CN102257147A - 在植物原生质体中使用双链rna提高靶基因改变的效率 - Google Patents

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Abstract

使植物细胞原生质体中靶基因改变的方法，其包括用dsRNA和突变核苷碱基短暂转染原生质体的步骤，该dsRNA优选靶向于植物MMR mRNA。转染可以是同时或依次进行，并且基因可以是在错配修饰系统中起作用的任何基因。

Description

在植物原生质体中使用双链RNA提高靶基因改变的效率
技术领域
本发明涉及生物技术，特别是植物生物技术。本发明尤其涉及在dsRNA分子的存在下使用突变核苷碱基在植物原生质体中进行靶基因改变的方法。本发明进一步涉及提高靶基因改变的效率和使用该技术进行基因改变的应用。
背景技术
遗传修饰是为了修饰细胞的一个或多个遗传编码的生物特性而有意地在该活细胞或部分由细胞形成的生物体或可以再生的生物体的遗传物质上形成变化的过程。这些变化可以采取部分遗传物质的删除，外源遗传物质的添加，或现有遗传物质核苷酸序列的变化的形式。真核生物的遗传修饰方法已被获知超过20年，被广泛地应用于植物，人和动物细胞和微生物中，以在农业，人类健康，食品质量和环境保护领域获得改进。遗传修饰的常规方法包括：将外源DNA片段添加至细胞基因组中，然后由其赋予该细胞或它的生物体超越现存基因编码特性之上的新特性(包括由其抑制现存基因的表达的应用)。尽管许多这类示例可有效地获取期望特性，但是这类方法不是非常精确，因为不能控制插入外源DNA片段的基因组位置的对照(因此不能控制最终的表达水平)，因为期望效果必须在由原始且均衡基因组所编码的天然特性中显现。相反地，会导致预定基因组位点中核苷酸的添加，删除或转变的遗传修饰方法可实现现有基因的精确修饰。
定向于靶基因改变的突变核苷碱基(TGA)是基于将合成的突变核苷碱基(其是包含在Watson-Crick碱基配对特性上与DNA类似的短直核苷酸样基序，但在化学上区别于DNA的分子)递送至真核细胞核内的方法(Alexeev and Yoon，NatureBiotechnol.16：1343，1998；Rice，Nature Biotechnol.19：321，2001；Kmiec，J.Clin.Invest.112：632，2003)。通过在突变核苷碱基的同源序列上有意设计错配核苷酸，可以将该错配核苷酸拷贝至基因组DNA序列中。该方法实现了现有位点中单个或至多几个核苷酸的转变，但可应用于在现有基因上形成终止密码子由此破坏其功能，或形成密码子，其导致具有改变的氨基酸组成的基因编码蛋白(蛋白工程)。
已描述了在植物，动物和酵母细胞中的TGA。在这些研究中使用了两种不同类型的合成突变核苷碱基，嵌合DNA:RNA类型(嵌合体)或单链类型。
嵌合体是仅含有25bp DNA区域的自我互补分子，而25bp互补序列是由在任一侧毗邻着10bp 2’-O-甲基化RNA的5bp DNA核心区所构成的，该2’-O-甲基化RNA被认为有利于嵌合体在细胞中的稳定性。5bp核心区包含在其中心设计的错配核苷酸以在基因组靶DNA序列中被改变。这两个区域通过4bp胸苷发夹连接。导入细胞之后，认为嵌合体会与其靶序列形成双D环且在嵌合体和靶核苷酸之间会形成错配。然后内源细胞DNA修复蛋白会通过转变基因组核苷酸来修复该错配。使用嵌合体的TGA的第一例来自动物细胞(参见Igoucheva等人2001 GeneTherapy 8，391-399)，之后也被用于在植物细胞中得到TGA(Beetham等人1999Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：8774-8778；Zhu等人1999 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，8768-8773；Zhu等人2000 Nature Biotech.18，555-558；Kochevenko等人2003 PlantPhys.132：174-184；Okuzaki等人2004 Plant Cell Rep.22：509-512)。不像人类细胞，发生TGA事件的植物细胞可以再生成完整的植物而TGA突变会转化至下一个世代，使其成为重要经济作物的研究和商业遗传工程的理想工具。然而，许多实验室的广泛研究显示了使用嵌合体的TGA频率是非常低且可变的，或甚至是不可测量的(Ruiter等人2003 Plant Mol.Biol.53，715-729，Van der Steege等人(2001)Nature Biotech.19：305-306)，这取决于以下因素例如目标的转录状态，细胞在细胞周期中的位置，靶序列和嵌合体的质量，而嵌合体的合成是困难的。由于TGA的相对低频率，只有在单个核苷酸的改变造成显性的可选择表型才可以检测到TGA事件。在植物细胞中，特异性点突变被导入乙酰乳酸合成酶(ALS，在玉米AHAS中)基因的开放式读码框，该基因催化支链氨基酸亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸所共有的起始步骤。在烟草中，单个核苷酸的改变足以产生密码子转变P194Q或W571L。这些密码子任一转变之后产生的ALS蛋白对于磺酰脲类型除草剂的抑制是不敏感的，从而提供了对于在染色体位点的单个核苷酸转变的选择的方法。
由于嵌合体运转困难，需要寻找更可靠的供选择的寡核苷酸设计。几个实验室研究了单链突变核苷碱基实施TGA的能力。已发现这些可获得更为再现的结果，更易于合成，并且也可以包括修饰核苷酸以改善细胞中突变核苷碱基的性能(Liu等人2002 Nuc.Acids Res.30：2742-2750；review，Parekh-Olmedo等人2005 GeneTherapy 12：639-646；Dong等人2006 Plant Cell Rep.25：457-65；De Piédoue等人2007 Oligonucleotides 27：258-263)。
在Kmiec的多个专利申请中描述了TGA，尤其在WO0173002，WO03/027265，WO01/87914，WO99/58702，WO97/48714，WO02/10364中。在WO 01/73002中，构想了使用未修饰DNA寡核苷酸获得低效率的基因改变被认为很大程度上是供体寡核苷酸被存在于反应混合物或靶细胞中的核酸酶降解的结果。为了弥补这个问题，提出了引入可使制得的突变核苷碱基抵御核酸酶的修饰核苷酸。典型的示例包括具有硫代磷酸连接或2’-O-类似物甲基类似物的核苷酸。这些修饰优选位于突变核苷碱基的末端，远离围绕靶碱基的中心DNA结构域。为了支持这些，专利申请WO 02/26967显示了增加突变核苷碱基的胞内寿命的某种修饰核苷酸增强在体外试验系统中以及在哺乳动物染色体靶点中的TGA效率。不仅核酸酶抗性，突变核苷碱基与其互补靶DNA的结合亲和力也具有明显增强TGA效率的潜力。含有增强其结合亲和力的修饰核苷酸的单链突变核苷碱基可更高效地在复合基因组中寻找到它的互补靶点和/或保持与靶点结合得更久并使被蛋白调控DNA转录和复制去除的可能性更低。体外TGA试验被用于测试许多修饰核苷酸以改善TGA过程的效率。锁核酸(LNA)和C5-丙炔嘧啶分别具有糖基序和碱基的修饰，它们稳定双螺旋形成并提高了双螺旋的溶解温度。当这些修饰核苷酸被引入突变核苷碱基中时，它们会使TGA效率增加至使用相同序列的未修饰突变核苷碱基的13倍。参见他的WO2007073166和WO2007073170。
在动物和酵母细胞中的研究显示了属于细胞错配修复(MMR)系统的蛋白质在TGA过程中是很重要的。在DNA复制中，偶尔依赖DNA的DNA聚合酶在新合成DNA链(子链)中引入了不正确的核苷酸。这导致DNA双螺旋中的核苷酸错配(如G:A，T:C，G:G等)，其必须被校正以保持细胞的遗传完整性。大肠杆菌(E.coli)的MMR复合物包含3类亚基，MutS，MutL和MutH蛋白。存在几个作为异二聚体起作用的且能够结合DNA双螺旋中的错配的MutS蛋白。这些MutS异二聚体对不同的错配具有不同的亲和力。一旦与该错配结合，MutS异二聚体为该错配吸收MutL异二聚体，其然后吸收MutH蛋白。MutH能够在该错配的附近和在其一侧裂开新合成的DNA链。从裂口开始，核酸外切酶然后能够开始新合成DNA的降解，包括错配核苷酸。然后通过再子链的合成完成错配的修复。MMR系统是普遍存在的，并且在原核和真核基因组包括动物和植物的基因组中都发现了MutS和MutL蛋白的同源体。(参见Kolodner & Marsishky 1999，Curr.Opin.Genet.Dev.9：89-96)。在植物中，存在四种MutS同源体(MSH2，MSH3，MSH6和MSH7)以及四种MutL同源体(MLH1，MLH2，MLH3和PMS1)。通过MutSα(aMSH2::MSH6异二聚体)完成碱基-碱基错对或单个螺旋外核苷酸的错配识别，而通过MutSβ(MSH2::MSH3异二聚体)识别更大的螺旋外环出序列。已鉴别植物中的MSH7基因，但是迄今在动物中还没有鉴别。MSH7与MSH6最为相似，也可与MSH2形成异二聚体(MutSγ)(Culligan & Hays，2000，Plant Cell 12：991-1002)。然而，MutSα和MutSγ对错配范围显示出有所不同的亲和力。缺乏MSH2的细胞不能够识别DNA错配，并显示出突变表型。在缺乏MSH2的拟南芥株(Arabidopsis lines)中，每个世代积累的突变达到植物丧失生存能力的点(T6世代)(Hoffman等人2004Genes & Dev.18：2676-2685)。在苔藓植物立碗藓属(Physcomitrella)中，MSH2的丧失会立即产生有害表型，可能是由于这种植物的单倍体性质(Trouiller等人2006 Nuc.Acids Res.34：232-242)。在微随体中也检测到了在拟南芥MSH2突变体中的遗传损伤，其是基因组的高突变区域(Leonard等人2003 Plant Phys.133：328-338；Depeiges等人2005 Plant Sci.168：939-947)。此外，MSH2突变体显示出增加发散序列之间的躯体和减数分裂的同源重组(Emmanuel等人2005 EMBO Rep.7：100-105；Li等人2006 Plant J.45：908-916)，这表明了非相同序列之间的重组被MMR系统所抑制。
MutL同源体形成以下异二聚体，MutLα(MLH1::PMS1)，MutLβ(MLH1::MLH3)和MutLγ(MLH1::MLH2)且每个异二聚体参与不同DNA损伤的修复。显然MLH1是非常重要的，因为它参与了所有异二聚体，但PMS1作为MutLα异二聚体的部分也发挥了重要作用，它参与了单个错对碱基的修复。最近鉴别了拟南芥PMS1基因(Alou等人2004 Plant Sci.167：447-456)。如所有MMR基因，在成熟植物组织中PMS1的表达非常低，但如所预期的在分裂细胞培养物中表达大幅升高，这是由于其DNA复制错误的修复中的作用。缺乏PMS1的植物和缺乏MSH2的植物一样显示出相同微随体不稳定性，这表明了MutLα功能的丧失足以产生突变株表型(Alou等人2004 Plant Mol.Biol.56：339-349).
