノールの勾配を使用したフラッシュシリカゲルカラムクロマトフグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド11(1.89 g, 84.4%)を得た。

δ_H (CDCl₃) 7.35-7.20 (11H, m, Bn, 6-H), 6.40 (1H, s, 1'-H), 4.57 (1H, s, Bn), 4.52 (1H, s, Bn), 4.46 (1H, d, J 11.0, Bn), 4.29 (1H, d, J 11.0, Bn), 4.07 (1H, dd, J' 0.5, 2.2, 4'-H), 3.95-3.70 (4H, m, 2''-H_a, 2''-H_b,
5'-H_a, 5'-H_b), 2.05 (1H, m, 1''-H_a), 2.42 (1H, m, 1''-H_b), 1.42 (3H, d,
J 1.1, 5-CH₃), 0.86 (9H, s, CH₃-C-Si), 0.01 (6H, s, CH₃-Si).

δ_C (CDCl₃) 202.6 (C-2'), 163.7 (C-4), 151.2 (C-2), 137.7, 136.6, 136.5 (Bn, C-6), 128.7, 128.5, 128.2, 128.1, 127.7, 126.4, 126.3 (Bn), 110.9 (C-5), 84.5, 81.3, 80.2 (C-1', C-3', C-4'), 73.6, 70.4 (Bn), 66.0 (C-5'),
57.6 (C-2''), 27.3 (C-1''), 25.9, 25.7, 18.2, -5.8, -5.9 (TBDMS), 11.7 (CH₃).

FAB-MS m/z 595.14 [M+H]⁺
(実測値: C, 64.1; H, 6.9; N, 4.5; C₃₂H₄₂O₇N₂Si の理論値C, 64.6; H, 7.1; N, 4.7%).

実施例15
(1S,5R,6R,8R)-1-ヒドロキシ-5-ベンジルオキシ-6-ベンジルオキシメチル-8-(チミン-1-イル)-2,7-ジオキサビシクロ[3.3.0]オクタン(12)。
化合物11 (1.80 g, 30.3 mmol)をメタノール(w/w, 20 cm³)中の0.5% HClに溶解し、混合物を室温で30分間攪拌した。蒸発乾固させた後、残渣をジクロロメタン(100 cm³)に溶解し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(2 x 40 cm³)で洗浄した。有機相を蒸発させ、残渣をジクロロメタン(v/v)中の2%メタノールで溶出させたフラッシュシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド12(1.35 g, 93.5%)を得た。

δ_H (CDCl₃) 7.37-7.27 (11H, m, Bn, 6-H), 5.87 (1H, s, 1'-H), 4.71 (2H, s, Bn), 4.64 (1H, d, J 12.0, Bn), 4.56 (1H, d, J 12.0, Bn), 4.36 (1H, t, J 5.7, 4'-H), 4.16 (1H, m, 2''-H_a), 3.96 (1H, m, 2''-H_b), 3.74 (2H, m, 5'-H_a, 5'-H_b), 2.35-2.15 (2H, m, 1''-H_a, 1''-H_b), 1.88 (3H, s, CH₃).

δ_C (CDCl₃) 163.7 (C-4), 151.4 (C-2), 137.8, 137.3, 136.7 (Bn, C-6), 128.5, 128.4, 128.0, 127.8, 127.5 (Bn), 109.9 (C-5), 108.6 (C-2'), 88.8, 87.1, 80.9 (C-1', C-3', C-4'), 73.6, 68.5, 68.1, 67.9 (C-5', C-2'', Bn), 30.9 (C-1''), 12.6 (CH₃).

FAB-MS: m/z 481.03 [M+H]⁺, 503.02 [M+Na]⁺
(実測値: C, 64.6; H, 5.8; N, 5.7; C₂₆H₂₈O₇N₂ の理論値 C, 65.0; H, 5.9; N, 5.8%).

実施例16
(1S,5R,6R,8R)-1,5-ジヒドロキシ-6-ヒドロキシメチル-8-(チミン-1-イル)-2,7-ジオキサビシクロ[3.3.0]オクタン(13)。
6の合成と同様の方法でベンジル保護基を触媒的に除去することにより、化合物13を化合物12から連続的に誘導した。13の精製をジクロロメタン中のメタノールの勾配濃度(6〜14%)で溶出させながらカラムシリカゲルクロマトグラフィで行った。分析量の化合物13(15 mgまで)をヌクレオシルC18(10 μm)を充填したカラム(10 x 250 mm)で逆相HPLCにより追加的に精製した。流量:8 cm³/分; 溶出液:0-10%アセトニトリル、60分間。 収率82%.

δ_H (CD₃OD) 7.44 (1H d, J 1.2, 6-H), 5.83 (1H, s, 1'-H), 4.10-3.80 (5H, m, 5'-H_a, 5'-H_b, 2''-H_a, 2''-H_b, 4'-H), 2.39-2.25 (1H, m, 1''-H_a), 2.00-1.90 (1H, m, 1''-H_b), 1.87 (3H, d, J 1.2, CH₃).

δ_C (CD₃OD) 166.3 (C-4), 152.7 (C-2), 139.8 (C-6), 110.0, 109.6 (C-2',C-5), 87.8, 85.8, 84.6 (C-1', C-3', C-4'), 68.8, 61.6 (C-5', C-2''), 35.6 (C-1''), 12.4 (CH₃).

FAB-MS: m/z 301.03 [M+H]⁺
(実測値: C, 46.6; H, 5.7; N, 8.5; C₁₂H₁₆O₇N₂ の理論値 C, 48.0; H, 5.4; N, 9.3%).

実施例17
(1S,5R,6R,8R)-5-ベンジルオキシ-6-ベンジルオキシメチル-1-メトキシ-8-(3-N-メチルチミン-1-イル)-2,7-ジオキサビシクロ[3.3.0]オクタン(14)、(1S,5R,6R,8R)-5-ベンジルオキシ-6-ベンジルオキシメチル-1-ヒドロキシ-8-(3-N-メチルチミン-1-イル)-2,7-ジオキサビシクロ[3.3.0]オクタン(15)および(1S,5R,6R,8R)-5-ベンジルオキシ-6-ベンジルオキシメチル-1-メトキシ-8-(チミン-1-イル)-2,7-ジオキサビシクロ[3.3.0]オクタン(16)。
化合物12(1.04 g, 2.16 mmol)と水素化ナトリウム(鉱油中60%懸濁液、171 mg、4.30 mmol)の混合物を攪拌しながら無水ジクロロメタン(4 cm³)に10分間溶解した。ヨウ化メチル(1 cm³, 16 mmol)を加え、反応混合物を36℃で23時間インキュベートした。蒸発後、残渣をジクロロメタン(v/v)中0.4-2.4%メタノールの勾配で溶出させながらシリカゲルクロマトグラフィで精製し、生成物14、15および16ならびに出発材料12(212 mg, 20.5%)を得た。

化合物14(47 mg, 4.3%)。
δ_H (CDCl₃) 7.25-7.37 (11H, m, Bn, 6-H), 6.15 (1H, s, 1'-H), 4.74 (1H, d, J 11.5, Bn), 4.67 (1H, d, J 11.3, Bn), 4.62 (1H, d, J 12.1, Bn), 4.55 (1H, d, J 11.9, Bn), 4.34 (1H, t, J 5.6, 4'-H), 3.99, (1H, m, 2''-H_a), 4.22 (1H, m, 2''-H_b), 3.72 (2H, m, 5'-H_a, 5'-H_a), 3.41 (3H, s, CH₃-O), 3.35 (3H, s, CH₃-N₃), 2.27 (1H, m, 1''-H_a), 2.41 (1H, m, 1''-H_b), 1.93 (3H, s, 5-CH₃).

δ_C (CDCl₃) 163.3 (C-4), 151.0 (C-2), 138.2, 137.3, 135.7 (Bn, C-6), 128.3, 128.2, 127.8, 127.6, 127.4, 126.9 (Bn), 111.8 (C-5), 108.5 (C-2'), 89.1, 84.8, 79.5 (C-1', C-3', C-4'), 73.5, 68.4, 68.2, 67.3 (Bn, C-5', C-2''), 50.8 (CH₃-O), 32.6 (C-1''), 27.9 (CH₃-N), 13.2 (CH₃).

FAB-MS: m/z 508.88 [M+H]⁺
(実測値: C, 65.7; H, 6.9; N, 4.8; C₂₈H₃₂O₇N₂ の理論値 C, 66.1; H, 6.3; N, 5.5%)。

化合物15 (97 mg, 9.1%)。
δ_H (CDCl₃) 7.37-7.28 (11H, m, Bn, 6-H), 5.86 (1H, s, 1'-H), 4.72 (2H, s, Bn), 4.64 (1H, d, J 11.9, Bn), 4.58 (1H, d, J 11.9, Bn), 4.37 (1H, t, J 5.6, 4'-H), 4.13 (1H, m, 2''-H_a), 3.93 (1H, m, 2''-H_b), 3.75 (2H, m, 5'-H_a, 5'-H_b), 3.34 (1H, s, CH₃-N), 2.32-2.16 (2H, m, 1''-H_a, 1''-H_b), 1.93 (3H, s, CH₃).

δ_C (CDCl₃) 163.2 (C-4), 151.9 (C-2), 137.5, 137.1, 134.0 (Bn, C-6), 128.4, 128.3, 128.1, 127.9 127.7, 127.6, 127.3 (Bn), 108.8, 108.5 (C-2', C-5), 88.7 (C-1'), 88.0, 81.0 (C-3', C-4'), 73.5, 68.3, 67.9, 67.7 (Bn, C-5', C-2''), 30.6 (C-1''), 27.8 (CH₃-N), 13.2 (CH₃).

FAB-MS m/z 495.28 [M+H]⁺, 517.24 [M+Na]⁺。

化合物16(665 mg, 62.3%)。
δ_H (CDCl₃) 7.35-7.25 (11H, m, Bn, 6-H), 6.06 (1H, s, 1'-H), 4.73 (1H, d, J 11.5, Bn), 4.66 (1H, d, J 11.3, Bn), 4.61 (1H, d, J 11.9, Bn), 4.55 (1H, d, J 12.0, Bn), 4.34 (1H, t, J 5.6, 4'-H), 4.20 (1H, m, 2''-H_a), 3.98 (1H, m, 2''-H_b), 3.72 (2H, m, 5'-H_a, 5'-H_b), 3.40 (3H, s, CH3-O), 2.45-2.35 (1H, m, 1''-Ha), 2.30-2.20 (1H, m, 1''-H_b), 1.90 (3H, d, J 1.1, CH₃).

δ_C (CDCl₃) 163.2 (C-4), 150.1 (C-2), 138.2, 137.9, 137.3 (Bn, C-6), 128.4, 128.2, 127.8, 127.6 127.4, 127.1 (Bn), 110.8 (C-5), 109.3 (C-2'), 89.2, 84.2, 79.6 (C-1', C-3', C-4'), 73.6, 68.5, 68.3, 67.4 (Bn, C-5', C-2''), 50.8 (CH₃-O), 32.6 (C-1''), 12.5 (CH₃).

FAB-MS m/z 495.22 [M+H]⁺, 517.23 [M+Na]⁺
(実測値: C, 66.2; H, 7.2; N, 4.4; C₂₇H₃₀O₇N₂ の理論値 C, 65.6; H, 6.1; N, 5.7%).

実施例18
(1S,5R,6R,8R)-5-ヒドロキシ-6-ヒドロキシメチル-1-メトキシ-8-(チミン-1-イル)-2,7-ジオキサビシクロ[3.3.0]オクタン(17)。
メタノール(10cm³)中のヌクレオシド16(1.20 g, 2.43 mmol)溶液に木炭上の20%水酸化パラジウム(250 mg)を加え、混合物を減圧下で注意深く脱気した。水素雰囲気を利用して攪拌を12時間続けた。反応混合物をメタノール中のシリカゲルを充填したガラスカラム(1 x 8 cm)で濾過することにより触媒を除去した。カラムをメタノール(20 cm³)でさらに洗浄した。全ての画分を回収し、蒸発乾固させて石油エーテルと共に蒸発させ、ガラス状の固形物を得た。この残渣をジクロロメタン(v/v)中の5-10%メタノール勾配で溶出させながらシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製した。生成物を含有する画分を回収し、合わせて蒸発乾固させた。残渣を無水メタノール(5 cm³)に溶解し、無水ベンゼン(100 cm³)を加えた。凍結乾燥により白色固形物としてヌクレオシド17を得た(0.61 g, 79%)。

δ_H (CD₃OD) 7.45 (1H, s, 6-H), 5.93 (1H, s, 1'-H), 4.15-3.81 (5H, m, 5'-H_a, 5'-H_b, 2''-H_a, 2''-H_b, 4'-H), 3.43 (3H, s, CH₃-O), 2.47-2.40 (1H, m,
1''-H_a), 2.03-1.93 (1H, m, 1''-H_b), 1.92 (3H, s, CH₃).

δ_C (CD₃OD) 164.1 (C-4), 150.1 (C-2), 138.3 (C-6), 109.6 (C-5), 108.3 (C-2'), 84.4, 84.1, 82.4 (C-1', C-3', C-4'), 68.0, 59.5 (C-5', C-2''), 49.6 (CH₃-O), 34.0 (C-1''), 10.5 (CH₃).

FAB-MS m/z 315.13 [M+H]⁺, 337.09 [M+Na]⁺
(実測値: C, 49.9; H, 5.7; N, 8.2; C₁₃H₁₈O₇N₂ の理論値 C, 49.7; H, 5.8; N, 8.9%)。

実施例19
(1S,5R,6R,8R)-6-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-5-ヒドロキシ-1-メトキシ-8-(チミン-1-イル)-2,7-ジオキサビシクロ[3.3.0]オクタン(18)。
化合物17(0.95 g, 3.03 mmol)と4,4'-ジメトキシトリチルクロライド(1.54 g,
4.77 mmol)の混合物を無水ピリジン(20 cm³)に溶解し、室温で4時間攪拌した。反応混合物を蒸発させ、油状の残渣を得た。これをトルエン(2 x 20 cm³)と共に蒸発させた。ジクロロメタン(50 cm³)および炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(50 cm³)を加え、有機相を分離して蒸発させ、残渣をシリカゲルHPLCで精製した(残渣は0.5%トリエチルアミン(v/v)を含む最少量のジクロロメタンに溶解し、同一の溶媒で平衡させたカラムに付した)。カラムを洗浄し(酢酸エチル:石油エーテル:トリエチルアミン; 15:84.5:0.5 (v/v/v, 1000 cm³)、生成物を0.5%トリエチルアミン(v/v/v)を含むジクロロメタン中のメタノール勾配(0-2%)で溶出し、白色固形物として化合物18(1.71 g, 92.8%)を得た。

δ_H (CDCl₃) 7.51-7.17 (10H, m, DMT, 6-H), 6.79-6.85 (4H, m, DMT), 6.04 (1H, s, 1'-H), 4.12-3.98 (3H, m, 5'-H_a, 5'-H_b, 4'-H), 3.77 (6H, s, CH₃-DMT), 3.49 (3H, s, CH₃-O), 3.45-3.32 (2H, m, 2''-H_a, 2''-H_b), 2.11-2.01 (1H, m,1''-H_a), 1.94-1.87 (1H, m, 1''-H_b), 1.93 (3H, s, CH₃).

δ_C (CDCl₃) 164.2 (C-4), 158.6, 144.7, 135.7, 130.1, 128.2, 127.9, 126.8, 113.2 (DMT), 150.7 (C-2), 137.7 (C-6), 109.8, 109.7 (C-5, C-2'), 86.5,
85.3, 85.0, 81.4 (DMT, C-1' , C-3', C-4'), 69.2, 62.4 (C-5', C-2''), 55.2 (CH₃-DMT), 51.7 (CH₃-O), 35.5 (C-1''), 12.7 (CH3).

FAB-MS m/z 617.26 [M+H]⁺, 639.23 [M+Na]⁺
(実測値: C, 66.4; H, 6.1; N, 4.2; C₃₄H₃₆O₉N₂ の理論値 C, 66.2; H, 5.9; N, 4.5%).

実施例20
(1S,5R,6R,8R)-5-(2-シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノキシ)-6-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-1-メトキシ-8-(チミン-1-イル)-2,7-ジオキサビシクロ[3.3.0]オクタン(19)。
化合物18(1.2 g, 1.95 mmol)を無水ジクロロメタン(10 cm³)に溶解した。N,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.35 cm³, 7.8 mmol)および2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホラミドクロリダイト (0.92 g, 3.9 mmol)を室温で攪拌しながら加えた。72時間後、混合物をジクロロメタンで100 cm³に希釈し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(50 cm³)で洗浄した。有機相を蒸発させ、溶出液A (石油エーテル: ジクロロメタン: ピリジン; 50:50:0.5; v/v/v)中の溶出液B(石油エーテル:ジクロロメタン:酢酸エチル:ピリジン; 45:45:10:0.5; v/v/v)の勾配を用いたシリカゲルHPLCに付した。生成物を含む画分を濃縮し、トルエン(10 cm³)と共に蒸発させ、減圧下で乾燥した。残渣を無水ベンゼン(20 cm³)に溶解し、この溶液を無水石油エーテル(400 cm³)に攪拌しながら加えることによって析出した。得られた白色固形物を濾過して分離し、乾燥して化合物19 (0.96 g, 60.3%)を得た。

δ_P (CDCl₃) 142.64, 142.52.

FAB-MS m/z 817.26 [M+H]⁺, 839.24 [M+Na]⁺
(実測値: C, 62.8; H, 6.4; N, 6.9; C₄₃H₅₃O₁₀N₄P の理論値C, 63.2; H, 6.5; N, 6.9%).

実施例21
1,2-O-イソプロピリデン-3-C-ビニル-α-D-リボフラノース(20)。
無水THF(250 cm³)中の5-O-t-ブチルジメチルシリル-1,2-O-イソプロピリデン-α-D-エリスロ-ペント-3-ウロフラノース (Y. Yoshimura, T. Sano, A. Matsuda, T. Ueda, Chem. Pharm. Bull., 1988, 36, 162) (6.05 g, 0.020 mol)溶液を0℃で攪拌し、エーテル(44 cm³, 44 mmol)中のビニルマグネシウムブロマイド1 M溶液を滴加した。反応混合物を室温で2時間攪拌し、そこに飽和水性塩化アンモニウム(200 cm³)を加え、ジクロロメタン(3 x 300 cm³)を用いて抽出した。合わせた抽出物をブライン(3 x 250 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を除去し、残渣を無水THF(225 cm³)に再溶解した。この混合物にTHF(22 cm³, 22 mmol)中のテトラブチルアンモニウムフルオライド1 M溶液を加え、室温で20分間攪拌し、混合物を減圧下で蒸発させた。残渣をジクロロメタン(500 cm³)に溶解し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(2 x 200 cm³)で洗浄した。12時間の継続抽出によって水相を抽出し、合わせた抽出物を乾燥し(Na₂SO₄) 、蒸発させた。残渣をジクロロメタン/メタノール(99:1, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてフラノース20を得た(3.24 g, 75%)。

δ_H (CDCl ₃) 5.84 (1H, d, J 3.7, 1-H), 5.74 (1H, dd, J 11.0, 17.2, 1'-H), 5.52 (1H, dd, J 1.6, 17.1, 2'-H_a), 5.29 (1H, dd, J 1.3, 11.0, 2'-H_b), 4.21 (1H, d, J 3.7, 2-H), 3.98 (1H, t, J 5.7, 4-H), 3.68-3.64 (2H, m, 5-H_a, 5-H_b), 2.88 (1H, s, 3-OH), 1.99 (1H, t, J 6.3, 5-OH), 1.60 (3H, s, CH₃), 1.35 (3H, s, CH₃).

δ_C (CDCl₃) 133.6 (C-1'), 116.2 (C-2'), 113.0 (C(CH₃)₂), 103.8 (C-1), 83.4, 82.4 (C-4, C-2), 79.6 (C-3), 61.3 (C-5), 26.5, 26.4 (CH₃).

実施例22
3,5-ジ-O-ベンジル-1,2-O-イソプロピリデン-3-C-ビニル-α-D-リボフラノース(21)。
無水DMF(50 cm³)中の60%水素化ナトリウム懸濁液(w/w, 1.78 g, 44.5 mmol)を0℃で攪拌し、無水DMF(35 cm³)中のフラノース20 (3.20 g, 14.8 mmol)の溶液を30分間かけて滴加した。混合物を50℃で1時間攪拌し、次いで0℃に冷却した。無水DMF(5.3 cm3)中の臭化ベンジル溶液(5.3 mL, 44.5 mmol)を滴加し、混合物を室温で20時間攪拌した。反応混合物を蒸発させ、ジクロロメタン(300 cm³)に再び溶解し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 200 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣を石油エーテル/酢酸エチル(9:1, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてフラノース21を得た(5.36 g, 91%)。

δ_H (CDCl₃) 7.40-7.26 (10H, m, Bn), 5.90 (1H, d, J 3.6, 1-H), 5.72 (1H, dd, J 11.1, 17.9, 1'-H), 5.41 (1H, dd, J 0.7, 11.1, 2'-H_a), 5.30 (1H, dd, J 0.5, 17.8, 2'-H_b), 4.70-4.45 (6H, m, Bn, 2-H, 4-H), 3.69 (1H, dd, J 2.6, 10.8, 5-Ha), 3.50 (1H, dd, J 7.9, 10.9, 5-H_b), 1.64 (3H, s, CH₃), 1.40 (3H, s, CH₃).

δ_C (CDCl₃) 138.6, 138.3 (Bn), 134.5 (C-1'), 128.3-127.4 (Bn), 118.2 (C-2'), 112.9 (C(CH₃)₂), 104.7 (C-1), 84.7, 81.1, 81.0 (C-2, C-3, C-4), 73.3 (C-5), 69.4, 67.0 (Bn), 26.8, 26.6 (CH₃).

実施例23
1,2-ジ-O-アセチル-3,5-ジ-O-ベンジル-3-C-ビニル-α,β-D-リボフラノース(22)。
80% 水性酢酸(50 cm³)中のフラノース21溶液(4.40 g, 11.1 mmol)を90℃で8時間攪拌した。溶媒を除去し、残渣を99%エタノール(3 x 25 cm³)、トルエン(3 x 25 cm³)および無水ピリジン(2 x 25 cm³)と共に蒸発させ、無水ピリジン(20 cm³)に再び溶解した。無水酢酸(17 cm³)を加え、溶液を室温で48時間攪拌した。反応混合物を氷冷水(100 cm³)で失活させ、ジクロロメタン(2 x 100 cm³)で抽出した。合わせた抽出物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 100 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を蒸発し、残渣を石油エーテル/酢酸エチル(4:1, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、油としてフラノース22を得た(4.27 g, 87%, α:β〜1:1)。

δ_C (CDCl₃) 169.9, 169.8 (C=O), 139.0, 138.6, 138.0, 137.8 (Bn), 133.3, 132.4 (C-1'), 128.4-126.8 (Bn), 119.6, 119.5 (C-2'), 99.5, 94.0 (C-1), 85.4, 85.0, 84.3, 83.6, 77.7, 73.6, 73.5, 73.3, 70.0, 69.2, 67.5, 67.2 (C-2, C-3, C-4, C-5, Bn), 21.0, 20.9, 20.6, 20.4 (CH₃).

実施例24
1-(2-O-アセチル-3,5-ジ-O-ベンジル-3-C-ビニル-β-D-リボフラノシル)チミン(23)。
無水アセトニトリル(100 cm³)中の化合物22(4.24 g, 9.6 mmol)およびチミン(2.43 g, 19.3 mmol)の攪拌溶液にN,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド(11.9 cm³, 48.1 mmol)を加えた。反応混合物を還流させながら30分間攪拌した。0℃に冷却した後、トリメチルシリルトリフレート(3.2 cm³, 16.4 mmol)を滴加し、溶液を室温で24時間攪拌した。反応を冷たい炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(100
cm3)で失活させ、得られた混合物をジクロロメタン(3 x 50 cm³)で抽出した。合わせた抽出物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(2 x 50 cm³)およびブライン(2
x 50 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。抽出物を減圧下で蒸発させ、残渣をジクロロメタン/メタノール(99:1, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色発泡体としてヌクレオシド23を得た(4.03 g, 83%)。

δ_H (CDCl₃) 8.78 (1H, br s, NH), 7.75 (1H, s, 6-H), 7.38-7.26 (10 H, m, Bn), 6.49 (1H, d, J 8.1, 1'-H), 5.99-5.88 (2H, m, 2'-H and 1''-H), 5.54-5.48 (2H, m, 2''-H_a, 2''-H_b), 4.91-4.50 (4H, m, Bn), 4.34 (1H, s, 4'-H),
3.80 (1H, m, 5'-H_a), 3.54 (1H, m, 5'-H_b), 2.11 (3H, s, COCH₃), 1.48 (3H, s, CH₃).

δ_C (CDCl₃) 170.1 (C=O), 163.8 (C-4), 151.0 (C-2), 138.9, 136.9 (Bn), 136.1 (C-6), 132.0 (C-1''), 128.7, 128.5, 128.2, 127.8, 127.7, 127.5, 127.5, 127.1 (Bn), 120.7 (C-2''), 111.3 (C-5), 85.4 (C-1'), 85.2 (C-3'), 84.3 (C-4'), 76.0 (C-2'), 73.7 (C-5'), 69.3, 67.6 (Bn), 20.6 (COCH₃), 11.7 (CH₃).

実測値: C, 66.3; H, 6.0; N, 5.1; C₂₈H₃₀N₂O₇ の理論値 C, 66.4; H, 6.0; N,
5.5%。

実施例25
1-(3,5-ジ-O-ベンジル-3-C-ビニル-β-D-リボフラノシル)チミン(24)。
無水メタノール(40 cm³)中のヌクレオシド23(3.90 g, 7.7 mmol)の攪拌溶液にナトリウムメトキシド(0.83 g, 15.4 mmol)を加えた。混合物を室温で42時間攪拌し、希塩酸水で中和した。混合物をジクロロメタン(2 x 150 cm³)で抽出し、合わせた抽出物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 100 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、白色発泡体としてヌクレオシド24を得た(3.48 g, 97%)。

δ_H (CDCl₃) 8.89 (1H, br s, NH), 7.60 (1H, d, J 0.9, 6-H), 7.36-7.26 (10H, m, Bn), 6.23 (1H, d, J 7.8, 1'-H), 5.98 (1H, dd, J 11.2, 17.7, 1''-H), 5.66 (1H, d, J 17.7, 2''-H_a), 5.55 (1H, d, J 11.5, 2''-H_b), 4.75-4.37 (6H, m, 2'-H, 4'-H, Bn), 3.84 (1H, dd, J 2.7, 10.8, 5'-H_a), 3.58 (1H, d,
J 11.2, 5'-H_b), 3.23 (1H, d, J 10.6, 2'-OH), 1.50 (3H, s, CH₃).

δ_C (CDCl₃) 163.7 (C-4), 151 3 (C-2), 138.0, 136.9 (Bn), 136.0 (C-6), 131.2 (C-1''), 128.8, 128.6, 128.3, 127.8, 127.7, 127.3 (Bn), 120.7 (C-2''), 111.3 (C-5), 87.3 (C-1'), 84.6 (C-3'), 81.4 (C-4'), 78.0 (C-2'), 73.7
(C-5'), 70.0, 66.4 (Bn), 11.8 (CH3).

実測値: C, 66.8; H, 6.2; N, 5.9; C₂₆H₂₈N₂O₆ の理論値 C, 67.2; H, 6.1; N,
6.0%。

実施例26
1-(3,5-ジ-O-ベンジル-2-O-メタンスルホニル-3-C-ビニル-β-D-リボフラノシル)チミン(25)。
ヌクレオシド24 (2.57 g, 5.53 mmol)を無水ピリジン(18 cm³)に溶解し、0℃に冷却した。塩化メタンスルホニル(1.28 cm³, 16.6 mmol)を滴加し、混合物を室温で30分間攪拌した。反応を水(5 cm³)で失活させ、得られた混合物をジクロロメタン(3 x 80 cm³)で抽出した。合わせた抽出物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 120 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をジクロロメタン/メタノール(99:1, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、黄色の発泡体としてヌクレオシド25を得た(2.53 g, 84%)。

δ_H (CDCl₃) 8.92 (1H, br s, NH), 7.71 (1H, d, J 1.4, 6-H), 7.41-7.28 (10H, m, Bn), 6.57 (1H, d, J 7.8, 1'-H), 5.99-5.61 (4H, m, 2'-H, 1''-H and 2''-H_a, 2''-H_b), 4.86-4.50 (4H, m, Bn), 4.37 (1H, dd, J 1.5, 2.4, 4'-H),
8.82 (1H, dd, J 2.6, 11.0, 5'-H_a), 3.55 (1H, dd, J 1.2, 11.0, 5'-H_b), 3.02 (3H, s, CH₃), 1.47 (3H, d, J 1.1, CH₃)。

δ_C (CDCl₃) 163.7 (C-4), 151.5 (C-2), 138.7, 136.7 (Bn), 135.7 (C-6), 130.9 (C-1''), 128.8, 128.5, 128.4, 127.6, 127.0 (Bn), 121.8 (C-2''), 111.9 (C-5), 85.1 (C-1'), 84.5 (C-3'), 84.0 (C-4'), 80.7 (C-2'), 73.7 (C-5'), 69.2, 67.7 (Bn), 38.9 (CH3), 11.8 (CH₃)。

実施例27
1-(3,5-ジ-O-ベンジル-3-C-ビニル-β-D-アラビノフラノシル)チミン(26)。
エタノール(50 cm³)、水(50 cm³)および1 M 水性水素化ナトリウム (15 cm³)の混合物中のヌクレオシド25 (2.53 g, 4.66 mmol) 溶液を還流させながら16時間攪拌した。混合物を希塩酸水で中和し、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をジクロロメタン(3 x 120 cm³)で抽出した。合わせた抽出物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 150 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン/メタノール(99:1)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色発泡体として26を得た(1.61 g, 74%)。

δ_H (CDCl₃) 9.89 (1H, br s, NH), 7.50 (1H, d, J 1.1, 6-H), 7.41-7.26 (Bn), 6.28 (1H, d, J 2.8, 1'-H), 6.05 (1H, dd, J 11.1, 17.9, 1''-H), 5.58-5.50 (2H, m, 2''-H_a, 2''-H_b), 4.98 (1H, d, J 9.0, 2'-OH), 4.64-4.31 (6H, m, 2'-H, 4'-H, Bn), 3.73 (2H, m, 5'-H_a, 5'-H_b), 1.73 (1H, d, J 0.6, CH₃)。

δ_C (CDCl₃) 165.1 (C-4), 150.5 (C-2), 138.4, 138.0, 136.7 (C-6, Bn), 130.4 (C-1''), 128.8, 128.6, 128.5, 128.1, 128.0, 127.8 (Bn), 120.6 (C-2''), 108.1 (C-5), 88.6 (C-1'), 87.9 (C-3'), 87.2 (C-4'), 73.7 (C-2'), 71.8 (C-5'), 69.7, 66.3 (Bn), 12.3 (CH₃)。

実測値: C, 66.8; H, 6.2; N, 5.9; C₂₆H₂₈N₂O₆ の理論値 C, 67.2; H, 6.1; N,
6.0。

実施例28
1-(3,5-ジ-O-ベンジル-3-C-ヒドロキシメチル-β-D-アラビノフラノシル)チミン(27)。
THF(15 cm³)と水(15 cm³)の混合物中のヌクレオシド26 (2.00 g, 4.31 mmol) 溶液に過ヨウ素酸ナトリウム(2.76 g, 12.9 mmol)およびt-ブタノール中の四酸化オスミウム2.5%溶液(w/w, 0.54 cm³, 43 μmol)を加えた。反応を室温で18時間攪拌し、水(50 cm³)で失活させ、混合物をジクロロメタン(2 x 100 cm³)で抽出した。合わせた抽出物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 75 cm³)で洗浄し、乾燥し(Na₂SO₄)、減圧下で蒸発させた。残渣をTHF(15 cm³)と水(15 cm³)の混合物に再び溶解し、水素化ホウ素ナトリウム(488 mg, 12.9 mmol)を加えた。反応混合物を室温で1時間攪拌し、水(50 cm³)を加え、混合物をジクロロメタン(2 x 100 cm³)で抽出した。合わせた有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 75 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を除去し、残渣をジクロロメタン/メタノール(98:2, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色発泡体としてヌクレオシド27を得た(732 mg, 36%)。

δ_H (CDCl₃) 11.09 (1H, br s, NH), 7.41 (1H, d, J 1.0, 6-H), 7.38-7.26 (Bn), 6.16 (1H, d, J 2.6, 1'-H), 5.12 (1H, d, J 5.4, 2'-OH), 4.66-4.29 (6H, m, 2'-H, 4'-H, Bn), 4.02-3.96 (2H, m, 1''-H_a, 1''-H_b), 3.90 (1H, dd, J
7.2, 9.7, 5'-H_a), 3.79 (1H, dd, J 5.6, 9.7, 5'-H_b), 2.49 (1H, t, J 6.4,
1''-OH), 1.68 (3H, d, J 0.6, CH₃);

δ_C (CDCl₃) 166.1 (C-4), 150.6 (C-2), 139.0, 137.9, 137.0 (C-6, Bn), 128.7, 128.6, 128.4, 128.3, 128.0 (Bn), 107.5 (C-5), 88.2 (C-1'), 88.1 (C-3'), 84.2 (C-4'), 73.7 (C-5'), 72.1 (C-2'), 69.3, 65.4 (Bn), 58.6 (C-1''), 12.3 (CH₃)。

実施例29
(1R,2R,4R,5S)-1-ベンジルオキシ-2-ベンジルオキシメチル-4-(チミン-1-イル)-3,6-ジオキサビシクロ[3.2.0]ヘプタン(28)。
無水ピリジン(20 cm³)中の化合物27(2.26 g, 4.83 mmol)溶液を-40℃で攪拌し、無水ピリジン(10 cm³)中の塩化メタンスルホニル溶液(0.482 cm³, 4.83 mmol)を加えた。反応混合物を室温で17時間攪拌し、水(50 cm³)を加え、混合物をジクロロメタン(2 x 100 cm³)で抽出した。合わせた有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 100 cm3)で洗浄し、乾燥し(Na₂SO₄)、減圧下で蒸発させた。残渣をジクロロメタン/メタノール(99:1, v/v) を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、中間生成物を得た。これを溶媒の蒸発後に無水DMF(15
cm³)に溶解した。この溶液を無水DMF(15 cm³)中の60%水素化ナトリウム懸濁液(461 mg, 11.5 mmol)に0℃で滴加した。反応を室温で30分間攪拌し、水(60 cm³)で失活させた。希塩酸水で中和した後、混合物をジクロロメタン(150 cm³)に溶解し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 100 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を蒸発させ、残渣をジクロロメタン/メタノール(99:1, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色発泡体としてヌクレオシド28を得た(2.00 g, 93%)。

δ_H (CDCl₃) 9.13 (1H, br s, NH), 7.55 (1H, d, J 1.4, 6-H), 7.40-7.26 (Bn), 5.99 (1H, d, J 2.5, 1'-H), 5.30 (1H, d, J 2.7, 2'-H), 4.88-4.57 (6H, m, 1''-H_a, 1''-H_b, Bn), 4.22-4.19 (1H, m, 4'-H), 3.92 (1H, dd, J 6.2, 10.8, 5'-H_a), 3.82 (1H, dd, J 3.7, 10.8, 5'-H_b), 1.91 (3H, d, J 1.3, CH3)。

δ_C (CDCl₃) 163.8 (C-4), 150.3 (C-2), 137.6 (C-6), 137.5, 137.0 (Bn), 128.7, 128.6, 128.2, 128.0, 127.8, 127.3 (Bn), 109.8 (C-5), 85.7 (C-3'), 84.1 (C-1'), 83.5 (C-4'), 79.7 (C-1''), 73.9 (C-2'), 73.6 (C-5'), 68.6, 67.8 (Bn), 12.4 (CH₃)。

FAB m/z 451 [M+H]⁺, 473 [M+Na]⁺.
実測値: C, 66.3; H, 5.9; N, 6.1; C₂₅H₂₆N₂O₆ の理論値 C, 66.7; H, 5.8; N,
6.2%。

実施例30
(1R,2R,4R,5S)-1-ヒドロキシ-2-ヒドロキシメチル-4-(チミン-1-イル)-3,6-ジオキサビシクロ[3.2.0]ヘプタン(29)。
エタノール(3 cm³)中のヌクレオシド28溶液(180 mg, 0.40 mmol)に炭素上の10%水酸化パラジウム(90 mg)を加えた。混合物をアルゴンで数回脱気し、水素雰囲気下に置いた。反応混合物を室温で6時間攪拌し、次いでセライトで濾過した。濾液を減圧下で蒸発させ、残渣をジクロロメタン/メタノール(96:4, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド29を得た(92 mg, 86%)。

δ_H (CD₃OD) 7.79 (1H, d, J 1.2, 6-H), 5.91 (1H, d, J 2.5, 1'-H), 4.96 (1H, d, J 2.5, 2'-H), 4.92 (1H, d, J 7.4, 1''-H_a), 4.58 (1H, dd, J 0.9, 7.4, 1''-H_b), 3.98 (1H, dd, J 7.3, 12.8, 5'-H_a), 3.87-3.82 (2H, m, 4'-H, 5'-H_b), 3.34 (2H, s, 3'-OH, 5'-OH), 1.87 (3H, d, J 1.3, CH₃)。

δ_C (CD₃OD) 166.5 (C-4), 152.1 (C-2), 140.1 (C-6), 110.1 (C-5), 91.2 (C-2'), 85.1 (C-1'), 84.0 (C-4'), 79.6 (C-3'), 78.6 (C-1''), 61.1 (C-5'), 12.3 (CH₃)。

実施例31
(1R,2R,4R,5S)-1-(2-シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノキシ)-2-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-4-(チミン-1-イル)-3,6-ジオキサビシクロ[3.2.0]ヘプタン(30)。
無水ピリジン(4 cm³)中のジオール29溶液(250 mg, 0.925 mmol)に4,4'-ジメトキシトリチルクロライド (376 mg, 1.11 mmol) を加え、混合物を室温で18時間攪拌した。反応をメタノール(1.5 cm³)で失活させ、混合物を減圧下で蒸発させた。ジクロロメタン(30 cm³)中の残渣の溶液を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3
x 20 cm³)で洗浄し、乾燥し(Na₂SO₄)、蒸発させた。残渣をジクロロメタン/メタノール(98:2, v/v) を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し中間生成物を得、それを無水ジクロロメタン(7.0 cm³)に溶解した。N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.64 cm³, 3.70 mmol)、次いで2-シアノエチルN,N-ジイソプロピルホスホラミドクロリダイト(0.41 cm³, 1.85 mmol)を加え、混合物を室温で25時間攪拌した。反応をメタノール(3 cm³)で失活させ、混合物を酢酸エチル(70 cm³)に溶解し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 50 cm³)およびブライン(3 x 50 cm³)で洗浄し、乾燥し(Na₂SO₄)、減圧下で蒸発させた。残渣を石油エーテル/ジクロロメタン/酢酸エチル/トリメチルアミン(100:45:45:10, v/v/v/v) を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製した。得られた残渣をトルエン(2 cm³)に溶解し、-50℃で攪拌しながら石油エーテルから析出した。溶媒を蒸発させた後、残渣を無水アセトニトリル(4 x 5 cm³)と共に蒸発させ、白色発泡体として30を得た(436 mg, 61%)。

³¹P NMR (CDCl₃) 146.6。

実施例32
3,5-ジ-O-ベンジル-4-C-ヒドロキシメチル-1,2-O-イソプロピリデン-α-D-リボフラノース(31)。
-5℃の無水DMF(100 cm³)中の3-O-ベンジル-4-C-ヒドロキシメチル-1,2-O-イソプロピリデン-α-D-リボフラノース(R. D. Youssefyeh, J. P. H. Verheyden および J. G. Moffatt, J. Org. Chem., 1979, 44, 1301)(20.1 g, 0.064 mol)溶液にNaH懸濁液(鉱油中60%(w/w), 1時間30分間に4回、合計2.85 g, 0.075 mol)を加えた。臭化ベンジル(8.9 cm³, 0.075 mol)を滴加し、室温で3時間攪拌し、そこへ氷冷水(50 cm³)を加えた。混合物をEtOAc (4 x 100 cm³)で抽出し、合わせた有機相を乾燥した(Na₂SO₄)。蒸発後、残渣を石油エーテル中5% EtOAc(v/v)で溶出させてシリカゲルクロマトグラフィで精製し、化合物31を得た(18.5 g, 71%)。

δ_C (CDCl₃) 138.0, 137.4, 128.5, 128.3, 128.0, 127.8, 127.6 (Bn), 113.5 (C(CH₃)₂), 104.4 (C-1), 86.5 (C-4), 78.8, 78.6 (Bn), 73.6, 72.6, 71.6 (C-2, C-3, C-5), 63.2, (C-1'), 26.7, 26.1 (CH₃)。

実施例33
4-C-(アセトキシメチル)-3,5-ジ-O-ベンジル-1,2-O-イソプロピリデン-α-D-リボフラノース(32)。
無水ピリジン(4.5 cm³)中のフラノース31溶液 (913 mg, 2.28 mmol)に 無水酢酸(1.08 cm³, 11.4 mmol)を滴加し、反応混合物を室温で3時間攪拌した。反応を氷冷水(50 cm³)を加えて失活させ、ジクロロメタン (3 x 50 cm³)で抽出した。合わせた有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(2 x 50 cm³)で洗浄し、乾燥し(Na₂SO₄)、減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタンを溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、透明の油として化合物32を得た(911 mg, 90%)。

δ_H (CDCl₃) 7.34-7.25 (10 H, m, Bn), 5.77 (1 H, d, J 3.6, 1-H), 4.78-4.27 (8 H, m, Bn, H-5a, H-5b, H-3, H-2), 3.58 (1 H, d, J 10.3, H-1'a), 3.48
(1 H, d, J 10.5, H-1'b), 2.04 (3 H, s, COCH₃), 1.64 (3 H, s, CH₃), 1.34
(3 H, s, CH₃)。

δ_C (CDCl₃) 171.1 (C=O), 138.2, 137.9, 128.6, 128.1, 128.0, 128.0, 127,8
(Bn), 114.0 (C(CH₃)₂), 104.5 (C-1), 85.4 (C-4), 79.3, 78.6 (C-2, C-3), 73.7, 72.7, 71.2 (Bn, C-5), 64.9 (C-1'), 26.7, 26.3 (C(CH₃)₂), 21.0 (COCH₃).

