KR20230150844A - 케토헥소키나아제(KHK) iRNA 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

케토헥소키나아제(KHK) iRNA 조성물 및 이의 사용 방법 Download PDF

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레일라 노트즐리
제임스 디. 맥키닌치
프레드릭 트렘블레이
마크 케이. 쉴레겔
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Abstract

본 발명은 케토헥소키나아제(KHK) 유전자를 표적으로 하는 RNAi 제제, 예를 들어, dsRNA 제제에 관한 것이다. 또한 본 발명은 KHK 유전자의 발현을 억제하기 위해 이러한 RNAi 제제를 사용하는 방법 및 대상체에서 KHK-관련 장애를 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다.

Description

케토헥소키나아제(KHK) iRNA 조성물 및 이의 사용 방법
관련 출원
본 출원은 2021년 2월 26일자로 출원된 미국 가출원 제63/154,005호, 2021년 7월 20일자로 출원된 미국 가출원 제 63/223,581호 및 2021년 11월 18일자로 출원된 미국 가출원 제63/280,668호에 대한 우선권의 이익을 주장한다. 전술된 출원 각각의 전문이 본원에 참조로서 통합된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 본원에 그 전체가 참조로서 통합된다. 2022년 2월 16일자로 생성된 상기 ASCII 복사본은 파일명이 121301_14720_SL.txt이며, 크기가 572,214 바이트이다.
서양식 식단이 현대 비만 유행병의 주요 원인 중 하나임을 역학 연구가 밝혀냈다. 농축 청량 음료 및 가공 식품의 사용과 관련된 과당 흡수의 증가가 유행병에 대한 주요 기여 인자로 제안된다. 고과당 옥수수 감미료는 1967년까지 식품 업계에서 널리 사용되기 시작했다. 포도당과 과당은 분자당 동일한 칼로리 값을 갖지만, 2개의 당은 다르게 대사되며 상이한 GLUT 수송체를 이용한다. 과당은 거의 간에서 전적으로 대사되며, 포도당 대사 경로와는 달리, 과당 대사 경로는 생성물에 의한 피드백 억제에 의해 조절되지 않는다(문헌참조: Khaitan Z 등, (2013) J. Nutr. Metab. 2013, Article ID 682673, 1~12). 헥소키나아제 및 포스포프룩토키나아제(PFK)는 간에서 과당-1-포스페이트로의 과당의 인산화를 담당하는 포도당, 프룩토키나아제 또는 케토헥소키나아제(KHK)로부터 글리세르알데히드-3-P의 생성을 조절하는 반면, 이는 과당-1-포스페이트의 농도를 증가시킴으로써 하향 조절되지 않는다. 그 결과, 세포로 들어가는 모든 과당은 신속하게 인산화된다. (문헌참조: Cirillo P. 등(2009) J. Am. Soc. Nephrol. 20: 545~553). 과당에서 과당-1-포스페이트로 인산화하기 위한 ATP의 지속적인 이용은 세포내 포스페이트 고갈, ATP 고갈, AMP 데아미나제의 활성화 및 요산의 형성을 초래한다(문헌참조: Khaitan Z. 등(2013) J. Nutr. Metab. Article ID 682673, 1~12). 요산 증가는 추가적으로 KHK의 상향 조절을 자극하고(문헌참조: Lanaspa M.A. 등(2012) PLOS ONE 7(10): 1~11), 내피 세포 및 지방 세포 기능장애를 유발한다. 과당-1-포스페이트는 이어서 알돌라아제 B의 작용에 의해 글리세르알데히드로 전환되고, 글리세르알데히드-3-포스페이트로 인산화된다. 후자는 당분해 경로의 하류로 진행하여, 시트르산 사이클로 진입하는 피루브산을 형성하며, 잘 먹은 조건 하에서, 이로부터 시트레이트는 미토콘드리아로부터 세포질로 수출되어, 지방생성을 위한 아세틸 코엔자임 A를 제공한다(도 1).
KHK에 의한 과당의 인산화 및 지방생성의 후속적인 활성화는, 예를 들어 지방간, 고중성지방혈증, 이상지질혈증 및 인슐린 저항성을 초래한다. 신장 근위 세뇨관 세포의 전염증성 변화는 또한 KHK 활성에 의해 유도되는 것으로 나타났다(문헌참조: Cirillo P. 등(2009) J. Am. Soc. Nephrol. 20: 545~553). KHK에 의한 과당의 인산화는 간 질환(예를 들어, 지방간, 지방간염), 이상지질혈증(예를 들어, 고지혈증, 고LDL 콜레스테롤, 저HDL 콜레스테롤, 고중성지방혈증, 식후 고중성지방혈증), 혈당 조절 장애(예를 들어, 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병), 심혈관 질환(예를 들어, 고혈압, 내피 세포 기능장애), 신장 질환(예를 들어, 급성 신장 장애, 관상 기능장애, 근위 세관에 대한 전염증성 변화, 만성 신장 질환), 대사 증후군, 지방세포 기능장애, 내장 지방 침착, 비만, 고요산혈증, 통풍, 섭식 장애 및 과도한 당 갈망과 같은 질환, 장애 또는 병태와 관련된다. 따라서, KHK 활성과 관련된 질환, 장애 및 병태를 치료하기 위한 조성물 및 방법에 대한 필요성이 당업계에 존재한다.
본 발명은 케토헥소키나아제(KHK)를 암호화하는 유전자의 RNA 전사체의 RNA-유도 침묵 복합체(RISC)-매개 절단에 영향을 미치는 iRNA 조성물을 제공한다. KHK 유전자는 세포, 예를 들어 인간 대상체와 같은 대상체 내 세포 안에 존재할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 세포 내에서 케토헥소키나아제(KHK)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제를 제공하며, 여기서 dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 0, 1, 2, 또는 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열과 1, 2, 또는 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다. 일 구현예에서, dsRNA 제제는 적어도 하나의 열 불안정화 뉴클레오타이드 변형, 예를 들어 무염기 변형; 듀플렉스 내 반대 뉴클레오타이드와의 미스매치; 불안정화 당 변형, 2'-데옥시 변형, 비환형 뉴클레오타이드, 잠김 해제된 핵산(UNA), 또는 글리세롤 핵산(GNA)을 포함하며, 예를 들어 안티센스 가닥은 적어도 하나의 열 불안정화 뉴클레오타이드 변형을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 내에서 케토헥소키나아제(KHK)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA)을 제공하되, 상기 dsRNA는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 KHK를 암호화하는 mRNA에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상보성 영역은 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나의 안티센스 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나와 0, 1, 2 또는 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 그의 전체 길이에 걸쳐 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나의 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나에 대해 적어도 85%, 예를 들어 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 뉴클레오타이드 서열 동일성을 갖는 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 센스 가닥 및 그의 전체 길이에 걸쳐 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나의 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나에 대해 적어도 85%, 예를 들어 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 뉴클레오타이드 서열 동일성을 갖는 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나의 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 센스 가닥 및 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나의 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나의 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나와 2개 이하의 뉴클레오타이가 상이한 적어도 15개, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 센스 가닥 및 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나의 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나와 2개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나의 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나와 1개 이하의 뉴클레오타이가 상이한 적어도 15개, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 센스 가닥 및 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나의 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나와 1개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나의 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 센스 가닥 및 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나의 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 가닥을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 세포 내에서 케토헥소키나아제(KHK)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA)을 제공하되, 상기 dsRNA는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 120~162; 164~188; 181~207; 193~217; 209~231; 283~306; 508~546; 568~603; 596~632; 640~674; 746~806; 806~835; 917~942; 936~084; 1016~1041; 1100~1123; 1149~1175; 1160~1193; 1205~1229; 1252~1283; 1334~1356; 1407~1429; 1472~1497; 1506~1533; 1539~1561; 1704~1727; 1747~1787; 1850~1873; 1936~1964; 1960~1990; 2015~2048; 2060~2095; 2090~2118; 2124~2160; 2181~2200; 2221~2262의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 0, 1, 2 또는 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 2의 상응하는 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하, 예를 들어 3, 2, 1 또는 0개가 상이한 적어도 15개, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 세포 내에서 케토헥소키나아제(KHK)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA)을 제공하되, 상기 dsRNA는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 517~539; 521~543; 524~546; 517~546; 581~603; 610~632; 747~769; 749~771; 752~774; 755~777; 757~779; 758~780; 764~786; 776~798; 781~803; 747~803; 920~942; 941~963; 944~966; 950~972; 962~984; 920~984; 1149~1171; 1161~1183; 1165~1187; 1171~1193; 1149~1193; 1205~1227; 1206~1228; 1205~1228; 1334~1356; 1472~1494; 1475~1497; 1472~1497의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 0, 1, 2 또는 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 2의 상응하는 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하, 예를 들어 3, 2, 1 또는 0개가 상이한 적어도 15개, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 세포 내에서 케토헥소키나아제(KHK)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA)을 제공하되, 상기 dsRNA는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 517~539; 524~546; 517~546; 753~775; 757~779; 753~779; 764~786; 767~789; 768~790; 769~791; 764~791; 773~795; 781~803; 773~803; 753~803; 808~830; 937~959; 941~963; 944~966; 941~966; 948~970; 950~972; 948~972; 1160~1182; 1161~1183; 1160~1183; 및 1207~1229의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 0, 1, 2 또는 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 2의 상응하는 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하, 예를 들어 3, 2, 1 또는 0개가 상이한 적어도 15개, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 안티센스 가닥은 AD-1613400; AD-1613243; AD-1290757.3; AD-1290878.3; AD-1290969.3; AD-1423317.2; AD-1423327.2; AD-1423336.2; AD-1290599.3; AD-1523172.1; AD-1290837.3; AD-1523173.1; AD-1290884.3; AD-1523174.1; AD-1290959.3; AD-1523175.1; AD-1423311.2; AD-1423324.2; AD-1523176.1; AD-1423329.2; AD-1423333.2; AD-1423330.2; AD-1523177.1; AD-1290885.3; AD-1523178.1; AD-1423334.2; AD-1523179.1; AD-1523180.1; AD-1290539.3; 및 AD-1523181.1로 이루어진 군으로부터 선택된 듀플렉스의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 0, 1, 2 또는 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 내에서 케토헥소키나아제(KHK)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제를 제공하되, 상기 dsRNA는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 495~517, 492~517, 500~529, 514~551, 517~539, 524~546, 517~548, 614~643, 625~647, 625~660, 642~664, 642~672, 753~811, 754~780, 762~791, 764~786, 772~800, 781~803, 805~827, 808~830, 809~831, 792~838, 931~982, 944~966, 947~969, 948~970, 948~982, 1011~1035, 1021~1043, 1019~1050, 1063~1091, 1150~1192, 1152~1176, 1160~1192, 1160~1182, 1162~1184, 1198~1230, 1198~1221, 및 1202~1230의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하, 예를 들어 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 2의 상응하는 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하, 예를 들어 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 세포 내에서 케토헥소키나아제(KHK)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제를 제공하되, 상기 dsRNA는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 513~556, 753~813, 936~981, 1155~1193, 1200~1229, 1704~1727, 1747~1787, 1850~1873, 1936~1964, 1960~1990, 1936~1990, 2015~2048, 2060~2095, 2090~2118, 2060~2118, 2124~2160, 2181~2220, 2221~2249, 2181~2249, 2240~2262, 2221~2262, 및 2181~2262의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하, 예를 들어 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 2의 상응하는 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하, 예를 들어 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 세포 내에서 케토헥소키나아제(KHK)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제를 제공하되, 상기 dsRNA는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1207~1229 또는 937~959의 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하, 예를 들어 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 2의 상응하는 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하, 예를 들어 3, 2, 1 또는 0개가 상이한 적어도 15개, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1207-1229의 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하, 예를 들어 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 2의 상응하는 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하, 예를 들어 3, 2, 1 또는 0개가 상이한 적어도 15개, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 적어도 하나의 변형 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드; 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드는 변형을 포함하거나; 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드 및 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드는 변형을 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 변형을 포함하거나; 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 변형을 포함하거나; 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 변형을 포함한다.
일 구현예에서, 변형 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 데옥시-뉴클레오타이드, 3'-말단 데옥시티미딘(dT) 뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 변형 뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오타이드, 잠김 뉴클레오타이드, 잠김 해제된 뉴클레오타이드, 입체적으로 제한된 뉴클레오타이드, 구속된 에틸 뉴클레오타이드, 무염기 뉴클레오타이드, 2'-아미노-변형 뉴클레오타이드, 2'-O-알릴-변형 뉴클레오타이드, 2'-C-알킬-변형 뉴클레오타이드, 2'-하이드록실-변형 뉴클레오타이드, 2'-메톡시에틸 변형 뉴클레오타이드, 2'-O-알킬-변형 뉴클레오타이드, 모르폴리노 뉴클레오타이드, 포스포라미데이트, 뉴클레오타이드를 포함하는 비-천연 염기, 테트라하이드로피란 변형 뉴클레오타이드, 1,5-안하이드로헥시톨 변형 뉴클레오타이드, 시클로헥세닐 변형 뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오타이드, 메틸포스포네이트기를 포함하는 뉴클레오타이드, 5'-포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 5'-포스페이트 모방체를 포함하는 뉴클레오타이드, 열 불안정화 뉴클레오타이드, 글리콜 변형 뉴클레오타이드(GNA), 2' 포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드 및 2-O-(N-메틸아세트아미드) 변형 뉴클레오타이드; 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 뉴클레오타이드 상에서의 변형은 LNA, HNA, CeNA, 2’-메톡시에틸, 2’-O-알킬, 2’-O-알릴, 2’-C-알릴, 2’-플루오로, 2’-데옥시, 2’-하이드록실, 및 글리콜; 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 변형 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 데옥시-뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 변형 뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오타이드, 글리콜 변형 뉴클레오타이드(GNA), 예를 들어 Ggn, Cgn, Tgn, 또는 Agn, 2' 포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 예를 들어 G2p, C2p, A2p, U2p, 비닐-포스포네이트 뉴클레오타이드; 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 상에서의 변형 중 적어도 하나는 열 불안정화 뉴클레오타이드 변형이다.
일 구현예에서, 열 불안정화 뉴클레오타이드 변형은 무염기 변형; 듀플렉스 내 반대 뉴클레오타이드와의 미스매치; 및 불안정화 당 변형, 2'-데옥시 변형, 비환형 뉴클레오타이드, 잠김 해제된 핵산(UNA), 및 글리세롤 핵산(GNA)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 변형 뉴클레오타이드는 3'-말단 데옥시티미딘 뉴클레오타이드(dT)의 짧은 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 상에서의 변형은 2'-O-메틸, GNA 및 2' 플루오로 변형이다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 추가로 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, dsRNA 제제는 6~8개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 하나의 구현예에서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합은 하나의 가닥의 3'-말단에 있다. 선택적으로, 가닥은 안티센스 가닥이다. 또 다른 구현예에서, 가닥은 센스 가닥이다. 관련 구현예에서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합은 하나의 가닥의 5'-말단에 있다. 선택적으로, 가닥은 안티센스 가닥이다. 또 다른 구현예에서, 가닥은 센스 가닥이다. 또 다른 구현예에서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합은 하나의 가닥의 5'- 및 3'-말단 모두에 있다. 선택적으로, 가닥은 안티센스 가닥이다. 또 다른 구현예에서, 가닥은 센스 가닥이다.
이중 가닥 영역은 길이가 19~30개의 뉴클레오타이드 쌍; 길이가 19~25개의 뉴클레오타이드 쌍; 길이가 19~23개의 뉴클레오타이드 쌍; 길이가 23~27개의 뉴클레오타이드 쌍; 또는 길이가 21~23개의 뉴클레오타이드 쌍일 수 있다.
일 구현예에서, 각각의 가닥은 독립적으로 길이가 30개 이하의 뉴클레오타이드이다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 길이가 21개의 뉴클레오타이드이고 안티센스 가닥은 길이가 23개의 뉴클레오타이드이다.
상보성 영역은 길이가 적어도 17개의 뉴클레오타이드; 길이가 19 내지 23개의 뉴클레오타이드; 또는 길이가 19개의 뉴클레오타이드일 수 있다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 포함한다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 리간드를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 리간드는 dsRNA 제제의 센스 가닥의 3' 말단에 접합된다.
일 구현예에서, 리간드는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 유도체이다.
일 구현예에서, 리간드는 1가, 2가, 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체이다.
일 구현예에서, 리간드는 다음이다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 다음의 개략도에 도시된 것과 같이 리간드에 접합되고,
여기서 X는 O 또는 S이다.
일 구현예에서, X는 O이다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합은 하나의 가닥, 예를 들어 안티센스 가닥 또는 센스 가닥의 3'-말단에 존재한다.
또 다른 구현예에서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합은 하나의 가닥, 예를 들어 안티센스 가닥 또는 센스 가닥의 5'-말단에 존재한다.
일 구현예에서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합은 하나의 가닥의 5'- 및 3'-말단 모두에 존재한다. 일 구현예에서, 가닥은 안티센스 가닥이다.
일 구현예에서, 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5'-말단의 1 위치에서 염기쌍은 AU 염기쌍이다.
일 양태에서, 본 발명은 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는, 세포 내 케토헥소키나아제(KHK)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공하되,
a) 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’-gscsaggaagCfAfCfugagauucgu-3’과 4개 이하의 염기가 상이하고 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’- asdCsgadAudCucagdTgCfuuccugcsasc-3’과 4개 이하의 염기가 상이하되, a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C 및 U이고; Cf 및 Uf는 2′-데옥시-2’-플루오로(2’-F) C 및 U이고; dC, dA 및 dT는 2′-데옥시 C, A 및 T이고; s는 포스포로티오에이트 결합이거나;
b) 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’-csusacggagAfCfGfugguguuugu-3’과 4개 이하의 염기가 상이하고 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’- asdCsaadAcdAccacdGuCfuccguagscsc -3’과 4개 이하의 염기가 상이하되, a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C 및 U이고; Cf 및 Uf는 2′-데옥시-2’-플루오로(2’-F) C 및 U이고; dC, dA 및 dG는 2′-데옥시 C, A 및 G이고; s는 포스포로티오에이트 결합이다.
일 구현예에서,
a) 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’-gscsaggaagCfAfCfugagauucgu-3’과 3개 이하의 염기가 상이하고 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’- asdCsgadAudCucagdTgCfuuccugcsasc-3’과 3개 이하의 염기가 상이하되, a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C 및 U이고; Cf 및 Uf는 2′-데옥시-2’-플루오로(2’-F) C 및 U이고; dC, dA 및 dT는 2′-데옥시 C, A 및 T이고; s는 포스포로티오에이트 결합이거나;
b) 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’-csusacggagAfCfGfugguguuugu-3’과 3개 이하의 염기가 상이하고 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’- asdCsaadAcdAccacdGuCfuccguagscsc -3’과 3개 이하의 염기가 상이하되, a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C 및 U이고; Cf 및 Uf는 2′-데옥시-2’-플루오로(2’-F) C 및 U이고; dC, dA 및 dG는 2′-데옥시 C, A 및 G이고; s는 포스포로티오에이트 결합이다.
일 구현예에서,
a) 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’-gscsaggaagCfAfCfugagauucgu-3’과 2개 이하의 염기가 상이하고 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’- asdCsgadAudCucagdTgCfuuccugcsasc-3’과 2개 이하의 염기가 상이하되, a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C 및 U이고; Cf 및 Uf는 2′-데옥시-2’-플루오로(2’-F) C 및 U이고; dC, dA 및 dT는 2′-데옥시 C, A 및 T이고; s는 포스포로티오에이트 결합이거나;
b) 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’-csusacggagAfCfGfugguguuugu-3’과 2개 이하의 염기가 상이하고 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’- asdCsaadAcdAccacdGuCfuccguagscsc -3’과 2개 이하의 염기가 상이하되, a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C 및 U이고; Cf 및 Uf는 2′-데옥시-2’-플루오로(2’-F) C 및 U이고; dC, dA 및 dG는 2′-데옥시 C, A 및 G이고; s는 포스포로티오에이트 결합이다.
일 구현예에서,
a) 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’-gscsaggaagCfAfCfugagauucgu-3’과 1개 이하의 염기가 상이하고 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’- asdCsgadAudCucagdTgCfuuccugcsasc-3’과 1개 이하의 염기가 상이하되, a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C 및 U이고; Cf 및 Uf는 2′-데옥시-2’-플루오로(2’-F) C 및 U이고; dC, dA 및 dT는 2′-데옥시 C, A 및 T이고; s는 포스포로티오에이트 결합이거나;
b) 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’-csusacggagAfCfGfugguguuugu-3’과 1개 이하의 염기가 상이하고 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’- asdCsaadAcdAccacdGuCfuccguagscsc -3’과 1개 이하의 염기가 상이하되, a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C 및 U이고; Cf 및 Uf는 2′-데옥시-2’-플루오로(2’-F) C 및 U이고; dC, dA 및 dG는 2′-데옥시 C, A 및 G이고; s는 포스포로티오에이트 결합이다.
일 구현예에서,
a) 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’-gscsaggaagCfAfCfugagauucgu-3’을 포함하고 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’- asdCsgadAudCucagdTgCfuuccugcsasc-3’을 포함하되, a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C 및 U이고; Cf 및 Uf는 2′-데옥시-2’-플루오로(2’-F) C 및 U이고; dC, dA 및 dT는 2′-데옥시 C, A 및 T이고; s는 포스포로티오에이트 결합이거나;
b) 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’-csusacggagAfCfGfugguguuugu-3’을 포함하고 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’- asdCsaadAcdAccacdGuCfuccguagscsc -3’을 포함하되, a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C 및 U이고; Cf 및 Uf는 2′-데옥시-2’-플루오로(2’-F) C 및 U이고; dC, dA 및 dG는 2′-데옥시 C, A 및 G이고; s는 포스포로티오에이트 결합이다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 리간드를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 리간드는 dsRNA 제제의 센스 가닥의 3' 말단에 접합된다.
일 구현예에서, 리간드는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 유도체이다.
일 구현예에서, 리간드는 1가, 2가, 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체이다.
일 구현예에서, 리간드는 다음이다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 다음의 개략도에 도시된 것과 같이 리간드에 접합되고,
상기 식에서, X는 O 또는 S이다.
일 구현예에서, X는 O이다.
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 dsRNA 제제를 함유하는 세포 및 본 발명의 임의의 dsRNA 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비완충 용액, 예를 들어, 식염수 또는 물 중의 dsRNA 제제를 포함할 수 있거나, 본 발명의 약제학적 조성물은 완충 용액, 예를 들어, 아세테이트, 시트레이트, 프로라민, 카보네이트, 또는 포스페이트, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 완충 용액; 또는 포스페이트 완충 식염수(PBS) 중의 dsRNA 제제를 포함할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 세포 내 케토헥소키나아제(KHK) 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 본 방법은 세포를 본 발명의 임의의 dsRNA 또는 본 발명의 임의의 약제학적 조성물과 접촉시켜, 세포 내 KHK 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 세포는 대상체, 예를 들어, 인간 대상체, 예를 들어, 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 KHK-관련 장애와 같은 케토헥소키나아제(KHK)-관련 장애를 가진 대상체 내에 존재한다: 간 질환(예를 들어, 지방간, 지방간염, 비알코올성 지방간염(NASH)), 이상지질혈증(예를 들어, 고지혈증, 고LDL 콜레스테롤, 저HDL 콜레스테롤, 고중성지방혈증, 식후고중성지방혈증), 혈당 조절 장애(예를 들어, 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병), 심혈관 질환(예를 들어, 고혈압, 내피세포 기능장애), 신장 질환(예를 들어, 급성 신장 장애, 관상 기능장애, 근위 세관에 대한 전염증성 변화, 만성 신장 질환), 대사 증후군, 지방세포 기능장애, 내장지방 침착, 비만, 고요산혈증, 통풍, 섭식 장애, 및 과도한 당 갈망.
일 구현예에서, 세포를 dsRNA 제제와 접촉시키는 단계는 KHK의 발현을 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%만큼 억제한다.
일 구현예에서, KHK의 발현을 억제하는 단계는 대상체의 혈청 내 KHK 단백질 수준을 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%만큼 감소시킨다.
일 양태에서, 본 발명은 케토헥소키나아제(KHK) 발현의 감소로 혜택을 받을 장애를 가진 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 본 발명의 임의의 dsRNA 또는 본 발명의 임의의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여함으로써, KHK 발현의 감소로 혜택을 받을 장애를 가진 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 케토헥소키나아제(KHK) 발현의 감소로 혜택을 받을 장애를 가진 대상체에서 하나 이상의 증상을 예방하는 방법을 제공한다. 본 방법은 본 발명의 임의의 dsRNA 또는 본 발명의 임의의 약제학적 조성물의 예방학적 유효량을 대상체에게 투여함으로써, KHK 발현의 감소로 혜택을 받을 장애를 가진 대상체에서 하나 이상의 증상을 예방하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, KHK-관련 장애는 간 질환, 예를 들어, NAFLD 또는 NASH와 같은 지방간 질환이다. 특정 구현예에서, KHK-관련 장애는 이상지질혈증, 예를 들어, 혈청 중성지방 상승, 혈청 LDL 상승, 혈청 콜레스테롤 상승, 혈청 HDL 저하, 식후고중성지방혈증이다. 또 다른 구현예에서, KHK-관련 장애는 혈당 조절 장애, 예를 들어, 인슐린에 대한 면역 반응으로 인한 것이 아닌 인슐린 저항성, 포도당 저항성, 제2형 당뇨병이다. 특정 구현예에서, KHK-관련 장애는 심혈관 질환, 예를 들어, 고혈압, 내피 세포 기능장애이다. 특정 구현예에서, KHK-관련 질환은 신장 질환, 예를 들어, 급성 신장 장애, 관상 기능장애, 근위 세관에 대한 전염증성 변화, 만성 신장 질환이다. 특정 구현예에서, 질환은 대사 증후군이다. 특정 구현예에서, KHK-관련 장애는 지질 침착 또는 기능장애 질환, 예를 들어, 내장 지방 침착, 지방 간, 비만이다. 특정 구현예에서, KHK-관련 장애는 요산 상승 질환, 예를 들어, 통풍, 고요산혈증이다. 특정 구현예에서, KHK-관련 장애는 과도한 당 갈망과 같은 섭식 장애이다.
특정 구현예에서, 대상체에게 dsRNA를 투여하는 것은 과당 대사의 감소를 야기한다. 특정 구현예에서, dsRNA의 투여는 대상체에서 KHK, 특히 간 KHK, 특히 KHK가 상승된 대상체에서 KHK-C 수준의 감소를 야기한다. 특정 구현예에서, dsRNA의 투여는 대상체에서 과당 대사의 감소를 야기한다. 특정 구현예에서, dsRNA의 투여는 혈청 요산이 상승된 대상체, 예를 들어 통풍과 연관된 혈청 요산이 상승된 대상체에서 요산, 예를 들어 혈청 요산 수치의 감소를 야기한다. 특정 구현예에서, dsRNA의 투여는 적어도 하나의 비정상적인 혈청 지질 수준을 갖는 대상체에서 혈청 지질, 예를 들어 식후 중성지방, LDL, HDL, 또는 콜레스테롤을 포함하는 중성지방의 정상화를 유발한다. 특정 구현예에서, dsRNA의 투여는 지질 침착의 정상화, 예를 들어, 간에서의 지질 침착의 감소(예를 들어, NAFLD 또는 NASH의 감소), 내장 지방 침착의 감소, 체중의 감소를 야기한다. 특정 구현예에서, dsRNA의 투여는 인슐린에 대한 면역 반응과 관련되지 않은 비정상적인 인슐린 반응 또는 비정상적인 포도당 반응을 갖는 대상체에서 인슐린 또는 포도당 반응의 정상화를 야기한다. 특정 구현예에서, dsRNA의 투여는 신장 기능의 개선, 또는 신장 기능의 손실률의 중단 또는 감소를 초래한다. 특정 구현예에서, dsRNA는 고혈압, 즉 혈압 상승의 감소를 야기한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 추가 제제를 KHK-관련 질환을 가진 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 다양한 KHK-관련 질환에 대해 당업계에 공지된 치료제가 본 발명의 RNAi 제제와 조합되어 사용된다. 이러한 치료는 아래에서 논의된다.
일 구현예에서, 대상체는 인간이다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 약 0.01mg/kg 내지 약 50mg/kg의 용량으로 대상체에게 투여된다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 대상체에게 피하 투여된다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법은 대상체로부터의 시료(들)에서 KHK의 수준을 추가로 결정하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 대상체 시료(들)의 KHK의 수준은 혈액 또는 혈청 시료(들)의 KHK 단백질 수준이다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법은 대상체에서 요산 수치, 특히 혈청 요산 수치를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 방법은 대상체에서 소변 과당 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 방법은 대상체에서 혈청 지질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 대상체에서 인슐린 또는 포도당 민감도를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 과당 대사의 발현 수준 또는 활성의 감소는 KHK-관련 질환이 치료되고 있거나 예방되고 있음을 나타낸다.
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 dsRNA 또는 본 발명의 임의의 약제학적 조성물 및, 선택적으로, 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 임의의 dsRNA 제제의 안티센스 가닥을 포함하는 RNA-유도 침묵 복합체(RISC)를 추가로 제공한다.
또 다른 구현예에서, RNAi 제제는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다. 본원의 RNAi 제제 각각의 "약제학적으로 허용가능한 염"은 나트륨 염, 칼슘 염, 리튬 염, 칼륨 염, 암모늄 염, 마그네슘 염, 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 당업자는, RNAi 제제가, 선택적으로 변형된 포스포디에이터 골격의 유리산 기당 하나의 양이온 및/또는 임의의 다른 산성 변형(예를 들어, 5'-말단 포스포네이트 기)을 갖는 다중양이온 염으로서 제공될 때, 이를 이해할 것이다. 예를 들어, 길이가 "n"개 뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드는 n-1개의 선택적로 변형된 포스포디에스테르를 함유하므로, 길이가 21개의 뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드가 최대 20개의 양이온(예를 들어, 20개의 나트륨 양이온)을 갖는 염으로서 제공될 수 있다. 유사하게, 길이가 21개의 뉴클레오타이드인 센스 가닥 및 길이가 23개의 뉴클레오타이드인 안티센스 가닥을 갖는 RNAi 제제는 최대 42개의 양이온(예를 들어, 42개의 나트륨 양이온)을 갖는 염으로서 제공될 수 있다. RNAi 제제가 또한 5'-말단 포스페이트 또는 5'-말단 비닐포스포네이트 기를 포함하는 선행 예에서, RNAi 제제는 최대 44개의 양이온(예를 들어, 44개의 나트륨 양이온)을 갖는 염으로서 제공될 수 있다.
본 발명은 다음의 상세한 설명 및 도면에 의해 추가로 예시된다.
도 1은 과당의 고전적이고 대안적인 지방 생성 경로를 도시한다. 고전적 경로에서, 중성지방(TG)은 알돌라아제 B(Aldo B) 및 지방산 합성효소(FAS)를 포함하는 다수의 효소의 작용에 의한 과당 대사의 직접 산물이다. 대안적인 경로에서, 과당에서 과당-1-포스페이트(F-1-P)로의 인산화 중에 발생하는 뉴클레오타이드 전환으로부터 생성된 요산은, 크렙(Krebs) 사이클에서 아코니타아제(ACO2)의 활성 감소를 유발하는 미토콘드리아 산화 스트레스(mtROS)를 생성한다. 결과적으로, ACO2 기질인 시트레이트는 축적되어 시토졸로 방출되고, 여기서 ATP 시트레이트 리아제(ACL) 및 지방산 합성효소의 활성화를 통해 TG 합성을 위한 기질로서 작용한다. AMPD2, AMP 데아미나제 2; IMP, 이노신 모노포스페이트; PO4, 포스페이트(문헌참조: Johnson 등(2013) Diabetes. 62:3307~3315).
도 2는 투여 후 29일차에 표시된 듀플렉스의 단일 3mg/kg 용량의 투여가 KHK mRNA 및 KHK 단백질의 수준에 미치는 효과를 도시하는 그래프이다. mRNA 및 단백질의 수준은 mRNA 및 단백질의 투여-전 수준에 대해 정규화된 남은 %로서 도시되어 있다.
도 3은 투여 후 50일차에 표시된 듀플렉스의 단일 3mg/kg 용량의 투여가 KHK mRNA의 수준에 미치는 효과를 도시하는 그래프이다. mRNA의 수준은 mRNA의 투여-전 수준에 대해 정규화된 남은 %로서 도시되어 있다.
도 4는 투여 후 78일차에 표시된 듀플렉스의 단일 3mg/kg 용량의 투여가 KHK mRNA의 수준에 미치는 효과를 도시하는 그래프이다. mRNA의 수준은 mRNA의 투여-전 수준에 대해 정규화된 남은 %로서 도시되어 있다.
본 발명은 케토헥소키나아제(KHK) 유전자의 RNA 전사체의 RNA-유도 침묵 복합체(RISC)-매개 절단에 영향을 미치는 iRNA 조성물을 제공한다. 유전자는 세포 내, 예를 들어, 인간과 같은 대상체 내 세포에 존재할 수 있다. 이들 iRNA의 사용은 포유류에서 상응하는 유전자(KHK 유전자)의 mRNA의 표적화된 분해를 가능하게 한다.
본 발명의 iRNA는 다른 포유동물 종의 케토헥소키나아제(KHK) 오솔로그(orthologs)에 보존된 유전자의 일부를 포함하는 인간 케토헥소키나아제(KHK) 유전자를 표적으로 하도록 설계되었다. 이론에 의해 제한하고자 하는 의도 없이, 이들 iRNA에서 이전의 성질 및 특이적 표적 부위 또는 특이적 변형의 조합 또는 서브-조합은 본 발명의 iRNA에 개선된 효능, 안정성, 효능, 내구성 및 안전성을 부여하는 것으로 사료된다.
따라서, 본 발명은 KHK 유전자의 RNA 전사체의 RNA-유도 침묵 복합체(RISC)-매개 절단에 영향을 미치는 iRNA 조성물을 사용하여, 케토헥소키나아제(KHK)-관련 장애, 예를 들어, 간 질환(예를 들어, 지방간, 지방간염, 비알코올성 지방간염(NASH)), 이상지질혈증(예를 들어, 고지혈증, 고LDL 콜레스테롤, 저HDL 콜레스테롤, 고중성지방혈증, 식후 고중성지방혈증), 혈당 조절 장애(예를 들어, 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병), 심혈관 질환(예를 들어, 고혈압, 내피세포 기능장애), 신장 질환(예를 들어, 급성 신장 장애, 관상 기능장애, 근위 세관에 대한 전염증성 변화, 만성 신장 질환), 대사 증후군, 지방세포 기능장애, 내장지방 침착, 비만, 고요산혈증, 통풍, 섭식 장애, 및 과도한 당 갈망을 치료 및 예방하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 iRNA는 길이가 최대 약 30개 이하의 뉴클레오타이드인, 예를 들어, 길이가 19~30, 19~29, 19~28, 19~27, 19~26, 19~25, 19~24, 19~23, 19~22, 19~21, 19~20, 20~30, 20~29, 20~28, 20~27, 20~26, 20~25, 20~24, 20~23, 20~22, 20~21, 21~30, 21~29, 21~28, 21~27, 21~26, 21~25, 21~24, 21~23, 또는 21~22개의 뉴클레오타이드인 영역을 갖는 RNA 가닥(안티센스 가닥)을 포함하며, 이 영역은 KHK 유전자의 mRNA 전사체의 적어도 일부에 실질적으로 상보적이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 이중가닥 RNAi 제제의 가닥 중 하나 또는 둘 모두는 길이가 최대가 66개의 뉴클레오타이드, 예를 들어 길이가 36~66, 26~36, 25~36, 31~60, 22~43, 27~53개의 뉴클레오타이드이며, 적어도 19개 연속 뉴클레오타이드의 영역은 KHK 유전자의 mRNA 전사체의 적어도 일부에 실질적으로 상보적이다. 일부 구현예에서, 더 긴 길이의 안티센스 가닥을 갖는 이러한 iRNA 제제는, 예를 들어 길이가 20~60개 뉴클레오타이드의 제2 RNA 가닥(센스 가닥)을 포함할 수 있되, 센스 및 안티센스 가닥은 18~30개의 연속 뉴클레오타이드의 듀플렉스를 형성한다.
본 발명의 iRNA의 사용은 포유류에서 상응하는 유전자(KHK 유전자)의 mRNA의 표적화된 분해를 가능하게 한다. 시험관 내 검정을 사용하여, 본 발명자들은 KHK 유전자를 표적으로 하는 iRNA가 강력하게 RNAi를 매개하여, KHK 유전자의 발현을 상당히 억제할 수 있음을 입증하였다. 따라서, 이들 iRNA를 포함하는 방법 및 조성물은 KHK-관련 장애, 예를 들어, 간 질환(예를 들어, 지방간, 지방간염, 비알코올성 지방간염(NASH)), 이상지질혈증(예를 들어, 고지혈증, 고LDL 콜레스테롤, 저HDL 콜레스테롤, 고중성지방혈증, 식후고중성지방혈증), 혈당 조절 장애(예를 들어, 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병), 심혈관 질환(예를 들어, 고혈압, 내피세포 기능장애), 신장 질환(예를 들어, 급성 신장 장애, 관상 기능장애, 근위 세관에 대한 전염증성 변화, 만성 신장 질환), 대사 증후군, 지방세포 기능장애, 내장지방 침착, 비만, 고요산혈증, 통풍, 섭식 장애, 및 과도한 당 갈망을 가진 대상체를 치료하는 데 유용하다.
따라서, 본 발명은 KHK 유전자의 RNA 전사체의 RNA-유도 침묵 복합체(RISC)-매개 절단에 영향을 미치는 iRNA 조성물을 사용하여, KHK 유전자의 발현을 억제하거나 감소시키는 것으로부터 혜택을 받을 장애, 예를 들어 간 질환(예를 들어, 지방간, 지방간염, 비알코올성 지방간염(NASH)), 이상지질혈증(예를 들어, 고지혈증, 고LDL 콜레스테롤, 저HDL 콜레스테롤, 고중성지방혈증, 식후고중성지방혈증), 혈당 조절 장애(예를 들어, 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병), 심혈관 질환(예를 들어, 고혈압, 내피세포 기능장애), 신장 질환(예를 들어, 급성 신장 장애, 관상 기능장애, 근위 세관에 대한 전염증성 변화, 만성 신장 질환), 대사 증후군, 지방세포 기능장애, 내장지방 침착, 비만, 고요산혈증, 통풍, 섭식 장애, 및 과도한 당 갈망과 같은 KHK-관련 장애를 가진 대상체를 치료하기 위한 방법 및 병용 요법을 제공한다.
본 발명은 또한 KHK 유전자의 발현을 억제하거나 감소시키는 것으로부터 혜택을 받을 장애, 예를 들어 간 질환(예를 들어, 지방간, 지방간염, 비알코올성 지방간염(NASH)), 이상지질혈증(예를 들어, 고지혈증, 고LDL 콜레스테롤, 저HDL 콜레스테롤, 고중성지방혈증, 식후고중성지방혈증), 혈당 조절 장애(예를 들어, 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병), 심혈관 질환(예를 들어, 고혈압, 내피세포 기능장애), 신장 질환(예를 들어, 급성 신장 장애, 관상 기능장애, 근위 세관에 대한 전염증성 변화, 만성 신장 질환), 대사 증후군, 지방세포 기능장애, 내장지방 침착, 비만, 고요산혈증, 통풍, 섭식 장애, 및 과도한 당 갈망을 가진 대상체에서 적어도 하나의 증상을 예방하기 위한 방법을 제공한다.
다음의 상세한 설명은 KHK 유전자의 발현을 억제하기 위한 iRNA를 함유하는 조성물을 제조하고 사용하는 방법뿐만 아니라 KHK 유전자의 발현의 억제 및/또는 감소로 혜택을 받을 대상체, 예를 들어 KHK-관련 장애에 취약하거나 이를 진단받은 대상체를 치료하기 위한 조성물, 용도 및 방법 들을 개시한다.
I. 정의
본 발명이 보다 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위해, 먼저 특정 용어를 정의한다. 또한, 파라미터의 값 또는 값의 범위가 인용될 때마다, 인용된 값의 중간 값 및 범위가 또한 본 발명의 일부로 의도된다는 점에 유의해야 한다.
단수형 관사("a" 및 "an")는 본원에서 관사의 문법적인 대상 중 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭한다. 예로서, "일 요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소, 예를 들어, 복수의 요소를 의미한다.
용어 "포함하는(including)"은 문구 "~을 포함하지만 이에 제한되지 않는"을 의미하기 위해 본원에 사용되고 이와 상호교환적으로 사용된다.
용어 "또는"은 문맥상 명백하게 달리 의미하지 않는 이상, 용어 "및/또는"을 의미하기 위해 본원에 사용되고 이와 상호교환적으로 사용된다. 예를 들어, "센스 가닥 또는 안티센스 가닥"은 "센스 가닥 또는 안티센스 가닥 또는 센스 가닥 및 안티센스 가닥"으로 이해된다.
용어 "약"은 당업계의 통상적인 허용 오차 범위 내에 있음을 의미하기 위해 본원에 사용된다. 예를 들어, "약"은 평균으로부터 약 2 표준 편차로서 이해될 수 있다. 특정 구현예에서, 약은 ±10%를 의미한다.. 특정 구현예에서, 약은 ± 5%를 의미한다. 약이 일련의 수 또는 범위 앞에 존재하는 경우, "약"은 일련의 수 또는 범위 내의 수 각각을 수식할 수 있는 것으로 이해한다.
수 또는 일련의 수들 앞의 용어 "적어도", "초과", 또는 "이상"은 용어 "적어도"에 근접한 수, 및 문맥으로부터 분명해지듯이 논리적으로 포함될 수 있는 모든 후속 수 또는 정수를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 핵산 분자 내 뉴클레오타이드의 수는 정수이어야 한다. 예를 들어, "21개 뉴클레오타이드 핵산 분자의 적어도 19개 뉴클레오타이드"는 19, 20, 또는 21개 뉴클레오타이드가 지정된 성질을 가 짐을 의미한다. 적어도가 일련의 수 또는 범위 앞에 존재하는 경우, "적어도"는 일련의 수 또는 범위 내의 수 각각을 수식할 수 있는 것으로 이해한다.
본 명세서에서 사용되는 것과 같이, "미만" 또는 "이하"는 문구에 근접한 값으로 이해되고, 논리적으로 더 낮은 값 또는 정수는 문맥상 논리적으로 0에 근접한 값으로 이해한다. 예를 들어, "2개 이하의 뉴클레오타이드"의 오버행을 갖는 듀플렉스는 2, 1, 또는 0개의 뉴클레오타이드 오버행을 갖는다. "이하"가 일련의 수 또는 범위 앞에 존재하는 경우, "이하"는 일련의 또는 범위 내의 수 각각을 수식할 수 있는 것으로 이해된다. 본원에서 사용되는 것과 같이, 범위는 상한 및 하한 모두를 포함한다.
본원에 사용된 것과 같이, 검출 방법은 존재하는 분석물의 양이 방법의 검출 수준 미만인 결정을 포함할 수 있다.
지정된 표적 부위와 센스 또는 안티센스 가닥에 대한 뉴클레오타이드 서열에 모순이 있는 경우, 지정된 서열이 우선된다.
서열과 전사체 상의 그 지정된 부위 또는 다른 서열 사이에 모순이 있는 경우, 본 명세서에 인용된 뉴클레오타이드 서열이 우선된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "KHK"와 상호교환적으로 사용되는 "케토헥소키나아제"는 과당에서 과당-1-포스페이트로의 전환을 촉매하는 효소를 암호화하는 자연적으로 발생하는 유전자를 지칭한다. 해당 유전자의 생성물은 식이 과당을 분해하는 경로의 첫 번째 효소이다. 대안적으로, 상이한 이소형을 암호화하는 접합된(spliced) 전사 변이체가 식별되었다. 이 유전자는 프락토키나아제로도 알려져 있다.
KHK의 예시적인 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은. 예를 들어, GenBank 수탁 번호 XM_017004061.1(호모 사피엔스 KHK; 서열번호 1; 역방향 보체, 서열번호 2); NM_006488.3(호모 사피엔스 KHK; 서열번호 3; 역방향 보체, 서열번호 4); NM_000221.3(호모 사피엔스 KHK; 서열번호 5; 역방향 보체, 서열번호 6); GenBank 수탁 번호 NM_001310524.1(무스 무스쿨루스 KHK; 서열번호 7; 역방향 보체, 서열번호 8); GenBank 수탁 번호 NM_031855.3(래터스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus) KHK; 서열번호 9; 역방향 보체, 서열번호 10); GenBank 수탁 번호 XM_005576322.2(게잡이원숭이 KHK, 서열번호 11; 역방향 보체, 서열번호 12)에서 확인할 수 있다.
KHK(케토헥소키나아제) 유전자는 염색체 2p23 상에 위치하며, 프락토키나아제로도 알려진 케토헥소키나아제를 암호화한다. KHK는 포스페이트 수용체로서 알코올을 갖는 포스포트랜스퍼라아제 효소이다. KHK는 탄수화물 키나아제의 리보키나아제 계열에 속한다(문헌참조: Trinh 등, ACTA Cryst., D65: 201~211). 케토헥소키나아제의 두 가지 이소형인 KHK-A 및 KHK-C가 식별되었으며, 이는 전장 mRNA의 대안적인 접합에서 기인한다. 이들 이소형은 엑손 3a 또는 3c를 포함함으로써 상이하고, 위치 72와 115 사이 32개 아미노산에 의해 상이하다. KHK-C mRNA는 주로 간, 신장 및 소장에서 높은 수준으로 발현된다. KHK-C는 과당 결합에 대해 KHK-A보다 훨씬 더 낮은 Km을 가지며, 그 결과 식이 과당을 인산화하는 데 매우 효과적이다. 인간 KHK-C mRNA 전사체의 서열은, 예를 들어, GenBank 수탁 번호 NM_006488.3(호모 사피엔스 KHK; 서열번호 3)에서 확인할 수 있다. 인간 KHK-A mRNA 전사체의 서열은 예를 들어 GenBank 수탁 번호 NM_000221.3; 서열번호 5에서 확인할 수 있다. 전장 인간 KHK mRNA의 서열은 GenBank 수탁 번호 GI: XM_017004061.1(서열번호 1)에 제공된다.
본 명세서에 제공된 iRNA 제제는 하나 또는 둘 모두의 KHK 이소형을 침묵시킬 수 있다.
KHK mRNA 서열의 추가적인 예가 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스, 예를 들어 GenBank, UniProt, OMIM 및 마카카(Macaca) 게놈 프로젝트 웹사이트를 통해 쉽게 이용 가능하다.
KHK에 대한 추가 정보는 예를 들어, www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=khk에서 확인할 수 있다.
전술한 GenBank 수탁 번호 및 유전자 데이터베이스 번호 각각의 전문은 본 출원을 제출한 날짜를 기준으로 본원에 참조로서 통합된다.
본 명세서에서 사용된 용어 KHK는 SNP 데이터베이스에 제공된 변이체를 포함하는 KHK 유전자의 변이 또한 지칭한다. KHK 유전자 내 수많은 서열 변이가 확인되었고, 예를 들어, NCBI dbSNP 및 UniProt에서 확인할 수 있다(예를 들어, www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/?term=KHK를 참조하며, 이의 전문이 본 출원을 제출한 날짜를 기준으로 본원에 참조로서 통합된다).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "표적 서열"은 일차 전사 생성물의 RNA 처리 생성물인 mRNA를 포함하는 KHK 유전자의 전사 동안 형성된 mRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열의 연속 부분을 지칭한다. 서열의 표적 부분은 KHK 유전자의 전사 동안 형성된 mRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 부분에서 또는 그 부분 근처에서 iRNA-지시 절단을 위한 기질로 작용하기에 적어도 충분히 길 것이다. 일 구현예에서, 표적 서열은 KHK의 단백질 코딩 영역 내에 존재한다.