已经明确地证实在动物细胞中MMR系统抑制了TGA过程。Dekker等人(2003Nuc.Acids Res.31：e27)在小鼠胚胎干细胞(ES)中实施了TGA实验，并显示出单个核苷酸置换只可在缺乏MSH2的ES株获得。Dekker等人(2006 Gene Therapy 13：686-694)在缺乏MSH3的ES株也发现相似的结果。此外，Igoucheva等人(2008Oligonucleotides 18：111-122)证实了在肝细胞中通过单个核苷酸置换在染色体上整合GFP报告基因的恢复比使用RNAi抑制MSH2表达的株中更有效30倍。使用RNAi短暂的抑制MMR系统也显示出可改善TGA效率。Maguire等人(2007 Gene386：107-114)共转化了携带缺陷型GFP基因的质粒，一种校正该突变的设计的突变核苷碱基和靶向MSH2转录物的siRNAt。尽管MSH2水平的下调被限制了(仅为对照表达的62％)，它们观察到了TGA频率的3倍改善，也有报道在MutL异二聚体中的突变也导致了TGA频率的增加。Yin等人(2005 Biochem.J.390：253-261)报道了在内源β-珠蛋白基因中的TGA频率在缺乏MLH1活性的人结肠癌株中增加了5倍。与MSH2类似，MLH1存在于所有MutL异二聚体中。对于在MMR缺陷型动物细胞株中观察到的TGA效率的增加的最简单解释是突变核苷碱基与其靶点之间形成的错配可被功能性MMR系统检测到因而TGA过程失败了。考虑到用于这些研究中的宽范围细胞类型，显示出MMR系统对于TGA的抑制不限于特定细胞类型。缺乏MMR系统的植物细胞也可因此显示出TGA效率的增加。然而，明显的是不希望使用MMR系统永久下调的植物株，因为它们会持续积累DNA复制相关的错误，并最终变得无法生存。因而，期望暂时下调植物细胞MMR系统的方法。然而，这样的系统在现有技术还没有。
因而迄今没有描述、表明或尝试使用dsRNA暂时抑制植物原生质体中的MMR系统。现有技术中也未公开或表明使用dsRNA暂时抑制植物原生质体中的MMR系统以增加TGA效率。
发明内容
本发明发现通过暂时抑制植物原生质体中的MMR系统明显改善植物细胞中突变核苷碱基的TGA效率。因而本发明涉及转染，优选在体外合成，靶向于植物MMR mRNA的dsRNA与突变核苷碱基结合以在植物基因组中产生期望的核苷酸改变。由于dsRNA对转录水平的下调是暂时的，MMR系统仅失效一定时间，优选约48-72h。在时间上的这个空窗通常是足够的，因为突变核苷碱基在植物原生质体中会快速降解，并通常在大约72小时之后消除，因此优选在导入突变核苷碱基之后的72小时之内发生TGA过程。这个时期之后，MMR转录物会恢复至其正常水平，因此预防复制相关突变的积累。该方法可应用于宽范围的植物物种且是非常灵活的，因为不会生成表达发夹RNAi结构的转基因株，也不用筛选期望的下调，而这些都是费时费力的。事实上，来自许多植物物种的MMR系统的EST编码成分是已知的(表1)，且已经发现这些EST序列可充当体外制备期望dsDNA的模板。
发明详述
因此本发明涉及在植物细胞原生质体中靶基因改变的方法，其包括用以下物质转染原生质体：
●靶向植物MMR mRNA的dsRNA；和
●突变核苷碱基。
如下文所讨论的，以前已经描述了在植物原生质体中特定基因转录物的暂时下调，但未涉及有关TGA的MMR转录物。首次研究是Akashi等人实施的(2001Antisense & Nucl.Acid Drug Dev.11：359-367)。他们利用所谓的发夹RNAi结构(质粒)，其包含作为反向重复被克隆的靶基因的相同互补区，并通过短的非特异性DNA序列分离。转录之后，这些靶基因的互补区退火形成双链RNA区，并与非特异性DNA形成环结构。然后该双链RNA区被DICER加工成小干扰RNA(siRNA)，然后将其引入RISC复合物中并引起目标mRNA的降解。作者证实了在烟草BY-2细胞中，表达靶向于GFP mRNA的发夹RNAi的质粒能够暂时抑制GFP表达。因此，不需要首先将发夹RNAi结构整合到植物基因组中来下调特定mRNA。然而，含有发夹RNAi结构的质粒的构建是困难且耗时的，因此测试了其他形式的抑制dsRNA的mRNA。在类似实验中，An等人(2003 Biosci.Biotechnol.Biochem.67：2674-2677)通过体外转录靶向于荧光素酶mRNA制备了长的双链RNA(dsRNA)。然后将其与表达荧光素酶的质粒共转化至拟南芥原生质体中，其显示出暂时抑制荧光素酶活性。这种抑制不依赖所用的dsRNA长度(50bp，100bp，250bp或500bp)，并且原生质体转化之后长达14天都观察到抑制了90％的荧光素酶表达。因此，体外制备的并转染至细胞内的dsRNA区显示出获得了特定mRNA的暂时下调，但是此外，不下调TGA和与MMR相关的mRNA。对于实际应用，证实体外制备的dsRNA可下调内源植物基因是必要的，该基因的表达与暂时GFP和荧光素酶表达相比水平相对更低。这已经在两个不同植物物种中被证实。首先，An等人(2005 Biosci.Biotechnol.Biochem.69：415-418)显示了dsRNA可将两种内源的拟南芥基因下调80％达3天，之后mRNA水平恢复至对照水平，假定是由于dsRNA分子的降解。其次，Dubouzet等人(2005 Biosci.Biotechnol.Biochem.69：63-70)显示了使用dsRNA抑制参与日本黄连(Coptis japonica)原生质体中黄连素生物合成途径的mRNA获得了相同结果。
在植物细胞中，dsRNA似乎比其他类型的RNA更适宜，因此更优选用于暂时抑制内源基因转录物，而其他类型的RNA分子(siRNA)更常用于在动物研究中。siRNA是短的(～21nt)单链RNA分子，其在体外合成然后被转染至动物细胞，在其中它们被直接引入RISC复合物并定向于它们靶mRNA的序列特异性裂解。虽然siRNA在动物细胞中有效运转，迄今没有描述或表明过将它们用于植物细胞以抑制来自内源植物基因的转录物。siRNA的表达足以抑制在培养的植物细胞中植物病毒的积累(Vanitharani等人2003 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：9632-9636)或降低外源添加的GUS或荧光素酶基因的暂时表达(Bart等人2006 Plant Methods 2：13)，但没有报道siRNA能够暂时抑制内源植物基因mRNA’s。这表明了只用使用长的dsRNA时才能有效地降解内源植物mRNA。在动物细胞中，dsRNA不适合抑制内源哺乳动物基因转录物。在哺乳动物细胞中，dsRNA造成经由干扰素通路的对所有mRNA种类的非特异性抑制和降解，而该通路作为针对病毒感染的防御系统是非常重要的且由病毒dsRNA所触发。因此dsRNA转染至动物细胞中会导致该通路和细胞凋亡的激活。而植物细胞中似乎不存在该通路，因为未报道过dsRNA的转染对原生质体存活具有任何有害作用。因此，尽管使用dsRNA转染植物原生质体也被证实可用于某些特定基因，但没有启示或教导通过使用靶向于MMR相关的mRNA的dsRNA来影响MMR系统。此外，以上引用的所有研究都证实了在原生质体来自于植物细胞悬浮液(体外生长的未分化的植物细胞培养物)时，会发生dsRNA下调植物mRNA’s。这些培养物是易于使用的并提供了几乎无限制的植物细胞来源。然而，这些细胞不能与来自成熟植物的细胞相比。例如，不像来自叶片叶肉细胞的原生质体，烟草BY-2悬浮液细胞分裂快得多且不能够再生为成熟植物。因此在研究开始时，就没有启示dsRNA能够下调来自叶肉细胞原生质体中的内源植物基因转录物，而TGA过程必须使用叶肉细胞才能实现最终再生为成熟植物。
可同时用dsRNA实施转染，即在一个转染步骤中添加dsRNA和突变核苷碱基，其对效率原因是优选的。然而，在特定实施方案中，可有利地首先用dsRNA转染原生质体，之后在一定时间之内用突变核苷碱基转染，反之亦然，即首先导入突变核苷碱基然后是dsRNA。在特定实施方案中，优选该时间段不超过48小时。在特定实施方案中，用dsRNA和突变核苷碱基(反之亦然)转染之间间隔不大于1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、18、24、36、48小时。有利地，可以首先导入dsRNA，靶向于MMR基因，在足以下调MMR系统时导入突变核苷碱基。也可有利地首先导入突变核苷碱基之后是dsRNA，因为在突变核苷碱基激活MMR系统之前会花费一些时间，该空窗可成功开展TGA。