実測値: C, 67.0; H, 6.5; C₂₅H₃₀O₇,1/4H₂Oの理論値C, 67.2; H, 6.9%.

実施例34
4-C-(アセトキシメチル)-1,2-ジ-O-アセチル-3,5-ジ-O-ベンジル-D-リボフラノース(33)。
80%酢酸(10 cm³)中のフラノース32溶液 (830 mg, 1.88 mmol)を90℃で4時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をエタノール(3 x 5 cm³)、トルエン(3 x 5 cm³)および無水ピリジン(3 x 5 cm³)と共に蒸発させ、無水ピリジン(3.7 cm³)に再び溶解した。無水酢酸(2.85 cm³)を加え、溶液を室温で72時間攪拌した。溶液を氷冷水(20 cm³)に注ぎ、混合物をジクロロメタン(2 x 20 cm³)で抽出した。合わせた有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(2 x 20 cm³)で洗浄し、乾燥し(Na₂SO₄)、減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタンを溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、透明の油として33(β:α〜1:3)を得た(789 mg, 86%)。

δ_C (CDCl₃) 171.0, 170.3, 170.0, 169.3 (C=O), 138.1, 137.6, 136.3, 128.9, 128.6, 128.2, 128.0, 128.0, 127.9, 127.7, 124.0 (Bn), 97.8, 97.8 (C-1), 87.0, 85.0, 78.9, 74.5, 74.4, 73.8, 73.6, 72.0, 71.8, 71.0, 70.9, 64.6, 64.4 (C-2, C-3, C-4, Bn, C-5, C-1'), 21.0, 20.8, 20.6 (COCH₃).

実測値: C, 64.2; H, 6.3; C₂₆H₃₀O₉の理論値C, 64.2; H, 6.2%。

実施例35
1-(4-C-(アセトキシメチル)-2-O-アセチル-3,5-ジ-O-ベンジル-β-D-リボフラノシル)チミン(34)。
無水アセトニトリル(14.5 cm³)中のアノマー混合物33(736 mg, 1.51 mmol)とチミン(381 mg, 3.03 mmol)の攪拌溶液に、N,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド(2.61 cm³, 10.6 mmol)を加えた。反応混合物を還流させながら1時間攪拌し、次いで0℃に冷却した。攪拌しながらトリメチルシリルトリフレート(0.47 cm³, 2.56 mmol)を滴加し、溶液を65℃で2時間攪拌した。反応を冷たい炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(15 cm³)で失活させ、ジクロロメタン(3 x 10 cm³)で抽出した。合わせた有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(2 x 10 cm³)およびブライン(2 x 10 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン/メタノール(98:2, v/v) を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド34を得た(639 mg, 76%)。

δ_H (CDCl₃) 8.98 (1 H, br s, NH), 7.39-7.26 (11 H, m, Bn, 6-H), 6.22 (1 H, d, J 5.3, 1'-H), 5.42 (1 H, t, J 5.4, 2'-H), 4.63-4.43 (5H, m, 3'-H, Bn), 4.41 (1 H, d, J 12.2, 5'-H_a), 4.17 (1 H, d, J 12.1, 5'-H_b), 3.76 (1
H, d, J 10.2, 1''-H_a), 3.51 (1 H, d, J 10.4, 1''-H_b), 2.09 (3 H, s, COCH₃), 2.03 (3 H, s, COCH₃), 1.53 (3 H, d, J 0.9, CH₃)。

δ_C (CDCl₃) 170.8, 170.4 (C=O), 163.9 (C-4), 150.6 (C-2), 137.4 (C-6) 137.4, 136.1, 128.9, 128.8, 128.4, 128.2, 127,9 (Bn), 111.7 (C-5), 87.2, 87.2, 86.1 (C-1', C-3', C-4'), 77.6 (C-2'), 74.8, 73.9, 71.1, 63.8 (Bn, C-1'', C-5'), 20.9, 20.8 (COCH₃), 12.0 (CH₃).

FAB-MS m/z 553 [M+H]⁺.
実測値: C, 62.7; H, 5.9; N, 4.7; C₂₉H₃₂N₂O₉ の理論値 C, 63.0; H, 5.8; N,
5.1%。

実施例36
1-(3,5-ジ-O-ベンジル-4-C-(ヒドロキシメチル)-β-D-リボフラノシル)チミン(35)。
メタノール(5.5 cm³)中のヌクレオシド34(553 mg, 1.05 mmol)の攪拌溶液にナトリウムメトキシド (287 mg, 5.25 mmol)を加えた。反応混合物を室温で10分間攪拌し、次いで希塩酸で中和した。溶媒を部分的に蒸発させ、ジクロロメタン (2 x 20 cm³)で抽出した。合わせた有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液 (3 x
20 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄). 溶媒を減圧下で除去し、白色固形物として35を得た(476 mg, 97%)。

δ_H (CDCl₃) 7.47 (1 H, d, J 1.0 6-H), 7.36-7.22 (10 H, m, Bn), 6.07 (1 H, d, J 3.8, 1'-H), 4.87 (1 H, d, J 11.7, Bn), 4.55 (1 H, d, J 11.7, Bn),
4.50-4.32 (4 H, m, Bn, 2'-H, 3'-H), 3.84-3.53 (4 H, m, 5'-H_a, 5'-H_b, 1''-H_a, 1''-H_b), 1.50 (3 H, d, J 1.1, CH₃)。

δ_C (CDCl₃) 164.3 (C-4), 151.3 (C-2), 137.6 (C-6) 136.4, 136.3, 128.8, 128.6, 128.4, 128.3, 127,9 (Bn), 111.1 (C-5), 91.1, 91.0, 88.1 (C-1', C-3', C-4'), 77.4 (C-2'), 74.8, 73.8, 71.4, 63,2 (Bn, C-5', C-1''), 12.0 (CH₃).

FAB-MS m/z 491 [M+Na]⁺。
実測値: C, 63.4; H, 6.0; N, 5.5; C₂₅H₂₈N₂O₇,1/4H₂O の理論値 C, 63.5; H, 6.1; N, 5.9%。

実施例37
中間生成物35A。
無水ピリジン(1.3 cm³)中のヌクレオシド35溶液(225 mg, 0.48 mmol)を0℃で攪拌し、塩化p-トルエンスルホニル (118 mg, 0.62 mmol)を少量ずつ加えた。溶液を室温で16時間攪拌し、塩化p-トルエンスルホニル(36 mg, 0.19 mmol)をさらに加えた。さらに4時間攪拌し、氷冷水(15 cm³)を加えた後、ジクロロメタン(2 x 15 cm³)で抽出した。合わせた有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 15
cm3)で洗浄し、乾燥した (Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン/メタノール(99:1, v/v) を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、中間生成物35A (140 mg)を得た。これは精製せずに次の工程で用いられた。

実施例38
(1S,3R,4R,7S)-7-ベンジルオキシ-1-ベンジルオキシメチル-3-(チミン-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン(36)。
中間生成物35A (159 mg)を無水DMF (0.8 cm³)に溶解した。この溶液を無水DMF
(0.8 cm³)中の鉱油中60% 水素化ナトリウム懸濁液 (w/w, 32 mg, 0.80 mmol)に0℃で攪拌しながら滴加した。混合物を室温で72時間攪拌し、次いで減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタン(10 cm³)に溶解し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 5 cm³)で洗浄し、乾燥した (Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン/メタノール(99:1, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物として二環式ヌクレオシド36を得た(65.7 mg, 57%)。

δ_H (CDCl₃) 9.24 (1 H, br s, NH), 7.49 (1 H, s, 6-H), 7.37-7.26 (10 H, m, Bn), 5.65 (1 H, s, 1'-H), 4.70-4.71 (5 H, m, Bn, 2'-H), 4.02-3.79 (5 H, m, 3'-H, 5'-H_a, 5'-H_b, 1''-H_a, 1''-H_b), 1.63 (3 H, s, CH₃)。

δ_C (CDCl₃) 164.3 (C-4), 150.1 (C-2), 137.7, 137.1 (Bn), 135.0 (C-6), 128.8, 128.7, 128.4, 128.0, 127.9 (Bn), 110.4 (C-5), 87.5, 87.3 (C-1', C-3'), 76.7, 75.8, 73.9, 72.3, 72.1 (Bn, C-5', C-2', C-4'), 64.5 (C-1''), 12.3 (CH₃).

FAB-MS m/z 451 [M+H]⁺。

実施例39
(1S,3R,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-3-(チミン-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン(37)。
エタノール(1.5 cm³)中のヌクレオシド36溶液(97 mg, 0.215 mmol)を室温で攪拌し、炭素上の20%水酸化パラジウム(50 mg)を加えた。混合物をアルゴンで数回脱ガスし、風船で水素雰囲気に置いた。4時間攪拌した後、混合物をジクロロメタン-メタノール(97:3, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド37を得た(57 mg, 98%)。

δ_H ((CD₃)₂SO) 11.33 (1H, br s, NH), 7.62 (1H, d, J 1.1 Hz, 6-H), 5.65 (1H, d, J 4.4 Hz, 3'-OH), 5.41 (1H, s, 1'-H), 5.19 (1H, t, J 5.6 Hz, 5'-OH), 4.11 (1H, s, 2'-H), 3.91 (1H, d, J 4.2 Hz, 3'-H), 3.82 (1H, d, J 7.7
Hz, 1''-H_a), 3.73 (1H, s, H'-5a), 3.76 (1H, s, 5'-H_b), 3.63 (1H, d, J 7.7 Hz, 1''-H_b), 1.78 (3H, d, J 0.7 Hz, CH₃)。

δ_C (CDCl₃) 166.7 (C-4), 152.1 (C-2), 137.0 (C-6), 110.9 (C-5), 90.5, 88.4 (C-1', C-4'), 80.9, 72.5, 70.4 (C-2', C-3', C-5'), 57.7 (C-1''), 12.6
(CH₃).

EI-MS m/z 270 [M]⁺.

実施例40
(1R,3R,4R,7S)-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-7-ヒドロキシ-3-チミン-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン(38)。
無水ピリジン(5 cm³)中のヌクレオシド37溶液(1.2 g, 4.44 mmol)に、4,4'-ジメトキシトリチルクロライド(2.37 g, 7.0 mmol)を0℃で加えた。溶液を室温で2時間攪拌し、反応を氷冷水(10 cm³)で失活させ、ジクロロメタン(3 x 15 cm³)で抽出した。合わせた有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 10 cm³)およびブライン(2 x 10 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン/メタノール(98:2, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド38を得た(2.35 g, 93%)。

δ_H (CDCl₃) 9.89 (1H, br s, NH), 7.64 (1H, s, 6-H), 7.47-7.13 (9H, m, DMT), 6.96-6.80 (4H, m, DMT), 5.56 (1H, s, 1'-H), 4.53 (1H, br s, 2'-H), 4.31 (1H, m, 3'-H), 4.04-3.75 (9H, m, 1''-H_a, 1''-H_b, 3'-OH, OCH₃), 3.50 (2H, br s, 5'-H_a, 5'-H_b), 1.65 (3H, s, CH₃).

δ_C (CDCl₃) 164.47 (C-4), 158.66 (DMT), 150.13 (C-2), 144.56, 135.46, 135.35, 134.78, 130.10, 129.14, 128.03, 127.79, 127.05 (C-6, DMT), 113.32,
113.14 (DMT), 110.36 (C-5), 89.17, 88.16, 87.05 (C-1', C-4', DMT), 79.36, 71.81, 70.25, 58.38 (C-2', C-3', C-5', C-1''), 55.22 (OCH₃), 12.57 (CH₃).

FAB-MS m/z 595 [M+Na]⁺, 573 [M+H]⁺.

実施例41
(1R,3R,4R,7S)-7-(2-シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノキシ)-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-3-(チミン-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン(39)。
室温の無水ジクロロメタン(6 cm³)中のヌクレオシド38溶液(2.21 g, 3.86 mmol)にN,N-ジイソプロピルエチルアミン(4 cm³)および2-シアノエチルN,N-ジイソプロピルホスホラミドクロリダイト(1 cm³, 4.48 mmol)を加え、1時間攪拌した。MeOH(2 cm³)を加え、混合物を酢酸エチル(10 cm³)で希釈し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 5 cm³)およびブライン(3 x 5 cm³)で連続的に洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をジクロロメタン/メタノール(99:1, v/v) を溶出液として用いた塩基性アルミナカラムクロマトグラフィで精製し、白色発砲体として39を得た。この残渣をジクロロメタン(2 cm³)に溶解し、生成物を激しく攪拌しながら石油エーテル(100 cm³、-30℃に冷却)から析出させた。析出物を濾過によって回収し、乾燥し、白色固形物としてヌクレオシド39を得た(2.1 g, 70%)。

δ_P(CDCl₃) 149.06, 148.74.

FAB-MS m/z 795 [M+Na]⁺, 773 [M+H]⁺.

実施例42
1-(2-O-アセチル-4-C-アセトキシメチル-3,5-ジ-O-ベンジル-β-D-リボフラノシル)ウラシル(40)。
無水アセトニトリル(65 cm³)中のアノマー混合物33 (3.0 g, 6.17 mmol)とウラシル(1.04 g, 9.26 mmol)の攪拌溶液に、N,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド(9.16 cm³, 37.0 mmol)を加えた。反応混合物を室温で1時間攪拌し、0℃に冷却した。トリメチルシリルトリフレート(1.8 cm³, 10.0 mmol)を滴加し、溶液を60℃で2時間攪拌した。反応を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液 (10 cm³)を加えて0℃に失活させ、ジクロロメタン(3 x 20 cm³)で抽出した。合わせた有機相をブライン(2 x 20 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン/メタノール(99:1, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド40を得た(2.5 g, 75%)。

δ_H (CDCl₃) 9.57 (1H, br s, NH), 7.63 (1H, d, J 8.2, 6-H), 7.40-7.24 (10H, m, Bn), 6.18 (1H, d, J 4.5, 1'-H), 5.39-5.32 (2H, m, 2'-H, 5-H), 4.61
(1H, d, J 11.6, Bn), 4.49-4.40 (5H, m, 3'-H, Bn, 1''-H_a), 4.37 (1H, d, J 12.3, 1''-H_b), 3.76 (1H, d, J 10.1, 5'-H_a), 3.49 (1H, d, J 10.1, 5'-H_b), 2.09 (s, 3H, COCH₃), 2.04 (3H, s, COCH₃).

δ_C (CDCl₃) 170.47, 169.94 (C=O), 163.32 (C-4), 150.30 (C-2), 140.24 (C-6), 137.15, 136.95, 128.65, 128.52, 128.32, 128.19, 128.02, 127.77 (Bn),
102.57 (C-5), 87.41, 86.14 (C-1', C-4'), 77.09, 74.84, 74.51, 73.75, 70.60, 63.73 (C-2', C-3', C-5', C-1'', Bn), 20.79, 20.68 (COCH₃).

FAB-MS m/z 539 [M]⁺.

実施例43
1-(3,5-ジ-O-ベンジル-4-C-ヒドロキシメチル-β-D-リボフラノシル)ウラシル(41)。
メタノール(25 cm³)中のヌクレオシド40(2.0 g, 3.7 mmol)の攪拌溶液に、ナトリウムメトキシドを加えた(0.864 g, 95%, 16.0 mmol)。反応混合物を室温で10分間攪拌し、20% 水性塩酸で中和した。溶媒を部分的に蒸発させ、残渣を酢酸エチル(3 x 50 cm³)で抽出した。合わせた有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 20 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン/メタノール(98.5:1.5, v/v) を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物として41を得た(1.58 g, 95%)。

δ_H (CDCl₃) 9.95 (1H, br s, NH), 7.69 (d, J 8.1, 6-H), 7.35-7.17 (10H, m, Bn), 6.02 (1H, d, J 2.3, 1'-H), 5.26 (1H, d, J 8.1, 5-H), 4.80 (1H, d,
J 11.7, Bn), 4.47 (1H, d, J 11.7, Bn), 4.45-4.24 (4H, m, Bn, 2'-H, 3'-H), 3.81 (1H, d, J 11.9, 1''-H_a), 3.69 (2H, br s, 2'-OH, 1''-OH), 3.67 (2H, m, 5'-H_a, 1''-H_b), 3.48 (1H, d, J 10.3, 5'-H_b).

δ_C (CDCl₃) 163.78 (C-4), 150.94 (C-2), 140.61 (C-6), 137.33, 137.22, 128.59, 128.18, 128.01 (Bn), 102.16 (C-5), 91.46, 88.36 (C-1', C-4'), 76.73, 74.66, 73.71, 73.29, 70.81, 62.81 (C-2', C-3', C-5', C-1'', Bn).

FAB-MS m/z 455 [M+H]⁺.

実施例44
中間生成物42。
ヌクレオシド41 (1.38 g, 3.0 mmol)、無水ピリジン(2 cm³)および無水ジクロロメタン(6 cm³)の溶液を-10℃で攪拌し、塩化p-トルエンスルホニル (0.648 g,
3.4 mmol)を1時間で少量ずつ加えた。溶液を-10℃で3時間攪拌した。反応を氷冷水 (10 cm³)を加えて失活させ、混合物をジクロロメタン (3 x 50 cm³)で抽出した。合わせた有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 20 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン/メタノール(99:1, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、中間生成物42 (0.9 g)を得た。これは精製せずに次の工程で使用する。

実施例45
(1S,3R,4R,7S)-7-ベンジルオキシ-1-ベンジルオキシメチル-3-(ウラシル-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン(43)。
化合物42 (0.7 g)を無水DMF (3 cm³)に溶解し、60%水素化ナトリウム懸濁液(w/w, 0.096 g, 24 mmol)を0℃で10分間で4回に分けて加え、反応混合物を室温で12時間攪拌した。反応をメタノール(10 cm³)で失活させ、溶媒を減圧下で除去した。残渣をジクロロメタン (20 cm³)に溶解し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 6 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン/メタノール(99:1, v/v) を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、ヌクレオシド43 を得た(0.30 g, 60%)。

δ_H (CDCl₃) 9.21 (1H, br s, NH), 7.70 (1H, d, J 8.2, 6-H), 7.37-7.24 (10H, m, Bn), 5.65 (1H, s, 1'-H), 5.52 (1H, d, J 8.2, 5-H), 4.68-4.45 (5H, m, 2'-H, Bn), 4.02-3.55 (5H, m, 3'-H, 5'-H_a, 1''-H_a , 5'-H_b, 1''-H_b).

δ_C (CDCl₃) 163.33 (C-4), 149.73 (C-2), 139.18 (C-6), 137.46, 136.81, 128.58, 128.54, 128.21, 128.10, 127.79, 127.53 (Bn), 101.66 (C-5), 87.49, 87.33 (C-1', C-4'), 76.53, 75.71, 73.77, 72.33, 72.00, 64.35 (C-2', C-3', C-5', C-1'', Bn).

FAB-MS m/z 459 [M+Na]⁺.

実施例46
(1S,3R,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-3-(ウラシル-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン(44)。
無水エタノール(2 cm³)中の化合物43溶液(0.35 g, 0.8 mmol)に炭素上の20%水酸化パラジウム (0.37 g)を加え、混合物を水素で数回脱ガスし、水素雰囲気下で4時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン/メタノール(9:1, v/v) を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド44を得た(0.16 g, 78%)。

δ_H (CD₃OD) 7.88 (1H, d, J 8.1, 6-H), 5.69 (1H, d, J 8.1, 5-H), 5.55 (1H, s, 1'-H), 4.28 (1H, s, 2'-H), 4.04 (1H, s, 3'-H), 3.96 (1H, d, J 7.9, 1''-H_a), 3.91 (2H, s, 5'-H), 3.76 (1H, d, J 7.9, 1''-H_b).

δ_C (CD₃OD) 172.95 (C-4), 151.82 (C-2), 141.17 (C-6), 101.97 (C-5), 90.52, 88.50 (C-1', C-4'), 80.88, 72.51, 70.50, 57.77 (C-2', C-3', C-5', C-1'').

FAB-MS m/z 257 [M+H]⁺.

実施例47
(1R,3R,4R,7S)-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-7-ヒドロキシ-3-(ウラシル-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン(45)。
無水ピリジン(0.5 cm³)中の化合物44溶液(0.08 g, 0.31 mmol)に、4,4'-ジメトキシトリチルクロライド(0.203 g, 0.6 mmol) を0℃で加え、混合物を室温で2時間攪拌した。反応を氷冷水(10 cm³)で失活させ、ジクロロメタン(3 x 4 cm³)で抽出した。合わせた有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 3 cm³) およびブライン(2 x 3 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン/メタノール(98:2, v/v) を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド45を得た(0.12 g,
69%)。

δ_H (CDCl₃) 9.25 (1H, br s, NH), 7.93 (1H, d, J 7.2, 6-H), 7.50-7.15 (9H, m, DMT), 6.88-6.78 (4H, m, DMT), 5.63 (1H, s, 1'-H), 5.59 (1H, d, J 8.0, 5-H), 4.48 (1H, s, 2'-H), 4.26 (1H, s, 3'-H), 3.88 (1H, d, J 8.1, 1''-H_a), 3.85-3.55 (7H, m, 1''-H_b, OCH₃), 3.58-3.40 (2H, m, 5'-H_a, 5'-H_b).

δ_C (CDCl₃) 164.10 (C-4), 158.60 (DMT), 150.45 (C-2), 147.53 (DMT), 144.51 (C-6), 139.72, 135.49, 135.37, 130.20, 129.28, 128.09, 127.85, 127.07
(DMT), 113.39, 113.17 (DMT), 101.79 (C-5), 88.20, 87.10, 86.87 (C-1', C-4', DMT), 79.25, 71.79, 69.70, 58.13 (C-2', C-3', C-5', C-1''), 55.33 (OCH₃).

FAB-MS m/z 559 [M+H]⁺.

実施例48
(1R,3R,4R,7S)-7-(2-シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノキシ)-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-3-(ウラシル-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン(46)。
無水ジクロロメタン(2 cm³)中の化合物45溶液(0.07 g, 0.125 mmol)に、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.1 cm³)および2-シアノエチルN,N-ジイソプロピルホスホラミドクロリダイト(0.07 cm³, 0.32 mmol)を室温で加えた。1時間攪拌した後、反応をMeOH (2 cm³)で失活させ、得られた混合物を酢酸エチル (5 cm³)で希釈し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液 (3 x 2 cm³)およびブライン(3 x 2 cm³)で連続的に洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で蒸発し、残渣をジクロロメタン/メタノール(99:1, v/v) を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色発泡体を得た。この発泡体をジクロロメタン(2 cm³)に溶解し、激しく攪拌しながら生成物を石油エーテル (10 cm³, -30℃に冷却)から析出した。析出物を濾過によって回収し、乾燥し、白色固形物として化合物46を得た (0.055 g, 58%)。

δ_p (CDCl₃) 149.18, 149.02。

実施例49
9-(2-O-アセチル-4-C-アセトキシメチル-3,5-ジ-O-ベンジル-β-D-リボフラノシル)-2-N-イソブチリルグアニン(47)。
無水ジクロロエタン(60 cm³)中のアノマー混合物33 (1.28 g, 5.6 mmol)および2-N-イソブチリルグアニン(1.8 g, 3.7 mmol)の攪拌溶液にN,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド(4 cm³, 16.2 mmol)を加えた。反応混合物を還流させながら1時間攪拌した。トリメチルシリルトリフレート(1.5 mL, 8.28 mmol) を0℃で滴加し、溶液を還流させながら2時間攪拌した。反応混合物を1時間半で室温に冷却させた。ジクロロメタンを加えて250 cm³に希釈した後、混合物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(200 cm³)および水(250 cm³)で洗浄した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン中1.25% (200 cm³)および1.5% (750 cm³)のメタノール(v/v) を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物として2.10 g (87%)を得た。 ¹H-NMR 分析により、これは3つのアイソマーからなる(12.5:2.5:1)。この条件で形成された主生成物は化合物47であると思われる(P. Garner, S. Ramakanth, J. Org. Chem. 1988, 53, 1294; H. Vorbruggen, K. Krolikiewicz, B. Bennua, Chem. Ber. 1981, 114, 1234)。 個々のアイソマーは分離しておらず、この混合物は次の工程で使用された。

主生成物47:
δ_H (CDCl₃) 12.25 (br s, NHCO), 9.25 (br s, NH), 7.91 (s, 8-H) 7.39-7.26
(m, Bn), 6.07 (d, J 4.6, 1'-H), 5.80 (dd, J 5.8, J 4.7, 2'-H), 4.72 (d,
J 5.9, 3'-H), 4.59-4.43 (m, Bn, 1''-H_a), 4.16 (d, J 12.1, 1''-H_b), 3.70
(d, J 10.1, 5'-H_a), 3.58 (d, J 10.1, 5'-H_b), 2.65 (m, CHCO), 2.05 (s, COCH₃), 2.01 (s, COCH₃), 1.22 (d, J 6.7, CH₃CH), 1.20 (d, J 7.0, CH₃CH)。

δ_C (CDCl₃) 178.3 (COCH), 170.6, 179.8 (COCH₃), 155.8, 148.2, 147.6 (グアニン), 137.6, 137.2 (グアニン, Bn), 128.5, 128.4, 128.2, 128.1, 128.0,
127.8, 127.7 (Bn), 121.2 (グアニン), 86.2, 86.0 (C-1', C-4'), 77.8 (C-3'), 74.9, 74.5, 73.7, 70.4 (Bn, C-2', C-5'), 63.5 (C-1''), 36.3 (COCH), 20.8, 20.6 (COCH₃), 19.0 (CH₃CH)。

混合物: FAB-MS m/z 648 [M+H]⁺, 670 [M+Na]⁺.
実測値: C, 60.8; H, 6.0; N, 10.4; C₃₃H₃₆N₅O₉ の理論値 C, 61.3; H, 5.6; N, 10.8%。

実施例50
9-(3,5-ジ-O-ベンジル-4-C-ヒドロキシメチル-β-D-リボフラノシル)-2-N-イソブチリルグアニン(48)。
THF/ピリジン/メタノール(2:3:4, v/v/v) (40 cm₃)中の化合物47を含む実施例49に記載の混合物の溶液(2.10 g, 3.25 mmol)を-10℃に冷却し、ナトリウムメトキシド (320 mg, 5.93 mmol) を攪拌溶液に加えた。反応混合物を10℃で30分間攪拌し、2 cm³の酢酸で中和した。溶媒を減圧下で蒸発させ,残渣をジクロロメタン/水系(2 x 100 cm³)で2回抽出した。有機画分を合わせ、減圧下で蒸発させた。トルエンと共に蒸発させた後、 残渣をジクロロメタン(v/v)中のメタノールの勾配(2-7 %)によるシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物を得た (1.62 g)。¹H-NMRより、これは3つのアイソマーからなる (比：13.5:1.5:1)。

主生成物48:
δ_H (CD₃OD) 8.07 (s, 8-H) 7.36-7.20 (m, Bn), 6.05 (d, J 3.9, 1'-H), 4.81
(d, J 11.5, Bn), 4.75 (m, 2'-H), 4.56 (d, J 11.5, Bn), 4.51-4.43 (m, Bn, 3'-H), 3.83 (d, J 11.7, 1''-H_a), 3.65 (d, J 11.7, 1''-H_b), 3.64 (d, J 10.6, 5'-H_a), 3.57 (d, J 10.3, 5'-H_b), 2.69 (m, CHCO), 1.20 (6 H, d, J 6.8, CH₃CH)。

δ_C (CD₃OD) 181.6 (COCH), 157.3, 150.2, 149.5 (グアニン), 139.4, 139.3, 139.0 (グアニン, Bn), 129.5, 129.4, 129.3, 129.2, 129.1, 129.0, 128.9, 128.8 (Bn), 121.2 (グアニン), 90.7, 89.6 (C-1', C-4'), 79.2 (C-3'), 75.8,
74.5, 74.3, 72.2 (Bn, C-2', C-5'), 63.1 (C-1''), 36.9 (COCH), 19.4 (CH₃CH), 19.3 (CH₃CH)。

混合物: FAB-MS m/z 564 [M+H]⁺。

実施例51
中間生成物49。
無水ピリジン(6 cm³)中の48 (1.6 g)を含む実施例50に記載の混合物の溶液を-20℃で攪拌し、塩化p-トルエンスルホニル(0.81 g, 4.27 mmol)を加えた。溶液を-20℃で1時間、-25℃で2時間攪拌した。次いで混合物をジクロロメタンを加えて100 cm³に希釈し、すぐに水(2 x 100 cm³)で洗浄した。有機相を分離し、減圧下で蒸発させた。残渣をジクロロメタン/メタノール(1-2%, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、中間生成物49を得た(980 mg)。カラムから化合物49を溶出した後、48を含む出発混合物(510 mg)をジクロロメタン中8%メタノール(v/v)を溶出液として溶出した。この物質を濃縮し、減圧下で乾燥し、上記と同様の方法にて処理し、252 mgの中間生成物をさらに得た。中間生成物(1.23 g)をシリカゲルHPLC(Porasilでパックされたプレパック（PrepPak）カートリッジ, 15-20 μm, 125A, 流量60 cm³/分、溶出液はジクロロメタン中0-4%メタノール(v/v)、120 分)で精製した。中間生成物49を含む画分をプールし、濃縮して白色固形物を得た (1.04 g)。¹H-NMR によれば、これは２つの主生成物すなわち〜2:1の比の1''-O および 2'-O モノトシル化誘導体である。

FAB-MS m/z 718 [M+H]⁺.
実測値C, 60.4; H, 5.8; N, 9.3; C₃₆H₃₉N₅O₉S の理論値C, 60.2; H, 5.5; N, 9.8%。

実施例52
(1S,3R,4R,7S)-7-ベンジルオキシ-1-ベンジルオキシメチル-3-(2-N-イソブチリルグアニン-9-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン(50)。
無水THF (20 cm³)中の中間生成物49溶液(940 mg)に60%水素化ナトリウム懸濁液(w/w, 130 mg, 3.25 mmol)を加え、混合物を室温で１時間攪拌した。酢酸(0.25 mL)を加え、混合物を減圧下で濃縮した。 残渣をジクロロメタン (100 cm³)に溶解し、水 (2 x 100 cm³)で洗浄した。有機相を分離し、減圧下で蒸発させた。残渣をメタノール/ジクロロメタン(1-1.5%, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド50を得た(451 mg, 57%)。

δ_H (CDCl₃) 12.25 (1H, br s, NHCO), 10.12 (1H, br s, NH), 7.84 (1H, s, 8-H), 7.31-7.15 (10H, m, Bn), 5.72 (1H, s, 1'-H), 4.60-4.46 (5H, m, Bn, 2'-H), 4.14 (1H, s, 3'-H), 4.02 (1H, d, J 7.9, 1''-H_a), 3.85 (1H, d, J 7.9, 1''-H_b), 3.78 (2H, s, 5'-H), 2.81 (1H, m, CHCO), 1.24 (3H, d, J 6.8, CH₃CH), 1.22 (3H, d, J 6.4, CH₃CH)。

δ_C (CDCl₃) 179.5 (COCH), 155.6, 148.1, 147.3 (グアニン), 137.3, 136.9, 136.0 (グアニン, Bn), 128.4, 128.3, 127.9, 127.8, 127.5, 127.4 (Bn), 121.2 (グアニン), 87.1, 86.2 (C-1', C-4'), 77.0 (C-3'), 73.6, 72.5, 72.1 (Bn, C-2', C-5'), 64.9 (C-1''), 36.1 (COCH), 19.0 (CH₃CH), 18.9 (CH₃CH)。

FAB-MS m/z 546 [M+H]⁺.
実測値: C, 63.3; H, 5.9; N, 12.5; C₂₉H₃₀N₅O₆の理論値 C, 64.0; H, 5.6; N,
12.9%。

化合物50の別の生成方法。G1AQ。
化合物78(1.5g, 2.51 mmol)と乾燥DCM (50 mL)中のN2-イソブチリルグアニン(0.93 g, 4.06 mmol)の懸濁液に、BSA (N,O-ビストリメチルシリルアセトアミド; 3.33 mL, 13.5 mmol) を加え、混合物を2時間還流させた。トリメチルシリルトリフレート(1.25 mL, 6.9 mmol)を混合物に加え、さらに2時間還流させた。混合物を室温に冷却し、200 mLのDCMで希釈し、NaHCO₃飽和水溶液および水で洗浄した。シリカゲルカラムクロマトグラフィ(ジクロロメタン中1- 2.5 % of CH₃OH)により1.05g (55%)の所望のアイソマーG1AQおよび上記手順を繰り返すことによってG1AQに変換される380 mgの高流動性アイソマーを得た。水酸化アンモニウム(12 mLの25%水溶液)をG1AQ溶液(12 mL メタノール中1.05 g)に加え、混合物を室温で1時間攪拌した。濃縮後、生成物をシリカゲルコラムクロマトグラフィ(ジクロロメタン中1-3 % CH₃OH)で精製し、白色固形物として700 mgのG3を得た。無水THF (15 mL)中の700 mgのG3をNaH (鉱油中225 mgの60%懸濁液)で処理した。30分後、反応を1.25 mLの酢酸を加えることにより失活させ、混合物を減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解し、NaHCO₃および水で洗浄し、メタノール/DCMの0.5-3%勾配でシリカゲルクロマトグラフィで精製した。400 mg (75%)の50を得た。

実施例53
(1S,3R,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-3-(2-N-イソブチリルグアニン-9-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン(51)。
ヌクレオシド50 (717 mg, 1.31 mmol)と炭素上の10%パラジウム(500 mg)の混合物を室温でメタノール(8 cm³)に懸濁した。 混合物を減圧下で数回脱ガスし、水素雰囲気下に置いた。24時間攪拌した後、混合物をメタノール/ジクロロメタン(8-20%, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、ガラス状固形物としてヌクレオシド51を得た(440 mg, 92%)。

δ_H (CD₃OD) 8.12 (1H, br s, 8-H), 5.86 (1H, s, 1'-H), 4.50 (1H, s, 2'-H), 4.30 (1H, s, 3'-H), 4.05 (1H, d, J 8.0, 1''-H_a), 3.95 (2H, s, 5'-H), 3.87 (1H, d, J 7.9, 1''-H_b), 2.74 (1H, m, CHCO), 1.23 (6H, d, J 6.9, CH₃CH)。

δ_C (CD₃OD, 炭水化物部分からのシグナル) 90.2, 87.6 (C-1', C-4'), 81.1 (C-3'), 72.9, 71.3 (C-2', C-5'), 58.2 (C-1''), 37.1 (COCH), 19.5 (CH₃CH).

FAB-MS m/z 366 [M+H]⁺。

実施例54
(1R,3R,4R,7S)-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-7-ヒドロキシ-3-(2-N-イソブチリルグアニン-9-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン(52)。
化合物51 (440 mg, 1.21 mmol)と4,4'-ジメトキシトリチルクロライド (573 mg, 1.69 mmol)の混合物を無水ピリジン (7 cm³)に溶解し、室温で4時間攪拌した。混合物を減圧下で蒸発させて油を得た。ジクロロメタン/水系(1:1, v/v, 40 cm³)で抽出した。有機相を分離して濃縮し、0.5%のピリジン(v/v)を含む最小容量の溶液を得た。これを同一の溶媒で平衡させたシリカゲルクロマトグラフィに付した。生成物を0.5%のピリジン(v/v)を含むジクロロメタン中のメタノールの濃度勾配(0.6 - 2%, v/v)で溶出し、白色固形物として化合物52を得た(695 mg, 86%)。

δ_H (CDCl₃) 12.17 (1H, br s, NHCO), 10.09 (1H, br s, NH), 7.87 (1H, s, 8-H), 7.42-6.72 (13H, m, DMT), 5.69 (1H, s, 1'-H), 4.59 (1H, s, 2'-H), 4.50 (1H, s, 3'-H), 3.98 (1H, d, J 8.1, 1''-H_a), 3.69-3.39 (9H, m, DMT, 5'-H, 1''-H_b), 2.72 (1H, m, CHCO), 1.17 (6H, d, J 6.8, CH₃CH)。

δ_C (CDCl₃) 179.8 (COCH), 158.8, 144.5, 135.6, 135.5, 130.1, 128.1, 127.7, 126.9, 113.2 (DMT), 155.8, 147.9, 147.5, 137.0, 120.8 (グアニン), 87.6, 86.4, 86.1 (C-1', C-4', DMT), 79.7 (C-3'), 72.6, 71.4 (C-2', C-5'), 59.8 (C-1''), 55.2 (DMT), 36.1 (COCH), 19.1, 18.8 (CH₃CH).