표적 서열은 길이가 약 19~36개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 길이가 약 19~30개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 예를 들어, 표적 서열은 길이가 약 19~30개의 뉴클레오타이드, 19~30, 19~29, 19~28, 19~27, 19~26, 19~25, 19~24, 19~23, 19~22, 19~21, 19~20, 20~30, 20~29, 20~28, 20~27, 20~26, 20~25, 20~24, 20~23, 20~22, 20~21, 21~30, 21~29, 21~28, 21~27, 21~26, 21~25, 21~24, 21~23, 또는 21~22개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 서열은 길이가 19~23개의 뉴클레오타이드, 선택적으로 길이가 21~23개의 뉴클레오타이드이다. 위에서 언급된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이 또한 본 개시내용의 일부로 고려된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "서열을 포함하는 가닥"은 표준 뉴클레오타이드 명명법을 사용하여 지칭된 서열에 의해 기술된 뉴클레오타이드 쇄를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다.
"G," "C," "A," "T," 및 "U"는 일반적으로 염기로서 각각 구아닌, 시토신, 아데닌, 티미딘 및 우라실을 함유하는 뉴클레오타이드를 각각 의미한다. 그러나, 용어 "리보뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드"는 또한 하기에 추가로 상세히 설명되는 것과 같이 변형 뉴클레오타이드, 또는 대용 대체 모이어티(예를 들어, 표 1 참조)를 지칭할 수 있음이 이해될 것이다. 통상의 기술자는 구아닌, 시토신, 아데닌, 및 우라실이 이러한 대체 모이어티를 보유하는 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 염기쌍 형성 특성을 실질적으로 변경하지 않고 다른 모이어티로 대체될 수 있음을 잘 알고 있다. 예를 들어, 비제한적으로, 이노신을 그 염기로 포함하는 뉴클레오타이드는 아데닌, 시토신, 또는 우라실을 함유하는 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성할 수 있다. 따라서, 우라실, 구아닌, 또는 아데닌을 함유하는 뉴클레오타이드는 발명에서 특징화된 dsRNA의 뉴클레오타이드 서열에서, 예를 들어 이노신을 함유하는 뉴클레오타이드에 의해 대체될 수 있다. 또 다른 예에서, 올리고뉴클레오타이드 어느 곳의 아데닌 및 시토신은 각각 구아닌 및 우라실과 대체되어 표적 mRNA와 G-U 워블 염기쌍을 형성할 수 있다. 이러한 대체 모이어티를 함유하는 서열은 본 발명에서 특징화된 조성물 및 방법에 적합하다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "iRNA", "RNAi 제제", "iRNA 제제", "RNA 간섭 제제"는 본 명세서에서 정의된 것과 같은 RNA를 함유하고, RNA-유도 침묵 복합체(RISC) 경로를 통한 RNA 전사체의 표적화된 절단을 매개하는 제제를 지칭한다. iRNA는 RNA 간섭(RNAi)으로 알려진 프로세스를 통해 mRNA의 서열 특이적 분해를 지시한다. iRNA는 세포, 예를 들어, 포유동물 대상체와 같은 대상체 내 세포에서 KHK 유전자의 발현을 조절, 예를 들어, 억제한다.
일 구현예에서, 본 발명의 RNAi 제제는 표적 RNA 서열, 예를 들어, KHK 표적 mRNA 서열과 상호작용하여 표적 RNA의 절단을 지시하는 단일 가닥 RNA를 포함한다. 이론에 얽매이고자 하는 것 없이 세포 내로 도입된 긴 이중 가닥 RNA는 다이서(Dicer)로 알려진 III형 엔도뉴클레아제에 의해 siRNA로 분해되는 것으로 사료된다(문헌참조: Sharp 등(2001) Genes Dev. 15:485). 리보뉴클레아제 III형 효소인 다이서는 dsRNA를 특징적인 2개의 염기 3' 오버행을 갖는 19~23개 염기쌍의 짧은 간섭 dsRNA로 가공한다(문헌참조: Bernstein, 등(2001) Nature 409:363). 이어서 siRNA는 하나 이상의 헬리카제가 siRNA 듀플렉스를 푸는 RNA-유도 침묵 복합체(RISC) 내로 혼입되어, 상보적 안티센스 가닥이 표적 인식을 유도할 수 있도록 한다(문헌참조: Nykanen, 등(2001) Cell 107:309). 적절한 표적 mRNA에 결합 시, RISC 내의 하나 이상의 엔도뉴클레아제는 표적을 절단하여 침묵을 유도한다(문헌참조: Elbashir, 등(2001) Genes Dev. 15:188). 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 세포 내에서 생성되고 RISC 복합체의 형성을 촉진하여 표적 유전자, 즉, KHK 유전자의 침묵에 영향을 미치는 단일 가닥 RNA(siRNA)에 관한 것이다. 따라서, 용어 "siRNA"는 또한 전술한 것과 같은 iRNA를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다.
특정 구현예에서, RNAi 제제는 표적 mRNA를 억제하기 위해 세포 또는 유기체 내로 도입되는 단일 가닥 siRNA(ssRNAi)일 수 있다. 단일 가닥 RNAi 제제는 RISC 엔도뉴클레아제인 아르고너트(Argonaute) 2에 결합하여 표적 mRNA를 절단한다. 단일-가닥 siRNA는 일반적으로 15~30개의 뉴클레오타이드이며 화학적으로 변형된다. 단일-가닥 siRNA의 설계 및 시험은 미국 특허번호 제8,101,348호 및 문헌[Lima 등(2012) Cell 150:883~894]에 기재되어 있으며, 이의 각각의 전문은 본원에 참조로서 통합된다. 본 명세서에서 기술된 임의의 안티센스 뉴클레오타이드 서열은 본 명세서에서 기술된 것과 같거나 문헌[Lima 등(2012) Cell 150:883~894]에 기술된 방법에 의해 화학적으로 변형된 것과 같은 단일-가닥 siRNA로서 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물, 용도, 및 방법에 사용하기 위한 "iRNA"는 이중 가닥 RNA이고, 본 명세서에서 "이중 가닥 RNA 제제", "이중 가닥 RNA(dsRNA) 분자", "dsRNA 제제" 또는 "dsRNA"로 지칭된다. 용어 "dsRNA"는 2개의 역평행하며 실질적으로 상보적인 핵산 가닥을 포함하는 듀플렉스 구조를 갖는 리보핵산 분자의 복합체를 지칭하고, 표적 RNA, 즉, KHK 유전자에 대해 "센스" 및 "안티센스" 배향을 갖는 것으로 지칭된다. 본 발명의 일부 구현예에서, 이중 가닥 RNA(dsRNA)는 본 명세서에서 RNA 간섭 또는 RNAi로 지칭되는 전사후 유전자-침묵 기전을 통해 표적 RNA, 예를 들어 mRNA의 분해를 촉발한다.
일반적으로, dsRNA 분자의 각 가닥의 뉴클레오타이드 대부분은 리보뉴클레오타이드지만, 본 명세서에서 상세히 기술된 것과 같이, 각각 또는 양 가닥은 또한 하나 이상의 비-리보뉴클레오타이드, 예를 들어, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 변형 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용된 것과 같은 "iRNA"는 화학적 변형을 갖는 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있고; iRNA는 다수의 뉴클레오타이드에서 실질적인 변형을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 것과 같이, 용어 "변형 뉴클레오타이드"는, 독립적으로, 변형 당 모이어티, 변형 뉴클레오타이드 간 결합, 또는 변형 뉴클레오염기, 또는 이의 임의의 조합을 갖는 뉴클레오타이드를 지칭한다. 따라서, 용어 변형 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 간 결합, 당 모이어티 또는 뉴클레오염기에 대한, 예를 들어 작용기 또는 원자의 치환, 추가 또는 제거를 포괄한다. 본 발명의 제제에 사용하기에 적합한 변형은 본 명세서에서 개시되거나 당업계에 공지된 모든 유형의 변형을 포함한다. siRNA 유형의 분자에 사용된 것과 같은 임의의 이러한 변형은 본 명세서 및 청구범위의 목적을 위해 "iRNA" 또는 "RNAi 제제"에 의해 포괄된다.
본 개시내용의 특정 구현예에서, RNAi 제제 내에 존재하는 경우, 데옥시-뉴클레오타이드의 포함은 변형 뉴클레오타이드를 구성하는 것으로 간주될 수 있다.
듀플렉스 영역은 RISC 경로를 통해 바람직한 표적 RNA의 특이적 분해를 허용하는 임의의 길이일 수 있고, 길이가 약 19 내지 36개의 염기쌍, 예를 들어 길이가 약 19~30개의 염기쌍, 예를 들어 길이가 약 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 또는 36개의 염기쌍, 예컨대 길이가 약 19~30, 19~29, 19~28, 19~27, 19~26, 19~25, 19~24, 19~23, 19~22, 19~21, 19~20, 20~30, 20~29, 20~28, 20~27, 20~26, 20~25, 20~24, 20~23, 20~22, 20~21, 21~30, 21~29, 21~28, 21~27, 21~26, 21~25, 21~24, 21~23, 또는 21~22개의 염기쌍 범위일 수 있다. 특정 구현예에서, 듀플렉스 영역은 길이가 19~21개의 염기쌍, 예를 들어, 길이가 21개의 염기쌍이다. 위에서 언급된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이는 또한 발명의 일부인 것으로 고려된다.
듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 가닥은 하나의 더 큰 RNA 분자의 상이한 부분일 수 있거나 이들은 별도의 RNA 분자일 수 있다. 2개의 가닥이 하나의 더 큰 분자의 일부이고, 따라서 듀플렉스 구조를 형성하는 한 가닥의 3'-말단과 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이에 연속적인 뉴클레오타이드 쇄로 결합되어 있는 경우, 연결 RNA 쇄는 "헤어핀 루프"로서 지칭된다. 헤어핀 루프는 적어도 하나의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 헤어핀 루프는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 23개 이상의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 헤어핀 루프는 10개 이하의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 헤어핀 루프는 8개 이하의 쌍을 형성하지 않는 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 헤어핀 루프는 4~10개의 쌍을 형성하지 않는 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 헤어핀 루프는 4~8개의 뉴클레오타이드일 수 있다.
dsRNA의 2개의 실질적으로 상보적인 가닥이 별개의 RNA 분자로 구성되는 경우, 이들 분자는 그럴 필요는 없지만 공유 연결될 수 있다. 2개의 가닥이 듀플렉스 구조를 형성하는 한 가닥의 3'-말단과 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이에 연속적인 뉴클레오타이드 쇄 이외의 수단에 의해 공유적으로 연결되어 있는 경우, 연결 구조는 "링커"로 지칭된다. RNA 가닥은 동일하거나 상이한 수의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 염기쌍의 최대 수는 dsRNA의 최단 가닥에서 듀플렉스 내에 존재하는 임의의 오버행을 제외한 뉴클레오타이드의 수이다. 듀플렉스 구조 이외에, RNAi는 하나 이상의 뉴클레오타이드 오버행을 포함할 수 있다. RNAi 제제의 일 구현예에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개 뉴클레오타이드, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 포함한다. 다른 구현예에서, RNAi 제제의 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개 뉴클레오타이드의 5' 오버행을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개 뉴클레오타이드, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 뉴클레오타이드의 5' 오버행을 포함한다. 또 다른 구현예에서, RNAi 제제의 하나의 가닥의 3' 및 5' 말단 둘 모두는 1개 이상의 뉴클레오타이드의 오버행을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 iRNA 제제는 dsRNA이며, 이의 각각의 가닥은 표적 RNA 서열, 예를 들어, KHK 유전자와 상호작용하여 표적 RNA의 절단을 지향하는 19~23개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 iRNA는 표적 RNA 서열, 예를 들어, KHK 표적 mRNA 서열과 상호작용하여 표적 RNA의 절단을 지향하는 24~30개의 뉴클레오타이드의 dsRNA이다.
본 명세서에서 사용되는 것과 같이, 용어 "뉴클레오타이드 오버행"은 이중 가닥 iRNA의 듀플렉스 구조로부터 돌출된 적어도 하나의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드를 지칭한다. 예를 들어, dsRNA의 한 가닥의 3'-말단이 다른 가닥의 5'-말단을 넘어 확장되거나 그 반대인 경우, 뉴클레오타이드 오버행이 존재한다. dsRNA는 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 오버행을 포함할 수 있고; 대안적으로, 오버행은 적어도 2개의 뉴클레오타이드, 적어도 3개의 뉴클레오타이드, 적어도 4개의 뉴클레오타이드, 적어도 5개의 뉴클레오타이드 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 오버행은 데옥시뉴클레오타이드/뉴클레오사이드를 포함하는 뉴클레오타이드/뉴클레오사이드 유사체를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 오버행(들)은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 이들의 임의의 조합 상에 있을 수 있다. 또한, 오버행의 뉴클레오타이드(들)는 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥의 5'-말단, 3'-말단 또는 양쪽 말단 상에 존재할 수 있다.
일 구현예에서, dsRNA의 안티센스 가닥은 3'-말단 또는 5'-말단에서 오버행된, 1~10개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 일 구현예에서, dsRNA의 센스 가닥은 3'-말단 또는 5'-말단에서 오버행된, 1~10개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 오버행에서 하나 이상의 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 티오포스페이트로 대체된다.
특정 구현예에서, dsRNA의 안티센스 가닥은 3'-말단 또는 5'-말단에서 오버행된, 1~10개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 0~3, 1~3, 2~4, 2~5, 4~10, 5~10 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 일 구현예에서, dsRNA의 센스 가닥은 3'-말단 또는 5'-말단에서 오버행된, 1~10개 뉴클레오타이드, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 오버행에서 하나 이상의 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 티오포스페이트로 대체된다.
특정 구현예에서, dsRNA의 안티센스 가닥은 3'-말단 또는 5'-말단에서 오버행된, 1~10개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 특정 구현예에서, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥, 또는 둘 모두 상의 오버행은 10개의 뉴클레오타이드보다 더 긴, 예를 들어, 길이가 1~30개의 뉴클레오타이드, 2~30개의 뉴클레오타이드, 10~30개의 뉴클레오타이드, 10~25개의 뉴클레오타이드, 10~20개의 뉴클레오타이드, 또는 10~15개의 뉴클레오타이드보다 길게 연장된 길이를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 센스 가닥 상에 있다. 특정 구현예에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 센스 가닥의 3' 말단 상에 존재한다. 특정 구현예에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 센스 가닥의 5' 말단 상에 존재한다. 특정 구현예에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 안티센스 가닥 상에 있다. 특정 구현예에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 안티센스 가닥의 3' 말단 상에 존재한다. 특정 구현예에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5' 말단 상에 존재한다. 특정 구현예에서, 연장된 오버행에서 하나 이상의 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 티오포스페이트로 대체된다. 특정 구현예에서, 오버행은 오버행이 생리학적 조건 하에서 안정한 헤어핀 구조를 형성할 수 있도록 자체 상보적인 부분을 포함한다.
"둔화(blunt)" 또는 "둔화 말단(blunt end)"은 이중 가닥 RNA 제제의 그 말단에 짝을 형성하지 않는 뉴클레오타이드가 없음을, 즉, 뉴클레오타이드 오"뵉敾* 없음을 의미한다. "둔화 말단" 이중 가닥 RNA 제제는 그 전체 길이에 걸쳐 이중 가닥인데, 즉, 분자의 양 말단에 뉴클레오타이드 오버행이 없다. 본 발명의 RNAi 제제는 하나의 말단에 뉴클레오타이드 오버행이 없거나(즉, 하나의 오버행 및 하나의 둔화 말단을 갖는 제제) 어느 한 말단에 뉴클레오타이드 오버행이 없는 RNAi 제제를 포함한다. 가장 흔하게, 그러한 분자는 그 전체 길이에 걸쳐 이중 가닥일 것이다.
용어 "안티센스 가닥" 또는 "가이드 가닥"은 iRNA, 예를 들어, dsRNA의 가닥을 지칭하며, 이는 표적 서열, 예를 들어, KHK mRNA에 실질적으로 상보적인 영역을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 것과 같이, "상보성 영역"은 표적 서열과 같은 서열, 예를 들어, 본 명세서에 정의된 것과 같은 KHK 뉴클레오타이드 서열에 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥 상의 영역을 지칭한다. 상보성 영역이 표적 서열에 완전히 상보적이지 않은 경우, 미스매치는 분자의 내부 또는 말단 영역에 존재할 수 있다. 일반적으로 가장 허용되는 미스매치는 말단 영역, 예를 들어, iRNA의 5'-말단 또는 3'-말단의 5, 4, 또는 3개 뉴클레오타이드 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 발명의 이중 가닥 RNA 제제는 안티센스 가닥 내에 뉴클레오타이드 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중 가닥 RNA 제제의 안티센스 가닥은 표적 mRNA와의 4개 이하 미스매치를 포함하는데, 예를 들어, 안티센스 가닥은 표적 mRNA와의 4, 3, 2, 1, 또는 0개 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중 가닥 RNA 제제의 안티센스 가닥은 센스 가닥과의 4개 이하 미스매치를 포함하는데, 예를 들어, 안티센스 가닥은 센스 가닥과의 4, 3, 2, 1, 또는 0개 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중 가닥 RNA 제제는 센스 가닥 내에 뉴클레오타이드 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중 가닥 RNA 제제의 센스 가닥은 안티센스 가닥과의 4개 이하 미스매치를 포함하는데, 예를 들어, 센스 가닥은 안티센스 가닥과의 4, 3, 2, 1, 또는 0개 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 미스매치는, 예를 들어, iRNA의 3'-말단으로부터 5, 4, 3개 뉴클레오타이드 내에 있다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 미스매치는, 예를 들어, iRNA 제제의 3'-말단 뉴클레오타이드 내에 있다. 일부 구현예에서, 미스매치(들)는 씨드 영역 내에 있지 않다.
따라서, 본원에 기술된 RNAi 제제는 표적 서열에 대해 하나 이상의 미스매치를 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 본 명세서에 기술된 RNAi 제제는 3개 이하의 미스매치(즉, 3, 2, 1, 또는 0개 미스매치)를 함유한다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 RNAi 제제는 2개 이하의 미스매치를 함유한다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 RNAi 제제는 1개 이하의 미스매치를 함유한다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 RNAi 제제는 0개의 미스매치를 함유한다. 특정 구현예에서, RNAi 제제의 안티센스 가닥이 표적 서열에 대해 미스매치를 함유하는 경우, 미스매치는 선택적으로 상보성 영역의 5'-말단 또는 3'-말단으로부터 마지막 5개 뉴클레오타이드 내에 존재하는 것으로 제한될 수 있다. 예를 들어, 그러한 구현예에서, 23개 뉴클레오타이드 RNAi 제재의 경우, KHK 유전자의 영역에 상보적인 가닥은 일반적으로 중앙 13개 뉴클레오타이드 내에 임의의 미스매치를 함유하지 않는다. 본 명세서에 기술된 방법 또는 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 표적 서열에 대해 미스매치를 함유하는 RNAi 제제가 KHK 유전자의 발현을 억제하는 데 효과적인지를 결정할 수 있다. KHK 유전자의 발현을 억제하는 데 있어서 미스매치를 갖는 RNAi 제제의 효능을 고려하는 것이 중요하며, KHK 유전자 내 특정 상보성 영역이 집단 내 다형성 서열 변화를 갖는 것으로 공지된 경우 특히 그러하다.
본 명세서에서 사용된 용어 "센스 가닥" 또는 "패신저 가닥"은 용어가 본 명세서에서 정의된 것과 같은 안티센스 가닥의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 iRNA의 가닥을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 것과 같이, "실질적으로 모든 뉴클레오타이드는 변형되는"은 대부분 변형되지만 전부 변형되지는 않으며, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 미변형 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 것과 같이, 용어 "절단 영역"은 절단 부위에 바로 인접하여 위치하는 영역을 지칭한다. 절단 부위는 절단이 일어나는 표적 상의 부위이다. 일부 구현예에서, 절단 영역은 절단 부위의 어느 하나의 말단 상에 있고 이에 바로 인접한 3개의 염기를 포함한다. 일부 구현예에서, 절단 영역은 절단 부위의 어느 하나의 말단 상에 있고 이에 바로 인접한 2개의 염기를 포함한다. 일부 구현예에서, 절단 부위는 구체적으로 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 10 및 11에 의해 결합되는 부위에서 발생하며, 절단 영역은 뉴클레오타이드 11, 12 및 13을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 것과 같이, 그리고 달리 명시되지 않는 한, 용어 "상보적"은 제2 뉴클레오타이드 서열과 관련하여 제1 뉴클레오타이드 서열을 설명하는 데 사용될 때, 당업자에 의해 이해될 수 있는 것과 같이, 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 특정한 조건 하에서 듀플렉스 구조를 혼성화하고 형성하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 능력을 지칭한다. 이러한 조건은, 예를 들어, 엄격한 조건일 수 있으며, 여기서 엄격한 조건은 다음을 포함할 수 있다: 400mM NaCl, 40mM PIPES pH 6.4, 1mM EDTA, 세척 후 12~16시간 동안 50°C 또는 70°C(문헌참조: 예를 들어, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Sambrook, 등(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). 이러한 조건은, 예를 들어, "엄격한 조건"일 수 있으며, 여기서 엄격한 조건은 다음을 포함할 수 있다: 400 mM NaCl, 40mM PIPES pH 6.4, 1mM EDTA, 세척 후 12~16시간 동안 50°C 또는 70°C(문헌참조: 예를 들어, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, 등(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). 유기체 내에서 접할 수 있는 생리학적으로 관련된 조건과 같은 다른 조건들이 적용될 수 있다. 당업자는 혼성화된 뉴클레오타이드의 궁극적인 적용에 따라 2개 서열의 상보성 시험에 가장 적합한 조건들의 세트를 결정할 수 있을 것이다.
iRNA 내의, 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 것과 같은 dsRNA 내의 상보적인 서열은 하나 또는 둘 모두의 뉴클레오타이드 서열의 전체 길이에 걸쳐 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 염기쌍 형성을 포함한다. 그러한 서열은 본 명세서에서 서로에 대해 "완전히 상보적"인 것으로 지칭될 수 있다. 그러나, 제1 서열이 본 명세서에서 제2 서열과 관련하여 "실질적으로 상보적"인 것으로 언급되는 경우, 2개의 서열은 완전히 상보적일 수 있거나, 이들은 최대 30개 염기쌍의 듀플렉스에 대하여 혼성화 시, 하나 이상, 그러나 일반적으로 5, 4, 3 또는 2개 이하의 미스매칭된 염기쌍을 형성할 수 있는 한편, 이들의 궁극적인 적용, 예를 들어, 시험관내 또는 생체내 유전자 발현의 억제와 가장 관련된 조건 하에서 혼성화하는 능력은 유지한다. 그러나, 혼성화 시, 2개의 올리고뉴클레오타이드가 하나 이상의 단일 가닥 오버행을 형성하도록 설계된 경우, 그러한 오버행은 상보성 결정과 관련하여 미스매치로서 간주되지 않는다. 예를 들어, 길이가 21개 뉴클레오타이드인 하나의 올리고뉴클레오타이드 및 길이가 23개 뉴클레오타이드인 또 다른 올리고뉴클레오타이드를 포함하되, 보다 긴 올리고뉴클레오타이드가 보다 짧은 올리고뉴클레오타이드에 완전히 상보적인 21개 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 dsRNA는 본 명세서에서 기술된 목적을 위해 "완전히 상보적"인 것으로 여전히 언급될 수 있다.
본원에 사용된 것과 같은 "상보적" 서열은 또한 혼성화하는 이들의 능력과 관련하여 위의 요건이 충족되는 한, 비-왓슨-클릭(non-Watson-Crick) 염기쌍 또는 비-천연 및 변형된 뉴클레오타이드로부터 형성된 염기쌍을 포함하거나 이들로부터 전적으로 형성될 수 있다. 그러한 비-왓슨-클릭 염기쌍은 G:U 워블(Wobble) 또는 후그슈타인(Hoogsteen) 염기쌍 형성을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
이들의 사용과 관련된 문맥으로부터 이해되는 것과 같이, 본 명세서의 용어 "상보적인", "완전한 상보적인", 및 "실질적으로 상보적인"은 dsRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이, 또는 2개의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 이중 가닥 RNA 제제의 안티센스 가닥과 표적 서열 사이의 염기 매칭과 관련해 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 것과 같이, 메신저 RNA(mRNA)의 "적어도 일부에 실질적으로 상보적"인 폴리뉴클레오타이드는 관심 mRNA(예를 들어, KHK 유전자를 암호화하는 mRNA)의 연속 부분에 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 서열이 KHK 유전자를 암호화하는 mRNA의 비-중단 부분에 실질적으로 상보적인 경우 KHK mRNA의 적어도 일부에 상보적이다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 표적 KHK 서열에 완전히 상보적이다. 다른 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 표적 KHK 서열에 실질적으로 상보적이고, 그의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 또는 11 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열의 등가 영역, 또는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 또는 11 중 임의의 하나의 단편에 적어도 80% 상보적인, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 표적 KHK 서열의 단편에 실질적으로 상보적이고, 그의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1의 뉴클레오타이드 120~162; 164~188; 181~207; 193~217; 209~231; 283~306; 508~546; 568~603; 596~632; 640~674; 746~806; 806~835; 917~942; 936~084; 1016~1041; 1100~1123; 1149~1175; 1160~1193; 1205~1229; 1252~1283; 1334~1356; 1407~1429; 1472~1497; 1506~1533; 1539~1561; 1704~1727; 1747~1787; 1850~1873; 1936~1964; 1960~1990; 2015~2048; 2060~2095; 2090~2118; 2124~2160; 2181~2200; 2221~2262의 군으로부터 선택된 서열번호 1의 단편에 적어도 80% 상보적인, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 표적 KHK 서열의 단편에 실질적으로 상보적이고, 그의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1의 뉴클레오타이드 517~539; 521~543; 524~546; 517~546; 581~603; 610~632; 747~769; 749~771; 752~774; 755~777; 757~779; 758~780; 764~786; 776~798; 781~803; 747~803; 920~942; 941~963; 944~966; 950~972; 962~984; 920~984; 1149~1171; 1161~1183; 1165~1187; 1171~1193; 1149~1193; 1205~1227; 1206~1228; 1205~1228; 1334~1356; 1472~1494; 1475~1497; 1472~1497의 군으로부터 선택된 서열번호 1의 단편에 적어도 80% 상보적인, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 표적 KHK 서열의 단편에 실질적으로 상보적이고, 그의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1의 뉴클레오타이드 517~539; 524~546; 517~546; 753~775; 757~779; 753~779; 764~786; 767~789; 768~790; 769~791; 764~791; 773~795; 781~803; 773~803; 753~803; 808~830; 937~959; 941~963; 944~966; 941~966; 948~970; 950~972; 948~972; 1160~1182; 1161~1183; 1160~1183; 및 1207~1229의 군으로부터 선택된 서열번호 1의 단편에 적어도 80% 상보적인, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 표적 KHK 서열의 단편에 실질적으로 상보적이고, 그의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1의 뉴클레오타이드 495~517, 492~517, 500~529, 514~551, 517~539, 524~546, 517~548, 614~643, 625~647, 625~660, 642~664, 642~672, 753~811, 754~780, 762~791, 764~786, 772~800, 781~803, 805~827, 808~830, 809~831, 792~838, 931~982, 944~966, 947~969, 948~970, 948~982, 1011~1035, 1021~1043, 1019~1050, 1063~1091, 1150~1192, 1152~1176, 1160~1192, 1160~1182, 1162~1184, 1198~1230, 1198~1221, 및 1202~1230의 군으로부터 선택된 서열번호 1의 단편에 적어도 80% 상보적인, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 표적 KHK 서열의 단편에 실질적으로 상보적이고, 그의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1의 뉴클레오타이드 495~517, 492~517, 500~529, 514~551, 517~539, 524~546, 517~548, 614~643, 625~647, 625~660, 642~664, 642~672, 753~811, 754~780, 762~791, 764~786, 772~800, 781~803, 805~827, 808~830, 809~831, 792~838, 931~982, 944~966, 947~969, 948~970, 948~982, 1011~1035, 1021~1043, 1019~1050, 1063~1091, 1150~1192, 1152~1176, 1160~1192, 1160~1182, 1162~1184, 1198~1230, 1198~1221, 및 1202~1230의 군으로부터 선택된 서열번호 1의 단편에 적어도 80% 상보적인, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 표적 KHK 서열에 실질적으로 상보적이고, 그의 전체 길이에 걸쳐 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 임의의 하나의 센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나, 또는 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 임의의 하나의 센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나의 단편에 적어도 약 80% 상보적인, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 본 개시내용의 RNAi 제제는 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 실질적으로 상보적이며 결국 표적 KHK 서열과 동일한 센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥 폴리뉴클레오타이드는 그의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 또는 12의 뉴클레오타이드 서열의 등가 영역, 또는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 또는 12 중 임의의 하나의 단편에 적어도 80% 상보적인, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 iRNA는 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 실질적으로 상보적이며 결국 표적 KHK 서열에 상보적인 센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥 폴리뉴클레오타이드는 그의 전체 길이에 걸쳐 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 임의의 하나의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나, 또는 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 임의의 하나의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나의 단편에 적어도 약 80% 상보적인, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥은 듀플렉스 AD-1613400; AD-1613243; AD-1290757.3; AD-1290878.3; AD-1290969.3; AD-1423317.2; AD-1423327.2; AD-1423336.2; AD-1290599.3; AD-1523172.1; AD-1290837.3; AD-1523173.1; AD-1290884.3; AD-1523174.1; AD-1290959.3; AD-1523175.1; AD-1423311.2; AD-1423324.2; AD-1523176.1; AD-1423329.2; AD-1423333.2; AD-1423330.2; AD-1523177.1; AD-1290885.3; AD-1523178.1; AD-1423334.2; AD-1523179.1; AD-1523180.1; AD-1290539.3; 및 AD-1523181.1 중 어느 하나로부터 선택된다.
일반적으로, "iRNA"는 화학적 변형을 갖는 리보뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 변형은 본 명세서에서 개시되거나 당업계에 공지된 모든 유형의 변형을 포함할 수 있다. dsRNA 분자에 사용된 것과 같은 임의의 이러한 변형은 본 명세서 및 청구범위의 목적을 위해 "iRNA"에 의해 포괄된다.
본 개시내용의 특정 구현예에서, RNAi 제제 내에 존재하는 경우, 데옥시-뉴클레오타이드의 포함은 변형 뉴클레오타이드를 구성하는 것으로 간주될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물에 사용하기 위한 제제는 안티센스 억제 메커니즘을 통해 표적 mRNA를 억제하는 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오타이드 분자이다. 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오타이드 분자는 표적 mRNA 내의 서열에 상보적이다. 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 mRNA에 대한 염기쌍 형성 및 번역 기계를 물리적으로 방해함으로써 화학량론적 방식으로 번역을 억제할 수 있으며, 문헌[Dias, N. 등(2002) Mol Cancer Ther 1:347~355]을 참조한다. 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오타이드 분자는 길이가 약 14 내지 약 30개의 뉴클레오타이드일 수 있고, 표적 서열에 상보적인 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오타이드 분자는 본 명세서에 기술된 안티센스 서열 중 임의의 하나로부터 적어도 약 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 연속 뉴클레오타이드인 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 dsRNA와 같은 "iRNA와 세포의 접촉"이라는 문구는 임의의 가능한 수단에 의해 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. iRNA와 세포의 접촉은 iRNA와 시험관내 세포를 접촉시키는 것 또는 iRNA와 생체내 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 접촉은 직접적으로 또는 간접적으로 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들어, iRNA는 방법을 수행하는 개체에 의해 세포와 물리적 접촉에 놓일 수 있거나, 대안적으로, iRNA는 후속적으로 세포와 접촉하도록 허용하거나 이를 야기하는 상황에 놓일 수 있다.
시험관내 세포와의 접촉은, 예를 들어, 세포를 iRNA와 항온처리함으로써 수행될 수 있다. 생체내 세포와의 접촉은, 예를 들어, iRNA를 세포가 위치한 조직 내로 또는 이의 부근에 주사하여, 또는 iRNA를 또 다른 영역, 예를 들어, 혈류 또는 피하 공간 내로 주사하여 접촉될 세포가 위치한 조직에 제제가 후속적으로 도달하도록함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, iRNA는 iRNA를 관심 부위, 예를 들어, 간으로 지시하는 리간드, 예를 들어, GalNAc을 함유하거나 이에 결합될 수 있다. 시험관내 및 생체내 접촉 방법의 조합 또한 가능하다. 예를 들어, 세포는 iRNA와 시험관내 접촉될 수 있고, 후속적으로 대상체 내로 이식될 수도 있다.
특정 구현예에서, iRNA와 세포의 접촉은 세포 내로의 취득(uptake) 또는 흡수(absorption)를 촉진하거나 초래함으로써 "iRNA를 세포 내로 도입" 또는 "전달하는 것"을 포함한다. iRNA의 흡수 또는 취득은 비보조 확산 또는 활성 세포 과정을 통해, 또는 보조제 또는 장치에 의해 일어날 수 있다. iRNA를 세포 내로 도입시키는 것은 시험관내 또는 생체내일 수 있다. 예를 들어, 생체내 도입을 위해, iRNA는 조직 부위 내로 주사되거나 전신 투여될 수 있다. 세포 내로의 시험관내 도입은 전기천공 및 지질감염과 같은 당업계에 공지된 방법을 포함한다. 추가의 접근법은 하기 본원에 기술되어 있거나 당업계에 공지되어 있다.
용어 "지질 나노입자" 또는 "LNP"는 핵산 분자, 예를 들어, iRNA 또는 iRNA가 전사되는 플라스미드와 같은 약제학적 활성 분자를 캡슐화하는 지질 층을 포함하는 소포이다. LNP는, 예를 들어, 미국 특허번호 제6,858,225호, 제6,815,432호, 제8,158,601호, 및 제8,058,069호에 기술되어 있으며, 이의 전문이 본원에 참조로서 통합된다.
본 명세서에서 사용되는 것과 같이, "대상체"는 영장류(예컨대, 인간, 비-인간 영장류, 예를 들어, 원숭이 및 침팬지), 비-영장류(예컨대, 소, 돼지, 말, 염소, 토끼, 양, 햄스터, 기니피그, 고양이, 개, 랫트 또는 마우스)를 포함하는 포유동물, 또는 내인성 또는 이종성으로 표적 유전자를 발현하는 조류와 같은 동물이다. 일 구현예에서, 대상체는 인간, 예컨대 본명세서에서 기술된 KHK 발현의 감소로 혜택을 받을 질환 또는 장애를 치료받거나 평가받는 사람, KHK 발현의 감소로 혜택을 받을 질환 또는 장애의 위험이 있는 사람; KHK 발현의 감소로 혜택을 받을 질환 또는 장애를 가진 사람; 또는 KHK 발현의 감소로 혜택을 받을 질환 또는 장애를 치료받는 사람이다. 일부 구현예에서, 대상체는 여성인 인간이다. 다른 구현예에서, 대상체는 남성인 인간이다. 일 구현예에서, 대상체는 성인 대상체이다. 또 다른 구현예에서, 대상체는 소아 대상체이다.
본 명세서에서 사용되는 것과 같이, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 유익하거나 바람직한 결과, 예컨대 대상체에서 KHK-관련 장애의 적어도 하나의 징후 또는 증상을 감소시키는 것을 지칭한다. 치료는 또한 원하지 않는 KHK 발현과 관련된 하나 이상의 징후 또는 증상의 감소; 원하지 않는 KHK 활성화 또는 안정화 정도의 감소; 원하지 않는 KHK 활성화 또는 안정화의 완화 또는 일시적 억제를 포함한다. "치료"는 또한 치료를 받지 않을 때 예상되는 생존률과 비교하여 생존을 연장시키는 것을 의미할 수 있다. 대상체에서 KHK 수준 또는 질환 마커 또는 증상의 맥락에서 용어 "낮추다"는 이러한 수준의 통계적으로 유의미한 감소를 지칭한다. 감소는 예를 들어, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, %, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상일 수 있다. 특정 구현예에서, 감소는 적어도 20%이다. 특정 구현예에서, 감소는 질환 마커, 예를 들어, 단백질 또는 유전자 발현 수준에서의 적어도 50%이다. 대상체의 KHK 수준의 문맥에서 "낮추다"는 그러한 장애가 없는 개체에 대한 정상 범위 내에 있는 것으로서 허용되는 수준으로의 감소이다. 특정 구현예에서, "낮추다"는 질환을 앓고 있는 대상체에 대한 마커 또는 증상의 수준과 개체에 대한 정상 범위 내에서 허용되는 수준 사이 차이의 감소, 예를 들어 비만인 개체와 정상 범위 내에서 허용되는 체중을 갖는 개체 사이 체중의 감소의 수준이다.
본 명세서에서 사용되는 것과 같이, 질환, 장애 또는 이의 병태와 관련하여 사용될 때, "예방" 또는 "예방하는"은 KHK 유전자 발현의 감소에 의해 치료되거나 개선될 수 있으며, 이는 대상체가 이러한 질환, 장애 또는 병태와 관련된 증상, 예를 들어, 원치 않거나 과도한 KHK 발현 및/또는 활성의 증상, 예를 들어, 과당 대상 증가, 요산 및 지질 수준 증가를 발생시킬 가능성의 감소를 지칭한다. 메커니즘에 구속되지 않고, KHK에 의해 과당-1-포스페이트를 형성하기 위해 촉매되는 과당 인산화는 피드백 억제에 의해 조절되지 않는 것으로 알려져 있으며, 이는 ATP 및 세포내 포스페이트의 고갈을 초래할 수 있고, AMP 수준을 증가시켜, 요산의 생성을 초래한다. 또한, 과당-1-포스페이트는 구연산 사이클 내로 공급되어 아세틸 Co-A 자극 지방산 합성의 생성을 증가시키는 글리세르알데히드로 대사된다. 요산 및 지방산 합성의 상승과 관련된 질환 및 병태는 다음을 포함한다: 예를 들어, 간 질환(예를 들어, 지방간, 비알코올성 지방간염(NASH)을 포함하는 지방간염), 이상지질혈증(예를 들어, 고지혈증, 고LDL 콜레스테롤, 저HDL 콜레스테롤, 고중성지방혈증, 식후고중성지방혈증), 혈당 조절 장애(예를 들어, 인슐린에 대한 면역 반응과 관련이 없는 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병), 심혈관 질환(예를 들어, 고혈압, 내피 세포 기능장애), 신장 질환(예를 들어, 급성 신장 장애, 관상 기능장애, 근위 세관에 대한 전염증성 변화, 만성 신장 질환), 대사 증후군, 지질 침착 질환 또는 기능장애(예를 들어, 지방세포 기능장애, 내장 지방 침착, 비만), 요산 상승 질환(예를 들어, 고요산혈증, 통풍), 및 과도한 당 갈망과 같은 섭식 장애. 질환, 장애 또는 병태 발병의 실패, 또는 이러한 질환, 장애 또는 병태와 관련된 증상 또는 동반질환의 발병의 (예를 들어, 임상적으로 허용되는 스케일에서 적어도 약 10%) 감소 또는 수일, 수주, 수개월, 또는 수년 지연된 징후 또는 증상의 발현 또는 질환 진행이 효과적인 예방으로 간주된다.
본 명세서에서 사용되는 것과 같이, 용어 " 케토헥소키나아제(KHK)-관련 질환" 또는 "KHK-관련 질환"은 KHK 유전자 발현 또는 KHK 단백질 생성에 의해 야기되거나 이와 연관된 질환 또는 장애이다. 용어 "KHK-관련 질환"은 KHK 유전자 발현, 복제, 또는 단백질 활성의 감소로 혜택을 받을 질환, 장애 또는 병태를 포함한다. KHK-관련 질환의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 예를 들어, 간 질환(예를 들어, 지방간, 비알코올성 지방간염(NASH)을 포함하는 지방간염), 이상지질혈증(예를 들어, 고지혈증, 고LDL 콜레스테롤, 저HDL 콜레스테롤, 고중성지방혈증, 식후고중성지방혈증), 혈당 조절 장애(예를 들어, 인슐린에 대한 면역 반응과 관련이 없는 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병), 심혈관 질환(예를 들어, 고혈압, 내피 세포 기능장애), 신장 질환(예를 들어, 급성 신장 장애, 관상 기능장애, 근위 세관에 대한 전염증성 변화, 만성 신장 질환), 대사 증후군, 지질 침착 질환 또는 기능장애(예를 들어, 지방세포 기능장애, 내장 지방 침착, 비만), 요산 상승 질환(예를 들어, 고요산혈증, 통풍), 및 과도한 당 갈망과 같은 섭식 장애.
특정 구현예에서, KHK-관련 질환은 요산 상승과 관련된다(예를 들어, 고요산혈증, 통풍).
특정 구현예에서, KHK-관련 질환은 지질 수준 상승과 관련된다(예를 들어, 지방간, 비알코올성 지방간염(NASH)을 포함하는 지방간염, 이상지질혈증).
본 명세서에서 사용되는 "치료학적 유효량"은 KHK-관련 질환을 앓는 대상체에 투여되었을 때, (예를 들어, 기존 질환 또는 질환의 하나 이상의 증상을 감소, 완화 또는 유지함으로써) 질환의 치료를 수행하기에 충분한 RNAi 제제의 양을 포함하는 것으로 의도된다. "치료학적 유효량"은 RNAi 제제, 제제가 투여되는 방식, 질환 및 그 중증도 및 치료 받을 대상체의 병력, 연령, 체중, 가족력, 유전적 구성, 경우에 따라 선행 또는 병용 치료의 유형, 및 기타 개별 특성에 따라 달라질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "예방학적 유효량"은 KHK-관련 장애를 가진 대상체에 투여되었을 때, 질환 또는 질환의 하나 이상의 증상을 예방하거나 완화시키기에 충분한 RNAi 제제의 양을 포함하는 것으로 의도된다. 질환의 완화는 질환 과정을 서행시키거나 후기 발병 질환의 중증도를 감소시킴을 포함한다. "예방학적 유효량"은 RNAi 제제, 제제가 투여되는 방식, 질환 위험 정도, 및 치료 받을 대상체의 병력, 연령, 체중, 가족력, 유전적 구성, 경우에 따라 선행 또는 병용 치료의 유형, 및 기타 개별 특성에 따라 달라질 수 있다.
"치료학적-유효량" 또는 "예방학적 유효량"은 또한 합리적인 이득/위험 비율로 임의의 치료에 적용가능한 일부 원하는 효과를 생성하는 RNAi 제제의 양을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용되는 iRNA는 그러한 치료에 적용가능한 합리적인 이득/위험 비율을 생성하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다.
문구 "약제학적으로 허용가능한"은 본 명세서에서 건전한 의학학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 대상체 및 동물 대상체의 조직과의 접촉에 사용하기에 적합하며, 합리적인 이득/위험 비율에 상응하는 화합물(염을 포함), 물질, 조성물, 또는 투여 형태를 지칭하기 위해 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 문구 "약제학적으로-허용 가능한 캐리어"는 대상 화합물을 하나의 기관 또는 신체의 한 부분에서 또 다른 기관 또는 신체의 다른 부분으로 전달하거나 운반하는 데 관여하는, 약제학적으로-허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 제조 보조제(예를 들어, 윤활제, 탈크 마그네슘, 칼슘 또는 아연 스테아레이트 또는 스테아르산), 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다. 각각의 캐리어는 제형의 다른 성분과 호환성일 수 있고 치료 받는 대상체에게 해를 끼치지 않는다는 점에서 "허용가능"해야만 한다. 이러한 캐리어는 당업계에 공지되어 있다. 약제학적으로 허용가능한 캐리어는 주사에 의한 투여를 위한 캐리어를 포함한다.
대상체 내 KHK 유전자 발현 또는 KHK 단백질 생성의 수준 또는 질환 마커 또는 증상과 관련하여 용어 "낮추다"는 그러한 수준의 통계적으로 유의미한 감소를 지칭한다. 감소는, 예를 들어, 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 또는 검출 방법의 검출 수준 미만일 수 있다. 특정 구현예에서, 표적의 발현은 정규화되는데, 즉, 그러한 장애가 없는 개체에 대한 정상 범위 내에 있는 것으로서 허용되는 수준, 예를 들어, 체중, 혈압, 또는 혈청 지질 수준의 정규화를 향해 또는 그 수준으로 감소된다. 본 명세서에서 사용되는 것과 같이, 대상체에서 "낮추다"는 대상체 내 세포에서 유전자 발현 또는 단백질 생성의 저하를 지칭할 수 있고, 대상체의 모든 세포 또는 조직에서 발현의 저하를 요구하는 것은 아니다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용되는 것과 같이, 대상체에서 낮추는 것은 대상체의 간에서 유전자 발현 또는 단백질 생성의 저하를 포함할 수 있다.
용어 "낮추다"는 또한 질환 또는 병태의 증상을 정규화하는 것, 즉, KHK-관련 질환을 앓고 있는 대상체의 수준 사이의 차이를 KHK-관련 질환을 앓고 있지 않는 정상 대상체의 수준을 향해 또는 그 수준으로 감소시키는 것과 관련되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 70kg이 정상 체중인 대상체가 치료 전에 90kg의 체중(20kg 과체중)이고 치료 후에 80kg의 체중(10kg 과체중)인 경우, 대상체의 체중은 정상 체중을 향해 50%(10/20 x 100%)만큼 감소된다. 유사하게, 여성의 HDL 수준이 50mg/dL(나쁨)에서 57mg/dL로 증가되고, 정상 수준이 60mg/dL인 경우, 대상체의 이전 수준과 정상 수준 사이의 차이는 70%만큼 감소한다(대상체 수준과 정상 수준 사이의 10mg/dL 차이가 7mg/dL, 7/10 x 100%만큼 감소함). 본 명세서에서 사용되는 것과 같이, 질환이 증상에 대해 상승한 값과 관련되는 경우, "정상"은 정상의 상한으로 간주된다. 질환이 증상에 대해 감소한 값과 관련되는 경우, "정상"은 정상의 하한으로 간주된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "시료"는 대상체로부터 분리된 유사한 체액, 세포 또는 조직뿐만 아니라 대상체 내에 존재하는 체액, 세포 또는 조직의 집합체를 포함한다. 생물학적 유체의 예는 혈액, 혈청 및 장액, 혈장, 뇌척수액, 안액, 림프, 소변, 타액 등을 포함한다. 조직 시료는 조직, 기관, 또는 국소 영역으로부터의 시료를 포함할 수 있다. 예를 들어, 시료는 특정 기관, 기관의 일부 또는 해당 기관 내의 체액 또는 세포로부터 유래할 수 있다. 특정 구현예에서, 시료는 간(예를 들어, 전체 간 또는 간의 특정 부문 또는 예를 들어, 간세포와 같은 간 내 특정 유형의 세포)으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, "대상체로부터 유래된 시료"는 대상체로부터 수득된 소변을 지칭한다. "대상체로부터 유래된 시료"는 대상체로부터 채취한 혈액(혈장 또는 혈청으로 쉽게 변환될 수 있음)을 지칭할 수 있다.