dsRNA通常具有30-5000bp的长度。优选长度可处于100-500bp的范围。
可被靶向的MMR基因原则上可以是任何MMR相关基因。然而也有优选，对于一致的MMR系统靶基因，例如MutS和/或MutL MMR基因，更优选MSH2、MSH3、MSH6、MSH7、MLH1、MLH2、MLH3和PMS1。在特定实施方案中，可以通过数据库分析，借助与MMR相关的分类或同一性鉴别基因并测试dsRNA的活性来确定相关基因。在特定实施方案中，可根据与MMR相关基因具有密切的同一性百分比的基因和基因片段设计dsRNA，如表1所列的那些。“同一性”是测量核苷酸序列或氨基酸序列的同一性。通常地，排列序列以便获得最高级别的匹配。每个序列的“同一性”具有领域公知的含义并可使用公开技术进行计算。参见例如(COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY，Lesk，A.M.，ed.，OxfordUniversity Press，New York，1988；BIOCOMPUTING：INFORMATICS ANDGENOME PROJECTS，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA，PART I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；SEQUENCE ANALYSIS INMOLECULAR BIOLOGY，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和SEQUENCEANALYSIS PRIMER；Gribskov，M.和Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。然而存在大量的方法可测量两个多核苷酸或多肽序列之间的同一性，术语“同一性”对技术人员是公知的(Carillo，H.，和Lipton，D.，SIAM J.Applied Math(1988)48：1073)。常用于确定两个序列之间同一性或相似性的方法包括但不限于：在GUIDE TO HUGE COMPUTERS，Martin J.Bishop，ed.，Academic Press，SanDiego，1994，和Carillo，H.，和Lipton，D.，SIAM J.Applied Math(1988)48：1073所公开的那些。确定同一性和相似性的方法被编码成计算机程序。优选的确定两个序列之间同一性和相似性的计算机程序方法包括但不限于GCS程序包(Devereux，J.，等人，Nucleic Acids Research(1984)12(1)：387)，BLASTP，BLASTN，FASTA(Atschul，S.F.等人，J.Molec.Biol.(1990)215：403)。
作为示例说明，与编码特定序列的多肽的参照核苷酸序列，在核苷酸序列上具有至少例如95％“同一性”的多核苷酸，其旨在使该多核苷酸的核苷酸序列与对照序列是相同的，除了多核苷酸序列可包括在参照多肽序列的每100个核苷酸上高达五个点突变。换而言之，为了获得与参照核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，参照序列中高达5％的核苷酸可被删除和/或被另一核苷酸置换，和/或高达参照序列总核苷酸5％的核苷酸数量可被插入至参照序列中。这些参照序列的突变可发生在参照核苷酸序列的5’或3’末端位置，或两末端之间的任何位置，单个分散在参照序列的核苷酸之间或在参照序列内形成一个或多个连续组。
本发明所述的方法导致优选在植物细胞原生质体中至少一个或多个MMR基因的下调，其足以实现用突变核苷碱基实施TGA。优选地该下调是特异性的，即其他mRNAs不会下调至明显影响操控植物细胞原生质体的其他生物系统的程度，即与缺乏dsRNA下它的正常功能性相比扰乱不大于5％，10％，15％，或25％。
植物可以是任何植物，优选选自单子叶或双子叶植物。优选的植物是葫芦科(Cucurbitaceae)、禾本科(Gramineae)、茄科(Solanaceae)或拟南芥(Asteraceae)(菊科(Compositae))、玉米(玉蜀黍属(Zea species))、小麦(小麦属(Triticum species))、大麦(如大麦属(Hordeum vulgare))、燕麦(如燕麦属(Avena sativa))，高粱(双色高粱(Sorghum bicolour))、黑麦(黑麦属(Secale cereale))、大豆(Glycine spp，如G.max)、棉花(棉属(Gossypium species如G.hirsutum、G.barbadense)、芸薹属(Brassica spp.)(如B.napus、B.juncea、B.oleracea、B.rapa，等)、向日葵(向日葵属(Helianthusannus))、红花、山药、木薯、紫花苜蓿(紫花苜蓿属(Medicago sativa))、水稻(水稻属(Oryza species)，如O.sativa印度培育品种或日本培育品种)、饲草、黑黍(Pennisetum spp.如P.glaucum)、树物种(松属(Pinus)、白杨(poplar)、枞树(fir)、车前草(plantain)等)、茶、咖啡、油棕、椰子、蔬菜物种例如豌豆、西葫芦、豆类(如菜豆属(Phaseolus species))、辣椒、黄瓜、洋蓟、芦笋、茄子、绿花椰菜、大蒜、韭菜、莴苣、洋葱、萝卜、芜菁、番茄，、土豆、甘蓝、胡萝卜、花椰菜、菊苣、芹菜、菠菜、苣买菜、茴香、甜菜、承载肉果的植物(葡萄、桃子、李子、草莓、芒果、苹果、李子、樱桃、杏、香蕉、黑莓、蓝莓、柑橘、奇异果、无花果、柠檬、酸橙、油桃、覆盆子、西瓜、橙子、葡萄柚等)、观赏物种(如玫瑰、牵牛花、菊花、百合、大丁草属)、草药(薄荷、欧芹、罗勒、百里香等)、木质树(如杨、柳、栎、桉树属)、纤维物种例如亚麻(栽培亚麻(Linum usitatissimum))和大麻(大麻属(Cannabis sativa))，和其他。
最优选的是茄科，例如烟草，番茄。也优选莴苣和/或芸薹。
突变核苷碱基可以是本领域所述的任何突变核苷碱基，例如在专利申请WO2007073149、WO2007073154和WO2007073170中公开的那些。
因此，突变核苷碱基可含有以下的一种或多种：
a.硫代磷酸修饰，优选在突变核苷碱基的一端或双端或其附近；
b.丙炔取代，优选不在突变核苷碱基的一端或双端或其附近；
c.LNA取代，优选不在突变核苷碱基的一端或双端或其附近。
硫代磷酸修饰可用于保护核苷碱基免于原生质体系统中存在的核酸酶降解。
优选不在突变核苷碱基的一端或双端或其附近的丙炔取代可增强与将通过TGA改变的靶序列的亲和力。优选不在突变核苷碱基的一端或双端或其附近的LNA取代也可增强与将通过TGA改变的靶序列的亲和力。LNA或丙炔修饰的寡核苷酸的使用可导致TGA效率的增加。
下文将进一步具体地描述可以使用的修饰突变核苷碱基。
LNA修饰的突变核苷碱基：
在特定实施方案中，突变核苷碱基含有至少一个，优选至少2个，更优选至少3个LNA修饰核苷酸。在特定实施方案中，突变核苷碱基可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个以上的LNA修饰核苷酸。在特定实施方案中，突变核苷碱基可含有高达1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个LNA修饰核苷酸。在特定实施方案中，突变核苷碱基可含有范围处于上述上下限之间的LNA。
在特定实施方案中，至少一个LNA处于距离错配最多10个核苷酸的位置，优选最多8个核苷酸，更优选最多6个核苷酸，还更优选最多4、3或2个核苷酸。在更优选实施方案中，至少一个LNA处于距离错配1个核苷酸的位置，即一个核苷酸处于错配和LNA之间。在涉及含有一个LNA以上的突变核苷碱基特定实施方案中，每个LNA位于距离错配至少一个核苷酸的位置。在优选实施方案中，LNAs不是位于彼此相邻，而是位于隔开至少一个核苷酸，优选两个或多个核苷酸的位置。在特定实施方案中，如果突变核苷碱基有两个或多个(甚至更多)LNA修饰，则修饰与错配间隔相等(大约)的距离。换而言之，优选LNA修饰对称地处于错配周围。例如，在优选实施方案中，两个LNA对称地处于错配周围并与错配距离1个核苷酸(相互距离3个核苷酸)。在特定实施方案中，LNA位于离突变核苷碱基的末端4-6个核苷酸的位置开始，且可以是任一端。