FAB-MS m/z 668 [M+H]⁺。

実施例55
(1R,3R,4R,7S)-7-(2-シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノキシ)-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-3-(2-N-イソプロピオニルグアニン-9-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン(53)。

化合物52 (670 mg, 1.0 mmol) を室温でN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.38 cm³, 4 mmol)を含む無水ジクロロメタン(5 cm³)に溶解した。2-シアノエチルN,N-ジイソプロピルホスホラミドクロリダイト(0.36 cm³, 2.0 mmol)を攪拌しながら滴加した。5時間後、メタノール(2 cm³)を加え、混合物をジクロロメタンを加えて100 cm³に希釈し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(50 cm³)で洗浄した。有機相を分離し、溶媒を減圧下で蒸発させて除去した。残渣を0.5%のピリジン(v/v)を含むジクロロメタン/石油エーテルの最小容量(1:1, v/v)に溶解し、同一の溶媒混合物で平衡させたシリカゲルを充填したカラムに付した。カラムをジクロロメタン/石油/ピリジン(75:25:0.5, v/v/v, 250 cm³)で洗浄し、生成物を0.5%のピリジン(v/v)を含むジクロロメタン(0-1%, v/v) 中のメタノール勾配を使用して溶出した。主生成物を含む画分を蒸発させ、トルエンと共に蒸発させた。残渣を無水ジクロロメタン(5 cm³)に溶解し、石油エーテル(100 cm³)から析出し、濾過および乾燥後、白色固形物として化合物53を得た(558 mg, 64%)。

δ_P (CDCl₃) 148.17, 146.07. FAB-MS m/z 868 [M+1]⁺。

実施例56
1-(2-O-アセチル-4-C-アセトキシメチル-3,5-ジ-O-ベンジル-β-D-リボフラノシル)-4-N-ベンゾイルシトシン(54)。
アノマー混合物33 (4.0 g, 8.22 mmol)と4-N-ベンゾイルシトシン(2.79 g, 13.0 mmol)の攪拌溶液にN,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド(8.16 cm³, 33.0
mmol)を加えた。反応混合物を室温で1時間攪拌し、0℃に冷却した。トリメチルシリルトリフレート (3.0 cm³, 16.2 mmol)を滴加し、混合物を60℃で2時間攪拌した。炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 20 cm³)およびブライン(2 x 20 cm³)を連続的に加え、分離した有機相を乾燥した (Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン/メタノール(99:1, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物として化合物54を得た(3.9 g, 74%)。

δ_H (CDCl₃), 8.28 (1H, d, J 7.5, 6-H), 7.94-7.90 (2H, m, Bz), 7.65-7.25 (13H, m, Bn, Bz), 7.16 (1H, d, J 7.1, 5-H), 6.22 (1H, d, J 2.8, 1'-H), 5.51 (1H, dd, J 2.8, 5.8, 2'-H), 4.62 (1H, d, J 11.6, Bn), 4.51 (1H, d, J
12.3, 1''-H_a), 4.49-4.34 (4H, m, 3'-H, Bn), 4.21 (1H, d, J 12.3, 1''-H_b), 3.85 (1H, d, J 10.3, 5'-H_a), 3.47 (1H, d, J 10.3, 5'-H_b), 2.13 (3H, s, COCH₃), 2.06 (3H, s, COCH₃).

δ_C (CDCl₃) 170.52, 169.61 (C=O), 166.83, 162.27 (C-4, C=O), 154.26 (C-2), 145.26 (C-6), 137.25, 136.93, 133.18, 129.0, 128.75, 128.51, 128,45, 128.18, 128.10, 127.89, 127.71 (Bn, Bz), 96.58 (C-5), 89.42, 86.52 (C-1', C-4'), 76.21, 75.10, 74.17, 73.70, 69.70, 63.97 (C-2', C-3', Bn, C-5',
C-1''), 20.82 (COCH₃)。

FAB-MS m/z 664 [M+Na]⁺, 642 [M+H]⁺.
実測値: C, 65.0; H, 5.7, N, 6.5; C₃₅H₃₅N₃O₉の理論値C, 65.5; H, 5.5; N, 6.5%.

実施例57
1-(3,5-ジ-O-ベンジル-4-C-ヒドロキシメチル-β-D-リボフラノシル)-4-N-ベンゾイルシトシン(55)。
メタノール(20 cm³)中のヌクレオシド54(3.4 g, 5.3 mmol)の攪拌溶液にナトリウムメトキシド(0.663 g, 11.66 mmol)を加えた。反応混合物を室温で10分間攪拌し、次いで20%水性塩酸で中和した。溶媒を部分的に蒸発させ、残渣をジクロロメタン(3 x 50 cm³)で抽出した。合わせた有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 20 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン/メタノール(98.5:1.5, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物として化合物55を得た(1.6 g, 54%)。

δ_H (CDCl₃) 9.95 (1H, br s, NH), 8.33 (1H, d, J 7.4, 6-H), 7.98 (2H, m, Bz), 7.60-7.12 (14H, m, Bn, Bz, 5-H), 6.17 (1H, d, J 1.6, 1'-H), 4.78 (1H, d, J 11.8, Bn), 4.48-4.27 (5H, m, Bn, 2'-H, 3'-H), 3.85 (1H, d, J 11.8, 5'-H_a), 3.66-3.61 (2H, m, 5'-H_b, 1''-H_a), 3.47 (1H, d, J 10.4, 1''-H_b)。

δ_C (CDCl₃) 167.5, 162.31 (C-4, C=O), 155.36 (C-2), 145.34 (C-6), 137.49, 137.08, 133.09, 133.01, 128.94, 128.67, 128.48, 128.30, 128.01, 127.90, 127.80 (Bn, Bz), 96.53 (C-5), 93.97, 89.35 (C-1', C-4'), 76.06, 75.28,
73.70, 72.76, 70.26, 62.44 (C-2', C-3', Bn, C-5', C-1'').

FAB-MS m/z 558 [M+H]⁺。

実施例58
中間生成物56。
無水テトラヒドロフラン(60 cm3)中のヌクレオシド55溶液(2.2 g, 3.94 mmol)を-20℃で攪拌し、鉱油中の60%水素化ナトリウム懸濁液(w/w, 0.252 g, 6.30 mmol)を45分で7回に分けて加えた。溶液を-20℃で15分間攪拌し、次いで塩化p-トルエンスルホニル(0.901 g, 4.73 mmol)を少量ずつ加えた。溶液を-20℃で4時間攪拌した。さらに水素化ナトリウム(0.252 g, 6.30 mmol)および塩化p-トルエンスルホニル(0.751 g, 3.93 mmol)を加えた。反応混合物を48時間-20℃に維持した。反応を氷冷水 (50 cm³)を加えて失活させ、ジクロロメタン(3x 60 cm³)で抽出した。合わせた有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 20 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をジクロロメタン/メタノール(99:1, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、中間生成物56 (1.80 g)を得た。

実施例59
(1S,3R,4R,7S)-7-ベンジルオキシ-1-ベンジルオキシメチル-3-(4-N-ベンゾイルシトシン-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン(57)。
中間生成物56 (1.80 g) を無水DMF (30.0 cm³)に溶解し、鉱油中の60%水素化ナトリウム懸濁液(w/w, 0.16 g, 3.9 mmol)を0℃で30分間で5回に分けて加えた。反応混合物を室温で36時間攪拌した。反応を氷冷水 (70 cm³)を加えて失活させ、得られた混合物をジクロロメタン (3 x 50 cm³)で抽出した。合わせた有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 30 cm³)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残査をジクロロメタン/メタノール(99.5:0.5, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物として化合物57を得た(1.08 g, 79%)。

δ_H (CDCl₃) 8.95 (1H, br s, NH), 8.20 (1H, d, J 7.5, 6-H), 7.95-7.92 (2H, m, Bz), 7.66-7.22 (14H, m, Bn, Bz, 5-H), 5.78 (1H, s, 1'-H), 4.70-4.65
(3H, m, 2'-H, Bn), 4.60 (1H, d, J 11.6, Bn), 4.47 (1H, d, J 11.6, Bn), 4.05-3.78 (5H, m, 3'-H, 5'-H_a, 1''-H_a, 5'-H_b, 1''-H_b)。

δ_C (CDCl₃) 167.0, 162.36 (C-4, C=O), 154.5 (C-2), 144.58 (C-6), 137.46,
136.93, 133.35, 132.93, 129.11, 128.67, 128.50, 128.16, 128.11, 127.68,
127.60 (Bn), 96.35 (C-5), 88.38, 87.67 (C-1', C-4'), 76.14, 75.70, 73.79, 72.27, 72.09, 64.34 (Bn, C-5', C-1'', C-2', C-3').

FAB-MS m/z 540 [M+H]⁺。
実測値: C, 68.0; H, 5.5, N, 7.5; C₃₁H₂₉N₃O₆の理論値C, 69.0; H, 5.4; N, 7.8%)。

実施例60
(1S,3R,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-3-(シトシン-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン(57A)。
無水メタノール(22 cm³)中のヌクレオシド57溶液(0.3 g, 0.55 mmol)に1,4-シクロヘキサジエン(5.0 cm³)および炭素上の10%パラジウム(0.314 g)を加えた。混合物を還流させながら18時間攪拌した。炭素上の10%パラジウム(0.380 g)および1,4-シクロヘキサジエン(5.5 cm³)をさらに加え、混合物を54時間還流させた。反応混合物をシリカゲルパッドで濾過し、次いでメタノール(1500 cm³)で洗浄した。合わせた濾液を減圧下で蒸発させ、残渣をジクロロメタン/メタノール (92.5:7.5, v/v) を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物として化合物57Aを得た(0.051 g, 36%)。

δ_H ((CD₃)₂SO) 7.73 (1H, d, J 7.7, 6-H), 7.12-7.20 (2H, br s, NH2), 5.74
(1H, d, J 7.7, 5-H), 5.61 (1H, br s, 3'-OH), 5.39 (1H, s, 1' -H), 5.12 (1H, m, 5'-OH), 4.08 (1H, s, 2'-H), 3.80 (1H, d, J 7.7, 1''-H_a), 3.81 (1H, s, 3'-H), 3.74 (2H, m, 5'-H_a, 5'-H_b), 3.63 (1H, d, J 7.7, 1''-H_b)。

δ_C ((CD₃)₂SO) 165.66 (C-4), 154.58 (C-2), 139.68 (C-6), 93.19 (C-5), 88.42, 86.73 (C-1', C-4'), 78.87, 70.85, 68.32, 56.04 (C-2', C-1'', C-3', C-5')。

FAB-MS m/z 256 [M+H]⁺。

実施例61
中間生成物57B。
無水ピリジン(2.0 cm³)中に懸濁したヌクレオシド57A(0.030 g, 0.11 mmol)に塩化トリメチルシリル(0.14 cm³, 1.17 mmol)を加え、室温で1時間攪拌した。塩化ベンゾイル(0.07 cm³, 0.58 mmol)を0℃で加え、混合物を室温で2時間攪拌した。 反応混合物を0℃に冷却した後、水(3.0 cm³)を加えた。5分間攪拌した後、アンモニア水溶液(1.5 cm³, 32%, w/w)を加え、室温で30分間攪拌した。混合物を減圧下で蒸発させ、残渣をジクロロメタン/メタノール(97.5:2.5, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物として中間生成物57Bを得た(0.062 g)。

実施例62
(1R,3R,4R,7S)-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-7-ヒドロキシ-3-(4-N-ベンゾイルシトシン-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン(57C)。
無水ピリジン(1.5 cm³)中の中間生成物57B溶液(0.042 g, 0.11 mmol)に4,4'-ジメトキシトリチルクロライド(0.06 g, 0.17 mmol)を加えた。反応混合物を室温で3.5時間攪拌し、0℃に冷却し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(20 cm³)を加えた。ジクロロメタン(3 x 10 cm³)を用いて抽出した。合わせた有機相を乾燥し(Na₂SO₄)、減圧下で蒸発乾固させた。残渣をジクロロメタン/メタノール/ピリジン(98.0:1.5:0.5, v/v/v) を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド57Cを得た(0.031g, 57Aから〜63%)。

δ_H (C₅D₅N) 12.32 (1H, br s, NHCO), 8.75-7.06 (20H, m, DMT, Bz, H-5, H-6), 6.24 (1H, s, 1'-H), 5.11 (1-H, s, 2'-H), 4.90 (1H, s, 3'-H), 4.38 (1H, d, J 7.6, 1''-H_a), 4.10 (1H, d, J 7.6, 1''-H_b), 4.02 (1H, d, J 10.6, 5'-H_a), 3.87 (1H, d, J 10.6, 5'-Hb), 3.77, 3.76 (2 x 3H, 2 x s, 2 x OCH₃)。

δ_C (C₅D₅N) 169.00 (NHCO), 164.24 (C-2), 159.39 (DMT), 150.5, 145.62 (DMT), 144.31, 132.89, 130.82, 130.72, 129.09, 128.89, 128.60, 113.96 (DMT), 96.96, 89.01, 87.18, 79.91, 72.56, 70.25 (C-5, C-1', C-4', C-2', C-1'',C-3'), 59.51 (C-5'), 55.33 (OCH₃).

FAB-MS m/z 662 [M+H]⁺。

実施例63
(1R,3R,4R,7S)-7-(2-シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノキシ)-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-3-(4-N-ベンゾイルシトシン-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン(57D)。
無水ジクロロメタン(1.5 cm³)中のヌクレオシド57C溶液(0.025 g, 0.03 mmol)にN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.03 cm³, 0.17 mmol)を加え、次いで2-シアノエチルN,N-ジイソプロピルホスホラミドクロリダイト(0.02 cm³, 0.09 mmol)を滴加した。室温で5時間攪拌した後、反応混合物を0℃に冷却し、ジクロロメタン/ピリジン(10.0 cm³, 99.5:0.5, v/v)を加え、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 8 cm³)で洗浄した。有機相を分離し、乾燥し(Na₂SO₄)、減圧下で蒸発乾固させた。残渣をジクロロメタン/メタノール/ピリジン(99.0:0.5:0.5, v/v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、薄黄色の油としてアミダイト57Dを得た(0.038 g)。

δ_P (CDCl₃) 147.93。

実施例64
9-(2-O-アセチル-4-C-アセチルオキシメチル-3,5-ジ-O-ベンジル-β-D-リボフラノシル)-6-N-ベンゾイルアデニン(58)。
無水ジクロロメタン(200 cm³)中のアノマー混合物33(5.0 g, 10.3 mmol)と6-N-ベンゾイルアデニン(3.76 g, 15.7 mmol)の攪拌懸濁液 にN,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド(15.54 cm³, 61.8 mmol)を加えた。反応混合物を還流させながら1時間攪拌し、次いで室温に冷却した。トリメチルシリルトリフレート(7.0 cm³, 38.7 mmol)を滴加し、混合物を20時間還流させた。 反応混合物を室温に冷却し、混合物の容量を減圧下で1/4に減らした。ジクロロメタン(250 cm³)を加え、溶液を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 50 cm³)および水(50 cm³)で洗浄した。有機相を乾燥し(Na₂SO₄)、減圧下で蒸発させた。残渣をジクロロメタン/メタノール(99.5:0.5, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド58を得た(3.65 g, 52%)。

δ_H (CDCl₃) 9.25 (1H, br s, NH), 8.71 (1H, s, 8-H), 8.24 (1H, s, 2-H), 8.0 (2H, d, J 7.5, Bz), 7.60-7.23 (13H, m, Bn, Bz), 6.35 (1H, d, J 4.6, 1'-H), 5.99 (1H, dd, J 4.9, 5.3, 2'-H), 4.78 (1H, d, J 5.6, 3'-H), 4.64-4.42 (5H, m, Bn, 1''-H_a), 4.25 (1H, d, J 12.1, 1''-H_b), 3.72 (1H, d, J 10.1, 5'-H_a), 3.56 (1H, d, J 10.1, 5'-H_b), 2.07 (3H, s, COCH₃), 2.02 (3H, s, COCH₃)。

δ_C (CDCl₃) 170.42, 169.72 (COCH₃), 164.60 (NHCO), 152.51 (C-6), 151.45 (C-2), 149.46 (C-4), 141.88 (C-8), 137.04, 137.00, 133.50, 132.60, 128.86, 128.66, 128.53, 128.41, 128.38, 128.18, 128.06, 127.91, 127.88, 127.79, 127.63, 123.26 (Bz, Bn, C-5), 86.38 (C-1'), 86.25 (C-4'), 77.74, 74.74, 74.44, 73.48 (C-2', C-3', 2 x Bn), 70.11 (C-1''), 63.42 (C-5'), 20.70, 20.54 (COCH₃)。

FAB-MS m/z 666 [M+H]⁺。

実施例65
9-(3,5-ジ-O-ベンジル-4-C-ヒドロキシメチル-β-D-リボフラノシル)-6-N-ベンゾイルアデニン(59)。
メタノール(50 cm³)中のヌクレオシド58 (4.18 g, 6.28 mmol)の攪拌溶液にナトリウムメトキシド(0.75 g, 13.8 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を2時間攪拌し、氷を加えた。混合物を20%HCl水溶液で中和した。ジクロロメタン(3 x 75 cm³)で抽出し、有機相を分離し、乾燥し(Na₂SO₄)、減圧下で蒸発させた。残渣をジクロロメタン/メタノール(98.5:1.5, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物として化合物59を得た(2.68 g, 73%)。

δ_H (CDCl₃) 9.42 (1H, br s, NH), 8.58 (1H, s, H-8), 8.16 (1H, s, 2-H), 7.96 (2H, d, J 7.2, Bz), 7.52-7.08 (13H, m, Bn, Bz), 6.18 (1H, d, J 2.5, 1'-H), 4.85-4.38 (4H, m, Bn, 2'-H, 3'-H), 4.33 (2H, s, Bn) 3.90 (1H, d, J 11.9, 1''-H_a), 3.71 (1H, d, J 11.8, 1''-H_b), 3.50-3.39 (2H, m, 5-H)。

δ_C (CDCl₃) 164.98 (NHCO), 152.19 (C-6), 151.00 (C-2), 149.34 (C-4), 142.28 (C-8), 137.32, 137.25, 133.46, 132.70, 128.69, 128.49, 128.40, 128.11, 128.03, 127.94, 127.83, 127.62, (Bz, Bn), 122.92 (C-5), 90.94, 88.75 (C-1', C-4'), 77.65, 74.08, 73.44, 73.20, 71.12, 62.39 (C-1'', C-5', C-2', C-3', 2 x Bn).

FAB-MS m/z 582 [M+H]⁺。
実測値: C, 65.6; H, 5.5; N, 11.7; C₃₂H₃₁N₅O₆ の理論値 C, 66.1; H, 5.4; N, 12.0%。

実施例66
中間生成物60。
無水テトラヒドロフラン(25 cm³)中のヌクレオシド59(2.43 g, 4.18 mmol)溶液を-20℃で攪拌し、鉱油中60%水素化ナトリウム懸濁液(w/w, 0.28 g, 7.0 mmol)を30分間で4回に分けて加えた。1時間攪拌した後、塩化p-トルエンスルホニル(1.34 g, 7.0 mmol)を少量ずつ加えた。混合物を-10℃で15時間攪拌した。氷冷水(50 cm³)を加え、ジクロロメタン(3 x 50 cm³)で抽出した。合わせた有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(2 x 25 cm³)で洗浄し、乾燥し(Na₂SO₄)、減圧下で蒸発した。残渣をジクロロメタン/メタノール(99:1, v/v) を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、中間生成物60 を得た(1.95 g)。

実施例67
(1S,3R,4R,7S)-7-ベンジルオキシ-1-ベンジルオキシメチル-3-(6-N-ベンゾイルアデニン-9-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン(61)。
中間生成物60 (1.90 g)を無水DMF (20 cm³)に溶解し、鉱油中の60%水素化ナトリウム懸濁液(w/w, 0.16 g, 3.87 mmol)を0℃で少量ずつ加えた。混合物を室温で10時間攪拌し、次いで減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタン(75 cm³)に溶解し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(2 x 25 cm³)で洗浄し、減圧下に蒸発させた。残渣をジクロロメタン/メタノール(99:1, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド61を得た(1.0 g, 〜44%、 59より)。

δ_H (CDCl₃) 8.71 (H, s, 8-H), 8.23 (1H, s, 2-H), 8.02 (2H, m, J 7.0, Bz), 7.99-7.19 (13H, m, Bn, Bz), 6.08 (1H, s, 1'-H), 4.78 (1H, s, 2'-H), 4.61-4.50 (4H, m, 2 x Bn), 4.24 (1H, s, 3'-H), 4.12 (1H, d, J 7.8, 1''-H_a), 4.00 (1H, d, J 7.9, 1''-H_b), 3.85-3.78 (2H, m, 5'-H_a, 5'-H_b)。

δ_C (CDCl₃) 164.61 (NHCO), 152.32 (C-6), 150.61 (C-2), 149.35 (C-4), 140.67 (C-8), 137.24, 136.76, 133.33, 132.66, 128.68, 128.39, 128.29, 127.94, 127.77, 127.51 (Bn, Bz), 123.43 (C-5), 87.14, 86.52 (C-1', C-4'), 77.21, 76.77, 73.56, 72.57, 72.27, 64.65 (C-2', C-3', C-1'', 2 x Bn, C-5').

FAB-MS m/z 564 [M+H]⁺。
実測値: C, 66.2; H, 5.5; N, 11.4; C₃₂H₂₉N₅O₅の理論値C, 66.2; H, 5.2; N, 12.4%。

実施例68
(1S,3R,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-3-(アデニン-9-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン(61A)。
無水ジクロロメタン(30 cm³)中のヌクレオシド61(0.80 g, 1.42 mmol)攪拌溶液にBCl₃ (ヘキサン中1 M溶液; 11.36 cm³, 11.36 mmol)を-78℃で30分かけて滴加した。混合物を-78℃で4時間攪拌し、さらにBCl₃ (ヘキサン中1 M溶液, 16.0 cm³, 16.0 mmol)を滴加し、混合物を-78℃で3時間攪拌した。 次いで反応混合物の温度をゆっくりと室温まで上昇させ、30分間攪拌した。メタノール(25.0 cm³)を-78℃で加え、混合物を室温で12時間攪拌した。混合物を減圧下で蒸発させ、残渣をジクロロメタン/メタノール(92:8, v/v) を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド61A を得た(0.332 g, 84%)。

δ_H ((CD₃)₂SO) 8.22 (1H, s, 8-H), 8.15 (1H, s, 2-H), 7.33 (2H, s, NH₂), 5.89 (1H, s, 1'-H), 5.83 (1H, d, J 4.2, 3'-OH), 5.14 (1H, t, J 5.9, 5'-OH), 4.14 (1H, s, 2'-H), 4.25 (1H, d, J 4.2, 3'-H), 3.92 (1H, d, J 7.8, 1''-Ha), 3.81-3.41 (3H, m, 5'-H_a, 5'-H_b, 1''-H_b)。

δ_C ((CD₃)₂SO) 155.90 (C-6), 152.64 (C-2), 148.35 (C-4), 137.72 (C-8), 118.94 (C-5), 88.48, 85.17 (C-1', C-4'), 79.09, 71.34, 69.83, 56.51 (C-2', C-3', C-1'', C-5')。

FAB-MS m/z 280 [M+H]⁺。

実施例69
(1S,3R,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-3-(6-N-ベンゾイルアデニン-9-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン(61B)。
無水ピリジン(1 cm³)中のヌクレオシド61A (0.32 g, 1.15 mmol)の攪拌溶液に塩化トリメチルシリル(0.73 cm³, 5.73 mmol)を加え、混合物を室温で20分間攪拌した。塩化ベンゾイル(0.67 cm³, 5.73 mmol)を0℃で加え、反応混合物を室温で2時間攪拌した。反応混合物を0℃に冷却し、氷冷水(15.0 cm³)を加えた。5分間攪拌した後、32%(w/w)アンモニア水溶液 (1.5 cm³)を加え、混合物を30分間攪拌した。混合物を蒸発乾固させ、残渣を水(25 cm³)に溶解した。減圧下で混合物を蒸発させた後、残渣をジクロロメタン/メタノール(97:3, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド61Bを得た(0.55 g)。

FAB-MS m/z 384 [M+H]⁺。

実施例70
(1R,3R,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-3-(6-N-ベンゾイルアデニン-9-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン(61C)。
無水ピリジン(20 cm³)中の化合物61B (0.50 g)の攪拌溶液に4,4'-ジメトキシトリチルクロライド (0.71 g, 2.09 mmol)および4-N,N-ジメチルアミノピリジン(DMAP)(0.1 g)を加えた。室温で2時間、50℃で1時間攪拌した後、反応混合物を0℃に冷却し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(100 cm³)を加えた。ジクロロメタン(3 x 50 cm³)で抽出した後、合わせた有機相を乾燥し(Na₂SO₄)、減圧下で蒸発させた。残渣をジクロロメタン/メタノール/ピリジン(98.0:1.5:0.5)で溶出させてシリカゲルクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド61Cを得た(0.36 g, 61Aから、〜50%)。

δ_H (C₅D₅N) 12.52 (NHCO), 9.10 (2H, d, J 7.7, Bz), 8.88 (1H, s, 8-H), 8.50-7.11 (17H, m, DMT, Bz, 2-H), 6.65 (1H, s, H-1'), 5.25 (2H, s, H-2', H-3'), 4.71 (1H, d, J 7.8, 1''-H_a), 4.56 (1H, d, J 7.8, 1''-H_b), 4.20 (1H, d, J 10.8, 5'-H_a), 4.07 (1H, d, J 10.8, 5'-H_b), 3.82, 3.81 (2 x 3H, 2 x s, 2 x OCH₃)。

δ_C (C₅D₅N) 167.56 (NHCO), 159.24 (C-6), 152.50, 152.08, 151.81, 145.84,
141.45, 136.52, 136.28, 132.55, 130.76, 130.70, 129.32, 128.85, 128.76,
128.46, 127.38, 126.33 (DMT, Bz, C-2, C-4, C-8), 113.84 (C-5), 88.64, 87.20, 86.85, 80.52, 73.13, 72.16, 60.86 (C-1', C-4', DMT, C-2', C-3', C-1'', C-5'), 55.24 (OCH₃)。

FAB-MS m/z 686 [M+H]⁺。
実測値: C, 68.3; H, 5.0; N, 9.7; C₃₉H₃₅N₅O₇ の理論値 C, 68.3; H, 5.1; N,
10.2%)。

実施例71
(1R,3R,4R,7S)-7-(2-シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノキシ)-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-3-(6-N-ベンゾイルアデニン-9-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン(61D)。
無水ジクロロメタン(1.5 cm³)中の化合物61C (190 mg, 0.277 mmol)溶液にN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.16 cm³, 0.94 mmol)および2-シアノエチルN,N-ジイソプロピルホスホラミドクロリダイト(0.1 cm³, 0.42 mmol)を0℃で加えた。混合物を室温に温め、5時間攪拌した。溶液をジクロロメタン(50 cm³)で希釈し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(2 x 30 cm³)で洗浄し、減圧下で蒸発させた。生成物をシリカゲルHPLC (PrepPak カートリッジ, 25 x 100 mm, Prep Nova-Pak(商標) HR シリカでパックされている、6μm 60A; 溶液A中の溶液B勾配 (25分で0%〜15%、さらに25分で15%〜100%, 溶液A: 石油/ジクロロメタン/ピリジン, 60/39.6/0.4, v/v/v, 溶液B: 酢酸エチル)で分離した。2つの主生成物を含む画分(維持時間 30-40分)を結合し、減圧下で濃縮し、無水トルエン(2 x 40 cm³)と共に蒸発させ、真空中で一晩乾燥した。残渣を無水ジクロロメタン(4 cm³)に溶解し、この溶液を激しく攪拌しながら無水石油エーテル(80 cm³)に加えることにより析出した。析出物を濾過によって回収し、石油エーテル(2 x 20 cm³)で洗浄し、減圧下で乾燥し、白色固形物として化合物61Dを得た(178 mg, 73。

δ_P (CD₃CN) 148.42, 147.93。

実施例72
1-(2,3-O-イソプロピリデン-4-C-(4-トルエンスルホニルオキシメチル)-β-D-リボフラノシル)ウリジン(62)。
無水ピリジン(28 cm³)中の1-(2,3-O-イソプロピリデン-4'-C-ヒドロキシメチル-β-D-リボフラノシル)ウリジン(2.0 g, 6.4 mmol) (R. Youssefyeh, D. Tegg, J. P. H. Verheyden, G. H. Jones および J. G. Moffat, Tetrahedron Lett., 1977, 5, 435; G. H. Jones, M. Taniguchi, D. Tegg および J. G. Moffat, J.
Org. Chem., 1979, 44, 1309)の攪拌溶液に無水ピリジン(10 cm³)に溶解した塩化p-トルエンスルホニル(1.46 g, 7.3 mmol)を-30℃で加えた。30分後、反応混合物を室温に到達させ、室温で12時間攪拌した。反応をメタノール(4 cm³)で失活させ、シリカゲル(2g)を加え、溶媒を減圧下で除去した。残渣をジクロロメタン(v/v)中の0-3%メタノール勾配を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、薄赤色の固形物としてヌクレオシド62を得た(1.8 g, 60%)。

δ_H (CDCl₃) 9.80 (1H, br s, NH), 7.80 (2H, d, J 8.3, Ts), 7.46 (1H, d, J
8.1, 6-H), 7.35 (2H, d, J 8.01, Ts), 5.72 (1H, d, J 8.0, 5-H), 5.54 (1H, d, J 3.5, 1'-H), 5.08 (1H, dd, J 3.5, 6.4, 2'-H), 4.94 (1H, d, J 6.4, 3'-H), 4.18 (2H, s, 1''-H), 3.82-3.70 (2H, m, 5'-H), 2.45 (3H, s, Ts), 1.46, 1.29 (6 H, s, CH₃)。

δ_C (CDCl₃) 163.6 (C-4), 150.4 (C-2), 145.2 (C-6), 142.9, 132.5, 129.9, 128.0 (Ts), 114.7 (OCO), 102.6 (C-5), 94.9, 87.6, 83.9, 81.5 (C-4', C-1', C-3', C-2'), 68.7, 63.5 (C-1'', C-5'), 26.4, 24.7 (CH₃), 21.7 (Ts)。

FAB-MS m/z 469 [M+H]⁺。

実施例73
1-(4-C-(p-トルエンスルホニルオキシメチル-β-D-リボフラノシル)ウリジン(63)。
ヌクレオシド62 (1.33 g, 2.83 mmol)を80%酢酸(25 cm³)に溶解し、80℃で3時間攪拌し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をエタノール(10 cm³)と共に蒸発させ、ジクロロメタン(v/v)中0-2%メタノール勾配を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド63を得た(391
mg, 33%)。

δ_H (CD₃OD) 7.81 (1H, d, J 8.1, 6-H), 7.77 (1H, d, J 8.4, Ts), 7.40 (2H,
d, J 8.6, Ts), 5.74 (1H, d, J 6.6, 1'-H), 5.69 (1H, d, J 8.1, 5-H), 4.17-4.33 (2H, m, 2'-H, 3'-H), 3.67-3.62 (2H, m, 1''-H), 3.26-3.20 (2H, m, 5'-H), 2.43 (3H, s, Ts)。

δ_C (CD₃OD) 166.0 (C-4), 153.0 (C-2), 146.5 (C-6), 142.5, 130.9, 129,15 (Ts), 103.1 (C-5), 89.0, 87.2 (C-1', C-4'), 75.1, 72.7, 71.3, 63.8 (C-1'', C-3', C-2', C-5'), 21.6 (Ts)。

実施例74
(1S,3R,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-3-(ウラシル-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン(44)。
無水DMF(2 cm³)中のヌクレオシド63 (64 mg, 0.14 mmol)の攪拌溶液に無水DMF(2 cm³)中の水素化ナトリウム(8.4 mg, 21 mmol, 鉱油中の60%懸濁液、w/w)を0℃でゆっくりと加えた。反応混合物を120℃で6時間熱した。反応を水(2 cm³)で失活させた後、溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン(v/v)中の5-7%メタノール勾配を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、白色固形物として化合物44を得た(9 mg, 29%)。NMRデータは化合物44について報告されたものと一致した。

実施例75
(1S,3R,4R,7S)-7-アセトキシ-1-アセトキシメチル-3-(チミン-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1] ヘプタン(64)。
無水ピリジン(2.5 cm³)中のヌクレオシド37 (209.8 mg, 0.78 mmol)の攪拌溶液に無水酢酸(0.3 cm³, 3.23 mmol)および触媒量のDMAP (5 mg)を加えた。2時間攪拌した後、エタノール(4 cm³)を加え、混合物を減圧下で蒸発させた。残渣をジクロロメタンに再び溶解し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(7 cm³)で洗浄した。有機相を乾燥し(Na₂SO₄)、減圧下で蒸発させた。残渣をジクロロメタン/メタノール(97:3, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、白色固形物として64を得た(249 mg, 90%)。

δ_C (CDCl₃) 169.59, 163.20, 149.50, 133.55, 110.64, 87.05, 85.38, 77.84,
71.70, 71.02, 58.60, 20.62, 20.53, 12.78.
FAB-MS m/z 355 [M+H]⁺。

実施例76
(1S,3R,4R,7S)-1-ヒドロキシメチル-3-(5-メチル-4-N-ベンゾイルシトシン-1-イル)-7-ヒドロキシ-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン(65)。
無水アセトニトリル(3 cm³)中のヌクレオシド64 (232.7 mg, 0.66 mmol)の溶液に無水アセトニトリル(5 cm³)中の1,2,4-トリアゾール(420 mg, 6.1 mmol)およびPOCl₃ (0.12 cm³, 1.3 mmol)の溶液を加えた。反応混合物を0℃に冷却し、無水トリエチルアミン(0.83 cm³)を加え、混合物を室温で90分間維持した。トリエチルアミン(0.54 cm³)および水(0.14 cm³)を加え、反応混合物を10分間攪拌し、減圧下で蒸発させた。残渣をEtOAcに溶解し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(2 × 9 cm³)および水(9 cm³)で洗浄した。水相をジクロロメタン(3 x 20 cm3)で抽出し、合わせた有機相を減圧下で蒸発させ、残渣をジオキサン(4 cm³)に再び溶解し、32% アンモニア水 (0.7 cm3)を加えた。3時間攪拌した後、反応混合物を減圧下で蒸発させ、無水ピリジンと共に蒸発させた。残渣を無水ピリジン(3.6
cm³)に溶解し、塩化ベンゾイル(0.42 cm³, 3.6 mmol)を加えた。2時間攪拌した後、反応を水(1 cm³)で失活させ、反応混合物を減圧下で蒸発させた。次いで残渣をEtOAcに再び溶解し、水(3 × 7 cm³)で洗浄した。有機相を減圧下で蒸発乾固させ、残渣をピリジン/メタノール/水(13:6:1, v/v/v, 14 cm³)に0℃で溶解し、ピリジン/メタノール/水(13:6:1, v/v/v, 7 cm³)中のNaOHの2M溶液を加えた。20分間攪拌した後、反応混合物をジオキサン中のHClの2M溶液で中和し、 反応混合物を減圧下で蒸発させた。残渣をジクロロメタン/メタノール(95:5, v/v) を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、黄色の発泡体としてヌクレオシド65を得た(94.6 mg, 38%)。

δ_H (CD₃OD) 8.21 (1H, br, s), 8.02 (1H, m), 7.84-7.9 (1H, m), 7.41-7.58 (4H, m), 5.61 (1H, s), 4.36 (1H, s), 4.10 (1H, s), 3.98 (1H, d, J 8.0), 3.94 (2H, s), 3.78 (1H, d, J 7.9), 2.11 (3H, d, J 1.0)。 δ_C (CD₃OD, 選択されたシグナル) 133.66, 132.90, 130.63, 129.50, 129.28, 128.65, 90.71,
88.86, 80.57, 72.47, 70.22, 57.53, 14.01.
FAB-MS m/z 374 [M+H]⁺。

実施例77
(1R,3R,4R,7S)-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-3-(5-メチル-4-N-ベンゾイルシトシン-1-イル)-7-O-(2-シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノキシ)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1] ヘプタン(66)。
無水ピリジン(1.5 cm³)中のヌクレオシド65 (82 mg, 0.22 mmol)の攪拌溶液に4,4'-ジメトキシトリチルクロライド(80 mg, 0.24 mmol)を加え、室温で12時間攪拌した。4,4'-ジメトキシトリチルクロライド(80 mg, 0.24 mmol) をさらに加え、攪拌をさらに12時間継続した。メタノール(0.5 cm³)を加え、反応混合物を減圧下で蒸発させた。残渣をジクロロメタン/メタノール/ピリジン(98.5:1.0:0.5,
v/v/v)を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィに付した。得られた中間生成物(FAB-MS m/z 676) (50.2 mg)を無水アセトニトリルと共に蒸発させ、無水ジクロロメタン (0.62 cm³)に溶解した。N,N-ジイソプロピルエチルアミンを加え(0.1 cm³)、次いで2-シアノエチルN,N-ジイソプロピルホスホラミドクロリダイト(0.3 cm³, 0.11 mmol)を加えた。室温で3時間攪拌した後、水(1 cm³)を加え、得られた混合物を酢酸エチル(10 cm³)で希釈し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3
× 6 cm³) およびブライン(3 × 6 cm³)で洗浄した。有機相を乾燥し(Na₂SO₄)、減圧下で蒸発させた。残渣をシリカゲルカラムHPLCで精製した。化合物53について記載した析出により、白色固形物として化合物66を得た(29.5 mg, 0.03 mmol, 14%)。

δ_P (CH₃CN) 148.46, 147.49。

実施例78
9-(4-(ヒドロキシメチル)-2,3-O-イソプロピリデン-β-D-リボフラノシル)-6-N-ベンゾイルアデニン(67)。
塩化オキサリル(0.93 mL, 10.75 mmol)およびジクロロメタン(25 mL)の混合物を-70℃に冷却した。ジメチルスルホキシド(DMSO, 1.7 mL, 22 mmol)を激しく攪拌しながら滴加した。混合物を-70℃で10分間攪拌し、ジメチルスルホキシド/ジクロロメタン(1:9 v/v, 20 mL)中の9-(2,3-O-イソプロピリデン-β-D-リボフラノシル)-6-N-ベンゾイルアデニン (3.4 g, 8.27 mmol)の溶液を5分で加えた。混合物を-60℃で30分間攪拌した。トリエチルアミン(7 mL, 50,3 mmol)を加え、混合物を室温まで温めた。溶液をジクロロメタン(50 mL)で希釈し、水(3 x 100 mL)で洗浄した。水の画分を100 mLのジクロロメタンでさらに洗浄した。有機相を濃縮して油状の塊とし、ジオキサン(50 mL)と共に蒸発させ、30 mLのジオキサンに再び溶解した。37%ホルムアルデヒド水溶液(2.95 mL, 33.4 mmol)およびNaOHの2M水溶液(8.26 mL)を加えた。混合物を室温で10分間攪拌し、0℃に冷却した。水素化ホウ素ナトリウム(640 mg, 16.9 mmol)を加え、反応混合物を15分間で室温まで温めた。反応を酢酸(5 mL)を加えることによって失活させ、この混合物にジクロロメタンと炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(それぞれ100 mL)を加えた。有機相を水(100 mL)で洗浄し、真空中で濃縮し、生成物をジクロロメタン(v/v)中の2 - 3.2 %メタノールを溶出液としてカラム(2.5 x 25 cm)シリカゲルクロマトグラフィで分離した。白色固形物として1.85 g (50.7 %)の化合物67を得た。

δ_H (CDCl₃) 8.72 (1H, s), 8.14 (1H, s), 8.03-8.00 (2H, m), 7.60-7.57 (1H, m), 7.56-7.46 (2H, m), 6.00 (1H, d, J4.9), 5.35 (1H, dd, J'5.8, J''5.0), 5.13 (1H, d, J5.8), 3.87-3.78 (4H, m), 1.65 (3H, s), 1.38 (3H, s)。δ_C (CDCl₃) 164.8, 152.2, 150.4, 150.2, 142.6, 133.3, 132.9, 128.8, 128.0,
124.1, 114.7, 93.3, 90.2, 83.8, 82.5, 65.3, 62.9, 27.3, 25.1.