II. 본 발명의 iRNA
본 발명은 KHK 유전자의 발현을 억제하는 iRNA를 제공한다. 특정 구현예에서, iRNA는 세포, 예컨대 대상체, 예를 들어, KHK-관련 질환을 갖고 있거나 이의 발병에 취약한 인간과 같은 포유류 내 세포에서 KHK 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 분자를 포함한다. dsRNAi 제제는 KHK 유전자의 발현에서 형성된 mRNA의 적어도 일부에 상보적인 상보성 영역을 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 상보성 영역은 길이가 약 30개 이하의 뉴클레오타이드(예를 들어, 길이가 약 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19 또는 18개의 뉴클레오타이드)이다. KHK 유전자를 발현하는 세포와의 접촉 시, iRNA는 예를 들어, PCR 또는 분지형 DNA(bDNA)-기반 방법에 의해, 또는 예를 들어, 웨스턴 블롯팅 또는 유동 세포측정 기술을 사용하는 면역형광 분석과 같은 단백질-기반 방법에 의한 검정 시, KHK 유전자(예를 들어, 인간, 영장류, 비-영장류, 또는 랫츠 KHK 유전자)의 발현을 적어도 약 50%만큼 억제한다. 특정 구현예에서, 발현의 억제는 본원에 제공된 적절한 유기체 세포주에서, 예를 들어, 10nM 농도의 siRNA를 사용하여 본원의 예에서 제공된 qPCR 방법에 의해 결정된다. 특정 구현예에서, 생체내 발현의 억제는 , 예를 들어, RNA 발현 최하점에서, 예를 들어, 3mg/kg의 단일 투여량으로 투여될 때, 인간 유전자를 발현하는 설치류, 예를 들어, 인간 표적 유전자를 발현하는 마우스 또는 AAV-감염 마우스 내 인간 유전자의 녹다운에 의해 결정된다.
dsRNA는 상보적이고, dsRNA가 사용될 조건 하에서 듀플렉스 구조를 형성하기 위해 혼성화하는 2개의 RNA 가닥을 포함한다. dsRNA의 하나의 가닥(안티센스 가닥)은 표적 서열과 실질적으로 상보적이고, 일반적으로 완전히 상보적인 상보성 영역을 포함한다. 표적 서열은 KHK 유전자의 발현 동안에 형성된 mRNA의 서열로부터 유래될 수 있다. 다른 가닥(센스 가닥)은 안티센스 가닥에 상보적인 영역을 포함하여, 2개의 가닥은 적합한 조건 하에서 조합되는 경우 혼성화하여 듀플렉스 구조를 형성한다. 본 명세서의의 다른 곳에 기술되고 당업계에 공지된 것과 같이, dsRNA의 상보적 서열은 별개의 올리고뉴클레오타이드 상에 존재하는 것과는 달리, 단일 핵산 분자의 자체-상보적 영역으로서 함유될 수도 있다.
일반적으로, 듀플렉스 구조는 길이가 15 내지 30개의 염기쌍, 예를 들어, 길이가 15~29, 15~28, 15~27, 15~26, 15~25, 15~24, 15~23, 15~22, 15~21, 15~20, 15~19, 15~18, 15~17, 18~30, 18~29, 18~28, 18~27, 18~26, 18~25, 18~24, 18~23, 18~22, 18~21, 18~20, 19~30, 19~29, 19~28, 19~27, 19~26, 19~25, 19~24, 19~23, 19~22, 19~21, 19~20, 20~30, 20~29, 20~28, 20~27, 20~26, 20~25, 20~24, 20~23, 20~22, 20~21, 21~30, 21~29, 21~28, 21~27, 21~26, 21~25, 21~24, 21~23, 또는 21~22개의 염기쌍이다. 특정 구현예에서, 듀플렉스 구조는 길이가 18 내지 25개의 염기쌍, 예를 들어, 길이가 18~25, 18~24, 18~23, 18~22, 18~21, 18~20, 19~25, 19~24, 19~23, 19~22, 19~21, 19~20, 20~25, 20~24, 20~23, 20~22, 20~21, 21~25, 21~24, 21~23, 21~22, 22~25, 22~24, 22~23, 23~25, 23~24 또는 24~25개의 염기쌍, 예를 들어, 길이가 19~21개의 염기쌍이다. 위에서 언급된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이 또한 본 개시내용의 일부로 고려된다.
유사하게, 표적 서열에 대한 상보성 영역은 길이가 15 내지 30개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 길이가 15~29, 15~28, 15~27, 15~26, 15~25, 15~24, 15~23, 15~22, 15~21, 15~20, 15~19, 15~18, 15~17, 18~30, 18~29, 18~28, 18~27, 18~26, 18~25, 18~24, 18~23, 18~22, 18~21, 18~20, 19~30, 19~29, 19~28, 19~27, 19~26, 19~25, 19~24, 19~23, 19~22, 19~21, 19~20, 20~30, 20~29, 20~28, 20~27, 20~26, 20~25, 20~24, 20~23, 20~22, 20~21, 21~30, 21~29, 21~28, 21~27, 21~26, 21~25, 21~24, 21~23, 또는 21~22개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 길이가 19~23개의 뉴클레오타이드 또는 길이가 21~23개의 뉴클레오타이드이다. 위에서 언급된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이 또한 본 개시내용의 일부로 고려된다.
일부 구현예에서, 듀플렉스 구조는 길이가 19 내지 30개 염기쌍이다. 유사하게, 표적 서열에 대한 상보성 영역은 길이가 19 내지 30개 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, dsRNA는 길이가 약 19 내지 약 23개 뉴클레오타이드, 또는 길이가 약 25 내지 약 30개 뉴클레오타이드이다. 일반적으로, dsRNA는 다이서 효소에 대한 기질로서 작용하기에 충분히 길다. 예를 들어, 길이가 약 21~23개 뉴클레오타이드보다 긴 dsRNA가 다이서에 대한 기질로 작용할 수 있다는 것이 당업계에 널리 공지되어 있다. 당업자가 또한 인지하는 것과 같이, 절단을 위해 표적화된 RNA의 영역은 가장 흔히 보다 큰 RNA 분자, 종종 mRNA 분자의 일부일 것이다. 관련되는 경우, mRNA 표적의 "일부"는 그것이 RNAi-지시된 절단(즉, RISC 경로를 통한 절단)을 위한 기질이 되도록 하기에 충분한 길이의 mRNA 표적의 연속 서열이다.
당업자는 또한 듀플렉스 영역이 dsRNA의 일차 기능성 부분으로, 예를 들어, 듀플렉스 영역은 약 19 내지 약 30개의 염기쌍, 예를 들어, 약 19~30, 19~29, 19~28, 19~27, 19~26, 19~25, 19~24, 19~23, 19~22, 19~21, 19~20, 20~30, 20~29, 20~28, 20~27, 20~26, 20~25, 20~24, 20~23, 20~22, 20~21, 21~30, 21~29, 21~28, 21~27, 21~26, 21~25, 21~24, 21~23, 또는 21~22개의 염기쌍이다. 따라서, 일 구현예에서, 절단을 위한 바람직한 RNA를 표적으로 하는, 예를 들어, 15~30개의 염기쌍의 기능성 듀플렉스로 가공되는 정도로, 30개 초과의 염기쌍의 듀플렉스 영역을 갖는 RNA 분자 또는 RNA 분자의 복합체는 dsRNA이다. 따라서, 당업자는 일 구현예에서, miRNA가 dsRNA임을 인지할 것이다. 또 다른 구현예에서, dsRNA는 자연적으로 발생하는 miRNA가 아니다. 또 다른 구현예에서, KHK 유전자 발현을 표적으로 하는데 유용한 iRNA 제제는 더 큰 dsRNA의 절단에 의해 표적 세포 내에서 생성되지 않는다.
본 명세서에서 기술된 dsRNA는 하나 이상의 단일-가닥 뉴클레오타이드 오버행, 예를 들어, 1~4, 2~4, 1~3, 2~3, 1, 2, 3, 또는 4개의 뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 적어도 하나의 뉴클레오타이드 오버행을 갖는 dsRNA는 이들의 둔화-말단 대응체에 비해 우수한 억제 특성을 가질 수 있다. 뉴클레오타이드 오버행은 데옥시뉴클레오타이드/뉴클레오사이드를 포함하는 뉴클레오타이드/뉴클레오사이드 유사체를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 오버행(들)은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 이들의 임의의 조합 상에 있을 수 있다. 또한, 오버행의 뉴클레오타이드(들)는 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥의 5'-말단, 3'-말단 또는 양쪽 말단 상에 존재할 수 있다.
dsRNA는 당업계에 공지된 표준 방법에 의해 합성될 수 있다. 발명의 이중 가닥 RNAi 화합물은 2단계 과정을 사용하여 제조될 수 있다. 첫번째로, 이중 가닥 RNA 분자의 개별 가닥은 별도로 제조된다. 이어서, 성분 가닥은 어닐링된다. siRNA 화합물의 개별 가닥은 용액상 또는 고체상 유기 합성 또는 둘 모두를 사용하여 제조될 수 있다. 유기 합성은 비천연 또는 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리 고뉴클레오타이드 가닥을 용이하게 제조할 수 있다는 이점을 제공한다. 유사하게, 본 발명의 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드는 용액-상 또는 고체-상 유기 합성 또는 둘 모두를 사용하여 제조될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 dsRNA는 적어도 2개의 뉴클레오타이드 서열, 센스 서열 및 안티센스 서열을 포함한다. 센스 가닥은 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나에 제공된 서열 군으로부터 선택되고, 센스 가닥의 상응하는 안티센스 가닥은 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나의 서열 군으로부터 선택된다. 본 양태에서, 2개의 서열 중 하나는 2개의 서열 중 다른 하나에 상보적이고, 서열 중 하나는 KHK 유전자의 발현에서 생성된 mRNA의 서열에 실질적으로 상보적이다. 이와 같이, 본 양태에서, dsRNA는 2개의 올리고뉴클레오타이드를 포함할 것이고, 여기서 하나의 올리고뉴클레오타이드는 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나에서 센스 가닥으로서 기술되고, 제2 올리고뉴클레오타이드는 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나에서 센스 가닥의 상응하는 안티센스 가닥으로서 기술된다.
특정 구현예에서, dsRNA의 실질적으로 상보적인 서열은 별도의 올리고뉴클레오타이드 상에 함유된다. 다른 구현예에서, dsRNA의 실질적으로 상보적인 서열은 단일 올리고뉴클레오타이드 상에 함유된다.
특정 구현예에서, 센스 또는 안티센스 가닥은 듀플렉스 AD-517197.2; AD-517258.2; AD-516748.2; AD-516851.2; AD-519351.2; AD-519754.2; AD-519828.2; AD-520018.2; AD-520035.2; AD-520062.2; AD-520064.2; AD-520065.2; AD-520067.2; AD-75289.2; AD-520069.2; AD-520099.2; AD-67575.7; AD-520101.2; AD-1193323.1; AD-1193344.1; AD-1193350.1; AD-1193365.1; AD-1193379.1; AD-1193407.1; AD-1193421.1; AD-1193422.1; AD-1193429.1; AD-1193437.1; AD-1193443.1; AD-1193471.1; AD-1193481.1 또는 AD-67605.7 중 어느 하나의 센스 또는 안티센스 가닥으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 센스 또는 안티센스 가닥은 듀플렉스 AD-519345.1, AD-519346.1, AD-519347.1, AD-67554.7, AD-519752.3, AD-1010731.1, AD-1010732.1, AD-519343.1, AD-519344.1, AD-519349.1, AD-519350.1, AD-519753.2, AD-519932.1, AD-519935.2, AD-520018.6, AD-517837.2, AD-805635.2, AD-519329.2, AD-520063.2, AD-519757.2, AD-805631.2, AD-516917.2, AD-516828.2, AD-518983.2, AD-805636.2, AD-519754.7, AD-520062.2, AD-67575.9, AD-518923.3, AD-520053.4, AD-519667.2, AD-519773.2, AD-519354.2, AD-520060.4, AD-520061.4, AD-1010733.2, AD-1010735.2, AD-1193323.1; AD-1193344.1; AD-1193350.1; AD-1193365.1; AD-1193379.1; AD-1193407.1; AD-1193421.1; AD-1193422.1; AD-1193429.1; AD-1193437.1; AD-1193443.1; AD-1193471.1; 또는 AD-1193481.1 중 어느 하나의 센스 또는 안티센스 가닥으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 센스 또는 안티센스 가닥은 듀플렉스 AD-519351의 센스 또는 안티센스 가닥으로부터 선택된다.
예를 들어, 표 2, 5, 8 및 10의 서열이 변형되거나 접합된 서열로서 기술되지 않았지만, 본 발명의 iRNA, 예를 들어, 본 발명의 dsRNA의 RNA는 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나에 제시된 서열 중 임의의 하나를 포함할 수 있으며, 이는 변형되지 않거나, 접합되지 않거나, 또는 본 명세서에서 기술된 것과 상이하게 변형되거나 접합된다는 것을 이해할 것이다. 다시 말해, 본 발명은 본원에 기술된 것과 같이, 변형되지 않거나, 접합되지 않거나, 변형되거나, 또는 접합된 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나의 dsRNA를 포함한다.
당업자는 약 20 내지 23개의 염기쌍, 예를 들어, 21개의 염기쌍의 듀플렉스 구조를 갖는 dsRNA가 RNA 간섭을 유도하는 데 특히 효과적인 것으로 환영받고 있음을 잘 알고 있다(문헌참조: Elbashir 등, EMBO 2001, 20:6877~6888). 그러나, 다른 당업자들은 더 짧거나 더 긴 RNA 듀플렉스 구조 또한 효과적일 수 있음을 밝혀냈다(문헌참조: Chu 및 Rana (2007) RNA 14:1714~1719; Kim 등(2005) Nat Biotech 23:222~226). 전술된 구현예에서, 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나에 제공된 올리고뉴클레오타이드 서열의 특성에 의해, 본원에 기술된 dsRNA는 최소 21개의 뉴클레오타이드 길이의 적어도 하나의 가닥을 포함할 수 있다. 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나의 서열 중 임의의 하나에서 하나 또는 양 말단 상의 수개의 뉴클레오타이드만을 뺀 것을 갖는 더 짧은 듀플렉스가 전술한 dsRNA와 비교하여 유사하게 효과적일 수 있는 것으로 합리적으로 예상할 수 있다. 따라서, 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나의 서열 중 임의의 하나로부터 유래된 적어도 19, 20, 21, 22, 23개 이상의 연속 뉴클레오타이드의 서열을 갖고, 전체 서열을 포함하는 dsRNA로부터 약 5, 10, 15, 20, 25 또는 30% 이하 억제로 KHK 유전자의 발현을 억제하는 이들의 능력이 상이한 dsRNA가 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다.
또한, 표 2, 3, 5, 6 및 8~13에 제공된 RNA는 KHK 전사체에서 RISC-매개 절단에 민감한 부위(들)를 식별한다. 이와 같이, 본 발명은 이들 부위 중 하나 내를 표적으로 하는 iRNA를 추가로 특징으로 한다. 본명서에서 사용되는 것과 같이, iRNA는, iRNA가 그 특정 부위 내 어느 곳에서든 전사체의 절단을 촉진하는 경우, RNA 전사체의 특정 부위 내를 표적으로 하는 것으로 일컬어진다. 이러한 iRNA는 일반적으로 KHK 유전자에서 선택된 서열에 인접한 영역으로부터 취해진 추가 뉴클레오타이드 서열에 결합된, 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나에 제공된 서열 중 임의의 하나로부터 적어도 약 19개의 연속 뉴클레오타이드를 포함할 것이다.
III. 본 발명의 변형 iRNA
특정 구현예에서, 본 발명의 iRNA, 예를 들어, dsRNA의 RNA는 변형되지 않고, 예를 들어, 당업계에 공지되고 본원에 기술된 화학적 변형 또는 접합을 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 본 발명의 iRNA, 예를 들어, dsRNA의 RNA는 화학적으로 변형되어 안정성 또는 다른 이로운 특징을 증진시킨다. 본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명의 iRNA의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드는 변형된다. 본 발명의 다른 구현예에서, iRNA의 모든 뉴클레오타이드 또는 iRNA의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드는 변형되고, 즉, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 미변형 뉴클레오타이드가 iRNA의 가닥에 존재한다.
본 발명에서 특징화된 핵산은 당업계에서 잘 확립된 방법, 예컨대 본원에 참조로서 통합된, 문헌["Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. 등(Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA]에 기술된 것과 같은 방법들에 의해 합성되거나 변형될 수 있다. 변형은, 예를 들어, 말단 변형, 예를 들어, 5'-말단 변형(인산화, 접합, 역위 결합) 또는 3'-말단 변형(접합, DNA 뉴클레오타이드, 역위 결합, 등); 염기 변형, 예를 들어, 안정화 염기, 불안정화 염기, 또는 파트너의 확장된 레퍼토리와 염기쌍을 형성하는 염기와의 대체, 염기(무염기 뉴클레오타이드), 또는 접합된 염기의 제거; 당 변형(예를 들어, 2'-위치 또는 4'-위치에서) 또는 당의 대체; 또는 포스포디에스테르 결합의 변형 또는 대체를 포함하는 골격 변형을 포함한다. 본원에 기술된 구현예에 유용한 iRNA의 특정 예는 변형된 골격을 함유하거나 어떠한 천연 뉴클레오타이드 간 연결을 함유하지 않는 RNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 변형된 골격을 갖는 RNA는 무엇보다 골격 내 인 원자를 갖지 않는 것들을 포함한다. 본 명세서의 목적을 위해서 그리고 당업계에서 때로 언급되는 것과 같이, 이들의 뉴클레오사이드 간 골격 내 인 원자를 갖지 않는 변형된 RNA는 또한 올리고뉴클레오타이드인 것으로 고려될 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 iRNA는 이의 뉴클레오사이드 간 골격 내 인 원자를 가질 것 이다,
변형된 RNA 골격은, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트를 포함하는 포스포라미데이트, 티오노포스포라미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상적인 3'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트, 이들 중 2'-5'-연결 유사체, 및 인접한 뉴클레오사이드 단위의 쌍이 3'-5'에서 5'-3' 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결되는 역극성을 갖는 것들을 포함한다. 다양한 염, 혼합 염 및 유리산 형태가 또한 포함된다. 발명의 일부 구현예에서, 발명의 dsRNA 제제는 유리산 형태로 있다. 발명의 다른 구현예에서, 발명의 dsRNA 제제는 염 형태로 있다. 일 구현예에서, 발명의 dsRNA 제제는 나트륨 염 형태로 있다. 특정 구현예에서, 발명의 dsRNA 제제가 나트륨 염 형태로 있는 경우, 나트륨 이온은 제제에 존재하는 실질적으로 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 군에 대한 역이온으로서 제제에 존재한다. 실질적으로 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 결합이 나트륨 역이온을 갖는 제제는 나트륨 역이온 없이 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제가 나트륨 염 형태로 존재하는 경우, 나트륨 이온은 제제에 존재하는 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트기에 대한 역이온으로서 제제에 존재한다.
전술한 인-함유 결합의 제조를 교지하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 번호 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,195호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,316호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 제5,625,050호; 제6,028,188호; 제6,124,445호; 제6,160,109호; 제6,169,170호; 제6,172,209호; 제6, 239,265호; 제6,277,603호; 제6,326,199호; 제6,346,614호; 제6,444,423호; 제6,531,590호; 제6,534,639호; 제6,608,035호; 제6,683,167호; 제6,858,715호; 제6,867,294호; 제6,878,805호; 제7,015,315호; 제7,041,816호; 제7,273,933호; 제7,321,029호; 및 미국 특허번호 RE39464호를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이의 각각의 전문이 본원에 참조로서 통합된다.
그 안에 인 원자를 포함하지 않는 변형 RNA 골격은 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오사이드 간 결합, 혼합 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오사이드 간 결합, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오사이드 간 결합에 의해 형성된 골격을 갖는다. 이들은 (부분적으로 뉴클레오사이드의 당 부분으로부터 형성된) 모르폴리노 연결; 실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아미드 골격; 아미드 골격을 갖는 것들; 및 혼합 N, O, S, 및 CH2 성분 부분을 갖는 기타를 포함한다.
앞서 말한 올리고뉴클레오사이드의 제조를 교지하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허번호 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,64,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 및 제5,677,439호를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이들 각각의 전문은 본원에 참조로서 인용된다.
적합한 RNA 모사체가 본원에 제공된 iRNA에서 사용하기 위해 고려되며, 뉴클레오타이드 단위의 당 및 뉴클레오사이드 간 결합, 즉, 골격 둘 모두가 신규 군과 대체된다. 염기 단위는 적당한 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위해 유지된다. 우수한 혼성화 성질을 갖는 것으로 나타난 RNA 모사체인 하나의 그러한 올리고머 화합물은 펩타이드 핵산(PNA)으로서 지칭된다. PNA 화합물에서, RNA의 당 골격은 아미드 함유 골격, 특히 아미노에틸글라이신 골격으로 대체된다. 뉴클레오염기는 보유되고 직접적으로 또는 간접적으로 골격의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허번호 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이들 각각의 전문이 본원에 참조로서 통합된다. 본 발명의 iRNA에 사용하기에 적합한 추가 PNA 화합물은, 예를 들어, 문헌[Nielsen 등, Science, 1991, 254, 1497~1500]에 기술되어 있다.
본 발명에서 특징화된 일부 구현예는 포스포로티오에이트 골격을 갖는 RNA 및 헤테로원자 골격을 갖는 올리고뉴클레오사이드, 그리고 특히 위에서 참조된 미국 특허번호 제5,489,677호의 --CH2--NH--CH2-, --CH2--N(CH3)--O--CH2--[메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 골격으로 공지됨], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- 및 --N(CH3)--CH2--CH2--, 및 위에서 참조된 미국 특허번호 제5,602,240호의 아미드 골격을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 특징화된 RNA는 위에서 참조된 미국 특허번호 제5,034,506호의 모르폴리노 골격 구조를 갖는다. 천연 포스포디에스테르 골격은 O-P(O)(OH)-OCH2-로 나타낼 수 있다.
변형 RNA는 또한 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 함유할 수 있다. iRNA, 예를 들어, 본원에서 특징화된 dsRNA는 2'-위치에서 하기 중 하나를 포함할 수 있다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬로, 여기서 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 치환되지 않은 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. 예시적인 적합한 변형은 O[(CH2)nO] mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2) nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2를 포함하고, 여기서, n 및 m은 1 내지 약 10이다. 다른 구현예에서, dsRNA는 2' 위치에서 하기 중 하나를 포함한다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기, 리포터기, 삽입제, iRNA의 약동학 성질을 개선시키기 위한 군, 또는 iRNA의 약력학 성질을 개선시키기 위한 군, 및 유사한 성질을 갖는 기타 치환체. 일부 구현예에서, 변형은 2'-메톡시에톡시(2'-O--CH2CH2OCH3, 또한 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로 공지됨)(문헌참조: Martin 등, Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486~504), 즉, 알콕시-알콕시기를 포함한다. 또 다른 예시적인 변형은 본원의 하기 실시예에 기술된 것과 같이 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, 2'-DMAOE로도 공지된 O(CH2)2ON(CH3)2기, 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시(당업계에 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE로도 공지됨), 즉, 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH3)2이다. 추가의 예시적인 변형은 다음을 포함한다: 5'-Me-2'-F 뉴클레오타이드, 5'-Me-2'-OMe 뉴클레오타이드, 5'-Me-2'-데옥시뉴클레오타이드(이 세 패밀리의 R 및 S 이성체 모두); 2'-알콕시알킬; 및 2'-NMA(N-메틸아세트아미드).
기타 변형은 2'-메톡시(2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시(2'-OCH2CH2CH2NH2), 2'-플루오로(2'-F)를 포함한다. 유사한 변형은 또한 iRNA의 RNA 상의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오타이드 상 또는 2'-5' 결합된 dsRNA의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오타이드의 5' 위치에서 이루어질 수 있다. iRNA는 또한 펜토푸라노실 당 대신에 시클로부틸 모이어티와 같은 당 모사체를 가질 수 있다. 이러한 변형된 당 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허번호 제4,981,957호; 제5,118,800호; 제5,319,080호; 제5,359,044호; 제5,393,878호; 제5,446,137호; 제5,466,786호; 제5,514,785호; 제5,519,134호; 제5,567,811호; 제5,576,427호; 제5,591,722호; 제5,597,909호; 제5,610,300호; 제5,627,053호; 제5,639,873호; 제5,646,265호; 제5,658,873호; 제5,670,633호; 및 제5,700,920호를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이 중 일부가 본 출원에 공통적으로 통합된다. 이전 문헌의 각각의 전문이 본원에 참조로서 통합된다.
iRNA는 또한 뉴클레오염기(종종 당업계에서 단순히 "염기"로서 지칭됨) 변형 또는 치환을 포함한다. 본원에서 사용되는 것과 같이, "변형되지 않은" 또는 "천연" 뉴클레오염기는 퓨린 염기 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 염기 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 변형 뉴클레오염기는 다른 합성 및 천연 뉴클레오염기, 예컨대 데옥시티미딘(dT), 5-메틸시토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌 및 구아닌의 기타 알킬 유도체, 2-프로필 및 아데닌 및 구아닌의 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 아날 기타 8-치환 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-다아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 추가 뉴클레오염기는 미국 특허번호 제3,687,808호에 개시된 것들, 문헌[Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008]에 개시된 것들; 문헌[The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 페이지 858~859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990]에 개시된 것들, 문헌[Englisch 등, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613]에 의해 개시된 것들, 및 문헌[Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, 페이지 289~302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993]에 의해 개시된 것들을 포함한다. 이들 뉴클레오염기 중 일부는 특히 본 발명에서 특징화된 올리고머 화합물의 결합 친화도를 증가시키는 데 유용하다. 이들은 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하는 5-치환 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 0-6 치환 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 듀플렉스 안정성을 0.6~1.2°C 증가시키는 것으로 나타났으며(문헌참조: Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276~278), 특히 더 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합될 때, 예시적인 염기 치환이다.
전술한 변형 뉴클레오염기뿐만 아니라 다른 변형 뉴클레오염기의 제조 중 일부를 교지하는 대표적인 미국 특허는 전술된 미국 특허번호 제3,687,808호, 제4,845,205호; 제5,130,30호; 제5,134,066호; 제5,175,273호; 제5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,594,121호, 제5,596,091호; 제5,614,617호; 제5,681,941호; 제5,750,692호; 제6,015,886호; 제6,147,200호; 제6,166,197호; 제6,222,025호; 제6,235,887호; 제6,380,368호; 제6,528,640호; 제6,639,062호; 제6,617,438호; 제7,045,610호; 제7,427,672호; 및 제7,495,088호를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이의 각각의 전문이 본원에 참조로서 통합된다.
본 개시내용의 iRNA 제제는 또한 하나 이상의 이환식 당 모이어티를 포함하도록 변형될 수 있다. “이환식 당”은 인접하든 인접하지 않든, 2개의 탄소의 가교에 의해 형성된 고리에 의해 변형된 후라노실 고리이다. “이환식 뉴클레오사이드”(“BNA”)는 인접하든 인접하지 않든, 당 고리의 2개의 탄소 원자의 가교에 의해 형성된 고리를 포함하는 당 모이어티를 가져 이환식 고리 시스템을 형성하는 뉴클레오사이드이다. 특정 구현예에서, 가교는 당 고리의 4’-탄소 및 2’-탄소를, 선택적으로는 2’-비환식 산소 원자를 통해 결합한다. 따라서, 일부 구현예에서, 발명의 제제는 하나 이상의 잠김 핵산(LNA)을 포함할 수 있다. 잠김 핵산은 변형 리보스 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드이고, 여기서 리보스 모이어티는 2’ 및 4’ 탄소를 결합하는 여분의 가교를 포함한다. 다시 말해, LNA는 4'-CH2-O-2' 가교를 포함하는 이환식 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오타이드이다. 본 구조는 3’-엔도 구조 형태에서 리보스를 효과적으로 “잠근다”. siRNA에 잠김 핵산을 첨가하는 것이 혈청에서 siRNA 안정성을 증가시키고 오프-표적 효과를 감소시키는 것으로 나타났다(문헌참조: Elmen, J. 등(2005) Nucleic Acids Research 33(1):439~447; Mook, OR. 등(2007) Mol Canc Ther 6(3):833~843; Grunweller, A. 등(2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185~3193). 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 사용하기 위한 이환식 뉴클레오사이드의 예는 4'와 2' 리보실 고리 원자 사이에 가교를 포함하는 뉴클레오사이드를 비제한적으로 포함한다. 특정 구현예에서, 발명의 안티센스 폴리뉴클레오타이드 제제는 4′에서 2′로의 가교를 포함하는 하나 이상의 이환식 뉴클레오사이드를 포함한다.
잠긴 뉴클레오사이드는 구조식(분리 입체화학)으로 나타낼 수 있되,
여기서 B는 뉴클레오염기 또는 변형 뉴클레오염기이고, L은 2'-탄소를 리보오스 고리의 4'-탄소에 결합하는 결합기이다. 이러한 4'에서 2'로의 가교 이환식 뉴클레오사이드의 예는 4'-(CH2)―O-2' (LNA); 4'-(CH2)―S-2'; 4'-(CH2)2―O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)―O-2' ("제한된 에틸" 또는 "cEt"로도 지칭됨) 및 4'-CH(CH2OCH3)―O-2' (및 이의 유사체; 예를 들어, 미국 특허번호 제7,399,845호를 참조함); 4'-C(CH3)(CH3)―O-2' (및 이의 유사체; 예를 들어, 미국 특허번호 제8,278,283호를 참조함); 4'-CH2―N(OCH3)-2' (및 이의 유사체; 예를 들어, 미국 특허번호 제8,278,425호를 참조함); 4'-CH2―O―N(CH3)-2' (예를 들어, 미국 공개번호 제2004/0171570호를 참조함); 4'-CH2―N(R)―O-2'로, 여기서 R은 H, C1-C12 알킬, 또는 질소 보호기(예를 들어, 미국 특허번호 제7,427,672호를 참조함); 4'-CH2―C(H)(CH3)-2' (문헌참조: 예를 들어, Chattopadhyaya 등, J. Org. Chem., 2009, 74, 118~134); 및 4'-CH2―C(-CH2)-2' (및 이의 유사체; 예를 들어, 미국 특허번호 제8,278,426호를 참조함)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이전 문헌의 각각의 전문이 본원에 참조로서 통합된다.
잠김 핵산 뉴클레오타이드의 제조를 교시하는 추가의 대표적인 미국 특허 및 미국 공보는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 미국 특허번호 제6,268,490호; 제6,525,191호; 제6,670,461호; 제6,770,748호; 제6,794,499호; 제6,998,484호; 제7,053,207호; 제7,034,133; 제7,084,125호; 제7,399,845호; 제7,427,672호; 제7,569,686호; 제7,741,457호; 제8,022,193호; 제8,030,467호; 제8,278,425호; 제8,278,426호; 제8,278,283호; 미국 특허 공개번호 제2008/0039618호; 및 미국 특허 공개번호 제2009/0012281호로, 이의 각각의 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
예를 들어 α-L-리보푸라노스 및 β-D-리보푸라노스를 포함하는 하나 이상의 입체화학적 당 구성을 갖는 임의의 전술한 이환식 뉴클레오시드를 제조할 수 있다(국제특허번호 제99/14226호를 참조함).
iRNA의 RNA는 또한 하나 이상의 제한된 에틸 뉴클레오타이드를 포함하도록 변형될 수 있다. 본원에 사용된 것과 같이, "구속된 에틸 뉴클레오타이드" 또는 "cEt"는 4'-CH(CH3)-O-2' 가교를 포함하는 이환식 당 모이어티를 포함하는 잠김 핵산이다(즉, L은 전술한 구조식에 있음). 일 구현예에서, 구속된 에틸 뉴클레오타이드는 본원에서 "S-cEt"로 지칭되는 S 형태로 있다.
발명의 iRNA는 또한 하나 이상의 "형태적으로 제한된 뉴클레오타이드"("CRN")를 포함할 수 있다. CRN은 리보스의 C2' 및 C4' 탄소 또는 리보스의 C3 및 -C5' 탄소를 결합하는 링커를 갖는 뉴클레오타이드 유사체이다. CRN은 리보스 환을 안정한 형태로 잠그고 mRNA에 대한 혼성화 친화성을 증가시킨다. 링커는 안정성과 친화성을 위한 최적의 위치에 산소를 배치하여 리보스 고리 퍼커링을 감소시키기에 충분한 길이이다.
전술된 CRN의 특정 제조를 교시하는 대표적인 공개 공보는 미국 공개번호 제2013/0190383호; 및 PCT 공개 공보 국제번호 제2013/036868호를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 이들 각각의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
일부 구현예에서, 발명의 iRNA는 UNA(잠김 해제된 핵산) 뉴클레오타이드인 하나 이상의 단량체를 포함한다. UNA는 잠김 해제된 비환형 핵산이고, 여기서 당의 임의의 결합은 제거되었고 잠김 해제된 "당" 잔기를 형성한다. 일 예에서, UNA는 또한 C1'-C4' 사이의 결합(즉, C1'과 C4' 탄소 사이의 공유 탄소-산소-탄소 결합)이 제거된 단량체를 포괄한다. 또 다른 예에서, 당의 C2'-C3' 결합(즉, C2'와 C3' 탄소 사이의 공유 탄소-탄소 결합)이 제거되었다(문헌참조: Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133~134 (2008) 및 Fluiter 등, Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039, 참조로서 본원에 통합됨).
UNA의 제조를 교시하는 대표적인 미국 공개 공보는 미국 특허번호 제8,314,227호; 및 미국 특허 공개번호 제2013/0096289호; 제2013/0011922호; 및 제2011/0313020호를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이의 각각의 전문이 본원에 참조로서 통합된다.
RNA 분자의 말단에 대한 잠재적인 안정화 변형은 N-(아세틸아미노카프로일)-4-하이드록시프롤리놀(Hyp-C6-NHAc), N-(카프로일-4-하이드록시프롤리놀(Hyp-C6), N-(아세틸-4-하이드록시프롤리놀(Hyp-NHAc), 티미딘-2'-O-데옥시티미딘(에테르), N-(아미노카프로일)-4-하이드록시프롤리놀(Hyp-C6-아미노), 2-도코사노일-우리딘-3'-포스페이트, 역 2'-데옥시-변형 리보뉴클레오타이드, 예컨대 역 dT(idT), 역 dA(idA), 및 역 무염기성 2'-데옥시리보뉴클레오타이드(iAb) 및 기타를 포함할 수 있다. 이 변형의 개시내용은 국제특허번호 제2011/005861호에서 찾을 수 있다.
일 실시예에서, 올리고뉴클레오타이드의 3' 또는 5' 말단 말단은 역 dT(idT), 역 dA(idA), 또는 역 무염기성 2'-데옥시리보뉴클레오타이드(iAb)와 같은 역 2'-데옥시-변형 리보뉴클레오타이드에 결합된다. 일 특정예에서, 역 2'-데옥시-변형 리보뉴클레오타이드는 본원에 기술된 센스 가닥의 3' 말단과 같은 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 결합되고, 여기서 결합은 3'-3' 포스포디에스테르 결합 또는 3'-3'-포스포로티오에이트 결합을 통해 이루어진다.
또 다른 실시예에서, 센스 가닥의 3' 말단은 3'-3'-포스포로티오에이트 결합을 통해 역 무염기성 리보뉴클레오타이드(iAb)에 결합된다. 또 다른 실시예에서, 센스 가닥의 3' 말단은 3'-3'-포스포로티오에이트 결합을 통해 역 dA(idA)에 결합된다.
일 특정예에서, 역 2'-데옥시-변형 리보뉴클레오타이드는 본원에 기술된 센스 가닥의 3' 말단과 같은 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 결합되고, 여기서 결합은 3'-3' 포스포디에스테르 결합 또는 3'-3'-포스포로티오에이트 결합을 통해 이루어진다.
또 다른 실시예에서, 센스 가닥의 3'-말단 뉴클레오타이드는 역 dA(idA)이고, 3'-3'-결합(예를 들어, 3'-3'-포스포로티오에이트 결합)을 통해 선행 뉴클레오타이드에 결합된다.
본 발명의 iRNA의 뉴클레오타이드의 기타 변형은 iRNA의 안티센스 가닥 상의 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 모방체, 예를 들어, 5'-말단 포스페이트 또는 포스페이트 모방체를 포함한다. 적합한 포스페이트 모방체는, 예를 들어, 미국 특허 공개번호 제2012/0157511호에 개시되어 있고, 이의 전문이 본원에 참조로서 통합된다.
A. 본 발명의 모티프를 포함하는 변형 iRNA
본 발명의 특정 양태에서, 본 발명의 이중 가닥 RNA 제제는, 예를 들어, 이의 각각의 전문이 본원에 참조로서 통합된 WO2013/075035에 개시된 것과 같은 화학적 변형을 갖는 제제를 포함한다. 본 명세서 및 WO2013/075035에서 알 수 있듯이, 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형 중 하나 이상의 모티프는 특히 절단 부위에서 또는 이의 부근에서 dsRNAi 제제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥으로 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, dsRNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 다르게는 완전히 변형될 수 있다. 이들 모티프의 도입은 경우에 따라 센스 또는 안티센스 가닥의 변형 패턴을 방해한다. dsRNAi 제제는 선택적으로 친유성 리간드, 예를 들어, 센스 가닥 상의 GalNAc 유도체 리간드와 접합될 수 있다.
보다 구체적으로, 이중 가닥 RNA 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에서 3개의 동일한 변형 중 하나 이상의 모티프를 dsRNAi 제제의 적어도 하나의 가닥의 절단 부위에서 또는 그 부근에서 갖도록 완전히 변형될 때, dsRNAi 제제의 유전자 침묵 활성이 관찰되었다.
따라서, 본 발명은 표적 유전자(즉, KHK 유전자)의 발현을 생체내 억제할 수 있는 이중 가닥 RNA 제제를 제공한다. RNAi 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. RNAi 제제의 각각의 가닥은, 예를 들어, 길이가 17~30개 뉴클레오타이드, 길이가 25~30개 뉴클레오타이드, 길이가 27~30개 뉴클레오타이드, 길이가 19~25개 뉴클레오타이드, 길이가 19~23개 뉴클레오타이드, 길이가 19~21개 뉴클레오타이드, 길이가 21~25개 뉴클레오타이드, 또는 길이가 21~23개 뉴클레오타이드일 수 있다.
센스 가닥 및 안티센스 가닥은 통상적으로 듀플렉스 이중 가닥 RNA("dsRNA")를 형성하며, 이는 본원에서 "dsRNAi 제제"로서도 지칭된다. dsRNAi 제제의 듀플렉스 영역은, 예를 들어, 길이가 27~30개 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 19~25개 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 19~23개 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 19~21개 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 21~25개 뉴클레오타이드 쌍, 또는 길이가 21~23개 뉴클레오타이드 쌍일 수 있다. 또 다른 예에서, 듀플렉스 영역은 길이가 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 및 27개 뉴클레오타이드로부터 선택된다.
특정 구현예에서, dsRNAi 제제는 하나 또는 둘 모두의 가닥의 3'-말단, 5'-말단, 또는 둘 모두의 말단에서 하나 이상의 오버행 영역 또는 캡핑 군을 함유할 수 있다. 오버행은 독립적으로 길이가 1~6개 뉴클레오타이드, 예를 들어, 길이가 2~6개 뉴클레오타이드, 길이가 1~5개 뉴클레오타이드, 길이가 2~5개 뉴클레오타이드, 길이가 1~4개 뉴클레오타이드, 길이가 2~4개 뉴클레오타이드, 길이가 1~3개 뉴클레오타이드, 길이가 2~3개 뉴클레오타이드, 또는 길이가 1~2개 뉴클레오타이드일 수 있다. 특정 구현예에서, 오버행 영역은 위에서 제공된 것과 같이 연장된 오버행 영역을 포함할 수 있다. 오버행은 한 가닥이 다른 가닥보다 길거나 동일한 길이의 두 가닥이 엇갈려서 생긴 결과일 수 있다. 오버행은 표적 mRNA와 미스매치를 형성할 수 있거나 이것은 표적화된 유전자 서열에 상보적일 수 있거나 또 다른 서열일 수 있다. 제1 및 제2 가닥은 또한, 예를 들어, 추가 염기에 의해 결합되어 헤어핀을 형성하거나, 다른 비염기 링커에 의해 결합될 수 있다.
특정 구현예에서, dsRNAi 제제의 오버행 영역에서의 뉴클레오타이드는 각각 독립적으로 2'-당 변형된 것, 예컨대 2'-F, 2'-O-메틸, 티미딘(T), 2`-O-메톡시에틸-5-메틸우리딘(Teo), 2`-O-메톡시에틸아데노신(Aeo), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸시티딘(m5Ceo), 및 이의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 변형된 또는 변형되지 않은 뉴클레오타이드일 수 있다.
예를 들어, TT는 어느 한 가닥의 어느 한 말단에 대해 오버행 서열일 수 있 다. 오버행은 표적 mRNA와 미스매치를 형성할 수 있거나 이것은 표적화된 유전자 서열에 상보적일 수 있거나 또 다른 서열일 수 있다.
dsRNAi 제제의 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 가닥 둘 모두에서 5'- 또는 3'- 오버행은 인산화될 수 있다. 일부 구현예에서, 오버행 영역(들)은 2개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트를 갖는 2개의 뉴클레오타이드를 함유하고, 여기서 2개의 뉴클레오타이드는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 오버행은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 둘 모두의 가닥의 3'-말단에 존재한다. 일부 구현예에서, 이 3'-오버행은 안티센스 가닥에 존재한다. 일부 구현예에서, 이 3'-오버행은 센스 가닥에 존재한다.
dsRNAi 제제는 그 전체 안정성에 영향을 미치지 않으면서 RNAi의 간섭 활성을 강화할 수 있는 단일 오버행만을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 가닥 오버행은 센스 가닥의 3'-말단 또는, 대안적으로 안티센스 가닥의 3'-말단에 위치할 수 있다. RNAi는 또한 안티센스 가닥의 5'-말단(또는 센스 가닥의 3'-말단) 또는 그 반대에 위치한 둔화 말단을 가질 수 있다. 일반적으로, dsRNAi 제제의 안티센스 가닥은 3'-말단에서 뉴클레오타이드 오버행을 갖고, 5'-말단은 둔화 말단이다. 이론에 의해 국한되고자 하는 것 없이, 안티센스 가닥의 5'-말단 및 안티센스 가닥의 3'-말단 오버행에서의 비대칭 둔화 말단은 RISC 공정으로 로딩되는 가이드 가닥을 선호한다.
특정 구현예에서, dsRNAi 제제는 길이가 19개의 뉴클레오타이드인 이중 둔화-말단이고, 여기서 센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 7, 8 및 9에 있는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-F 변형 중 적어도 하나의 모티프를 포함한다. 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 및 13에 있는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-O-메틸 변형 중 적어도 하나의 모티프를 포함한다.
또 다른 구현예에서, dsRNAi 제제는 길이가 20개의 뉴클레오타이드인 이중 둔화-말단이고, 여기서 센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 8, 9, 및 10에 있는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-F 변형 중 적어도 하나의 모티프를 포함한다. 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 및 13에 있는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-O-메틸 변형 중 적어도 하나의 모티프를 포함한다.
또 다른 구현예에서, dsRNAi 제제는 길이가 21개의 뉴클레오타이드인 이중 둔화-말단이고, 여기서 센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 9, 10 및 11에 있는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-F 변형 중 적어도 하나의 모티프를 포함한다. 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 및 13에 있는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-O-메틸 변형 중 적어도 하나의 모티프를 포함한다.
특정 구현예에서, dsRNAi 제제는 21개 뉴클레오타이드 센스 가닥 및 23개 뉴클레오타이드 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 9, 10 및 11에 있는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-F 변형 중 적어도 하나의 모티프를 포함하고; 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 11, 12 및 13에 있는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-O-메틸 변형 중 적어도 하나의 모티프를 포함하고, RNAi 제제의 하나의 말단은 둔화 말단인 한편, 다른 말단은 2개의 뉴클레오타이드 오버행을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 뉴클레오타이드 오버행은 안티센스 가닥의 3’-말단에 존재한다.
2개의 뉴클레오타이드 오버행이 안티센스 가닥의 3’-말단에 존재하는 경우, 말단 3개의 뉴클레오타이드 사이에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합이 있을 수 있고, 여기서 3개의 뉴클레오타이드 중 2개는 오버행 뉴클레오타이드이고, 3번째 뉴클레오타이드는 오버행 뉴클레오타이드 옆에 쌍을 형성한 뉴클레오타이드이다. 일 구현예에서, RNAi 제제는 추가적으로 센스 가닥의 5’-말단 및 안티센스 가닥의 5’-말단 둘 모두에서 말단 3개의 뉴클레오타이드 사이에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 갖는다. 특정 구현예에서, 모티프의 일부인 뉴클레오타이드를 포함하는 dsRNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이다. 특정 구현예에서, 각각의 잔기는 독립적으로, 예를 들어, 교호(alternating) 모티프에서 2’-O-메틸 또는 2’-플루오로로 변형된다. 선택적으로, dsRNAi 제제는 리간드(예컨대, GalNAc3)를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, dsRNAi 제제는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 길이가 25~30개의 뉴클레오타이드 잔기이고, 5' 말단 뉴클레오타이드(위치 1)에서 시작하여 제1 가닥의 위치 1 내지 23은 적어도 8개의 리보뉴클레오타이드를 포함하고; 안티센스 가닥은 길이가 36~66개의 뉴클레오타이드 잔기이고, 3' 말단 뉴클레오타이드에서 시작하여 센스 가닥의 위치 1~23과 쌍을 형성하는 위치에 적어도 8개의 리보뉴클레오타이드를 포함하여 듀플렉스를 형성하고; 안티센스 가닥의 적어도 3' 말단 뉴클레오타이드는 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않고, 최대 6개의 연속 3' 말단 뉴클레오타이드는 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않아 1~6개 뉴클레오타이드의 3' 단일 가닥 오버행을 형성하고; 안티센스 가닥의 5' 말단은 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않는 10~30개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하여, 10~30개의 뉴클레오타이드 단일 가닥 5’ 오버행을 형성하고; 적어도 센스 가닥 5’ 말단 및 3’ 말단 뉴클레오타이드는 센스 및 안티센스 가닥이 최대 상보성을 위해 정렬되는 경우 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성하여, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 실질적으로 듀플렉스된 영역을 형성하고; 안티센스 가닥은 이중 가닥 핵산이 포유류 세포 내로 도입되는 경우 표적 유전자 발현을 감소시키기 위해 안티센스 가닥 길이의 적어도 19개의 리보뉴클레오타이드를 따라 표적 RNA에 충분히 상보적이고; 센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2’-F 변형 중 적어도 하나의 모티프를 포함하며, 여기서 모티프 중 적어도 하나는 절단 부위에서 또는 그 부근에서 일어난다. 안티센스 가닥은 절단 부위에 또는 그 부근에 있는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함한다.
특정 구현예에서, dsRNAi 제제는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 dsRNAi 제제는 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 13에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프와 적어도 25 내지 최대 29개 뉴클레오타이드인 길이를 갖는 제1 가닥 및 최대 30개 뉴클레오타이드인 길이를 갖는 제2 가닥을 포함하고; 제1 가닥의 3' 말단 및 제2 가닥의 5' 말단은 둔화 말단을 형성하고 제2 가닥은 제1 가닥보다 이의 3' 말단에서 1~4개 뉴클레오타이드 더 길고, 듀플렉스 영역은 길이가 적어도 25개 뉴클레오타이드이고, 제2 가닥은 RNAi 제제가 포유동물 세포 내로 도입될 때 표적 유전자 발현을 감소시키기 위해 제2 가닥 길이의 적어도 19개 뉴클레오타이드를 따라 표적 mRNA에 충분히 상보적이고, dsRNAi 제제의 다이서 절단이 제2 가닥의 3'-말단을 포함하는 siRNA를 생성하여 포유류에서 표적 유전자의 발현을 감소시킨다. 선택적으로로, dsRNAi 제제는 추가로 리간드를 포함한다.
특정 구현예에서, dsRNAi 제제의 센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에서 3개의 동일한 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함하고, 여기서 모티프 중 하나는 센스 가닥 내 절단 부위에서 일어난다.
특정 구현예에서, dsRNAi 제제의 안티센스 가닥은 또한 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함하고, 여기서 모티프 중 하나는 안티센스 가닥 내 절단 부위에 또는 그 부근에서 일어난다.
길이가 19~23개의 뉴클레오타이드인 듀플렉스 영역을 갖는 dsRNAi 제제의 경우, 안티센스 가닥의 절단 부위는 통상적으로 5'-말단으로부터 10, 11 및 12 위치 주변에 존재한다. 따라서 3개의 동일한 변형의 모티프는 안티센스 가닥의 9, 10, 및 11 위치; 10, 11, 및 12 위치; 11, 12, 및 13 위치; 12, 13, 및 14 위치; 또는 13, 14, 및 15 위치에서 일어날 수 있고, 계수는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오타이드에서 시작하거나, 계수는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내 첫 번째 쌍을 형성한 뉴클레오타이드에서 시작한다. 안티센스 가닥 내 절단 부위는 또한 5’-말단으로부터 dsRNAi 제제의 듀플렉스 영역의 길이에 따라 변화할 수 있다.