在特定实施方案中，最多50％的突变核苷碱基的修饰核苷酸是LNA衍生物，即常规A、T、C、或G被其LNA对应物所取代，优选最多40％，更优选最多30％，还更优选最多20％，且最优选最多10％。锁核酸(LNA)是具有可用于反义基因治疗的最有兴趣特性的DNA类似物。LNA是双环和三环核苷和核苷酸类似物和含有这些类似物的突变核苷碱基。在许多公开文献和专利中公开了LNA及相关类似物的基础结构和功能特性，包括WO 99/14226、WO 00/56748、WO00/66604、WO98/39352、美国专利No.6,043,060,和美国专利No.6,268,490，其全部内容都引入本文作为参考。
特别地，它联合了辨别正确和不正确靶点之间极高的生物稳定性(低更新)的能力(高特异性)和前所未有的亲和力(极高的与靶点的结合强度)。事实上，LNA记录的亲和力增加远高于所有之前报道过的处于低级-中级范围的亲和力。
LNA是RNA类似物，其中核糖在结构上受到2’-氧和4’-碳原子之间亚甲基桥的限制。该桥限制了呋喃核糖环的灵活性并将该结构锁在刚性双环构造中。这种所谓的N类型(或3’-endo)构象导致含有双螺旋的LNA Tm的增加，并由此具有更高的结合亲和力和更高的特异性。事实上NMR谱研究已证实被锁住的LNA糖的N类型构象，而且揭示了LNA单体能够将它的未修饰核苷酸邻居弯曲成N类型构象。重要的是，LNA的有益特性不能达到其他重要特性的代价，因为其经常在核酸类似物被观察到。
可以将LNA与构成DNA类似物世界的所有其他化学成分自由地混合。LNA碱基可被引入突变核苷碱基，作为短的全-LNA序列或更长的LNA/DNA嵌合体。LNAs可位于内部，3’或5’的位置。然而，由于它们的刚性双环构象，LNA残基有时会阻碍核酸链的螺旋弯曲。因此通常不太优选设计具有两个或多个相邻LNA残基的突变核苷碱基。优选地，LNA残基被至少一个不会阻碍螺旋弯曲的(修饰)核苷酸，例如常规核苷酸(A，C，T，或G)间隔。
原始发展并优选的LNA单体(β-D-氧基-LNA单体)已被修饰成新的LNA单体。新的α-L-氧基-LNA显示出针对3’外切核酸酶活性的更好稳定性，也比β-D-氧基-LNA在设计有效的反义寡核苷酸上更强大更通用。也可使用木-LNAs和L-核糖LNAs，如WO9914226、WO00/56748、WO00/66604所公开的。在本发明中，上述任何类型的LNA都可有效地实现本发明的目标，即改善TGA的效率，并优选β-D-LNA类似物。
在TGA领域中，LNA修饰已被列在可能用于替换TGA所用的嵌合分子的突变核苷碱基修饰的列表中。然而，现有技术迄今没有启示，可表明当LNA处于远离错配至少一个核苷酸的位置和/或突变核苷碱基不含有约75％以上的LNA(几乎达到最接近核苷酸总数量)时，LNA修饰的单链突变核苷碱基可明显增强TGA效率至目前所发现的程度。
丙炔修饰的突变核苷碱基：
含有在C5位上具有丙炔基的嘧啶核苷酸的突变核苷碱基比它们对应的嘧啶衍生物形成更稳定的双螺旋和三螺旋。在7位上具有相同丙炔取代基的嘌呤形成还更稳定的双螺旋并因此被优选。在特定优选实施方案中，通过使用7-丙炔嘌呤核苷酸(8-氮杂-7-脱氮杂-2’-脱氧鸟苷和8-氮杂-7-脱氮杂-2’-脱氧腺嘌呤的7-丙炔衍生物)可进一步提高效率，其可将结合亲和力增强至比C5丙炔嘧啶核苷酸更高的程度。这种核苷酸尤其公开在He & Seela，2002 Nucleic Acids Res.30：5485-5496中。
丙炔基是具有三键的三碳原子链。三键与核苷酸基本结构共价结合，该基本结构位于嘧啶的C5位上和嘌呤核苷酸的7位上。胞嘧啶和胸苷都可以装配C5丙炔基，分别形成C5-丙炔-胞嘧啶和C5-丙炔-胸苷。单个C5-丙炔-胞嘧啶残基增加Tm 2.8℃，单个C5-丙炔-胸苷增加1.7℃。
(Froehler等人1993 Tetrahedron Letters 34：1003-6；Lacroix等人1999Biochemistry 38：1893-1901；Ahmadian等人1998 Nucleic Acids Res.26：3127-3135；Colocci等人1994 J.Am.Chem.Soc 116：785-786).这归因于C5位上1-丙炔基的疏水性，也可实现碱基更好的叠加，因为丙炔基对于杂环碱基更为扁平。
在特定实施方案中，修饰核苷碱基是丙炔修饰核苷碱基，最优选C7丙炔嘌呤或C5-丙炔嘧啶。在特定实施方案中，嘌呤是腺苷或鸟苷和/或嘧啶是胞嘧啶、尿嘧啶或胸苷，更优选地修饰核苷酸是嘧啶和/或修饰核苷酸是嘌呤。
在特定实施方案中，至少10％的嘧啶和/或嘌呤被其相应的丙炔化衍生物所替换，优选至少50％，更优选至少75％，最优选至少90％。
优选地，不修饰错配位置上的核苷酸。在一个实施方案中，至少一个修饰核苷酸不位于错配的附近，优选位于错配的2、3、4、6、7、8、9，、或10个核苷酸之内。
本发明所述的突变核苷碱基可进一步含有改善杂交特性的修饰，以便突变核苷碱基展示出增加的对靶DNA链的亲和力，从而使突变核苷碱基的插入更容易。突变核苷碱基也可被进一步修饰成具有针对核酸酶的更强抗性，稳定三螺旋或四螺旋结构。对C5丙炔取代嘧啶突变核苷碱基的修饰可包括硫代磷酸修饰、2-OMe取代、使用不同LNAs(锁核酸)、PNAs(肽核酸)、核糖核酸和其它修饰基，优选增强突变核苷碱基和受体链之间杂交稳定性的其他碱基。
根据本发明方法在改变细胞中获得应用，通过恢复至野生型校正突变，诱导突变，通过破坏编码区使酶失活，通过改变编码区修饰酶的生物活性，通过破坏编码区修饰蛋白，错配修复，(植物)遗传物质的靶向改变，包括基因突变，靶基因修复和基因敲除。
附图说明
图1：被翻译的用作dsRNA制备的模板的烟草和番茄PMS1区并与其他PMS1同源体排列的区域。
图2：导入靶向于PMS1转录物的dsRNA之后在烟草叶肉原生质体中的相对PMS1转录水平。叶肉原生质体用dsRNA(RNA)或水(MQ)处理，转染后直接(RNA-0，MQ-0)、24小时(RNA-1，MQ-1)、48小时(RNA-2，MQ-2)、72小时(RNA-3，MQ-3)从原生质体分离总RNA。
图3：番茄MLH1和MSH2 cDNA’s的序列。指出了所产生的用于dsRNA制备的PCR产物。
具体实施方式
实施例
实施例1
烟草叶肉原生质体中PMS1 mRNA的暂时抑制
进行实验以证实dsRNA能够下调烟草叶肉原生质体中的PMS1 mRNA。
材料与方法
dsRNA的生成
从公开数据库中筛选拟南芥PMS1的烟草同源体。然后使用RACE PCR分离全长克隆并测序。设计用于扩增烟草PMS1的PCR产物的引物，烟草PMS1将充当RNA合成的模板。这会产生186bp的PCR产物。PCR产物的翻译以及与其他PMS1同源体的排列如图1所示。
每个模板，扩增2个PCR产物，它们序列相同但在相反的链上具有T7 RNA聚合酶启动子序列。使用1μg每个PCR产物进行体外RNA转录，使用T7 RiboMAX表达RNAi体系(Promega)，其会导致对应PCR产物的上链或下链的单链RNA的产生。按照每个生产商的说明，纯化互补RNA链并退火生成dsRNA。
烟草原生质体的分离和转化
在体外将烟草(Nicotiana tabacum)cv Petit Havana株SR1的芽培养物在25℃2000lux的16/8h光照周期和60-70％RH保持在高玻璃瓶中的含有0.8％Difco琼脂的MS20培养基中。MS20培养基是含有2％(w/v)蔗糖，未添加激素和0.8％Difco琼脂的基础Murashige和Skoog′s培养基(Murashige，T.和Skoog，F.，Physiologia Plantarum，15：473-497，1962)。收割3-6周龄的芽培养物的完全展开叶片。将叶片切成1mm厚的条状，然后将其转移至含有45ml MDE基础培养基的大(100mmx100mm)皮氏培养皿(Petri dishes)中进行预质壁分离处理30分钟。在900ml总体积中的MDE基础培养基含有0.25g KCl、1.0g MgSO4.7H2O、0.136g KH2PO4、2.5g聚乙烯吡咯烷酮(MW 10,000)、6mg萘乙酸和2mg 6-苄氨基嘌呤。用山梨醇将溶液的渗透压浓度调整至600mOsm.kg-1，pH调整至5.7。然后添加5mL酶原液SR1。每100ml酶原液含有750mg纤维素酶Onozuka R10、500mg崩溃酶和250mg离析酶，并通过Whatman滤纸和灭菌过滤器过滤。在25℃暗处进行过夜消化。将消化叶片通过50μm尼龙滤网过滤至无菌烧杯中。使用等体积的冷KCl洗涤培养基洗涤滤网并与原生质体悬浮液混合。每升KCl洗涤培养基含有2.0g CaCl2.2H2O和使渗透压浓度达到540mOsm.kg-1的足够量甘露醇。将悬浮液转移至10mL导管中，在4℃85x g下将原生质体离心10分钟。丢弃上清液，将原生质体粒状物小心重悬在5mL冷MLm洗涤培养基，它是正常浓度一半的MS培养基(Murashige，T.和Skoog，F.，Physiologia Plantarum，15：473-497，1962)的主要养分，每升2.2g CaCl2.2H2O和使渗透压浓度达到540mOsm.kg-1的甘露醇量中。合并2个导管的内容物，并在4℃85x g下离心10分钟。丢弃上清液，将原生质体粒状物小心重悬在5mL冷MLm洗涤培养基中，它是用蔗糖替换甘露醇的MLm培养基。