FAB-MS: m/z 442 [M+H]⁺, 464 [M+Na]⁺。

67の別の合成方法。
無水ピリジン(250 mL)中の2',3'-O-イソプロピリデンアデノシン(15 g)の溶液に塩化トリメチルシリル(15.5 mL)を加えた。反応混合物を室温で20分間攪拌し、0℃に冷却した。塩化ベンゾイル(17 mL)を滴加し、混合物を2〜3時間室温に維持した。水(50 mL)および25 %水酸化アンモニウム水溶液(100 mL)を加え、3時間攪拌した。次いで混合物を減圧下で濃縮し、トルエン(2 x 200 mL)とジクロロメタン(DCM)と共に蒸発させ、飽和炭酸水素ナトリウムを加えた。有機相を蒸発乾固させ、黄色の固形物を得た。エタノールから再結晶することにより、白色固形物の中間物質として12.5 g (約80 %)を得た。乾燥DCM (120 mL)中の塩化オキサリル(4.68 mL) を-70℃に冷却した。DMSO (8.5 mL) を激しく攪拌しながら加えた。その後(10分)、10% DMSO/DCM (100 mL)中の合成は上記に記載した中間生成物(17 g)の溶液を滴加した(20分)。30分で温度を-50℃に上げ、次いで反応をトリエチルアミン(35 mL)で失活させた。この混合物にDCM (200 ml)を加え、水(3 x 200 mL)で洗浄した。中間生成物を真空中で濃縮し、ジオキサンと共に蒸発させ、ジオキサン(120 mL)に再び溶解した。ホルムアルデヒド(37 %)および水酸化ナトリウムの2 M水溶液(40 mL)を加え、反応混合物を1時間攪拌した。混合物を酢酸(6 mL) およびDCM(400 ml)で中和し、飽和炭酸水素ナトリウム(400 mL)を加えた。有機相を濃縮した。生成物67をカラムクロマトグラフィ(シリカゲル, 1.5
- 5.0 % メタノール/ DCM)で精製した。8.5 g (46 %)の67を得た。データはこの実施例の最初に記載した。

実施例79
9-(2,3-O-イソプロピリデン-4-(p-トルエンスルホニルオキシメチル)-β-D-リボフラノシル)-6-N-ベンゾイルアデニン(68)および9-(4-ヒドロキシメチル-2,3-O-イソプロピリデン-5-O-(p-トルエンスルホニル)-β-D-リボフラノシル)-6-N-ベンゾイルアデニン。
化合物67 (1.95 g, 4.42 mmol)と塩化p-トルエンスルホニル(1.26 g, 6.63 mmol)の混合物を10 mLの無水ピリジンに0℃で溶解した。反応混合物を4時間攪拌し、次いでジクロロメタン(100 mL)で希釈し、水(2x100 mL)で洗浄し、減圧下で濃縮した。その混合物のジクロロメタン中のメタノール(1-4%)勾配のシリカゲルカラム(2.5 x 20 cm)クロマトグラフィで精製し、白色固形物として出発材料67 (360 mg, 18.5 %)および２つの構造アイソマー、すなわち68 (極性の低いアイソマー; 971 mg, 36.7 %)と9-(4-ヒドロキシメチル-2,3-O-イソプロピリデン-5-O-(4'-トルエンスルホニル)-β-D-リボフラノシル)-N6-ベンゾイルアデニン(極性の高いアイソマー; 352 mg, 13,1%)を分離した。

68: δ_H (CDCl₃) 8.69 (1H, s), 8.11 (1H, s), 8.00 (2H, m), 7.79 (2H, m), 7.58-7.55 (1H, m), 7.50-7.46 (2H, m), 7.34-7.32 (2H, m), 5.88 (1H, d, J4.9), 5.35 (1H, dd, J'5.8, J''5.0), 5.13 (1H, d, J5.8), 3.87-3.78 (4H, m), 1.65 (3H, s), 1.38 (3H, s)。

δ_C (CDCl₃) 164.7, 152.0, 150.2, 150.1, 144.9, 142.5, 133.2, 132.7, 132.3, 129.6, 128.6, 127.9, 127.8, 123.9, 114.6, 93.1, 87.9, 83.4, 81.6, 68.3, 64.4, 27.1, 25.0, 21.5。
FAB-MS: m/z 596 [M+H]⁺

実施例80
9-(4-(p-トルエンスルホニルオキシメチル)-β-D-リボフラノシル)-6-N-ベンゾイルアデニン(69)。
10 mLの90 %トリフルオロ酢酸水溶液中の化合物 68 (940mg, 1.58 mmol)の溶液を室温で30分間維持し、真空中で濃縮して油質の塊とした。メタノール(2x20 mL)およびトルエン(20 mL)と共に蒸発させた後、混合物をジクロロメタン中のメタノール勾配(2-5.0%)を溶出液としたシリカカラム(2 x 25 cm)クロマトグラフィで精製し、白色固形物として化合物69を得た(825 mg, 94 %）。

δ_H (メタノール-d₄) 8.67 (1H, s), 8.53 (1H, s), 8.05 (2H, d, J7.7), 7.75
(2H, d, J8.2), 7.63 (1H, m), 7.53 (2H, m), 7.32 (2H, d, J8.0), 5.94 (1H, d, J 7.1), 4.92 (1H, dd, J'7.1, J''5.3), 4.41 (1H, d, J5.1), 4.38 (1H,
d, J10.2), 4.28 (1H, d, J10.2), 3.80 (1H, d, J12.0), 3.68 (1H, d, J12.0), 2.35 (3H, s).

δ_C (メタノール-d₄) 168.2, 152.9, 150.8, 151.2, 146.4, 144.9, 134.7, 134.1, 134.0, 130.8, 129.7, 129.4, 129.1, 125.1, 90.0, 88.4, 75.3, 73.1, 71.1, 64.2, 21.6.
FAB-MS: m/z 556 [M+H]⁺

実施例81
9-(4-(p-トルエンスルホニルオキシメチル)-3,5-O-(テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル)-β-D-リボフラノシル)-6-N-ベンゾイルアデニン(70)。
無水ピリジン(7 mL)中の化合物69 (780 mg, 1.40 mmol)の溶液に1,3-ジクロロ-1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン(500 μL, 1.57 mmol)を0℃で加えた。0℃で2時間攪拌した後、1,3-ジクロロ-1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン(50 μL, 0.16 mmol)をさらに加えた。 反応混合物を室温に温め、ジクロロメタン(100 mL)で希釈し、水(2 x 100 mL)で洗浄した。 有機相を濃縮し、残渣を分取HPLC (PrepPak カートリッジ, Porasil 15-20 μm 125 Å; 溶出液: ジクロロメタン(v/v)中0-3%メタノール、120 分; 流量: 60 ml/分)を用いて精製した。真空中で濃縮し、白色固形物として870 mg (78%)の化合物70を得た。

δ_H (CDCl₃) 8.65 (1H, s), 8.03(2H, m), 8.00 (1H, s), 7.83 (2H, d, J8.4),
7.58 (1H, m), 7.49 (2H, m), 7.34 (2H, d, J8.4), 5.87 (1H, s), 5.70 (1H,
d, J6.2), 4.68 (1H, d, J6.2), 4.59 (1H, d, J10.8), 4.31 (1H, d, J11.0),
3.91 (2H, s), 2.45 (3H, s), 1.03-0.84 (28H, m).

δ_C (CDCl₃) 164.9, 152.2, 150.5, 150.0, 144.7, 142.9, 133.5, 132.9, 132.8, 129.7, 128.8, 128.1, 128.0, 123.6, 90.3, 85.3, 76.0, 75.0, 68.7, 65.2, 21.6, 17.5, 17.4, 17.2, 17.1, 17.0,16.9, 13.1, 13.0, 12.5,12.4.
FAB-MS: m/z 798 [M+H]⁺

実施例82
9-(2-O,4-C-メチレン-3,5-O-(テトライソプロピルジシロキサ-1,3-ジイル)-β-D-リボフラノシル)-6-N-ベンゾイルアデニン(71)。
無水THF (20 mL)中の化合物70 (540 mg, 0.68 mmol)の溶液を0℃に冷却し、水素化ナトリウム(鉱油中の60%懸濁液130 mg、3.25 mmol)を攪拌しながら加えた。反応混合物を30分間攪拌し、次いで750 μLの酢酸を加えて中和した。ジクロロメタン(50 mL)を加え、混合物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(2 x 50 mL)で洗浄し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラム(2.5 x 25 cm)に付し、生成物をジクロロメタン中のメタノール濃度勾配(0.5 to 1.2 %)で溶出し、白色発泡体として化合物71を得た(356 mg, 84 %)。

δ_H (CDCl₃) 8.77 (1H, s), 8.28 (1H, s), 8.03(2H, m), 7.59 (1H, m), 7.50 (2H, m), 6.08 (1H, s), 4.86 (1H, s), 4.56 (1H, s), 4.14 (1H, d, J13.2), 4.06 (1H, d, J7.7), 3.97 (1H, d, J13.2), 3.89 (1H, d, J7.7), 1.12-0.95 (28H, m).

δ_C (CDCl₃) 164.8, 152.6, 150.5, 149.6, 140.7, 133.6, 132.7, 128.7, 127.9, 123.1, 89.4, 86.5, 78.9, 71.7, 71.2, 56.7, 17.3, 17.1, 17.0,16.9, 16.8, 13.3, 13.1, 12.5,12.2.
FAB-MS: m/z 626 [M+H]⁺

実施例83
7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-3-(6-N-ベンゾイルアデニン-9-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1] ヘプタン(61B)。
トリエチルアミン トリス-フッ化水素 (300 μL, 1.84 mmol)を無水THF(7 mL)中の化合物71 (420 mg, 0.067 mmol)の溶液に加えた。反応混合物を室温で1時間維持し、濃縮して油とし、それをジクロロメタン(v/v)中4 - 10%メタノールで溶出しながらシリカゲルカラム(2 x 25 cm)クロマトグラフィで精製した。 白色固形物として232 mg (92 %)の化合物61Bを得た。NMRデータは先の61Bについて報告されたものと同一である。

実施例84
1-(3,5-ジ-O-ベンジル-4-C-(p-トルエンスルホニルオキシメチル)-2-O-p-トルエンスルホニル-β-D-リボフラノシル)チミン(72)。
ジクロロメタン(20 ml)中の1-(3,5-ジ-O-ベンジル-4-C-(ヒドロキシメチル)-β-D-リボフラノシル)チミン35 (1.48 g, 3.16 mmol)、DMAP (1.344 g, 0.011 mol)および塩化p-トルエンスルホニル(1.45 g, 7.6 mmol)の溶液を室温で3時間攪拌した。反応混合物をジクロロメタン(30 ml)で希釈し、 炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 20 ml)および塩化ナトリウム(2 x 25 ml)で洗浄した。有機相を乾燥し(Na₂SO₄)、減圧下で濾過し、蒸発させた。残渣をメタノール:ジクロロメタン(1:99, v/v) を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、白色固形物としてヌクレオシド72を得た (1.95 g, 80%)。

FAB-MS m/e 776.
δ_C (CDCl₃) 162.9, 149.8 (C-2, C-4), 145.8, 145.2 (2 x Ts), 136.9, 136.8
(2 x Bn), 134.3 (C-6), 132.1, 132.0, 130.0, 129.9, 129.0 128.9, 128.4, 128.3, 128.2, 128.0, 127.7 (2 x Ts, 2 x Bn), 111.2 (C-5), 85.3, 84.0 (C-1', C-4'), 78.9, 78.3, 75.2, 74.3, 72.7, 69.1 (C-2', C-3', C-5', C-1'', 2 x Bn), 21.7 (2 x CH₃), 11.9 (CH₃).

C₃₉H₄₀N₂S₂O₁₁についての分析: C, 60.30; H, 5.19; N, 3.61. 実測値: C, 59.95; H, 5.11, N 3.81.

実施例85
1-(2-ベンジルアミノ-2-デオキシ-3,5-ジ-O-ベンジル-2-N,4-C-メチレン-β-D-リボフラノシル)チミン(73)。
ベンジルアミン(10 ml)中の72 (8.6 g, 11.1 mol)の溶液を130℃で36時間攪拌した。反応混合物をメタノール:ジクロロメタン(1:99, v/v) を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィに直接付し、白色固形物としてヌクレオシド73 (1.79 g, 30%)を得た。

FAB-MS m/e 540.
δ_C (CDCl₃) 163.9, 149.8 (C-2, C-4), 139.2, 137.6, 137.3 (3 x Bn), 135.6
(C-6), 128.5, 128.4, 128.3, 128.2, 128.0, 127.7, 127.0 (3 x Bn), 109.6 (C-5), 88.2, 86.3 (C-1', C-4'), 76.7, 73.8, 72.0, 66.0, 63.8, 57.9, 57.8
(C-2', C-3', C-5', C-1'', 3 x Bn), 12.2 (CH₃).

C₃₂H₃₃N₃O₅ x 0.5 H₂Oについての分析: C, 70.06; H, 6.25; N, 7.66. 実測値: C, 70.00; H, 6.06; N, 7.50.

実施例86
1-(2-アミノ-2-デオキシ-2-N,4-C-メチレン-β-D-リボフラノシル)チミン(74)。
エタノール(150 ml)中のヌクレオシド73 (1.62 g, 0.003 mol)の溶液に炭素上の20%水酸化パラジウム(3 g)およびその懸濁液を水素下で5日間攪拌した。触媒を濾過して除去し（シリカゲル）、メタノール(20 ml)で洗浄した。合わせた濾液を減圧下で濃縮し、白色固形物を得、濾過して取り出し、メタノール:ジクロロメタン(1:4, v/v)で洗浄し、モノベンジル化中間生成物(0.82 g, 76%)を得た。

FAB-MS: m/e 360 (M+H)⁺.
¹³C-NMR (DMSO-d₆, 250 MHz): 163.7, 149.8 (C-2, C-4), 138.2 (Bn), 134.9 (C-6), 128.2, 127.5, 127.4 (Bn), 107.8 (C-5), 87.8, 87.6 (C-1', C-4'), 72.7, 68.9, 65.9, 61.7, 49.4 (C-2', C-3', C-5', C-1'', Bn), 11.9 (CH₃).

C₁₈H₂₁N₃O₅についての分析: C, 60.16; H, 5.89; N, 11.69. 実測値: C, 59.86;
H, 5.61; N, 11.56.

無水メタノール(7 ml)中のこの中間生成物(0.1 g, 0.29 mmol), 蟻酸アンモニウム(0.085g, 1.35 mmol)および炭素上の10%パラジウム(130 mg)の混合物を還流させながら2時間加熱した。触媒を濾過して除去し(シリカゲル)、メタノール(15 ml)で洗浄し、合わせた濾液を減圧下で乾燥するまで濃縮した。残渣をメタノール:ジクロロメタン(1:9, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、白色固形物として表題の化合物74を得た (0.053 g, 71%)。

FAB-MS m/e 270.
δ_H (DMSO-d₆) 11.29 (bs, 1H, NH), 7.73 (d, 1H, J 1.1, 6-H), 5.31 (s, 1H,
1'-H), 5.29 (br s, 1H, 3'-OH), 5.13 (m, 1H, 5'-OH), 3.81 (s, 1H, 3'-H),
3.69 (m, 2H, 5'-H), 3.23 (s, 1H, 2'-H), 2.88 (d, 1H, J 9.8, 1''-H_a), 2.55 (d, 1H, J 9.8, 1''-H_b), 1.77 (d, 3H, J 0.8, CH₃).

δ_C (DMSO-d₆) 164.0, 150.1 (C-2, C-4), 135.6 (C-6), 107.8 (C-5), 89.5, 87.9 (C-1', C-4'), 68.7, 61.9, 57.1, 49.4, (C-2', C-3', C-5', C-1'').

C₁₁H₁₅N₃O₅ x 0.5 H₂Oについての分析: C, 47.48; H, 5.80; N, 15.10. 実測値:
C, 47.54; H, 5.30; N, 14.79.

73から74への転換の別の方法。
メタノール(6 ml)中の73 (0.045 g, 0.0834 mmol)の溶液に炭素上の10%Pd(0.118 g)および、 3時間で3回に分けて、蟻酸アンモニウム(0.145 g, 0.0023 mol)を加えた。懸濁液を4.5時間還流させた。触媒を濾過して除去し(シリカゲル)、メタノール(4 x 3 ml)で洗浄した。合わせた濾液を濃縮し、残渣をメタノール:ジクロロメタン(1:9, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、ヌクレオシド74 (0.015 g, 67%)を得た。スペクトルデータは先の74の実施例について報告されたものと一致した。

実施例87
1-(2-アミノ-2-デオキシ-2-N,4-C-メチレン-2-N-トリフルオロアセチル-β-D-リボフラノシル)チミン(74-COCF₃)。
メタノール(2 mL)中のヌクレオシド74 (0.050 g, 0.186 mmol)懸濁液にDMAP (0.013 mg, 0.106 mmol)およびエチルトリフルオロアセテート(0.029 mL, 0.242 mmol)を加え、混合物を室温で2.5時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をメタノール:ジクロロメタン(2.5:97.5, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、減圧下で溶媒を蒸発させた後、白色固形物として表題のヌクレオシド74-COCF₃ を得た(0.055 g, 81%)。

FAB-MS m/z 366 [M+H]⁺.
¹³C NMR (CD₃OD, 62.9 MHz) δ 166.5, 157.7 (q, ²J_C,F 37.5 Hz, COCF₃), 157.6 (q, ²J_C,F 37.2 Hz, COCF₃), 151.8, 136.8, 136.8, 117.6 (d, ¹J_C,F 287.5
Hz, CF₃), 117.5 (d, ¹J_C,F 286.5 Hz, CF₃), 110.8, 110.8, 90.7, 89.3, 87.7, 87.3, 70.1, 68.6, 66.2, 66.2, 64.5, 57.9, 53.3, 12.7.

C₁₃H₁₄N₃O₆F₃についての分析: C, 42.8; H, 3.9; N, 11.5. 実測値: C, 42.5; H, 4.0; N, 11.2.

実施例88
1-(2-アミノ-2-デオキシ-5-O-4,4'-ジメトキシトリチル-2-N,4-C-メチレン-2-N-トリフルオロアセチル-β-D-リボフラノシル)チミン(74-DMT)。
無水ピリジン(0.6 mL)中のヌクレオシド74-COCF₃ (0.030 g, 0.082 mmol)溶液に無水ピリジン:ジクロロメタン(0.6 mL, 1:1, v/v)に溶解した4,4'-ジメトキシトリチルクロライド(0.054 g, 0.159 mmol)を0℃で滴加し(20分)、混合物を室温で10時間攪拌した。氷と水の混合物を加え(5 mL)、得られた混合物をジクロロメタン(3 x 5 mL)で抽出した。合わせた有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液 (3 x 2 mL)で洗浄し、乾燥し(Na₂SO₄)、濾過した。濾液を減圧下で蒸発乾固させ、残渣をメタノール:ジクロロメタン:ピリジン (1.5:98.0:0.5, v/v/v) を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、減圧下で溶媒を蒸発した後、白色固形物としてヌクレオシド74-DMTを得た(0.051 g, 93%)。

FAB-MS m/z 667 [M]⁺, 668 [M+H]⁺. C₃₄H₃₂N₃O₈F₃ ⁺についてのFAB-HRMS: 667.2142. 実測値: 667.2146.

¹³C NMR (C₅D₅N, 100.6 MHz) δ 165.1, 165.0, 159.5, 159.5, 151.4, 145.7, 136.3, 136.1, 134.8, 134.6, 130.9, 130.9, 130.9, 128.9, 128.9, 128.7, 128.7, 128.4, 127.7, 123.2, 114.1, 114.1, 114.0, 110.4, 89.4, 87.9, 87.5, 87.4, 87.2. 70.8, 69.0, 66.0, 64.4, 60.5, 60.2, 55.5, 53.6, 53.4, 49.9, 13.2, 13.1.

実施例89
1-(2-アミノ-3-O-(2-シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノ-2-デオキシ)-5-O-4,4'-ジメトキシトリチル-2-N,4-C-メチレン-2-N-トリフルオロアセチル-β-D-リボフラノシル)チミン(74A)。
無水ジクロロメタン(2 mL)中のヌクレオシド74-DMT (0.121 g, 0.181 mmol)の溶液にN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.093 mL, 0.54 mmol)および2-シアノエチルN,N-ジイソプロピルホスホラミドクロリダイト(0.057 mL, 0.26 mmol)を0℃で加え、混合物を室温で10時間攪拌した。混合物をジクロロメタン(20 mL)で希釈し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 10 mL)で抽出し、乾燥し(Na₂SO₄)、濾過した。濾液を減圧下で蒸発乾固させ、残渣をメタノール:ジクロロメタン:ピリジン(1.5:98.0:0.5, v/v/v) を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、減圧下で溶媒を蒸発した後、 粗生成物(0.107 g)を得た。残渣を無水ジクロロメタン (1 mL)に溶解し、激しく攪拌しながら石油エーテル(60-80 ℃, 30 mL)に-30℃で滴加し、濾過後、白色固形物としてヌクレオシド74Aを析出した(0.090 g, 57%)。

FAB-MS m/z 868 [M+H]⁺, 890 [M+Na]⁺.
³¹P NMR (CD₃CN, 121.5 MHz) δ 150.4, 150.2, 148.8, 149.1.

実施例90
1-(2-アミノ-2-N,4-C-メチレン-3,5-O-(テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル)-β-D-リボフラノシル)チミン(74B)。
無水ピリジン(3 mL)中のヌクレオシド74 (0.20 g, 0.74 mmol)の溶液に1,3-ジクロロ-1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン (0.305 mL, 0.0011 mol)を-15℃で滴加し(3時間)、混合物を室温で10時間攪拌した。 MeOH (3 mL)を加え、混合物を減圧下で蒸発乾固させた。残渣をメタノール:ジクロロメタン(1:99, v/v)
を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、減圧下で溶媒を蒸発した後、白色固形物としてヌクレオシド74Bを得た (0.370 mg, 97%)。

FAB-MS m/z 512 [M+H]⁺.
¹H NMR ((CD₃)₂SO, 400 MHz) δ 11.37 (bs, 1H), 7.48 (s, 1H), 5.32 (s, 1H), 4.06 (d, 1H, J 13.5 Hz), 4.00 (s, 1H), 3.84 (d, 1H, J 13.5 Hz), 3.41 (s, 1H), 2.92 (d, 1H, J 10.2 Hz), 2.64 (d, 1H, J 10.2 Hz), 1.74 (s, 3H), 1.10-0.92 (m, 28 H).

¹³C NMR ((CD)₃SO₂, 62.9 MHz) δ 163.8, 149.8, 134.1, 107.9, 89.5, 87.9, 70.1, 61.1, 57.9, 49.3, 17.2, 17.2, 17.0, 16.9, 16.8, 16.7, 12.6, 12.2, 11.7.

C₂₃H₄₁N₃O₆Si₂についての分析: C, 54.0; H, 8.1; N, 8.2. 実測値: C, 54.0; H, 8.3; N, 7.8.

実施例91
1-(2-デオキシ-2-メチルアミノ-2-N,4-C-メチレン-3,5-O-(テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル)-β-D-リボフラノシル)チミン(74C)。
無水THF:ジクロロメタン(4:1, v/v)中のヌクレオシド74B (0.33 g, 0.64 mmol)の溶液に1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン(DBU, 0.125 mL, 0.836 mmol)およびヨウ化メチル(0.05 mL, 0.79 mmol)を-10℃で滴加し(30分)、混合物を10℃で48時間攪拌した。反応混合物にDBU (0.05 mL, 0.33 mmol) およびヨウ化メチル(0.020 mL, 0.32 mmol)をさらに滴加し(15分)、 10℃で24時間攪拌した。混合物を減圧下で蒸発乾固させ、残渣をメタノール:ジクロロメタン(1:99, v/v)
を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、減圧下で溶媒を蒸発した後、白色固形物としてヌクレオシド74C を得た(0.25 g, 74%)。

FAB-MS m/z 526 [M+H]⁺.
¹H NMR (CDC_l3, 400 MHz) δ 8.19 (bs, 1H), 7.65 (d, 1H, J 1.3 Hz), 5.59 (s, 1H), 4.11 (s, 1H), 4.05 (d, 1H, J 13.2 Hz), 3.87 (d, 1H, J 13.2 Hz), 3.44 (s, 1H), 2.98 (d, 1H, J 9.5 Hz), 2.71 (d, 1H, J 9.5 Hz), 2.72 (s, 3H), 1.91 (d, 1H, J 1.1 Hz), 1.12-0.96 (m, 28 H).

¹³C NMR (CDCl₃, 62.9 MHz) δ163.7, 149.6, 135.2, 109.7, 90.9, 85.7, 71.4, 67.3, 58.6, 58.2, 41.2, 17.5, 17.4, 17.3, 17.2, 17.1, 16.9, 13.3, 13.1, 13.0, 12.6, 12.1.

C₂₄H₄₄N₃O₆Si₂,0.25H₂Oについての分析: C, 54.4; H, 8.3; N, 7.9. 実測値: C,
54.4; H, 8.1; N, 7.7.

実施例92
1-(2-デオキシ-2-メチルアミノ-2-N,4-C-メチレン-β-D-リボフラノシル)チミン(74D).
THF中のヌクレオシド74C (0.40 g, 0.76 mmol)溶液にTHF中のテトラブチルアンモニウムフルオライド溶液(1.0 M, 2.2 mL, 2.2 mmol)を室温で加え、反応混合物を20分間攪拌し、ピリジン:水:メタノール(6 mL, 3:1:1, v/v/v)を加えた。混合物をピリジン:水:メタノール(6 mL, 3:1:1, v/v/v)に懸濁したDowex 50x200樹脂(2.2 g, H⁺ (ピリジニウム)形態, 100-200 メッシュ)に加え、得られた混合物を20分間攪拌した。濾過した後、残渣をピリジン:水:メタノール(3 x 3 mL, 3:1:1, v/v/v)で洗浄し、合わせた濾液を減圧下で蒸発乾固させ、メタノール(2 x 5
mL)と共に蒸発させた後、油状の残渣を得た。メタノール:ジクロロメタン(1:49, v/v) を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィにより、減圧下で溶媒を除去した後、白色固形物としてヌクレオシド74Dを得た(0.17 g, 79%)。

FAB-MS m/z 284 [M+H]⁺. C¹²H¹⁸N³O⁵⁺についてのFAB-HRMS: 284.12465. 実測値:
284.12402.

¹H NMR ((CD₃)₂SO, 400 MHz) δ 11.3 (bs, 1H, NH), 7.70 (d, 1H, J 1.1 Hz, 6-H), 5.50 (s, 1H, 1'-H), 5.26 (d, 1H, J 4.9 Hz, 3'-OH), 5.12 (t, 1H, J 5.7 Hz, 5'-OH), 3.87 (d, 1H, J 4.8 Hz, 3'-H), 3.67 (d, 2H, J 5.5 Hz, 5'-H), 3.12 (s, 1H, 2'-H), 2.87 (d, 1H, J 9.3 Hz, 5''-H_a), 2.56 (s, 3H, NCH₃), 2.52-2.49 (1H, m, 5''-H_b), 1.77 (s, 3H, CH₃).

¹H NMR (CD₃OD, 400 MHz) δ 7.80 (d, 1H, J 1.3 Hz, 6-H), 5.71 (s, 1H, 1'-H), 4.07 (s, 1H, 3'-H), 3.83 (s, 2H, 5'-H), 3.36 (s, 1H, 2'-H), 3.08 (d,
1H, J 9.9 Hz, 5''-H_a), 2.68 (s, 3H, NCH₃), 2.57 (d, 1H, J 9.9 Hz, 5''-H_b), 1.88 (d, 3H, J 1.1 Hz, CH₃).

¹³C NMR (CD₃OD, 62.9 MHz) δ166.6, 151.9, 137.4, 110.4, 91.3, 85.2, 71.4, 69.1, 59.4, 58.7, 40.2, 12.2.

実施例93
1-(2-デオキシ-5-O-4,4'-ジメトキシトリチル-2-メチルアミノ-2-N,4-C-メチレン-β-D-リボフラノシル)チミン(74E)。
無水ピリジン(1.5 mL)中のヌクレオシド74D (0.135 g, 0.477 mmol)の溶液に無水ピリジン: ジクロロメタン(1.0 mL, 1:1, v/v)中の 4,4'-ジメトキシトリチルクロライド(0.238 g, 0.702 mmol)溶液を0℃で滴加し(20分)、得られた混合物を室温で10時間攪拌した。氷と水の混合物(5 mL)を加え、混合物をジクロロメタン(3 x 10 mL)で抽出した。合わせた有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 5 mL)で洗浄し、乾燥し(Na₂SO₄)、濾過した。濾液を蒸発乾固させ、残渣をメタノール:ジクロロメタン:ピリジン(1:98:1, v/v/v) を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、減圧下で溶媒を除去した後、白色固形物としてヌクレオシド74Eを得た (0.20 g, 72%)。

FAB-MS m/z 586 [M+H]⁺.
¹H NMR (C₅D₅N, 400 MHz) δ13.2 (bs, 1H), 7.98 (d, 1H, J 1.3 Hz), 7.98-7.00 (m, 13H), 6.12 (s, 1H), 4.78 (d, 1H, J 3.7 Hz), 3.88-3.79 (m, 4H), 3.71 (s, 3H), 3.71 (s, 3H), 3.29 (d, 1H, J 9.3 Hz), 2.84 (d, 1H, J 9.3 Hz), 2.81 (s, 3H), 1.85 (d, 3H, J 0.9 Hz).

¹³C NMR (C₅D₅N, 62.9 MHz) δ165.1, 159.2, 151.4, 145.9, 136.5, 136.4, 130.8, 130.7, 128.7, 128.4, 127.4, 113.8, 109.6, 89.8, 86.8, 85.1, 72.0, 68.7, 60.9, 59.4, 55.2, 40.1, 13.1.
C₃₃H₃₅N₃O₇,0.25H₂Oについての分析: C, 67.2; H, 6.1; N, 7.1. 実測値: C, 67.2; H, 6.2; N, 6.9.

実施例94
1-(3-O-(2-シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノ)-5-O-4,4'-ジメトキシトリチル-2-メチルアミノ-2-N,4-C-メチレン-2-デオキシ-β-D-リボフラノシル)チミン(74F)。
無水ジクロロメタン(2 mL)中のヌクレオシド74E (0.130 g, 0.222 mmol) の溶液にN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.088 mL, 0.514 mmol) および 2-シアノエチルN,N-ジイソプロピルホスホラミドクロリダイト(0.065 mL, 0.291 mmol)を0℃で加え、混合物を室温で10時間攪拌した。ジクロロメタン(30 mL)を加え、混合物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 10 mL)で抽出し、乾燥し(Na₂SO₄)、濾過した。濾液を減圧下で蒸発乾固させ、残渣をメタノール:ジクロロメタン:ピリジン(0.5:98.5:1.0, v/v/v) を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、減圧下で溶媒を除去した後、粗生成物を得た(0.120 g)。残渣を無水ジクロロメタン(1 mL)に溶解し、激しく攪拌しながら石油エーテル (60-80℃, 30 mL)に-30℃で滴加し、濾過後、白色固形物としてヌクレオチド74Fを析出した(0.090 g, 52%)。

³¹P NMR (CD₃CN, 121.5 MHz) δ 147.7.

実施例95
1-(3,5-ジ-O-ベンジル-4-C-(p-トルエンスルホニルオキシメチル)-2-O-p-トルエンスルホニル-β-D-リボフラノシル)ウラシル(75)。
ジクロロメタン(50 cm³)中の1-(3,5-ジ-O-ベンジル-4-C-ヒドロキシメチル-β-D-リボフラノシル)ウラシル41 (3.55 g, 7.81 mmol)の攪拌溶液に DMAP (3.82 g)および塩化p-トルエンスルホニル(4.47 g, 23.5 mmol)を室温で加えた。2時間攪拌し、ジクロロメタン(100 cm3)を加えた。反応混合物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(2 x 75 cm3)で洗浄し、乾燥した(Na₂SO₄)。有機相を減圧下で蒸発させ、残渣をジクロロメタン/メタノール(99.5:0.5, v/v) を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド75を得た(4.65g, 78%)。

δ_H (CDCl₃) 8.49 (1H, br s, NH), 7.67 (1H, d, J 8.3, 6-H), 7.51-7.03 (18H, m, Bn, Ts), 6.0 (1H, d, J 7.6, 1'-H), 5.05 (1H, m, 2'-H), 4.91 (2H, m, 5-H, Bn), 4.56 (2H, m, Bn), 4.42 (1H, d, J 10.4, Bn), 4.31 (1H, d, J 4.9, 3'-H), 4.05 (2H, m, 1''-H), 3.75-3.64 (2H, m, 5'-H), 2.41 (3H, s, CH₃), 2.34 (3H, s, CH₃).

δ_C (CDCl₃) 162.2 (C-4), 149.5 (C-2), 146.0, 145.3 (Ts), 139.0 (C-6), 136.7, 131.9, 130.0, 129.9, 128.9, 128.7, 128.5, 128.4, 128.3, 128.2, 128.0, 127.6 (Bn, Ts) 102.7 (C-5), 85.5 (1'-C), 84.4 (4'-C), 79.2, 78.3, 75.1, 74.3, 72.4, 69.1 (Bn, 3'-C, 2'-C, 5'-C, 1''-C ), 21.7, 21.6 (Ts).

FAB-MS m/z 763. 実測値: C, 61.2 ;H, 4.4; N, 3.3; C₃₈H₃₈N₂O₁₁S₂ の理論値C, 59.8; H,5.0; N,3.6.

実施例96
1-(2-デオキシ-3,5-ジ-O-ベンジル-2-S,4-C-メチレン-2-メルカプト-β-D-リボフラノシル)チミン(76)。
DMF (40 cm³)中のヌクレオシド75 (3.70g, 4.86 mmol)の攪拌溶液にチオ酢酸カリウム(0.83 g, 7.28 mmol)を加えた。混合物を攪拌し、110℃で80時間熱した。減圧下で蒸発させた後、 H₂O (100 cm³)を加えた。抽出をジクロロメタン (4 x 50 cm³)で行い、合わせた有機相を乾燥し(Na₂SO₄)、濾過し、減圧下で蒸発させた。残渣をジクロロメタン/メタノール(99.6:0.4, v/v) を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド76
(1.65g, 75%)を得た。

δ_H (CDCl₃) 9.08 (1H, br s, NH), 7.98 (1H, d, J 8.1, 6-H), 7.39-7.20 (10H, m, Bn), 5.85 (1H, s, 1'-H), 5.26 (1H, d, J 8.1, 5-H), 4.61 (1H, d J 11.4, 5'-H), 4.56 (2H, s, Bn), 4.45 (1H, d, J 11.4, Bn), 4.14 (1H, d, J 1.7, 3'-H), 3.82 (2H, m, Bn), 3.72 (1H, d, J 1.9, 2'-H), 3.02 (1H, d, J 9.9, 1''-H_a), 2.78 (1H, d, J 9.9, 1''-H_b).

δ_C (CDCl₃) 163.4 (C-4), 150.0 (C-2), 139.9 (C-6), 137.2, 136.8, 128.6, 128.5, 128.2, 127.9, 127.7 (Bn), 100.8 (C-5), 90.8, 88.8 (C-1', C-4'), 76.5, 73.8, 72.0, 70.0 (2 x Bn, C-3', C-5'), 49.52 (C-2'), 35.63 (C-1'').FAB-MS m/z 453. 実測値: C, 63.4; H, 5.1;N, 5.9; C₂₄H₂₄N₂O₅S の理論値 C, 63.7; H, 5.3; N, 6.1.

実施例97
1-(2-O-p-トルエンスルホニル-4-C-(p-トルエンスルホニルオキシメチル)-β-D-リボフラノシル)ウラシル(76A)。
無水エタノール(2 cm³)中の化合物75 (0.80 g, 1.0 mmol)の溶液に炭素上の20%水酸化パラジウム(0.80 g)を加え、混合物を水素で数回脱ガスし、水素下で48時間攪拌した。 触媒を濾過して除去し、濾液を減圧下で蒸発させた。残渣をジクロロメタン/メタノール(99:1, v/v) を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド76Aを得た (0.30 g, 49%)。

δ_H (CD₃OD) 7.67 (4H, m), 7.45 (1H, d, J 8.2 Hz), 7.34 (4H, m), 5.86 (1H, d, J 8.0 Hz), 5.40 (1H, d, J 8.1 Hz), 4.95 (1H, m), 4.35 (1H, d, J 5.0
Hz), 4.17 (2H, m), 3.61 (2H, s), 2.40 (6H, s).

δ_C (CD₃OD) 165.4, 151.6, 147.5, 146.6, 141.3, 134.0, 133.8, 131.4, 130.9, 129.2, 128.9, 103.7, 88.0, 85.4, 80.7, 72.4, 71.0, 64.3, 21.7, 21.6. FAB-MS m/z 583 [M+H]⁺.

実施例98
1-(3,5-O-(テトライソプロピルジシロキサ-1,3-ジイル)-2-O-p-トルエンスルホニル-4-C-(p-トルエンスルホニルオキシメチル)-β-D-リボフラノシル)ウラシル(76B)。
無水ピリジン(4 cm³)中のヌクレオシド76A (0.27 g, 0.46 mmol)の攪拌溶液に1,3-ジクロロ-1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン(0.22 cm³, 0.70 mmol)を加えた。48時間攪拌した後、混合物を0℃に冷却し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(15 cm³)を加えた。混合物をジクロロメタン (3 x 10 cm³) で抽出し、合わせた有機相を乾燥し(Na₂SO₄)、濾過した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をジクロロメタン/メタノール(99.5:0.5, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド 76Bを得た(0.37 g, 97%)。

δ_H (CDCl₃) 8.70 (1H, br s), 7.80 (4H, m), 7.36 (4H, m), 6.98 (1H, d, J 8.1 Hz), 5.64 (1H, d, J 8.0 Hz), 5.18 (2H, m), 4.98 (1H, d, J 7.0 Hz), 4.39-4.32 (2H, m), 3.92-3.76 (2H, s), 2.45 (6H, s), 1.27-0.66 (28H, m).

δ_C (CDCl₃) 162.9, 149.3, 145.6, 144.8, 143.9, 132.9, 130.1, 129.9, 128.2, 128.1, 102.2, 94.6, 84.7, 80.4, 72.8, 67.8, 64.6, 21.7, 17.3, 17.2, 17.1, 16.9, 16.8, 13.1, 12.8, 12.3.
FAB-MS m/z 825 [M+H]⁺.

実施例99
1-(2-デオキシ-2-メルカプト-2-S,4-C-メチレン-3,5-O-(テトライソプロピルジシロキサ-1,3-ジイル)-β-D-リボフラノシル)ウラシル(76C)。
DMF (5 cm₃)中のヌクレオシド76B (0.26 g, 0.32 mmol)の攪拌溶液に チオ酢酸カリウム(0.054 g, 0.47 mmol)を加えた。反応混合物を110℃で20時間攪拌した。減圧下で混合物を蒸発させた後、H₂O (20 cm³)を加えた。抽出をジクロロメタン (3 x 10 cm³)で行い、合わせた有機相を乾燥し(Na₂SO₄)、濾過し、減圧下で蒸発させた。残渣をジクロロメタン/メタノール(99.25:0.75, v/v) を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド 76C を得た(0.125 g, 77%)。

δ_H (CDCl₃) 8.55 (1H, br s), 8.02 (1H, d, J 8.1 Hz), 5.82 (1H, s, 1'-H),
5.65 (1H, d, J 8.1 Hz), 4.37 (1H, d, J 2.1 Hz), 4.10 (1H, d, J 13.2 Hz), 3.90 (1H, d, J 13.1 Hz), 3.53 (1H, d, J 2.1 Hz), 2.92 (1H, d, J 10.1 Hz), 2.74 (1H, d, J 10.0 Hz), 1.30-0.80 (28H, m).

δ_C (CDCl₃) 163.2, 149.8, 139.6, 100.9, 91.4, 90.7, 71.5, 59.8, 51.5, 34.4, 17.5, 17.3, 17.1, 16.9, 15.5, 13.6, 13.3, 13.1, 12.9, 12.3.
FAB-MS m/z 515 [M+H]⁺.

実施例100
1-(2-デオキシ-2-メルカプト-2-S,4-C-メチレン-β-D-リボフラノシル)ウラシル(76D)。
THF (1.0 cm³)中のヌクレオシド76C (25 mg, 0.049 mmol)の攪拌溶液にフッ化テトラブチルアンモニウム溶液(THF中の1M 溶液0.20 cm³, 0.20 mmol)を0℃で加えた。混合物を0℃で1時間攪拌した後、H₂O (5 cm³)を加え、混合物を蒸発させた。残渣をジクロロメタン/メタノール(97:3, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド 76Dを得た (9.0 mg, 69%)。

δ_H (CD₃OD) 8.19 (1H, d, J 8.1 Hz, 6-H), 5.77 (1H, s, 1'-H), 5.65 (1H, d, J 8.1 Hz, 5-H), 4.31 (1H, d, J 2.1 Hz, 3'-H), 3.86 (2H, s, 5'-H), 3.53
(1H, d, J 2.2 Hz, 2'-H), 2.93 (1H, d, J 10.3 Hz, 1''-H_a), 2.73 (1H, d, J 10.3 Hz, 1''-H_b).