RNAi 제제의 센스 가닥은 가닥의 절단 부위에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함할 수 있고; 안티센스 가닥은 가닥의 절단 부위에서 또는 그 부근에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형의 적어도 하나의 모티프를 가질 수 있다. 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 dsRNA 듀플렉스를 형성할 때, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 센스 가닥 상의 3개의 뉴클레오타이드 중 하나의 모티프와 안티센스 가닥 상의 3개의 뉴클레오타이드 중 하나의 모티프가 적어도 하나의 뉴클레오타이드 중복을 갖도록 정렬될 수 있고, 즉, 센스 가닥 내 모티프의 3개의 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 안티센스 가닥 내 모티프의 3개의 뉴클레오타이드 중 적어도 하나와 염기쌍을 형성한다. 대안적으로, 적어도 2개의 뉴클레오타이드는 중복될 수 있거나, 모든 3개의 뉴클레오타이드는 중복될 수 있다.
일부 구현예에서, dsRNAi 제제의 센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형의 하나 초과의 모티프를 포함할 수 있다. 제1 모티프는 가닥의 절단 부위에 또는 그 부근에 존재할 수 있고, 다른 모티프는 윙(wing) 변형일 수 있다. 본원에서 용어 "윙 변형"은 동일한 가닥의 절단 부위에 또는 그 부근에 모티프로부터 분리된 가닥의 또 다른 부분에 존재하는 모티프를 지칭한다. 윙 변형은 첫 번째 모티프에 인접하거나 적어도 하나 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리된다. 모티프가 서로 바로 인접해 있는 경우, 모티프의 화학적 작용은 서로 구별되며, 모티프가 하나 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리되어 있는 경우, 화학적 작용은 동일하거나 상이할 수 있다. 2개 이상의 윙 변형이 존재할 수 있다. 예를 들어, 2개의 윙 변형이 존재하는 경우, 각각의 윙 변형은 절단 부위에 또는 그 부근에 있는 첫 번째 모티프에 대해 하나의 말단에 존재하거나 리드(lead) 모티프의 어느 한 측면 상에 존재한다.
센스 가닥과 마찬가지로, dsRNAi 제제의 안티센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형 중 하나 초과의 모티프를 포함할 수 있으며, 모티프 중 적어도 하나는 가닥의 절단 부위에서 또는 그 부근에서 발생한다. 이러한 안티센스 가닥은 또한 센스 가닥 상에 존재할 수 있는 윙 변형과 유사한 정렬로 하나 이상의 윙 변형을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, dsRNAi 제제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의윙 변형은 통상적으로 가닥의 3'-말단, 5'-말단, 또는 양 말단에 첫 번째 하나 또는 두 개의 말단 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
다른 구현예에서, dsRNAi 제제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 윙 변형은 통상적으로 가닥의 3'-말단, 5'-말단, 또는 양 말단에서 듀플렉스 영역 내에 첫 번째 하나 또는 두 개의 쌍을 형성하는 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
dsRNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 적어도 하나의 윙 변형을 포함하는 경우, 윙 변형은 듀플렉스 영역의 동일한 말단 상에 있을 수 있고, 1, 2 또는 3개 뉴클레오타이드의 중첩을 가질 수 있다.
dsRNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 적어도 2개의 윙 변형을 포함하는 경우, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 정렬되어 하나의 가닥에서 각각 두 개의 변형이 1, 2 또는 3개 뉴클레오타이드의 중첩을 갖는 듀플렉스 영역의 하나의 말단 상에 있고; 하나의 가닥에서 각각 두 개의 변형이 1, 2 또는 3개 뉴클레오타이드의 중첩을 갖는 듀플렉스 영역의 다른 말단 상에 있고; 하나의 가닥에서 두 개의 변형이 리드 모티프의 양측 상에 있으며, 듀플렉스 영역에 1, 2 또는 3개 뉴클레오타이드의 중첩을 갖는다.
일부 구현예에서, 모티프의 일부인 뉴클레오타이드를 포함하는 dsRNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 변형될 수 있다. 각각의 뉴클레오타이드는 동일하거나 상이한 변형으로 변형될 수 있으며, 이는 비-결합 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 모두 또는 결합 포스페이트 산소 중 하나 이상의 하나 이상의 변경; 리보스 당의 성분, 예를 들어, 리보스 당의 2' 하이드록실의 변경; 포스페이트 모이어티를 "데포스포" 링커로 대량 대체; 천연 발생 염기의 변형 또는 대체; 및 리보스-포스페이트 골격의 대체 또는 변형을 포함할 수 있다.
핵산은 서브유닛의 중합체이므로, 많은 변형, 예를 들어, 염기, 또는 포스페이트 모이어티의 변형, 또는 포스페이트 모이어티의 비-결합 O가 핵산 내에서 반복되는 위치에서 발생한다. 일부 경우에, 변형은 핵산 내의 모든 대상체 위치에서 발생하지만, 많은 경우에 그렇지 않을 것이다. 예를 들어, 변형은 3'- 또는 5' 말단 위치에서만 발생할 수 있고, 말단 영역 내, 예를 들어, 말단 뉴클레오타이드 상의 위치에서 또는 가닥의 마지막 2, 3, 4, 5, 또는 10개 뉴클레오타이드에서만 발생할 수 있다. 변형은 이중 가닥 영역, 단일 가닥 영역 또는 둘 모두에서 발생할 수 있다. 변형은 RNA의 이중 가닥 영역에서만 발생할 수 있거나 RNA의 단일 가닥 영역에서만 발생할 수 있다. 예를 들어, 비-결합 O 위치에서의 포스포로티오에이트 변형은 한쪽 또는 양쪽 말단에서만 발생할 수 있고, 말단 영역 내, 예를 들어, 말단 뉴클레오타이드 상의 위치에서 또는 가닥의 마지막 2, 3, 4, 5, 또는 10개 뉴클레오타이드에서만 발생할 수 있거나, 이중 가닥 및 단일 가닥 영역, 특히 말단에서 발생할 수 있다. 5'- 말단 또는 말단들은 인산화될 수 있다.
예를 들어, 안정성을 향상시키거나, 오버행에 특정 염기를 포함하거나, 변형 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 대리물을 단일 가닥 오버행에, 예를 들어, 5'- 또는 3'-오버행에, 또는 둘 모두에 포함하는 것이 가능할 수 있다. 예를 들어, 오버행에 퓨린 뉴클레오타이드를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, 3'- 또는 5'-오버행의 염기 모두 또는 일부는, 예를 들어, 본원에 기술된 변형으로 변형될 수 있다. 변형은, 예를 들어, 당업계에 공지된 변형을 갖는 리보스 당의 2' 위치에서의 변형의 사용, 예를 들어, 데옥시리보뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'-플루오로(2'-F) 또는 뉴클레오염기의 리보당 대신 변형된 2'-O-메틸의 사용, 및 포스페이트기에서의 변형, 예를 들어, 포스포로티오에이트 변형의 사용을 포함할 수 있다. 오버행은 표적 서열과 상동성일 필요는 없다.
일부 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 잔기는 LNA, CRN, cET, UNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-데옥시, 2'-하이드록실, 또는 2'-플루오로로 독립적으로 변형된다. 가닥은 하나 초과의 변형을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 잔기는 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로로 독립적으로 변형된다.
적어도 2개의 상이한 변형은 통상적으로 센스 가닥 및 안티센스 가닥 상에 존재한다. 그러한 2개의 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형, 또는 기타일 수 있다.
특정 구현예에서, Na 또는 Nb는 교호 패턴의 변형을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "교호 모티프"는 하나 이상의 변형을 갖는 모티프를 지칭하며, 각각의 변형은 한 가닥의 교호 뉴클레오타이드 상에서 발생한다. 교호 뉴클레오타이드는 하나 걸러 뉴클레오타이드 당 하나 또는 3개 뉴클레오타이드 당 하나 또는 유사한 패턴을 지칭할 수 있다. 예를 들어, A, B 및 C 각각이 뉴클레오타이드에 대한 한 가지 유형의 변형을 나타내는 경우, 교호 모티프는 “ABABABABABAB…,” “AABBAABBAABB…,” “AABAABAABAAB…,” “AAABAAABAAAB…,” “AAABBBAAABBB…,” 또는 “ABCABCABCABC…,” 등일 수 있다.
교호 모티프에 포함된 변형의 유형은 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, A, B, C, D 각각이 뉴클레오타이드 상에 한 가지 유형의 변형을 나타내는 경우, 교호 패턴, 즉, 다른 모든 뉴클레오타이드 상의 변형은 동일할 수 있지만, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 각각은 “ABABAB…”, “ACACAC…” “BDBDBD…” 또는 “CDCDCD…,” 등과 같은 교호 모티프 내 변형 중 몇 가지 가능성으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 발명의 dsRNAi 제제는 전환한 안티센스 가닥 상의 교호 모티프에 대한 변형 패턴에 비해 센스 가닥 상의 교호 모티프에 대한 변형 패턴을 포함한다. 전환(shift)은 센스 가닥의 뉴클레오타이드의 변형 군이 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드의 상이하게 변형된 군에 상응하도록 할 수 있고 그 반대의 경우도 마찬가지일 수 있다. 예를 들어, 센스 가닥이 dsRNA 듀플렉스 내 안티센스 가닥과 쌍을 형성하는 경우, 센스 가닥 내 교호 모티프는 가닥의 5’에서 3'로 "ABABAB"로 시작할 수 있고, 안티센스 가닥 내 교호 모티프는 듀플렉스 영역 내 가닥의 5’에서 3'로 "BABABA"로 시작할 수 있다. 또 다른 예로서, 센스 가닥 내 교호 모티프는 가닥의 5’에서 3’로 “AABBAABB”로 시작할 수 있고, 안티센스 가닥 내 교호 모티프는 듀플렉스 영역 내 가닥의 5’에서 3’로 “BBAABBAA”로 시작할 수 있어 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이 변형 패턴의 완전하거나 부분적인 전환이 있다.
하나의 특정 예에서, 센스 가닥 내 교호 모티프는 가닥의 5’에서 3’로 “ABABAB”이며, 여기서 각각의 A는 미변형 리보뉴클레오타이드이고 각각의 B는 2’-O메틸 변형 뉴클레오타이드이다.
하나의 특정 예에서, 센스 가닥 내 교호 모티프는 가닥의 5'에서 3'로 "ABABAB"이며, 여기서 각각의 A는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드이고, 각각의 B는 2'-O메틸 변형 뉴클레오타이드이다.
또 다른 특정 예에서, 안티센스 가닥 내 교호 모티프는 가닥의 3'에서 5'로 "BABABA"이며, 여기서 각각의 A는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드이고, 각각의 B는 2'-O메틸 변형 뉴클레오타이드이다.
하나의 특정 예에서, 센스 가닥 내 교호 모티프는 가닥의 5'에서 3'로 "ABABAB"이고, 안티센스 가닥 내 교호 모티프는 가닥의 3'에서 5'로 "BABABA"이며, 여기서 각각의 A는 미변형 리보뉴클레오타이드이고, 각각의 B는 2'-O메틸 변형 뉴클레오타이드이다.
하나의 특정 예에서, 센스 가닥 내 교호 모티프는 가닥의 5'에서 3'로 "ABABAB"이고, 안티센스 가닥 내 교호 모티프는 가닥의 3'에서 5'로 "BABABA"이며, 여기서 각각의 A는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드이고, 각각의 B는 2'-O메틸 변형 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, dsRNAi 제제는 2'-O-메틸 변형의 교호 모티프의 패턴을 포함하고 센스 가닥 상의 2'-F 변형은 초기에 안티센스 가닥 상의 2'-O-메틸 변형 및 2'-F 변형의 교호 모티프의 패턴에 대한 전환을 초기에 가지며, 즉, 센스 가닥 상의 2'-O-메틸 변형 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥 상의 2'-F 변형 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성하고, 그 반대도 마찬가지이다. 센스 가닥의 1 위치는 2'-F 변형으로 시작할 수 있고, 안티센스 가닥의 1 위치는 2'-O-메틸 변형으로 시작할 수 있다.
센스 가닥 또는 안티센스 가닥에 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형의 하나 이상의 모티프를 도입하는 것은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에 존재하는 초기 변형 패턴을 방해한다. 센스 또는 안티센스 가닥에 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형의 하나 이상의 모티프를 도입함으로써 센스 또는 안티센스 가닥의 변형 패턴의 이러한 방해는 표적 유전자에 대한 유전자 침묵 활성을 향상시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형의 모티프가 임의의 가닥에 도입될 때, 모티프 옆의 뉴클레오타이드의 변형은 모티프의 변형과 상이한 변형이다. 예를 들어, 모티프를 포함하는 서열의 부분은 "...NaYYYNb..."이며, 여기서 "Y"는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형의 모티프의 변형을 나타내고, "Na" 및 "Nb"는 Y의 변형과 상이한 모티프 "YYY" 옆의 뉴클레오타이드에 대한 변형을 나타내며, 여기서 Na 및 Nb는 동일하거나 상이한 변형일 수 있다. 대안적으로, 윙 변형이 존재할 때 Na 또는 Nb가 존재하거나 부재할 있다.
iRNA는 추가로 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함할 수 있다. 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형은 가닥의 임의의 위치의 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 두 가닥 모두의 임의의 뉴클레오타이드 상에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 간 연결 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 모든 뉴클레오타이드에서 발생할 수 있고; 각각의 뉴클레오타이드 간 연결 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 교호 패턴으로 발생할 수 있고; 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 교호 패턴으로 뉴클레오타이드 간 연결 변형 둘 모두를 포함할 수 있다. 센스 가닥 상의 뉴클레오타이드 간 연결 변형의 교호 패턴은 안티센스 가닥과 동일하거나 상이할 수 있고, 센스 가닥 상의 뉴클레오타이드 간 연결 변형의 교호 패턴은 안티센스 가닥 상의 뉴클레오타이드 간 연결 변형의 교호 패턴에 상대적인 전환을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 이중-가닥 RNAi 제제는 6-8개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다. 일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 5'-말단에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함하고 3'-말단에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함하고, 센스 가닥은 5'-말단 또는 3'-말단에서 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 포함한다.
일부 구현예에서, dsRNAi 제제는 오버행 영역에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형을 포함한다. 예를 들어, 오버행 영역은 2개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결을 갖는 2개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 간 연결 변형은 또한 오버행 뉴클레오타이드를 듀플렉스 영역 내의 말단 쌍을 형성하는 뉴클레오타이드와 연결하기 위해 만들어질 수 있다. 예를 들어, 적어도 2, 3, 4개, 또는 모든 오버행 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결을 통해 연결될 수 있고, 선택적으로, 오버행 뉴클레오타이드를 오버행 뉴클레오타이드 옆에 있는 쌍을 형성하는 뉴클레오타이드와 연결하는 추가의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 연결이 있을 수 있다. 예를 들어, 말단 3개의 뉴클레오타이드 사이에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결이 있을 수 있고, 여기서 3개의 뉴클레오타이드 중 2개는 오버행 뉴클레오타이드이고, 세 번째는 오버행 뉴클레오타이드 옆의 쌍을 형성하는 뉴클레오타이드이다. 이들 말단 3개의 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 3'-말단, 센스 가닥의 3'-말단, 안티센스 가닥의 5'-말단, 또는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있을 수 있다.
일부 구현예에서, 2개 뉴클레오타이드 오버행이 안티센스 가닥의 3'-말단에 있고, 말단 3개의 뉴클레오타이드 사이의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결이 있을 수 있고, 여기서 3개의 뉴클레오타이드 중 2개는 오버행 뉴클레오타이드이고, 3번째 뉴클레오타이드는 오버행 뉴클레오타이드 옆에 쌍을 형성하는 뉴클레오타이드이다. 선택적으로, dsRNAi 제제는 추가로 센스 가닥의 5'-말단 및 안티센스 가닥의 5'-말단 둘 모두에서 말단 3개의 뉴클레오타이드 사이에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결을 갖는다.
일 구현예에서, dsRNAi 제제는 듀플렉스 내에서 표적과 미스매치(들), 또는 이들의 조합을 포함한다. 미스매치는 오버행 영역 또는 듀플렉스 영역에서 발생할 수 있다. 염기쌍은 해리 또는 용융을 촉진하는 경향에 따라 순위가 매겨질 수 있다(예를 들어, 특정 쌍형성의 결합 또는 해리의 자유 에너지에 따라 가장 간단한 접근법은 개별 쌍을 기준으로 쌍을 검사하는 것이지만, 다음 이웃 또는 유사한 분석이 사용될 수도 있다). 해리를 촉진시키는 측면에서: A:U는 G:C 보다 바람직하고; G:U는 G:C 보다 바람직하고; I:C는 G:C 보다 바람직하다(I=이노신). 미스매치, 예를 들어, 비-카노니칼 또는 카노니칼 이외의 쌍형성(본원의 다른 곳에 기술된 것과 같이)은 카노니칼(A:T, A:U, G:C) 쌍형성 보다 바람직하고; 범용 염기를 포함하는 쌍형성은 카노니칼 쌍형성보다 바람직하다.
특정 구현예에서, dsRNAi 제제는 듀플렉스의 5'-말단에서 안티센스 가닥의 해리를 촉진하기 위해, 하기를 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택된 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내에서 처음 1, 2, 3, 4, 또는 5개 염기쌍 중 적어도 하나를 포함한다: A:U, G:U, I:C, 및 미스매치쌍, 예를 들어, 비-카노니칼 또는 카노니칼쌍 이외의 것 또는 범용 염기를 포함하는 쌍.
특정 구현예에서, 안티센스 가닥 내 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 1 위치에 있는 뉴클레오타이드는 A, dA, dU, U, 및 dT로부터 선택된다. 대안적으로, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 처음 1, 2, 또는 3개 염기쌍 중 적어도 하나는 AU 염기쌍이다. 예를 들어, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 처음 염기쌍은 AU 염기쌍이다.
또 다른 구현예에서, 센스 가닥의 3'-말단에서의 뉴클레오타이드는 데옥시티미딘(dT)이거나 안티센스 가닥의 3'-말단에서의 뉴클레오타이드는 데옥시티미딘(dT)이다. 예를 들어, 데옥시티미딘 뉴클레오타이드의 짧은 서열, 예를 들어, 센스, 안티센스, 또는 두 가닥 모두의 3'-말단 상의 2개의 dT 뉴클레오타이드가 있다.
특정 구현예에서, 센스 가닥 서열은 화학식 I로 나타낼 수 있다:
5' np-Na-(X X X )i-Nb-Y Y Y -Nb-(Z Z Z )j-Na-nq 3' (I)
여기서:
i 및 j는 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p 및 q는 각각 독립적으로 0~6이고;
각각의 Na는 독립적으로 0~25개 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형 뉴클레오타이드를 포함하고;
각각의 Nb는 독립적으로 0~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
각각의 np 및 nq는 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
여기서 Nb 및 Y는 동일한 변형을 갖지 않고;
XXX, YYY, 및 ZZZ 각각은 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형의 하나의 모티프를 나타낸다. 일부 구현예에서, YYY는 모두 2'-F 변형된 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, Na 또는 Nb는 교호 패턴의 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, YYY 모티프는 센스 가닥의 절단 부위에 또는 이의 부근에서 존재한다. 예를 들어, dsRNAi 제제가 길이가 17~23개의 뉴클레오타이드인 듀플렉스 영역을 갖는 경우, YYY 모티프는 센스 가닥의 절단 부위에서 또는 그 부근에서 존재할 수 있고(예를 들어, 위치 6, 7, 8; 7, 8, 9; 8, 9, 10; 9, 10, 11; 10, 11, 12; 또는 11, 12, 13), 계수는 제1 뉴클레오타이드로부터, 5'-말단으로부터 시작하거나; 선택적으로, 계수는 듀플렉스 영역 내 제1 쌍을 형성한 뉴클레오타이드에서 5'-말단으로부터 시작한다.
일 구현예에서, i는 1이고 j는 0이거나, i는 0이고 j는 1이거나, i 및 j 둘 모두는 1이다. 센스 가닥은 따라서 하기의 화학식으로 나타낼 수 있다:
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ib);
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ic); 또는
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Id).
센스 가닥을 화학식 Ib로 나타내는 경우, Nb는 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na는 독립적으로 2~20, 2~15 또는 2~10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
센스 가닥을 화학식 Ic로 나타내는 경우, Nb는 0~10, 0~7, 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na는 독립적으로 2~20, 2~15 또는 2~10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
센스 가닥을 화학식 Id로 나타내는 경우, 각각의 Nb는 독립적으로 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 일부 구현예에서, Nb는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다. 각각의 Na는 독립적으로 2~20, 2~15, 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
X, Y 및 Z 각각은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
다른 구현예에서, i는 0이고, j는 0이고, 센스 가닥은 하기 화학식으로 나타낼 수 있다:
5' np- Na -YYY- Na-nq 3' (Ia).
센스 가닥을 화학식 Ia로 나타내는 경우, 각각의 Na는 독립적으로 2~20, 2~15, 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
일 구현예에서, RNAi의 안티센스 가닥 서열은 화학식 II로 나타낼 수 있다:
5' nq'-Na'-(Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-N'a-np' 3' (II)
여기서:
k 및 l는 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p' 및 q'는 각각 독립적으로 0~6이고;
각각의 Na'는 독립적으로 0~25개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형 뉴클레오타이드를 포함하고;
각각의 Nb'는 독립적으로 0~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
각각의 np' 및 nq'는 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
여기서 Nb' 및 Y'는 동일한 변형을 갖지 않고;
X 'X 'X ', Y 'Y 'Y ', 및 Z 'Z 'Z '는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형의 하나의 모티프를 나타낸다.
일부 구현예에서, Na ' 또는 Nb '는 교호 패턴의 변형을 포함한다.
Y 'Y 'Y ' 모티프는 안티센스 가닥의 절단 부위에 또는 그 부근에 존재한다. 예를 들어, dsRNAi 제제가 길이가 17~23개 뉴클레오타이드인 듀플렉스 영역을 갖는 경우, Y 'Y 'Y ' 모티프는 안티센스 가닥의 위치 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; 또는 13, 14, 15에 존재할 수 있고, 계수는 제1 뉴클레오타이드로부터, 5'-말단으로부터 시작하거나; 선택적으로, 계수는 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내에서 제1 쌍을 형성하는 뉴클레오타이드에서 시작한다. 일부 구현예에서, Y 'Y 'Y '모티프는 위치 11, 12, 13에서 존재한다.
특정 구현예에서, Y 'Y 'Y '모티프는 모든 2'-OMe 변형된 뉴클레오타이드이다.
특정 구현예에서, k는 1이고 I은 0이거나, k는 0이고 I은 1이거나, k 및 I 둘 모두는 1이다.
안티센스 가닥은 따라서 하기의 화학식으로 나타낼 수 있다:
5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np' 3' (IIb);
5' nq'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np' 3' (IIc); 또는
5' nq'-Na'- Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'- X'X'X'-Na'-np' 3' (IId).
안티센스 가닥을 화학식 IIb로 나타내는 경우, Nb'는 0~10, 0~7, 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na'는 독립적으로 2~20, 2~15 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
안티센스 가닥을 화학식 IIc로 나타내는 경우, Nb'는 0~10, 0~7, 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na'는 독립적으로 2~20, 2~15 또는 2~10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
안티센스 가닥을 화학식 IId로 나타내는 경우, 각각의 Nb'는 0~10, 0~7, 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na'는 독립적으로 2~20, 2~15 또는 2~10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 일부 구현예에서, Nb는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
또 다른 구현예에서, k는 0이고 l은 0이고, 안티센스 가닥은 하기 화학식으로 나타낼 수 있다:
5' np'-Na'-Y'Y'Y'- Na'-nq' 3' (Ia).
안티센스 가닥을 화학식 IIa로 나타내는 경우, 각각의 Na'는 독립적으로 2~20, 2~15 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
X', Y' 및 Z' 각각은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 뉴클레오타이드는 LNA, CRN, UNA, cEt, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-하이드록실, 또는 2'-플루오로로 독립적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로로 변형된다. 각각의 X, Y, Z, X', Y' 및 Z'는 특히 2'-O-메틸 변형 또는 2'-플루오로 변형을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, dsRNAi 제제의 센스 가닥은 듀플렉스 영역이 21개의 뉴클레오타이드인 경우에 가닥의 9, 10, 및 11 위치에서 존재하는 YYY 모티프를 포함할 수 있고, 계수는 5'-말단으로부터 제1 뉴클레오타이드로부터 시작하거나, 선택적으로, 계수는 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내에서 제1 쌍형성 뉴클레오타이드에서 시작하고; Y는 2'-F 변형을 나타낸다. 센스 가닥은 추가로 듀플렉스 영역의 반대 말단에 윙 변형으로서 XXX 모티프 또는 ZZZ 모티프를 포함할 수 있고; XXX 및 ZZZ는 각각 독립적으로 2'-OMe-변형 또는 2'-F 변형을 나타낸다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 가닥의 위치 11, 12, 13에서 존재하는 Y'Y'Y' 모티프를 포함할 수 있고, 계수는 5'-말단으로부터 제1 뉴클레오타이드로부터 시작하거나, 선택적으로, 계수는 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내에서 제1 쌍형성 뉴클레오타이드에서 시작하고; Y'는 2'-O-메틸 변형을 나타낸다. 안티센스 가닥은 추가로 듀플렉스 영역의 반대 말단에 윙 변형으로서 X'X'X' 모티프 또는 Z'Z'Z' 모티프를 포함할 수 있고; X'X'X' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 2'-OMe-변형 또는 2'-F 변형을 나타낸다.
위의 화학식 Ia, Ib, Ic, 및 Id 중 어느 하나에 의해 나타낸 센스 가닥은 듀플렉스를 형성하고, 여기서 안티센스 가닥은 각각 화학식 IIa, IIb, IIc, 및 IId 중 어느 하나에 의해 나타낸다.
따라서, 발명의 방법에 사용하기 위한 dsRNAi 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함할 수 있고, 각각의 가닥은 14 내지 30개 뉴클레오타이드를 갖고, iRNA 듀플렉스는 하기 화학식 III에 의해 나타낸다:
센스: 5' np -Na-(X X X)i -Nb- Y Y Y -Nb -(Z Z Z)j-Na-nq 3'
안티센스: 3' np '-Na '-( X'X'X')k-Nb '- Y'Y'Y'-Nb '-( Z'Z'Z')l-Na '-nq ' 5'
(III)
여기서:
i, j, k, 및 l는 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p, p ', q, 및 q '는 각각 독립적으로 0~6이고;
각각의 Na 및 Na'는 독립적으로 0~25개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고;
각각의 Nb 및 Nb '는 독립적으로 0~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 나타내고;
여기서, 각각의 np', np, nq', 및 nq는 이의 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있고, 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형의 하나의 모티프를 나타낸다.
일 구현예에서, i는 0이고 j는 0이거나; i는 1이고 j는 0이거나; i는 0 이고 j는 1이거나; i 및 j 둘 모두는 0이거나; i 및 j 둘 모두는 1이다. 또 다른 구현예에서, k는 0이고 I는 0이거나; k는 l이고 I는 0이고; k는 0이고 I는 1이거나; k 및 I 둘 모두는 0이거나; k 및 I 둘 모두는 1이다.
iRNA 듀플렉스를 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 예시적인 조합은 하기 화학식을 포함한다:
5' Np - Na -Y Y Y -Na-nq 3'
3' np '-Na '- Y'Y'Y'-Na 'nq ' 5'
(IIIa)
5' np -Na -Y Y Y -Nb -Z Z Z -Na-nq 3'
3' np '-Na '- Y'Y'Y'-Nb '- Z'Z'Z'-Na 'nq ' 5'
(IIIb)
5' np-Na- X X X -Nb -Y Y Y - Na-nq 3'
3' np '-Na '- X'X'X'-Nb '- Y'Y'Y'-Na 'nq ' 5'
(IIIc)
5' np -Na -X X X -Nb-Y Y Y -Nb- Z Z Z -Na-nq 3'
3' np '-Na '- X'X'X'-Nb '- Y'Y'Y'-Nb '- Z'Z'Z'-Na-nq ' 5'
(IIId)
dsRNAi 제제를 화학식 IIIa로 나타내는 경우, 각각의 Na는 독립적으로 2~20, 2~15, 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
dsRNAi 제제를 화학식 IIIb로 나타내는 경우, 각각의 Nb는 독립적으로 1~10, 1~7, 1~5, 또는 1~4개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na는 독립적으로 2~20, 2~15 또는 2~10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
dsRNAi 제제를 화학식 IIIc로 나타내는 경우, 각각의 Nb, Nb'는 독립적으로 0~10, 0~7, 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na는 독립적으로 2~20, 2~15 또는 2~10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
dsRNAi 제제를 화학식 IIId로 나타내는 경우, 각각의 Nb, Nb'는 독립적으로 0~10, 0~7, 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na, Na'는 독립적으로 2~20, 2~15 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na, Na', Nb, 및 Nb '는 독립적으로 교호 패턴의 변형을 포함한다.
화학식 III, IIIa, IIIb, IIIc, 및 IIId의 X, Y, 및 Z 각각은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
dsRNAi 제제를 화학식 III, IIIa, IIIb, IIIc, 및 IIId로 나타내는 경우, Y 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 Y' 뉴클레오타이드 중 하나와 염기쌍을 형성할 수 있다. 대안적으로, Y 뉴클레오타이드 중 적어도 2개는 상응하는 Y' 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성하거나; Y 뉴클레오타이드 중 3개 모두는 상응하는 Y' 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성한다.
dsRNAi 제제를 화학식 IIIb 또는 화학식 IIId로 나타낸는 경우, Z 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 Z' 뉴클레오타이드 중 하나와 염기쌍을 형성할 수 있다. 대안적으로, Z 뉴클레오타이드 중 적어도 2개는 상응하는 Z' 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성하거나; Z 뉴클레오타이드 중 3개 모두는 상응하는 Z' 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성한다.
dsRNAi 제제를 화학식 IIIc 또는 화학식 IIId로 나타내는 경우, X 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 X' 뉴클레오타이드 중 하나와 염기쌍을 형성할 수 있다. 대안적으로, X 뉴클레오타이드 중 적어도 2개는 상응하는 X' 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성하거나; X 뉴클레오타이드 중 3개 모두는 상응하는 X' 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성한다.
특정 구현예에서, Y 뉴클레오타이드 상의 변형은 Y ' 뉴클레오타이드 상의 변형과 상이하거나, Z 뉴클레오타이드 상의 변형은 Z' 뉴클레오타이드 상의 변형과 상이하거나, X 뉴클레오타이드 상의 변형은 X ' 뉴클레오타이드 상의 변형과 상이하다.
특정 구현예에서, dsRNAi 제제를 화학식 IIId로 나타내는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이다. 다른 구현예에서, RNAi 제제를 화학식 IIId로 나타내는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np'>0이고 적어도 하나의 np'는 이웃하는 뉴클레오타이드에 포스포로티오에이트 결합을 통해 결합된다. 또 다른 구현예에서, RNAi 제제를 화학식 IIId로 나타내는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np' >0이고 적어도 하나의 np'는 이웃하는 뉴클레오타이드에 포스포로티오에이트 결합을 통해 결합되고, 센스 가닥은 2가 또는 3가 분지형 링커(후술됨)를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 접합된다. 다른 구현예에서, RNAi 제제를 화학식 IIId로 나타내는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np'>0이고 적어도 하나의 np'는 이웃하는 뉴클레오타이드에 포스포로티오에이트 결합을 통해 결합되고, 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고, 센스 가닥은 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 접합된다.
일부 구현예에서, dsRNAi 제제를 화학식 IIIa로 나타내는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np'>0이고 적어도 하나의 np'는 이웃하는 뉴클레오타이드에 포스포로티오에이트 결합을 통해 결합되고, 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고, 센스 가닥은 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 접합된다.
일부 구현예에서, dsRNAi 제제는 화학식 III, IIIa, IIIb, IIIc, 및 IIId로 나타낸 적어도 2개의 듀플렉스를 함유하는 다량체이고, 여기서 듀플렉스는 링커에 의해 연결된다. 링커는 절단가능하거나 절단가능하지 않을 수 있다. 선택적으로, 다량체는 추가로 리간드를 포함한다. 듀플렉스 각각은 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적화할 수 있거나; 듀플렉스 각각은 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적화할 수 있다.
일부 구현예에서, dsRNAi 화학식 III, IIIa, IIIb, IIIc, 및 IIId로 나타낸 3개, 4개, 5개, 6개 이상의 듀플렉스를 함유하는 다량체이고, 여기서 듀플렉스는 링커에 의해 연결된다. 링커는 절단가능하거나 절단가능하지 않을 수 있다. 선택적으로, 다량체는 추가로 리간드를 포함한다. 듀플렉스 각각은 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적화할 수 있거나; 듀플렉스 각각은 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적화할 수 있다.
일 구현예에서, 화학식 III, IIIa, IIIb, IIIc, 및 IIId 중 적어도 하나로 나타낸 2개의 dsRNAi 제제는 5' 말단, 및 3' 말단의 하나 또는 둘 모두에서 서로 연결되고, 선택적으로 리간드에 접합된다. 제제의 각각은 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적화할 수 있거나; 제제의 각각은 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적화할 수 있다.
특정 구현예에서, 발명의 RNAi 제제는 2'-플루오로 변형을 함유하는 적은 수의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 2'-플루오로 변형을 갖는 10개 이하의 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 예를 들어, RNAi 제제는 2'-플루오로 변형을 갖는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 또는 0개 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 발명의 RNAi 제제는 2'-플루오로 변형을 갖는 10개 뉴클레오타이드, 예를 들어, 센스 가닥에서 2'-플루오로 변형을 갖는 4개 뉴클레오타이드 및 안티센스 가닥에서 2'-플루오로 변형을 갖는 6개 뉴클레오타이드를 함유한다. 또 다른 특정 구현예에서, 발명의 RNAi 제제는 2'-플루오로 변형을 갖는 6개 뉴클레오타이드, 예를 들어, 센스 가닥에서 2'-플루오로 변형을 갖는 4개 뉴클레오타이드 및 안티센스 가닥에서 2'-플루오로 변형을 갖는 2개 뉴클레오타이드를 함유한다.
다른 구현예에서, 발명의 RNAi 제제는 2'-플루오로 변형을 함유하는 매우 낮은 수의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 2'-플루오로 변형을 함유하는 2개 이하의 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 예를 들어, RNAi 제제는 2'-플루오로 변형을 갖는 0개의 뉴클레오타이드 중 2개, 1개를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, RNAi 제제는 2'-플루오로 변형을 갖는 2개 뉴클레오타이드, 예를 들어, 센스 가닥에서 2-플루오로 변형을 갖는 0개 뉴클레오타이드 및 안티센스 가닥에서 2'-플루오로 변형을 갖는 2개 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다.
다양한 공보는 발명의 방법에 사용될 수 있는 다량체 iRNA를 기술한다. 이러한 공개 공보는 WO2007/091269, 미국 특허 제7,858,769호, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887, 및 WO2011/031520를 포함하고, 이들 각각의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 조성물 및 방법은 본원에 기술된 것과 같은 RNAi 제제의 비닐 포스포네이트(VP) 변형을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본 개시내용의 5'-비닐 포스포네이트 변형 뉴클레오타이드는 하기의 구조를 갖고:
여기서 X는 O 또는 S이고;
R은 수소, 하이드록시, 플루오로, 또는 C1-20알콕시(예를 들어, 메톡시 또는 n-헥사데실옥시)이고;
R5'는 =C(H)-P(O)(OH)2이고, C5' 탄소와 R5' 사이의 이중 결합은 E 또는 Z 배향(예를 들어, E 배향)이고;
B는 뉴클레오염기 또는 변형된 뉴클레오염기이고, 선택적으로 여기서 B는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 또는 우라실이다.
본 발명의 비닐 포스포네이트는 발명의 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥에 부착될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 비닐 포스포네이트는, 선택적으로, dsRNA의 안티센스 가닥의 5' 말단에서 dsRNA의 안티센스 가닥에 부착된다.
비닐 포스포네이트 변형은 또한 본 발명의 조성물 및 방법을 위해 고 려된다. 예시적인 비닐 포스포네이트 구조는 선행하는 구조를 포함하며, 여기서 R5'는 =C(H)-OP(O)(OH)2이고, C5' 탄소와 R5' 사이의 이중 결합은 E 또는 Z 배향(예를 들어, E 배향)이다.
하기에서 더 상세히 기술된 것과 같이, 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 iRNA로의 접합을 함유하는 iRNA는 iRNA의 하나 이상의 성질을 최적화할 수 있다. 많은 경우에, 탄수화물 모이어티는 iRNA의 변형된 서브유닛에 부착될 것이다. 예를 들어, iRNA의 하나 이상의 리보뉴클레오타이드 서브유닛의 리보스 당은 또 다른 모이어티, 예를 들어, 탄수화물 리간드가 부착된 비-탄수화물(예컨대, 환형) 캐리어로 대체될 수 있다. 서브유닛의 리보스 당이 그렇게 대체된 리보뉴클레오타이드 서브유닛은 본원에서 리보스 대체 변형 서브유닛(RRMS)으로 지칭된다. 환형(cyclic) 캐리어는 카보사이클릭 고리 시스템일 수 있고, 즉, 모든 고리(ring) 원자는 탄소 원자, 또는 헤테로사이클릭(heterocyclic) 고리 시스템이고, 즉, 하나 이상의 환 원자는 헤테로원자, 예를 들어 질소, 산소, 황일 수 있다. 환형 캐리어는 모노사이클릭(monocyclic) 고리 시스템일 수 있거나, 2개 이상의 고리, 예를 들어, 융합된 고리를 함유할 수 있다. 환형 캐리어는 완전히 포화된 고리 시스템일 수 있거나, 이것은 하나 이상의 이중 결합을 함유할 수 있다.
리간드는 캐리어를 통해 폴리뉴클레오타이드에 부착될 수 있다. 캐리어는 (i) 적어도 하나의 "골격 부착점", 예컨대 2개의 "골격 부착점" 및 (ii) 적어도 하나의 "테더링 부착점"을 포함한다. 본원에 사용된 "골격 부착점"은 작용기, 예를 들어, 하이드록실기, 또는 일반적으로 이를 위해 이용가능한 결합을 지칭하고, 이는 골격, 예를 들어, 리보핵산의 포스페이트, 또는 변형 포스페이트, 예를 들어 황 함유 골격으로의 캐리어의 혼입에 적합하다. 일부 구현예에서 "테더링 부착점"(TAP)은 선택된 모이어티를 연결하는, 환형 캐리어의 구성 고리 원자, 예를 들어, 탄소 원자 또는 헤테로원자(골격 부착점을 제공하는 원자와 구별됨)를 지칭한다. 모이어티는 예를 들어, 탄수화물, 예를 들어, 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 올리고당류, 또는 다당류일 수 있다. 선택적으로, 선택된 모이어티는 환형 캐리어로의 삽입 테더에 의해 연결된다. 따라서, 환형 캐리어는 종종 작용기, 예를 들어, 아미노기를 포함하거나, 일반적으로 또 다른 화학적 실체, 예를 들어, 구성 고리에 대한 리간드의 혼입 또는 테더링에 적합한 결합을 제공한다.
iRNA는 캐리어를 통해 리간드에 접합될 수 있으며, 여기서 캐리어는 환형기 또는 비환형(acyclic)기일 수 있다. 일부 구현예에서, 환형 기는 피롤리디닐, 파라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔란, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸릴, 및 데칼린으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 비환형기는 세리놀 골격 또는 디에탄올아민 골격이다.
i. 열 불안정화 변형
특정 구현예에서, dsRNA 분자는 안티센스 가닥의 시드 영역에 열 불안정화 변형을 혼입시킴으로써 RNA 간섭에 대해 최적화될 수 있다. 본원에서 사용되는 것과 같이, "시드 영역"은 참조된 가닥의 5' 말단의 위치 2~9 또는 참조된 가닥의 5' 말단의 위치 2~8을 의미한다. 예를 들어, 열 불안정화 변형은 안티센스 가닥의 시드 영역에 혼입되어 오프-타겟 유전자 침묵을 감소시키거나 억제할 수 있다.
용어 "열 불안정화 변형(들)"은 dsRNA이 그러한 변형(들)을 갖지 않는 dsRNA의 용융 온도(Tm)보다 낮은 전체 Tm을 갖도록 하는 변형(들)을 포함한다. 예를 들어, 열 불안정화 변형(들)은 dsRNA의 Tm을 1~4°C, 예컨대 1, 2, 3 또는 4도만큼 감소시킬 수 있다. 또한, 용어 "열 불안정화 뉴클레오타이드"는 하나 이상의 열 불안정화 변형을 포함하는 뉴클레오타이드를 지칭한다.
안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여 처음 9개 뉴클레오타이드 위치 내 듀플렉스의 적어도 하나의 열 불안정화 변형을 포함하는 안티센스 가닥을 갖는 dsRNA가 오프-표적 유전자 침묵 활성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 5' 영역의 처음 9개 뉴클레오타이드 위치 내에 듀플렉스의 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상)의 열 불안정화 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 듀플렉스의 하나 이상의 열 불안정화 변형(들)은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 2~9, 예컨대 위치 4~8에 위치한다. 일부 추가 구현예에서, 듀플렉스의 열 불안정화 변형(들)은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 6, 7 또는 8에 위치한다. 또 일부 추가의 구현예에서, 듀플렉스의 열 불안정화 변형은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 7에 위치한다. 일부 구현예에서, 듀플렉스의 열 불안정화 변형은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부 위치 2, 3, 4, 5 또는 9에 위치한다.
iRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 각각의 가닥은 14 내지 40개 뉴클레오타이드를 갖는다. RNAi 제제는 화학식 L로 나타낼 수 있다:
화학식 L에서, B1, B2, B3, B1', B2', B3', 및 B4'는 각각 독립적으로 2'-O-알킬, 2'-치환 알콕시, 2'-치환 알킬, 2'-할로, ENA, 및 BNA/LNA로 이루어진 군으로부터 선택된 변형을 함유하는 뉴클레오타이드이다. 일 구현예에서, B1, B2, B3, B1', B2', B3', 및 B4'는 각각 2'-OMe 변형을 함유한다. 일 구현예에서, B1, B2, B3, B1', B2', B3', 및 B4'는 각각 2'-OMe 또는 2'-F 변형을 함유한다. 일 구현예에서, B1, B2, B3, B1', B2', B3', 및 B4' 중 적어도 하나는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA, , 2'O-CH2C(O)N(Me)H) 변형을 함유한다.
C1은 안티센스 가닥의 시드 영역에 대향하는 부위(즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 위치 2~8 또는 참조된 가닥의 5'-말단의 위치 2~9에)에 위치하는 열 불안정화 뉴클레오타이드이다. 예를 들어, C1은 안티센스 가닥의 5'-말단의 위치 2~8에서 뉴클레오타이드와 쌍을 이루는 센스 가닥의 위치에 존재한다. 일 실시예에서, C1은 센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 15에 존재한다. C1 뉴클레오타이드는 무염기 변형; 듀플렉스 내 반대 뉴클레오타이드와의 미스매치; 및 당 변형, 예컨대 2'-데옥시 변형 또는 비환형 뉴클레오타이드, 예를 들어, 잠김 해제된 핵산(UNA) 또는 글리세롤 핵산(GNA) 및 2'-5'-결합 리보뉴클레오타이드("3'-RNA")를 포함할 수 있는 열 불안정화 변형을 갖는다. 일 구현예에서, C1은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 열 불안정화 변형을 갖고: i) 안티센스 가닥 내 반대 뉴클레오타이드와의 미스매치; ii) 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 무염기 변형:
; 및 iii) 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 당 변형:
및 , 여기서 B는 변형 또는 미변형 뉴클레오염기이고, R1 및 R2는 독립적으로 H, 할로겐, OR3, 또는 알킬이고; R3은 H, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당이다. 일 구현예에서, C1에서의 열 불안정화 변형은 G:G, G:A, G:U, G:T, A:A, A:C, C:C, C:U, C:T, U:U, T:T, 및 U:T로 이루어진 군으로부터 선택된 미스매치이고; 선택적으로, 미스매치 쌍 내의 적어도 하나의 뉴클레오염기는 2'-데옥시 뉴클레오염기이다. 일 실시예에서, C1에서의 열 불안정화 변형은 GNA 또는 이다.
T1, T1', T2', 및 T3'은 각각 독립적으로 뉴클레오타이드에 2'-OMe 변형의 입체 벌크 이하인 입체 벌크를 제공하는 변형을 포함하는 뉴클레오타이드를 나타낸다. 입체 벌크는 변형의 입체 효과의 합을 지칭한다. 뉴클레오타이드의 변형의 입체 효과를 결정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 변형은 뉴클레오타이드의 리보스 당의 2' 위치에 있을 수 있거나, 비-리보스 뉴클레오타이드, 비환형 뉴클레오타이드, 또는 리보스 당의 2' 위치와 유사하거나 동등한 뉴클레오타이드의 골격에 대한 변형일 수 있고, 뉴클레오타이드에 2'-OMe 변형의 입체 벌크보다 이하인 입체 벌크를 제공한다. 예를 들어, T1, T1', T2', 및 T3'은 DNA, RNA, LNA, 2'-F, 및 2'-F-5'-메틸로부터 각각 독립적으로 선택된다. 일 구현예에서, T1은 DNA이다. 일 구현예에서, T1'은 DNA, RNA 또는 LNA이다. 일 구현예에서, T2'는 DNA 또는 RNA이다. 일 구현예에서, T3'은 DNA 또는 RNA이다.
n1, n3, 및 q1은 독립적으로 길이가 4 내지 15개 뉴클레오타이드이다.
n5, q3, 및 q7은 독립적으로 길이가 1~6개 뉴클레오타이드(들)이다.
n4, q2, 및 q6은 독립적으로 길이가 1~3개 뉴클레오타이드(들)이고; 대안적으로, n4는 0이다.
q5는 독립적으로 길이가 0~10개 뉴클레오타이드(들)이다.
n2 및 q4는 독립적으로 길이가 0~3개 뉴클레오타이드(들)이다.
대안적으로, n4는 길이가 0~3개 뉴클레오타이드(들)이다.
일 구현예에서, n4는 0일 수 있다. 일 실시예에서, n4는 0이고, q2 및 q6은 1이다. 또 다른 예에서, n4는 0이고, q2 및 q6은 1이고, 센스 가닥의 위치 1~5 내에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수함)을 포함한다.
일 구현예에서, n4, q2, 및 q6은 각각 1이다.
일 구현예에서, n2, n4, q2, q4, 및 q6은 각각 1이다.
일 구현예에서, C1은 센스 가닥이 길이가 19~22개 뉴클레오타이드인 경우, 센스 가닥의 5' 말단의 위치 14~17에 있고, n4는 1이다. 일 구현예에서, C1은 센스 가닥의 5'-말단의 위치 15에 있다.
일 구현예에서, T3'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2에서 시작한다. 일 실시예에서, T3'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2에 있고, q6은 1과 같다.
일 구현예에서, T1'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 14에서 시작한다. 일 실시예에서, T1'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 14에 있고, q2은 1과 같다.
예시적인 구현예에서, T3'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2에서 시작하고, T1'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 14에서 시작한다. 일 실시예에서, T3'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2번에서 시작하고, q6은 1과 같고, T1'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 14에서 시작하고, q2는 1과 같다.
일 구현예에서, T1' 및 T3'는 길이가 11개 뉴클레오타이드에 의해 분리된다(즉, T1' 및 T3' 뉴클레오타이드를 계수하지 않음).
일 구현예에서, T1'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 14에 있다. 일 실시예에서, T1'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 14에 있고, q2는 1과 같고, 변형은 2' 위치 또는 비-리보스 내 위치에 있고, 비환형 또는 골격은 2'-OMe 리보스보다 덜 입체적인 벌크를 제공한다.