混合2个导管的内容物，然后在蔗糖溶液保护层之上添加1mL KCl洗涤培养基，以其被取走不会搅乱下层相。将原生质体在4℃85x g下离心10分钟。小心收集在蔗糖和含有活原生质体的KCl溶液之间的中间相。添加等体积的KCl洗涤培养基并小心混合。用血球计测量原生质体密度。
dsRNA的导入和原生质体再生
将原生质体悬浮液在5℃85x g下离心10分钟。丢弃上清液，并将原生质体粒状物以终浓度106.mL-1重悬在KCl洗涤培养基中。在10mL导管中，温和但充分混合250μL原生质体悬浮液+/-12.5μg dsRNA和250μl PEG溶液(40％PEG4000(Fluka#81240)、0.1M Ca(NO3)2、0.4M甘露醇)。20分钟之后，室温温育，并逐滴添加5mL冷0.275M Ca(NO3)2。将原生质体悬浮液在4℃85x g下离心10分钟，丢弃上清液。然后将原生质体粒状物小心重悬浮在2.5mL补充了50μg.mL-1头孢噻亏和50μg.mL-1万古霉素的To培养基中。T0培养基含有(每升，pH 5.7)950mg KNO3、825mg NH4NO3、220mg CaCl2.2H2O、185mg MgSO4.7H2O、85mgKH2PO4、27.85mg FeSO4.7H2O、37.25mg Na2EDTA.2H2O、根据Heller′s培养基(Heller，R.，Ann Sci Nat Bot Biol Veg 14：1-223，1953)的微量养分、根据Morel和Wetmore′s培养基(Morel，G.和R.H.Wetmore，Amer.J.Bot.38：138-40，1951)的维生素、2％(w/v)蔗糖、3mg萘乙酸、1mg 6-苄氨基嘌呤和使渗透压浓度达到540mOsm.kg-1的甘露醇量，并转移至35mm皮氏培养皿中。
PMS1 mRNA水平的定量
使用RNAeasy试剂盒(Qiagen)从原生质体分离总RNA。使用Quantitect RT试剂盒(Qiagen)进行cDNA合成。使用Light Cycler装置(Roche)和扩增来自烟草PMS1 mRNA的126bp产物的引物5’-AGCAGTTCCCTTCAGCAAAAAT[SEQ IDNO 1]和5’-GAATCGGCGGTATCATCCTTAT[SEQ ID NO 2]测量内源PMS1的水平。对于每个时间点，实施5次独立的原生质体转染。为了烟草PMS1的标准化，测量每个样品中的肌动蛋白mRNA水平。
结果
qPCR分析结果如图1所示。
在烟草叶肉原生质体中，通过添加dsRNA可明显降低PMS1 mRNA水平。结果证实了dsRNA转染之后24小时，PMS1 mRNA水平降至对照对平的25％。显然PMS1 mRNA的下调是暂时的，因为在48-72小时之后就观察到了PMS1 mRNA水平的部分恢复，推测是由于dsRNA的降解。dsRNA对其他mRNA种类的表达没有非特异性影响，例如肌动蛋白mRNA的水平，评估了每个样品标准化PMS1表达。因而，在体外烟草叶肉原生质体中，合成dsRNA能够暂时地、特异性地下调MMR mRNA。
实施例2
在烟草中使用靶向PMS1的dsRNA的TGA实验
使用突变核苷碱基PB124(5’A*T*C*A*TCCTACGTTGCACTTG*A*C*C*G[SEQ ID NO 3])进行实验。其对应烟草中编码乙酰乳酸合成酶(ALS)同源体的SurB基因的非转录链。该寡核苷酸含有与SurB的单个错配(下划线)，这使得SurB的脯氨酸191转变成谷氨酸，并给予对磺酰脲类除草剂的显性抗性表型。星号表示硫代磷酸连接，其中磷酸连接的非桥氧原子被硫原子所取代。已知这种修饰连接对外切核酸酶攻击具有更强抗性，从而延长了突变核苷碱基在细胞中的寿命。
如实施例1所述制备烟草原生质体。将12.5μg ds RNA和10μg PB124转染至等份的原生质体中，最后将其重悬在1.25ml的T0培养基中，将悬浮液转移至35mm皮氏培养皿中。添加等体积的T0琼脂糖培养基并温和混合。在25℃暗处温育样品并按下文进一步培养。
原生质体的培养和再生
培养10天之后，将琼脂糖块切成6等份并转移至含有22.5mL补充了20nM氯磺隆的MAP1AO培养基的皮氏培养皿中。该培养基含有(每升，pH 5.7)950mgKNO3、825mg NH4NO3、220mg CaCl2.2H2O、185mg MgSO4.7H2O、85mgKH2PO4、27.85mg FeSO4.7H2O、37.25mg Na2EDTA.2H2O、为原始浓度十分之一的根据Murashige和Skoog′s培养基(Murashige，T.和Skoog，F.，PhysiologiaPlantarum，15：473-497，1962)的微量养分、根据Morel和Wetmore′s培养基(Morel，G.和R.H.Wetmore，Amer.J.Bot.38：138-40，1951)的维生素、6mg丙酮酸盐、12mg每种苹果酸、富马酸和柠檬酸、3％(w/v)蔗糖、6％(w/v)甘露醇、0.03mg萘乙酸和0.1mg 6-苄氨基嘌呤。将样品在25℃低亮度下温育6-8周。然后将生长的愈伤组织转移至MAP1培养基中并使其再生长2-3周。MAP1培养基与MAP1AO培养基具有相同成分，但用3％(w/v)甘露醇替代6％，并且有46.2mg.l-1组氨酸(pH 5.7)。其用0.8％(w/v)Difco琼脂将其固化。
然后用无菌镊子将愈伤组织转移至RP培养基中。RP培养基含有(每升，pH 5.7)273mg KNO3、416mg Ca(NO3)2.4H2O、392mg Mg(NO3)2.6H2O、57mgMgSO4.7H2O、233mg(NH4)2SO4、271mg KH2PO4、27.85mg FeSO4.7H2O、37.25mg Na2EDTA.2H2O、为公开浓度五分之一的根据Murashige和Skoog′s培养基的微量养分、根据Morel和Wetmore′s培养基(Morel，G.和R.H.Wetmore，Amer.J.Bot.38：138-40，1951)的维生素、0.05％(w/v)蔗糖、1.8％(w/v)甘露醇、0.25mg玉米素和41nM氯磺隆，并用0.8％(w/v)Difco琼脂将其固化。2-3周之后将成熟芽转移至根培养基中。
结果
TGA实验的结果如表3所示。
表3.在烟草原生质体中使用dsRNA下调内源PMS1表达的TGA实验
烟草PMS1的下调使TGA效率增加至少30倍。由20个用突变核苷碱基和dsRNA处理的愈伤组织再生了芽并进行了基因分型。从这些植物中分离DNA并扩增含有P191的SurB PCR产物且对其测序。所有植物都显示出预期的P191Q突变，因此我们得出结论在这些株中确实发生了TGA。
在番茄中使用靶向PMS1的dsRNA的TGA实验
使用表4所列的突变核苷碱基进行这些实验。在番茄中，ALS是多拷贝基因，在植物转录数据库(http://planta.tigr.org)中存在两个全长EST’s。在研究中，我们将转录物TA37274_4081定义为ALS1并将转录物TA37275_4081定义为ALS2。ALS1编码659AA的蛋白而ALS2编码657AA的蛋白。ALS1和ALS2在DNA和蛋白水平上分别显示出93％和96％的同一性。两个蛋白的主要区别在于蛋白中负责靶向叶绿体的信号肽区域。尽管有这些区别，ALS1和ALS2蛋白都预测可靶向叶绿体。之前的研究显示了ALS保守残基上的几个氨基酸变化足以给予针对磺酰脲类型除草剂的半显性抗性。其中之一是P184Q变化。在之前我们发现了当突变核苷碱基包含C5-丙炔和LNA(锁核酸)修饰时，番茄原生质体中的TGA效率增加了8倍。因此，在该研究中我们引入正常DNA突变核苷碱基或设计的C5-丙炔和LNA修饰的突变核苷碱基以在ALS2中产生P184Q改变，同时将靶向番茄PMS1的dsRNA(205bp)导入了番茄叶片原生质体。