δ_C (CD₃OD) 166.5, 152.0, 141.7, 101.2, 92.1, 92.0, 71.4, 59.9, 53.6, 35.4.
FAB-MS m/z 273 [M+H]⁺.

実施例101
1-(2-デオキシ-5-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-2-メルカプト-2-S,4-C-メチレン-β-D-リボフラノシル)ウラシル(76E)。
無水ピリジン(5 cm³)中の76D (0.2 g, 0.37 mmol)の溶液に4,4'-ジメトキシトリチルクロライド (0.186 g, 0.55 mmol)を室温で加えた。溶液を5時間攪拌し、反応混合物を0℃に冷却した。炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(30 cm³)を加え、得られた混合物をジクロロメタン(3 x 50 cm³)で抽出した。合わせた有機相を分離し、乾燥した (Na₂SO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン/メタノール/ピリジン(98.5:1.0:0.5 v/v) を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、白茶色の固形物としてヌクレオシド76Eを得た (0.175
g, 83%)。

δ_C (CDCl₃) 164.5, 159.4, 151.6, 145.7, 139.9, 136.4, 136.0, 135.6, 130.9, 130.8, 128.8, 128.5, 128.4, 127.5, 127.4, 122.7, 113.9, 101.5, 91.7, 90.2, 87.6, 71.8, 61.9, 55.3, 53.7, 36.2, 30.6.

FAB-MS m/z 574 [M]⁺, 575 [M+H]⁺
(実測値: C, 65.2; H, 5.4; N, 5.0; C₃₁H₃₀N₂O₇S の理論値C, 64.8; H, 5.3; N, 4.9%).

実施例102
1-(3-O-(2-シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノ)-(2-デオキシ-5-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-2-メルカプト-2-S,4-C-メチレン-β-D-リボフラノシル)ウラシル(76F)。
無水ジクロロメタン(2 cm³)中の76E (0.160 g, 0.28 mmol)の溶液にN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.27 cm³)および2-シアノエチルN,N-ジイソプロピルホスホラミドクロリダイト (97mg, 0.42 mmol)を0℃で加えた。室温で5時間攪拌した。 反応混合物を0℃に冷却し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(30 cm³)を加えた。抽出はジクロロメタン(3 x 20 cm³)を用いて行い、合わせた有機相を乾燥し (Na₂SO₄) 減圧下で蒸発乾固させた。残渣をジクロロメタン/メタノール/ピリジン(99:0.5:0:5 v/v) を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、白色発泡体を得た。この残渣をジクロロメタン (2 cm³) に溶解し、生成物を激しく攪拌しながら揮発油 (100 cm³, -40℃に冷却)から析出した。析出物を濾過して回収し、最後に乾燥し、白色固形物としてヌクレオシド76F を得た
(95 mg, 44%)。

δ_P (CDCl₃) 148.9, 149.0.

実施例103
3,5-ジ-O-ベンジル-1,2-O-イソプロピリデン-4-C-(p-トルエンスルホニルオキシメチル)-β-D-リボフラノース(77)。
3,5-ジ-O-ベンジル-4-C-ヒドロキシメチル-1,2-O-イソプロピリデン-α-D-リボフラノース31 (15.38 g, 38.4 mmol)、無水ピリジン(20 cm³)および無水ジクロロメタン (80 ml) の溶液を-5℃で攪拌した。無水ジクロロメタン(8 cm³)に溶解した塩化p-トルエンスルホニル (8.75 g, 46.0 mmol) を15分で加えた。溶液を室温で17時間攪拌した。反応を氷冷水(200 cm3)で失活させた、抽出をジクロロメタン(5 x 150 cm³)で行い、合わせた有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 100 cm³)およびブライン(3 x 100 cm³)で洗浄し、乾燥し(Na₂SO₄)、濾過し、減圧下で蒸発させた。残渣をジクロロメタン: メタノール(98.5:1.5, v/v) を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、 透明の油として77を得た(17.4 g, 82%)。

δ_H (CDCl₃) 7.79-7.19 (14H, m, Bn), 5.66 (1H, d, J 3.6, 1-H), 4.69-4.20 (8H, m, Bn, 5-H_a, 5-H_b, 3-H, 2-H), 3.53 (1H, d, J 10.3, 1'-H_a), 3.46 (1H, d, J 10.3, 1'-H_b), 2.40 (3H, s, CH₃), 1.29 (3H, s, CH₃), 1.26 (3H, s, CH₃).

δ_C (CDCl₃) 144.6, 137.9, 137.3, 133.0, 129.8, 128.4, 128.3, 128.1, 128.0, 127.9, 127.7, 127.6 (芳香族), 113.6 (C(CH₃)₂), 104.2, (C-1), 84.7 (C-4), 79.0, 78.7, 73.7, 72.7, 70.7, 70.2, (Bn, C-2, C-3, C-5, C-1'), 26.3,
26.0 (C(CH₃)₂), 21.6 (CH₃).
FAB-MS m/z 555 [M+H]⁺.
(実測値: C, 64.8; H, 6.2; C₃₀H₃₄O₈S の理論値 C, 64.9; H, 6.1%).

実施例104
1,2-ジ-O-アセチル-3,5-ジ-O-ベンジル -4-C-(p-トルエンスルホニルオキシメチル)-α,β-D-リボフラノース(78)。
80% 酢酸(250 cm³)中のフラノース77 (17.4 g, 31.4 mmol)の溶液を60℃で20時間攪拌した。溶媒を真空中で除去し、残渣をトルエン(3 x 20 cm³)と共に蒸発させた。残渣を無水ピリジン(100 cm³)に再び溶解した。 無水酢酸 (14.2 cm3)を加え、溶液を室温で15時間攪拌した。反応を氷冷水 (200 cm³)を加えて失活させ、混合物をジクロロメタン(4 x 150 cm³)で抽出した。合わせた有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(2 x 125 cm³)およびブライン(3 x 150 cm³)で洗浄し、乾燥し(Na₂SO₄)、濾過し、減圧下で蒸発させた。残渣を ジクロロメタン: メタノール(98.5:1.5, v/v) を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、透明の油として78を得た (α,β〜1:1) (13.5 g, 72%)。

δ_C (CDCl₃) 169.8, 169.6, 69.4, 168.8 (C=O), 144.7, 137.7, 137.5, 132.8,
129.7, 129.6, 128.5, 128.4, 128.3, 128.2, 128.0, 127.8, 127.7, 127.6 (Bn), 97.4, 94.2 (C-1), 86.4, 84.2 (C-4), 78.9, 77.5, 74.5, 74.1, 73.7, 73.5, 71.8, 70.6, 70.5, 69.6, 69.5 (Bn, C-2, C-3, C-1'), 21.6, 21.0, 20.8,
20.6, 20.4 (COCH₃, C(CH₃)₂).
FAB-MS m/z 599 [M+H]⁺.

化合物78の別の生成方法
3-O-ベンジル-1,2:5,6-ジ-O-イソプロピリデン-α-D-グルコフラノース(30B)。
ジメチルホルムアミド中の0℃の1,2:5,6-ジ-O-イソプロピリデン-α-D-アロフラノース (30A) (Pfanstiehl Laboratories Inc.より入手)(40 g)の溶液に 水素化ナトリウムを少量ずつ加えた。反応混合物を1時間攪拌し、臭化ベンジルを1時間かけて滴加した。反応混合物を室温で16時間攪拌した。メタノールを加えて反応を失活させ、ジメチルホルムアミドを減圧下で除去した。酢酸エチルでシロップを抽出し、ブラインで洗浄した。酢酸エチル層を蒸発し、半固形物を得た(93%)。TLCにより同質。

3-O-ベンジル-1,2-O-イソプロピリデン-α-D-グルコフラノース(30C)。
30B (50 g)を75 %酢酸中で20時間部分加水分解した。少量に濃縮し、酢酸エチルで抽出し、40 g (90 %)の30Cを得た。TLCにより同質。

3-O-ベンジル-1,2-O-イソプロピリデン-α-D-リボ-ペントジアルドフラノース(30D)。
水/メタノール(1:1)中の30C (40 g)溶液を攪拌しながら水中の過酸化ナトリウム溶液に0℃で加えた。反応を2時間攪拌し、エチレングリコールを加え、混合物を酢酸エチルで抽出した。乾燥抽出物を蒸発させ、30D, 32 g, (89%)を得た。TLCにより同質。この工程において、メタノールの添加は反応を完了するために不可欠である。

3-O-ベンジル-4-(ヒドロキシメチル)-1,2-O-イソプロピリデン-α-D-エリスロ-ペントフラノース(30E)。
37 %水性ホルムアルデヒドおよび1N水酸化ナトリウムを水およびテトラヒドロフラン(1:1)中の30D (32 g)の攪拌溶液に0℃で加え、反応を16時間継続し、酢酸エチルで抽出し、塩水で洗浄した。有機層を蒸発させてエーテル/石油エーテルから白色固形物として結晶した23 gのシロップを得た。濾液は低融点固形物として固化した10 gの油であった。あわせて30E, 92%を得た. [23 g (白色固形物は TLCより純度99 %), 低融点固形物10 g (had faster moving impurities by TLC,
純度約75%)]。この工程において、テトラヒドロフランの添加は時間および反応を完了するために不可欠である。

3,5-ジ-O-ベンジル-4-C-ヒドロキシメチル-1,2-O-イソプロピリデン-α-D-リボフラノース (31)。
NaH 60 %とBnBrを用いて30E (20 g)を-10℃でベンジル化し、2つのアイソマーを得た。フラッシュカラムクロマトグラフィにより、主アイソマーとして31、14
g, (54%)を得た。TLCにより同質。

3,5-ジ-O-ベンジル-1,2-O-イソプロピリデン-4-C-トシル-α-D-リボフラノース(77)。
ピリジン中の31 (12.5 g)の溶液を塩化p-トルエンスルホニルで0℃で処理し、反応を室温で14〜16時間継続した。ピリジンを除去し、塩化メチレンで抽出し、重炭酸塩溶液で飽和し、77, 14 g, (80%)を得た。TLCにより同質。

1,2-ジ-O-アセチル-3,5-ジ-O-ベンジル-4-C-トシル-D-リボフラノース(78)。
77 (14 g)の加水分解を75% 酢酸中65℃で18時間行った。溶媒を減圧下で除去し、残渣をエタノール (3x100)、トルエン(3x50)および無水ピリジン(2x50)で処理した。(この化合物78 は石油エーテルから細かい白色固形物として結晶化した。)残渣を乾燥ピリジンに入れ、室温で8時間無水酢酸で処理した。酢酸エチルで抽出し、重炭酸塩で飽和し、次いでブラインで洗浄し、αおよびβアノマーの混合物として12g, (83%)の78を得た。78 の信用あるサンプルと直接比較(TLC, HPLC,
NMR)することにより、その同定と純度を確認した。

実施例 105
1-(2-O-アセチル-3,5-ジ-O-ベンジル-4-C-(p-トルエンスルホニルオキシメチル)-β-D-リボフラノシル)チミン (79)。
無水アセトニトリル (182 cm³)中のアノマー混合物78 (12.8 g, 21.4 mmol)およびチミン(5.38 g, 42.7 mmol)の攪拌溶液にN,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド(31.68 ml, 128.23 mmol)を加えた。反応混合物を室温で1時間攪拌し、攪拌を60℃で1.5時間継続した。0℃に冷却した後、トリメチルシリルトリフレート(6.57 ml, 30.33 mmol)を滴加し、混合物を60℃で10時間攪拌した。反応混合物を氷冷した炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(90 mL)で中和した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で容量が半分になるまで濃縮した。ジクロロメタン (4 x 200 cm³)を用いて抽出した。合わせた有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3
x 150 cm³)およびブライン(3 x 150 ml)で洗浄し、乾燥し(Na₂SO₄)、濾過し、減圧下で蒸発させた。残渣をジクロロメタン:メタノール (99:1〜98:2, v/v)を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド 79を得た(13.1 g, 92%)。

δ_H (CDCl₃) 9.04 (s, 1H, NH), 7.73-7.19 (15H, m, 6-H, 芳香族), 5.94 (1H,
d, J 5.5, 1'-H), 5.37 (1H, d, J 5.6, 2'-H), 4.57-4.40 (5H, m, 3'-H, 5'-H_a, 5'-H_b, Bn), 4.14 (2H, s, Bn), 3.75 (1H, d, J 10.2, 1''-H_a), 3.57 (1H, d, J 10.2, 1''-H_b), 2.41 (3H, s, CH₃C₆H₅), 2.02 (3H, s, COCH₃), 1.54 (3H, s, CH₃).

δ_C (CDCl₃) 169.8 (C=O), 163.5 (C-4), 150.2 (C-2), 145.0, 136.8, 135.6, 132.1, 129.7, 128.5, 128.0, 127.9, 127.8, 127.5 (芳香族), 113.5 (C-5), 86.8, 85.3, 77.6, 74.6, 74.3, 73.6, 70.8, 68.8 (Bn, C-1', C-3', C-2', C-4'), 21.3 (CH₃), 20.5 (COCH₃), 11.8 (CH₃).
FAB-MS m/z 665 [M+H]⁺
(実測値 C, 61.2; H, 5.3; N, 4.1; S, 4.7, C₃₄H₃₆O₁₀N₂S の理論値 C, 61.4; H, 5.4; N, 4.2; S, 4.8 ).

実施例 106
1-(3,5-ジ-O-ベンジル-4-C-(p-トルエンスルホニルオキシメチル)-β-D-リボフラノシル)チミン(80)。
ヌクレオシド79 (13.1 g, 19.7 mmol)をメタノール (200 cm³,飽和メタノール性アンモニアを同容量のメタノールで希釈することにより調製)中のアンモニア溶液に溶解し、室温で4時間攪拌した。次いで反応混合物を蒸発させ、残渣をジクロロメタン (400 cm³)に溶解した。有機相をブライン(3 x 150 cm³)で洗浄し、乾燥し(Na₂SO₄)、濾過し、減圧下で蒸発させた。残渣をジクロロメタン:メタノール(99.5:0.5, v/v) 溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド 80 を得た(10.7 g, 87%)。

δ_H (CDCl₃) 9.66 (s, 1H, NH), 7.71-7.21 (15H, m, 6-H, 芳香族), 5.72 (1H,
d, J 5.1, 1'-H), 4.75, 4.55 (2H, それぞれ d, J 11.5, Bn), 4.51 (2H, s, Bn), 4.37 (1H, t, J 5.4, 2*-H), 4.30-4.12 (3H, m, 3'-H, Bn), 3.76 (1H, d, J 10.2, 1''-H_a), 3.59 (1H, d, J 10.2, 1''-H_b), 2.39 (3H, s, CH₃C₆H₅), 1.48 (3H, s, CH₃).

δ_C (CDCl₃) 163.8 (C-4), 150.9 (C-2), 145.0, 137.0, 136.9, 135.9, 132.3,
129.8, 128.7, 128.6, 128.2, 128.1, 128.0, 127.6 (芳香族), 111.0 (C-5), 89.6, 85.3, 78.4, 74.5, 73.8, 71.1, 69.7, (Bn, C-1', C-3', C-2', C-4', C-1''), 21.6 (CH₃), 12.0 (CH₃).

FAB-MS m/z 623 [M+H]⁺
(実測値C, 61.5; H, 5.2; N, 4.4; S, 5.2, C₃₂H₃₄O₉N₂S の理論値C, 61.7; H, 5.4; N, 4.5; S, 5.1 ).

実施例 107
(1S,3R,4R,7S)-7-ベンジルオキシ-1-ベンゾイルオキシメチル-3-(チミン-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン (36)。
無水 DMF (150 cm³)中のヌクレオシド 80 (10.65 g, 17.1 mmol)の攪拌溶液に鉱油中(0.9 g, 22.2 mmol)の水素化ナトリウム60%懸濁液を0℃で少量ずつ加えた。混合物を0℃°で15時間攪拌し、60%水素化ナトリウム(0.205 g, 5.12 mmol)をさらに加え、反応混合物を0℃で22時間攪拌した。メタノール(20 cm³)を加え、次いで反応混合物を減圧下で容量が半分になるまで濃縮した。氷冷水 (300 cm³)を加え、抽出をジクロロメタン (5 x 150 cm³)を用いて行った。合わせた有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(3 x 40 cm³)およびブライン(3 x 40 cm³)で洗浄し、乾燥し(Na₂SO₄)、濾過し、減圧下で蒸発させた。残渣をジクロロメタン:メタノール (99.5:0.5, v/v) 溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、白色固形物としてヌクレオシド 36 を得た(7.1 g, 92%)。スペクトルデータは36について先に得られたデータ(実測値 C, 66.2; H, 5.8; N, 6.1; C₂₅H₂₆N₂O₆の理論値 C, 66.6; H, 5.8; N, 6.2 )と一致した。

実施例 108
3,5-ジ-O-ベンジル-1,2-O-イソプロピリデン-4-C-メタンスルホニルオキシメチル-α-D-リボフラノース(200)。
無水ピリジン(3 mL)中のフラノース31 (2.16 g, 5.39 mmol)の攪拌溶液に塩化メタンスルホニル(0.61 mL, 16.0 mmol)を0℃で滴加した。反応混合物を室温で20時間攪拌し、氷冷水(300 mL)で失活させ、ジクロロメタン(2x300 mL)で抽出した。合わせた抽出物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(300 mL)で洗浄し、乾燥した(MgSO₄)。溶媒を減圧下で蒸留して除去し、残渣をジクロロメタンを溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、透明の油として生成物200を得た(2.55 g, 99%);

¹H NMR (CDCl₃): δ7.37-7.24 (10 H, m, Bn), 5.78 (1 H, d, J 3.8 Hz, H-1),
4.85 (1 H, d, J 11.7 Hz, Bn), 4.73 (1 H, d, J 11.9 Hz, Bn), 4.64 (1 H, dd, J 4.0, 5.3 Hz, H-2), 4.54 (1 H, d, J 11.9 Hz, H-5'), 4.52 (1 H, d, J
11.9 Hz, Bn), 4.46 (1 H, d, J 11.9 Hz, H-5'), 4.41 (1 H, d, J 11.8 Hz, Bn), 3.60 (1 H, d, J 10.4 Hz, H-5), 3.50 (1 H, d, J 10.5 Hz, H-5), 3.06 (3 H, s, SO₂CH₃), 1.68 (3 H, s, CH₃), 1.34 (3 H, s, CH₃);

¹³C NMR (CDCl₃): δ137.79, 137.31, 128.54, 128.48, 128.16, 128.01, 127.87, 127.79 (Bn), 113.66 (C(CH₃)₂), 104.46 (C-1), 84.88 (C-4), 78.48, 78.41 (C-2, C-3), 73.65, 72.63, 70.78, 70.16 (Bn, C-5, C-5'), 37.84 (SO₂CH₃), 26.20 (CH₃), 25.69 (CH₃);

MS FAB: 501 (M+Na, 100%).
実測値: C, 60.37; H, 6.29; S, 6.53; C₂₄H₃₀O₈S の理論値 C, 60.24; H, 6.32; S, 6.70 %.

実施例 109
メチル3,5-ジ-O-ベンジル-4-C-メタンスルホニルオキシメチル-α-D-リボフラノシド(201)。
メタノール性塩酸(20% w/w, 31.7 mL)および水(4.4 mL)中のフラノース200 (1.133 g, 2.37 mmol)の溶液を室温で2時間攪拌した。炭酸水素ナトリウムで中和した後、溶液をジクロロメタン (2x150 mL)で抽出した。合わせた抽出物を水(150 mL)で洗浄し、次いで乾燥した(MgSO₄)。溶媒を減圧下で蒸留して除去し、残渣をジクロロメタン:メタノール (99:1) 溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、透明の油(1.018 g, 95%)として生成物201を得た(β:α〜2:1);

¹H NMR (CDCl₃): δ7.39-7.22 (m, Bn), 4.86 (br s, Bn), 4.69-3.99 (m, Bn, H-5', H-1, H-2, H-3), 3.68 (d, J 8.9 Hz, H-5 β), 3.51 (d, J 9.8 Hz, H-5
α), 3.46 (s, OCH₃ α), 3.34 (d, J 9.1 Hz, H-5 β), 3.32 (d, J 9.7 Hz, H-5 α), 3.28 (s, OCH₃ β), 2.97 (3 H, s, SO₂CH₃ β), 2.93 (3 H, s, SO₂CH₃ α);

¹³C NMR (CDCl₃): δ 137.74, 136.98, 128.70, 128.64, 128.58, 128.56, 128.37, 128.21, 128.15, 128.09, 127.98, 127.86, 127.83 (Bn), 107.54 (C-1 β), 103.39 (C-1 α), 84.65, 83.18, 81.90, 78,87 (C-4, C-3), 75.04, 74.07, 73.73, 73.70, 73.38, 72.56, 72.11, 70.85, 70.55, 70.20 (C-2, Bn, C-5, C-5'), 55.90 (OCH₃ α), 54.96 (OCH₃ β), 37.18 (SO₂CH₃ β), 37.07 (SO₂CH₃ α);

MS FAB: 475 (M+Na, 25%).
実測値: C, 58.40; H, 6.33; C₂₄H₃₀O₈S の理論値 C, 58.39; H, 6.24 %.

実施例 110
(3R)- および(3S)-(1S,4R,7S)-7-ベンジルオキシ-1-ベンジルオキシメチル-3-メトキシ-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン (202および203)。
無水 DMF (25 mL)中の 201 (3.32 g, 7.34 mmol)の溶液を0℃で攪拌し、水素化ナトリウムの60%油懸濁液(700 mg, 16.9 mmol)を加えた。混合物を室温で90分間攪拌し、水(300 mL)で失活させ、ジエチルエーテル(2x300 mL)で抽出した。合わせた抽出物を水(200 mL)で洗浄し、乾燥した(MgSO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタンを溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、透明の油として2つの生成物202および203を得た(それぞれ1.571 g, 60% および0.777 g, 30%)。

(1S,3R,4R,7S)-7-ベンジオキシ-1-ベンジルオキシメチル-3-メトキシ-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン (202)。
¹H NMR (CDCl₃): δ7.36-7.26 (10 H, m, Bn), 4.81 (1 H, s, H-1), 4.65 (1 H, d, J 11.9 Hz, Bn), 4.61 (2 H, s, Bn), 4.56 (1 H, d, J 11.9 Hz, Bn), 4.11 (1 H, s, H-2), 4.09 (1 H, s, H-3), 4.01 (1 H, d, J 7.5 Hz, H-5'), 3.80-3.77 (3 H, m, H-5', H-5), 3.39 (3 H, s, OCH₃);

¹³C NMR (CDCl₃): δ138.05, 137.36, 128.47, 128.44, 127.88, 127.73, 127.63 (Bn), 104.97 (C-1), 85.13 (C-4), 79.16 (C-3), 77.18 (C-2), 73.64 (Bn),
72.26, 72.10 (Bn, C-5'), 66.50 (C-5), 55.34 (OCH₃);
MS FAB: 379 (M+Na, 28%).
実測値: C, 70.55; H, 6.97; C₂₁H₂₄O₅の理論値C, 70.77; H, 6.79 %.

(1S,3R,4R,7S)-7-ベンジルオキシ-1-ベンジルオキシメチル-3-メトキシ-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン (203)。
¹H NMR (CDCl₃): δ7.36-7.26 (10 H, m, Bn), 5.00 (1 H, s, H-1), 4.67-4.54
(4 H, m, Bn), 4.18 (1 H, s, H-2), 3.99 (1 H, s, H-3), 3.99-3.90 (2 H, m, H-5'), 3.75-3.68 (2 H, m, H-5), 3.49 (3 H, s, OCH₃);

¹³C NMR (CDCl₃): δ137.83, 137.53, 128.51, 128.48, 127.96, 127.82, 127.71, 127.62 (Bn), 104.05 (C-1), 88.44 (C-4), 79.54 (C-3), 77.16 (C-2), 73.68 (Bn), 72.61 (C-5'), 72.24 (Bn), 65.73 (C-5), 56.20 (OCH₃);
MS FAB: 379 (M+Na, 100%).

実施例 111
(1R,2S,3S)-2-ベンジルオキシ-3-ベンジルオキシメチル-1-(メトキシ(チミン-1-イル)メチル)-3-トリメチルシリルオキシテトラヒドロフラン(204)。
無水アセトニトリル (9.3 mL)中の 202 (216 mg, 0.606 mmol)およびチミン (153 mg, 1.22 mmol)の溶液にBSA (N,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド, 0.90 mL, 3.6 mmol)を加え、還流下に15分間攪拌した。溶液を0℃に冷却し、トリメチルシリルトリフレート (0.153 mL, 0.777 mmol)を滴加した。室温で18時間、60℃で24時間攪拌した後、反応を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(20 mL)で失活させ、ジクロロメタン (2x50 mL)を用いて抽出した。合わせた抽出物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(50 mL)で洗浄し、乾燥した(MgSO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン:メタノール (98:2) を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、固形物(196 mg, 67%)として生成物204 を得た(ジアステレオアイソマー〜 1.7:1の混合物)。

¹H NMR (CDCl₃): δ7.36-7.14 (m, Bn, H-6), 5.77 (1 H, d, J 7.9 Hz, H-1'),
5.57 (1 H, d, J 5.8 Hz, H-1'), 4.68-4.43 (m, Bn, H-2'), 4.12-3.68 (m, H-5', H-5', H-3'), 3.32 (s, OCH₃), 3.24 (s, OCH₃), 1.93 (d, J 0.9 Hz, CH₃), 1.86 (d, J 1.1 Hz, CH₃), 0.14 (s, Si(CH₃)₃), 0.12 (s, Si(CH₃)₃);

¹³C NMR (CDCl₃):δ163.68, 163.55 (C-4), 151.58, 151.07 (C-2), 137.84, 137.74, 137.32 (Bn), 135.93, 135.10 (C-6), 128.57, 128.42, 128.41, 128.10,
127.95, 127.85, 127.77, 127.74 (Bn), 111.38, 111.01 (C-5), 86.89, 85.61, 85.40, 84.72, 83.40, 83.31, 82.10 (C-1', C-2', C-3', C-4'), 75.20, 73.98, 73.62, 73.59, 72.55, 72.13, 71.04, 70.74 (Bn, C-5', C-5''), 56.82, 56.54 (OCH₃), 12.47, 12.38 (CH₃), 1.72, 1.69 (Si(CH₃)₃);

MS FAB: 555 (M+H, 65%), 577 (M+Na, 70%).
実測値: C, 62.76; H, 6.88; N, 4.94; C₂₉H₃₈N₂O₇Si の理論値 C, 62.79; H, 6.90; N, 5.05 %.

実施例 112
(1R,2S,3S)-2-ベンジルオキシ-3-ベンジルオキシメチル-1-(メトキシ(6-N-ベンゾイルアデニン-9-イル)メチル)-3-トリメチルシリルオキシテトラヒドロフラン(205)。
無水アセトニトリル(8.2 mL)中の202 (240 mg, 0.673 mmol) および 6-N-ベンゾイルアデニン(301 mg, 1.26 mmol)の溶液にBSA (0.67 mL, 2.7 mmol) を加え、室温で1時間攪拌した。溶液を0℃に冷却し、トリメチルシリルトリフレート(0.25 mL, 1.33 mmol) を滴加した。65℃で18時間攪拌した後、反応を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(50 mL)で失活させ、ジクロロメタン(2x50 mL)で抽出した。合わせた抽出物を乾燥した(MgSO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン:メタノール (98:2) を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、固形物(185 mg, 41%)として生成物205を得た(ジアテレオアイソマー〜1.8:1の混合物。

¹H NMR (CDCl₃): δ 8.78 (s, H-8), 8.21 (s, H-2), 8.17 (s, H-2), 8.03-8.00 (m, Bz), 7.61-7.49 (m, Bz), 7.36-7.23 (m, Bn), 7.07-7.04 (m, Bz), 5.85
(1 H, d, J 7.9 Hz, H-1'), 5.76 (1 H, d, J 6.0 Hz, H-1'), 4.74-4.40 (m, Bn, H-2'), 4.22-3.62 (m, H-5', H-5', H-3'), 3.33 (s, OCH₃), 3.24 (s, OCH₃), 0.15 (s, Si(CH₃)₃), 0.14 (s, Si(CH₃)₃);

¹³C NMR (CDCl₃): δ164.68 (HNC=O), 153.17, 152.99 (C-6), 149.47 (C-2), 141.82, 141.66 (C-8), 137.74, 137.71, 137.65 (Bn), 133.87, 132.87, 132.78
(Bz), 128.97, 128.93, 128.45, 128.42, 128.38, 128.14, 127.97, 127.88, 127.82, 127.78 (Bn, Bz), 123.66, 122.85 (C-5), 86.41, 86.23, 85.70, 85.24, 84.78, 83.73, 83.58, 82.79 (C-1', C-2', C-3', C-4'), 75.32, 74.55, 73.61, 72.18, 71.98, 70.85, 70.59 (Bn, C-5', C-5''), 57.23, 57.04 (OCH₃), 1.78 (Si(CH₃)₃);

MS FAB: 668 (M+H, 50%), 690 (M+Na, 100%).
実測値: C, 64.07; H, 6.01; N, 9.94; C₂₉H₃₈N₂O₇Si,0.5H₂O の理論値 C, 63.88; H, 6.25; N, 10.34 %.

実施例 113
(1R,2R,3R)-2-ベンジルオキシ-3-ベンジルオキシメチル-3-ヒドロキシテトラヒドロフルフラール(206)。
80% 酢酸(3.8 mL)中の 202/203 (252 mg, 0.707 mmol)の溶液を90℃で2時間攪拌し、溶媒を減圧下で蒸留して除去した。残渣をトルエン(3x10 mL)中で共に蒸発させ、油として生成物206を得た(242 mg, 100%)。

¹H NMR (CDCl₃): δ9.66 (1 H, d, J 0.8 Hz, H-1), 7.36-7.25 (10 H, m, Bn),
4.68 (1 H, d, J 11.9 Hz, Bn), 4.60-4.39 (5 H, m, Bn, H-2, H-3), 3.98-3.92 (2 H, m, H-5), 3.85 (1 H, d, J 9.3 Hz, H-5'), 3.52 (1 H, d, J 9.2 Hz,
H-5');

¹³C NMR (CDCl₃): δ203.64 (C-1), 137.39, 137.19, 128.61, 128.54, 128.29,
128.12, 127.87, 127.83 (Bn), 87.17, 87.05 (C-4, C-2), 80.98 (C-3), 75.00, 73.70, 71.86 (Bn, C-5'), 67.84 (C-5);
MS FAB: 707 (2xM+Na, 100%).

実施例 114
(1S,3S,4R,7S)-3-アセトキシ-7-ベンジルオキシ-1-ベンジルオキシメチル-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン(207)。
無水ピリジン(2.0 mL)中の 206 (230 mg, 0.672 mmol)の攪拌溶液に無水酢酸(0.18 mL, 1.91 mmol)を加えた。反応混合物を室温で23時間攪拌し、水(0.13 mL)を加え、溶媒を減圧下で蒸留して除去した。残渣をトルエン(3x10 mL)中で共に蒸発させ、ジクロロメタン:メタノール(99:1)を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、透明の油として生成物207を得た(56.7 mg, 23%);

¹H NMR (CDCl₃): δ7.38-7.26 (10 H, m, Bn), 6.00 (1 H, s, H-1), 4.68 (1 H, d, J 12.0 Hz, Bn), 4.62 (1 H, d, J 12.2 Hz, Bn), 4.60 (1 H, d, J 12.4 Hz, Bn), 4.56 (1 H, d, J 12.2 Hz, Bn), 4.17 (1 H, s, H-2), 4.14 (1 H, s,
H-3), 4.01 (1 H, d, J 7.7 Hz, H-5'), 3.81-3.78 (3 H, m, H-5', H-5), 20.06 (3 H, s, COCH₃);

¹³C NMR (CDCl₃): δ 169.18 (C=O), 137.92, 137.48, 128.52, 128.45, 128.03, 127.77, 127.73, 127.68 (Bn), 95.95 (C-1), 86.49 (C-4), 78.27, 76.58 (C-3, C-2), 73.65 (Bn), 72.26, 71.96 (Bn, C-5'), 65.49 (C-5), 20.98 (COCH₃);
MS FAB: 407 (M+Na, 55%).
実測値: C, 68.80; H, 6.11; C₂₂H₂₄O₆の理論値 C, 68.74; H, 6.29 %.

実施例 115
(1S,3S,4R,7S)-3-(6-N-ベンゾイルアデニン-9-イル)-7-ベンジルオキシ-1-ベンジルオキシメチル-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン (208)。
無水アセトニトリル (5.3 mL) 中のフラノース207 (167 mg, 0.434 mmol)および6-N-ベンゾイルアデニン(194 mg, 0.813 mmol)の溶液にBSA (0.43 mL, 1.76 mmol)を加え、室温で1時間攪拌した。溶液を0℃で冷却し、トリメチルシリルトリフレート (0.16 mL, 0.86 mmol) を滴加した。65℃で2時間攪拌した後、反応を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(40 mL)で失活させ、混合物をジクロロメタン(2x50 mL)で抽出した。合わせた抽出物を乾燥した(MgSO₄)。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン:メタノール (98:2)を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、固形物として生成物208を得た(111 mg, 45%)。;

¹H NMR (CDCl₃): δ8.82 (1 H, s, H-8), 8.14 (1 H, s, H-2), 7.59-7.26 (15 H, m, Bz, Bn), 6.74(1 H, s, H-1'), 4.92 (1 H, s, H-2'), 4.74-4.39 (4 H, m, Bn), 4.42 (1 H, s, H-3'), 4.19-4.10 (2 H, m, H-5''), 3.92 (1 H, d, J 11.8 Hz, H-5'), 3.88 (1 H, d, J 11.5 Hz, H-5');
MS FAB: 564 (M+H, 100%).

実施例 116
メチル 2-O-アセチル-3,5-ジ-O-ベンジル-4-C-メタンスルホニルオキシメチル-D-リボフラノシド (209)。
無水ピリジン(4 mL)中の 201 (687 mg, 1.52 mmol)の攪拌溶液に無水酢酸(0.43
mL, 4.56 mmol)を0℃で滴加した。反応混合物を室温で2日間攪拌し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(75 mL)で失活させ、ジクロロメタン(150 + 75 mL)で抽出した。合わせた抽出物を乾燥し(MgSO₄)、溶媒を減圧下で蒸留して除去し、残渣をジクロロメタンを溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、透明の油として生成物209を得た(β:α〜3:1, 750 mg, 100 %);

MS FAB: 463 (M-OCH₃, 100%), 517 (M+Na, 28%);
実測値: C, 58.53; H, 6.16; C₂₄H₃₀O₉Sの理論値 C, 58.29; H, 6.11 %.

メチル 2-O-アセチル-3,5-ジ-O-ベンジル-4-C-メタンスルホニルオキシメチル-β-D-リボフラノシド (209β)。
¹H NMR (CDCl₃): δ7.36-7.18 (10 H, m, Bn), 5.27 (1 H, d, J 4.9 Hz, H-2),
4.88 (1 H, s, H-1), 4.55-4.44 (6 H, m, H-5', Bn), 4.35 (1 H, d, J 5.0 Hz, H-3), 3.73 (1 H, d, J 9.2 Hz, H-5), 3.38 (1 H, d, J 9.3 Hz, H-5), 3.30 (3 H, s, OCH₃), 2.95 (3 H, s, SO₂CH₃), 2.11 (3 H, s, OCCH₃);

¹³C NMR (CDCl₃): δ169.91 (C=O), 137.83, 137.28, 128.49, 128.44, 127.99,
127.87, 127.77 (Bn), 105.40 (C-1), 82.65, 81.05, 74.55, 73.62, 73.56, 71.86, 70.22 (C-2, C-3, C-4, C-5, C-5', Bn), 55.03 (OCH₃), 37.14 (SO₂CH₃), 20.73 (OCCH₃)。

メチル 2-O-アセチル-3,5-ジ-O-ベンジル-4-C-メタンスルホニルオキシメチル-α-D-リボフラノシド (209α).
¹H NMR (CDCl₃): δ7.36-7.18 (10 H, m, Bn), 5.09 (1 H, d, J 4.5 Hz, H-1),
4.95 (1 H, dd, J 4.5, 6.8 Hz, H-2), 4.65-4.44 (6 H, m, H-5', Bn), 4.27 (1 H, d, J 6.6 Hz, H-3), 3.49 (1 H, d, J 9.9 Hz, H-5), 3.46 (3 H, s, OCH₃), 3.36 (1 H, d, J 9.9 Hz, H-5), 2.92 (3 H, s, SO₂CH₃), 2.14 (3 H, s, OCCH₃);

¹³C NMR (CDCl₃): δ 170.41 (C=O), 137.59, 137.28, 128.56, 128.51, 128.49, 128.44, 127.98, 127.88 (Bn), 102.35 (C-1), 84.25, 77.53, 74.66, 73.67,
72.12, 70.39, 70.28 (C-2, C-3, C-4, C-5, C-5', Bn), 56.07 (OCH₃), 36.94
(SO₂CH₃), 20.63 (OCCH₃).

実施例 117
フェニル2-O-アセチル-3,5-ジ-O-ベンジル-4-C-メタンスルホニルオキシメチル-1-チオ-β-D-リボフラノシド (210)。
方法a。
無水ジクロロメタン(6.4 mL)中の209 (738 mg, 1.49 mmol)の攪拌溶液にフェニルチオトリメチルシラン(2.42 mL, 12.8 mmol)を加え、0℃に冷却した。トリメチルシリルトリフレート (0.67 mL, 3.67 mmol) を滴加し、溶液を室温で4時間攪拌した。反応を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(100 mL)で失活させ、ジクロロメタン(2x200 mL)で抽出した。合わせた抽出物を乾燥し(MgSO₄)、溶媒を減圧下で蒸留して除去した。残渣をジクロロメタンを溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、透明の油として生成物210(564 mg, 66%)および未反応の出発材料(191 mg, 26%)を得た。
方法b。
無水ジクロロメタン(0.49 mL)中の211 (86 mg, 0.165 mmol)の溶液に フェニルチオトリメチルシラン(0.16 mL, 0.825 mmol)を加え、0℃に冷却した。トリメチルシリルトリフレート(0.037 mL, 0.206 mmol)を加え、溶液を室温で2時間攪拌した。反応を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(15 mL)で失活させ、得られた混合物をジクロロメタン(2x25 mL)で抽出した。合わせた抽出物を乾燥し(MgSO₄)、溶媒を減圧下で蒸留して除去した。残渣をジクロロメタンを溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、透明の油として生成物210を得た(75
mg, 79%)。

¹H NMR (CDCl₃): δ 7.47-7.19 (15 H, m, Bn, SPh), 5.48 (1 H, d, J 3.6 Hz,
H-2), 5.34 (1 H, dd, J 3.7, 5.2 Hz, H-1), 4.54-4.36 (7 H, m, H-3, H-5',
Bn), 3.66 (1 H, d, J 9.7 Hz, H-5), 3.48 (1 H, d, J 9.5 Hz, H-5), 2.89 (3 H, s, SO₂CH₃), 2.09 (3 H, s, OCCH₃);

¹³C NMR (CDCl₃): δ169.93 (C=O), 137.69, 137.08, 132.65, 132.45, 129.15,
128.53, 128.52, 128.18, 128.14, 128.08, 127.91, 127.85 (Bn, SPh), 87.99, 84.35, 80.34, 75.33, 74.20, 73.67, 70.83, 69.34 (C-1, C-2, C-3, C-4, C-5, C-5', Bn), 37.27 (SO₂CH₃), 20.68 (OCCH₃);
MS FAB: 463 (M-SPh, 100%), 595 (M+Na, 24%);
実測値: C, 61.17; H, 5.55; C₂₉H₃₂O₈S₂の理論値 C, 60.82; H, 5.63 %.