일 구현예에서, T3'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2에 있다. 일 실시예에서, T3'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2에 있고, q6은 1과 같고, 변형은 2' 위치 또는 비-리보스 내 위치에 있고, 비환형 또는 골격은 2'-OMe 리보스 보다 덜 하거나 동등한 입체적인 벌크를 제공한다.
일 구현예에서, T1은 센스 가닥의 절단 부위에 있다. 일 실시예에서, T1은 센스 가닥이 길이가 19~22개 뉴클레오타이드인 경우, 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 11에 있고, n2는 1이다. 예시적인 구현예에서, T1은 센스 가닥이 길이가 19~22개 뉴클레오타이드인 경우, 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 11에 있는 센스 가닥의 절단 부위에 있고, n2는 1이다.
일 구현예에서, T2'는 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 6에서 시작한다. 일 실시예에서, T2'는 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 6~10에 있고, q4는 1이다.
예시적인 구현예에서, T1은, 예를 들어, 센스 가닥이 길이가 19~22개 뉴클레오타이드인 경우, 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 11에 있는 센스 가닥의 절단 부위에 있고, n2는 1이고; T1'는 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 14에 있고, q2는 1과 같고, T1'에 대한 변형은 리보스 당의 2' 위치에 또는 비-리보스 내의 위치에 있고, 비환형 또는 골격은 2'-OMe 리보스 보다 덜 입체적인 벌크를 제공하고; T2'는 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 6~10에 있고, q4는 1이고; T3'는 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2에 있고, q6는 1과 같고, T3'에 대한 변형은 2' 위치에 또는 비-리보스 내 위치에 있고, 비환형 또는 골격은 2'-OMe 리보스 보다 덜 하거나 동등한 입체적인 벌크를 제공한다.
일 구현예에서, T2'는 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 8에서 시작한다. 일 실시예에서, T2'는 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 8에서 시작하고, q4는 2이다.
일 구현예에서, T2'는 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 9에서 시작한다. 일 실시예에서, T2'는 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 9에 있고, q4는 1이다.
일 구현예에서, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 1이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 6이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 인터뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수함)을 포함한다.
일 구현예에서, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 1이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 6이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'-F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'는 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'는 2'-F이고, q6는 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 6이고, T1은 2'-F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 7이고, T1'는 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3는 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'는 2'-F이고, q6는 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 6이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 7이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'-F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'는 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 1이고, B3'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 6이고, T3'는 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 1이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 6이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18-23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'-F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'는 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 5이고, T2'는 2'-F이고, q4는 1이고, B3'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'는 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 선택적으로, 안티센스 가닥의 3'-말단에 적어도 2개의 추가 TT를 갖는다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 5이고, T2'는 2'-F이고, q4는 1이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 선택적으로, 안티센스 가닥의 3' 말단에 적어도 2개의 추가 TT를 갖고; 센스 가닥의 위치 1~5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18-23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수함)을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18-23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-F 이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18-23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-F 이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18-23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다.
RNAi 제제는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 5' 말단에 인 함유기를 포함할 수 있다. 5'-말단 인 함유기는 5'-말단 포스페이트(5'-P), 5'-말단 포스포로티오에이트(5'-PS), 5'-말단 포스포로디티오에이트(5'-PS2), 5'-말단 비닐포스포네이트(5'-VP), 5'-말단 메틸포스포네이트(MePhos), 또는 5'-데옥시-5'-C-말로닐()일 수 있다. 5'-말단 인 함유기가 5'-말단 비닐포스포네이트(5'-VP)인 경우, 5'-VP는 5'-E-VP 이성질체(즉, 트랜스-비닐포스포네이트, ), 5'-Z-VP 이성질체(즉, 시스-비닐포스포네이트, ), 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
일 구현예에서, RNAi 제제는 센스 가닥의 5'-말단에 인 함유기를 포함한다. 일 구현예에서, RNAi 제제는 안티센스 가닥의 5'-말단에 인 함유기를 포함한다.
일 구현예에서, RNAi 제제는 5'-P를 포함한다. 일 구현예에서, RNAi 제제는 안티센스 가닥에 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, RNAi 제제는 5'-PS를 포함한다. 일 구현예에서, RNAi 제제는 안티센스 가닥에 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에서, RNAi 제제는 5'-VP를 포함한다. 일 구현예에서, RNAi 제제는 안티센스 가닥에 5'-VP를 포함한다. 일 구현예에서, RNAi 제제는 안티센스 가닥에 5'-E-VP를 포함한다. 일 구현예에서, RNAi 제제는 안티센스 가닥에 5'-Z-VP를 포함한다.
일 구현예에서, RNAi 제제는 5'-PS2를 포함한다. 일 구현예에서, RNAi 제제는 안티센스 가닥에 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, RNAi 제제는 5'-PS2를 포함한다. 일 구현예에서, RNAi 제제는 안티센스 가닥에 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'-F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'는 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'는 2'-F이고, q6는 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이다. RNAi 제제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'-F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'는 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'는 2'-F이고, q6는 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이다. RNAi 제제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'-F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'는 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'는 2'-F이고, q6는 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이다. RNAi 제제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'-F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'는 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'는 2'-F이고, q6는 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이다. RNAi 제제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'-F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'는 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'는 2'-F이고, q6는 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이다. RNAi 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'-F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'는 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3는 4이고, q4는 0이고, B3'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'는 2'-F이고, q6는 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이다. RNAi 제제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'-F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'는 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3는 4이고, q4는 0이고, B3'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'는 2'-F이고, q6는 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'-F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'는 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3는 4이고, q4는 0이고, B3'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'는 2'-F이고, q6는 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이다. RNAi 제제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'-F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'는 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3는 4이고, q4는 0이고, B3'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'는 2'-F이고, q6는 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이다. RNAi 제제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'-F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'는 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3는 4이고, q4는 0이고, B3'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'는 2'-F이고, q6는 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이다. RNAi 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'-F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'는 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3는 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'는 2'-F이고, q6는 1이고, B4'는 2'-F이고, q7은 1이다. RNAi 제제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'-F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'는 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3는 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'는 2'-F이고, q6는 1이고, B4'는 2'-F이고, q7은 1이다. RNAi 제제는 또한 5'- PS를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'-F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'는 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3는 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'는 2'-F이고, q6는 1이고, B4'는 2'-F이고, q7은 1이다. RNAi 제제는 또한 5'- VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'-F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'는 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3는 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'는 2'-F이고, q6는 1이고, B4'는 2'-F이고, q7은 1이다. dsRNAi RNA 제제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'-F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'는 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3는 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'는 2'-F이고, q6는 1이고, B4'는 2'-F이고, q7은 1이다. RNAi 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-F 이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18-23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-F 이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18-23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'- PS를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-F 이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18-23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'- VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-F 이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18-23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-F 이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18-23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'-F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'는 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3는 4이고, q4는 0이고, B3'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'는 2'-F이고, q6는 1이고, B4'는 2'-F이고, q7은 1이다. RNAi 제제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'-F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'는 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3는 4이고, q4는 0이고, B3'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'는 2'-F이고, q6는 1이고, B4'는 2'-F이고, q7은 1이다. RNAi 제제는 또한 5'- PS를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'-F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'는 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3는 4이고, q4는 0이고, B3'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'는 2'-F이고, q6는 1이고, B4'는 2'-F이고, q7은 1이다. RNAi 제제는 또한 5'- VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'-F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'는 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3는 4이고, q4는 0이고, B3'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'는 2'-F이고, q6는 1이고, B4'는 2'-F이고, q7은 1이다. RNAi 제제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'-F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'는 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3는 4이고, q4는 0이고, B3'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'는 2'-F이고, q6는 1이고, B4'는 2'-F이고, q7은 1이다. RNAi 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-F 이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-F 이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'- PS를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-F 이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'- VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-F 이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-F 이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-P 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-P는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-PS 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-PS는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-VP(예를 들어, 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합) 및 표적화 리간드를 포함한다.
일 구현예에서, 5'-VP는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'- PS2 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-PS2는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-데옥시-5'-C-말로닐은 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-P 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-P는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-PS 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-PS는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-VP(예를 들어, 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합) 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-VP는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-PS2 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-PS2는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-OMe이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-데옥시-5'-C-말로닐은 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-F 이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18-23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-P 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-P는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-F 이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18-23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-PS 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-PS는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-F 이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18-23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-VP(예를 들어, 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합) 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-VP는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-F 이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18-23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-PS2 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-PS2는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'는 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-F 이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18-23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-데옥시-5'-C-말로닐은 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-F 이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-P 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-P는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-F 이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-PS 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-PS는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-F 이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'- VP(예를 들어, 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합) 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-VP는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-F 이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'- PS2 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-PS2는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'는 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'는 2'-F 이고, q7은 1이고; 센스 가닥의 위치 1~5 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함), 및 위치 1 및 2에서의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형 및 안티센스 가닥의 위치 18~23 내의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결 변형(안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수함)을 포함한다. RNAi 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐 및 표적화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-데옥시-5'-C-말로닐은 안티센스 가닥의 5'-말단에 있고, 표적화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 RNAi 제제는 다음을 포함하며:
(a) 다음을 갖는 센스 가닥:
(i) 21개 뉴클레오타이드의 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 상기 ASGPR 리간드는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, ASGPR 리간드; 및
(iii) 위치 1, 3, 5, 7, 9 내지 11, 13, 17, 19 및 21에서의 2'-F 변형 및 위치 2, 4, 6, 8, 12, 14 내지 16, 18 및 20에서의 2'-OMe 변형(5' 말단으로부터 계수함);
및
(b) 다음을 갖는 안티센스 가닥:
(i) 23개 뉴클레오타이드의 길이;
(ii) 위치 1, 3, 5, 9, 11 내지 13, 15, 17, 19, 21, 및 23에서의 2'-OMe 변형 및 위치 2, 4, 6 내지 8, 10, 14, 16, 18, 20, 및 22에서의 2'F 변형(5' 말단으로부터 계수함);
(iii) 뉴클레오타이드 위치 21과 22 사이, 및 뉴클레오타이드 위치 22와 23 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결(5' 말단으로부터 계수함);
여기서, dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 3'-말단에 2개의 뉴클레오타이드 오버행을, 그리고 안티센스 가닥의 5'-말단에 둔화 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 RNAi 제제는 다음을 포함하며:
(a) 다음을 갖는 센스 가닥:
(i) 21개 뉴클레오타이드의 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 상기 ASGPR 리간드는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, ASGPR 리간드;
(iii) 위치 1, 3, 5, 7, 9 내지 11, 13, 15, 17, 19 및 21에서의 2'-F 변형 및 위치 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18 및 20에서의 2'-OMe 변형(5' 말단으로부터 계수함); 및
(iv) 뉴클레오타이드 위치 1과 2 사이, 및 뉴클레오타이드 위치 2와 3 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결(5' 말단으로부터 계수함);
및
(b) 다음을 갖는 안티센스 가닥:
(i) 23개 뉴클레오타이드의 길이;
(ii) 위치 1, 3, 5, 7, 9, 11 내지 13, 15, 17, 19, 및 21 내지 23에서의 2'-OMe 변형 및 위치 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 18, 및 20에서의 2'F 변형(5' 말단으로부터 계수함);
(iii) 뉴클레오타이드 위치 1과 2 사이, 뉴클레오타이드 위치 2와 3 사이, 뉴클레오타이드 위치 21과 22 사이, 및 뉴클레오타이드 위치 22와 23 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결(5' 말단에서 계수함);
여기서, RNAi 제제는 안티센스 가닥의 3'-말단에 2개의 뉴클레오타이드 오버행을, 그리고 안티센스 가닥의 5'-말단에 둔화 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 RNAi 제제는 다음을 포함하며:
(a) 다음을 갖는 센스 가닥:
(i) 21개 뉴클레오타이드의 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 상기 ASGPR 리간드는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, ASGPR 리간드;
(iii) 위치 1 내지 6, 8, 10 및 12 내지 21에서의 2'-OMe 변형, 위치 7 및 9에서의 2'-F 변형, 및 위치 11에서의 데옥시-뉴클레오타이드(예를 들어, dT)(5' 말단으로부터 계수함); 및
(iv) 뉴클레오타이드 위치 1과 2 사이, 및 뉴클레오타이드 위치 2와 3 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결(5' 말단으로부터 계수함);
및
(b) 다음을 갖는 안티센스 가닥:
(i) 23개 뉴클레오타이드의 길이;
(ii) 위치 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19 내지 23에서의 2'-OMe 변형 및 위치 2, 4 내지 6, 8, 10, 12, 14, 16, 및 18에서의 2'-F 변형(5' 말단으로부터 계수함); 및
(iii) 뉴클레오타이드 위치 1과 2 사이, 뉴클레오타이드 위치 2와 3 사이, 뉴클레오타이드 위치 21과 22 사이, 및 뉴클레오타이드 위치 22와 23 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합(5' 말단에서 계수함);
여기서, RNAi 제제는 안티센스 가닥의 3'-말단에 2개의 뉴클레오타이드 오버행을, 그리고 안티센스 가닥의 5'-말단에 둔화 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 RNAi 제제는 다음을 포함하며:
(a) 다음을 갖는 센스 가닥:
(i) 21개 뉴클레오타이드의 길이;
(ii) 3’-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 상기 ASGPR 리간드는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, ASGPR 리간드;
(iii) 위치 1 내지 6, 8, 10, 12, 14, 및 16 내지 21에서의 2’-OMe 변형, 및 위치 7, 9, 11, 13, 및 15에서의 2’-F 변형; 및
(iv) 뉴클레오타이드 위치 1과 2 사이, 및 뉴클레오타이드 위치 2와 3 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결(5’ 말단으로부터 계수함);
및
(b) 다음을 갖는 안티센스 가닥:
(i) 23개 뉴클레오타이드의 길이;
(ii) 위치 1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 및 21 내지 23에서의 2’-OMe 변형 및 위치 2 내지 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 및 20에서의 2’-F 변형(5’ 말단으로부터 계수함); 및
(iii) 뉴클레오타이드 위치 1과 2 사이, 뉴클레오타이드 위치 2와 3 사이, 뉴클레오타이드 위치 21과 22 사이, 및 뉴클레오타이드 위치 22와 23 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결(5’ 말단에서 계수함);
여기서, RNAi 제제는 안티센스 가닥의 3’-말단에 2개의 뉴클레오타이드 오버행을, 그리고 안티센스 가닥의 5’-말단에 둔화 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 RNAi 제제는 다음을 포함하며:
(a) 다음을 갖는 센스 가닥:
(i) 21개 뉴클레오타이드의 길이;
(ii) 3’-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 상기 ASGPR 리간드는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, ASGPR 리간드;
(iii) 위치 1 내지 9, 및 12 내지 21에서의 2’-OMe 변형, 및 위치 10 및 11에서의 2’-F 변형; 및
(iv) 뉴클레오타이드 위치 1과 2 사이, 및 뉴클레오타이드 위치 2와 3 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결(5’ 말단으로부터 계수함);
및
(b) 다음을 갖는 안티센스 가닥:
(i) 23개 뉴클레오타이드의 길이;
(ii) 위치 1, 3, 5, 7, 9, 11 내지 13, 15, 17, 19, 및 21 내지 23에서의 2’-OMe 변형 및 위치 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 18, 및 20에서의 2’-F 변형(5’ 말단으로부터 계수함);
(iii) 뉴클레오타이드 위치 1과 2 사이, 뉴클레오타이드 위치 2와 3 사이, 뉴클레오타이드 위치 21과 22 사이, 및 뉴클레오타이드 위치 22와 23 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결(5’ 말단에서 계수함);
여기서, RNAi 제제는 안티센스 가닥의 3’-말단에 2개의 뉴클레오타이드 오버행을, 그리고 안티센스 가닥의 5’-말단에 둔화 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 RNAi 제제는 다음을 포함하며:
(a) 다음을 갖는 센스 가닥:
(i) 21개 뉴클레오타이드의 길이;
(ii) 3’-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 상기 ASGPR 리간드는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, ASGPR 리간드;
(iii) 위치 1, 3, 5, 7, 9 내지 11, 및 13에서의 2’-F 변형, 및 위치 2, 4, 6, 8, 12, 및 14 내지 21에서의 2’-OMe 변형; 및
(iv) 뉴클레오타이드 위치 1과 2 사이, 및 뉴클레오타이드 위치 2와 3 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결(5’ 말단으로부터 계수함);
및
(b) 다음을 갖는 안티센스 가닥:
(i) 23개 뉴클레오타이드의 길이;
(ii) 위치 1, 3, 5 내지 7, 9, 11 내지 13, 15, 17 내지 19, 및 21 내지 23에서의 2’-OMe 변형, 및 위치 2, 4, 8, 10, 14, 16, 및 20에서의 2’-F 변형(5’ 말단으로부터 계수함); 및
(iii) 뉴클레오타이드 위치 1과 2 사이, 뉴클레오타이드 위치 2와 3 사이, 뉴클레오타이드 위치 21과 22 사이, 및 뉴클레오타이드 위치 22와 23 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결(5’ 말단에서 계수함);
여기서, RNAi 제제는 안티센스 가닥의 3’-말단에 2개의 뉴클레오타이드 오버행을, 그리고 안티센스 가닥의 5’-말단에 둔화 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 RNAi 제제는 다음을 포함하며:
(a) 다음을 갖는 센스 가닥:
(i) 21개 뉴클레오타이드의 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 상기 ASGPR 리간드는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, ASGPR 리간드;
(iii) 위치 1, 2, 4, 6, 8, 12, 14, 15, 17, 및 19 내지 21에서의 2'-OMe 변형 및 위치 3, 5, 7, 9 내지 11, 13, 16, 및 18에서의 2'-F 변형; 및
(iv) 뉴클레오타이드 위치 1과 2 사이, 및 뉴클레오타이드 위치 2와 3 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결(5' 말단으로부터 계수함);
및
(b) 다음을 갖는 안티센스 가닥:
(i) 25개 뉴클레오타이드의 길이;
(ii) 위치 1, 4, 6, 7, 9, 11 내지 13, 15, 17, 및 19 내지 23에서의 2'-OMe 변형 및 위치 2, 3, 5, 8, 10, 14, 16, 및 18에서의 2'-F 변형, 및 위치 24 및 25에서의 데옥시-뉴클레오타이드(예를 들어, dT)(5' 말단으로부터 계수함); 및
(iii) 뉴클레오타이드 위치 1과 2 사이, 뉴클레오타이드 위치 2와 3 사이, 뉴클레오타이드 위치 21과 22 사이, 및 뉴클레오타이드 위치 22와 23 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결(5' 말단에서 계수함);
여기서, RNAi 제제는 안티센스 가닥의 3'-말단에 4개의 뉴클레오타이드 오버행을, 그리고 안티센스 가닥의 5'-말단에 둔화 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 RNAi 제제는 다음을 포함하며:
(a) 다음을 갖는 센스 가닥:
(i) 21개 뉴클레오타이드의 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 상기 ASGPR 리간드는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, ASGPR 리간드;
(iii) 위치 1 내지 6, 8 및 12 내지 21에서의 2'-OMe 변형, 및 위치 7 및 9 내지 11에서의 2'-F 변형; 및
(iv) 뉴클레오타이드 위치 1과 2 사이, 및 뉴클레오타이드 위치 2와 3 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결(5' 말단으로부터 계수함);
및
(b) 다음을 갖는 안티센스 가닥:
(i) 23개 뉴클레오타이드의 길이;
(ii) 위치 1, 3 내지 5, 7, 8, 10 내지 13, 15, 및 17 내지 23에서의 2'-OMe 변형, 및 위치 2, 6, 9, 14, 및 16에서의 2'-F 변형(5' 말단으로부터 계수함); 및
(iii) 뉴클레오타이드 위치 1과 2 사이, 뉴클레오타이드 위치 2와 3 사이, 뉴클레오타이드 위치 21과 22 사이, 및 뉴클레오타이드 위치 22와 23 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결(5' 말단에서 계수함);
여기서, RNAi 제제는 안티센스 가닥의 3'-말단에 2개의 뉴클레오타이드 오버행을, 그리고 안티센스 가닥의 5'-말단에 둔화 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 RNAi 제제는 다음을 포함하며:
(a) 다음을 갖는 센스 가닥:
(i) 21개 뉴클레오타이드의 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 상기 ASGPR 리간드는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, ASGPR 리간드;
(iii) 위치 1 내지 6, 8 및 12 내지 21에서의 2'-OMe 변형, 및 위치 7 및 9 내지 11에서의 2'-F 변형; 및
(iv) 뉴클레오타이드 위치 1과 2 사이, 및 뉴클레오타이드 위치 2와 3 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결(5' 말단으로부터 계수함);
및
(b) 다음을 갖는 안티센스 가닥:
(i) 23개 뉴클레오타이드의 길이;
(ii) 위치 1, 3 내지 5, 7, 10 내지 13, 15, 및 17 내지 23에서의 2'-OMe 변형, 및 위치 2, 6, 8, 9, 14, 및 16에서의 2'-F 변형(5' 말단으로부터 계수함); 및
(iii) 뉴클레오타이드 위치 1과 2 사이, 뉴클레오타이드 위치 2와 3 사이, 뉴클레오타이드 위치 21과 22 사이, 및 뉴클레오타이드 위치 22와 23 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결(5' 말단에서 계수함);
여기서, RNAi 제제는 안티센스 가닥의 3'-말단에 2개의 뉴클레오타이드 오버행을, 그리고 안티센스 가닥의 5'-말단에 둔화 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 RNAi 제제는 다음을 포함하며:
(a) 다음을 갖는 센스 가닥:
(i) 19개 뉴클레오타이드의 길이;
(ii) 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 상기 ASGPR 리간드는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, ASGPR 리간드;
(iii) 위치 1 내지 4, 6 및 10 내지 19에서의 2'-OMe 변형 및 위치 5 및 7 내지 9에서의 2'-F 변형; 및
(iv) 뉴클레오타이드 위치 1과 2 사이, 및 뉴클레오타이드 위치 2와 3 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 연결(5' 말단으로부터 계수함);
및
(b) 다음을 갖는 안티센스 가닥:
(i) 21개 뉴클레오타이드의 길이;
(ii) 위치 1, 3 내지 5, 7, 10 내지 13, 15, 및 17 내지 21에서의 2'-OMe 변형, 및 위치 2, 6, 8, 9, 14, 및 16에서의 2'-F 변형(5' 말단으로부터 계수함); 및
(iii) 뉴클레오타이드 위치 1과 2 사이, 뉴클레오타이드 위치 2와 3 사이, 뉴클레오타이드 위치 19와 20 사이, 및 뉴클레오타이드 위치 20과 21 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합(5' 말단에서 계수함);
여기서, RNAi 제제는 안티센스 가닥의 3'-말단에 2개의 뉴클레오타이드 오버행을, 그리고 안티센스 가닥의 5'-말단에 둔화 말단을 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 iRNA는 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나에 열거된 제제로부터 선택된 제제이다. 이들 제제는 리간드를 추가로 포함할 수 있다.
IV. 리간드에 접합된 iRNA
본 발명의 iRNA의 RNA의 또 다른 변형은, 예를 들어, 세포로의 iRNA의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키는 iRNA 하나 이상의 리간드, 모이어티 또는 접합체에 화학적으로 결합하는 것을 포함한다. 이러한 모이어티는 콜레스테롤 모이어티와 같은 지질 모이어티를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다(문헌참조: Letsinger 등, Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553~6556). 다른 구현예에서, 리간드는 콜산(문헌참조: Manoharan 등, Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053~1060), 티오에테르, 예를 들어, 베릴-S-트리틸티올(문헌참조: Manoharan 등, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306~309; Manoharan 등, Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765~2770), 티오콜레스테롤(문헌참조: Oberhauser 등, Nucl. Acids Res., 1992, 20:533~538), 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(문헌참조: Saison-Behmoaras 등, EMBO J, 1991, 10:1111~1118; Kabanov 등, FEBS Lett., 1990, 259:327~330; Svinarchuk 등, Biochimie, 1993, 75:49~54), 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-포스포네이트(문헌참조: Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651~3654; Shea 등, Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777~3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(문헌참조: Manoharan 등, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969~973), 또는 아다만탄 아세트산(문헌참조: Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651~3654), 손바닥 모이어티(문헌참조: Mishra 등, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229~237), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐옥시콜레스테롤 모이어티(문헌참조: Crooke 등, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923~937)이다.
특정 구현예에서, 리간드는 이것이 혼입되는 iRNA 제제의 분포, 표적화 또는 수명을 변경시킨다. 일부 구현예에서 리간드는, 예를 들어, 이러한 리간드가 부재하는 종과 비교하여 선택된 표적, 예를 들어, 분자, 세포 또는 세포 유형, 구획, 예를 들어 세포 또는 기관 구획, 조직, 기관 또는 신체의 영역에 대해 증진된 친화성을 제공한다. 일부 구현예에서, 리간드는 듀플렉스된 핵산에서 듀플렉스 쌍형성에 관여하지 않는다.
리간드는 천연 발생 물질, 예컨대 단백질(예를 들어, 인간 혈청 알부민(HSA), 저밀도 지질단백질(LDL) 또는 글로불린); 탄수화물(예를 들어, 덱스트란, 풀루란, 키틴, 키토산, 이눌린, 시클로덱스트린, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민 또는 히알루론산); 또는 지질을 포함할 수 있다. 리간드는 또한 합성 중합체, 예를 들어, 합성 폴리아미노산과 같은 재조합 또는 합성 분자일 수 있다. 폴리아미노산의 예는 폴리라이신(PLL), 폴리 L-아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 스티렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리(L- 락티드-코-글리콜화된) 공중합체, 디비닐 에테르-말레산 무수물 공중합체, N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드 공중합체 (HMPA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 중합체 또는 폴리포스파진을 포함한다. 폴리아민의 예는 다음을 포함한다: 폴리에틸렌이민, 폴리리신(PLL), 스퍼민, 스퍼미딘, 폴리아민, 슈도펩타이드-폴리아민, 펩티도미메틱 폴리아민, 덴드리머 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 지질, 양이온성 포르피린, 폴리아민의 4차 염 또는 알파 나선 펩타이드.
리간드는 또한 표적화 군, 예를 들어, 세포 또는 조직 표적화 제제, 예를 들어, 렉틴, 당단백질, 지질 또는 단백질, 예를 들어, 콩팥 세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 표적화 그룹은 티로트로핀, 멜라노트로핀, 렉틴, 당단백질, 계면활성제 단백질 A, 뮤신 탄수화물, 다가 락토스, 다가 갈락토스, N-아세틸-갈락토스아민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노스, 다가 푸코스, 글리코실화된 폴리아미노산, 다가 갈락토스, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타메이트, 폴리아스파르테이트, 지질, 콜레스테롤, 스테로이드, 담즙산, 폴레이트, 비타민 B12, 비타민 A, 비오틴, 또는 RGD 펩타이드 또는 RGD 펩타이드 모사체일 수 있다. 특정 구현예에서, 리간드는 다가 갈락토스, 예를 들어, N-아세틸-갈락토사민이다.
리간드의 다른 예는 염료, 중간증량제(예를 들어, 아크리딘), 가교제(예를 들어, 소랄렌, 미토마이신 C), 포르피린(TPPC4, 텍사피린, 삭피린), 다환 방향족 탄화수소(예를 들어, 페나진, 디히드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제(예를 들어, EDTA), 친유성 분자, 예를 들어, 콜레스테롤, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-Bis-O(헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥실기, 헥사데실글리세롤, 보르놀, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실기, 팔미트산, 미리스트산,O3-(올레오일)리소콜산, O3-(올레오일)콜레산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진) 및 펩타이드 접합체(예를 들어, 안테나피디아 펩타이드, Tat 펩타이드), 알킬화제, 포스페이트, 아미노, 메르캅토, PEG(예를 들어, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사성 표지된 마커, 효소, 합텐(예를 들어, 비오틴), 수송/흡수 촉진자(예를 들어, 아스피린, 비타민 E, 엽산), 합성 리보뉴클레아제(예를 들어, 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 접합체, 테트라아자마크로사이클의 Eu3+ 복합체), 디니트로페닐, HRP, 또는 AP를 포함한다.
리간드는 단백질, 예를 들어, 당단백질, 또는 펩타이드, 예를 들어, 공동-리간드에 대한 특이적 친화성을 갖는 분자, 또는 항체, 예를 들어, 간세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는 항체일 수 있다. 리간드는 또한 호르몬 및 호르몬 수용체를 포함할 수 있다. 이들은 또한 비-펩타이드 종, 예를 들어, 지질, 렉틴, 탄수화물, 비타민, 조인자, 다가 락토스, 다가 갈락토스, N- 아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노스 또는 다가 푸코스를 포함할 수 있다. 리간드는, 예를 들어, 리포폴리사카라이드, p38 MAP 키나제의 활성화제 또는 NF-κB의 활성화제일 수 있다.
리간드는, 예를 들어, 세포의 미세소관, 마이크로필라멘트 또는 중간 필라멘트를 붕괴시킴에 의해 세포의 세포골격을 예를 들어 파괴함으로써 iRNA 제제의 세포로의 흡수를 증가시킬 수 있는 물질, 예를 들어 약물일 수 있다. 약물은, 예를 들어, 탁솔, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 시토칼라신, 노코다졸, 자플라키놀리드, 라트린쿨린 A, 팔로이딘, 스윈홀리드 A, 인다노신, 또는 미오세빈일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 것과 같은 iRNA에 부착된 리간드는 약동학적 조절제(PK 조절제)로서 작용한다. PK 조절제는 친유성체, 담즙산, 스테로이드, 인지질 유사체, 펩타이드, 단백질 결합제, PEG, 비타민 등을 포함한다. 예시적인 PK 조절제는 콜레스테롤, 지방산, 콜산, 리토콜산, 디알킬글리세리드, 디아실글리세리드, 인지질, 스핑고지질, 나프록센, 이부프로펜, 비타민 E, 비오틴 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다수의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 또한 혈청 단백질에 결합하는 것으로 알려져 있고, 따라서, 짧은 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 골격 내 다수의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 약 5개 염기, 10개 염기, 15개 염기 또는 20개 염기의 올리고뉴클레오타이드도 본 발명에 리간드로서(예를 들어, PK 조절 리간드로서) 적용될 수 있다. 또한, 혈청 성분(예를 들어, 혈청 단백질)에 결합하는 압타머 또한 본원에 기술된 구현예에서 PK 조절 리간드로서 사용하기에 적합하다.
본 발명의 리간드-접합 iRNA는 (하기에서 기술하는 것과 같이) 올리고뉴클레오타이드 상으로의 결합 분자의 부착으로부터 유래된 것과 같은 펜던트 반응성 관능기를 함유하는 올리고뉴클레오타이드의 사용에 의해 합성될 수 있다. 이러한 반응성 올리고뉴클레오타이드는 상업적으로 이용가능한 리간드, 임의의 다양한 보호기를 보유하는 합성된 리간드, 또는 이에 부착된 결합 모이어티를 갖는 리간드와 직접 반응할 수 있다.
본 발명의 접합체에 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 널리 공지된 고체상 합성 기술을 통해 편리하고 통상적으로 제조될 수 있다. 그러한 합성을 위한 기기는 여러 판매업자에 의해 시판되고 있고, 예를 들어, Applied Biosystems®(Foster City, Calif.)을 포함한다. 당업계에 공지된 그러한 합성을 위한 임의의 다른 방법은 추가로 또는 대안적으로 사용될 수 있다. 또한 다른 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체를 제조하기 위한 유사한 기술을 사용하는 것이 공지되어 있다.
본 발명의 리간드-접합된 iRNA 및 리간드-분자 함유 서열-특이적 연결된 뉴클레오시드에서, 올리고뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오사이드는 표준 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 전구체, 또는 이미 연결 모이어티를 보유하는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 접합 전구체, 이미 리간드 분자를 보유하는 리간드-뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드-접합체 전구체, 또는 비-뉴클레오사이드 리간드-보유 빌딩 블록을 사용하여 적합한 DNA 합성기 상에서 제조될 수 있다.
이미 연결 모이어티를 보유하는 뉴클레오사이드 접합 전구체를 사용하는 경우, 서열-특이적 연결된 뉴클레오사이드의 합성은 통상적으로 완료되고, 리간드 분자는 연결 모이어티와 반응하여 리간드-접합 올리고뉴클레오타이드를 형성한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 또는 연결된 뉴클레오사이드는 상업적으로 이용가능하고 올리고뉴클레오타이드 합성에 통상적으로 사용되는 표준 포스포르아미디트 및 비표준 포스포르아미디트에 추가하여 리간드-뉴클레오사이드 접합체로부터 유래된 포스포르아미디트를 사용하여 자동화된 합성기에 의해 합성된다.
A. 지질 접합체
특정 구현예에서, 리간드 또는 접합체는 지질 또는 지질 기반 분자이다. 그러한 지질 또는 지질 기반 분자는 혈청 단백질, 예를 들어, 인간 혈청 알부민(HSA)에 결합할 수 있다. HSA 결합 리간드는 표적 조직, 예를 들어, 신체의 비-콩팥 표적 조직으로의 접합체의 분포를 가능하게 한다. 예를 들어, 표적 조직은 간의 실질 세포를 포함하는 간일 수 있다. HSA에 결합할 수 있는 다른 분자는 또한 리간드로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 나프록센 또는 아스피린이 사용될 수 있다. 지질 또는 지질 기반 리간드는 (a) 접합체의 분해에 대한 내성을 증가시킬 수 있거나, (b) 표적 세포 또는 세포막으로의 표적화 또는 수송을 증가시킬 수 있거나, (c) 혈청 단백질, 예를 들어, HSA로의 결합을 조정하는 데에 사용될 수 있다.
또한 지질 기반 리간드를 사용하여 접합체의 표적 조직으로의 결합을 억제, 예를 들어, 제어할 수 있다. 예를 들어, 보다 강하게 HSA에 결합하는 지질 또는 지질 기반 리간드는 콩팥으로 표적화될 가능성이 적고 따라서 신체로부터 제거될 가능성이 적다. HSA에 덜 강하게 결합하는 지질 또는 지질 기반 리간드를 사용하여 접합체를 콩팥에 표적화시킬 수 있다.
특정 구현예에서, 지질 기반 리간드는 HSA에 결합한다. 일부 구현예에서, 이는 접합체가 비-콩팥 조직에 분포되기에 충분한 친화도로 HSA에 결합한다. 그러나, 친화성은 HSA-리간드 결합이 역행될 수 없을 정도로 강하지 않는 것이 바람직하다.
다른 구현예에서, 지질 기반 리간드는 HSA에 약하게 결합하거나 전혀 결합하지 않아, 접합체가 콩팥에 분포될 것이다. 콩팥 세포를 표적화하는 다른 모이어티는 또한 지질 기반 리간드 대신에 또는 이에 추가로 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 리간드는 모이어티, 예를 들어, 표적 세포, 예를 들어, 증식 세포에 의해 흡수되는 비타민이다. 이들은 특히, 예를 들어, 악성 또는 비악성 유형의 원치 않는 세포 증식을 특징으로 하는 장애, 예를 들어 암세포를 치료하는 데에 유용하다. 예시적인 비타민은 비타민 A, E, 및 K를 포함한다. 다른 예시적인 비타민은 B 비타민, 예를 들어, 폴산, B12, 리보플라빈, 비오틴, 피리독살 또는 간 세포와 같은 표적 세포에 의해 흡수되는 다른 비타민 또는 영양물을 포함한다. 또한 HSA 및 저밀도 지질단백질(LDL)이 포함된다.
B. 세포 투과 제제
또 다른 양태에서, 리간드는 나선 세포-투과 제제와 같은 세포-투과 제제이다. 일부 구현예에서, 제제는 양친매성이다. 예시적인 제제는 tat 또는 안테노페디아와 같은 펩타이드이다. 제제가 펩타이드인 경우, 이는 펩티딜모사체, 인버토머, 비펩타이드 또는 슈도-펩타이드 연결 및 D-아미노산의 사용을 포함하여 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 나선형 제제는 친유성 및 소유성 상을 갖는 알파-나선 제제이다.
리간드는 펩타이드 또는 펩티도모사체일 수 있다. (본원에서 올리고펩티도모사체라고도 지칭되는) 펩티도모사체는 천연 펩타이드와 유사한 한정된 3차원 구조로 폴딩할 수 있는 분자이다. iRNA 제제로의 펩타이드 및 펩티도모사체의 부착은 예를 들어, 세포 인지 및 흡착을 증진시킴에 의해 iRNA의 약동학적 분포에 영향을 미칠 수 있다. 펩타이드 또는 펩티도모사체 모이어티는 약 5~50개 아미노산 길이, 예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개 아미노산 길이일 수 있다.
펩타이드 또는 펩티도모사체는 예를 들어, 세포 투과 펩타이드, 양이온성 펩타이드, 양친매성 펩타이드 또는 소수성 펩타이드(예를 들어, 주로 Tyr, Trp, 또는 Phe로 이루어진)일 수 있다. 펩타이드 모이어티는 덴드리머 펩타이드, 구속된 펩타이드 또는 가교결합된 펩타이드일 수 있다. 또 다른 대안에서, 펩타이드 모이어티는 소수성 막 전좌 서열(MTS)을 포함할 수 있다. 예시적인 소수성 MTS-함유 펩타이드는 아미노산 서열 AAVALLPAVLLALLAP(서열번호 14)를 갖는 RFGF이다. 소수성 MTS를 함유하는 RFGF 유사체(예를 들어, 아미노산 서열 AALLPVLLAAP(서열번호 15)는 또한 표적화 모이어티일 수 있다. 펩타이드 모이어티는 "전달" 펩타이드일 수 있으며, 이는 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 및 단백질을 포함하는 큰 극성 분자를 세포막을 가로질러 운반할 수 있다. 예를 들어, HIV Tat 단백질(GRKKRRQRRRPPQ(서열번호 16) 및 드로소필라 안테나피디아 단백질(RQIKIWFQNRRMKWKK(서열번호 17)) 유래의 서열은 전달 펩타이드로서 기능할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 펩타이드 또는 펩티도모사체는 DNA의 무작위 서열, 예를 들어 파지-디스플레이 라이브러리, 또는 OBOC(one-bead-one-compound) 조합 라이브러리로부터 식별된 펩타이드)에 의해 암호화될 수 있다(문헌참조: Lam 등, Nature, 354:82~84, 1991. 세포 표적화 목표를 위해 혼입된 단량체 단위를 통해 dsRNA 제제에 테터링된 펩타이드 또는 펩티도모사체의 예는 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD)-펩타이드, 또는 RGD 모방체이다. 펩타이드 모이어티는 길이가 약 5개 아미노산 내지 약 40개 아미노산 범위일 수 있다. 펩타이드 모이어티는 예를 들어, 안정성을 증가시키거나 형태적 성질을 지시하기 위해 구조적 변형을 가질 수 있다. 하기 기술된 임의의 구조적 변형이 사용될 수 있다.
발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 RGD 펩타이드는 선형 또는 환형일 수 있고, 변형되어, 예를 들어, 글리코실화되거나 메틸화되어 특이적 조직(들)로의 표적화를 촉진시킬 수 있다. RGD-함유 펩타이드 및 펩티도모사체는 합성 RGD 모방체 뿐만 아니라 D-아미노산을 포함할 수 있다. RGD에 추가로, 당업자는 인테그린 리간드를 표적으로 하는 다른 모이어티, 예를 들어, PECAM-1 또는 VEGF를 사용할 수 있다.
"세포 투과 펩타이드"는 세포, 예를 들어, 박테리아 또는 진균류 세포와 같은 미생물 세포, 또는 인간 세포와 같은 포유동물 세포를 투과할 수 있다. 미생물 세포-투과 펩타이드는 예를 들어, α-나선 선형 펩타이드(예를 들어, LL-37 또는 세로핀 P1), 디설파이드 결합-함유 펩타이드(예를 들어, α-데펜신, β-데펜신 또는 박테네신), 또는 단지 하나 또는 2개의 주요 아미노산을 함유하는 펩타이드(예를 들어, PR-39 또는 인돌리시딘)일 수 있다. 또한 세포 투과 펩타이드는 핵 국소화 신호(NLS)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포 투과 펩타이드는 HIV-1 gp41의 융합 펩타이드 도메인 및 SV40 대형 T 항원의 NLS로부터 유래된 MPG와 같은 이분형 양친매성 펩타이드일 수 있다(문헌참조: Simeoni 등, Nucl. Acids Res. 31:2717~2724, 2003).
C. 탄수화물 접합체
발명의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, iRNA는 추가로 탄수화물을 포함한다. 탄수화물 접합된 iRNA는 본원에 기술된 것과 같이, 핵산의 생체내 전달뿐만 아니라 생체내 치료적 사용에 적합한 조성물에 유리하다. 본원에서 사용된 것과 같이, "탄수화물"은 각각의 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 함께 적어도 6개의 탄소 원자를 갖는 하나 이상의 단당류 유닛(선형, 분지형 또는 환형일 수 있는)으로 이루어진 탄수화물 자체인 화합물; 또는 이의 일부로서 각각의 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 함께 각각 적어도 6개의 탄소 원자를 갖는 하나 이상의 단당류 유닛(선형, 분지형 또는 환형일 수 있는)으로 이루어진 탄수화물 모이어티를 갖는 화합물을 지칭한다. 대표적인 탄수화물은 당(모노-, 디-, 트리-, 및 약 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 단당류 유닛을 함유하는 올리고사카라이드) 및 폴리사카라이드, 예를 들어, 전분, 글리코겐, 셀룰로스 및 폴리사카라이드 검을 포함한다. 특이적 단당류는 C5 이상(예를 들어, C5, C6, C7, 또는 C8) 당을 포함하고; 이당류 및 삼당류는 2개 또는 3개의 단당류 유닛(예를 들어, C5, C6, C7, 또는 C8)을 갖는 당을 포함한다.
특정 구현예에서, 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 탄수화물 접합체는 단당류이다.
특정 구현예에서, 단당류는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)이다. 하나 이상의 N-아세틸갈락토스아민(GalNAc) 유도체를 포함하는 GalNAc 접합체는 예를 들어, 미국 특허번호 제8,106,022호에 기술되어 있고, 이의 전문은 본원에 참조로 인용된다. 일부 구현예에서, GalNAc 접합체는 iRNA를 특정 세포로 표적화하는 리간드로서 작용한다. 일부 구현예에서, GalNAc 접합체는 예를 들어, 간 세포(예를 들어, 간 세포(hepatocyte))의 아시알로당단백질(asialoglycoprotein) 수용체에 대해 리간드로서 작용함에 의해 iRNA를 간 세포로 표적화한다.
일부 구현예에서, 탄수화물 접합체는 하나 이상의 GalNAc 유도체를 포함한다. GalNAc 유도체는 링커, 예를 들어, 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, GalNAc 접합체는 센스 가닥의 3' 말단에 접합된다. 일부 구현예에서, GalNAc 접합체는 링커, 예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은 링커를 통해 iRNA 제제에 (예를 들어, 센스 가닥의 3' 말단에) 접합된다. 일부 구현예에서, GalNAc 접합체는 센스 가닥의 5' 말단에 접합된다. 일부 구현예에서, GalNAc 접합체는 링커, 예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은 링커를 통해 iRNA 제제에 (예를 들어, 센스 가닥의 5' 말단에) 접합된다.
본 발명의 특정 구현예에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 1가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 제제에 부착된다. 일부 구현예에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 2가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 제제에 부착된다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 3가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 제제에 부착된다. 본 발명의 다른 구현에에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 4가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 제제에 부착된다.
특정 구현예에서, 발명의 이중 가닥 RNAi 제제는 iRNA 제제에 부착된 하나의 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함한다. 특정 구현예에서, 발명의 이중 가닥 RNAi 제제는 다수의(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6개) GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함하고, 각각은 독립적으로 다수의 1가 링커를 통해 이중가닥 RNAi 제제의 다수의 뉴클레오타이드에 부착된다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 본 발명의 iRNA 제제의 2개의 가닥이 하나의 가닥의 3'-말단과 별개의 다른 가닥의 5'-말단 사이에 중단되지 않은 뉴클레오타이드 쇄에 의해 연결되어 다수의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드를 포함하는 헤어핀 루프를 형성하는 하나의 더 큰 분자의 일부인 경우, 헤어핀 루프 내 각각의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드는 1가 링커를 통해 부착된 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 독립적으로 포함할 수 있다. 헤어핀 루프는 또한 듀플렉스의 하나의 가닥에 연장된 오버행에 의해 형성될 수 있다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 본 발명의 iRNA 제제의 2개의 가닥이 하나의 가닥의 3'-말단과 별개의 다른 가닥의 5'-말단 사이에 중단되지 않은 뉴클레오타이드 쇄에 의해 연결되어 다수의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드를 포함하는 헤어핀 루프를 형성하는 하나의 더 큰 분자의 일부인 경우, 헤어핀 루프 내 각각의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드는 1가 링커를 통해 부착된 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 독립적으로 포함할 수 있다. 헤어핀 루프는 또한 듀플렉스의 하나의 가닥에 연장된 오버행에 의해 형성될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 탄수화물 접합체는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
, 여기서, Y는 O 또는 S이고, n은 3~6이고(화학식 XXIV);
, 여기서, Y는 O 또는 S이고, n은 3~6이고(화학식 XXV);
, 여기서 X는 O 또는 S이고(화학식 XXVII);
화학식 XXXIV.
또 다른 구현예에서, 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 탄수화물 접합체는 단당류이다. 일 구현예에서, 단당류는 N-아세틸갈락토사민, 예컨대
화학식 II이다.
일부 구현예에서, RNAi 제제는 하기의 도식에 나타낸 것과 같이 링커를 통해 탄수화물 접합체에 부착되고, 여기서 X는 O 또는 S이다.
일부 구현예에서, RNAi 제제는 표 1에 정의되고 아래에 도시된 것과 같이 L96에 접합된다:
본원에 기술된 구현예에 사용하기 위한 또 다른 대표적인 탄수화물 접합체는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않고
(화학식 XXXVI), X 또는 Y 중 하나가 올리고뉴클레오타이드인 경우, 다른 하나는 수소이다.
일부 구현예에서, 적합한 리간드는 국제특허번호 제2019/055633호에 기술된 리간드이고, 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다. 일 구현예에서, 리간드는 하기의 구조를 포함한다:
본 발명의 특정 구현예에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 1가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 제제에 부착된다. 일부 구현예에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 2가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 제제에 부착된다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 3가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 제제에 부착된다.
일 구현예에서, 발명의 이중 가닥 RNAi 제제는 iRNA 제제에 부착된 하나 이상의 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함한다. GalNAc은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상에서 링커를 통해 임의의 뉴클레오타이드에 부착될 수 있다. GalNac는 센스 가닥의 5'-말단, 센스 가닥의 3'-말단, 안티센스 가닥의 5'-말단 또는 안티센스 가닥의 3'-말단에 부착될 수 있다. 일 구현예에서, GalNAc은, 예를 들어, 3가 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 부착된다.
다른 구현예에서, 발명의 이중 가닥 RNAi 제제는 다수의(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6개) GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함하고, 각각은 독립적으로 다수의 링커, 예를 들어 1가 링커를 통해 이중가닥 RNAi 제제의 다수의 뉴클레오타이드에 부착된다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 본 발명의 iRNA 제제의 2개의 가닥이 하나의 가닥의 3'-말단과 별개의 다른 가닥의 5'-말단 사이에 중단되지 않은 뉴클레오타이드 쇄에 의해 연결되어 다수의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드를 포함하는 헤어핀 루프를 형성하는 하나의 더 큰 분자의 일부인 경우, 헤어핀 루프 내 각각의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드는 1가 링커를 통해 부착된 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 독립적으로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 탄수화물 접합체는 전술된 하나 이상의 추가 리간드, 예를 들어 PK 조절제 또는 세포 투과 펩타이드를 추가로 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용하기에 적합한 추가 탄수화물 접합체 및 링커는 PCT 공개번호 국제특허번호 제2014/179620호 및 국제특허번호 제2014/179627호에 기술된 것들을 포함하고, 이의 각각의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
D. 링커
일부 구현예에서, 본원에 기술된 접합체 또는 리간드는 절단될 수 있거나 절단될 수 없는 다양한 링커로 iRNA 올리고뉴클레오타이에 부착될 수 있다.