Figure BPA00001390401400151
表4.y＝5-丙炔-2′-脱氧胞苷；z＝5-丙炔-2′-脱氧尿嘧啶；s＝LNAA；v＝LNA T；w＝LNA C；x＝LNA G；U＝脱氧尿嘧啶；*＝硫代磷酸连接。所有突变核苷碱基都是通过Eurogentec合成和HPLC纯化。与靶点形成错配的核苷酸是下划线的。
番茄原生质体实验
番茄原生质体分离和纯化
番茄叶片原生质体的分离和再生在之前已有描述(Shahin，1985Theor.Appl.Genet.69：235-240；Tan等人1987 Theor.Appl.Genet.75：105-108；Tan等人1987 Plant Cell Rep.6：172-175)且在这些公开文献中可查询所需的溶液。简而言之，番茄(Solanum lycopersicum)种子用0.1％次氯酸盐灭菌，并在体外在25℃在2000lux的16/8小时光照周期和50-70％相对湿度在灭菌MS20培养基中生长。将1g新收集的叶片置于含有5ml CPW9M的圆盘中，并使用手术刀片将主茎垂直切成每mm。将它们转移至含有25ml酶溶液(CPW9M含有2％纤维素酶onozukaRS、0.4％离析酶onozuka R10、2.4-D(2mg/ml)、NAA(2mg/ml)、BAP(2mg/ml)pH5.8)的新板上，并在25℃暗处消化过夜。然后通过将其在定轨振荡器(40-50rpm)中放置1小时使原生质体游离出来。通过50μm滤筛从细胞碎片中分离原生质体，用CPW9M洗涤滤筛两次。原生质体在85g离心，丢弃上清液，然后将其吸收在一半体积的CPW9M中。原生质体最终吸收在3ml CPW9M中，然后小心添加3mlCPW18S以避免两种溶液混合。将原生质体在85g旋转10分钟并使用长的巴斯德吸管收集漂浮在中间相层上的存活原生质体。通过添加CPW9M将原生质体体积增加至10ml，并在血球计中测定回收的原生质体数量。将原生质体悬浮液在5℃85x g下离心10分钟。丢弃上清液并将原生质体粒状物以终浓度106.mL-1重悬在CPW9M洗涤培养基中。在10mL导管中，温和但充分混合250μL原生质体悬浮液+/-12.5μg dsRNA和250μl PEG溶液(40％PEG4000(Fluka#81240)、0.1MCa(NO3)2、0.4M甘露醇)。20分钟之后，室温温育，并逐滴添加5mL冷0.275MCa(NO3)2。将原生质体悬浮液在4℃85x g下离心10分钟，丢弃上清液。
番茄原生质体浸入藻酸盐溶液中进行再生和除草剂抗性的愈伤组织的选择。添加2ml藻酸盐溶液(甘露醇90g/l、CaCl2.2H2O 140mg/l、藻酸-Na 20g/l(SigmaA0602))并通过颠转充分混合。将1ml该溶液平铺在Ca琼脂平板(72.5g/l甘露醇、7.35g/l CaCl2.2H2O、8g/l琼脂)上并允许其聚合。然后将藻酸盐圆片转移至含有4ml K8p培养基的4cm皮氏培养皿中，在30℃暗处温育7天，且不进行除草剂选择。然后将圆片切成5mm宽的条状，平铺在含有20nM氯磺隆的TM-DB愈伤组织诱导培养基上。30℃温育4-5周之后显现出除草剂抗性的愈伤组织，然后将个体转移至含有20nM氯磺隆的GM-ZG芽培养基中进一步生长。
结果
使用dsRNA下调PMS1 mRNA水平的TGA实验结果如表5所示。
表5靶向PMS1的dsRNA增加了番茄叶肉原生质体中的TGA效率
Figure BPA00001390401400161
和在烟草中一样，在番茄中通过dsRNA暂时下调PMS1将TGA频率提高了大约30倍。对含有P184密码子的ALS2基因区域的分析证实了除草剂抗性愈伤组织确实具有预期的P184Q改变。
实施例3
在番茄叶肉原生质体中通过dsDNA抑制MMR mRNA’s
实施实验以证实dsRNA能够下调番茄叶肉原生质体中的MLH1 mRNA。
番茄MLH1 dsRNA的生成
在公开的番茄基因组数据库中筛选拟南芥MLH1和MSH2的番茄同源体。设计引物扩增这些基因的片段，其充当合成RNA的模板。使用番茄cDNA作为模板制备PCR产物。番茄的MLH1和MSH2序列和用于合成dsRNA的区域如图3所示(下划线)。
每个模板，扩增2个PCR产物，它们序列相同但在相反的链上具有T7 RNA聚合酶启动子序列。使用每种1μg PCR产物进行体外RNA转录，使用T7 RiboMAX表达RNAi体系(Promega)，这会产生对应PCR产物的上链或下链的单链RNA。按照每个生产商的说明，纯化互补RNA链并退火生成dsRNA。此外，我们也制备了相同长度但包含随机DNA序列(非特异性dsRNA)的dsRNA分子。其被包含在实验中作为外部对照以确立dsRNA是否以非特异性方式影响mRNA丰度。
番茄原生质体
番茄原生质体的分离和纯化
番茄叶片原生质体的分离和再生在之前已有描述(Shahin，1985Theor.Appl.Genet.69：235-240；Tan等人1987 Theor.Appl.Genet.75：105-108；Tan等人1987 Plant Cell Rep.6：172-175)且在这些公开文献中可查询所需的溶液。简而言之，番茄(Solanum lycopersicum)种子用0.1％次氯酸盐灭菌，并在体外在25℃在2000lux的16/8小时光照周期和50-70％相对湿度在灭菌MS20培养基中生长。将1g新收割的叶片置于含有5ml CPW9M的圆盘中，并使用手术刀片将主茎垂直切成每个mm。将它们转移至含有25ml酶溶液(CPW9M含有2％纤维素酶onozuka RS、0.4％离析酶onozuka R10、2.4-D(2mg/ml)、NAA(2mg/ml)、BAP(2mg/ml)pH5.8)的新板上，并在25℃暗处消化过夜。然后通过将其在定轨振荡器(40-50rpm)中放置1小时使原生质体游离出来。通过50μm滤筛从细胞碎片中分离原生质体，用CPW9M洗涤滤筛两次。原生质体在85g离心，丢弃上清液，然后将其吸收在一半体积的CPW9M中。原生质体最终吸收在3ml CPW9M中，然后小心添加3ml CPW18S以避免两种溶液混合。将原生质体在85g旋转10分钟并使用长的巴斯德吸管收集漂浮在中间相层上的存活原生质体。通过添加CPW9M将原生质体体积增加至10ml，并在血球计中测定回收的原生质体数量。将原生质体悬浮液在5℃85x g下离心10分钟。丢弃上清液并将原生质体粒状物以终浓度106.mL-1重悬在CPW9M洗涤培养基中。在10mL导管中，温和但充分混合250μL原生质体悬浮液+/-12.5μg dsRNA和250μl PEG溶液(40％PEG4000(Fluka#81240)、0.1M Ca(NO3)2、0.4M甘露醇)。20分钟之后，室温温育，并逐滴添加5mL冷0.275M Ca(NO3)2。将原生质体悬浮液在4℃85x g下离心10分钟，丢弃上清液。
番茄原生质体浸入藻酸盐溶液中进行再生和除草剂抗性的愈伤组织的选择。添加2ml藻酸盐溶液(甘露醇90g/l、CaCl2.2H2O 140mg/l、藻酸-Na 20g/l(SigmaA0602))并通过颠转充分混合。将1ml该溶液平铺在Ca琼脂平板(72.5g/l甘露醇、7.35g/l CaCl2.2H2O、8g/l琼脂)上并允许其聚合。然后将藻酸盐圆片转移至含有4ml K8p培养基的4cm皮氏培养皿中。通过将圆片温育在柠檬酸钠溶液中使原生质体游离出来，之后收集。
MLH1 mRNA水平的定量
使用RNAeasy试剂盒(Qiagen)分离总RNA。使用Quantitect RT试剂盒(Qiagen)合成cDNA。使用Light Cycler装置(Roche)和扩增来自番茄MLH1mRNA的302bp产物的引物5’-CCTGGTCTATTGGATATTGTTAG[SEQ ID NO 7]和5’-GCTTGAGCAGTTCTGTATTC[SEQ ID NO 8]测量内源MLH1的水平。对于每个时间点，实施3次独立的原生质体转染且qPCR反应也做三个平行。对于番茄MLH1水平的标准化，使用以下引物5’-GCAATCAAGGAGGAATCAGAGG[SEQ ID No 9]和5’-CCAGCAGCATCAATCAAGCC[SEQ ID No 10]测量每个样品中的番茄GAPDH mRNA水平。