実施例 118
1,2-ジ-O-アセチル-3,5-ジ-O-ベンジル-4-C-メタンスルホニルオキシメチル-D-リボフラノース (211)。
80%酢酸(1.5 mL)中の201 (150 mg; 0.313 mmol)の溶液を90℃で3時間攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発して除去し、残渣をエタノール (3x5 mL)、トルエン(3x5 mL)およびピリジン(2x5 mL)と共に蒸発させた。残渣を無水ピリジン(0.62 mL)に溶解し、無水酢酸(0.47 mL)を加え、溶液を室温で16時間攪拌した。反応を水(50
mL)で失活させ、得られた混合物をジクロロメタン (2x50 mL)で抽出した。合わせた抽出物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(50 mL)で洗浄し、乾燥した(MgSO₄)。溶媒を蒸発させ、残渣をジクロロメタンを溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、油として生成物211を得た(99 mg, 60%);

¹H NMR (CDCl₃): δ7.39-7.21 (m, Bn), 6.38 (d, J 4.6 Hz, H-1 β), 6.15 (s, H-1 α), 5.35 (d, J 4.9 Hz, H-2 α), 5.17 (dd, J 6.3, 4.9 Hz, H-2 β),
4.69-4.23 (m, H-3, Bn), 3.64 (d, J 9.7 Hz, H-5 α), 3.52 (d, J 10.1 Hz,
H-2 β), 3.45 (d, J 9.7 Hz, H-5 α), 3.39 (d, J 9.9 Hz, H-2 β), 2.99 (s, SO₂CH₃ α), 2.96 (s, SO₂CH₃ β), 2.14, 2.13, 2.06, 1.90 (4xs, COCH₃);

¹³C NMR (CDCl₃): δ169.68, 169.00 (C=O), 137.68, 137.05, 128.60, 128.55,
128.50, 128.21, 128.12, 128.04, 127.94, 127.82, 127.79 (Bn), 99.35 (C-1
α), 94.24 (C-1 β), 86.36 (C-4 β), 84.28 (C-4 α), 79.15, 77.47, 74.58, 74.06, 73.73, 73.56, 71.67, 70.57, 70.19, 69.84 (Bn, C-2, C-3, C-5, C-5'), 37.61 (SO₂CH₃ β), 37.48 (SO₂CH₃ α), 21.07, 20.74, 20.63, 20.39 (COCH₃);

MS FAB: 545 (M+Na, 13%).
実測値: C, 57.70; H, 5.56; C₂₅H₃₀O₁₀S の理論値 C, 57.46; H, 5.79 %.

実施例 119
(3R)-および(3S)-(1S,4R,7S)-7-ベンジルオキシ-1-ベンジルオキシメチル-3-フェニルチオ-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン (212)。
アンモニアで飽和させたメタノール(35 mL)中の 210 (553 mg, 0.966 mmol)の溶液を室温で2時間攪拌し、溶媒を減圧下で蒸留して除去した。残渣を無水DMF (3.5 mL)に溶解し、0℃で溶液を攪拌した。水素化ナトリウム60%懸濁液(118 mg, 2.88 mmol)を加え、混合物を室温で12時間攪拌した。反応を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(100 mL)で失活させ、得られた混合物をジクロロメタン (2x100 mL)で抽出した。合わせた抽出物を乾燥し(MgSO₄)、溶媒を減圧下で蒸留して除去した。残渣をジクロロメタンを溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、透明の油として生成物212を得た(404 mg, 96%)。

MS FAB: 435 (M+H, 35%), 457 (M+Na, 16%);
実測値: C, 71.76; H, 6.18; C₂₆H₂₆O₄S の理論値 C, 71.86; H, 6.03 %.

(1S,3R,4R,7S)-7-ベンジルオキシ-1-ベンジルオキシメチル-3-フェニルチオ-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン (212β)。

¹H NMR (CDCl₃): δ7.46-7.26 (15 H, m, Bn, SPh), 5.35 (1 H, s, H-1), 4.68-4.56 (4 H, m, Bn), 4.31 (1 H, s, H-2), 4.10 (1 H, s, H-3), 4.09 (1 H, d, J 7.3 Hz, H-5'), 3.93 (1 H, d, J 7.8 Hz, H-5'), 3.79 (2 H, m, H-5);

¹³C NMR (CDCl₃): δ138.03, 137.45, 133.42, 132.36, 129.19, 128.55, 128.46, 128.05, 127.84, 127.83, 127.76 (Bn, SPh), 89.96 (C-1), 87.18 (C-4), 79.71 (C-2), 79.40 (C-3), 73.64 (Bn), 73.23 (C-5'), 72.30 (Bn), 66.31 (C-5).

(1S,3S,4R,7S)-7-ベンジルオキシ-1-ベンジルオキシメチル-3-フェニルチオ-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン (212α).

¹H NMR (CDCl₃): δ 7.52-7.19 (15 H, m, Bn, SPh), 5.52 (1 H, s, H-1), 4.70-4.50 (4 H, m, Bn), 4.41 (1 H, s, H-2), 4.18 (1 H, d, J 7.8 Hz, H-5'), 4.08 (1 H, d, J 8.4 Hz, H-5'), 4.07 (1 H, s, H-3), 3.78 (1 H, d, J 11.3 Hz, H-5), 3.72 (1 H, d, J 11.5 Hz, H-5);

¹³C NMR (CDCl₃): δ137.89, 137.46, 135.29, 130.93, 129.13, 128.99, 128.57, 128.48, 127.81, 127.76, 127.58, 126.95 (Bn, SPh), 91.87 (C-1), 88.59 (C-4), 80.07, 79.14 (C-2, C-3), 73.65, 73.40, 72.04 (Bn, C-5'), 65.62 (C-5).

実施例 120
(3R)- and (3S)-(1S,4R,7S)-7-ベンジルオキシ-1-ベンジルオキシメチル-3-(チミン-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン (36+213)。
チミン (175 mg, 1.38 mmol) をヘキサメチルジシラザン(6.8 mL)中で還流させながら攪拌し、硫酸アンモニウム(5 mg)を加えた。16時間攪拌した後、透明の溶液を40℃に冷却し、溶媒を減圧下で蒸留して除去した。残渣に無水ジクロロメタン (4.6 mL) 中の212 (201 mg, 0.463 mmol)溶液および4Åモレキュラーシーブス (180 mg)を加えた。室温で10分間攪拌した後、NBS (107 mg, 0.602 mmol)を加え、混合物をさらに30分間攪拌した。反応をチオ硫酸ナトリウム飽和水溶液(25 mL)で失活させ、得られた混合物をジクロロメタン (2x50 mL)で抽出した。合わせた抽出物を乾燥し(MgSO₄)、蒸発し、残渣をジクロロメタン:メタノール (97:3)を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、アノマー混合物(β:α〜1:2)として生成物36+213を得た (127 mg, 61%);

¹H NMR (CDCl₃): δ 7.49 (d, J 0.9 Hz, H-6 β), 7.46 (d, J 1.0 Hz, H-6 α), 7.39-7.25 (m, Bn), 5.94 (s, H-1' α), 5.64 (s, H-1' β), 4.71-4.50 (m, Bn, H-2'), 4.23 (s, H-3' α), 4.16 (d, J 8.6 Hz, H-5'' α), 4.09-3.78 (m, H-5', H-5'', H-3'β), 1.94 (d, J 0.9 Hz, CH₃ α), 1.62 (d, J 1.2 Hz,
CH₃ β);
MS FAB: 551 (M+H, 96%).

実施例 121
(3R)- および(3S)-(1S,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-3-(チミン-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン (37+214)。
エタノール(2.7 mL)中の 36+213 (175 mg, 0.39 mmol)の溶液を室温で攪拌し、炭素上の20%水酸化パラジウム(50 mg)を加えた。混合物をアルゴンで数回脱ガスし、水素雰囲気下に置いた。18時間攪拌した後、混合物をジクロロメタン:メタノール (95:5)を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し、37と214の混合物を得た(1:1.2) (26 mg, 25%);

¹H NMR (CD₃OD): δ 7.78 (d, J 1.3 Hz, H-6 α), 7.73 (d, J 1.2 Hz, H-6 β), 5.88 (s, H-1' α), 5.53 (s, H-1' β), 4.38 (s, H-2' α), 4.34 (s, H-3' α), 4.26 (s, H-2' β), 4.08-3.69 (m, H-5', H-5'', H-3'β), 1.92 (d, J
1.2 Hz, CH₃ α), 1.88 (d, J 1.1 Hz, CH₃ β);

¹³C NMR (CD₃OD): δ138.00 (C-6 α), 136.96 (C-6 β), 110.80 (C-5 β), 110.08 (C-5 α), 92.49, 89.01 (C-4', C-1' α), 90.46, 88.37 (C-4', C-1' β), 80.89, 74.27, 73.34 (C-2', C-3', C-5' α), 80.59, 72.47, 70.39 (C-2',
C-3', C-5' β), 59.29 (C-5'' α), 57.61 (C-5'' β), 12.52 (CH₃ α), 12.39 (CH₃ β);
MS EI: 270 (M+, 100%).

LNA ホスホロアミダイトの生成
実施例 122
4-N-ベンゾイル-LNA-C [(1R, 3R, 4R, 7S)-3-(4-N-ベンゾイルシトシン-1-イル)-1-(ヒドロキシメチル)-7-ヒドロキシ-2,5-ジオキサビシクロ [2.2.1] ヘプタン]。
LNA-C (式 Z) を無水エタノールに入れ、還流させながら熱した。還流溶液に無水安息香酸(2等量)を加え、反応をHPLC (溶出駅: 0.1M TEAA中20%アセトニトリル pH 7.0, 流量: 1ml/分、 Novapak C-18 分析用カラム)で追跡した。HPLCで生成物の増加が見られなくなるまで0.5〜2h間隔でさらに無水物を加えた。反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮した。残渣をエーテルで繰り返し洗浄し、濾過し、乾燥してオフホワイト色の固形物を得た。収量: 45%.

塩基が保護されたLNAヌクレオシド (LNA-C^Bz, LNA-T, LNA-G^iBu, LNA-A^Bz)のジメトキシトリチル化の一般的方法。
塩基が保護されたLNAヌクレオシドをピリジン (2x)と共に蒸発させ、ピリジン (〜10 ml/ヌクレオシドのg)中で塩化ジメトキシトリチル(1.5等量)と攪拌した。反応をHPLC (0.1M TEAA中50% アセトニトリル pH 7.0、5分間、10分間で50-100%
アセトニトリル、5分間で100% アセトニトリル、流量: 1 ml/分、Novapak C-18
カラム)で追跡した。出発材料の>95%が反応すると、反応混合物を氷中で冷却した。反応を冷たい飽和NaHCO₃ (〜15 ml xピリジンの容量)を加えて失活させた。混合物をジクロロメタン (3 x重炭酸ナトリウムの容量の半分)で抽出した。有機抽出物をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。残渣を真空中で乾燥し、ジクロロメタン中の0.5% ピリジンおよび 0-2% メタノールを溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製した。純粋な生成物を含む画分をあわせ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。残渣を無水アセトニトリル (3x)と共に蒸発させ、真空中で乾燥した。

保護された LNA ヌクレオシドのホスファイト化の一般的方法。
塩基が保護されたジメトキシトリチル-LNA ヌクレオシドを無水ジクロロメタン(2x)と共に蒸発させ、無水ジクロロメタン (A,G &T のヌクレオシドには10 ml/g、および Cには〜30 ml/g)に入れた。このビス(ジイソプロピルアミノ)(2-シアノエチル)ホスファイト(1.05-1.10 等量)に、テトラゾール(0.95 等量)を加えた。混合物を室温で攪拌し、次いで反応をHPLC (0.1M TEAA 中70% アセトニトリル、pH 7、2分間、 8分間で70-100% アセトニトリル、5分間で100% アセトニトリル 流量: 1 ml/分、 Novapak C-18 カラム)で追跡した。いったん反応が>90% まで進み、さらに攪拌してもアミダイト生成に増加が見られなくなると、混合物を氷中で冷却する。これをジクロロメタン (元の容量の〜15-20 倍)で希釈し、冷たい飽和重炭酸ナトリウム(2x)で洗浄し、次いで冷ブライン(1x)で洗浄する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。残渣を無水アセトニトリル (3x) と共に蒸発させ、真空中で一晩乾燥した。HPLC純度は 93-98%であった。

LNA ヌクレオシド 5'-トリホスフェートの生成
実施例 123
LNA ヌクレオシド 5'-トリホスフェートの合成。(Tetrahedron Letters 1988, 29 4525)。
13x100 mm のポリプロピレンチューブ内に1 mLピリジン(CaH₂で乾燥)にヌクレオシド37、 44, 51, 4-N-ベンゾイル化 57A または 61B (93.8 μmol)を懸濁した。溶液を高真空中にて乾燥するまでスピードバック（speedvac）で蒸発させた。残渣をアセトニトリル (CaH₂で乾燥)に2回再懸濁し、蒸発乾固させた。ヌクレオシドを 313 μL のトリメチルホスフェート(4Å モレキュラーシーブスで乾燥)に懸濁し、そこへ30.1 mgのプロトンスポンジ（Proton Sponge）（商標）(1.5 等量)を加えた。混合物を密閉し、攪拌し、0℃に冷却し、POCl₃ (9.8 μL, 1.1 等量) を攪拌しながら加えた。反応を0℃で2.5時間進行させた。この期間中、5 mLの水に469μmolsのピロリン酸ナトリウム(5 等量)を溶解し、5 mL のDow 50 H⁺ イオン交換樹脂に通過させた。排水が酸性に変わったらこれを220μLのトリブチルアミン中に集め、シロップ状になるまで蒸発させた。TBAピロリン酸を乾燥アセトニトリルと共に3回蒸発させた。最後に乾燥ピロリン酸を1.3 mL DMF (4Å
シーブス)に溶解した。2.5時間の反応時間後、TBAピロリン酸および130μL のトリブチルアミンをヌクレオシド溶液に激しく攪拌しながら加えた。1分後、反応を3 mLの0.1 M 酢酸トリメチルアンモニウム、pH 7.5を加えて失活させた。Mono Q クロマトグラフィによるアッセイにより、49%のヌクレオシド 5'-トリホスフェートが見られた。 反応混合物を水で100 mLに希釈し、Qセファロースイオン交換カラムに吸収させ、水で洗浄し、5 mM 硫酸ナトリウム中の0〜700 mM NaCl、pH 7.5の線勾配で溶出させた。トリホスフェートを含む画分をMono Q イオン交換クロマトグラフィでアッセイした。トリホスフェートを含む画分をプールし、NaCl飽和点まで濃縮した。生成物をC18カートリッジで脱塩した。トリホスフェートをUV 分光法で数値化し、10 mM 溶液に調整した。収量は17 - 44%であった。この方法で調製したLNA ヌクレオシドは U, T, A, GおよびCであった。

LNA 修飾オリゴヌクレオチドの調製
実施例 124
式 V, X, Y および Z^T, Z^U, Z^G, Z^C, Z^A, Z^MeCのLNAを含むオリゴヌクレオチドの合成。
二環式ヌクレオシド 3'-O-ホスホロアミダイト類似体8, 19, 30, 39, 46, 53, 57D, 61D, および66ならびに市販の3'-O-ホスホロアミダイトを、タイプV, X, Y
ならびに Z^T, Z^U, Z^G, Z^C, Z^A, および Z^MeCのLNAを1つ以上含む本発明のLNA オリゴヌクレオチドの例を合成するために使用した(0.2 〜 5μmol スケール)。合成したLNA オリゴヌクレオチドの純度および組成は毛管ゲル電気泳動および/またはHPLCおよび/またはMALDI-MSで確認した。一般的に、十分な結合効率は全てのモノマーで得られた。最良の結合効率(〜95-100%)は LNA39, 46, 53, 57D, 61Dおよび66 (式ZのLNAモノマーへ導く)で得られ、完全修飾LNAオリゴヌクレオチドを生成する際、またはLNAを非修飾DNAまたはRNA 鎖またはLNAを全-ホスホロチオエート オリゴヌクレオチドに組み込む際に非常に満足のいく結果を生じさせる。 LNAオリゴヌクレオチドを純水に溶解させ、濃度をOD₂₆₀として測定する。可溶性は全ての場合において良好であった。単純な DNA/RNA 合成および部分修飾LNAオリゴマーにおいては、標準CPG支持体またはポリスチレン支持体を使用する。完全修飾LNA

を合成する際にはBioGenex Universial CPG 支持体(BioGenex, U.S.A.) またはLNA 誘導化支持体を使用する。)

実施例 125
ホスホロチオエート LNA オリゴヌクレオチドの合成。
全てのホスホロチオエート LNA (表7)を自動DNAシンセサイザーにて上記と同様の条件(実施例 124)で合成した。Beaucages' 試薬を硫化剤として使用した。段階的結合により、収量>98%を得た。合成終了後、固形支持体からの脱保護および開裂は濃縮アンモニア(55℃, 14時間)を用いて効果的に行った。

実施例 126
2'-チオ-LNA オリゴヌクレオチドの合成。
2'-thio-LNAオリゴヌクレオチド(モノマーU^Sを含む (図2の式Z (チオ-変異体))、図37、表8)を標準条件を用いて(実施例 124)自動DNAシンセサイザーで合成した。段階的結合により、アミダイト76Fの収量は約85% (12分間結合;上昇したアミダイト76Fの純度は結合収量の増加をもたらすと考えられる)であった。合成終了後、固形支持体からの脱保護および分割は濃縮アンモニア(55 ℃, 8時間)を用いて効果的に行った。

実施例 127
2'-アミノ-LNA オリゴヌクレオチドの合成。
実施例126に記載のと同様の手順により、2'-アミノ-LNA オリゴヌクレオチド(モノマーT^NHおよびモノマーT^NMeを含む (図2の式Z (アミノ変異体)),図35および36)をアミダイト74A および74Fを用いて自動DNAシンセサイザーで効果的に得た(段階結合収量≧98%)。

実施例128
LNAオリゴマーのフルオレセイン標識。

を製造者(Promega)の記載にしたがってFluoroAmp T4キナーゼ緑色オリゴヌクレオチド標識システムでフルオレセインを用いて首尾よく標識した。簡単に、16 nmol のLNA-オリゴマー AL16またはAL17のどちらかをT4キナーゼおよびγ-S-ATPを含む 50μl の反応緩衝液中で5'-チオホスフェート標識した。反応を37℃で2時間インキュベートした。チオリン酸化 LNAオリゴは 5μl のオリゴヌクレオチド沈殿剤(Promega)および165 μl の氷冷(-20℃) 95 % エタノールを加えて析出させた。遠心分離した後、ペレットを500 μl の氷冷(-20℃) 70% エタノールで一回洗浄し、25 μl のPBSE緩衝液に再び溶解した。調製したばかりの5-マレイミド-フルオレセイン溶液(5 μl DMSO中50 μg)を チオリン酸化 LNA オリゴに加え、反応混合物を68℃で30分間インキュベートした。5-マレイミド-フルオレセイン(5 μl DMSO 中50 μg)をそれぞれのLNAオリゴにさらに加え、反応混合物をさらに60分間インキュベートした。インキュベート後、10 μl のオリゴヌクレオチド析出物を各反応混合物に加え、次いで180 μl の氷冷(-20℃)および100
μl のN,N-ジメチルホルムアミドを加えた。フルオレセイン標識したLNAオリゴを遠心分離で分離し、次いで上澄を吸引除去した。フルオレセイン標識したLNA-オリゴマーを逆相HPLCで次のように精製した:カラム Delta-Pack C-18, 300A, 0.4 x 30 cm; 溶出液 0.04 Mトリエチルアンモニウム緩衝液(pH 7.0)中0-50 % アセトニトリル; 流量 1.5 ml/分。 LNA-オリゴを含む画分をプールし、減圧下で12時間蒸発させた (オイルポンプおよびスピードバック システム)。

ハイブリッド化データ
実施例 129
式V, X, Y およびZ^T, Z^U, Z^G, Z^C, Z^A, Z^MeCのモノマーを含むオリゴヌクレオチドの耐熱性。
LNA修飾オリゴヌクレオチドの耐熱性を温度調節されたペルチエ エレメント（Peltier element）を備えた分光光度計で測定した。3つの異なる緩衝液(10mM Na₂HPO₄, pH 7.0, 100mM NaCl, 0.1mM EDTA; 10mM Na₂HPO₄ pH 7.0, 0.1mM EDTA; 3M テトラメチルアンモニウムクロリド(TMAC), 10mM Na₂HPO₄, pH 7.0, 0.1mM EDTA)のいずれか、および等モル (1 μM または 1.5 μM)量の異なるLNA修飾オリゴヌクレオチドおよびその相補的またはミスマッチDNA または RNA オリゴヌクレオチドを含むハイブリッド混合物1 mlを調製した。同一のハイブリッド混合物を非修飾オリゴヌクレオチドを用いて基準として調製した。Tm'sを最初の誘導体の融解曲線として得た。表1〜4に結果を要約する(LNAは太字で表す)。図2に使用したモノマーLNAを示す。V, X, Y および Z^T, Z^U, Z^G, Z^C, Z^A, Z^MeCの命名は図2のV, X, YおよびZの構造を参照する。表中、LNAモノマーの核塩基をインキュベートした。さらに、最後の２つの表のLNA構造Zのチオおよびアミノ変異体について使用した命名はそれぞれ例えばZ^TS および Z^TNHであった。

構造Zを含むLNAを特に徹底的に試験した(表1参照)。3つのZ^T 残基を混合配列オリゴヌクレオチドに組み込むときは、相補的DNA (10) およびRNA (16) オリゴヌクレオチドの両方についてNaCl緩衝液中で得られたTm's(修飾毎に対してRNA: 約7℃ DNA: 約5 ℃)は、非修飾オリゴヌクレオチド(1および8)の対応する二重らせんのTmよりも実質的に高かった。同様の結果が2つのZ^T 残基およびZ^G (21および24B) またはZ^U (25)のいずれか1つ、 Z^C (69), Z^MeC (65), ならびにZ^A (58) 残基を含むLNAからも得られた。標的RNAまたはDNA オリゴヌクレオチドにミスマッチが導入されるときは、LNA修飾オリゴヌクレオチドのTmは全ての場合において顕著な低下を示し(11-15Aおよび17; 18-20および22-24A; 26-31; 57および59-60; 63-64および66, ならびに67)、ワトソン-クリック水素結合法則に従ってLNA修飾オリゴヌクレオチドが標的配列にハイブリッドすることが明白に証明される。全ての場合において、ミスマッチの導入によるLNA修飾オリゴヌクレオチドのTmの低下が対応する非修飾オリゴヌクレオチド (2-7および9; 33-38)のそれと同等かまたはそれよりも大きいことは、LNA修飾オリゴヌクレオチドが少なくともその天然の対応物と同じくらい特異的であることを示している。ハイブリッド化緩衝液のイオン強度の低下 (10mM Na₂HPO₄, pH 7.0, 100mM NaCl, 0.1mM EDTAから10mM Na₂HPO₄ pH 7.0, 0.1mM EDTA)により、相補的DNAオリゴ(40,41)またはRNAオリゴヌクレオチド(40A, 41A)についてのLNA修飾オリゴヌクレオチドのTmが低下する。同様の効果が非修飾オリゴヌクレオチドおよびその相補的DNAオリゴ(39)またはRNAオリゴ(39A)について見られる。

3Mテトラメチルアンモニウムクロリド(TMAC)をハイブリッド化緩衝液に加えることにより、相補的DNAオリゴ(10,21,25)についてのLNA修飾オリゴヌクレオチドのTmが顕著に増加する。さらに、TMACがNaCl緩衝液中で見られる異なるオリゴヌクレオチドのTmの差 (TMAC中で56℃および57℃に対し、NaCl緩衝液中で最低Tm 44℃、最高49℃)を均一化する。ミスマッチの導入により、DNA標的(11-13, 18-20および26-28)についてのLNA修飾オリゴヌクレオチドのTmが顕著に低下する。同様の情況が非修飾の基準オリゴヌクレオチド(1-4および32-35)において現れる。

低塩緩衝液のデータより、LNA修飾オリゴヌクレオチドが正常オリゴヌクレオチドと同様、ハイブリッド化緩衝液のイオン強度に対する感度を示すことが示される。TMAC緩衝液のTmデータから、TMACがLNA修飾オリゴヌクレオチドに対して、正常DNAオリゴヌクレオチドに対する効果と同様のTm等化効果を示すと推論される。LNA修飾オリゴヌクレオチドは両方のハイブリッド化緩衝液において完璧な特異性を保持する。

４つのモノマー全てを含む完全修飾LNAオリゴヌクレオチド(71および75)、Z^GおよびZ^Tの両方を含むほぼ完全な修飾LNAオリゴヌクレオチド(41および41A)(3'-末端DNAヌクレオシドを除く)、ならびにZ^TおよびZ^Gの中心ブロックを含む部分修飾オリゴヌクレオチド(40および40A)もまた、非修飾の対照オリゴヌクレオチド(39および39A; 1および8)に比較して実質的に増大した親和性を示す。これにより式ZのLNAが完全および部分修飾オリゴマーの両方の調製において非常に有用であることがわかる。我々はほぼ完全な修飾オリゴマー(41および41A)が相補的RNA(>93℃)およびDNA(83℃)の両方について無比の高親和性を示すことに注目する。同様の極端な親和性(RNAおよびDNAの両方について)がZ^Tのみを含むほぼ完全な修飾LNAオリゴマー(表1: 52および53)および完全修飾LNAオリゴマー(71および75)について見られる。部分修飾ポリ-Tオリゴヌクレオチドの親和性は、組み込まれるZ^Tモノマーの位置および数に依存する(44-51)。しかしながら全ての場合において、RNA標的のTm's (45, 47, 49および51)は、DNA標的(46)で低いTmを示す対応する非修飾オリゴヌクレオチド(43)よりも高かった。3つのZ^T残基を含む混合配列オリゴヌクレオチドは非修飾の基準オリゴヌクレオチド(1および8)と比較して、DNA(10)およびRNA標的(16)について実質的に高い親和性を示したため、ワトソン-クリック以外の他の結合モチーフ(例えばフーグスティーン結合モチーフ)はポリ-Tオリゴヌクレオチドに対して開放性であること、またこれら結合モチーフは修飾オリゴヌクレオチドの正確な構造に対してある程度感受性であることを示唆している。全ての場合において、単塩基ミスマッチを完全Z^T修飾ポリ-TオリゴヌクレオチドとDNA標的(54-56)の間の複合体に導入することにより、Tmの顕著な低下が生じる。

構造V (表2), X (表3) およびY(表4)のLNAのいずれかを含むオリゴヌクレオチドを完全および部分修飾ポリ-T配列を考慮して分析した。構造VおよびYの完全修飾オリゴヌクレオチドは非修飾オリゴヌクレオチド(表1, 42および43)と比較して、RNA (表2, 14および表4, 14) およびDNA (表2, 13および 表4, 13)標的の両方についてTmの増加を示した(Z^T修飾オリゴヌクレオチドよりはるかに低いにもかかわらず)。構造VおよびYのモノマーを含む部分修飾オリゴヌクレオチドはZ^Tを含む部分修飾オリゴヌクレオチドと同様に機能した。これは上記にて説明した配列のホモポリマー特性によるものと思われる。X^Tを含むオリゴヌクレオチドは全ての場合において基準のDNAオリゴヌクレオチドと比較してさらに低いTmを示した。

実施例 130
逆平行および平行配向の両方において、完全修飾LNAオリゴヌクレオチドは相補的DNAで安定なハイブリッドを形成する。
完全修飾LNAオリゴヌクレオチドを逆平行および平行配向の両方において相補的DNAにハイブリッドした。ハイブリッド化溶液(1 mL)は10 mM Na₂HPO₄ (pH 7), 100 mM NaClおよび0.1 mM EDTAおよびそれぞれ1 μMの2つのオリゴヌクレオチドを含む。表1に示すように、逆平行(71) および平行結合配向(77)の両方は安定な二重らせんを形成する。逆平行は明らかに２つのうちで最も安定している。しかしながら、平行二重らせんでも非修飾 DNA オリゴヌクレオチドの対応する逆平行二重らせんよりはるかに安定である(表1, 1)。

実施例 131
LNAモノマーは、相補的核酸についてのRNAオリゴマーの親和性を増加するために使用することができる。
3つのLNA-T モノマー(Z^T)を含む9-量体 RNA オリゴヌクレオチドと相補的DNAまたはRNAオリゴヌクレオチドとの間の複合体の耐熱性を分光光度で測定した。10mM Na₂HPO₄, pH 7.0, 100mM NaCl, 0.1mM EDTA およびそれぞれ1μMの２つのオリゴヌクレオチドを含むハイブリッド化溶液(1 ml)。非修飾RNAオリゴヌクレオチドを用いた同一のハイブリッド混合物を基準として測定した。表5に示すように、LNA修飾RNAオリゴヌクレオチドは相補的DNA (1)およびRNA(3)オリゴヌクレオチドの両方にハイブリッドする。先にLNA修飾DNAオリゴヌクレオチドについて見られたように、LNA修飾RNAオリゴヌクレオチドの結合親和性はRNA相補体(3)に対して最も強かった。両方の場合においてLNA修飾RNAオリゴヌクレオチドの親和性は実質的に非修飾の対照(2および4)のそれよりも高かった。表5により、DNAおよびRNA標的にの両方対する特異性がLNA修飾RNAオリゴヌクレオチド中に保持されていることがわかる。

実施例 132
LNA-LNA塩基対。
3つのZ^T LNA モノマーまたはLNA Z モノマーから全て構成されるオリゴヌクレオチドを含むRNAまたはDNAオリゴヌクレオチドを相補的非修飾DNAオリゴヌクレオチドまたは3つのZ^A LNAモノマーを含むDNAオリゴヌクレオチドにハイブリッドした。ハイブリッドのTmは分光光度で測定した。10mM Na₂HPO₄, pH 7.0, 100mM NaClおよび0.1mM EDTAおよびそれぞれ1 μM の2つのオリゴヌクレオチドを含むハイブリッド化溶液(1 ml)。 表6に示すように、全てのLNA修飾オリゴヌクレオチドは相補的非修飾DNAオリゴヌクレオチド(2および3)および相補的LNA修飾オリゴヌクレオチド(4, 5および6)にハイブリッドした。先に見られたように、ハイブリッド(2および3)中の1つの鎖中のLNAモノマーの存在により非修飾の対照ハイブリッド(1)と比較してT_Mが顕著に増加する。ハイブリッド中のLNA-LNA塩基対の存在によりT_Mがさらに増加する(4および5)。さらに、完全修飾LNAオリゴヌクレオチドおよび部分LNA-Z^A修飾DNAオリゴヌクレオチド(6)の間で高安定ハイブリッドを形成することができる。これによりハイブリッド中のLNA-LNA塩基対の第1の例が構成される。

実施例 133
LNA 全-ホスホロモノチオエート オリゴヌクレオチドでは相対的に相補的DNAおよびRNAに対する耐熱性が、対応する全-ホスホロチオエート DNA オリゴヌクレオチドよりも減少しない。
3つのZ^T LNA モノマーを含む全-ホスホロモノチオエート DNA オリゴヌクレオチド(LNAオリゴヌクレオチド)および対応する全-ホスホロモノチオエート 基準DNAオリゴヌクレオチドの相補的DNAおよびRNAに対する耐熱性を、EDTAを使用しないこと以外は実施例132に記載の条件と同一の条件下で評価した(表7)。3つのZ^T LNA モノマーを含むLNA 全-ホスホロモノチオエート オリゴヌクレオチドは対応する基準 LNA オリゴヌクレオチド(表1, 10および16)と比較して、耐熱性においてわずかな減少を示した(表7, 3および4)。対応する全-ホスホロモノチオエート
DNA オリゴヌクレオチド(表7, 1および2)は対応する基準DNA オリゴヌクレオチド(表1, 1および8)と比較して、耐熱性において顕著な減少を示した。これはアンチセンスにおける全-または部分的ホスホロモノチオエート LNA オリゴヌクレオチドの使用および他の治療的使用への重要な起こりうる影響を有する。したがって、LNAモノマーおよび非修飾モノマーのホスホロモノチオエート オリゴヌクレオチドでの適合性が証明された。このような構造がLNA増強ハイブリッド特性に加え、Rnaseリボヌクレアーゼ H 活性およびヌクレアーゼ耐性を示すことが考えられる。

実施例 134
2'-チオ-LNAはLNA(モノマーZ)に匹敵する核酸認識特性を示す。
ハイブリッド条件はEDTAを使用しないこと以外は実施例132に記載の条件と同様であった。2'-チオ-LNA(表8)の結果は2'-チオ-LNAモノマーU^S(メチレンオキシ架橋がメチレンチオ架橋で置換されている図2の式Zに対応するモノマー)の導入によるDNAおよびRNAの両方に対する二重らせんの耐熱性における正の効果を明確に示している。この効果(△Tm 〜 +5℃ / DNAへの修飾; △Tm 〜 +8℃ / RNAへの修飾)は親LNAで見られる効果に匹敵する。情況は2つの修飾を同時に導入することにより複雑になった(2'-チオ官能性およびチミンのかわりのウラシル)。しかし、LNAチミンとウラシルモノマーで同一の融点が先にみられ、かつチミンのかわりに2'-デオキシウリジンを含む基準のように、Tm値を減少させるのであれば、この比較は意義がある。

実施例 135
2'-アミノ-LNA (モノマーZ^TNH)および2'-メチルアミノ-LNA (モノマーZ^TNMe)は親LNA(モノマーZ)に匹敵する核酸認識特性を示す。
ハイブリッド化条件はEDTAを使用しないこと以外は実施例132に記載の条件と同様であった。2'-アミノ-LNAを溶融した結果(表9)は2'-アミノ-LNAモノマーT^NHまたはT^NMe のいずれか(メチレンオキシ橋かけがメチレンアミノ橋かけまたはメチレン-(N-メチル)アミノ橋かけでそれぞれ置換されている図2の式Zに対応するモノマー) を導入することによるDNAおよびRNAの両方に対する二重らせんの耐熱性における正の効果を明確に示している。この効果(△Tm 〜 +3℃ / DNAへの修飾および△Tm 〜 +6〜+8℃/ RNAへの修飾)は親LNAの効果に匹敵する。増大した熱親和性が2'-アルキルアミノ-LNAモノマーおよび非アルキル化2'-アミノ-LNAモノマーの混合物からなるオリゴにおいても見られることは注目に値する。

酵素の基質としてのLNAおよびLNA修飾オリゴヌクレオチド

実施例 136
オリゴマー 5'-V^T ₁₃Tおよび5'-Z^T ₁₃Tの3'-エキソ核酸分解性（Exonucleolytic）安定性。
2 mlの緩衝液(0.1 M Tris-HCl, pH 8.6, 0.1 M NaCl, 14 mM MgCl₂)中のオリゴヌクレオチド(0.2 OD)溶液を25℃で1.2 U SVPDE(ヘビ毒ホスホジエステラーゼ)を用いて温浸した。温浸中、260 nmで吸収度の増加が生じた。非修飾の対照T₁₄は10分の分解で完全に分解されたが、5-Z^T ₁₃Tおよび5'-V^T ₁₃Tは60分間変化しないままであった。

実施例 137
T4 ポリヌクレオチドキナーゼの基質としてのLNA修飾オリゴ。

をT4 ポリヌクレオチドキナーゼ (5ユニット; New England Biolabs)と70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl₂, 5 mM ジチオトレチオールを含む緩衝液(最終容量20 μl)中の6 μl γ^-32PATP (3000 Ci/mmol, Amersham)と混合した。試料を37℃で40分間インキュベートし、次いで65℃で5分間熱した。各反応に2μlのtRNA(1μg/μl),29μlの3M酢酸アンモニウムおよび100μlのエタノールを加えた。反応を-20℃で30分間インキュベートし、標識オリゴを15000gで30分間遠心分離して析出させた。ペレットを20 μl のH₂Oに再び懸濁した。 試料(1 μl)をローディング緩衝液(ホルムアミド(pH 8.0), 0.1 %キシレンシアノール FF, 0.1 % ブロモフェノールブルーおよび10 mM EDTA)と混合し、TBEランニング緩衝液(90 mM
Tris-HCl (pH 8.3), 90 mM ホウ酸および 2.5 mM 2ナトリウムEDTA-2 H₂O)中の変性ポリアクリルアミドゲル(16 % アクリルアミド/ビスアクリルアミド溶液, 7
M尿素, 1 X TBE および0.1 mM EDTA)で電気泳動させた。ゲルをゲル乾燥器(BioRad model 583)で乾燥し、X線フィルム(CL-XPosure フィルム, Pierce 34075)に20分間オートラジオグラフした。結果を図6に示す(FP2: レーン1および2; AL2:レーン3および4; AL3: レーン5および6)。この実験に基づき、3つの結論が導き出される。第1に、部分および完全修飾オリゴは、ポリヌクレオチドキナーゼのような核酸特異酵素の基質として機能する能力において、天然核酸の優れた模倣物である。第2に、LNA修飾オリゴは標準的な核酸を析出する際に通常採用される手順によって効率よく析出することができる。実際に、オートラジオグラムにおける非修飾オリゴ(レーン1,2)、部分修飾オリゴ(レーン 3,4)、および完全修飾オリゴ(レーン5,6)の相対的なシグナル強度は、標準のDNAオリゴがLNAヌクレオシドを多く含むほど、標準のDNAオリゴがより効果的に塩/アルコール工程によって析出することができることを示唆している。第3に、オートラジオグラムにおける非修飾オリゴ、部分修飾オリゴおよび完全修飾オリゴのシグナル位置が近いことはLNAヌクレオシドのDNAオリゴへの組み込みがポリアクリルアミドゲル中での電気泳動運動性を変化させないことを示している。

実施例 138
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いたLNA含有オリゴヌクレオチドの3'-末端標識。
LNAモノマーを含むオリゴヌクレオチドを酵素のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて3'-末端標識した。配列およびLNA修飾の程度は次の通りである(LNAモノマーは太字):

オリゴヌクレオチド(50 pmol)を、250 μl の100mM カコジル酸塩緩衝液 pH 7.2, 2mM CoCl₂および0.2mM 2-メルカプトエタノール中の100ユニットの250 μCi [α^-32P]ddATP (3000 Ci/mmol)とターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼと37℃で2時間インキュベートした。次いで反応をホルムアミドローディング緩衝液を加えて停止し、100℃で5分間熱し、その後氷上に置いた。試料(0.2 pmol)を7M 尿素を含む19% アクリルアミドゲルに流し、オリゴヌクレオチドバンドへの放射活性の取り込み率をリンイメージャー（phosphorimager）(Molecular Dynamics)を用いて数値化した。この結果は全ての場合におけるLNA含有量が高いオリゴヌクレオチドを含む放射活性の取り込みを示す:コントロール 94.9%, (1) 39.7%, (2) 83.7%, (3) 31.7%。LNA修飾オリゴはTdT酵素の基質であると断定する。

実施例 139
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)のLNA修飾オリゴヌクレオチド末尾への能力はオリゴマーデザインに依存する。
次の15量体プライマーおよび8〜32塩基オリゴヌクレオチドマーカー混合物を[γ^33P] ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼで 5'末端標識した (LNAモノマーは太字):

標識後、反応を5分間沸騰させ、すべてのPNK活性を除去した。4 pmoleの各標識プライマー、25 U ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼおよび16 μM dATPを25 μlの100 mM カコジル酸塩緩衝液pH 7.2, 2 mM CoCl₂および0.2 mM 2-メルカプトエタノール中で37℃で9分間インキュベートした。反応をホルムアミド停止液を加えることにより停止し、反応生成物を19%ポリアクリルアミド7 M尿素ゲルに標識マーカーと共に流した。Biomax フィルムを用いたオートラジオグラフィを乾燥ゲル上で行った。図22に示すように、P1 (レーン2), P2 (レーン 4) およびPZ1 (レーン 3)は8-32塩基標識に基づき、全て概算で70 塩基以上の末尾（tail）を得た(レーン1および6)。プライマーPZ2 (レーン 5)はこの反応条件では伸長しなかった。TdT酵素はオリゴヌクレオチド中のLNAモノマーに対して耐性であるが、最終の 3'末端に対してはそうではないことがいえる。