용어 "링커" 또는 "결합기"는 화합물의 두 부분을 연결하는, 예를 들어 화합물의 두 부분을 공유적으로 부착시키는 유기 모이어티를 의미한다. 링커는 통상적으로 직접 결합 또는 산소 또는 황과 같은 원자, NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH와 같은 단위 또는 원자 사슬, 예를 들어, 하지만 비제한적으로, 치환되거나 비치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 알케닐, 치환되거나 비치환된 알키닐, 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐, 헤테로아릴알킬, 헤테로아릴알케닐, 헤테로아릴알키닐, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로사이클릴알케닐, 헤테로사이클릴알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬아릴알킬, 알킬아릴알케닐, 알킬아릴알키닐, 알케닐아릴알킬, 알케닐아릴알케닐, 알케닐아릴알키닐, 알키닐아릴알킬, 알키닐아릴알케닐, 알키닐아릴알키닐, 알킬헤테로아릴알킬, 알킬헤테로아릴알케닐, 알킬헤테로아릴알키닐, 알케닐헤테로아릴알킬, 알케닐헤테로아릴알케닐, 알케닐헤테로아릴알키닐, 알키닐헤테로아릴알킬, 알키닐헤테로아릴알케닐, 알키닐헤테로아릴알키닐, 알킬헤테로사이클릴알킬, 알킬헤테로사이클릴알케닐, 알킬헤테로사이클릴알키닐, 알케닐헤테로사이클릴알킬, 알케닐헤테로사이클릴알케닐, 알케닐헤테로사이클릴알키닐, 알키닐헤테로사이클릴알킬, 알키닐헤테로사이클릴알케닐, 알키닐헤테로사이클릴알키닐, 알킬아릴, 알케닐아릴, 알키닐아릴, 알킬헤테로아릴, 알케닐헤테로아릴, 알키닐헤테로아릴을 포함하고, 여기서 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), 치환되거나 비치환된 아릴, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴, 또는 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릭에 의해 중단되거나 종결될 수 있고; 여기서 R8은 수소, 아실, 지방족 또는 치환된 지방족이다. 일 구현예에서, 링커는 약 1~24개 원자, 2~24, 3~24, 4~24, 5~24, 6~24, 6~18, 7~18, 8~18, 7~17, 8~17, 6~16, 7~17, 또는 8~16개 원자이다.
절단가능한 결합기는 세포 외부에서 충분히 안정할 수 있지만 표적 세포로 진입 시 절단되어 링커가 함께 유지하고 있는 2개의 부분을 방출시키는 그룹이다. 일 구현예에서, 절단가능한 결합기는 대상체의 혈액에서 또는 제2 참조 조건(예를 들어, 혈액 또는 혈청 중에서 발견되는 조건을 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있는) 하에서 보다 표적 세포에서 또는 제1 참조 조건(예를 들어, 세포내 조건을 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있는) 하에서 적어도 약 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배 이상 또는 적어도 100배 더 신속하게 절단된다.
절단가능한 결합기는 절단제, 예를 들어, pH, 산화환원 전위 또는 분해 분자의 존재에 민감할 수 있다. 일반적으로, 절단제는 혈청 또는 혈액에서 보다 세포 내부에서 보다 높은 수준 또는 활성인 상태로 보다 만연해 있거나 발견된다. 그러한 분해제의 예는 다음을 포함한다: 특정 기질에 대해 선택되거나 어떠한 기질 특이성을 갖지 않는 산화환원제로서, 이는 예를 들어, 산화 또는 환원 효소 또는 환원제, 예를 들어, 환원에 의해 산화환원 절단가능한 결합기를 분해시킬 수 있는 세포에 존재하는 머캅탄을 포함하는 산화환원제; 에스테라제; 엔도좀 또는 산성 환경을 생성시킬 수 있는 제제, 예를 들어, 5 이하의 pH를 유도하는 것들; 일반산으로서 작용함에 의해 산 절단가능한 결합기를 가수분해시키거나 분해할 수 있는 효소, 펩티다제(이는 기질 특이적일 수 있다), 및 포스파타제.
절단가능한 결합기, 예를 들어, 디설파이드 결합은 pH에 민감할 수 있다. 사람 혈청의 pH는 7.4이고, 평균 세포내 pH는 약간 더 낮아 약 7.1~7.3 범위이다. 엔도좀은 5.5~6.0의 범위에서 보다 산성의 pH를 갖고, 리소좀은 약 5.0에서 심지어 보다 산성의 pH를 갖는다. 일부 링커는 선택된 pH에서 절단되어 세포 내부의 리간드로부터 양이온성 지질을 방출하거나 세포의 목적하는 구획으로 양이온성 지질을 방출하는 절단가능한 결합기를 갖는다.
링커는 특정 효소에 의해 절단될 수 있는 절단가능한 결합기를 포함할 수 있다. 링커로 혼입된 절단가능한 결합기의 유형은 표적화될 세포에 의존할 수 있다. 예를 들어, 간-표적화 리간드는 에스테르 군을 포함하는 링커를 통해 양이온성 지질에 결합될 수 있다. 간 세포는 에스테라제가 풍부함으로, 링커는 에스테라제가 풍부하지 않은 세포 유형에서 보다 간 세포에서 보다 효율적으로 절단된다. 에스테라제가 풍부한 다른 세포 유형은 폐, 신피질 및 고환의 세포를 포함한다.
펩타이드 결합을 함유하는 링커는 간 세포 및 활막세포와 같은 펩티다제가 풍부한 세포 유형을 표적화하는 경우 사용될 수 있다.
일반적으로, 후보 절단가능한 결합기의 적합성은 후보 결합기를 절단하는 분해제(또는 조건)의 능력을 시험함으로써 평가될 수 있다. 또한 혈액 내에서 또는 다른 비표적 조직과 접촉할 때 절단에 저항하는 능력에 대해 후보 절단가능한 결합기를 테스트하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 따라서, 당업자는 제1 조건 과 제2 조건 사이의 절단에 대한 상대적인 감수성을 결정할 수 있고, 여기서 제1 조건은 표적 세포에서 절단을 나타내도록 선택되고, 제2 조건은 다른 조직 또는 생물학적 유체, 예를 들어 혈액 또는 혈청 내 절단을 나타내도록 선택된다. 평가는 무세포 시스템, 세포, 세포 배양물, 기관 또는 조직 배양물 또는 전체 동물에서 수행될 수 있다. 무세포 또는 배양 조건에서 초기 평가를 수행하고 전체 동물에서 추가적으로 평가함으로써 확인하는 것이 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, 유용한 후보 화합물은 혈액 또는 혈청(또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하에서)과 비교하여 세포(또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하에서)에서 적어도 약 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100배 더 신속하게 절단된다.
i. 산화환원 절단가능한 결합기
특정 구현예에서, 절단가능한 결합기는 환원 또는 산화 시 절단되는 산화환원 절단가능한 결합기이다. 환원 절단가능한 결합기의 예는 디설파이드 결합기(-S-S-)이다. 후보 절단 가능한 결합기가 적합한 "환원 절단가능한 결합기"인지 또는 예를 들어 특정 iRNA 모이어티 및 특정 표적화제와 함께 사용하기에 적합한지의 여부를 결정하기 위해, 당업자는 본원에 기술된 방법을 살펴볼 수 있다. 예를 들어, 후보물은 세포, 예를 들어 표적 세포에서 관찰되는 절단 속도를 모방하는 당업계에 공지된 시약을 사용하여 디티오트레이톨(DTT) 또는 기타 환원제를 사용한 항온처리에 의해 평가될 수 있다. 후보물은 또한 혈액 또는 혈청 조건을 모방하도록 선택된 조건 하에서 평가될 수 있다. 하나에서, 후보 화합물은 혈액에서 최대 약 10%만큼 절단된다. 다른 구현예에서, 유용한 후보 화합물은 혈액(또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건하에서)과 비교하여 세포(또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건하에서)에서 적어도 약 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 약 100배 보다 신속하게 분해 된다. 후보 화합물의 절단 속도는 세포내 배지를 모방하도록 선택된 조건 및 세포외 배지를 모방하도록 선택된 조건과 비교하여 표준 효소 동역학 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
ii. 포스페이트 기반 절단가능한 결합기
다른 구현예에서, 절단가능한 링커는 포스페이트 기반 절단가능한 결합기를 포함한다. 표스페이트 기반 절단가능한 결합기는 포스페이트 그룹을 분해하거나 가수분해하는 제제에 의해 절단된다. 세포에서 포스페이트 그룹을 절단하는 제제의 예는 세포의 포스파타제와 같은 효소이다. 포스파타제 기반 결합기의 예는 -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)( Rk)-S-이고, 여기서 Rk는 각 경우에 독립적으로 C1-C20 알킬, C1-C20 할로알킬, C6-C10 아릴 또는 C7-C12 아르알킬일 수 있다. 예시적인 구현예는 -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, 및 -O-P(S)(H)-S-를 포함한다. 특정 구현예에서, 포스페이트-기반 결합기는 -O-P(O)(OH)-O-이다. 이들 후보물은 전술된 것들과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
iii. 산 절단가능한 결합기
다른 구현예에서, 절단가능한 링커는 산 절단가능한 결합기를 포함한다. 산 절단가능한 결합기는 산성 조건 하에서 절단되는 결합기이다. 일부 구현예에서, 산 절단가능한 결합기는 pH가 약 6.5 이하(예를 들어, 약 6.0, 5.5, 5.0 이하)인 산성 환경에서 또는 일반 산으로서 작용할 수 있는 효소와 같은 제제에 의해 절단된다. 세포에서, 엔도좀 및 리소좀과 같은 특정 낮은 pH 기관은 산 절단가능한 결합기에 대한 절단 환경을 제공할 수 있다. 산 절단가능한 결합기의 예는 하이드라존, 에스테르, 및 아미노산의 에스테르를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 산 절단가능한 그룹은 화학식 -C=NN-, C(O)O, 또는 -OC(O)를 가질 수 있다. 예시적인 구현예는 에스테르의 산소에 부착된 탄소(알콕시 그룹)가 아릴 그룹, 치환된 알킬 그룹 또는 3급 알킬 그룹, 예를 들어, 디메틸 펜틸 또는 t-부틸인 경우이다. 이들 후보물은 전술된 것들과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
iv. 에스테르 기반 결합기
다른 구현예에서, 절단가능한 링커는 에스테르 기반 절단가능한 결합기를 포함한다. 에스테르 기반 절단가능한 결합기는 세포내 에스테라제 및 아미다제와 같은 효소에 의해 절단된다. 에스테르 기반 절단가능한 결합기의 예는 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌 그룹의 에스테르를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 에스테르 절단가능한 결합기는 화학식 -C(O)O- 또는 -OC(O)-를 갖는다. 이들 후보물은 전술된 것들과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
v. 펩타이드 기반 절단기
또 다른 구현예에서, 절단가능한 링커는 펩타이드 기반 절단가능한 결합기를 포함한다. 펩타이드 기반 절단가능한 결합기 세포내 펩티다제 및 프로테아제와 같은 효소에 의해 절단된다. 펩타이드-기반 절단가능한 결합기는 아미노산 사이에 형성된 펩타이드 결합이고 올리고펩타이드(예를 들어, 디펩타이드, 트리펩타이드 등) 및 폴리펩타이드를 생성한다. 펩타이드-기반 절단가능한 군은 아미드 군(-C(O)NH-)을 포함하지 않는다. 아미드 군은 임의의 알킬렌, 알케닐렌 또는 알키넬렌 사이에 형성될 수 있다. 펩타이드 결합은 아미노산 사이에 형성된 특별한 유형의 아미드 결합이고 펩타이드 및 단백질을 생성한다. 펩타이드 기반 절단 군은 일반적으로 펩타이드 및 단백질을 생성하는 아미노산 사이에 형성된 펩타이드 결합(즉, 아미드 결합)으로 제한되고, 전체 아미드 작용기를 포함하지 않는다. 펩타이드-기반 절단가능한 결합기는 화학식 - NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-을 갖고, 여기서 RA 및 RB는 2개의 인접한 아미노산의 R 군이다. 이들 후보물은 전술된 것들과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, 발명의 iRNA는 링커를 통해 탄수화물에 접합된다. 발명의 조성물 및 방법의 링커와 iRNA 탄수화물 접합체의 비제한적인 예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
(화학식 XLIV), X 또는 Y 중 하나가 올리고뉴클레오타이드인 경우, 다른 하나는 수소이다.
본 발명의 조성물 및 방법의 특정 구현예에서, 리간드는 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 "GalNAc"(N-아세틸갈락토사민) 유도체이다.
일 구현예에서, 발명의 dsRNA는 화학식 (XLV) - (XLVI) 중 임의의 것에 나타낸 구조의 군으로부터 선택된 2가 또는 3가 분지형 링커에 접합된다:
여기서:
q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B 및 q5C는 각 경우에 독립적으로 0~20을 나타내고, 여기서 반복 단위는 동일하거나 상이할 수 있고;
P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T4A, T5B, T5C는 부재하는 각 경우에 각각 독립적으로 CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH 또는 CH2O이고;
Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C는 부재하는 각 경우에 독립적으로 알킬렌, 치환된 알킬렌이고, 여기서 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R')=C(R''), C≡C 또는 C(O) 중 하나 이상에 의해 중단되거나 종결될 수 있고;
R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C는 부재하는 각각의 경우에 각각 독립적으로 NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO, CH=N-O, 또는 헤테로시클릴이고;
L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B 및 L5C는 리간드를 나타내고; 즉, 각각의 발생에 대해 각각 독립적으로 단당류(예컨대 GalNAc), 이당류, 삼당류, 사당류, 올리고당류 또는 다당류를 나타내고; Ra는 H 또는 아미노산 측쇄이다. 3가 결합 GalNAc 유도체는, 화학식 XLIX의 것과 같은 표적 유전자의 발현을 억제하기 위해 RNAi 제제와 함께 사용하기에 특히 유용하다:
여기서 L5A, L5B 및 L5C는 GalNAc 유도체와 같은 단당류를 나타낸다.
GalNAc 유도체를 접합시키는 적합한 2가 및 3가 분지형 링커 군의 예는 화학식 II, VII, XI, X, 및 XIII로서 앞서 언급된 구조를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
RNA 접합체의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허번호 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,578,717호, 제5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486,603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,958,013호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241호, 제5,391,723호; 제5,416,203호, 제5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928호; 제5,688,941호; 제6,294,664호; 제6,320,017호; 제6,576,752호; 제6,783,931호; 제6,900,297호; 제7,037,646호; 및 제8,106,022호를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이의 각각의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
주어진 화합물의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없으며 실제로 앞서 언급한 변형 중 하나 이상이 단일 화합물 또는 심지어 iRNA 내의 단일 뉴클레오사이드에 도입될 수 있습니다. 본 발명은 또한 키메라 화합물인 iRNA 화합물을 포함한다.
본 발명의 맥락에서, "키메라" iRNA 화합물 또는 "키메라"는 iRNA 화합물, 예컨대 dsRNAi 제제이고, 이는 2개 이상의 화학적으로 상이한 영역을 함유하고, 이들 각각은 적어도 하나의 단량체 유닛, 즉, dsRNA 화합물의 경우에는 뉴클레오타이드로 구성된다. 이들 iRNA는 통상적으로 적어도 하나의 영역을 함유하고, 여기서 RNA는 iRNA에 뉴클레아제 분해에 대해 증가된 내성, 증가된 세포 취득, 또는 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화성을 부여하도록 변형된다. iRNA의 추가의 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 효소에 대한 기질로서 작용할 수 있다. 예를 들어, RNase H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 절단하는 세포 엔도뉴클레아제이다. RNase H의 활성화는 따라서 RNA 표적을 절단하여 유전자 발현의 iRNA 억제의 효율을 증진시킨다. 결과적으로, 상응하는 결과는 흔히 키메라 dsRNA가 사용되는 경우 동일한 표적 영역에 하이브리드화하는 포스포로티오에이트 데옥시 dsRNA와 비교하여, 보다 짧은 iRNA를 사용하여 수득될 수 있다. RNA 표적의 절단은 통상적으로 겔 전기영동 및 필요한 경우, 당업계에 공지된 연합된 핵산 하이브리드화 기술에 의해 검출될 수 있다.
특정 경우에, iRNA의 RNA는 비-리간드 군에 의해 변형될 수 있다. 다수의 비-리간드 분자는 iRNA에 접합되어 iRNA의 활성, 세포 분포 또는 세포 취득을 증진시키고, 이러한 접합을 수행하기 위한 과정은 과학 문헌에서 이용가능하다. 이러한 비-리간드 모이어티는 지질 모이어티, 예컨대 콜레스테롤(문헌참조: Kubo, T. 등, Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54~61; Letsinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), 콜산(문헌참조: Manoharan 등, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), 티오에테르, 예를 들어, 헥실-S-트리틸티올(문헌참조: Manoharan 등, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan 등, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), 티오콜레스테롤(문헌참조: Oberhauser 등, Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), 지방족 사슬, 예를 들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기(문헌참조: Saison-Behmoaras 등, EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov 등, FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk 등, Biochimie, 1993, 75:49), 인지질, 예를 들어 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트(문헌참조: Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea 등, Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(문헌참조: Manoharan 등, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), 또는 아다만탄 아세트산(문헌참조: Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), 손바닥 모이어티(문헌참조: Mishra 등, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티(문헌참조: Crooke 등, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923)를 포함한다. 이러한 RNA 접합체의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 앞서 열거되었다. 통상적인 접합 프로토콜은 서열의 하나 이상의 위치에서 아미노링커를 함유하는 RNA의 합성을 포함한다. 아미노 군은 이어서 적당한 커플링 또는 활성화 시약을 사용하여 접합된 분자와 반응시킨다. 접합 반응은 고체 지지체에 여전히 결합된 RNA를 사용하거나 용액 상에서 RNA의 절단 후 수행될 수 있다. HPLC에 의한 RNA 접합체의 정제는 통상적으로 순수한 접합체를 제공한다.
Ⅴ. 본 발명의 iRNA의 전달
본 발명의 iRNA를 세포, 예를 들어, 인간 대상체(예를 들어, 본원에서 기술된 것과 같이, KHK-관련 장애에 취약하거나 이를 진단받은 대상체와 같은 치료를 필요로 하는 대상체)와 같은 대상체 내 세포로의 전달은 다수의 상이한 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 전달은 세포를 본 발명의 iRNA와 시험관내 또는 생체내 접촉시킴으로써 수행될 수 있다. 생체내 전달은 또한 iRNA, 예를 들어, dsRNA를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함으로써 직접적으로 수행될 수 있다. 대안적으로, 생체내 전달은 iRNA를 암호화하고 이를 지시하는 하나 이상의 벡터를 투여함으로써 간접적으로 수행될 수 있다. 이들 대안은 하기에서 추가로 논의된다.
일반적으로, (시험관내 또는 생체내) 핵산 분자를 전달하는 임의의 방법은 본 발명의 iRNA와 사용하기 위해 채택될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Akhtar S. 및 Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139~144 및 WO94/02595, 이의 전문은 본원에 참조로서 통합된다). 생체내 전달을 위해, iRNA 분자를 전달하기 위해 고려할 인자들에는, 예를 들어, 전달된 분자의 생물학적 안정성, 비-특이적 효과의 예방, 및 표적 조직에서의 전달된 분자의 축적이 포함된다. 또한 RNA 간섭은 직접 주사에 의한 CNS로의 국소 전달에 성공한 것으로 나타났다(문헌참조: Dorn, G., 등(2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., 등(2005) Gene Ther. 12:59~66; Makimura, H., 등(2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., 등(2004) Neuroscience 129:521~528; Thakker, ER., 등(2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270~17275; Akaneya,Y., 등(2005) J. Neurophysiol. 93:594~602). RNA 또는 약제학적 캐리어의 변형은 또한 iRNA를 표적 조직으로 표적화할 수 있도록 하고, 바람직하지 않은 오프-표적 효과를 피할 수 있도록 한다. iRNA 분자는 콜레스테롤과 같은 친유성 기에 대한 화학적 접합에 의해 변형되어 세포 취득을 향상시키고 분해를 방지할 수 있다. 예를 들어, 친유성 콜레스테롤 모이어티에 접합된 ApoB에 대해 지시된 iRNA가 마우스에 전신 주사되고 간과 공장 둘 모두에서 apoB mRNA의 녹다운을 초래하였다(문헌참조: Soutschek, J., 등(2004) Nature 432:173~178).
대안적인 구현예에서, iRNA는 나노입자, 덴드리머, 폴리머, 리포좀 또는 양이온성 전달 시스템과 같은 약물 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 양으로 하전된 양이온성 전달 시스템은 iRNA 분자(음으로 하전된)의 결합을 촉진시키고 또한 음으로 하전된 세포막에서 상호작용을 증진시켜 세포에 의한 iRNA의 효율적인 흡수를 가능하게 한다. 양이온성 지질, 덴드리머 또는 중합체는 iRNA에 결합될 수 있거나 iRNA를 내장하는 소포 또는 마이셀을 형성하도록 유도될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Kim SH, 등(2008) Journal of Controlled Release 129(2):107~116) 소포 또는 마이셀의 형성은 전신 투여되는 경우 iRNA의 분해를 추가로 방지한다. 양이온성-iRNA 복합체를 제조하고 투여하기 위한 방법은 능히 당업자의 능력 범위 내에 있다(문헌참조: 예를 들어, Sorensen, DR, 등(2003) J. Mol. Biol 327:761~766; Verma, UN, 등(2003) Clin. Cancer Res. 9:1291~1300; Arnold, AS 등(2007) J. Hypertens. 25:197~205, 이의 전문이 본원에 참조로서 통합된다). iRNA의 전신 전달에 유용한 약물 전달 시스템의 비제한적인 예는 DOTAP(문헌참조: Sorensen, DR., 등(2003), 전술됨; Verma, UN, 등(2003), 전술됨), "고체 핵산 지질 입자"(문헌참조: Zimmermann, TS, 등(2006) Nature 441:111~114), 카디오리핀(문헌참조: Chien, PY, 등(2005) Cancer Gene Ther. 12:321~328; Pal, A, 등(2005) Int J. Oncol. 26:1087~1091), 폴리에틸렌이민(문헌참조: Bonnet ME, 등(2008) Pharm. Res. Aug 16 인쇄 전 Epub; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), Arg-Gly-Asp(RGD) 펩타이드(문헌참조: Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472~487), 및 폴리아미도아민(문헌참조: Tomalia, DA, 등(2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61~67; Yoo, H., 등(1999) Pharm. Res. 16:1799~1804)을 포함한다. 일부 구현예에서, iRNA는 전신 투여를 위해 사이클로덱스트린과 복합체를 형성한다. iRNA 및 사이클로덱스트린의 투여 및 약제학적 조성물 위한 방법은 미국 특허번호 제7,427,605호에서 찾을 수 있고, 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
A. 본 발명의 iRNA를 암호화하는 벡터
KHK 유전자를 표적으로 하는 iRNA는 DNA 또는 RNA 벡터에 삽입된 전사 단위로부터 발현될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Couture, A, 등, TIG. (1996), 12:5~10; Skillern, A, 등, 국제 PCT 공개번호 WO 00/22113, Conrad, 국제 PCT 공개번호 WO 00/22114, 및 Conrad, 미국 특허번호 제6,054,299호). 발현은 사용된 특정 작제물 및 표적 조직 또는 세포 유형에 따라 일시적(수 시간 내지 수 주의 순서로)이거나 지속될(수 주 내지 수 개월 또는 그 이상) 수 있다. 이들 전이유전자는 선형 작제물, 원형 플라스미드 또는 바이러스 벡터로서 도입될 수 있고, 이는 통합 또는 비-통합 벡터일 수 있다. 전이유전자는 또한 염색체외 플라스미드로서 유전될 수 있도록 구성될 수 있다(문헌참조: Gassmann, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).
본원에 기술된 방법 및 조성물과 사용될 수 있는 바이러스 벡터 시스템은 (a) 아데노바이러스 벡터; (b) 렌티바이러스 벡터, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 레트로바이러스 벡터; (c) 아데- 관련 바이러스 벡터; (d) 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터; (e) SV 40 벡터; (f) 폴리오마 바이러스 벡터; (g) 파필로마 바이러스 벡터; (h) 피코나바이러스 벡터; (i) 폭스 바이러스 벡터, 예컨대, 오르토폭스, 예를 들어, 백시니아 바이러스 벡터 또는 아비폭스, 예를 들어, 카나리 폭스 또는 파울 폭스; 및 (j) 헬퍼-의존성 또는 거트리스(gutless) 아데노바이러스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 복제 결함 바이러스가 또한 유리할 수 있다. 상이한 벡터는 세포의 게놈에 도입되거나 도입되지 않는다. 작제물은 경우에 따라 형질감염을 위한 바이러스 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 작제물은 에피좀 복제가 가능한 벡터, 예를 들어, EPV 및 EBV 벡터 내로 혼입될 수 있다. iRNA의 재조합 발현을 위한 작제물은 일반적으로 표적 세포 내 iRNA의 발현을 확실히 하기 위해 조절 요소, 예를 들어, 프로모터, 증진제 등을 필요로 한다. 벡터 및 작제물을 위해 고려할 다른 양태는 당업계에 공지되어 있다.
Ⅵ. 본 발명의 약제학적 조성물
본 발명은 또한 본 발명의 iRNA를 포함하는 약제학적 조성물 및 제형을 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 것과 같은 iRNA를 함유하는 약제학적 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 캐리어가 본원에 제공된다. iRNA를 함유하는 약제학적 조성물은 KHK의 발현 또는 활성과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 데 유용하다. 이러한 약제학적 조성물은 전달 방식을 기준으로 제형화된다. 일례로는 비경구 전달을 통한, 예를 들어 피하(SC), 또는 정맥내(IV) 전달에 의한 전신 투여용으로 제형화된 조성물이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 KHK 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 용량으로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 멸균성이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 발열성 물질이 없다.
본 발명의 약제학적 조성물은 KHK 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 용량으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 iRNA의 적합한 용량은 하루 수용자의 체중 킬로그램 당 약 0.001 내지 약 200.0 밀리그램의 범위이고, 일반적으로 하루 체중 킬로그램 당 약 1 내지 50mg의 범위이다. 통상적으로, 본 발명의 iRNA의 적합한 용량은 약 0.1mg/kg 내지 약 5.0mg/kg, 약 0.3mg/kg 내지 약 3.0mg/kg의 범위일 것이다. 반복 투여 용법은 정기적으로, 예컨대 매월, 3~6개월 마다 1회, 또는 일년에 1회로 치료적 양의 iRNA를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, iRNA는 매월 약 1회 내지 6개월 마다 약 1회로 투여된다.
초기 치료 용법 후, 치료제는 덜 빈번한 기준으로 투여될 수 있다. 치료 기간은 질환의 중증도에 기초하여 결정될 수 있다.
다른 구현예에서, 약제학적 조성물의 단일 용량은 오래 지속되어, 용량은 1, 2, 3, 또는 4개월 이하의 간격으로 투여될 수 있다. 발명의 일부 구현예에서, 발명의 약제학적 조성물의 단일 용량은 1개월마다 1회 투여 된다. 본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물의 단일 용량은 분기마다(즉, 약 3개월마다) 투여된다. 본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물의 단일 용량은 일년에 2번(즉, 약 6개월마다 1회) 투여된다.
당업자는 특정 요인들이 대상체를 효과적으로 치료하기 위해 요구되는 용량 및 타이밍에 영향을 줄 수 있음을 인지하며, 이는 대상체에 존재하는 돌연변이, 이전의 치료, 대상체의 일반 건강 및/또는 연령 및 존재하는 다른 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또한, 적절한 예방학적 또는 치료학적 유효량의 조성물을 사용한 대상체의 치료는 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다.
iRNA는 특정 조직(예를 들어, 간세포)을 표적화하는 방식으로 전달될 수 있다.
발명의 약제학적 조성물은 용제, 에멀젼 및 리포좀 함유 제형을 포 함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 조성물은 미리 형성된 액체, 자가-유화 고체 및 자가-유화 반고체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 성분으로부터 생성 될 수 있다. 제형은 간을 표적으로 하는 것을 포함한다.
유닛 투여 형태로 편리하게 제시될 수 있는 발명의 약제학적 제형은 제약 산업에 잘 공지된 종래의 기술에 따라 제조될 수 있다. 그러한 기술들은 활성 성분을 약제학적 담체(들) 또는 부형제(들)과 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 액체 담체와 활성 성분을 균일하게 및 친밀하게 연합시킴으로써 제조된다.
A. 추가의 제형
i. 에멀젼
본 발명의 조성물은 에멀젼으로 제조되고 제형화될 수 있다. 통상적으로 에멀젼은 일반적으로 직경이 0.1μm를 초과하는 액적 형태인 또 다른 액체에 분산된 하나의 액체의 이종성 시스템이다(문헌참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi 등, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301). 에멀젼은 종종 서로 밀접하게 혼합되고 분산된 2개의 비혼화성 액체 상을 포함하는 이상성 시스템이다. 일반적으로, 에멀졀은 유중수(w/o) 또는 수중유(o/w) 다양성 중 어느 하나일 수 있다. 수성상이 미세하게 나누어져 미세한 액적으로서 벌크 오일상으로 분산되는 경우, 생성된 조성물은 유중수(w/o) 에멀젼으로 불리운다. 대안적으로 오일상이 미세하게 나누어져 미세한 액적으로서 벌크 수성상으로 분산되는 경우, 생성된 조성물은 수중유(o/w) 에멀젼으로 불리운다. 에멀젼은 분산상 외에 추가 성분을 함유할 수 있으며, 수성상, 오일상 또는 별도의 상으로 자체적으로 용액으로 존재할 수 있는 활성 약물을 함유할 수 있다. 유화제, 안정화제, 염료 및 항산화제와 같은 약제학적 부형제는 또한 필요에 따라 에멀젼에 존재할 수 있다. 약제학적 에멀젼은 또한 예를 들어 유중수중유(o/w/o) 및 수중유중수 (w/o/w) 에멀젼의 경우에 2개 이상의 상으로 이루어진 다중 에멀젼일 수 있다. 이러한 복합 제형은 종종 단순 이원 에멀젼이 제공하지 않는 특정 이점을 제공한다. o/w 에멀젼의 개별 오일 액적이 작은 물 액적을 내포하는 다중 에멀젼은 w/o/w 에멀젼을 구성한다. 또한, 오일 연속 상으로 안정화된 물의 구체에 내포된 오일 액적 시스템은 o/w/o 에멀젼을 제공한다.
에멀젼은 거의 열역학 안정성이 없음을 특징으로 한다. 흔히, 에멀젼의 분산 또는 불연속 상은 외부 또는 연속 상으로 잘 분산되고 유화제 또는 제형의 점도를 통해 이러한 형태로 유지된다. 에멀젼을 안정화시키는 다른 수단은 에멀젼의 어느 하나의 상에 도입될 수 있는 유화제의 사용을 수반한다. 유화제는 광범위하게 4가지 범주로 분류될 수 있다: 합성 계면활성제, 천연 유화제, 흡수 기제, 및 미세 분산 고체(문헌참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
표면 활성제로도 공지된 합성 계면활성제는 에멀젼의 제형에서 광범위하게 적용할 수 있음을 발견했고, 문헌에서 검토되었다(문헌참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., 및 Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1권, 페이지. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, 1권, 페이지. 199). 계면활성제는 통상적으로 양친매성이고 친수성 및 소수성 부분을 포함한다. 계면활성제의 친수성 대 소수성 특성의 비율을 친수성/친유성 균형(HLB)이라고 하며 제형의 제조에서 계면활성제를 분류하고 선택하는데 유용한 도구이다. 계면활성제는 친수성 기의 특성에 따라 비이온성, 음이온성, 양이온성 및 양쪽성의 상이한 부류로 분류될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285).
다양한 비-유화 재료는 또한 에멀젼 제형에 포함되고, 에멀젼의 성질에 기여한다. 이들은 지방, 오일, 왁스, 지방산, 지방 알코올, 지방 에스테르, 보습제, 친수성 콜로이드, 방부제 및 항산화제를 포함한다(문헌참조: Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
피부과, 경구 및 비경구 경로를 통한 에멀젼 제제의 적용 및 이들의 제조를 위한 방법이 문헌에서 검토되었다(문헌참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
ii. 마이크로에멀젼
본 발명의 일 구현예에서, iRNA 조성물 및 핵산의 조성물은 마이크에멀젼으로 제형화되었다. 마이크로에멀젼은, 단일 광학적으로 등방성이며 열역학적으로 안정한 액체 용액인 물, 오일 및 양친매체의 시스템으로서 정의될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). 통상적으로 마이크로에멀젼은 먼저 수성 계면활성제 용액에 오일을 분산시킨 다음 충분한 양의 제4 성분, 일반적으로 중간 쇄 길이의 알코올을 첨가하여 투명한 시스템을 형성함으로써 제조되는 시스템이다. 따라서, 마이크로에멀젼은 또한 표면 활성 분자의 계면 필름에 의해 안정화되는 두 개의 불혼화성 액체의 열역학적으로 안정하고 등방성으로 투명한 분산액으로 기술되었다(문헌참조: Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215).
iii. 마이크로입자
발명의 iRNA는 입자, 예를 들어, 마이크로입자 내에 혼입될 수 있다. 마이크로입자는 분무 건조에 의해 생성될 수 있지만 또한 동결건조, 증발, 유동층 건조, 진공 건조 또는 이러한 기술의 조합을 비롯한 다른 방법에 의해 생성될 수도 있다.
iv. 투과 증진제
일 구현예에서, 본 발명은 핵산, 특히 iRNA를 동물의 피부에 효율적으로 전달하기 위해 다양한 투과 증진제를 사용한다. 대부분의 약물은 이온화된 및 비이온화된 형태 둘 모두로 용액 중에 존재한다. 그러나, 일반적으로 지용성 또는 친유성 약물만이 용이하게 세포막을 통과한다. 심지어 비친유성 약물이 통과될 막이 투과 증진제로 처리되는 경우 세포막을 통과할 수 있다는 것이 발견되었다. 세포막을 통한 비친유성 약물의 확산을 돕는 것 외에도, 투과 증진제는 친유성 약물의 투과성 또한 증진시킨다.
침투 증진제는 크게 다섯 가지 범주, 즉, 계면활성제, 지방산, 담즙염, 킬레이트제 및 비킬레이트 비계면활성제 중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). 전술한 침투 증진제의 부류 및 이들의 약제학적 조성물의 제조 및 약제학적 제제의 전달에서의 용도 각각은 당업계에 잘 알려져 있다.
v. 부형제
담체 화합물과 대조적으로, "약제학적 담체" 또는 "부형제"는 하나 이상의 핵산을 동물에게 전달하기 위한 약제학적으로 허용되는 용매, 현탁제, 또는 임의의 다른 약리학적 불활성 비히클이다. 부형제는 액체 또는 고체일 수 있고 주어진 약제학적 조성물의 핵산 및 기타 성분과 조합될 때 목적하는 벌크, 일관성 등을 제공하기 위해 계획된 투여 방식을 염두에 두고 선택된다. 이러한 제제는 당업계에 잘 알려져 있다.
vi. 다른 성분
본 발명의 조성물은 약제학적 조성물에서 통상적으로 발견되는 다른 부가 성분을 당업계에 확립된 사용 수준으로 추가로 함유할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 조성물은 예를 들어 항소양제, 수렴제, 국소 마취제 또는 항염증제와 같은 추가의 상용성 약제학적 활성 물질을 함유할 수 있거나 본 발명의 조성물의 다양한 투여 형태를 물리적으로 제형화하는 데 유용한 추가 물질, 예를 들어, 염료, 착향제, 방부제, 항산화제, 불투명화제, 증점제 및 안정제를 함유할 수 있다. 그러나, 이러한 물질은 첨가될 때 본 발명의 조성물의 성분의 생물학적 활성을 과도하게 방해해서는 안 된다. 제형은 멸균화될 수 있고, 바람직한 경우, 보조제, 예를 들어, 윤활제, 방부제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제, 착색제, 향미제 또는 방향 물질 등과 혼합될 수 있고, 이들은 제형의 핵산(들)과 해롭게 상호 작용하지 않는다.
수성 현탁액은 예를 들어 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 현탁액은 또한 안정화제를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에서 특징화된 약제학적 조성물은 (a) 하나 이상의 iRNA 및 (b) 비-iRNA 메커니즘에 의해 작용하며 KHK-관련 장애, 예를 들어, 간 질환(예를 들어, 지방간, 지방간염, 비알코올성 지방간염(NASH)), 이상지질혈증(예를 들어, 고지혈증, 고LDL 콜레스테롤, 저HDL 콜레스테롤, 고중성지방혈증, 식후고중성지방혈증), 혈당 조절 장애(예를 들어, 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병), 심혈관 질환(예를 들어, 고혈압, 내피세포 기능장애), 신장 질환(예를 들어, 급성 신장 장애, 관상 기능장애, 근위 세관에 대한 전염증성 변화, 만성 신장 질환), 대사 증후군, 지방세포 기능장애, 내장지방 침착, 비만, 고요산혈증, 통풍, 섭식 장애, 및 과도한 당 갈망을 치료하는 데에 유용한 하나 이상의 제제를 포함한다.
그러한 화합물의 독성 및 예방학적 효능은, 예를 들어 LD50(집단의 50%에게 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에 예방학적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위한 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료학적 효과 사이의 용량비가 치료 지수이며, 이는 LD50/ED50 비율로 나타낼 수 있다. 높은 치료학적 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다.
세포 배양물 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에게 사용하기 위한 용량의 범위를 정하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 본 명세서에서 특징화된 조성물의 투여량은 일반적으로 ED50, 예컨대 ED80 또는 ED90을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있으며, 독성은 거의 없거나 전혀 없다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 발명에서 특징화된 방법에 사용되는 임의의 화합물에 대해, 치료학적 유효량은 세포 배양 검정으로부터 초기에 평가될 수 있다. 투여량은 동물 모델에서 정해져 화합물의 순환 혈장 농도 범위를 달성하거나, 적절한 경우, 세포 배양물 중에서 결정된 것과 같이 IC50 (즉, 증상의 절반-최대 억제를 달성하는 시험 화합물의 농도) 또는 그보다 높은 수준의 억제를 포함하는, (예를 들어, 폴리펩타이드의 감소된 농도를 달성하는) 표적 서열의 폴리펩타이드 생성물의 순환 혈장 농도 범위를 성취할 수 있다. 이러한 정보를 사용하여 사람에게 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다. 혈장 내 수준은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
위에서 논의된 바와 같이, 이들의 투여에 더해, 본 발명에서 특징화된 iRNA는 KHK-관련 장애, 예를 들어, 간 질환(예를 들어, 지방간, 지방간염, 비알코올성 지방간염(NASH)), 이상지질혈증(예를 들어, 고지혈증, 고LDL 콜레스테롤, 저HDL 콜레스테롤, 고중성지방혈증, 식후고중성지방혈증), 혈당 조절 장애(예를 들어, 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병), 심혈관 질환(예를 들어, 고혈압, 내피세포 기능장애), 신장 질환(예를 들어, 급성 신장 장애, 관상 기능장애, 근위 세관에 대한 전염증성 변화, 만성 신장 질환), 대사 증후군, 지방세포 기능장애, 내장지방 침착, 비만, 고요산혈증, 통풍, 섭식 장애, 및 과도한 당 갈망의 예방 또는 치료를 위해 사용되는 기타 공지된 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 어떠한 경우에도, 투여하는 의사는 당업계에 공지되거나 본원에 기술된 것과 같은 표준 효능 측정을 사용하여 관찰된 결과에 기초하여 iRNA 투여의 양 및 타이밍을 조정할 수 있다.
Ⅶ. KHK 발현을 억제하는 방법
본 발명은 또한 세포 내 KHK 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제 공한다. 방법은 세포를 RNAi 제제, 예를 들어, 세포 내 KHK의 발현을 억제하는 데에 유효한 양의 이중 가닥 RNAi 제제와 접촉시킴으로써, 세포 내 KHK의 발현을 억제하는 단계를 포함한다.
세포와 iRNA, 예를 들어 이중 가닥 RNA 제제의 접촉은 시험관내 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 세포와 iRNA 제제의 생체내 접촉은 대상체, 예를 들어 인간 대상체 내 세포 또는 세포군과 iRNA를 접촉시키는 단계를 포함한다. 세포를 접촉시키는 시험관내 및 생체내 방법의 조합도 가능하다. 세포와의 접촉은 앞서 논의된 것과 같이 직접적이거나 간접적일 수 있다. 또한, 세포와의 접촉은 본원에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 리간드를 포함하는 표적화 리간드를 통해 성취될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 탄수화물 모이어티, 예를 들어 GalNAc3 리간드, 또는 RNAi 제제를 관심 부위로 지시하는 임의의 다른 리간드이다.
본원에서 사용되는 용어 "억제하는(inhibiting)"은 "감소시키는(reducing)", "침묵시키는(silencing)" "하향조절하는(downregulating)", "억제하는(suppressing)", 및 기타 유사 용어와 상호교환적으로 사용되고, 임의의 억제 수준을 포함한다.
문구 "KHK의 발현을 억제하는"은 (예를 들어, 마우스 KHK 3 유전자, 랫트 KHK 유전자, 원숭이 KHK 유전자, 또는 인간 KHK 유전자와 같은) 임의의 KHK 유전자뿐만 아니라 KHK 유전자의 변이체 또는 돌연변이의 발현의 억제를 지칭하도록 의도된다. 따라서, KHK 유전자는 유전적으로 조작된 세포, 세포군 또는 유기체의 맥락에서 야생형 KHK 유전자, 돌연변이 KHK 유전자, 또는 유전자이식 KHK 유전자일 수 있다.
"KHK 유전자의 발현 억제"는 KHK 유전자의 임의의 억제 수준, 예를 들어, KHK 유전자 발현의 적어도 부분적인 억제를 포함한다. KHK 유전자의 발현은 KHK 유전자 발현과 관련된 임의의 변수의 수준 또는 수준의 변화, 예를 들어 KHK mRNA 수준 또는 KHK 단백질의 수준에 기초하여 평가될 수 있다. 이 수준은, 예를 들어, 대상체로부터 유래된 샘플을 포함하는 개별 세포 또는 세포군에서 평가될 수 있다.
억제는 대조군 수준과 비교하여 KHK 발현과 관련된 하나 이상의 변수의 절대적 또는 상대적 수준의 감소에 의해 평가될 수 있다. 대조군 수준은 당업계에서 사용되는 임의의 유형의 대조군 수준, 예를 들어, 투여 전 베이스라인 수준, 또는 처리되지 않거나 대조군(예를 들어, 완충제 단독 대조군 또는 불활성 제제 대조군)으로 처리된 유사 대상체, 세포, 또는 시료로부터 결정된 수준일 수 있다.
KHK-관련 질환 징후의 상승 정도 및 지속 기간은 징후에 따라 달라질 것임을 이해할 것이다. 예를 들어, 지질 징후, 예를 들어, 공복 지질 수준, NAFLD, NASH, 비만; 간 및 신장 기능의 징후, 및 포도당 또는 인슐린 반응은, 하루 이내에 또는 심지어 일주일 이내에 임상적으로 유의미한 방식으로 변하지 않는 지속적인 징후이다. 다른 마커, 예를 들어, 혈청 요산 및 포도당 수준, 및 소변 과당 수준은 수일 내에 그리고 수일 사이에 달라질 수 있다. 혈압은 과당에 반응하여 일시적으로 그리고 지속적으로 상승될 수 있다. 과당은 적어도 부분적으로 포만 상태를 짧게 만들어 체중 증가를 초래할 가능성이 높기 때문에, 열량 제한과 함께 과당 소비는 체중 증가를 초래하지 않을 수 있다.
또한, 대상체의 질환 상태에 따라, 예를 들어, 장 내 GLUT5 수송체의 발현 변이로 인해 성인의 최대 3분의 1 및 아동의 3분의 2가 과당을 흡수한다(문헌참조: Johnson 등(2013) Diabetes. 62:3307~3315). 그러나, 과당에 대한 반복적인 노출은 과당 흡수를 증가시킬 수 있다. 과당 대사는 과당의 공급원에 따라, 예를 들어, 고과당 옥수수 시럽 대 천연 과일의 과당에 따라 상이한 것으로 입증되었으며, 청량음료에 의해 제공되는 것과 같은 고농도에서, 포도당은 폴리올 경로에 의해 과당으로 변환될 수 있다. 그러나, 과당은 포도당보다 대사 효과가 더 크다. 체성분, 예를 들어, 체지방량이 적더라도 과당 대사에 영향을 미치는 것으로 입증되었다. 따라서, 시험 및 제어 시점 모두 신중하게 선택되어야 한다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, KHK 유전자의 발현은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%만큼, 또는 검정의 검출 수준 미만으로 억제된다. 일부 구현예에서, KHK 유전자의 발현은 적어도 70%만큼 억제된다. 일부 구현예에서, 발현 수준은 적절한 종 일치 세포주에서 10nM siRNA 농도로 실시예 2에 제공된 검정 방법을 사용하여 결정된다.
특정 구현예에서, 생체내 발현의 억제는, 예를 들어, RNA 발현 최하점에서, 예를 들어, 3mg/kg의 단일 용량으로 투여될 때, 인간 유전자를 발현하는 설치류, 예를 들어, 인간 표적 유전자(즉, KHK)를 발현하는 AAV-감염 마우스 내 인간 유전자의 녹다운에 의해 결정된다. 또한, 예를 들어, RNA 발현 최하점에서, 예를 들어, 3mg/kg의 단일 용량을 투여한 후, 모델 동물 시스템에서 내인성 유전자 발현의 녹다운이 결정될 수 있다. 이러한 시스템은 인간 유전자의 핵산 서열과 모델 동물 유전자가 충분히 근접해 인간 iRNA가 iRNA가 모델 동물 유전자의 효과적인 녹다운을 제공할 때 유용하다. 간에서의 RNA 발현은 실시예 2에 제공된 PCR 방법을 사용하여 결정된다.
KHK 유전자의 발현 억제는 제1 세포 또는 세포군(이러한 세포는 예를 들어 대상체로부터 유래된 시료에 존재)에 의해 발현된 mRNA 양의 감소에 의해 분명해질 수 있고, 여기서 KHK 유전자는 전사되고 (예를 들어, 세포 또는 세포들을 본 발명의 iRNA와 접촉시킴으로써, 또는 본 발명의 iRNA를 세포가 존재하거나 존재했던 대상체에게 투여함으로써) 처리되어, 제1 세포 또는 세포군과 실질적으로 동일하지만 그렇게 처리되지 않은 제2 세포 또는 세포군과 비교하여 KHK 유전자의 발현이 억제된다(대조군 세포(들)는 iRNA로 처리되지 않거나 관심 유전자에 대해 표적화된 iRNA로 처리되지 않음). 일부 구현예에서, 억제는 종 일치 세포주에서 10nM siRNA 농도를 사용하여 실시예 2에서 제공된 방법에 의해 평가되어, 치료된 세포의 mRNA 수준을 대조군 세포의 mRNA 수준의 백분율로서 하기 화학식을 사용하여 표현한다:
다른 구현예에서, KHK 유전자의 발현 억제는 KHK 유전자 발현에 기능적으로 연결된 파라미터, 예를 들어, 대상체로부터의 혈액 또는 혈청 내 KHK 단백질 수준의 감소의 측면에서 평가될 수 있다. KHK 유전자 침묵은 발현 작제물로부터 내인성 또는 이종성인 KHK를 발현하는 임의의 세포에서, 그리고 당업계에 공지된 임의의 검정에 의해 결정될 수 있다.
KHK 단백질의 발현 억제는 세포 또는 세포군에 의해 또는 대상체 시료에서 발현되는 KHK 단백질의 수준(예를 들어, 대상체로부터 유래된 시료 내 단백질의 수준)의 감소에 의해 분명해질 수 있다. 위에서 설명한 것과 같이, mRNA 억제 평가의 경우, 처리된 세포 또는 세포군 내 단백질 발현 수준의 억제는 대조군 세포 또는 세포군 내 단백질 수준의 백분율, 또는 대상체 시료, 예를 들어 혈액 또는 그로부터 유래된 혈청 내 단백질 수준의 변화로서 유사하게 표현될 수 있다.