结果
qPCR分析的结果如图4所示。在番茄叶肉原生质体中，通过添加dsRNA可明显降低MLH1 mRNA水平。在对照样品中原生质体分离之后MLH1 mRNA水平快速增加，但在用MLH1 dsRNA处理的原生质体中不是这样，其中未观察到水平增加。dsRNA对其他mRNA种类的表达没有影响，例如GAPDH mRNA的水平，评估了每个样品标准化MLH1表达。因而，在体外番茄叶肉原生质体中，合成dsRNA能够暂时地、特异性地下调MMR mRNA。我们观察到用MSH2 dsRNA转染原生质体时对番茄MSH2 dsRNA具有相似影响。
实施例4
在烟草原生质体细胞中使用靶向MLH1和MSH2的dsRNA的TGA实验
使用突变核苷碱基PB124(5’A*T*C*A*TCCTACGTTGCACTTG*A*C*C*G[SEQ ID NO 3])进行实验。其对应烟草中编码乙酰乳酸合成酶(ALS)同源体的SurB基因的非转录链。该寡核苷酸含有与SurB的单个错配(下划线)，这使得SurB的脯氨酸191转变成谷氨酸，并给予对磺酰脲类型除草剂的显性抗性表型。星号表示硫代磷酸连接，其中磷酸连接的非桥氧原子被硫原子所取代。已知这种修饰连接对外切核酸酶攻击具有更强抗性，从而延长了突变核苷碱基在细胞中的寿命。
如实施例3所述的制备烟草原生质体。将12.5μg ds RNA和10μg PB124转染至等份的原生质体中，最后将其重悬在1.25ml的T0培养基中。将悬浮液转移至35mm培养皿中。添加等体积的T0琼脂糖培养基并温和混合。在25℃暗处温育样品并按下文进一步培养。
烟草原生质体的分离和转化
在体外在25℃2000lux的16/8h光照周期和60-70％RH将烟草(Nicotianatabacum)cv Petit Havana株SR1的芽培养物保持在高玻璃瓶中的含有0.8％Difco琼脂的MS20培养基中。MS20培养基是含有2％(w/v)蔗糖、未添加激素和0.8％Difco琼脂的基础Murashige和Skoog′s培养基(Murashige，T.和Skoog，F.，Physiologia Plantarum，15：473-497，1962)。收割3-6周龄的芽培养物的完全展开叶片。将叶片切成1mm厚的条状，然后将其转移至含有45ml MDE基础培养基的大(100mmx100mm)皮氏培养皿中进行预质壁分离处理30分钟。在900ml总体积的MDE基础培养基中含有0.25g KCl、1.0g MgSO4.7H2O、0.136g KH2PO4，2.5g聚乙烯吡咯烷酮(MW 10,000)、6mg萘乙酸和2mg 6-苄氨基嘌呤。用山梨醇将溶液的渗透压浓度调整至600mOsm.kg-1，pH调整至5.7。然后添加5mL酶原液SR1。每100ml酶原液含有750mg纤维素酶Onozuka R10、500mg崩溃酶和250mg离析酶R 10，并通过Whatman滤纸和灭菌过滤器过滤。在25℃暗处进行过夜消化。将消化叶片通过50μm尼龙滤网过滤至无菌烧杯中。使用等体积的冷KCl洗涤培养基洗涤滤网并与原生质体悬浮液混合。每升KCl洗涤培养基含有2.0gCaCl2.2H2O和使渗透压浓度达到540mOsm.kg-1的足够量甘露醇。将悬浮液转移至10mL导管中，在4℃85x g下将原生质体离心10分钟。丢弃上清液，将原生质体粒状物小心重悬在5mL冷MLm洗涤培养基中，其是正常浓度一半的MS培养基(Murashige，T.和Skoog，F.，Physiologia Plantarum，15：473-497，1962)的主要养分、每升2.2g CaCl2.2H2O和使渗透压浓度达到540mOsm.kg-1的甘露醇量。合并2个导管的内容物，并在4℃85x g下离心10分钟。丢弃上清液，将原生质体粒状物小心重悬在5mL冷MLm洗涤培养基中，其是用蔗糖替换甘露醇的MLm培养基。
混合2个导管的内容物，然后在蔗糖溶液保护层之上添加1mL KCl洗涤培养基，以使其被取走不会搅乱下层相。将原生质体在4℃85x g下离心10分钟。小心收集在蔗糖和含有活原生质体的KCl溶液之间的中间相。添加等体积的KCl洗涤培养基并小心混合。用血球计测量原生质体密度。
dsRNA的导入和原生质体再生
将原生质体悬浮液在5℃85x g下离心10分钟。丢弃上清液，并将原生质体粒状物以终浓度106.mL-1重悬在KCl洗涤培养基中。在10mL导管中，温和但充分混合250μL原生质体悬浮液+/-12.5μg dsRNA和250μl PEG溶液(40％PEG4000(Fluka#81240)、0.1M Ca(NO3)2、0.4M甘露醇)。20分钟之后，室温温育，并逐滴添加5mL冷0.275M Ca(NO3)2。将原生质体悬浮液在4℃85x g下离心10分钟，丢弃上清液。然后将原生质体粒状物小心悬浮在2.5mL补充了50μg.mL-1头孢噻亏和50μg.mL-1万古霉素的To培养基中。T0培养基含有(每升，pH 5.7)950mg KNO3、825mg NH4NO3 220mg CaCl2.2H2O 185mg MgSO4.7H2O 85mgKH2PO4 27.85mg FeSO4.7H2O 37.25mg Na2EDTA.2H2O根据Heller′s培养基(Heller，R.，Ann Sci Nat Bot Biol Veg 14：1-223，1953)的微量养分，根据Morel和Wetmore′s培养基(Morel，G.和R.H.Wetmore，Amer.J.Bot.38：138-40，1951)的维生素、2％(w/v)蔗糖、3mg萘乙酸、1mg 6-苄氨基嘌呤和使渗透压浓度达到540mOsm.kg-1的甘露醇量，并转移至35mm培养皿中。
原生质体培养和再生
培养10天之后，将琼脂糖块切成6等份并转移至含有22.5mL补充了20nM氯磺隆的MAP1AO培养基的皮氏培养皿中。该培养基含有(每升，pH 5.7)950mgKNO3、825mg NH4NO3、220mg CaCl2.2H2O、185mg MgSO4.7H2O、85mgKH2PO4、27.85mg FeSO4.7H2O、37.25mg Na2EDTA.2H2O、为原始浓度十分之一的根据Murashige和Skoog′s培养基(Murashige，T.和Skoog，F.，PhysiologiaPlantarum，15：473-497，1962)的微量养分、根据Morel和Wetmore′s培养基(Morel，G.和R.H.Wetmore，Amer.J.Bot.38：138-40，1951)的维生素、6mg丙酮酸盐、12mg每种苹果酸、富马酸和柠檬酸、3％(w/v)蔗糖、6％(w/v)甘露醇、0.03mg萘乙酸和0.1mg 6-苄氨基嘌呤。将样品在25℃低亮度下温育6-8周。然后将生长的愈伤组织转移至MAP1培养基中并使其再生长2-3周。MAP1培养基与MAP1AO培养基具有相同成分，但用3％(w/v)甘露醇替代6％，并且有46.2mg.l-1组氨酸(pH5.7)。用0.8％(w/v)Difco琼脂将其固化。
然后用无菌镊子将愈伤组织转移至RP培养基中。RP培养基含有(每升，pH 5.7)273mg KNO3、416mg Ca(NO3)2.4H2O、392mg Mg(NO3)2.6H2O、57mgMgSO4.7H2O、233mg(NH4)2SO4、271mg KH2PO4、27.85mg FeSO4.7H2O、37.25mg Na2EDTA.2H2O、为公开浓度五分之一的根据Murashige和Skoog′s培养基的微量养分、根据Morel和Wetmore′s培养基(Morel，G.和R.H.Wetmore，Amer.J.Bot.38：138-40，1951)的维生素、0.05％(w/v)蔗糖、1.8％(w/v)甘露醇、0.25mg玉米素和41nM氯磺隆，并用0.8％(w/v)Difco琼脂将其固化。2-3周之后将成熟芽转移至根培养基中。
结果
TGA实验的结果如表6所示。
表6.在烟草原生质体中使用dsRNA下调内源MLH1和MSH2表达的TGA实验
Figure BPA00001390401400211
烟草MLH1和MSH2的下调使TGA效率增加至少30倍。由20个用突变核苷碱基和dsRNA处理的愈伤组织再生了芽并进行了基因分型。从这些植物中分离DNA并扩增含有P191的SurB PCR产物且对其测序。所有植物都显示出预期的P191Q突变，因此我们得出结论在这些株中确实发生了TGA。
在番茄中使用靶向MLH1的dsRNA的TGA实验