実施例 140
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)の基質としてのLNA-チミジン-5'-トリホスフェート (LNA-TTP)。
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)の基質として受容されるLNA-TTPのトリホスフェート(実施例123)の能力を試験するために、オリゴヌクレオチド末尾（tail）反応を行った。15量体プライマー(配列: 5'-TGC ATG TGC TGG AGA-3')および8〜32塩基オリゴヌクレオチド標識の混合物を[γ^33P]ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて5'末端標識した。標識後、反応を5分間沸騰させてすべてのPNK 活性を除去した。4pmoleの標識プライマー、25 U ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼおよび32, 64または128 μM のdTTPまたはLNA-TTPを25 μl の100 mM カコジル酸塩緩衝液pH 7.2, 2 mM CoCl₂および0.2 mM 2-メルカプトエタノール中で37℃で90分間インキュベートした。反応をホルムアミド停止液を加えることにより停止し、反応性生物を19% ポリアクリルアミド 7M 尿素ゲルに標識マーカーと共に流した。Biomax フィルムを用いたオートラジオグラフィを乾燥ゲル上で行った。図10に示すように、32 μM のdTTP (レーンB), 64 μM のdTTP (レーンC)または128 μM のdTTP (レーンD)のいずれかを用いた反応は全て(一番左と右のレーン)、8-32 オリゴヌクレオチド標識に基づくと100ヌクレオチド以上と推定される追跡オリゴヌクレオチドを生成した。LNA-TTP反応(32 μM のdTTP (レーン E), 64 μM のdTTP (レーン F) または 128 μM のdTTP (レーン G))は全て、1つの塩基で伸長したプライマーおよびそれ以上の塩基で伸長した〜50%のプライマーを生じた。この結果はリボヌクレオチド および TdTにおいて得られた結果と酷似している。LNA誘導トリホスフェートはTdT 酵素によって認識され、DNAオリゴヌクレオチドに組み込まれる。 LNA-TTPがポリメラーゼに結合できるというこの後者の発見はヌクレオシド製剤として LNA-モノマー誘導体を使用することができることを強調している。

実施例 141
エキソヌクレアーゼのないクレノーフラグメントDNAポリメラーゼ IはLNAアデノシン、シトシン、グアノジンおよびウリジン-5'-トリホスフェート(LNA ATP, LNA CTP, LNA GTP, LNA UTP)をDNA鎖に組み込むことができる。
LNA NTP's (実施例123を参照)およびリボヌクレオチドをエキソヌクレアーゼのないクレノーフラグメントDNA ポリメラーゼI (EFK)の基質として評価するためにプライマー伸長アッセイを使用した。³³P 5' 末端標識15量体プライマーを使用したアッセイは、4つの異なる24量体テンプレートのうちの1つにハイブリッドした。プライマーおよびテンプレートの配列は(LNAモノマーは太字):

1 pmoleの³³P標識プライマーをx2 クレノー 緩衝液中の2 pmoleのテンプレートにハイブリッドした。これに4μM のdNTPαS または 500μM のLNA NTP あるいは4μM のdNTPαS と 500μM のLNA NTPの混合物のいずれかを加えた。EFK DNA ポリメラーゼの2ユニットを各反応に加えた。2mU 無機ピロホスファターゼを各反応に加えた。プライマーおよびテンプレートおよび酵素コントロールも同じく行った。全ての反応は全容量20μlで行った。反応を37℃で3分間インキュベートした。次いで反応を10μl ホルムアミドEDTA停止液を加えて停止した。反応性生物を19% ポリアクリルアミド7M尿素ゲルで分離し、Kodak Biomax オートラジオグラフィフィルムに露出した後、生成物の画分を³³P 標識8-32塩基オリゴヌクレオチドラダー（ladder）と比較しながら大きさで分離した。

図20にテンプレート1を用いたLNA-UTPの結果を示す。トラック(1-12)は以下の反応に対応する:EFKによるLNA UTPの組み込み。レーン1 − プライマー、テンプレートおよび酵素。レーン2 − プラス dTTPαS。 レーン3 − プラス LNA UTP。レーン4 − プラス dTTPαS およびdGTPαS。レーン5 - プラス LNA UTP およびdGTPαS。 レーン 6 - プラス dATPαS, dGTPαS およびdTTPαS。レーン 7 -
プラス LNA UTP, dCTPαS, dGTPαS およびdTTPαS。 レーン 8 - プラス dGTPαS。レーン 9 - プラス dCTPαS, dGTPαS およびdTTPαS。 レーン 10 - プラスLNA UTP, dATPαS, dCTPαS およびdGTPαS。 レーン 11 - プラス dATPαS, dCTPαS および dGTPαS。 レーン12 - 全 4つのdNTPαS全て。どちらのレーンも生成物を大きさ分類するために使用した8 - 32塩基オリゴヌクレオチド標識を示す。

図20から明らかなように、LNA UTP は特に"T"として組み込まれる。dNTPαSでのLNA UTP 終結 3'末端からのさらなる伸長は非常に緩慢である。

図21にテンプレート2-4を使用したLNA-ATP, LNA CTPおよび LNA GTPの結果を示す。トラック(1-21)は以下の反応に対応する: レーン1, 7, 13 および17 - プライマー、テンプレートおよび酵素。 レーン2 - プラス dGTPαS。 レーン3 - プラス dATPαS および dGTPαS。 レーン4 - プラス LNA GTP。 レーン5 - プラス dGTPαS および LNA ATP。 レーン 6 - プラスLNA ATP および LNA GTP。レーン8 - プラス dATPαS。レーン9 - プラス dATPαS および dCTPαS。 レーン10 - プラス LNA ATP。 レーン11 - プラス dCTPαS および LNA ATP。 レーン 12 - プラス dATPαS および LNA CTP。 レーン14 - プラス dTTPαS。 レーン15 - プラス dGTPαS および dTTPαS。 レーン 16 - プラス dTTPαS および LNA GTP。 レーン 18 - プラス dCTPαS。 レーン 19 - プラス dCTPαS およびdTTPαS. レーン 20 - プラス LNA CTP. レーン21 - dTTPαS および LNA CTP. どちらのレーンも生成物を大きさ分類するために使用した8 - 32塩基オリゴヌクレオチド標識を示す。

テンプレート2を用いた実験(トラック1-6)により、LNA GTPがプライマーを効果的に伸長して(トラック4)+1 生成物を生成することができることがわかる。dGTPαS および LNA ATPを加えることにより、主に+2生成物(トラック 5)が生じる。これはdGTPαSを取り込むことによって +1 生成物を得、次いでLNA ATPでの伸長が生じることによる。LNA ATPを連続して取り込むことから少量の +3 生成物の徴候がある。テンプレート3を使用した実験(トラック7-12)により、LNA ATP が効果的に取り込まれて +1 生成物が生じたことがわかる(トラック10)。この生成物のdCTPαSでの伸長は緩慢である(トラック11)。dATPαSおよびLNA CTPを加えることにより、 +2 および +3 生成物が生じる(トラック12)。示唆的な +1 生成物が存在しないことにより、最初のLNA CTPの添加が効果的であり、2回目の LNA
CTPの添加が緩慢であることがわかる。 テンプレート1(トラック13-16)および4(トラック17-21)を用いた実験結果から、他のテンプレートにおける結果の同様の傾向がわかる。LNA CTPは効果的に取り込まれてテンプレート4で+1生成物を生じさせる(トラック20)。 この生成物のdTTPαS による伸長はまた緩慢である（トラック 21）。LNA GTP および dTTPαS をテンプレート1の反応に加えることにより、+2 生成物が生じる(トラック16)。 これはまた、一回のLNA トリホスフェートの添加は効果的であるが、連続的なLNA トリホスフェートの添加は緩慢であることを示す。

実施例 142
LNAモノマーはエキソヌクレアーゼIIIによる消化に対するオリゴヌクレオチドの耐性を向上するのに使用することができる。
オリゴヌクレオチドを含むLNAのエキソヌクレアーゼIII分解への耐性を試験するため、以下の反応を行った。以下の15量体プライマーおよび8-32塩基オリゴヌクレオチドマーカーを[γ³³P] ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼで5'末端標識した(LNAモノマーは太字):

標識後、反応を5分間沸騰させてすべてのPNK活性を除去した。8 pmoleの各プライマーを25 pmoleテンプレート(配列: 3'- ACG TAC ACG ACC TCT ACC TTG CTA-5')にx2 クレノー緩衝液中でハイブリッドした。10ユニットのエキソヌクレアーゼIIIを各反応に加えた。コントロールは酵素の代わりに1μlの水を加えて設定した。反応を37℃で5分間インキュベートした。反応を10μl ホルムアミド/EDTA停止液を加えて停止した。反応を19%ポリアクリルアミド7M尿素ゲルに入れる前に95℃で3分間熱した。ゲルを3MM の紙に移して乾燥する前に10%酢酸/10%メタノール中で固定した。乾燥したゲルを3時間蛍光体スクリーンに暴露した。蛍光体スクリーンをイメージクアント（ImageQuant）ソフトウエアを用いて分子力学ストーム（Molecular Dynamics Storm） 860装置で分析した。蛍光体スクリーン分析により、酵素の非存在下ではP2全長帯(full length band)はシグナル中99%、PZ2全長帯はシグナル中96%であった。酵素の存在下では、5分間のインキュベート後、20%のP2全長生成物のみが残留した。しかしながら同処理後、62%の全長PZ2生成物が残留していた。これはオリゴヌクレオチドの3'末端の一個のLNAモノマーがエキソヌクレアーゼIIIによる分解に対する耐性を増強させることができることを示している。

PCRの応用
実施例 143
LNAモノマーはビオチン化-DNAオリゴの性能を、MTPフォーマットでのPCRアンプリコンの配列特異的捕捉において、顕著に増加させるために使用することができる。pUC19からの2つのDIG標識アンプリコンをPCR増幅により以下のように生成した:

アンプリコン 1のPCR 反応混合物
1μl pUC19 (1 ng/μl),
1μl 逆プライマー(5'-AACAGCTATGACCATG-3') (20μM),
1μl 前進（forward）プライマー (5'- GTAAAACGACGGCCAGT-3') (20 μM),
10 μl dUTP-mix (2 mM dATP, 2 mM dCTP, 2 mM dGTPおよび6mM dUTP),
1.5 μl DIG-11-dUTP (1 mM)
10 μl 10x Taq緩衝液(ベーリンガー・マンハイム 含MgCl₂)
1 μl Taqポリメラーゼ(ベーリンガー・マンハイム) 5 U/μl
H₂O まで 100 μl

アンプリコン 2のPCR 反応混合物
1μl pUC19 (1 ng/μl),
0.4 μl プライマー3 (5'-GATAGGTGCCTCACTGAT-3') (50 μM),
0.4 μl プライマー4 (5'-GTCGTTCGCTCCAAGCTG-3') (50 μM),
10 μl dUTP-mix (2 mM dATP, 2 mM dCTP, 2 mM dGTP および 6mM dUTP),
1.5 μl DIG-11-dUTP (1 mM)
10 μl 10x Taq緩衝液 (ベーリンガー・マンハイム 含MgCl₂)
1 μl Taqポリメラーゼ (ベーリンガー・マンハイム) 5 U/μl
H₂O まで 100 μl

PCR反応: (サイクラー: パーキン・エルマー 9600) 94℃、5分間; ポリメラーゼ添加; 94℃1分間, 45℃1分間、70℃ 2分間 (29 サイクル)、 72℃10分間。

各PCR反応から10 μl を標準アガロースゲルで分析したところ、約100 bpおよび500 bpの予想画分が見られた。

10 μlのDIG-標識アンプリコン 1またはアンプリコン 2を1xSSC (0.15 M NaCl,
15mM クエン酸, pH 7.0)中で5 pmolの5'ビオチン化捕捉プローブと全容量450 μlで混合した。以下の捕捉プローブを使用した:

アンプリコンを変性するために反応を95℃で5分間熱し、25℃で15分間冷却し、プローブと標的アンプリコン鎖とのハイブリッドを促進した。ハイブリッド後、190μlの各反応をストレプタビジンを塗布したマイクロプレート(Pierce, cat. no.15124)に移し、37℃で1時間インキュベートした。プレートをリン酸緩衝生理食塩水(PBST, 0.15 M Na⁺, pH 7.2, 0.05% Tween 20, 3x 300μl) で洗浄した後、200 μl のペルオキシダーゼ標識抗-DIG抗体を加えた(ベーリンガー・マンハイム, PBST中で1:1000に希釈)。プレートを37℃で30分インキュベートし、洗浄した(PBST, 3x 300μl)。100 μl の基質溶液(0.1 M クエン酸-リン酸緩衝液 pH
5.0, 0.66mg/ml オルト-フェニレンジアミンジヒドロクロリド、 0.012% H₂O₂)を加えることにより、ウェルをペルオキシダーゼ活性についてアッセイした。反応を8分後に100 μl H₂SO₄ (0.5 M)を加えて停止し、492 nmでの吸収度をマイクロプレートリーダーで読みとった。図3に示すように、非修飾ビオ-DNA捕捉プローブ(B-DNA1およびB-DNA2)は両方とも予想した通りに機能した。つまりこれらはそれぞれの標的PCR アンプリコンのみを捕捉した。B-DNA1プローブと比較して、B-DNA2プローブは同じ性質のアンプリコンの捕捉にはそれほど効果的ではなかった。しかしながらB-DNA2プローブの捕捉効率は13のDNAヌクレオシドのうち12を対応するLNAヌクレオシドと置換したことにより劇的に向上した。図3に示すように、B-DNA2プローブの代わりにB-LNA2プローブを使用すると、アッセイの感度が10倍以上になる。B-LNA2は、関連および非関連アンプリコンを効果的に区別する非修飾B-DNA2の能力を維持すると同時に、LNA-オリゴの優れた特異性を強化する。1)LNA修飾オリゴに共有結合的に付着したビオチンはストレプタビジンと結合する能力を保持すること、2)LNA修飾オリゴはMTP ベース アンプリコン捕捉アッセイにおいて効果的に機能すること、および3)LNAはPCR アンプリコンの親和的捕捉における標準DNAオリゴの性能を劇的に向上させる手段を提供することが断定される。

実施例 144
LNA置換オリゴは同性質のPCR アンプリコンを鎖侵入によって捕捉することができる。 2組の独立したアンプリコン 1または2の10μl 反応物(実施例143と同様に生成)を、全容量450 μlの、1 x SSC (0.15 M NaCl, 15mM クエン酸塩, pH 7.0)中、1, 5または25pmolのB-LNA2捕捉プローブ

のいずれかと混合した。1組の反応物を95℃で5分間熱して、アンプリコンを変性し、25℃に冷却してプローブと標的アンプリコン鎖とのハイブリッドを促進した。別の組の反応物は変性させないままにした。それぞれの反応物から190 μl をトレプタビジンを塗布したマイクロプレート(Pierce, cat. no.15124)に移し、37℃で1時間インキュベートした。 プレートをリン酸緩衝生理食塩水(PBST, 0.15
M Na⁺, pH 7.2, 0.05% Tween 20, 3x 300μl)で洗浄した後、200 μlのペルオキシダーゼ標識抗-DIG抗体を加えた(Boehringer Manheim, PBST中で1:1000に希釈)。プレートを37℃で30分間インキュベートし、洗浄した (PBST, 3x 300μl)。100 μl の基質溶液(0.1 M クエン酸-リン酸緩衝液 pH 5.0, 0.66mg/ml オルト-フェニレンジアミン２塩酸塩、 0.012% H₂O₂)を加えることにより、ウェルをペルオキシダーゼ活性についてアッセイした。10分後、100μlのH₂SO₄ (0.5 M)を加えて反応を停止し、492 nmでの吸収度をマイクロプレートリーダーで読み取った。アンプリコンがハイブリッド前に捕捉プローブ(図4A)で変性されているときは、実施例143と同様の効果的な配列特異的アンプリコンの捕捉が見られる。B-LNA2濃度を1から5pmolに増加すると捕捉親和性が増加する。プローブを25pmolにさらに増加させると、シグナルが減少する。これはストレプタビジンMTPにおける使用可能なビオチン結合部位が飽和状態であることと一致する。アンプリコンがハイブリッド前に捕捉プローブで変性されていないとき(図4B)においても、効果的な配列特異的アンプリコンの捕捉が確認される。実際、このデータから、変性していないアンプリコン捕捉は変性したアンプリコン捕捉と同様、効果的かつ特異的であることがわかる。これはビオ-LNA2プローブが標的配列を鎖侵入によって結合することができることを強力に示している。我々の知る限りでは、これは生理的食塩条件下で混合プリン/ピリミジンプローブによってdsDNAの配列特異的ターゲティングを行った最初の例である。基本的研究およびDNA診断手順の範囲を著しく簡素にできる可能性は別として、このLNA修飾オリゴの予期し得なかった特性には、アンチセンスによる効果的な新薬の開発および特に抗遺伝子の研究方法における主な重要性を予見することができる。

実施例 145
PCR アンプリコンの配列特異的捕捉において固形表面上に効果的に固定されたLNA置換オリゴ。
ストレプタビジンを塗布したマイクロタイタープレート(ベーリンガー・マンハイム)のウェルを全容量100μlの1xSSC (0.15 M NaCl, 15mM クエン酸, pH 7.0)中の5 pmolのB-DNA2プローブ(ビオチン-GGTGGTTTGTTTG-3'; アンプリコン 2に特異なDNAプローブ) または B-LNA2プローブ

のいずれかと1時間インキュベートした。全部で４つのウェルを B-DNA2プローブとインキュベートし、４つのウェルを B-DNA2プローブとインキュベートし、４つのウェルを緩衝液のみでインキュベートした。インキュベートした後、ウェルを1 xSSC で3回洗浄した。DIG-標識アンプリコン 1(60μl) または アンプリコン 2 (60μl) (実施例143と同様に生成)を540μlの1 xSSCと混合し、95℃で5分間熱変性し、マイクロプレートウェルに移した(100μl)。B-DNA2, B-LNA2のいずれかを含むかまたは捕捉プローブを含まない2つのウェルにアンプリコン 1を収容し、B-DNA2, B-LNA2を含むかまたは捕捉プローブを含まない2つのウェルにアンプリコン 2を収容した。37℃で1時間後、プレートをリン酸緩衝生理食塩水(PBST, 0.15 M Na⁺, pH 7.2, 0.05% Tween 20, 3x 300μl) で3回洗浄し、200 μl のペルオキシダーゼ標識抗-DIG抗体を加えた(ベーリンガー・マンハイム, PBST中で1:1000に希釈)。プレートを37℃で30分間インキュベートし、300μl のPBSTで3回洗浄した。100μlの基質溶液 (0.1 M クエン酸-リン酸緩衝液pH 5.0, 0.66mg/ml オルト-フェニレンジアミン２塩酸塩, 0.012% H₂O₂)を加えることによりウェルをペルオキシダーゼ活性についてアッセイした。反応を6分後に100μlのH₂SO₄ (0.5 M)を加えて停止し、492 nmでの吸収度をマイクロプレートリーダーで読み取った。図5に示すように、LNA修飾捕捉プローブ(B-LNA2)はその特異的アンプリコン (アンプリコン 2)を対応する非修飾DNA捕捉プローブ(B-DNA2)よりもさらに効果的に捕捉する(感度は約5倍の増加)。B-LNA2 プローブを非関連アンプリコン(アンプリコン 1)とインキュベートしたときはどのようなシグナルも得られなかった。これはB-LNA2 プローブの優れた特異性を強調する。LNA修飾オリゴは固体面に固定されたときにPCR アンプリコンの配列特異的捕捉において効果的に機能することが結論付けられる。さらに、LNA修飾オリゴを標準DNAオリゴの代わりに使用することにより、ノイズ比により良いシグナルが提供されることが断定できる。したがって、LNAは、例えば複数の固定プローブを使用して試料中の異なる標的配列の存在を同時に検出するアレイフォーマット(array format)のような固定された捕捉プローブを使用する現在のDNAに基づくアッセイの性能を有意に向上するための手段を提供する。

実施例 146
完全に混合したLNAモノマーはMTPフォーマットにおけるPCR アンプリコンの配列特異的捕捉において固定したビオチン化-DNAオリゴの性能を有意に増加するために使用することができる。
Nras配列からの3つのDIG標識アンプリコン(参照: Nucleic Acid Research, 1985, Vol. 13, No. 14, p 52-55)をPCR増幅により次のように生成した:
PCRプライマー:
前進プライマー: NAR レファレンスによる 5'-CCAGCTCTCAGTAGTTTAGTACA-3'塩基701-723。
910 bp 逆プライマー: 5'-GTAGAGCTTTCTGGTATGACACA-3'塩基1612-1590 (NAR レファレンスによる逆配列)。
600 bp逆プライマー: 5'-TAAGTCACAGACGTATCTCAGAC-3'塩基1331-1308 (NAR レファレンスによる逆配列)。
200 bp逆プライマー: 5'-CTCTGTTTCAGACATGAACTGCT-3'塩基909-886 (NAR レファレンスによる逆配列)。

Nras アンプリコンのPCR反応混合物: 2.3μl ヒト胎盤ゲノムDNA (440 ng/μl),
50μl 10x PCR緩衝液(MgCl₂を含まない、パーキン・エルマー), 30μl 25 mM MgCl₂, 50μl dNTP-mix (2 mM dATP, dCTP, dGTPおよび1.8 mM dTTP), 10μlの1 mM Dig-11-dUTP, 10μl の25μM 前進プライマー, 10μlの25μM 逆プライマー , 5μlの5 U/μl AmpliTaq Gold (パーキン・エルマー)および水を500μlまで。

PCR反応:上記混合物はすべて Nras PCR 生成物から形成した。違いは逆プライマー910 bp, 600 bp または 200 bp が一回で加えられたことだけである。PCR混合物は10個のPCRチューブにそれぞれアリコートし、パーキン・エルマー 9600で以下の条件で循環させた: 95℃ 3分間; 55℃ 2分間, 72℃ 3分間, 95℃ 1分間(30サイクル); 55℃ 2分間, 72℃ 10分間および 4℃で浸漬。各PCR反応物から10μlをそれぞれ標準アガロースゲルで分析し、約910 bp, 600 bp および 200 bpの予想画分を確認した。

アッセイ条件: ストレプタビジンを塗布したマイクロタイタープレートのウェル(ベーリンガー・マンハイム; ウェルあたり20 pmol ビオチン結合能力)を、5 x SSCT (0.75 M NaCl, 75 mM クエン酸, pH 7.0, 0.1% Tween 20)中で、

のいずれかとともに37℃で1時間インキュベートした; LNA ヌクレオシドは太字。Nras Cap A捕捉プローブはアンプリコン Nras 910, Nras 600およびNras 200を捕捉した。Nras Cap B捕捉プローブは特異的アンプリコン Nras 910およびNras 600を捕捉した。異なる捕捉プローブとインキュベートした後、ウェルを5 x SSCT中で洗浄し、95 μlの 1 x SSCT (0.15 M NaCl, 15 mM クエン酸, pH 7.0, 0.1% Tween 20)中の5 μlの天然または変性(95℃ 5 分間および氷上で10 分間)DIG-標識アンプリコン (Nras 910, Nras 600 または Nras 200)をウェル毎に加え、37℃で1時間インキュベートした。ウェルをリン酸緩衝生理食塩水(1 x PBST, 0.15 M Na⁺, pH 7.2, 0.05% Tween 20)で3回洗浄し、200 μl ペルオキシダーゼ標識抗-DIG抗体(ベーリンガー・マンハイム, 1 x PBST中で1:1000に希釈)と共に37℃で30分間インキュベートした。最後にウェルを1 x PBST中で3回洗浄し、100
μl の基質溶液(0.1 M クエン酸-リン酸緩衝液 pH 5.0, 0.66 mg/ml オルト-フェニレンジアミン２塩酸塩, 0.012% H₂O₂)を加えることにより、ペルオキシダーゼ活性についてアッセイした。9分後、100 μlの0.5 M H₂SO₄ を加えて反応を停止し、492 nm での吸収度をマイクロタイタープレートリーダーで読み取る前にH₂SO₄ で4倍希釈した。図23Aに示すように、12個のLNAヌクレオシドでスパイクされた捕捉プローブ(LNA Nras Cap A および LNA Cap B)は前もって変性していない特異的なアンプリコン(天然のアンプリコン)を非常に効果的に捕捉した。4個のLNAヌクレオシドでスパイクされた捕捉プローブ(LNA/DNA Nras Cap A および LNA/DNA Nras Cap B)はそれほど効果的ではなく、同じアンプリコンを捕捉し、DNA捕捉プローブ(DNA Nras Cap A および DNA Nras Cap B)は特異なアンプリコンをまったく捕捉しなかった。対照のアンプリコンであるNras 200はLNA Cap B または LNA/DNA Nras Cap Bプローブのどちらにも捕捉されず、LNAでスパイクした捕捉プローブの優れた特異性を証明している。図23Bに変性したアンプリコンについて行った同様の実験を示す。本質的に、捕捉効率が概して向上したという本質的な違いをもって同一の情況が現れる。混合LNAヌクレオシド(A, T, G または
C LNA ヌクレオシド)を含むLNA修飾オリゴは固体表面に固定されたときのPCR アンプリコンの配列特異的捕捉において効果的に機能するといえる。LNAは前もって変性しないアンプリコンの捕捉、つまり鎖置換による捕捉において効果的に機能する捕捉プローブを構成する手段を提供するといえる。この能力はDNAに基づく現在のアンプリコン検出フォーマットを有意に簡略化することを容易にする。

実施例 147
LNA修飾オリゴは核酸ポリメラーゼのプライマーとして機能する。

のテンプレートに依存するプライマーおよび酵素的伸長として機能する能力を3つの異なるクラスのポリメラーゼを用いて調査した。RNA および DNAの両方をテンプレートとして使用することができる逆転写酵素M-MuLV (ベーリンガー・マンハイム)、標準 DNA ポリメラーゼおよび熱安定ポリメラーゼに対応するクレノーポリメラーゼ、 BM-TAQ (ベーリンガー・マンハイム)。対照として、伸長反応を同一の非修飾DNAプライマー(5'-GGTGGTTTGTTTG-3')を用いて行った。LNAおよびDNAプライマーを³²P-γ-ATPで実施例137に記載のように標識した。50 量体 DNAオリゴ (5'-AAAAATCGACGCTCAAGTCAGAAAAGCATCTCACAAACAAACAAACCACC-3')をテンプレートとして使用した。M-MuLV (ベーリンガー・マンハイム,)との反応は2μlの標識LNA-プライマーまたはDNAプライマー(10μM)のいずれか、2μlのDNAテンプレート(10μM)、2μlの2mM dNTP、2μl の 10 x 緩衝液(500mM Tris-HCl, 300mM
KCl, 60mM MgCl₂, 100mM DTT, pH 8.3 (37℃))、1μlの酵素(20U/μl)および水を20μlまで含んでいた。反応を37℃で60分間インキュベートした。クレノーポリメラーゼ(USB)との反応は2μlの標識LNA-またはDNAプライマー(10μM)のいずれか、2μlのDNAテンプレート(10μM)、2μlの2mM dNTP、2μl の 10 x 緩衝液(100mM Tris-HCl, 50mM MgCl₂, 75mM DTT, pH 7.5)、1μlの酵素(10U/μl) および水を20μlまで含んでいた。これら反応を37℃で60分間インキュベートした。BM-Taq (ベーリンガー・マンハイム)との反応は 2μlの標識LNA-またはDNAプライマー(10μM)のいずれか、2μlのDNAテンプレート(10μM) 、2μlの2mM dNTP、2μl の 10 x 緩衝液(100mM Tris-HCl, 15mM MgCl₂, 50mM KCL, pH 8.3)、1μlの酵素(5U/μl) および水を20μlまで含んでいた。反応を出発温度37℃から1℃/分で60℃まで勾配しながらインキュベートし、30分間維持した。インキュベート終了期に10μlのローディング緩衝液(0.25% (w/v) ブロモフェノールブルー、0.25% (w/v)キシレンシアノール、80% (v/v)ホルムアミド)を加え、反応を停止した。 試料を95℃で1分間熱し、氷上に置き、2μlを8% 配列ポリアクリルアミドゲルに入れ、（Life Technologies Inc.） BRL モデル 52で電気泳動させた。電気泳動後、ゲルをガラスプレート上で乾燥し、オートラジオグラフィ(X線フィルム: Kodak X-Omat AR)に付した。図7に示すように、クレノーポリメラーゼ (レーン3)またはBM-Taqポリメラーゼ(レーン5)を使用するときは、LNAおよびDNAプライマーの両方において透明で類似した伸長生成物が確認された。M-MuLV逆転移酵素を使用するとき(レーン2)、伸長生成物はLNA-プライマーの場合にのみ検出することができる。酵素的伸長に付さなかった標識LNAおよびDNAプライマーはレーン1、4および6に存在する。LNAヌクレオシドを標準DNAオリゴに組み込むことは、核酸ポリメラーゼによるオリゴ/テンプレート二重らせんの認識を妨害しないことがいえる。 また、LNA修飾オリゴは非修飾DNAオリゴとしてのプライマーとして効果的に機能するといえる。

実施例 148
LNA修飾オリゴは標的増幅工程においてプライマーとして機能する。
PCR増幅においてプライマーとして機能するLNA修飾オリゴの能力を、含有するLNAヌクレオシド数のみが異なる3つのオリゴ:

を用いて分析した。PCR反応(100μl)は、テンプレートなし(対照), 0.01ng, 0.1ng または 1ngのテンプレート(pUC19プラスミド)のいずれか、0.2μM 逆プライマー (5'-GTGGTTCGCTCCAAGCTG-3')、0.2μMのAL2, AL10またはFP2前進プライマーのいずれか、200μMのdATP, dGTP, dCTPおよびdTTP、10mM Tris-HCl pH 8.3, 1.5mM MgCl₂, 50mM KClおよび2.5UのBM-Taqポリメラーゼを含んでいた。テクノジニアスサーモサイクラー（Techne Genius thermocycler）で、それぞれ94℃ 1分間、 - 45℃ 1分間、 - 72℃ 1.5分間で合計50サイクルで行った(最初の30サイクル後さらに2.5UのTaqポリメラーゼを加えた) 最終サイクル後、反応を72℃で3分間、次いで4℃で一晩インキュベートした。30μlの各反応に6μlのローディング緩衝液(0.25% (w/v)ブロモフェノールブルーおよび40% (v/v)グリコール)を加え、試料を(Amplisize（商標） サイズマーカーと)2%アガロースゲルに入れ、150Vで45分間電気泳動させた。最後に、ゲルをエチジウムブロミドで染色して撮影した。図8に示すように、非修飾前進プライマーFP2および非修飾逆プライマーを用いたPCR反応は、使用したテンプレートの全量で正確な大きさの検出可能なアンプリコンを生じさせた(レーン9: 0.01ng テンプレート、レーン10: 0.1ng、レーン11: 1ng)。 テンプレートなしのコントロール反応からはどのようなシグナルも得られなかった(レーン12)。FP2前進プライマーが1 中心LNAヌクレオシドを含むプライマー(AL10)で置換されているときも、アンプリコンは使用したテンプレートの全量で検出された(レーン5: 0.01ng、レーン6: 0.1ng、レーン7: 1ng)。このことはAL10プライマーが指数関数的増幅を維持すること、つまりAL10プライマーがそのままの状態で伸長し、テンプレートとして使用されることを明白に示している。また、テンプレートなしのコントロール反応(レーン8)ではアンプリコンは生成されない。FP2前進プライマーが4中枢LNA ヌクレオシドを含むプライマー(AL2)で置換されているとき、正確な大きさのアンプリコンはどの反応においても検出できない(レーン1: 0.01ngテンプレート、レーン2: 0.1ng、レーン3: 1ng、レーン4: テンプレートなし)。しかしながらテンプレート濃度が最大(1ng)のときは、ゲル中に高い分子量帯が見られる(レーン3)。しかしながらテンプレートの最大量(1ng)のテンプレートでアンプリコンを生成する能力についてプライマーAL2(レーンA)、AL10(レーンB)、FP2(レーンC)およびRP1(レーンD)をそれぞれ試験したコントロール反応において指摘したように、これはRP1プライマーの人工物である。AL2が実施例147においてプライマーとして機能すると示されたため、検出可能なアンプリコンが存在しないことはテンプレートとして機能する能力が欠落している、つまり4つの連続したLNAヌクレオシドブロックがポリメラーゼの前進を阻害しており、反応を線増幅させている(この生成物は使用した実験構成では検出できない)ことを強力に示している。LNA修飾オリゴはPCR増幅においてプライマーとして使用することができるといえる。さらに、増幅の程度(完全に可能なものから線状の増幅を等級付けて)はLNA修飾オリゴのデザインによって制御可能であることがいえる。LNAヌクレオシドをプライマーに組み込むことによってポリメラーゼの前進をブロックする可能性が単一の鎖末端を有するアンプリコンの生成を容易にすることがいえる。このような末端は変性されることなく容易にハイブリッドされやすく、この特徴がさまざまの応用方法において有用である。

実施例 149
5'アントラキノンを有するLNA修飾オリゴマーは照射により固形支持体に共有結合的に固定され、固定されたオリゴマーは相補的DNAオリゴの捕捉に効果的である。
25 pmol/μlまたは12.5 pmol/μlのいずれかのアントラキノンDNAオリゴ(5'-AQ-CAG CAG TCG ACA GAG-3')またはアントラキノンLNA修飾DNAオリゴ(5'-AQ-CAG CAG TCG ACA GAG-3'; LNA モノマーには下線を付す)をポリカーボネートスライド(Nunc)上で0.2 M LiCl中でスポットした(1 μl/スポット)。オリゴを穏やかなUV線で15分間照射した。照射後、スライドをミルQウオーター（Milli-Q water）で3回洗浄し、空気乾燥した。25mlの0.5 pmol/μlの相補的ビオチン化オリゴマー(5'-ビオチン- CTC TGT CGA CTG CTG-3')を5 x SSCT (75 mM クエン酸, 0.75 M NaCl, pH 7.0, 0.1% Tween 20)中で固定オリゴマーと50℃で2時間ハイブリッドした。1 x SSCTで4回、リン酸緩衝生理食塩水(PBST, 0.15 M Na⁺, pH 7.2, 0.05% Tween 20)で1回洗浄した後、0.06 μg/mlのストレプタビジン共役ホースラディッシュペルオキシダーゼおよび1 μg/mlのストレプタビジンを含む25ml PBSTをスライドに加えた。スライドを30分間インキュベートし、25ml PBSTで4回洗浄した。製造業者の記載のとおりにスライドを化学発光基質(SuperSignal; Pierce)およびX線フィルム(CL-Xposureフィルム、Pierce 34075)で視覚化した。図9に示すように、AQ-DNAオリゴおよびAQ-LNA修飾DNAオリゴの両方において、明確に検出可能なシグナルを得た。アントラキノン結合LNA修飾DNAオリゴは照射により固体表面に効果的に付着し、このように付着したオリゴは相補的な標的DNAオリゴにハイブリッドすることができるといえる。

実施例 150
異なるLNA修飾Cy3-標識8量体との末端ミスマッチのアレイ上でのハイブリッド化および検出。
スライド標本: ガラススライドをアセトン中のアミノプロピルトリエトキシシラン10%溶液でアミノシラン化し、アセトン中で洗浄した。以下のオリゴヌクレオチドをスライドにスポットした:

12のスライド上に各ペン（pen）からそれぞれのオリゴヌクレオチドについて約1
nlのスポットを10回繰り返した。

スライドおよびハイブリッド条件:
スライド1、2および3はaZ1プローブ @ 300fmol/μl, 30fmol/μl, 3fmol/μlとハイブリッドした。
スライド4、5および6はaZ2プローブ @ 300fmol/μl, 30fmol/μl, 3fmol/μlとハイブリッドした。
スライド7、8および9はaZ3プローブ @ 300fmol/μl, 30fmol/μl, 3fmol/μlとハイブリッドした。
スライド10、11および12は配列16 プローブ @ 300fmol/μl, 30fmol/μl, 3fmol/μlとハイブリッドした。
30μlハイブリッド化緩衝液(5 x SSC, 7% ラウリルサルコシンナトリウム)に希釈したプローブを各スライドの長さにそってピペットで移し、カバーガラスで覆い、プラスチック挿入体上部のプラスチックボックスに入れ、それを水で湿らせたペーパータオルの上に置いた。ボックスはアルミニウム箔で覆って光を遮断し、+4℃で一晩インキュベートした。

スライド洗浄: カバーガラスを取り除き、スライドをラックに挿入し(1つのラックに6個のスライド)、ガラス製スライド皿に置き、ホイルで包んだ:

洗浄後、スライドを送風乾燥し、スキャンした。蛍光をスライドスキャナーに映し、データをイメージクオントソフトウエア (分子力学)（ImageQuant software (Molecular Dynamics)）から分析した。図11に示すように、ミスマッチオリゴ3へのCy3標識プローブの結合は、非修飾プローブ(スライド10-12), 1重LNA修飾プローブ aZ1 (slide 1-3)、1重LNA修飾プローブaZ2(スライド4-6)または3重LNA修飾プローブaZ3(スライド7-9)のいずれにおいても見られない (つまりミスマッチオリゴ3で得られたシグナルはバックグラウンドシグナルと同等)。相補的オリゴ6では、特異的なシグナルが全ての場合において見られる。これらのシグナルの強度はプローブ中に存在するLNAの数およびプローブ濃度に明らかに相関している。LNA T 残基はそれぞれ通常のDNAオリゴプローブよりも因数でシグナル強度を約2ほど増加させた。つまり、aZ1 および aZ2 = 2x 配列 16のシグナル、aZ3 = 8x 配列 16のシグナルである。マッチ/ミスマッチの区別はLNA T 塩基置換および増加したシグナル強度で良好であり、ミスマッチ区別は容易であると思われる。

実施例 151
LNA修飾Cy3-標識8量体との末端ミスマッチのアレイでのハイブリッドおよび検出。
スライド調製:ガラススライドをアセトン中の10% アミノプロピルトリエトキシシラン溶液を用いてアミノシラン化し、次いでアセトン中で洗浄した。以下のオリゴヌクレオチドを1pmol/μlでスライドにスポットした:
配列 No.9 5'-GTGTGGAG-3'
配列 No.15 5'-GTGTGGAA-3'
配列 No.131 5'-GTGTGGAT-3'
配列 No.132 5'-GTGTGGAC-3'
配列 No.133 5'-ATGTGGAA-3'
配列 No.134 5'-CTGTGGAA-3'
配列 No.135 5'-TTGTGGAA-3'

それぞれ12のスライドに6ペンから各オリゴヌクレオチドについて約1 nlのスポットを10回繰り返した。
プローブ(LNAモノマーは太字):

LNAモノマーを有するプローブは配列番号の一部として予め35Z-とした。特異的LNAモノマーはイタリック体/太字で表記し、LNAオリゴの3'および5'末端に配置した。

スライドおよびハイブリッド条件: 各プローブ配列は別々のスライドでハイブリッドした。全てのプローブ濃度は1fmol/μlであった。各プローブをハイブリッド化緩衝液(5 x SSC, 7% ラウリルサルコシンナトリウム)で希釈し、その30μlを各スライドの長さにそってピペットで移し、カバーガラスで覆い、プラスチック挿入体上部のプラスチックボックスに入れ、水で湿らせたペーパータオル上に置いた。ボックスをアルミニウム箔で覆って光を遮断し、+4℃で一晩インキュベートした。

スライド洗浄: カバーガラスを取り除き、スライドをラックに挿入し(1つのラックに8個のスライド)、ガラス製スライド皿に置き、ホイルで包んだ。全てのスライドを5 x SSC 中で2 x 5分間、+4℃で洗浄した。洗浄後、スライドを送風乾燥し、スキャンした。蛍光をスライドスキャナーに映し、データをイメージクオントソフトウエア (分子力学)から分析した。

結論:図12および13に示すように、LNAヌクレオシドを5'および3'末端に含むプローブでのマッチおよびミスマッチの標的配列の区別は、大部分において対応する非修飾オリゴヌクレオチドよりも良好であった。

DNAオリゴにおいて、C=T ミスマッチは例えばプローブ配列1が標的配列132とハイブリッドしたとき、およびプローブ配列5が標的配列134とハイブリッドした時において、最も区別が困難であった。T=TおよびG=Tミスマッチなどのその他のミスマッチは見ることができたが、これらのスポットは例えば標的配列135とそれぞれハイブリッドしたプローブ配列5および6においてやや強度が劣っていた。LNAオリゴでは他のミスマッチに匹敵するレベルまでこれらのC=TおよびT=Tミスマッチスポット強度が著しく減少した。プローブ配列1、2および3の相対的スポット強度はDNAおよびLNAオリゴと同様であった。しかしながら、プローブ配列4、5および6では、LNAオリゴはマッチ標的配列9、133および134とそれぞれハイブリッドした時にスポット強度の著しい増加を示した。