KHK 유전자의 발현 억제를 평가하기 위해 사용될 수 있는 대조군 세포, 세포군, 또는 대상체 시료는 아직 본 발명의 RNAi 제제와 접촉되지 않은 세포, 세포군, 또는 대상체 시료를 포함한다. 예를 들어, 대조군 세포, 세포군, 또는 대상체 시료는 RNAi 제제를 사용한 대상체의 치료 전에 개별 대상체(예를 들어, 인간 또는 동물 대상체) 또는 적절하게 매칭된 집단 대조군으로부터 유래될 수 있다.
세포 또는 세포군에 의해 발현되는 KHK mRNA의 수준은 mRNA 발현을 평가하기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 일 구현예에서, 샘플의 KHK의 발현 수준은 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부, 예를 들어, KHK 유전자의 mRNA를 검출함으로써 결정된다. RNA는, 예를 들어, 산 페놀/구아니딘 이소티오시아네이트 추출물(RNAzol B; 생체발생), RNeasyTM RNA 제조 키트(Qiagen®) 또는 PAXgeneTM(PreAnalytixTM, 스위스) 사용을 포함하는 RNA 추출 기술을 사용하여 세포로부터 추출될 수 있다. 리보핵산 혼성화를 사용하는 통상적인 검정 포맷은 핵 런-온 검정, RT-PCR, RNase 보호 검정, 노던 블롯팅, 제자리 혼성화 및 마이크로어레이 분석을 포함한다.
일부 구현예에서, KHK의 발현 수준은 핵산 프로브를 사용하여 결정된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "프로브"는 특정 KHK에 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 프로브는 당업자에 의해 합성될 수 있거나 적당한 생물학적 제제로부터 유래될 수 있다. 프로브는 특이적으로 표지되도록 설계될 수 있다. 프로브로서 사용될 수 있는 분자의 예는 RNA, DNA, 단백질, 항체 및 유기 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
단리된 mRNA는 서던 또는 노던 분석, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 분석 및 프로브 어레이를 포함하지만 이에 제한되지 않는 혼성화 또는 증폭 검정에 사용될 수 있다. mRNA 수준 결정을 위한 한 가지 방법은 단리된 mRNA를 KHK mRNA에 대해 혼성화할 수 있는 핵산 분자(프로브)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, mRNA는 고체 표면 상에 고정되고, 예를 들어, 아가로스 겔 상에서 단리된 mRNA를 전개시키고 겔로부터 니트로셀룰로스와 같은 막 상으로 mRNA를 전달함으로써, 프로브와 접촉된다. 대안적 구현예에서, 프로브(들)는 고체 표면 상에 고정되고, mRNA는, 예를 들어, Affymetrix® 유전자 칩 어레이에서 프로브(들)와 접촉된다. 당업자는 KHK mRNA의 수준을 결정하는 데 사용하기 위해 공지된 mRNA 검출 방법을 용이하게 적용할 수 있다.
시료에서 KHK의 발현 수준을 결정하기 위한 대안적인 방법은, 예를 들어, RT-PCR(실험적 구현예가 Mullis, 1987, 미국 특허번호 제4,683,202호에 제시됨), 리가제 연쇄 반응(문헌참조: Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189~193), 자체 지속 시퀀스 복제(문헌참조: Guatelli 등(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874~1878), 전사 증폭 시스템(문헌참조: Kwoh 등(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173~1177), Q-베타 레플리카제(문헌참조: Lizardi 등(1988) Bio/Technology 6:1197), 롤링 서클 복제(문헌참조: Lizardi 등, 미국 특허번호 제5,854,033호) 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법에 이어서 당업자에게 잘 공지된 기술을 사용한 증폭된 분자의 검출에 의해, 시료 중의, 예를 들어, mRNA의 핵산 증폭 또는 역전사 효소(cDNA를 제조하기 위한)의 프로세스를 포함한다. 이들 검출 기획은 핵산 분자가 매우 적은 수로 존재하는 경우 핵산 분자의 검출에 특히 유용하다. 본 발명의 특정 양태에서, KHK의 발현 수준은 정량적 형광 RT-PCR(즉, TaqManTM 시스템)에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 발현 수준은, 종 일치 세포주에서 예를 들어, 10nM siRNA 농도를 사용하여 실시예 2에 제공된 방법에 의해 결정된다.
KHK mRNA의 발현 수준은 (노던, 서던, 도트 등과 같은 혼성화 분석에 사용된 것과 같은) 막 블롯, 또는 마이크로웰, 샘플 튜브, 겔, 비드 또는 섬유(또는 결합된 핵산을 포함하는 임의의 고체 지지체)를 사용하여 모니터링될 수 있다. 본원에 참조로서 통합된 미국 특허번호 제5,770,722호, 제5,874,219호, 제5,744,305호, 제5,677,195호 및 제5,445,934호를 참조한다. KHK 발현 수준의 결정은 또한 용액 중 핵산 프로브 사용을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, mRNA 발현의 수준은 분지형 DNA(bDNA) 검정 또는 실시간 PCR(qPCR)을 사용하여 평가된다. 이들 방법의 사용은 본 명세서에 제공된 실시예에서 기술되고 예시된다. 일부 구현예에서, 발현 수준은, 종 일치 세포주에서 10nM siRNA 농도를 사용하여, 실시예 2에 제공된 방법에 의해 결정된다.
KHK 단백질 발현의 수준은 단백질 수준의 측정을 위해 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 전기영동, 모세관 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 박층 크로마토그래피(TLC), 과확산 크로마토그래피, 유체 또는 겔 침전 반응, 흡수 분광법, 비색 검정, 분광광도측정 검정, 유동 세포측정, 면역확산(단일 또는 이중), 면역전기영동, 웨스턴 블롯팅, 방사선면역검정(RIA), 효소 결합된 면역흡착 검정(ELISA), 면역형광 검정, 전기화학발광 검정 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법의 효능은 (예를 들어, 간 생검에서) KHK mRNA 또는 단백질 수준의 감소에 의해 평가된다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, iRNA가 대상체에게 투여되어 대상체 내의 특정 부위로 iRNA가 전달된다. KHK의 발현 억제는 대상체 내 특정 부위(예를 들어, 간 또는 혈액)로부터의 유체 또는 조직으로부터 유래된 시료에서 KHK mRNA 또는 KHK 단백질의 수준 또는 수준 변화의 측정을 사용하여 평가될 수 있다.
본원에서 사용되는 것과 같이, 용어 분석물 수준의 검출 또는 결정은 물질, 예를 들어, 단백질, RNA가 존재하는지 여부를 결정하기 위한 단계를 수행하는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 본원에서 사용되는 것과 같이, 검출 또는 결정 방법은 사용된 방법에 대한 검출 수준 미만인 분석물 수준의 검출 또는 측정을 포함한다.
Ⅷ. 본 발명의 예방 및 치료 방법
본 발명은 또한 KHK의 발현을 억제하기 위해 본 발명의 iRNA 또는 본 발명의 iRNA를 함유하는 조성물을 사용함으로써, KHK-관련 장애, 예를 들어, 간 질환(예를 들어, 지방간, 지방간염, 비알코올성 지방간염(NASH)), 이상지질혈증(예를 들어, 고지혈증, 고LDL 콜레스테롤, 저HDL 콜레스테롤, 고중성지방혈증, 식후고중성지방혈증), 혈당 조절 장애(예를 들어, 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병), 심혈관 질환(예를 들어, 고혈압, 내피세포 기능장애), 신장 질환(예를 들어, 급성 신장 장애, 관상 기능장애, 근위 세관에 대한 전염증성 변화, 만성 신장 질환), 대사 증후군, 지방세포 기능장애, 내장지방 침착, 비만, 고요산혈증, 통풍, 섭식 장애, 및 과도한 당 갈망을 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에서, 세포는 siRNA와 시험관내 또는 생체내 접촉될 수 있는데, 즉, 세포는 대상체 내에 존재할 수 있다.
본 발명의 방법을 사용하는 치료에 적합한 세포는 KHK 유전자를 발현하는 임의의 세포, 예를 들어 간 세포일 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 세포는 포유류 세포, 예를 들어 영장류 세포(예컨대, 키메라 비-인간 동물 내 인간 세포를 포함하는 인간 세포 또는 비-인간 영장류 세포, 예를 들어 원숭이 세포 또는 침팬지 세포) 또는 비-영장류 세포일 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 인간 세포, 예를 들어 인간 간 세포이다. 본 발명의 방법에서, KHK 발현은 세포에서 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95만큼, 또는 검정의 검출 수준 미만의 수준으로 억제된다.
본 발명의 생체내 방법은 대상체에게 iRNA를 함유하는 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 iRNA는 RNAi 제제가 투여될 포유동물의 KHK 유전자의 RNA 전사체의 적어도 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 조성물은 경구, 복강내 또는 두개내(예를 들어, 심실내, 실질내 및 척수강내), 정맥내, 근육내, 피하, 경피, 기도(에어로졸), 비강, 직장을 포함하는 비경구 경로 및 국소(협측 및 설하 포함) 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 조성물은 피하 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 조성물은 근육내 주사에 의해 투여된다.
일 양태에서, 본 발명은 또한 포유류에서 KHK 유전자의 발현을 억제하기 위한 방법을 제공한다. 본 방법은 포유류에게 포유류의 세포 내 KHK 유전자를 표적으로 하는 dsRNA를 포함하는 조성물을 투여하는 단계 및 KHK 유전자의 mRNA 전사체의 분해를 수득하여 세포 내 KHK 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 시간 동안 포유류를 유지하는 단계를 포함한다. 유전자 발현의 감소는 당업계에 공지된 임의의 방법 및 본 명세서, 예를 들어 실시예 2에 기술된 방법, 예를 들어 qRT-PCR에 의해 평가 될 수 있다. 단백질 생성의 감소는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 ELISA에 의해 평가될 수 있다. 특정 구현예에서, 천공 간 생검 시료는 KHK 유전자 또는 단백질 발현의 감소를 모니터링하기 위한 조직 물질로서의 역할을 한다. 다른 구현예에서, 혈액 시료는 KHK 단백질 발현의 감소를 모니터링하기 위한 대상체 시료로서의 역할을 한다. KHK 발현의 감소는 또한 과당 대사의 하나 이상의 지표, 예를 들어, 과당 대사의 결여를 나타내는 소변 내 과당의 존재를 검출하여 과당 대사의 감소를 측정함으로써 간접적으로 평가될 수 있다.
본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체, 예를 들어, 간 질환(예를 들어, 지방간, 지방간염, 비알코올성 지방간염(NASH)), 이상지질혈증(예를 들어, 고지혈증, 고LDL 콜레스테롤, 저HDL 콜레스테롤, 고중성지방혈증, 식후고중성지방혈증), 혈당 조절 장애(예를 들어, 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병), 심혈관 질환(예를 들어, 고혈압, 내피세포 기능장애), 신장 질환(예를 들어, 급성 신장 장애, 관상 기능장애, 근위 세관에 대한 전염증성 변화, 만성 신장 질환), 대사 증후군, 지방세포 기능장애, 내장지방 침착, 비만, 고요산혈증, 통풍, 섭식 장애, 및 과도한 당 갈망과 같은 KHK-관련 장애를 진단받은 대상체를 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체의 예방 방법을 추가로 제공한다. 본 발명의 치료 방법은 본 발명의 iRNA를 대상체, 예를 들어 KHK 발현의 감소로 혜택을 받을 받을 대상체에게 KHK 유전자를 표적으로 하는 iRNA 또는 KHK 유전자를 표적으로 하는 iRNA를 포함하는 약제학적 조성물의 예방학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 KHK 발현의 감소로 혜택을 받을 장애, 예를 들어, 간 질환(예를 들어, 지방간, 지방간염, 비알코올성 지방간염(NASH)), 이상지질혈증(예를 들어, 고지혈증, 고LDL 콜레스테롤, 저HDL 콜레스테롤, 고중성지방혈증, 식후고중성지방혈증), 혈당 조절 장애(예를 들어, 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병), 심혈관 질환(예를 들어, 고혈압, 내피세포 기능장애), 신장 질환(예를 들어, 급성 신장 장애, 관상 기능장애, 근위 세관에 대한 전염증성 변화, 만성 신장 질환), 대사 증후군, 지방세포 기능장애, 내장지방 침착, 비만, 고요산혈증, 통풍, 섭식 장애, 및 과도한 당 갈망과 같은 KHK-관련 질환을 가진 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, KHK-관련 장애는 간 질환, 예를 들어, NAFLD 또는 NASH와 같은 지방간 질환이다. 특정 구현예에서, KHK-관련 장애는 이상지질혈증, 예를 들어, 혈청 중성지방 상승, 혈청 LDL 상승, 혈청 콜레스테롤 상승, 혈청 HDL 저하, 식후고중성지방혈증이다. 또 다른 구현예에서, KHK-관련 장애는 혈당 조절 장애, 예를 들어, 인슐린에 대한 면역 반응으로 인한 것이 아닌 인슐린 저항성, 포도당 저항성, 제2형 당뇨병이다. 특정 구현예에서, KHK-관련 장애는 심혈관 질환, 예를 들어, 고혈압, 내피 세포 기능장애이다. 특정 구현예에서, KHK-관련 질환은 신장 질환, 예를 들어, 급성 신장 장애, 관상 기능장애, 근위 세관에 대한 전염증성 변화, 만성 신장 질환이다. 특정 구현예에서, 질환은 대사 증후군이다. 특정 구현예에서, KHK-관련 장애는 지질 침착 또는 기능장애 질환, 예를 들어, 내장 지방 침착, 지방 간, 비만이다. 특정 구현예에서, KHK-관련 장애는 요산 상승 질환, 예를 들어, 통풍, 고요산혈증이다. 특정 구현예에서, KHK-관련 장애는 과도한 당 갈망과 같은 섭식 장애이다.
본 발명의 iRNA는 "유리 iRNA"로서 투여될 수 있다. 유리 iRNA는 약제학적 조성물의 부재하에 투여된다. 나출된 iRNA는 적합한 완충 용액 중에 있을 수 있다. 완충 용액은 아세테이트, 시트레이트, 프롤라민, 카보네이트 또는 포스페이트, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 완충 용액은 포스페이트 완충 식염수(PBS)이다. iRNA를 함유하는 완충 용액의 pH 및 삼투압은 대상체에게 투여하기에 적합하도록 조정될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 iRNA는 dsRNA 리포좀 제형과 같은 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다.
KHK 유전자 발현의 억제로 혜택을 받을 대상체는 간 질환(예를 들어, 지방간, 지방간염, 비알코올성 지방간염(NASH)), 이상지질혈증(예를 들어, 고지혈증, 고LDL 콜레스테롤, 저HDL 콜레스테롤, 고중성지방혈증, 식후고중성지방혈증), 혈당 조절 장애(예를 들어, 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병), 심혈관 질환(예를 들어, 고혈압, 내피세포 기능장애), 신장 질환(예를 들어, 급성 신장 장애, 관상 기능장애, 근위 세관에 대한 전염증성 변화, 만성 신장 질환), 대사 증후군, 지방세포 기능장애, 내장지방 침착, 비만, 고요산혈증, 통풍, 섭식 장애, 및 과도한 당 갈망과 같은 KHK-관련 장애에 취약하거나 이를 진단받은 대상체이다.
일 구현예에서, 본 방법은 표적 KHK 유전자의 발현이 예컨대 투여 당 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 1~6, 1~3, 또는 3~6개월 동안 감소되도록 본 명세서에서 특징화된 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 3~6개월마다 일회 투여된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 특징화된 방법 및 조성물에 유용한 iRNA는 표적 KHK 유전자의 RNA(일차 또는 가공된)를 특이적으로 표적으로 한다. iRNA를 사용하여 이들 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법은 본원에 기술된 것과 같이 제조되고 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 iRNA의 투여는 KHK-관련 장애, 예를 들어, 간 질환(예를 들어, 지방간, 지방간염, 비알코올성 지방간염(NASH)), 이상지질혈증(예를 들어, 고지혈증, 고LDL 콜레스테롤, 저HDL 콜레스테롤, 고중성지방혈증, 식후고중성지방혈증), 혈당 조절 장애(예를 들어, 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병), 심혈관 질환(예를 들어, 고혈압, 내피세포 기능장애), 신장 질환(예를 들어, 급성 신장 장애, 관상 기능장애, 근위 세관에 대한 전염증성 변화, 만성 신장 질환), 대사 증후군, 지방세포 기능장애, 내장지방 침착, 비만, 고요산혈증, 통풍, 섭식 장애, 및 과도한 당 갈망의 예방 또는 치료를 초래할 수 있다.
대상체는 치료적 양의 iRNA, 예컨대 약 0.01mg/kg 내지 약 200mg/kg을 투여받을 수 있다.
일부 구현예에서, iRNA는 피하, 즉 피하 주사에 의해 투여된다. 하나 이상의 주사를 사용하여 목적하는 용량의 iRNA를 대상체에게 전달할 수 있다. 주사는 일정 기간 동안 반복될 수 있다.
투여는 정기적 주기로 반복될 수 있다. 특정 구현예에서, 초기 치료 용법 후, 치료는 덜 빈번한 주기로 투여될 수 있다. 반복 투여 용법은 치료적 양의 iRNA를 정기적으로, 예를 들어 매월 1회 내지 1년에 1회 투여하는 것을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, iRNA는 약 매월 1회 내지 약 3개월에 1회, 또는 약 3개월에 1회 내지 약 6개월에 1회 투여된다.
본 발명은 KHK 유전자 발현의 감소 및/또는 억제로 혜택을 받을 대상체, 예를 들어 KHK-관련 장애가 있는 대상체를 다른 약제 및/또는 다른 치료적 방법, 예를 들어 이들 장애를 치료하기 위해 현재 사용되는 것들과 같은 공지된 약제 및/또는 공지된 치료적 방법과 조합하여 치료하기 위한 iRNA 제제 또는 이의 약제학적 조성물의 방법 및 용도를 추가로 제공한다.
따라서, 본 발명의 일부 양태에서, 본 발명의 단일 iRNA 제제 중 하나를 포함하는 방법은 대상체에게 하나 이상의 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
iRNA 제제 및 추가 치료제 및/또는 치료는 동시에 및/또는 동일한 조합으로, 예를 들어 비경구 투여될 수 있거나, 추가 치료제는 별개의 조성물의 일부로서 또는 별개의 시간에 및/또는 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기술된 또 다른 방법에 의해 투여될 수 있다.
Ⅸ. KHK-관련 질환의 진단 기준 및 치료
다양한 KHK-관련 질환의 진단 기준, 치료제 및 치료를 위한 고려 사항이 아래에 제공된다.
A. 고요산혈증
혈청 요산 수치는 임상 실험실 수치로서 일상적으로 획득되지 않는다. 그러나, 고요산혈증(요산 상승)은 통풍, NAFLD, NASH, 대사 장애, (인슐린에 대한 면역 반응으로 인한 것이 아닌) 인슐린 저항성, 심혈관 질환, 고혈압, 및 제2형 당뇨병을 포함하는 다수의 질환 및 병태와 관련된다. KHK 발현을 감소시키는 것이 상승된 혈청 요산 수치와 관련된 하나 이상의 병태를 예방하거나 치료하는 데에 유용할 수 있을 것으로 예상된다. 또한, 대상체는 상승된 요산과 관련된 하나 이상의 병태의 명백한 징후나 증상이 없는 경우에도, 예를 들어, 6.8mg/dl 이하, 예컨대, 6mg/dl 이하인 정상 혈청 요산 수치를 향해 또는 정상 혈청 요산 수치로 혈청 요산 수치를 정상화시키는 것으로부터 임상적 혜택을 얻을 것으로 예상된다.
고요산혈증의 동물 모델은, 예를 들어, 지방간을 포함하는 지방 축적, 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병, 내장 비만을 포함하는 비만, 대사 증후군, 아디포넥틴 분비 감소, 신장 기능 감소, 및 염증 중 하나 이상을 유도할 수 있는, 랫트 및 마우스에서의 고과당 식이요법을 포함한다(문헌참조: 예를 들어, Johnson 등(2013) Diabetes. 62:3307~3315). 요산분해효소 억제제인 옥소닉산의 투여는 고요산혈증을 유도하기 위해서도 사용될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Mazalli 등(2001) Hypertens. 38:1101~1106). 10배 더 높은 수준의 혈청 요산 수치로 고요산혈증을 발생시키는, Jackson Laboratory(/jaxmice.jax.org/strain/002223.html)로부터 이용가능한 B6;129S7-Uoxtm1Bay/J 마우스가 고요산혈증의 유전자 모델에 포함된다.
고요산혈증의 다양한 치료법이 당업계에 알려져 있다. 그러나, 일부 제제는 제한된 집단에서만 사용될 수 있다. 예를 들어, 알로푸리놀은 잔틴 산화효소 억제제로, 다수의 병태, 예를 들어, 통풍, 허혈-재관류 손상, 고혈압, 동맥경화증, 및 뇌졸중을 포함하는 심혈관 질환, 및 염증성 질환의 치료를 위해 혈청 요산 수치를 감소시키는 데에 사용된다(문헌참조: Pacher 등(2006) Pharma. Rev. 58:87~114). 그러나, 알로푸리놀은 신장 기능이 손상된 대상체, 예를 들어, 만성 신장 질환, 갑상선 기능 저하증, 고인슐린혈증, 또는 인슐린 저항성이 있는 대상체; 또는 신장 질환 또는 신장 기능이 손상되기 쉬운 대상체, 예를 들어, 고혈압, 대상 장애, 당뇨병, 및 고령의 대상체에서 사용이 금지된다. 또한, 알로푸리놀은 경구용 응고제 또는 프로베네시드를 복용 중인 대상체뿐만 아니라 이뇨제, 특히 티아지드 이뇨제 또는 시장 기능을 저하시킬 수 있거나 잠재적인 신장 독성이 있을 수 있는 기타 약물을 복용 중인 대상체가 복용해서는 안 된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 고요산혈증을 치료하기 위한 다른 조성물 및 방법, 예를 들어, 알로푸리놀, 옥시푸리놀, 페북소스타트와 조합하여 사용된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 신장 기능이 저하되었거나, 예를 들어, 연령, 동반 질환, 또는 약물의 상호작용으로 인해 신장 기능이 저하되기 쉬운 대상체의 치료에 사용된다.
B. 통풍
통풍은 성인 40명 중 약 1명에게 영향을 미치며, 가장 일반적으로는 30~60세의 남성에게 영향을 미친다. 통풍은 여성에게 덜 흔하게 발생한다. 통풍은 치료에 의해 향후 관절 손상을 피할 수 있는 관절염의 몇 가지 유형 중 하나이다. 통풍은 신장의 요산 제거가 충분하지 않거나 과도한 요산 생성으로부터 기인하는 고요산혈증으로 인한 관절 내 요산 결정체에 대한 염증 반응에 의해 유발되는 급성 염증성 관절염의 재발성 발병을 특징으로 한다. 과당 관련 통풍은 때때로 신장, 장 및 간에서 발현된 수송체의 변이체와 관련이 있다. 통풍은 관절 내에서 그리고 피하에서 결절, 요산 나트륨(MSU) 결정체의 형성 및 침착을 특징으로 한다. 통풍과 관련된 통증은 결절의 크기와 관련이 없지만, MSU 결정체에 대한 면역 반응의 결과이다. 혈청 요산과 결절 크기의 감소 속도 사이에는 선형의 역관계가 있다. 예를 들어, 기질성 통풍이 아닌 18명의 환자를 대상으로 한 한 연구에서, 요산염 저하 요법을 시작한 지 3개월 내에 모든 대상체에서 혈청 요산이 2.7~5.4mg/dL(0.16~0.32mM)으로 감소하였다(문헌참조: Pascual and Sivera (2007) Ann. Rheum. Dis. 66:1056~1058). 그러나, 10년 미만 동안 통풍이 있었던 환자의 경우 혈청 요산을 정상화시키는 것과 함께 MSU 결정체가 무증상 무릎 또는 첫 번째 MTP 관절에서 사라지는 데에 12개월이 소요된 반면, 10년 이상 통풍이 있었던 환자의 경우 18개월이 소요되었다. 따라서, 통풍의 효과적인 치료는 결절의 완전한 제거 또는 모든 증상, 예를 들어, 관절 통증 및 부종, 염증의 완전한 해소를 요구하지는 않지만, 단순히 통풍의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 감소, 예를 들어, 혈청 요산염 수준의 감소와 함께, 통풍 발병의 중증도 또는 빈도의 감소를 필요로 한다.
통풍의 동물 모델은 옥소닉산-유도 고요산혈증을 포함한다(문헌참조: 예를 들어, Jang 등(2014) Mycobiology. 42:296~300).
현재 이용 가능한 통풍 치료제는 다수의 대상체에서 금지되거나 효과가 없다. 통풍이 있는 대상체에서 요산 수치를 감소시키기 위한 일반적인 1차 치료제인 알로푸리놀은 다수의 집단, 특히 상기 논의된 바와 같이 신장 기능이 손상된 집단에서 금지된다. 또한, 다수의 대상체, 예를 들어, 치료에도 불구하고 통풍 발적을 겪는 대상체, 또는 알로푸리놀과 관련된 발진 또는 과민 반응을 겪는 대상체는 알로푸리놀을 사용하는 치료에 실패한다.
특정 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 혈청 요산을 감소시키기 위한 다른 제제와 조합하여 사용된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 통풍 증상의 치료를 위한 제제, 예를 들어, 진통제 또는 항염증제, 예를 들어, NSAIDS와 조합하여 사용된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 신장 기능이 저하되었거나, 예를 들어, 연령, 동반 질환, 또는 약물의 상호작용으로 인해 신장 기능이 저하되기 쉬운 대상체의 치료에 사용된다.
C. 간 질환
NAFLD는 고요산혈증과 관련이 있으며(문헌참조: Xu 등(2015) J. Hepatol. 62:1412~1419), 이는 결과적으로 과당 대사의 상승과 관련이 있다. 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)의 정의는 (a) 영상촬영이나 조직학에 의한 간 지방증의 증거가 있고, (b) 상당한 알코올 섭취, 지방원성 약물 사용 또는 유전성 장애와 같은 이차적인 간 지방 축적의 원인이 없을 것을 요구한다. 대부분의 환자에서, NAFLD는 비만, 당뇨병 및 이상지질혈증과 같은 대사 위험 인자와 관련이 있다. NAFLD는 조직학적으로 비알코올성 지방간(NAFL) 및 비알코올성 지방간염(NASH)으로 추가 분류된다. NAFL은 간세포의 팽창(ballooning) 형태로 간세포 손상의 증거가 없는 간 지방증의 존재로서 정의된다. NASH는 섬유증을 동반하거나 동반하지 않는 간세포 손상(팽창)과 함께 간 지방증 및 염증의 존재로서 정의된다(문헌참조: Chalasani 등(2012) Hepatol. 55:2005~2023). 단순 지방증이 있는 환자는 조직학적 진행이 매우 느린 반면, NASH 환자는 간경변 단계 질환으로의 조직학적 진행을 나타낼 수 있다는 것이 일반적으로 동의된다. NAFLD 및 NASH 환자의 장기적인 결과는 여러 연구에서 보고되었다. 이들의 소견은 다음과 같이 요약될 수 있다; (a) NAFLD 환자는 상응하는 대조군 모집단과 비교하여 전체 사망률이 증가하였고, (b) NAFLD, NAFL 및 NASH 환자에게서 가장 흔한 사망 원인은 심혈관 질환이며, (c) (NAFL이 아닌) NASH 환자는 간 관련 사망률이 증가하였다.
NAFLD의 동물 모델에는 다양한 고지방 또는 고과당을 먹인 동물 모델이 포함된다. NAFLD의 유전자 모델은 The Jackson Laboratory로부터 이용 가능한 B6.129S7-Ldlrtm1Her/J 및 B6.129S4-Ptentm1Hwu/J 마우스를 포함한다.
NAFLD 치료는 통상적으로 NAFLD의 발생을 초래한 병태를 관리하는 것이다. 예를 들어, 이상지질혈증 환자는 필요에 따라, 콜레스테롤 또는 중성지방을 정상화시키는 제제로 치료되어 NAFLD를 치료하거나 이의 추가 진행을 방지한다. 제2형 당뇨병 환자는 포도당 또는 인슐린 민감도를 정상화시키는 제제로 치료된다. 또한 라이프스타일의 변화, 예를 들어, 식이요법 및 운동의 변화가 NAFLD 치료하는 데에 이용된다. NAFLD의 마우스 모델에서, 알로푸리놀을 사용하는 치료는 간 지방증의 발생을 예방하였지만, 또한 마우스에서 확립된 간 지방증을 상당히 개선시키기도 했다(문헌참조: Xu 등, J. Hepatol. 62:1412~1419, 2015).
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 혈청 요산을 감소시키기 위한 다른 제제와 조합하여 사용된다. 특정 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 NAFLD 증상의 치료를 위한 제제와 조합하여 사용된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 신장 기능이 저하되었거나, 예를 들어, 연령, 동반 질환, 또는 약물의 상호작용으로 인해 신장 기능이 저하되기 쉬운 대상체의 치료에 사용된다.
D. 이상지질혈증, 혈당 조절 장애, 대사 증후군 및 비만
이상지질혈증(예를 들어, 고지질혈증, 고LDL 콜레스테롤, 저HDL 콜레스테롤, 고중성지방혈증, 식후고중성지방혈증), 혈당 조절 장애(예를 들어, 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병), 대사 증후군, 지방세포 기능장애, 내장 지방 침착, 비만, 및 과도한 당 갈망은 과당 대사의 증가와 관련이 있다. 병태에 대한 특성 또는 진단 기준이 아래에 제공된다. 대사 장애 및 성분 특징의 동물 모델에는 다양한 고지방 또는 고과당을 먹인 동물 모델이 포함된다. 유전자 모델은 일반적으로 ob 또는 ob/ob 마우스로 알려져 있는, 렙틴 결핍 B6.Cg-Lep ob/J를 포함하며, 이는 The Jackson Laboratory로부터 이용 가능하다.
지질의 정상 공복 수준 및 비정상적인 공복 수준이 아래 표에 제공되어 있다.
식후고중성지방혈증은 주로 중성지방이 풍부한 지질단백질(TRL)의 과생성 또는 이화작용의 감소에 의해 개시되며, 유전적 변이 및 비만 및 인슐린 저항성과 같은 의학적 병태를 유발한 결과이다.
인슐린 저항성은 다음 중 적어도 하나의 존재를 특징으로 한다:
1. 상이한 두 시간대에 측정된 100~125mg/dL의 공복 혈당 수준; 또는
2. 포도당 섭취 2시간 후 포도당 수준이 140~199mg/dL인 경구 포도당 내성 시험.
본원에서 사용되는 바와 같이, 인슐린 저항성은 인슐린 의존성 당뇨병, 특히 제1형 당뇨병의 후기 단계에서 종종 발생하는 바와 같이, 투여된 인슐린에 대한 면역 반응의 결과로서 인슐린에 대한 반응 결여를 포함하지 않는다.
제2형 당뇨병은 다음 중 적어도 하나를 특징으로 한다:
1. 상이한 두 시간대에 측정된 126mg/dL 이상의 공복 혈당 수준;
2. 6.5% 이상의 헤모글로빈 A1c(A1C) 시험 결과; 또는
3. 포도당 섭취 2시간 후 포도당 수준이 200mg/dL 이상인 경구 포도당 내성 시험.
제2형 당뇨병 및 인슐린 저항성에 대한 약리학적 치료는 메트포르민(예를 들어, 글루코파지, 글루메트자), 설포닐우레아(예를 들어, 글리부리드, 글리피지드, 글리메피리드), 메글리티니드(예를 들어, 레파글리니드, 네이트글리니드), 티아졸리딘디온(로시글리타존, 피오글리타존), DPP-4 억제제(시타글립틴, 삭사글립틴, 리나글립틴), GLP-1 수용체 길항제(엑세나티드, 리라글루티드), 및 SGLT2 억제제(예를 들어, 카나글리플로진, 다파글리플로진)과 같은 혈당을 정상화시키는 제제를 사용하는 치료를 포함한다.
비만은 체지방 과잉 질환으로 특징된다. 체중(킬로그램(kg) 단위)을 신장(미터(m) 단위)의 제으로 나누어 계산한 체질량 지수(BMI)는 모든 사람에 대한 것은 아니지만 대부분의 사람에 대한 체지방의 합리적인 추정치를 제공한다. 일반적으로, 18.5 미만의 BMI는 저체중, 18.5 내지 24.9는 정상, 25.0 내지 29.9는 과체중, 30.0 내지 34.9는 비만(클래스 I), 35 내지 39.9는 비만(클래스 II), 그리고 40.0 이상은 고도비만(클래스 III)인 것으로 특징된다.
피하 대 내장 지방의 평가 방법은, 예를 들어, 문헌[Wajchenberg (2000) Subcutaneous and visceral adipose tissue: their relation to the metabolic syndrome, Endocr Rev. 21:697~738]에 제공되며, 이는 본원에 참조로서 통합된다.
대사 증후군은 다음의 5가지 대사 위험 인자 중 적어도 3가지로 정의되는 병태의 군집(cluster)을 특징으로 한다:
1. 큰 허리둘레(여성의 경우 > 35인치 또는 남성의 경우 > 40인치)
2. 높은 중성지방 수준(> 150mg/dl);
3. 저HDL 콜레스테롤(여성의 경우 < 50mg/dl 또는 남성의 경우 < 40mg/dl);
4. 혈압 상승(> 130/85) 또는 고혈압 치료를 위한 약물 복용; 및
5. 높은 공복 혈당(> 100mg/dl) 또는 고혈당을 치료하기 위해 약물을 복용하고 있는 경우.
NAFLD와 마찬가지로, 대사 증후군의 치료를 위한 제제는 존재하는 특정 위험 인자에 좌우되는데, 예를 들어, 지질이 비정상인 경우 지질을 정상화하고, 포도당 또는 인슐린 민감도가 비정상인 경우 이들을 정규화한다.
대사 증후군, 인슐린 저항성, 및 제2형 당뇨병은 종종 신장 기능 감소 또는 신장 기능 감소의 가능성과 관련이 있다.
특정 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 이상지질혈증, 혈당 조절 장애, 대사 증후군, 및 비만을 가진 대상체의 치료에 사용하기 위한 것이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 대사 증후군, 인슐린 저항성, 또는 제2형 당뇨병 및 만성 신장 질환을 가진 대상체에게 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 조성물 및 방법은 심혈관 질환, 갑상선 기능 저하증 또는 염증성 질환 중 하나 이상을 앓고 있는 대사 증후군, 인슐린 저항성 또는 제2형 당뇨병을 앓고 있는 대상체; 또는 고령 대상체(예를 들어, 65세 초과)에게 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 조성물 및 방법은 또한 약물 라벨에 의해 입증 시 신장 기능을 감소시킬 수 있는 약물을 복용 중인 대사 증후군, 인슐린 저항성, 또는 제2형 당뇨병을 앓고 있는 대상체에게 사용하기 위한 것이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 경구용 응고제 또는 프로베네시드로 치료 중인 대사 증후군, 인슐린 저항성, 또는 제2형 당뇨병을 앓고 있는 대상체에게 사용하기 위한 것이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 이뇨제, 특히 티아지드 이뇨제로 치료 중인 대사 증후군, 인슐린 저항성, 또는 제2형 당뇨병을 앓고 있는 대상체에게 사용하기 위한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 혈청 요산을 감소시키기 위한 다른 제제와 조합하여 사용된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 대사 증후군, 인슐린 저항성, 또는 제2형 당뇨병의 증상을 치료하기 위한 제제와 조합하여 사용된다. 특정 구현예에서, 대상체는, 예를 들어, 혈압을 낮추는 제제, 예를 들어, 이뇨제, 베타-차단제, ACE 억제제, 안지오텐신 II 수용체 차단제, 칼슘 채널 차단제, 알파 차단제, 알파-2 수용체 길항제, 알파-차단제와 베타-차단제의 조합, 중앙 작용제, 말초 아드레날린 억제제, 및 혈관 확장제; 콜레스테롤을 감소시키는 제제, 예를 들어, 스타틴, 선택적 콜레스테롤 흡수 억제제, 수지, 또는 지질 저하 요법; 또는 혈당을 정상화시키는 제제, 예를 들어, 메트포르민, 설포닐우레아, 메글리티나이드, 티아졸리딘디온, DPP-4 억제제, GLP-1 수용체 길항제, 및 SGLT2 억제제로 치료된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 신장 기능이 저하되었거나, 예를 들어, 연령, 동반 질환, 또는 약물의 상호작용으로 인해 신장 기능이 저하되기 쉬운 대상체의 치료에 사용된다.
iRNA 및 추가 치료제는 동시에 또는 동일한 조합으로, 예를 들어, 비경구 투여될 수 있거나, 추가 치료제는 별도의 조성물의 일부로서 또는 별도의 시간에 또는 당업계에 공지되거나 본원에 기술된 또 다른 방법에 의해 투여될 수 있다.
E. 심혈관 질환
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 심혈관 질환을 앓고 있는 대상체의 치료에 사용하기 위한 것이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 심혈관 질환 및 만성 신장 질환을 앓고 있는 대상체에게 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 조성물 및 방법은 대사 장애, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 당뇨병, 갑상선기능저하증, 또는 염증성 질환 중 하나 이상을 앓고 있는 심혈관 질환을 앓고 있는 대상체에게 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 조성물 및 방법은 약물 라벨에 의해 입증 시 신장 기능을 감소시킬 수 있는 약물 또한 복용 중인 심혈관 질환을 앓고 있는 대상체에게 사용하기 위한 것이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 경구용 응고제 또는 프로베네시드로 치료 중인 심혈관 질환을 앓고 있는 대상체에게 사용하기 위한 것이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 이뇨제, 특히 티아지드 이뇨제로 치료 중인 심혈관 질환을 앓고 있는 대상체에게 사용하기 위한 것이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 알로푸리놀을 사용하는 치료에 실패한 심혈관 질환을 앓고 있는 대상체에게 사용하기 위한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 혈청 요산을 감소시키기 위한 다른 제제와 조합하여 사용된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 심혈관 질환의 증상을 치료하기 위한 제제, 예를 들어, 혈압을 낮추는 제제, 예를 들어, 이뇨제, 베타-차단제, ACE 억제제, 안지오텐신 II 수용체 차단제, 칼슘 채널 차단제, 알파 차단제, 알파-2 수용체 길항제, 알파-차단제와 베타-차단제의 조합, 중앙 작용제, 말초 아드레날린 억제제, 및 혈관 확장제; 또는 콜레스테롤을 감소시키는 제제, 예를 들어, 스타틴, 선택적 콜레스테롤 흡수 억제제, 수지, 또는 지질 저하 요법과 조합하여 사용된다.
F. 신장 질환
신장 질환은, 예를 들어, 급성 신장 장애, 요세관 기능장애, 근위 세관에 대한 전염증성 변화, 및 만성 신장 질환을 포함한다.
급성 신부전(신장)은 신장이 혈액으로부터의 노폐물을 갑자기 여과할 수 없게 되어 혈청 내 노폐물 축적의 위험한 수준 및 전신 화학물질 불균형을 초래할 때 발생한다. 급성 신장 부전은 수시간 또는 수일에 걸쳐 빠르게 발생할 수 있으며, 이미 입원한 사람, 특히 집중 치료가 필요한 중환자에게 가장 일반적이다. 급성 신부전은 치명적일 수 있으며 집중 치료가 필요하다. 그러나, 급성 신부전은 회복가능할 수 있다. 건강 상태가 양호한 경우, 정상 또는 거의 정상적인 신장 기능을 회복할 수 있다.
만성 신부전이라고도 불리는 만성 신장 질환은 신장 기능의 점진적인 상실을 말한다. 만성 신장 질환이 상당히 진행된 경우, 위험한 수준의 체액, 전해질 및 노폐물이 체내에 축적될 수 있다. 신장 질환의 징후 및 증상에는 메스꺼움, 구토, 식욕 상실, 피로 및 허약, 수면 문제, 소변량의 변화, 정신 선명도 감소, 근육 경련(twitch) 및 발작(cramp), 딸꾹질, 발과 발목의 부종, 지속적인 가려움, 흉통, 체액이 심장 내벽 주위에 축적되는 경우에는 호흡곤란, 체액이 폐에 축적되는 경우에는 조절하기 어려운 고혈압이 포함될 수 있다. 만성 신장 질환의 징후 및 증상은 종종 비특이적이며, 서서히 발생할 수 있고, 회복이 불가능한 손상이 발생할 때까지 나타나지 않을 수 있다.
신장 질환은 신장 손상을 유발하는 손상 제제 또는 병태를 제거함으로써 치료되는데, 예를 들어, 신장 기능을 개선하기 위해 혈압을 정상화시키고, 신장 손상을 유도할 수 있는 제제를 사용한 치료를 종료하거나, 신장 손상을 유발하는 염증을 감소시키거나, 신장 기능을 보조하기 위해 신장 지원(예를 들어, 신장 투석)을 제공함으로써 치료된다.
신장 기능은 통상적으로 하나 이상의 일상적인 실험실 검사, BUN(혈중 요소 질소), 크레아티닌(혈액), 크레아티닌(소변), 또는 크레아티닌 클리어런스를 사용하여 결정된다(예를 들어, www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003435.htm를 참조함). 검사는 또한 다른 기관의 병태를 진단할 수 있다.
일반적으로, 6 내지 20mg/dL의 BUN 수준은 정상으로 간주되지만, 정상 값은 실험실마다 다를 수 있다. BUN 수준 상승은 사구체신염, 신우신염, 및 급성 요세관 괴사, 또는 신부전을 포함하는 신장 질환을 나타낼 수 있다.
혈중 크레아티닌의 정상 결과는 남성의 경우 0.7 내지 1.3mg/dL이고 여성의 경우 0.6 내지 1.1mg/dL이다. 혈중 크레아티닌 상승은 신장 손상 또는 신부전, 감염, 또는 혈류 감소로 인한 신장 기능 손상을 나타낼 수 있다.
소변 크레아티닌(24시간 시료) 수치는 500 내지 2000mg/일의 범위일 수 있다. 결과는 연령과 체지방량에 따라 달라진다. 정상적인 결과는 남성의 경우 일일 체질량(kg 단위)당 14 내지 26mg이고 여성의 경우 일일 체질량(kg 단위)당 11 내지 20mg이다. 비정상적인 결과는 세관 세포 손상, 신부전, 신장으로 가는 혈류 감소, 또는 신장 감염(신우신염)과 같은 신장 손상을 나타낼 수 있다.
크레아티닌 클리어런스 검사는 소변 내 크레아티닌 수준과 혈액 내 크레아티닌 수준을 비교하여 신장 기능에 관한 정보를 제공하는 데 도움이 된다. 클리어런스는 종종 분당 밀리리터(ml/분)로 측정된다. 정상 값은 남성의 경우 97 내지 137ml/분이고, 여성의 경우 88 내지 128ml/분이다. 정상보다 낮은 크레아티닌 클리어런스는 세관 세포 손상, 신부전, 신장으로 가는 혈류 감소, 또는 신장의 사구체 여과 감소와 같은 신장 손상을 나타낼 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 신장 질환의 치료에 사용될 수 있다. 이러한 제제는 신장에 손상을 일으키지 않을 것으로 예상된다.
Ⅹ. 키트
특정 양태에서, 본 개시내용은 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중 가닥 siRNA 화합물 또는 siRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어 siRNA 화합물로 가공될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어 이중 가닥 siRNA 화합물 또는 ssiRNA 화합물을 암호화하는 DNA 또는 이의 전구체)의 약제학적 제형을 함유하는 적합한 용기를 포함하는 키트를 제공한다.
이러한 키트는 하나 이상의 dsRNA 제제(들) 및 사용 설명서, 예를 들어 예방학적 또는 치료적 유효량의 dsRNA 제제(들)를 투여하기 위한 지침서를 포함한다. dsRNA 제제는 바이알 또는 사전에 충전된 주사기에 있을 수 있다. 선택적으로 키트는 dsRNA 제제를 투여하기 위한 수단(예를 들어, 사전에 충전된 주사기와 같은 주사 장치), 또는 KHK의 억제를 측정하기 위한 수단(예를 들어, KHK mRNA, KHK 단백질, 및/또는 KHK 활성의 억제를 측정하기 위한 수단)을 추가로 포함할 수 있다. KHK의 억제를 측정하기 위한 이러한 수단은, 예를 들어, 혈장 시료와 같은, 대상체로부터의 시료를 수득하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 선택적으로 치료학적 유효량 또는 예방학적 유효량을 결정하기 위한 수단을 추가로 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 약제학적 제형의 개별 성분은 하나의 컨테이너, 예를 들어 바이알 또는 미리 충전된 주사기에 제공될 수 있다. 대안적으로, 약제학적 제형의 성분을 2개 이상의 컨테이너, 예를 들어 siRNA 화합물 제조를 위한 하나의 컨테이너 및 캐리어 화합물을 위한 적어도 또 다른 컨테이너에 별도로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 키트는 단일 박스에 하나 이상의 컨테이너와 같은 다양한 구성으로 패키징될 수 있다. 예를 들어 키트와 함께 제공된 지침에 따라 다양한 성분들이 조합될 수 있다. 성분들은 예를 들어 약제학적 조성물을 제조 및 투여하기 위해 본원에 기술된 방법에 따라 조합될 수 있다. 키트는 또한 전달 장치를 포함할 수 있다.
본 발명은 제한하는 것으로 해석되어서는 안되는 다음의 실시예에 의해 추가로 예시된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참조, 특허 및 공개된 특허 출원의 전문뿐만 아니라 비공식적인 서열 목록이 본원에 참조로서 통합된다.
실시예
실시예 1. iRNA 합성
시약 공급원
시약 공급원이 본원에 구체적으로 주어지지 않는 경우, 그러한 시약은 분자 생물학에 적용하기 위한 품질/순도 표준에서 분자 생물학용 시약 공급업체로부터 수득될 수 있다.
siRNA 설계
인간 KHK(인간 NCBI 참조서열번호: XM_017004061.1; NCBI 유전자번호: 3795)를 표적으로 하는 siRNA가 맞춤형 R 및 파이톤 스크립트를 사용하여 설계되었다. 인간 KHK REFSEQ mRNA는 2283개 염기의 길이를 갖는다.
미변형 KHK 센스 및 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열의 상세한 목록이 표 2, 5 및 8에 나타나 있다. 변형 KHK 센스 및 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열의 상세한 목록이 표 3, 6 및 9에 나타나 있다.
출원 전반에 걸쳐, 소수가 없는 듀플렉스 명칭은 단지 듀플렉스의 배치 번호를 참조하는 소수를 갖는 듀플렉스 명칭과 동등하다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어,AD-959917은 AD-959917.1과 동등하다.
siRNA 합성
당업계에 공지된 방법을 사용하여 siRNA가 설계, 합성되고, 제조되었다.
간략하게, siRNA 서열이 고체 지지체 상의 포스포라미다이트 화학작용을 갖는 Mermade 192 합성기(BioAutomation)를 사용하여 1μmol 규모로 합성되었다. 고체 지지체는 맞춤형 GalNAc 리간드(3’-GalNAc 접합체), 범용 고체 지지체(AM Chemicals) 또는 관심 제1 뉴클레오타이드로 로딩된 제어된 기공 유리(500-1000 Å)였다. 보조 합성 시약 및 표준 2-시아노에틸 포스포라미다이트 단량체(2’-데옥시-2’-플루오로, 2’-O-메틸, RNA, DNA)는 Thermo-Fisher(위스콘신주 밀워키), 홍엔(중국), 또는 Chemgenes(미국 매사추세츠주 윌밍턴)로부터 수득되었다. 추가의 포스포라미다이트 단량체는 상업적 공급업체로부터 조달되거나, 자체적으로 제조되거나, 다양한 CMO로부터의 맞춤형 합성을 사용하여 조달되었다. 아세토나이트릴 또는 9:1 아세토니트릴:DMF 중 어느 하나에서 100 mM의 농도로 포스포라미다이트를 제조하고 5-에틸티오-1H-테트라졸(ETT, 아세토니트릴 중 0.25 M)을 사용해 400초의 반응 시간으로 결합시켰다. 무수 아세토니트릴/피리딘(9:1 v/v) 중 3-((디메틸아미노-메틸리덴) 아미노)-3H-1,2,4-디티아졸-3-티온(DDTT, Chemgenes(미국 매사추세츠주 윌밍턴)로부터 입수함)의 100 mM 용액을 사용하여 포스포로티오에이트 연결을 생성하였다. 산화 시간은 5분이었다. 모든 서열은 DMT 군의 최종 제거(“DMT-Off”)로 합성하였다.