使用表7所列的突变核苷碱基进行这些实验。在番茄中，ALS是多拷贝基因，在植物转录数据库(http://planta.tigr.org)中存在两个全长EST’s。在研究中，我们将转录物TA37274_4081定义为ALS1并将转录物TA37275_4081定义为ALS2。ALS1编码659AA的蛋白而ALS2编码657AA的蛋白。ALS1和ALS2在DNA和蛋白水平上分别显示出93％和96％的同一性。两个蛋白的主要区别在于蛋白中负责靶向叶绿体的信号肽区域。尽管有这些区别，ALS1和ALS2蛋白都预测可靶向叶绿体。之前的研究显示了ALS保守残基上的几个氨基酸变化足以给予针对磺酰脲类型除草剂的半显性抗性。其中之一是P184Q变化。在之前我们发现了当突变核苷碱基包含C5-丙炔和LNA(锁核酸)修饰时，番茄原生质体中的TGA效率增加了8倍。因此，在该研究中我们引入正常DNA突变核苷碱基或设计的C5-丙炔和LNA修饰的突变核苷碱基以在ALS2中产生P184Q改变，同时将靶向番茄MLH1和MSH2的dsRNA导入番茄叶片原生质体。
Figure BPA00001390401400221
表7.y＝5-丙炔-2′-脱氧胞苷；z＝5-丙炔-2′-脱氧尿嘧啶；s＝LNAA；v＝LNAT；w＝LNA C；x＝LNA G；U＝脱氧尿嘧啶；*＝硫代磷酸连接。所有突变核苷碱基都是通过Eurogentec合成和HPLC纯化。与靶点形成错配的核苷酸是下划线的。
如实施例1所述分离并转染番茄原生质体。7天之后，将植入原生质体置于选择培养基中。将藻酸盐块切成5mm宽的条状并平铺在含有20nM氯磺隆的TM-DB愈伤组织诱导培养基上。30℃温育4-5周之后显现出除草剂抗性的愈伤组织，然后将个体转移至含有20nM氯磺隆的GM-ZG芽培养基中进一步生长。
结果
使用dsRNA下调MLH1 mRNA水平的TGA实验结果如表8所示。
表8靶向PMS1的dsRNA增强了番茄叶肉原生质体中的TGA效率
Figure BPA00001390401400222
和在烟草中一样，在番茄中通过dsRNA暂时下调MLH1将TGA频率提高了大约30倍。对含有P184密码子的ALS2基因区域的分析证实了除草剂抗性愈伤组织确实具有预期的P184Q改变。
(修饰)核苷酸概述：
Figure BPA00001390401400231
Figure BPA00001390401400241
Figure BPA00001390401400251
Figure BPA00001390401400261
Figure BPA00001390401400271
Figure BPA00001390401400291
Figure BPA00001390401400301
Figure BPA00001390401400311
Figure BPA00001390401400321
Figure BPA00001390401400331
Figure BPA00001390401400341
Figure BPA00001390401400351
Figure BPA00001390401400361
Figure BPA00001390401400391
Figure IPA00001390400900011
Figure IPA00001390400900021
Figure IPA00001390400900031
Figure IPA00001390400900041
Figure IPA00001390400900051
Figure IPA00001390400900061
Figure IPA00001390400900071
Figure IPA00001390400900081
Figure IPA00001390400900091

Claims (26)

1.使植物细胞原生质体中靶基因改变的方法，其包括用以下物质转染原生质体：
优选地靶向植物MMR mRNA的dsRNA；和
突变核苷碱基。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述dsRNA和突变核苷碱基基本同时被导入植物细胞原生质体中。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述dsRNA和突变核苷碱基的导入最多间隔48小时。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述植物MMR mRNA是与MutS和/或MutL MMR基因相关的mRNA，更优选来自MSH2、MSH3、MSH6 MSH7 MLH1、MLH2、MLH3和PMS1。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述转染导致MMR基因的下调，优选是暂时下调。
6.如权利要求1所述的方法，其中在植物细胞原生质体中dsRNA是选择性地下调MMR系统(不会明显下调植物细胞原生质体中的其他mRNA种类)。
7.如权利要求1所述的方法，其中与在不存在dsRNA下基因改变的可比较方法相比，所述靶基因改变的效率增加了至少10倍。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述植物选自单子叶或双子叶植物。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述植物是茄科，优选番茄和/或烟草。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述突变核苷碱基包括一个或多个修饰核苷酸。
11.如权利要求11所述的方法，其中所述修饰核苷酸选自包含以下的组：
d、硫代磷酸修饰，优选在突变核苷碱基的一端或双端或其附近；
e、丙炔取代，优选不在突变核苷碱基的一端或双端或其附近；
f、LNA取代，优选不在突变核苷碱基的一端或双端或其附近。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述突变核苷碱基包括至少一个修饰LNA，其处于距离至少一个错配至少一个核苷酸的位置，而且其中任选地所述突变核苷碱基含有最多大约75％LNA修饰核苷酸。
13.如权利要求9所述的方法，其中至少2，优选至少3，更优选至少4，甚至更优选至少5，最优选至少6个核苷酸是LNAs。
14.如权利要求11所述的方法，其中LNAs独立地分布距离错配两侧最多10个核苷酸，优选最多8个核苷酸，更优选最多6个核苷酸，甚至更优选最多4、3、或2个核苷酸。
15.如权利要求12所述的方法，其中2，优选3，更优选4，甚至更优选5，最优选6个核苷酸是LNAs。
16.如权利要求12所述的方法，其中最多50％的所述突变核苷碱基的修饰核苷酸是LNA衍生物，优选最多40％，更优选最多30％，甚至更优选最多20％，最优选最多10％。
17.如权利要求10所述的方法，其中至少一个所述修饰核苷酸是独立位于错配5’侧和/或3’侧。
18.如前述任意一项权利要求所述的方法，其中位于错配5’或3’侧之一的两个LNA修饰核苷酸相互间隔至少一个，优选至少两个碱基对。
19.如权利要求9所述的方法，其中所述丙炔修饰核苷酸是C7-丙炔嘌呤或C5-丙炔嘧啶。
20.如权利要求17所述的方法，其中所述嘌呤是腺苷或鸟苷和/或嘧啶是胞嘧啶、尿嘧啶或胸苷。
21.如权利要求17所述的方法，其中至少10％的所述嘧啶和/或所述嘌呤被其分别的丙炔化衍生物所取代，优选至少50％，更优选至少75％，最优选至少90％。
22.如权利要求17所述的方法，其中所述修饰核苷酸是嘧啶。
23.如权利要求17所述的方法，其中所述修饰核苷酸是嘌呤。
24.如前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述在错配位置上的核苷酸是不修饰的。
25.如前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述至少一个修饰核苷酸不位于邻近错配，优选位于错配的2、3、4、6、7、8、9、或10个核苷酸之内。
26.如前述任意一项权利要求所述的方法，对于改变细胞，通过恢复至野生型校正突变，诱导突变，通过破坏编码区使酶失活，通过改变编码区修饰酶的生物活性，通过破坏编码区错配修复修饰蛋白，(植物)遗传物质的靶向改变，包括基因突变，靶基因修复和基因敲除。
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