実施例 152
ATおよび全てのLNA修飾Cy3-標識8量体との末端ミスマッチのアレイ上でのハイブリッド化および検出。
スライド標本: ガラススライドをアセトン中の10% アミノプロピルトリエトキシシラン溶液を用いてアミノシラン化し、次いでアセトン中で洗浄した。以下のオリゴヌクレオチドを1pmol/μlでスライドにスポットした:

配列 No.9 5'-GTGTGGAG-3'
配列 No.15 5'-GTGTGGAA-3'
配列 No.131 5'-GTGTGGAT-3'
配列 No.132 5'-GTGTGGAC-3'
配列 No.133 5'-ATGTGGAA-3'
配列 No.134 5'-CTGTGGAA-3'
配列 No.135 5'-TTGTGGAA-3'

各36のスライドに6 ペンのおのおのからオリゴヌクレオチドについてスポット毎に約1 nlを10回スポットを繰り返した。
プローブ(LNAモノマーは太字):

LNAモノマーを有するプローブは予め配列番号の一部としてATZ- または AllZ-とした。特異性LNAモノマーはLNAオリゴとしてイタリック体/太字で表記した。

スライドおよびハイブリッド条件:各プローブ配列は別々のスライドでハイブリッドした。 全てのプローブ濃度は1fmol/μlであった。各プローブをハイブリッド化緩衝液(5 x SSC, 7% ラウリルサルコシンナトリウム)で希釈し、その30μlを各スライドの長さにそってピペットで移し、カバーガラスで覆い、プラスチック挿入体上部のプラスチックボックスに入れ、水で湿らせたペーパータオル上に置いた。ボックスをアルミニウム箔で覆って光を遮断し、室温で一晩インキュベートした。

スライド洗浄: カバーガラスを取り除き、スライドをラックに挿入し(1つのラックに9個のスライド)、ガラス製スライド皿に置き、ホイルで包んだ。全てのスライドを5 x SSC 中で2 x 5分間、室温で洗浄した。洗浄後、スライドを送風乾燥し、スキャンした。蛍光をスライドスキャナーに映し、データをイメージクオントソフトウエア (分子力学)から分析した。

結論: 図15A、15Bおよび15Cに示すように、DNAハイブリッドの室温での平均強度はATまたはすべてのLNA修飾オリゴで得られた強度の約10%であった。DNAプローブ5および6でハイブリッドしたスライドではどのようなスポットも見られなかった。これらの条件はしたがって、DNAプローブでは最適ではない。しかし、マッチ/ミスマッチの区別はAおよびT塩基でのLNA ヌクレオシドの置換では良好であった。AT LNAオリゴにおいてマッチ/ミスマッチの区別がそれほど良好でなかったため、全てのLNAオリゴにおける説得力は際立って十分ではなかった。

LNA修飾を有するオリゴは良好に機能した。最も区別が困難だったミスマッチは以下であった;
標的 135 へのプローブ 1 = CT ミスマッチ
標的131 へのプローブ 2 = GTミスマッチ
標的15 へのプローブ 3 = AAミスマッチ
標的131 へのプローブ 4 = CTミスマッチ
標的135 へのプローブ 5 = TTミスマッチ
標的135 へのプローブ 6 = GTミスマッチ
標的133 へのプローブ 6 = GAミスマッチ。

AT LNAオリゴはこれらミスマッチスポット強度が概して最大でマッチスポットの50%のとき良好な区別を示した。これらのミスマッチにおいて、全てのLNAオリゴは適性スポット強度の約50から70%のミスマッチスポット強度を示した。全体として、LNA修飾によって高温を使用したハイブリッドおよび洗浄が可能になり、末端不適性が区別される。これらの結果は少なくとも4℃でハイブリッドしたDNAプローブに関して信頼できる(実施例151参照)。

実施例 153
LNA T モノマーを含む配列 DNAテンプレートへの[α³³P] ddNTP'sおよびサーモシーケンナーゼ（ThermoSequenase）（商標）DNAポリメラーゼの使用。
放射線標識ターミネーター配列決定反応をLNA T モノマーのDNAポリメラーゼのテンプレートとして受け入れられる能力を試験するために行った。15量体プライマー (配列: 5'- TGC ATG TGC TGG AGA -3')を次の短い配列を感作するために使用した(LNA モノマーは太字):

次の反応混合物を生成した:

テンプレート 1 混合物:
2μl x16 サーモシーケンナーゼ緩衝液
6μl プライマー 2pmole/μl
6μl テンプレート 1 1pmole/μl
4μl 水
2μl サーモシーケンナーゼ DNAポリメラーゼ (4U/μl)
20μl 全容量

テンプレート TZ1 混合物
2μl x16 サーモシーケンナーゼ緩衝液
6μl プライマー 2pmole/μl
6μl テンプレート TZ1 1pmole/μl
4μl 水
2μl サーモシーケンナーゼ DNAポリメラーゼ (4U/μl)
20μl 全容量

2μl ヌクレオチド混合物(7.5μM 各dNTP) を8個の エッフェンドルフ（Eppendorf）チューブにそれぞれ加えた。 0.5μl [α³³P] ddATP をチューブ1および5に加えた。0.5μl [α³³P] ddCTP をチューブ2および6に加えた。0.5μl [α³³P] ddGTP をチューブ3および7に加えた。0.5μl [α³³P] ddTTP をチューブ4および8に加えた。4.5μl のテンプレート1混合物をチューブ1-4にそれぞれ加えた。4.5μlのテンプレートTZ1混合物をチューブ5-8にそれぞれ加えた。全ての反応を60℃で3分間インキュベートした。反応を4μl ホルムアミド/EDTA停止液を加えて停止した。反応を95℃で3分間熱し、その後19%ポリアクリルアミド 7M尿素ゲルに入れた。ゲルを10%メタノール中の10%酢酸中に固定し、次いで3MMの紙に移し、乾燥した。乾燥ゲルをKodak Biomaxオートラジオグラフィフィルムに暴露した。

結果を図18(トラック1-4)および図19に示す(5-8)。以下の反応に対応するトラックは: (図18):レーン1 - ddATP トラック。 レーン2 - ddCTP トラック。 レーン3 - ddGTP トラック, レーン4 - ddTTP トラック。 レーン5 - 8-32塩基オリゴマーカー; 図19: レーンA - 8-32塩基オリゴマーカー。 レーン5 - ddATP トラック。 レーン6 - ddCTP トラック。 レーン7 - ddGTP トラック。 レーン8 -
ddTTP トラック。

図18および19から明らかなように、両方のテンプレートの全ての配列はオートラジオグラフィで容易に読み取ることができる。配列は5'-TGG AAC GTA- 3'で、テンプレート配列 3'-ACC TTG CTA- 5'に対応する。これにより、シングルLNA T モノマーがポリメラーゼのテンプレートとして機能することがわかる。LNA T モノマーは取り込まれたddATPを用いて特に「T」として複写される。

治療的応用
実施例 154
LNA修飾オリゴは細胞に転写可能である。放射線標識LNAオリゴを用いた実験。

キナーゼ緩衝液(50 mM Tris/HCl pH 7,6, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 0.1 mM EDTA)中のT4 ポリヌクレオチドキナーゼ (10ユニット, BRL cat. no. 510-8004SA), 5 μl ガンマ-³²P-ATP 5000 Ci/mmol, 10 uCi/μl (Amersham)と混合した。試料を37℃で45分間インキュベートし、その後68℃で10分間熱し、次いで+0℃にした。組み込まれていないヌクレオチドをクローマスピン（Chroma Spin） TE-10 カラム (Clontech cat. no. K1320-1)を通過させて除去した。収量はそれぞれODN#10, AL16およびAL17において、5x10⁵ cpm/μl , 2x10⁵ cpm/μl および 0.8x10⁵ cpm/μlであった。本来ヒト細胞培養銀行（Human Cell Culture Bank (Mason Research Institute, Rockville)）から得たMCF-7 ヒト胸部ガン細胞を25 cm² 細胞培養フラスコ(Nunclon, NUNC)中の1%の熱不活化ウシ胎児血清(Gibco BRL), 6 ng/ml のウシインシュリン(Novo)および2.5 mM グルタマック（glutamax） (Life Technologies)で補強したDME/F12 培養培地 (1:1)で培養し、腐植化インキュベータで37℃、5%CO₂、20%O₂、75%N₂でインキュベートした。MCF-7細胞は実験時において約40% 集密性（confluent）であった。少量(0.1 pmol以下)のキナーゼ化オリゴを1.5 μg のpEGFP-NI プラスミド(Clontech cat. no. 60851)と混合し、100 μl希釈FuGENE6 形質移入剤(ベーリンガー・マンハイム cat no. 1 814 443)[希釈液:血清を含まない95 μl のDME/F12 培養培地中の5μl のFuGENE6]と混合した。FuGENE6/DNA/オリゴ-混合物を成長するMCF-7細胞を粘着性の培養培地(5 ml)に直接加え、ほぼ製造者の指示どおりに細胞とともに18時間インキュベートした。3種類の実験1) ODN#10 + pEGFP-NI; 2) AL16 + pEGFP-NI; 3) AL17 + pEGFP-NIを設定した。DNA/LNA物質の細胞摂取は培地(アリコートはシンチレーターバイアルに移した)を含むFuGENE6/DNA/オリゴ-混合物を除去して調査した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で一回洗浄し、新しい培養培地を加え、細胞を蛍光顕微鏡で調べた。緑色蛍光物質を含む約30%の形質移入細胞が見られ、約30%の細胞がpEGFP-NI プラスミドを摂取し、このプラスミドでコードされた緑色蛍光タンパク質を発現したことがわかる。蛍光顕微鏡検査の後、粘着性のMCF-7細胞を培養フラスコから取り出した。一時的に培養培地を取り出し、次いで細胞をPBS (Mg₂ ⁺ および Ca₂ ⁺を含まない)中の0.25%トリプシン(Gibco BRL) 1 mM EDTA溶液で洗浄し、1 ml トリプシン/EDTAを加え、細胞を37℃で10分間インキュベートした。インキュベート中、細胞は遊離し、シンチレーターバイアルに容易に再懸濁して移動した。次いで細胞を10 ml オプティフルー（Optifluor） シンチレーションカクテル (Packard cat. no. 6013199)を加えて完全に溶解させ、バイアルをWallac 1409 シンチレーション計数器で数えた。結果は以下のとおりである: 1) ODN#10 + pEGFP-NI: 加えた放射線のうち約1.4%が細胞物質と結合した; 2) AL16 + pEGFP-NI: 加えた放射線のうち約0.8%が細胞物質と結合した; 3) AL17 + pEGFP-NI: 加えた放射線のうち約0.4%が細胞物質と結合した。加えた放射線の0.4 - 0.8%が細胞に摂取されたといえる。

実施例155
LNAを生体のヒトMCF-7胸部ガン細胞に効果的に運搬する。
ヒトMCF-7細胞によるLNA-摂取効率を高めるため、異なる形質移入剤をさまざまの濃度の5'FITC-標識LNAおよびDNAで試験した。下表に記載のオリゴヌクレオチドを試験した。

AL16およびAL17は実施例128に記載のように、FITCで酵素的に標識した。EQ3009-01およびEQ3008-01は標準固相化学によりFITCで標識した。3つの形質移入剤:FuGENE-6 (ベーリンガー・マンハイム cat. no. 1 814 443), スーパーフェクト（SuperFect）(Quiagen cat. no. 301305)およびリポフェクチン（Lipofectin）(GibcoBRL cat. no. 18292-011)を試験した。ヒトMCF-7胸部ガン細胞を先に記載のように(実施例154)培養した。実験の3日前に細胞をcm²あたり約0.8 x 10⁴細胞の細胞密度で接種した。実験の種類に応じて、MCF-7細胞を標準T25フラスコ(Nunc,
LifeTechnologies cat. no. 163371A)、24 ウエルマルチディッシュ (Nunc, LifeTechnologies cat. no. 143982A)またはスライドフラスコ(Nunc, LifeTechnologies cat. no. 170920A)に接種した。実験は細胞が30 - 40 %集密性のときに行った。LNAおよびDNAの細胞摂取は血清の非存在下で試験した。つまり細胞に形質移入混合物を加える前に通常の血清含有DME/F12培地を除去し、血清を含まないDME/F12と取替えた。この条件下で、スーパーフェクトはMCF-7細胞に対して毒性であることが証明された。スーパーフェクトとプラスミドDNA (pEGFP-N1, Clontech cat. no. 6085-1)、オリゴDNAまたはオリゴLNAのいずれかからなる形質移入混合物もまた MCF-7細胞に毒性であった。スーパーフェクトと異なり、FuGene6およびリポフェクチンはプラスミドDNA (pEGFP-N1)と良好に作用した。しかしながら、リポフェクチンだけが生体MCF-7へのオリゴヌクレオチドの運搬を効果的に行うことができた。つまり、MCF-7細胞へのFITC-標識LNAおよびDNAの効果的な運搬は細胞を1% FCSを含むDME/F12中で約40%集密まで培養することにより得られる。次いでリポフェクチン試薬を血清を含まないDME/F12培地中で40倍に希釈し、750 nMのオリゴ濃度でオリゴとあわせた。オリゴ-リポフェクチン複合体を室温で15分間形成させ、血清なしの培地で最終オリゴ濃度250 nM、0.8 ug/ml リポフェクチンまでさらに希釈する。次いで培地を細胞から除去してオリゴ-リポフェクチン複合体を含む培地と入れ替えた。細胞を37℃で6時間インキュベートし、血清なしのDME/F12培地で一回洗浄し、1%FCSを含むDME/F12にて37℃でさらに18時間インキュベートした。実験結果は培養フラスコ中または24 ウエルマルチディッシュ中の生体細胞のいずれかから直接、またはスライドフラスコで培養し、4%氷冷PFA中で固定した細胞で評価した。全ての場合において、高解像度CCDカメラを備えたLeica DMRB蛍光顕微鏡を使用した。生体細胞での結果を図16に、スライドフラスコで培養した固定細胞での結果を図17に示す。図16および17の細胞は共にFITC-標識AL16 LNA分子で形質移入された。いくつかの領域で細胞の全個数および緑色蛍光細胞を数えることにより、FITC-標識AL16 LNAがMCF-7細胞の約35%に形質移入されたことがわかる。重要なのはLNAが主に細胞の核に集中していることである(図17)。これは核による蛍光オリゴ摂取がアンチセンス活性に相関していることから(Stein C.A. ら、 (1997) Making sense of antisense: A debate. In HMS Beagle: A BioMedNet Publication (http:// hmsbeagle. com/ 06/ cutedge/ overwiev. htm))注目に値する。オリゴおよびリポフェクチンの量を最終濃度のオリゴ1250 nM、リポフェクチン 4 ug/mlに高めたが、緑色蛍光細胞の比率はわずかに上昇しただけであった。濃度をこれ以上に高めることは細胞にとって有毒である。同様の結果が他のLNAおよびFITC-標識オリゴにおいても見られた(上記表参照)。 結論として: 1) LNA はリポフェクチン-媒介形質移入により生体MCF-7胸部ガン細胞に効果的に運搬されうる。 2) 30%以上の細胞の安定した高い細胞画分が、血清なしの成長培地mlあたりの最終濃度250 nM LNA, 0,8 ug リポフェクチンを用いて形質移入される。LNAおよびリポフェクチンの濃度を5倍以上に増加しても形質移入収量はわずかに上昇するだけである3)報告によるLNAを細胞核に形質移入する方法は、このような形質移入LNAが細胞にアンチセンス効果をもたらすことを示唆している。

実施例 156
LNA修飾オリゴは細胞に転写可能である。フルオレセイン標識LNAオリゴを用いた実験。
2つのLNAオリゴ:

を実施例128に記載のようにフルオレセインを用いて標識した。MCF-7ヒト胸部ガン細胞を実施例154に記載のように培養した。3種類の実験:1)約1.5 μg のFITC-標識AL16; 2)約1.5 μgのFITC-標識AL17;および3)約0.75 μgのFITC-標識AL16および0.75 μgのpRSVβgalプラスミド(β-ガラクトシダーゼ酵素でコードされたバクテリアlac Z遺伝子を発現するプラスミド、 Tulchinsky ら、(1992) PNAS, 89, 9146-50)を設定した。２つのLNAオリゴおよびLNA-プラスミド混合物をFuGENE6と混合し、実施例154に記載のようにMCF-7細胞に加えた。18時間インキュベートした後、細胞によるLNAオリゴの摂取を細胞培養の蛍光顕微鏡検査法により評価した。緑色蛍光物質を含む処理細胞の一部から（図16参照）、細胞がフルオレセイン標識LNAを摂取したことがわかる。フルオレセイン標識AL16はこの点においてフルオレセイン標識AL17よりも優れている。蛍光顕微鏡検査後、培養培地をフルオレセイン標識AL16とpRSVβgalの両方で処理した細胞から除去した。細胞をPBSで一回洗浄し、2% (v/v)ホルムアルデヒド、 0.2% (v/v) グルタルアルデヒド中で4℃で5分間固定し、細胞を含むβ-ガラクトシダーゼをβ-ガラクトシダーゼ活性の存在下で無色から青色に変化するX-gal(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイルβ-D-ガラクトピラノシド)で青色に染色した。X-gal染色により、pRSVβgalが細胞中に効果的に移動したことがわかる。結論として、フルオレセインLNAオリゴは細胞に摂取された。

実施例 157
LNA修飾オリゴは細胞培養条件下では相対的に安定である。
実施例156に記載の蛍光顕微鏡検査に続き、フルオレセイン標識AL16 LNAのみで処理した細胞をさらに3日間インキュベートした。この期間中、緑色蛍光細胞の数は変化していなかったようであった。結論として、フルオレセイン標識LNAオリゴは細胞培養中の条件下において良好な安定性を有する。

実施例 158
覚醒ラットを用いた温水尾軽打テスト（Warm Water Tail Flick Test）におけるアンチセンス ロックされた核酸(LNA)による [D-Ala2] デルトロフィン（Deltorphin）-誘導痛みを与える効果（Antinociception）の阻害。
オスのSprague-Dawley ラット(300 g)にポリエチレンカテーテルをクモ膜下挿入し、注入の前に少なくとも5日間回復させた(コントロールも含む)。アンチセンスLNA化合物(注入あたり12.5および2.5 μg)を3日間にわたり5 μl容量で1日2回投与した(08.00および17.00 h)。運動態度の観察や体重測定からわかるように、どのような非特異性効果または毒性の徴候も検出されなかった。最後の注入の翌日に、[D-Ala2]デルトロフィン (60μg, クモ膜下)をラットに注入し、温水(52℃)尾軽打試験でδオピオイド受容体-媒介痛みを与える効果について試験した。データをグループ中6-8個体のメジアンとして図14に示す(パーセント最大可能応答へ変換したデータ、 % MPE)。統計的な分析を階数によるKruskal-Wallis 1-way ANOVAを用いて行い、次いで処理とコントロールを比較した。図14に示すように、デルトロフィンは生理食塩水で処理したコントロールにおいて強健な抗痛みを与える効果を発揮した。統計的にはこの応答は、生理食塩水で処理したコントロールと比較して両方のアンチセンスLNAグループ(12.5および2.5 μg)において著しく抑制された。

LNA固形支持
実施例 159
DMT-LNA ヌクレオシドコハク酸塩の一般的方法。
塩基保護された DMT-LNA ヌクレオシドおよび無水コハク酸(1.5等量)を無水エチレンジクロライド(〜10 ml/ヌクレオシドのg)に入れた。この混合物にトリエチルアミン(2等量)を加え、混合物を室温で攪拌した。反応をHPLC (トリチル化と同条件)で追跡した。完全に反応した後(>95%)、反応混合物を濃縮し、エチレンジクロライドおよびアセトニトリルと共に蒸発させ、真空中で乾燥してトリエチルアミンを除去した。残渣をエチレンジクロライドまたは酢酸エチル(〜100 ml/出発のヌクレオシドのg)に溶解し、冷たい10%クエン酸(3 x 80 ml/g)および冷水(3 x 80 ml/g)で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、1-2 等量のトリエチルアミンを加えるかまたは加えずに濃縮した。残渣の固体を無水アセトニトリル(2-3x)と共に蒸発させ、真空中で乾燥し、白色固形物として純粋生成物を得た。

LNAヌクレオシド支持体の一般的方法。
塩基保護されたDMT-LNA-ヌクレオシドコハク酸塩(遊離酸またはトリエチルアンモニウム塩、65 μmol/支持体のg)、アミノ誘導支持体(Primer Support^TM 30HL,
160 μmol のアミノ基/支持体のg)、DMAP (3 mg/支持体のg)および1-(3-[ジメチルアミノ]プロピル)-3-エチルカルボジミド塩酸塩(80 mg/支持体のg)を無水ピリジン(6 ml/支持体のg)に入れた。この混合物にトリエチルアミン(16 μl/支持体のg)を加え、混合物を振盪装置で一晩150 rpmに維持した。支持体を濾過し、メタノール (3 x 10 ml/支持体のg)およびジクロロメタン (3 x 10 ml/支持体のg)で洗浄した。空気乾燥後、支持体を真空中で0.5時間乾燥した。これに無水アセトニトリル中の6% DMAP(Cap A, 支持体の〜3 ml/g)および20%無水酢酸/ 30% 2,4,6-コリジン/ 50% アセトニトリル(Cap B, 支持体の〜 3 ml/g)の混合物を加えた。混合物を振盪装置で5時間維持した。支持体を濾過し、無水ジクロロメタン(2 x 10 ml/支持体のg)で洗浄し、上記のように乾燥した。これをCap AおよびCap B (合計容量 6 ml/支持体のg)の混合物に再懸濁し、振盪装置で一晩維持した。支持体を濾過し、メタノール (6 x 10 ml/支持体のg)、ジクロロメタン (3 x 10 ml/支持体のg)で洗浄し、空気中で乾燥した。これをさらに真空中で5-6時間乾燥した。装填量をジメトキシトリチルアッセイによって測定したところ、約40 μmol/gであった。

実施例 160
LNA T モノマーを含むポリdTプライマーを用いた第1の鎖cDNA合成。
LNA T 残基を含むポリdT プライマーの第1鎖cDNA合成を感作する能力を試験するため、反応を設定した。以下のポリdTプライマーを試験した(LNAモノマーは太字):

RPK0140 キット Cy 染料 cDNA 標識キット(Amersham Pharmacia Biotech)からの固定ポリdTプライマーをコントロールとした。

反応を上記プライマーのそれぞれに対し、以下のように設定した:

1μl シロイヌナズナ mRNA 0.5μg/μl
2μl ポリdTプライマー 8pmole/μl
4μl x5 AMV 逆転写酵素緩衝液
1μl 水
8μl 全容量

この混合物を75℃で3分間熱し、次いで少なくとも10分間室温に冷却した。

次いで下記のものをそれぞれの反応に加えた:
1μl 80mM ピロリン酸ナトリウム
1μl ヒト胎盤リボヌクレアーゼ阻害因子20U/μl
7μl 0.5mM dNTP 溶液
2μl [α³³P] dATP 10mCi/ml 3000Ci/mmole
1μl AMV 逆転写酵素 20U/μl
20μl 全容量

反応を42℃で2時間インキュベートした。次いで反応を95℃で3分間熱し、その後6%ポリアクリルアミド7M尿素ゲルに入れた。ゲルを10% 酢酸/ 10%メタノール中に固定し、その後3MMの紙に移して乾燥した。乾燥したゲルを一晩Kodak Biomaxオートラジオグラフィフィルムに暴露した。

オートラジオグラフィにより、オリゴヌクレオチドプライマー RTZ1-4を含むLNAはcDNA合成を効果的にプライムすることができたことがわかる。この反応中で得られたcDNA生成物の量および強度はコントロールの固定ポリdTオリゴヌクレオチドのものと同一であった。RTZ 5はいくらかのcDNAを生成したが、収量は対照のオリゴプライマーの収量と比べて著しく低かった。

実施例 161
セファロースビーズに共有結合的に付着したLNA-修飾オリゴヌクレオチドはRNA分子の配列特異的捕捉において効果的に機能する。
化学(Amy Mueller)によって3つのオリゴを合成し、ポリ(rA)結合について評価した。

200 nmol の各オリゴをパンフレットの指示に従って50 mgの調製したCNBr-活性化セファロース4B (Pharmacia)と結合させた。樹脂中の未反応の結合部位は100 nM Tris pH 8.0中でブロックした。

ポリ(rA)結合分析を2回行うためにオリゴ結合樹脂を2つの部分に分割した(それぞれ〜25 mg樹脂)。ポリ(rA) (ファルマシア) #27-4110-01 (結合緩衝液に28.2 A₂₆₀ ユニット/mlで溶解)を結合するために使用した。SOP QC 5543にしたがって5つのA₂₆₀ ユニットを２つのオリゴ結合樹脂 25 mg に結合させた。未結合の「前進 (breakthrough)」ポリ(rA)をA₂₆₀吸収度により数値化し、結合を計算するために用いた。結合ポリ(rA)の運命は低塩緩衝液による洗浄および数回の溶出により追跡した。表10に示すように、LNAおよびDNAの両方でコートしたビーズはポリ(rA)標的分子の捕捉において効果的に機能した。しかしながら異なるビーズのポリ(rA)溶出プロフィールからわかるように、LNAでコートしたビーズはDNAでコートしたビーズよりも強固にポリ(rA)ターゲットに結合した。結論として、1)LNA T9オリゴはA残基の伸長を含むRNA分子の捕捉において効果的であり、2)捕捉されたRNA分子は対照のDNA T9およびDNA T16オリゴよりもさらに強固にLNA T9オリゴビーズに結合することがいえる。

図１Ａおよび１Ｂは、公知の配座的に束縛されたヌクレオチド類を示す。 図２は、この発明のヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を示す。 図３は、PCR アンプリコンの配列特異的捕捉における LNA 修飾オリゴヌクレオチド類の性能を示す。 図４Ａおよび４Ｂは、LNA 修飾オリゴヌクレオチド類が鎖侵入によりそれの同族の PCR アンプリコンを捕捉し得ることを示す。 図５は、固体表面上に固定された LNA 修飾オリゴヌクレオチド類が、PCR アンプリコンの配列特異的捕捉において効果的に機能することを示す。 図６は、LNA 修飾オリゴヌクレオチド類が T4 ポリヌクレオチドキナーゼの基質として行動しうることを示す。 図７は、LNA 修飾オリゴヌクレオチド類が核酸ポリメラーゼ類のプライマーとして機能しうることを示す。 図８は、LNA 修飾オリゴヌクレオチド類がターゲット増幅工程においてプライマーとして機能しうることを示す。 図９は、5'アントラキノンを有する LNA 修飾オリゴヌクレオチド類が照射により固体支持体上に共有結合的に固定されることができ、かつ固定されたオリゴマーが相補的 DNA オリゴの捕捉において効果があることを示す。 図１０は、LNA-チミジン-5'-トリホスフェート (LNA-TTP) がターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ (TdT) の基質として行動しうることを示す。 図１１は、異なる LNA 修飾 Cy3-標識化8量体とのアレイ上のハイブリッド化および検出を示す。 図１２および１３は、LNA 修飾 Cy3-標識化8量体とのアレイ上の末端ミスマッチのハイブリッド化および検出を示す。 図１２および１３は、LNA 修飾 Cy3-標識化8量体とのアレイ上の末端ミスマッチのハイブリッド化および検出を示す。 図１４は、覚醒ラットにおける温水尾はね試験での [D-Ala2] デルトルフィン（deltorphin）-誘導 アンチノシセプション（antinociception ）の LNA による阻害を示す。 図１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｃは、AT および全 LNA 修飾 Cy3-標識化8量体とのアレイ上の末端ミスマッチのハイブリッド化および検出を示す。 図１６および１７は、LNA が生体ヒト MCF-7 乳がん細胞に届けられうることを示す。 図１６および１７は、LNA が生体ヒト MCF-7 乳がん細胞に届けられうることを示す。 図１８および１９は、[α³³P] ddNTP's および サーモシークエンス（ThermoSequenase）^TM DNA ポリメラーゼのLNA T モノマー類を含有する配列 DNA テンプレートへの使用を示す。 図１８および１９は、[α³³P] ddNTP's および サーモシークエンス（ThermoSequenase）^TM DNA ポリメラーゼのLNA T モノマー類を含有する配列 DNA テンプレートへの使用を示す。 図２０および２１は、エキソヌクレアーゼのないクレノウフラグメントDNA ポリメラーゼ I が LNA アデノシン、シトシン、グアノシンおよびウリジン-5'-トリホスフェート類を DNA 鎖内に組みこむことができるのを示す。 図２０および２１は、エキソヌクレアーゼのないクレノウフラグメントDNA ポリメラーゼ I が LNA アデノシン、シトシン、グアノシンおよびウリジン-5'-トリホスフェート類を DNA 鎖内に組みこむことができるのを示す。 図２２は、末尾 LNA 修飾オリゴヌクレオチドに対するターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ (TdT) の可能性を示す。 図２３Ａおよび２３Ｂは、完全に混合した LNA モノマー類が PCR アンプリコンの配列特異的捕捉において固定化されたビオチニル化-DNA オリゴの性能を著しく増加させるのに使用され得るのを示す。 図２４〜４１は、この発明の LNA モノマー類への可能な合成ルートを示す。 図２４〜４１は、この発明の LNA モノマー類への可能な合成ルートを示す。 図２４〜４１は、この発明の LNA モノマー類への可能な合成ルートを示す。 図２４〜４１は、この発明の LNA モノマー類への可能な合成ルートを示す。 図２４〜４１は、この発明の LNA モノマー類への可能な合成ルートを示す。 図２４〜４１は、この発明の LNA モノマー類への可能な合成ルートを示す。 図２４〜４１は、この発明の LNA モノマー類への可能な合成ルートを示す。 図２４〜４１は、この発明の LNA モノマー類への可能な合成ルートを示す。 図２４〜４１は、この発明の LNA モノマー類への可能な合成ルートを示す。 図２４〜４１は、この発明の LNA モノマー類への可能な合成ルートを示す。 図２４〜４１は、この発明の LNA モノマー類への可能な合成ルートを示す。 図２４〜４１は、この発明の LNA モノマー類への可能な合成ルートを示す。 図２４〜４１は、この発明の LNA モノマー類への可能な合成ルートを示す。 図２４〜４１は、この発明の LNA モノマー類への可能な合成ルートを示す。 図２４〜４１は、この発明の LNA モノマー類への可能な合成ルートを示す。 図２４〜４１は、この発明の LNA モノマー類への可能な合成ルートを示す。 図２４〜４１は、この発明の LNA モノマー類への可能な合成ルートを示す。 図２４〜４１は、この発明の LNA モノマー類への可能な合成ルートを示す。

Claims (2)

1. 一般式Ｉ
   ［式中、Xは、-O-、-S-、-N(R^N*)-、-C(R⁶R^6*)-、-O-C(R⁷R^7*)-、-C(R⁶R^6*)-O-、-S-C(R⁷R^7*)-、-C(R⁶R^6*)-S-、-N(R^N*)-C(R⁷R^7*)-、-C(R⁶R^6*)-N(R^N*)-および-C(R⁶R^6*)-C(R⁷R^7*)-から選択され；
   Bは、水素、ヒドロキシ、任意に置換されたC_1-4-アルコキシ、任意に置換されたC_1-4-アルキル、任意に置換されたC_1-4-アシルオキシ、核塩基、DNAインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから選択され；
   Pは、継続するモノマーへのヌクレオシド間結合のためのラジカル位置または5'-末端基を意味し、そのようなヌクレオシド間結合または5'-末端基は任意に置換基R⁵を含有し；
   置換基R²、R^2*、R³およびR^3*の１つは、先行するモノマーへのヌクレオシド間結合または3'-末端基を意味する基P^*であり；
   R^1*、R^4*、R⁵、R^5*、R⁶、R^6*、R⁷、R^7*、R^N*の存在する置換基から選択される非ジェミナル置換基ならびにP^*を意味しないR²、R^2*、R³およびR^3*の存在する置換基から選択される非ジェミナル置換基の１または２の対(ただし、R^2*とR^4*は唯一の対となり得ない)は、各々、-C(R^aR^b)-、-C(R^a)=C(R^a)-、-C(R^a)=N-、-O-、-Si(R^a)₂-、-S-、-SO₂-、-N(R^a)-および>C=Z［式中、Zは-O-、-S-および-N(R^a)-から選択され、かつR^aおよびR^bは各々独立して、水素、任意に置換されたC_1-12-アルキル、任意に置換されたC_2-12-アルケニル、任意に置換されたC_2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C_1-12-アルコキシ、C_2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C_1-12-アルコキシカルボニル、C_1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、C_1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C_1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C_1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C_1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは任意に置換されていてもよく、ここで２つのジェミナル置換基R^aおよびR^bは、一緒になって任意に置換されたメチレン(=CH₂)を意味してもよく、ここでR^a、R^bならびに存在していてP、P^*またはビラジカル(類)に含まれていない置換基R^1*、R²、R^2*、R³、R^3*、R^4*、R⁵、R^5*、R⁶およびR^6*、R⁷およびR^7*のいずれかから選択される２つの非ジェミナルなまたはジェミナル置換基は、一緒になって上記と同じ種類のビラジカル類から選択された結合したビラジカルを形成してもよい］から選択される１−８の基／原子からなるビラジカルを意味し；
   非ジェミナル置換基の該対は、それにより(i)該非ジェミナル置換基が結合している原子および(ii)いずれかの介在原子と一緒になって単環式または２環式のものを形成し；かつ
   存在していてP、P^*またはビラジカルに含まれていない置換基R^1*、R²、R^2*、R³、R^4*、R⁵、R^5*、R⁶ならびにR^6*、R⁷およびR^7*の各々は、水素、任意に置換されたC_1-12-アルキル、任意に置換されたC_2-12-アルケニル、任意に置換されたC_2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C_1-12-アルコキシ、C_2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C_1-12-アルコキシカルボニル、C_1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、C_1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C_1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C_1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C_1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから独立して選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは任意に置換されていてもよく、ここで２つのジェミナル置換基は一緒になってオキソ、チオキソ、イミノまたは任意に置換されたメチレンを意味してもよく、または任意に-O-、-S-および-(NR^N)-から選択される１以上のヘテロ原子／基によって割り込まれかつ／または末尾をなしている１〜５の炭素原子アルキレン鎖からなるスピロビラジカルを一緒になって形成してもよく、ここでR^Nは水素およびC_1-4-アルキルから選択され、かつここで２つの隣接した(非ジェミナルな)置換基は二重結合を生じる付加的な結合を意味し；かつR^N*は存在するがビラジカル中に含有されないとき、水素およびC_1-4-アルキルから選択され；
   ただし、
   (i)LNAが２環式ヌクレオシド類似体であるとき、R²およびR³は一緒になって-O-CH₂-CH₂-および-O-CH₂-CH₂-CH₂-から選択されるビラジカルを意味せず；
   (ii)LNAが２環式ヌクレオシド類似体であるとき、R³およびR⁵は一緒になって-CH₂-CH₂-、-O-CH₂-から選択されるビラジカルを意味せず；
   (iii)LNAが３環式ヌクレオシド類似体であるとき、R³、R⁵およびR^5*は一緒になってトリラジカル-CH₂-CH(-)-CH₂-を意味せず；
   (iv)LNAが２環式ヌクレオシド類似体であるとき、R^1*およびR^6*は一緒になってビラジカル-CH₂-を意味せず；かつ
   (v)LNAが２環式ヌクレオシド類似体であるとき、R^4*およびR^6*は一緒になってビラジカル-CH₂-を意味しない］
   のヌクレオシド類似体(以後、「LNA」と称する)ならびにその塩基性塩および酸付加塩の少なくとも一つからなるオリゴマー(以後、「LNA修飾オリゴヌクレオチド」と称する)。
2. 一般式II：
   ［式中、置換基Bは、核塩基、DNAインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから選択され；
   Xは、-O-、-S-、-N(R^N*)-および-C(R⁶R^6*)-から選択され；
   置換基R²、R^2*、R³およびR^3*の一つは基Q^*であり；
   QおよびQ^*の各々は、水素、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Prot-O-、Act-O-、メルカプト、Prot-S-、Act-S-、C_1-6-アルキルチオ、アミノ、Prot-N(R^H)-、Act-N(R^H)-、モノ-またはジ(C_1-6-アルキル)アミノ、任意に置換されたC_1-6-アルコキシ、任意に置換されたC_1-6-アルキル、任意に置換されたC_2-6-アルケニル、任意に置換されたC_2-6-アルケニルオキシ、任意に置換されたC_2-6-アルキニル、任意に置換されたC_2-6-アルキニルオキシ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、DNAインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基、リガンド、カルボキシ、スルホノ、ヒドロキシメチル、Prot-O-CH₂-、Act-O-CH₂-、アミノメチル、Prot-N(R^H)-CH₂-、Act-N(R^H)-CH₂-、カルボキシメチル、スルホノメチル（ここで、Protはそれぞれ-OH、-SHおよび-NH(R^H)のための保護基であり、Actはそれぞれ-OH、-SHおよび-NH(R^H)のための活性化基であり、R^Hは水素およびC_1-6-アルキルから選択される）から独立して選択され；
   (i)R²およびR³は一緒になって、-O-、-(CR^*R^*)_r+s-、-(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s-および-(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s-から選択されるビラジカルを意味し；
   (ii)R^2*およびR³は一緒になって、-O-、-(CR^*R^*)_r+s-、-(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s-および-(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s-から選択されるビラジカルを意味し；
   (iii)R³およびR^4*は一緒になって、-(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s-および-(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s-から選択されるビラジカルを意味し；
   (iv)R³およびR⁵は一緒になって、-(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s-および-(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s-から選択されるビラジカルを意味し；または
   (v)R^1*およびR^4*は一緒になって、-(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s-、および-(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s-から選択されるビラジカルを意味し；
   (vi)R^1*およびR^2*は一緒になって、-(CR^*R^*)_r-O-(CR^*R^*)_s-、-(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s-および-(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s-から選択されるビラジカルを意味し；
   ここで、各R^*は、水素、ハロゲン、アジド、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、モノ-またはジ(C_1-6-アルキル)アミノ、任意に置換されたC_1-6-アルコキシ、任意に置換されたC_1-6-アルキル、DNAインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンド、から独立して選択され、かつ/または２つの隣接する(非ジェミナルな)R^*は、一緒になって二重結合を意味してもよく、かつrおよびsの各々は０〜３であり、ただしr+sの合計は１〜４である；
   Q、Q^*またはビラジカル中に含有されない置換基R^1*、R²、R^2*、R³、R^4*、R⁵およびR^5*の各々は、水素、任意に置換されたC_1-12-アルキル、任意に置換されたC_2-12-アルケニル、任意に置換されたC_2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C_1-12-アルコキシ、C_2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C_1-12-アルコキシカルボニル、C_1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、C_1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C_1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C_1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C_1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから独立して選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは任意に置換されてもよく、ここで２つのジェミナル置換基は一緒になってオキソ、チオキソ、イミノまたは任意に置換されたメチレンを意味してもよく、または-O-、-S-および-(NR^N)-から選択される１以上のヘテロ原子／基により任意に割り込まれかつ／または末尾をなしている１〜５の炭素原子アルキレン鎖からなるスピロラジカルを一緒になって形成してもよく、ここでR^Nは水素およびC_1-4-アルキルから選択され、ここで２つの隣接する(非ジェミナルな)置換基は二重結合を生じる付加的な結合を意味してもよく；かつR^N*は存在するがビラジカル中に含有されないときは、水素およびC_1-4-アルキルから選択され；
   ただし第１の条件として、
   (i)R²およびR³は一緒になって-O-CH₂-CH₂-および-O-CH₂-CH₂-CH₂-から選択されるビラジカルを意味せず；かつ
   (ii)R³およびR⁵は一緒になって-CH₂-CH₂-、-O-CH₂-および-O-Si(ⁱPr)₂-O-Si(ⁱPr)₂-O-から選択されるビラジカルを意味せず；
   ただし第２の条件として、オリゴヌクレオチド合成で普及している条件下で反応性ないかなる化学基(核塩基を含む)も、任意に保護された官能基である］
   のヌクレオシド類似体(以後、LNA)ならびにその塩基性塩および酸付加塩。