고형상 합성의 완료 시, 고형 지지 올리고리보뉴클레오타이드를 실온에서 약 2시간 동안 96 웰 플레이트에서 300 μL의 메틸아민(40% 수성)으로 처리하여 고형 지지체로부터 절단하고 모든 추가의 염기 불안정 보호기를 후속 제거하였다. 털트-부틸 디메틸 실릴(TBDMS)기로 보호된 임의의 천연 리보뉴클레오타이드 연결(2'-OH)을 함유하는 서열의 경우, 제2 탈보호 단계를 TEA.3HF(트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드)를 사용하여 수행하였다. 수성 메틸아민 중의 각각의 올리고뉴클레오타이드 용액에 200 μL의 디메틸 설폭시드(DMSO) 및 300 μL TEA.3HF를 첨가하고, 용액을 60°C에서 대략 30분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 플레이트를 실온으로 옮겨 미정제 올리고뉴클레오타이드를 1 mL의 9:1 아세톤트리올:에탄올 또는 1:1 에탄올:이소프로판올의 첨가에 의해 침전하도록 하였다. 그런 다음, 플레이트를 4°C에서 45분 동안 원심분리하고, 다중 채널 피펫의 도움으로 상청액을 조심스럽게 디켄팅하였다. 올리고뉴클레오타이드 펠릿은 20 mM NaOAc에 재현탁하고, 이어서 자동샘플러, UV 검출기, 전도도 측정기, 및 분별 수집기가 구비된 Agilent LC 시스템 상에서 HiTrap 크기 배제 컬럼(5 mL, GE Healthcare)을 사용하여 탈염하였다. 탈염된 샘플을 96 웰 플레이트에서 수집한 다음, LC-MS 및 UV 분광분석법으로 분석하여 각각 동일성을 확인하고 재료의 양을 정량화하였다.
단일 가닥의 듀플렉싱을 Tecan 액체 취급 로봇 상에서 수행하였다. 센스 및 안티센스 단일 가닥을 96웰 플레이트에서 1x PBS의 10 μM의 최종 농도에 대한 등몰 비율로 조합하고, 플레이트를 밀봉하고, 100°C에서 10분 동안 항온처리한 다음, 2~3시간에 걸쳐 서서히 실온으로 복귀시켰다. 각각의 듀플렉스의 농도 및 동일성을 확인한 다음 시험관 내 스크리닝 검정에 사용하였다.
실시예 2. 시험관 내 스크리닝 방법
HepG2 세포 배양 및 96-웰 형질감염
트립신화(trypsinization)에 의해 플레이트로부터 방출되기 전에, HepG2 세포가 10% FBS(ATCC)로 보충된 Eagle의 최소 필수 배지(Gibco)에서 5% CO2의 대기인 37°C에서 거의 합류점까지 성장되었다. 형질감염이 웰당 18.5 ml의 Opti-MEM과 0.25 ml의 리포펙타민 RNAiMax(Invitrogen, Carlsbad CA. cat # 13778-150)를 96-웰 플레이트 내 개별 웰에 대한 각각의 siRNA 듀플렉스의 5 ml에 첨가함으로써 수행되었다. 혼합물은 이어서 15분 동안 실온에서 항온처리되었다. 이어서~2 x104 HepG2 세포를 함유하는 무항생제의 80 ml의 완전 성장 배지를 siRNA 혼합물에 첨가하였다. 세포는 RNA 정제 전에 24시간 동안 항온처리되었다. 용량 실험이 10nM, 1nM, 및 0.1nM 최종 듀플렉스 농도에서 수행되었다.
DYNABEADS mRNA 단리 키트(Invitrogen??, 부품 #: 610-12)를 사용한 총 RNA 단리
세포는 웰당 3μL의 비드를 함유하는 75ml의 용해/결합 완충액에 용해되었고 정전기 쉐이커 상에서 10분 동안 혼합되었다. 자기 플레이트 지지체를 사용하여, 세척 단계가 Biotek EL406 상에서 자동화되었다. 비드를 (90mL에서)완충액 A에서 1회, 완충액 B에서 1회, 및 완충액 E에서 2회 세척하고, 그 사이에 흡입 단계를 두었다. 최종 흡입 후, 하기에서 기술되는 것과 같이, 완료 10mL RT 혼합물을 각 웰에 첨가하였다.
ABI 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA, Cat #4368813)를 사용한 cDNA 합성
반응물당 1μl 10X 완충액, 0.4ml 25X dNTP, 1ml 무작위 프라이머, 0.5ml 역전사 효소, 0.5ml RNase 억제제 및 6.6ml의 H2O의 마스터 혼합물이 웰당 첨가되었다. 플레이트를 밀봉하고, 정전기 진탕기 상에서 10분 동안 교반된 다음, 37°C에서 2시간 동안 항온처리되었다. 그 후, 플레이트를 80°C에서 8분 동안 교반하였다.
실시간 PCR
웰당 384 웰 플레이트(Roche cat # 04887301001)에, 2 마이크로리터(μL)의 cDNA를 0.5μL의 인간 GAPDH TaqMan 프로브(4326317E), 0.5μl 인간 KHK, 2μl 뉴클레아제가 없는 물 및 5μl의 라이트사이클러 480 프로브 마스터 혼합물(Roche Cat # 04887301001)을 함유하는 마스터 혼합물에 첨가하였다. 실시간 PCR은 라이트사이클러480 실시간 PCR 시스템(Roche)에서 수행되었다.
상대적 배수 변화를 계산하기 위해, 데이터를 ΔΔCt 방법을 사용하여 분석하고 10nM AD-1955로 형질감염된 세포 또는 모방 형질감염된 세포로 수행된 검정에 대해 정규화하였다. XLFit를 사용한 4 파라미터 피팅 모델을 사용하여 IC50을 계산하고, AD-1955로 형질감염된 세포 또는 모방 형질감염된 세포에 대해 정규화되었다. AD-1955의 센스 및 안티센스 서열은: 센스: cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT(서열번호 18) 및 안티센스 UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT(서열번호 19)이다.
HepG2 세포에서의 표 2 및 3에 열거된 dsRNA 제제의 형질감염 검정의 결과를 표 4에 나타냈다.
[표 1] 핵산 서열 제공에서 사용되는 뉴클레오타이드 단량체의 약어. 올리고뉴클레오타이드에 존재할 때, 이들 단량체는 5'-3'-포스포디에스테르 결합에 의해 상호 연결되는 것을 이해할 것이고; 뉴클레오타이드가 2'-플루오로 변형을 함유하는 경우, 플루오로가 부모 뉴클레오타이드의 해당 위치에서 하이드록시를 대체한다는 것을 이해할 것이다(즉, 이는 2'-데옥시-2'-플루오로뉴클레오타이드임).
실시예 3. 추가 dsRNA 듀플렉스의 설계, 합성 및 시험관 내 스크리닝
당업계에 공지되고 실시예 1에서 전술된 방법을 사용하여 추가 siRNA가 설계, 합성되고, 제조되었다.
추가적인 미변형 KHK 센스 및 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열의 상세한 목록이 표 5에 나타나 있다. 변형 KHK 센스 및 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열의 상세한 목록이 표 6에 나타나 있다.
형질감염을 위해, 트립신화(trypsinization)에 의해 플레이트로부터 방출되기 전에, Hep3b 세포(ATCC, Manassas, VA)가 10% FBS(ATCC)로 보충된 Eagle의 최소 필수 배지(Gibco)에서 5% CO2의 대기인 37°C에서 거의 합류점까지 성장되었다. 형질감염이 웰당 7.5 ml의 Opti-MEM과 0.1 ml의 리포펙타민 RNAiMax(Invitrogen, Carlsbad CA. cat # 13778-150)를 384-웰 플레이트 내 개별 웰에 각각의 siRNA 듀플렉스의 2.5 ml에 첨가함으로써 수행되었다. 혼합물은 이어서 15분 동안 실온에서 항온처리되었다. 이어서, 약 1.5 x104 Hep3b 세포를 함유하는 무항생제의 40ml의 완전 성장 배지를 siRNA 혼합물에 첨가하였다. 세포는 RNA 정제 전에 24시간 동안 항온처리되었다. 단일 투여량 실험이 10nM의 최종 듀플렉스 농도로 수행되었다.
총 RNA 단리가 DYNABEADS를 사용하여 수행되었다. 간략하게, 세포는 웰당 3μL의 비드를 함유하는 10ml의 용해/결합 완충액에서 용해되었고 정전기 진탕기 상에서 10분 동안 혼합되었다. 자기 플레이트 지지체를 사용하여, 세척 단계가 Biotek EL406 상에서 자동화되었다. 비드는 (3mL에서) 완충액 A에서 1회, 완충액 B에서 1회, 그리고 완충액 E에서 2회 세척되고, 그 사이에 흡입 단계를 두었다. 최종 흡입 후, 하기에서 기술되는 것과 같이, 완료 12mL RT 혼합물이 각각의 웰에 첨가되었다.
cDNA 합성을 위해, 반응당 1.5μl 10X 완충액, 0.6ml 10X dNTP, 1.5ml 무작위 프라이머, 0.75ml 역전사 효소, 0.75ml RNase 억제제 및 9.9ml의 H2O의 마스터 혼합물이 웰당 첨가되었다. 플레이트를 밀봉하고, 정전기 진탕기 상에서 10분 동안 교반된 다음, 37°C에서 2시간 동안 항온처리되었다. 그 후, 플레이트를 80°C에서 8분 동안 교반하였다.
RT-qPCR을 전술한 것과 같이 수행하였고, 상대 배수 변화를 전술한 것과 같이 계산하였다.
Hep3b 세포에서의 표 5 및 6에 열거된 dsRNA 제제의 형질감염 검정의 결과를 표 7에 나타냈다.
표 8은 선택된 dsRNA 제제의 미변형 KHK 센스 및 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열의 목록을 제공한다. 표 9는 선택된 dsRNA 제제의 변형 KHK 센스 및 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열의 목록을 제공한다.
실시예 4. 추가 dsRNA 듀플렉스의 설계, 합성 및 시험관 내 스크리닝
실시예 1에서 전술된 방법을 사용하여 추가 siRNA가 설계, 합성되고, 제조되었다.
추가적인 미변형 KHK 센스 및 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열의 상세한 목록이 표 10에 나타나 있다. 변형 KHK 센스 및 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열의 상세한 목록이 표 11에 나타나 있다.
실시예 5. 추가 dsRNA 듀플렉스의 설계, 합성 및 시험관 내 스크리닝
시험관 내 분석에 기초하여, 구조-활성 관계(SAR) 분석을 수행하였다. 특히, 추가적인 듀플렉스를 설계, 합성 및 분석하였다.
siRNA를 전술한 방법을 사용하여 설계, 합성하고, 제조하였다. 이들 siRNA를 이요한 Hep3B 및 PCH 세포에서의 시험관 내 스크리닝 검정을 전술한 것과 같이 수행하였다.
미변형 KHK 센스 및 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열의 상세한 목록이 표 12에 나타나 있다. 변형 KHK 센스 및 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열의 상세한 목록이 표 13에 나타나 있다.
형질감염을 위해, 트립신화(trypsinization)에 의해 플레이트로부터 방출되기 전에, 세포(ATCC, Manassas, VA)가 10% FBS(ATCC)로 보충된 Eagle의 최소 필수 배지(Gibco)에서 5% CO2의 대기인 37°C에서 거의 합류점까지 성장되었다. 형질감염이 웰당 7.5 ml의 Opti-MEM과 0.1 ml의 리포펙타민 RNAiMax(Invitrogen, Carlsbad CA. cat # 13778-150)를 384-웰 플레이트 내 개별 웰에 각각의 siRNA 듀플렉스의 2.5 ml에 첨가함으로써 수행되었다. 혼합물은 이어서 15분 동안 실온에서 항온처리되었다. 이어서, 약 1.5 x104 세포를 함유하는 무항생제의 40ml의 완전 성장 배지를 siRNA 혼합물에 첨가하였다. 세포는 RNA 정제 전에 24시간 동안 항온처리되었다. 단일 투여량 실험이 10, 1 및 0.1nM의 최종 듀플렉스 농도로 수행되었다.
총 RNA 단리가 DYNABEADS를 사용하여 수행되었다. 간략하게, 세포는 웰당 3μL의 비드를 함유하는 10ml의 용해/결합 완충액에서 용해되었고 정전기 진탕기 상에서 10분 동안 혼합되었다. 자기 플레이트 지지체를 사용하여, 세척 단계가 Biotek EL406 상에서 자동화되었다. 비드는 (3mL에서)완충액 A에서 1회, 완충액 B에서 1회, 및 완충액 E에서 2회 세척되고, 그 사이에 흡입 단계를 두었다. 최종 흡입 후, 하기에서 기술되는 것과 같이, 완료 12mL RT 혼합물이 각각의 웰에 첨가되었다.
cDNA 합성을 위해, 반응당 1.5μl 10X 완충액, 0.6ml 10X dNTP, 1.5ml 무작위 프라이머, 0.75ml 역전사 효소, 0.75ml RNase 억제제 및 9.9ml의 H2O의 마스터 혼합물이 웰당 첨가되었다. 플레이트를 밀봉하고, 정전기 진탕기 상에서 10분 동안 교반된 다음, 37°C에서 2시간 동안 항온처리되었다. 그 후, 플레이트를 80°C에서 8분 동안 교반하였다.
RT-qPCR이 전술한 것과 같이 수행되었고, 상대 배수 변화가 전술한 것과 같이 계산되었다. Hep3B 세포에서의 표 12 및 13에 열거된 dsRNA 제제의 형질감염 검정 결과를 표 14에 나타냈다. 일차 시노몰구스 간세포(PCH)에서의 표 12 및 13에 열거된 dsRNA 제제의 형질감염 검정 결과를 표 15에 나타냈다.
이중-Glo® 루시퍼라제 검정을 위해, 트립신화(trypsinization)에 의해 플레이트로부터 방출되기 전에, 세포(ATCC, Manassas, VA)가 10% FBS(ATCC)로 보충된 Eagle의 최소 필수 배지(Gibco)에서 5% CO2의 대기인 37°C에서 거의 합류점까지 성장되었다. 이중-Glo® 루시퍼라제 작제물을 인간 KHK 게놈 서열을 함유하는 psiCHECK2 플라스미드에서 생성하였다. siRNA(표 12 및 13)를 이용하여, 각각의 이중-루시퍼라제 플라스미드를 리포펙타민 2000(Invitrogen, Carlsbad CA. cat # 11668-019)을 사용해 대략 2x104개의 세포로 공동형질감염시켰다. 96 웰 플레이트의 각 웰에 대해, 0.5μl의 리포펙타민을 14.8μl의 Opti-MEM 중의 100ng의 플라스미드 벡터 및 단일 siRNA(표 12 및 13)에 첨가하고, 실온에서 15분 동안 복합체를 만들었다. 그런 다음, 혼합물을 세포에 첨가하고, 80μl의 신선한 완료 배지에서 재현탁시켰다. 세포를 24시간 동안 항온처리한 후 루시퍼라제를 측정하였다. 단일 투여량 실험이 10, 1 및 0.1nM의 최종 듀플렉스 농도로 수행되었다.
siRNA의 형질감염 48시간 후에 반딧불이(형질감염 대조군) 및 Rinella(KHK 표적 서열에 융합됨) 루시퍼라제를 측정하였다. 먼저, 세포로부터 배지를 제거하였다. 그런 다음, 각각의 웰에 배양 배지 부피와 동일한 75μl의 이중-Glo® 루시퍼라제 시약을 첨가함으로써 반딧불이 루시퍼라제 활성을 측정하고 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 항온처리한 후, Spectramax(Molecular Devices) 상에서 발광(500nm)을 측정하여 반딧불이 루시퍼라제 신호를 검출하였다. 75μl의 실온의 이중-Glo® Stop&Glo® 시약을 각 웰에 첨가함으로써 레닐라 루시퍼라제 활성을 측정하고, 플레이트를 10~15분 동안 항온처리한 후, 발광을 다시 측정하여 레닐라 루시퍼라제 신호를 결정하였다. 이중-Glo® Stop&Glo® 시약은, 반딧불이 루시퍼라제 신호를 켄칭하고, 레닐라 루시퍼라아제 반응에 대한 발광을 지속시킨다. siRNA 활성은 각 웰 내의 반딧불이(대조군) 신호에 대한 레닐라(KHK) 신호를 정규화함으로써 결정되었다. 그런 다음, siRNA 활성의 크기를 동일한 벡터로 형질감염되었지만 siRNA로 처리되지 않았거나 비표적 siRNA로 처리된 세포에 대해 상대적으로 평가되었다. 모든 형질감염은 4회 수행되었다.
표 16은 표 12 및 13에 표시된 제제로 형질감염된 세포에서의 단일 투여량 스크리닝의 이중-Glo® 루시퍼라제 검정 결과를 보여준다.
실시예 6. 비인간 영장류에서의 siRNA -GalNAC 접합체의 효과
비인간 영장류에서의 이들의 효과에 대해, 전술한 시험관 내 연구로부터 식별된 후보물질인, 듀플렉스 AD-1613062, AD-1613073, AD-1613242, AD-1613243, AD-1613246, AD-1613247, AD-1613400, AD-1634397, AD-1634424, 및 AD-1634425의 효과가 추가로 조사되었다. 구체적으로, 3mg/kg의 AD-1613062, AD-1613073, AD-1613242, AD-1613243, AD-1613246, AD-1613247, AD-1613400, AD-1634397, AD-1634424, 또는 AD-1634425의 단일 투여량이 시노몰구스 원숭이에게 피하 투여되었다. 혈청 및 조직 시료가 투여 후 29, 50 및 78일차에 수집되었다.
Macherey-Nagel에 의해 NucleoMag RNA 키트를 사용하여 자기 비드 기반 추출 방법에 의해 간 조직으로부터 mRNA를 추출하였다. Applied Biosystems SuperScript IV VILO 마스터 혼합물을 사용하여 cDNA를 생성하였다. Taqman 프로브 기반 qPCR을 사용하여 2개의 하우스키핑 유전자인 ARL6IP4 및 PPIB의 기하 평균으로 정규화된 KHK mRNA를 정량화하였다.
시노몰구스 원숭이 간에서 KHK 단백질의 표적화된 정량화가 양이온 모드(positive ion mode)에서 병렬 반응 모니터링(PRM)을 사용하여 질량 분광계(LC-MS)에 결합된 액체 크로마토그래피를 통해 수행되었다. 정량화를 위해 선택된 시그니처 펩타이드 서열은 HLGFQSAGEALR(UniProtKB - A0A2K5V1R8-1, 아미노산 위치 198~209)이었다.
도 2는 선택된 듀플렉스의 단일 3mg/kg 투여량의 투여가 투여 후 29일차에 KHK mRNA 및 단백질의 수준에 미치는 효과를 보여준다.
도 3은 선택된 듀플렉스의 단일 3mg/kg 투여량의 투여가 투여 후 50일차에 KHK mRNA 수준에 미치는 효과를 보여준다.
도 4는 선택된 듀플렉스의 단일 3mg/kg 투여량의 투여가 투여 후 78일차에 KHK mRNA 수준에 미치는 효과를 보여준다.
데이터는 표시된 제제, 예를 들어, AD-1613400 및 AD-1613243이 KHK mRNA 및 단백질 발현을 지속적으로 그리고 강력하게 억제하는 데에 효과적임을 입증한다.
균등물
당업자는 단지 통상적인 실험을 사용하여 본원에 기술된 특정 구현예 및 방법에 대한 많은 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 다음 청구범위의 범주에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> ALNYLAM PHARMACEUTICALS, INC. <120> KETOHEXOKINASE (KHK) IRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF <130> 121301-14720 <140> <141> <150> 63/280,668 <151> 2021-11-18 <150> 63/223,581 <151> 2021-07-20 <150> 63/154,005 <151> 2021-02-26 <160> 2041 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2283 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggggcggggc ggggccgccg cgaccgcggg cttcaggcag ggctgcagat gcgaggccca 60 gctgtacctc gcgtgtcccg ggtcgggagt cggagacgca ggtgcaggag agtgcggggc 120 aagtagcgca ttttctcttt gcattctcga gatcgcttag ccgcgcttta aaaaggtttg 180 catcagctgt gagtccatct gacaagcgag gaaactaagg ctgagaagtg ggaggcgttg 240 ccatctgcag gcccaggcaa cctgctacgg gaagaccggg gaccaagacc tctgggttgg 300 ctttcctaga cccgctcggg tcttcgggtg tcgcgaggaa gggccctgct cctttcgttc 360 cctgcacccc tggccgctgc aggtggctcc ctggaggagg agctcccacg cggaggagga 420 gccagggcag ctgggagcgg ggacaccatc ctcctggata agaggcagag gccgggagga 480 accccgtcag ccgggcgggc aggaagctct gggagtagcc tcatggaaga gaagcagatc 540 ctgtgcgtgg ggctagtggt 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1620 gcaggagttg gacgcgttgc ctccgcgctg ccatctctgg gacaaacacc ttatctccga 1680 gtcctcctta gggtacttgt ccaccaggct gatgacgtcc agcaccacta gccccacgca 1740 caggatctgc ttctcttcca tgaggctact cccagagctt cctgcccgcc cggctgacgg 1800 ggttcctccc ggcctctgcc tcttatccag gaggatggtg tccccgctcc cagctgccct 1860 ggctcctcct ccgcgtggga gctcctcctc cagggagcca cctgcagcgg ccaggggtgc 1920 agggaacgaa aggagcaggg cccttcctcg cgacacccga agacccgagc gggtctagga 1980 aagccaaccc agaggtcttg gtccccggtc ttcccgtagc aggttgcctg ggcctgcaga 2040 tggcaacgcc tcccacttct cagccttagt ttcctcgctt gtcagatgga ctcacagctg 2100 atgcaaacct ttttaaagcg cggctaagcg atctcgagaa tgcaaagaga aaatgcgcta 2160 cttgccccgc actctcctgc acctgcgtct ccgactcccg acccgggaca cgcgaggtac 2220 agctgggcct cgcatctgca gccctgcctg aagcccgcgg tcgcggcggc cccgccccgc 2280 ccc 2283 <210> 3 <211> 2397 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 aggcagggct gcagatgcga ggcccagctg tacctcgcgt gtcccgggtc gggagtcgga 60 gacgcaggtg caggagagtg cggggcaagt agcgcatttt ctctttgcat tctcgagatc 120 gcttagccgc 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agcaaggaaa 960 gcacagtgca ggagttggac gcgttgcctc cacgctgcca tctctgggat aggcacctgc 1020 gatccgtgtc ttcctctggg tatttgtcca ccacattgat gatgtccagc accaccagcc 1080 ccacgcacag gatctgcttc tcttccatga ggctgctccc caagcttcct acccgcaagc 1140 ggaggggatt cctgctagac tctgtctctt atctaccgca ggaccgtgtc ccaacttctc 1200 aggggctacc ctggctcctc ctctgcctgc ggagctcctc ccgcagggtg ctttctgctg 1260 ttgcgagggt ttggttacct agtccggcca atggcagacc ctctcac 1307 <210> 11 <211> 2416 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 11 ggggccgggc agccgcgacc acggtcttca ggcagggctg cagatgcagg cccagctcta 60 cctcgcgggt ccagggtcgg gagtccgaga cgcaggtgca gcagagggcg gggcacgtag 120 cgcatttcca gcgcattttc tctttgcatt ctcgagatcg cttagccgcg ctttagaagg 180 gtttgcatca gctccgagtc catctgacaa gcgaggaaac tgaggctgag aagtgggagg 240 cgttgccatc tgcaggccca ggcaacctgc tacgggaaga ccgggggcca agacctccgg 300 gttggctttc ccaggccagc ttgggtcttc gggtgtcggg agcaaaggcc cagctccttt 360 cgtttcctgc acccctcgcc gctgcaggtg gctccccgga ggaggagctc ccacgcggag 420 gaggagccag ggcagctggg agcgaggaca ccatcctcct ggataacagg cagaggccgg 480 gaggaacccg tcagtcgggc gggcaggaag ctctgggatc agcctcatgg aagagaagca 540 gatcctgtgc gtggggctag tggtgctgga cgtcatcagc ctggtggaca agtaccctaa 600 ggaggactca gagataaggt gcttgtccca gagatggcaa cgcggaggca acgcgtccaa 660 ctcctgcacc gttctctccc tgctcggagc cccctgtgcc ttcatgggct caatggcccc 720 tggccatgtt gctgacttcc tggtggccga cttcaggcgg cggggtgtgg acgtgtctca 780 ggtggcctgg cagagcaagg gggacacccc cagctcctgc tgcatcatca acaactccaa 840 tggcaaccgt accattgtgc tccatgacac gagcctgcca gatgtgtctg ctacggactt 900 tgagaaggtt gatctgaccc agttcaagtg gatccacatt gagggccgga atgcatcgga 960 gcaggtgaag atgctgcagc ggatagacgc gcacaacacc aggcagcctc cagagcagaa 1020 gatccgggtg tccgtggagg tggagaagcc acaagaggag ctctttcagc tgtttggcta 1080 cggagacgtg gtgtttgtca gcaaagatgt ggccaagcac ttggggttcc agtcagcagg 1140 ggaagccctg aggggcttgt atggtcgtgt gaggaaaggg gctgtgcttg tctgtgcctg 1200 ggctgaggag ggcgccgacg ccctgggccc tgatggcaaa ctgatccact cggatgcttt 1260 cccgccaccc cgcgtggtgg ataccctggg ggctggagac accttcaatg cctccgtcat 1320 cttcagcctc tcccagggga ggagcgtgca ggaagcactg agattcggat gccaggtggc 1380 cggcaagaag tgtggccagc agggctttga tggcatcgtg tcagagccgg tgcggtagga 1440 ggtgccggct ccccgcacac tatggaggct gacattgcgg ctgcatcgcc ttctcccctc 1500 catccagcct ggcatccagg ttgccctgct caggggacag atgcaggctg tggggaggac 1560 tccgcctgtg tcctgtgttc cccacacgtc tctccctgca gagcctcaga gcgaataaat 1620 cttcctcgga gccagcttcc cctggcagct tctgtcctcg atgtctgaac tgctctggct 1680 gggcattcct gaggctctga ctctccagtc ctccctcctc gtgtgcattc cccaaattaa 1740 cctctccacc caggcccaga ggaggggctg cctgggctat agcagcaaga agtgccccag 1800 gcttgccgcc agctctgccc tggctgggga ggacactcag tgccccatac ccagcgaacc 1860 tgccaaagaa ccagaagcca tgagagctct ttggggccct gcgttgtgca gactctattc 1920 ccatagctca gaagctggga gtccacacgg ctgagccaaa ctgacaggcc agtggggggc 1980 gagggggtgg ggcgcctcct ctgccctgcc caccagcctg tgatttggtg gcgtctttgt 2040 tgtccaaaaa tatctcctcc cgctgactgc cccagagcct gaaagtctca cccgtggagc 2100 ccaccttgga attaagggga 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ccacttctca gcctcagttt cctcgcttgt cagatggact 2220 cggagctgat gcaaaccctt ctaaagcgcg gctaagcgat ctcgagaatg caaagagaaa 2280 atgcgctgga aatgcgctac gtgccccgcc ctctgctgca cctgcgtctc ggactcccga 2340 ccctggaccc gcgaggtaga gctgggcctg catctgcagc cctgcctgaa gaccgtggtc 2400 gcggctgccc ggcccc 2416 <210> 13 <400> 13 000 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: RFGF peptide sequence" <400> 14 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: RFGF analogue sequence" <400> 15 Ala Ala Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro 1 5 10 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus 1 <400> 16 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Drosophila sp. <400> 17 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> 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27 gcauuuucuc uuugcauucu u 21 <210> 28 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 28 cauuuucucu uugcauucuc u 21 <210> 29 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 29 uuuucucuuu gcauucucga u 21 <210> 30 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 30 uucucuuugc auucucgaga u 21 <210> 31 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 31 ucucuuugca uucucgagau u 21 <210> 32 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 32 cucuuugcau ucucgagauc u 21 <210> 33 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 33 ucuuugcauu cucgagaucg u 21 <210> 34 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 34 uuugcauucu cgagaucgcu u 21 <210> 35 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 35 ugcauucucg agaucgcuua u 21 <210> 36 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 36 gcauucucga gaucgcuuag u 21 <210> 37 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 37 cauucucgag aucgcuuagc u 21 <210> 38 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 38 cuuuaaaaag guuugcauca u 21 <210> 39 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 39 uuuaaaaagg uuugcaucag u 21 <210> 40 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 40 uuaaaaaggu uugcaucagc u 21 <210> 41 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 41 ucagcuguga guccaucuga u 21 <210> 42 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 42 gcugugaguc caucugacaa u 21 <210> 43 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 43 cugugagucc aucugacaag u 21 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 65 gcuacagacu uugagaaggu u 21 <210> 66 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 66 cuacagacuu ugagaagguu u 21 <210> 67 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 67 acagacuuug agaagguuga u 21 <210> 68 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 68 cagacuuuga gaagguugau u 21 <210> 69 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 69 agacuuugag aagguugauc u 21 <210> 70 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 70 gacuuugaga 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1226 cccaguucaa guggauccac u 21 <210> 1227 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1227 guggauccac auugagggcc u 21 <210> 1228 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1228 agacguggug uuugucagca u 21 <210> 1229 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1229 ugucagcaaa gauguggcca u 21 <210> 1230 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1230 gcaaagaugu ggccaagcac u 21 <210> 1231 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 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Synthetic oligonucleotide" <400> 1247 aagguugauc ugaccuaguu u 21 <210> 1248 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1248 aagguugauc ugacucaguu u 21 <210> 1249 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1249 aaguuugauc ugaccuaguu u 21 <210> 1250 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1250 aauguugauc ugaccuaguu u 21 <210> 1251 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1251 aaguuugauc ugacucaguu u 21 <210> 1252 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1252 aauguugauc 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Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 1363 aucutuacug acaaacacaa cgu 23 <210> 1364 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 1364 auctutgcug acaaacucca cgu 23 <210> 1365 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 1365 auctutgcug acaaacagca cgu 23 <210> 1366 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 1366 auctutgcug acaaacaaca cgu 23 <210> 1367 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 1367 auctutgcug acaaacacga cgu 23 <210> 1368 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 1368 auctutgcug acaaacacaa cgu 23 <210> 1369 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1369 acacaggauc ugcuucucuu ccu 23 <210> 1370 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1370 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1402 cggagacgug guguuuguca u 21 <210> 1403 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1403 ggagacgugg uguuugucag u 21 <210> 1404 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1404 ugguguuugu cagcaaagau u 21 <210> 1405 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1405 gguguuuguc agcaaagaug u 21 <210> 1406 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1406 guguuuguca gcaaagaugu u 21 <210> 1407 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 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Synthetic oligonucleotide" <400> 1423 gccucaugga agagaagcag u 21 <210> 1424 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1424 cauggaagag aagcagaucc u 21 <210> 1425 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1425 agagaagcag auccugugcg u 21 <210> 1426 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1426 ugagaagguu gaucugaccc u 21 <210> 1427 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1427 agaagguuga ucugacccag u 21 <210> 1428 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1428 ucugacccag 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 1493 atugaacugg gtcagaucaa ccu 23 <210> 1494 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1494 acuugaacug ggucagauca acc 23 <210> 1495 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 1495 aacutgaacu gggucagauc aac 23 <210> 1496 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 1496 acactugaac ugggucagau caa 23 <210> 1497 <211> 23 <212> DNA <213> 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Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 1891 aggatccacu ugaacugggu cag 23 <210> 1892 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1892 auggauccac uugaacuggg uca 23 <210> 1893 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 1893 aaugtggauc cacuugaacu ggg 23 <210> 1894 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1894 aaauguggau ccacuugaac ugg 23 <210> 1895 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 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<400> 2026 caaguggauc cacauugagg gcc 23 <210> 2027 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2027 uggauccaca uugagggccg gaa 23 <210> 2028 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2028 ggauccacau ugagggccgg aac 23 <210> 2029 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2029 cggagacgug guguuuguca gca 23 <210> 2030 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2030 guuugucagc aaagaugugg cca 23 <210> 2031 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2031 uugucagcaa agauguggcc aag 23 <210> 2032 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2032 ugucagcaaa gauguggcca agc 23 <210> 2033 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2033 gucagcaaag auguggccaa gca 23 <210> 2034 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2034 ucagcaaaga uguggccaag cac 23 <210> 2035 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2035 uggagacacc uucaaugccu ccg 23 <210> 2036 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2036 ggagacaccu ucaaugccuc cgu 23 <210> 2037 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2037 gagacaccuu caaugccucc guc 23 <210> 2038 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2038 augccuccgu caucuucagc cuc 23 <210> 2039 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2039 gaggagcgug caggaagcac uga 23 <210> 2040 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2040 aggagcgugc aggaagcacu gag 23 <210> 2041 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2041 gagcgugcag gaagcacuga gau 23

Claims (108)

  1. 세포 내에서 케토헥소키나아제(KHK)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제로서, 상기 dsRNA는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하되, 안티센스 가닥은 KHK를 암호화하는 mRNA에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상보성 영역은 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나의 안티센스 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  2. 제1항에 있어서, dsRNA 제제는 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나의 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 센스 가닥 및 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나의 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는, dsRNA 제제.
  3. 제1항에 있어서, dsRNA 제제는 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나의 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나와 2개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 센스 가닥 및 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나의 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나와 2개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는, dsRNA 제제.
  4. 제1항에 있어서, dsRNA 제제는 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나의 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나와 2개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 센스 가닥 및 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나의 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나와 2개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는, dsRNA 제제.
  5. 제1항에 있어서, dsRNA 제제는 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나의 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 센스 가닥 및 표 2, 3, 5, 6 및 8~13 중 어느 하나의 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는, dsRNA 제제.
  6. 세포 내에서 케토헥소키나아제(KHK)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제로서, 상기 dsRNA는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하되, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 120~162; 164~188; 181~207; 193~217; 209~231; 283~306; 508~546; 568~603; 596~632; 640~674; 746~806; 806~835; 917~942; 936~084; 1016~1041; 1100~1123; 1149~1175; 1160~1193; 1205~1229; 1252~1283; 1334~1356; 1407~1429; 1472~1497; 1506~1533; 1539~1561; 1704~1727; 1747~1787; 1850~1873; 1936~1964; 1960~1990; 2015~2048; 2060~2095; 2090~2118; 2124~2160; 2181~2200; 2221~2262의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 2의 상응하는 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  7. 세포 내에서 케토헥소키나아제(KHK)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제로서, 상기 dsRNA는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하되, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 517~539; 521~543; 524~546; 517~546; 581~603; 610~632; 747~769; 749~771; 752~774; 755~777; 757~779; 758~780; 764~786; 776~798; 781~803; 747~803; 920~942; 941~963; 944~966; 950~972; 962~984; 920~984; 1149~1171; 1161~1183; 1165~1187; 1171~1193; 1149~1193; 1205~1227; 1206~1228; 1205~1228; 1334~1356; 1472~1494; 1475~1497; 1472~1497의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 2의 상응하는 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  8. 세포 내에서 케토헥소키나아제(KHK)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제로서, 상기 dsRNA는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하되, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 517~539; 524~546; 517~546; 753~775; 757~779; 753~779; 764~786; 767~789; 768~790; 769~791; 764~791; 773~795; 781~803; 773~803; 753~803; 808~830; 937~959; 941~963; 944~966; 941~966; 948~970; 950~972; 948~972; 1160~1182; 1161~1183; 1160~1183; 및 1207~1229의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 2의 상응하는 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥은 AD-1613400; AD-1613243; AD-1290757.3; AD-1290878.3; AD-1290969.3; AD-1423317.2; AD-1423327.2; AD-1423336.2; AD-1290599.3; AD-1523172.1; AD-1290837.3; AD-1523173.1; AD-1290884.3; AD-1523174.1; AD-1290959.3; AD-1523175.1; AD-1423311.2; AD-1423324.2; AD-1523176.1; AD-1423329.2; AD-1423333.2; AD-1423330.2; AD-1523177.1; AD-1290885.3; AD-1523178.1; AD-1423334.2; AD-1523179.1; AD-1523180.1; AD-1290539.3; 및 AD-1523181.1로 이루어진 군으로부터 선택된 듀플렉스의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  10. 세포 내에서 케토헥소키나아제(KHK)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제로서, 상기 dsRNA는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하되, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 495~517, 492~517, 500~529, 514~551, 517~539, 524~546, 517~548, 614~643, 625~647, 625~660, 642~664, 642~672, 753~811, 754~780, 762~791, 764~786, 772~800, 781~803, 805~827, 808~830, 809~831, 792~838, 931~982, 944~966, 947~969, 948~970, 948~982, 1011~1035, 1021~1043, 1019~1050, 1063~1091, 1150~1192, 1152~1176, 1160~1192, 1160~1182, 1162~1184, 1198~1230, 1198~1221, 및 1202~1230의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 2의 상응하는 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  11. 세포 내에서 케토헥소키나아제(KHK)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제로서, 상기 dsRNA는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하되, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 513~556, 753~813, 936~981, 1155~1193, 1200~1229, 1704~1727, 1747~1787, 1850~1873, 1936~1964, 1960~1990, 1936~1990, 2015~2048, 2060~2095, 2090~2118, 2060~2118, 2124~2160, 2181~2220, 2221~2249, 2181~2249, 2240~2262, 2221~2262, 및 2181~2262의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 2의 상응하는 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  12. 세포 내에서 케토헥소키나아제(KHK)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제로서, 상기 dsRNA는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하되, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1207~1229 또는 937~959의 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 2의 상응하는 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  13. 제12항에 있어서, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1207~1229의 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 2의 상응하는 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA 제제가 적어도 하나의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드가 변형을 포함하거나; 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드가 변형을 포함하거나; 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드 및 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드가 변형을 포함하는, dsRNA 제제.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드가 변형을 포함하거나; 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드가 변형을 포함하거나; 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드가 변형을 포함하는, dsRNA 제제.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 데옥시-뉴클레오타이드, 3'-말단 데옥시티미딘(dT) 뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 변형 뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오타이드, 잠김 뉴클레오타이드, 잠김 해제된 뉴클레오타이드, 형태적으로 제한된 뉴클레오타이드, 구속된 에틸 뉴클레오타이드, 무염기 뉴클레오타이드, 2'-아미노-변형 뉴클레오타이드, 2'-O-알릴-변형 뉴클레오타이드, 2'-C-알킬-변형 뉴클레오타이드, 2'-하이드록실-변형 뉴클레오타이드, 2'-메톡시에틸 변형 뉴클레오타이드, 2'-O-알킬-변형 뉴클레오타이드, 모르폴리노 뉴클레오타이드, 포스포라미데이트, 뉴클레오타이드를 포함하는 비-천연 염기, 테트라하이드로피란 변형 뉴클레오타이드, 1,5-안하이드로헥시톨 변형 뉴클레오타이드, 시클로헥세닐 변형 뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오타이드, 메틸포스포네이트기를 포함하는 뉴클레오타이드, 5'-포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 5'-포스페이트 모방체를 포함하는 뉴클레오타이드, 2' 포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 열 불안정화 뉴클레오타이드, 글리콜 변형 뉴클레오타이드(GNA), 2' 포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드 및 2-O-(N-메틸아세트아미드) 변형 뉴클레오타이드; 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, dsRNA 제제.
  18. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오타이드 상에서의 변형은 LNA, HNA, CeNA, 2’-메톡시에틸, 2’-O-알킬, 2’-O-알릴, 2’-C-알릴, 2’-플루오로, 2’-데옥시, 2’-하이드록실 및 글리콜; 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, dsRNA 제제.
  19. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 데옥시-뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 변형 뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오타이드, 글리콜 변형 뉴클레오타이드(GNA), 2’ 포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 비닐-포스포네이트 뉴클레오타이드; 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, dsRNA 제제.
  20. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오타이드 상에서의 변형 중 적어도 하나는 열 불안정화 뉴클레오타이드 변형인, dsRNA 제제.
  21. 제20항에 있어서, 열 불안정화 뉴클레오타이드 변형은 무염기 변형; 듀플렉스 내 반대 뉴클레오타이드와의 미스매치; 및 불안정화 당 변형, 2'-데옥시 변형, 비환형 뉴클레오타이드, 잠김 해제된 핵산(UNA) 및 글리세롤 핵산(GNA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, dsRNA 제제.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 19~30개의 뉴클레오타이드 쌍인, dsRNA 제제.
  23. 제22항에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 19~25개의 뉴클레오타이드 쌍인, dsRNA 제제.
  24. 제22항에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 19~23개의 뉴클레오타이드 쌍인, dsRNA 제제.
  25. 제22항에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 23~27개의 뉴클레오타이드 쌍인, dsRNA 제제.
  26. 제22항에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 21~23개의 뉴클레오타이드 쌍인, dsRNA 제제.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 가닥은 독립적으로 길이가 30개 이하의 뉴클레오타이드인, dsRNA 제제.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 길이가 21개의 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥은 길이가 23개의 뉴클레오타이드인, dsRNA 제제.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상보성 영역은 길이가 적어도 17개의 뉴클레오타이드인, dsRNA 제제.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상보성 영역은 길이가 19 내지 23개의 뉴클레오타이드인, dsRNA 제제.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상보성 영역은 길이가 19개의 뉴클레오타이드인, dsRNA 제제.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 가닥은 적어도 뉴클레오타이드 하나의 3' 오버행을 포함하는, dsRNA 제제.
  33. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 뉴클레오타이드 2개의 3' 오버행을 포함하는, dsRNA 제제.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드를 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
  35. 제34항에 있어서, 리간드가 dsRNA 제제의 센스 가닥의 3' 말단에 접합되는, dsRNA 제제.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 리간드는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 유도체인, dsRNA 제제.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드는 1가, 2가, 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체인, dsRNA 제제.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 리간드는 다음인, dsRNA 제제.
  39. 제38항에 있어서, dsRNA 제제가 하기 개략도에 도시된 것과 같이 리간드에 접합되고,

    상기 식에서, X는 O 또는 S인, dsRNA 제제.
  40. 제39항에 있어서, X는 O인, dsRNA 제제.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA 제제가 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합을 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
  42. 제41항에 있어서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합은 한 가닥의 3'-말단에 존재하는, dsRNA 제제.
  43. 제42항에 있어서, 가닥은 안티센스 가닥인, dsRNA 제제.
  44. 제42항에 있어서, 가닥은 센스 가닥인, dsRNA 제제.
  45. 제41항에 있어서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합은 한 가닥의 5'-말단에 존재하는, dsRNA 제제.
  46. 제45항에 있어서, 가닥은 안티센스 가닥인, dsRNA 제제.
  47. 제45항에 있어서, 가닥은 센스 가닥인, dsRNA 제제.
  48. 제41항에 있어서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합은 한 가닥의 5'-말단 및 3'-말단 둘 모두에 존재하는, dsRNA 제제.
  49. 제48항에 있어서, 가닥은 안티센스 가닥인, dsRNA 제제.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5'-말단의 1 위치에 존재하는 염기쌍은 AU 염기쌍인, dsRNA 제제.
  51. 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는, 세포 내에서 케토헥소키나아제(KHK)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로서,
    a) 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’-gscsaggaagCfAfCfugagauucgu-3’와 4개 이하의 염기가 상이하고, 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’- asdCsgadAudCucagdTgCfuuccugcsasc-3’와 4개 이하의 염기가 상이하되,
    여기서, a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C 및 U이고; Cf 및 Uf는 2′-데옥시-2’-플루오로(2’-F) C 및 U이고; dC, dA 및 dT는 2′-데옥시 C, A 및 T이고; s는 포스포로티오에이트 결합이거나;
    b) 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’-csusacggagAfCfGfugguguuugu-3’와 4개 이하의 염기가 상이하고, 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’- asdCsaadAcdAccacdGuCfuccguagscsc -3’와 4개 이하의 염기가 상이하되,
    여기서, a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C 및 U이고; Cf 및 Uf는 2′-데옥시-2’-플루오로(2’-F) C 및 U이고; dC, dA 및 dG는 2′-데옥시 C, A 및 G이고; s는 포스포로티오에이트 결합인, dsRNA 제제.
  52. 제51항에 있어서,
    a) 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’-gscsaggaagCfAfCfugagauucgu-3’와 3개 이하의 염기가 상이하고, 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’- asdCsgadAudCucagdTgCfuuccugcsasc-3’와 3개 이하의 염기가 상이하되,
    여기서, a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C 및 U이고; Cf 및 Uf는 2′-데옥시-2’-플루오로(2’-F) C 및 U이고; dC, dA 및 dT는 2′-데옥시 C, A 및 T이고; s는 포스포로티오에이트 결합이거나;
    b) 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’-csusacggagAfCfGfugguguuugu-3’와 3개 이하의 염기가 상이하고, 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’- asdCsaadAcdAccacdGuCfuccguagscsc -3’와 3개 이하의 염기가 상이하되,
    여기서, a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C 및 U이고; Cf 및 Uf는 2′-데옥시-2’-플루오로(2’-F) C 및 U이고; dC, dA 및 dG는 2′-데옥시 C, A 및 G이고; s는 포스포로티오에이트 결합인, dsRNA 제제.
  53. 제51항에 있어서,
    a) 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’-gscsaggaagCfAfCfugagauucgu-3’와 2개 이하의 염기가 상이하고, 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’- asdCsgadAudCucagdTgCfuuccugcsasc-3’와 2개 이하의 염기가 상이하되,
    여기서, a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C 및 U이고; Cf 및 Uf는 2′-데옥시-2’-플루오로(2’-F) C 및 U이고; dC, dA 및 dT는 2′-데옥시 C, A 및 T이고; s는 포스포로티오에이트 결합이거나;
    b) 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’-csusacggagAfCfGfugguguuugu-3’와 2개 이하의 염기가 상이하고, 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’- asdCsaadAcdAccacdGuCfuccguagscsc -3’와 2개 이하의 염기가 상이하되,
    여기서, a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C 및 U이고; Cf 및 Uf는 2′-데옥시-2’-플루오로(2’-F) C 및 U이고; dC, dA 및 dG는 2′-데옥시 C, A 및 G이고; s는 포스포로티오에이트 결합인, dsRNA 제제.
  54. 제51항에 있어서,
    a) 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’-gscsaggaagCfAfCfugagauucgu-3’와 1개 이하의 염기가 상이하고, 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’- asdCsgadAudCucagdTgCfuuccugcsasc-3’와 1개 이하의 염기가 상이하되,
    여기서, a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C 및 U이고; Cf 및 Uf는 2′-데옥시-2’-플루오로(2’-F) C 및 U이고; dC, dA 및 dT는 2′-데옥시 C, A 및 T이고; s는 포스포로티오에이트 결합이거나;
    b) 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’-csusacggagAfCfGfugguguuugu-3’와 1개 이하의 염기가 상이하고, 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’- asdCsaadAcdAccacdGuCfuccguagscsc -3’와 1개 이하의 염기가 상이하되,
    여기서, a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C 및 U이고; Cf 및 Uf는 2′-데옥시-2’-플루오로(2’-F) C 및 U이고; dC, dA 및 dG는 2′-데옥시 C, A 및 G이고; s는 포스포로티오에이트 결합인, dsRNA 제제.
  55. 제51항에 있어서,
    a) 센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’-gscsaggaagCfAfCfugagauucgu-3’를 포함하고, 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’- asdCsgadAudCucagdTgCfuuccugcsasc-3’를 포함하되,
    여기서, a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C 및 U이고; Cf 및 Uf는 2′-데옥시-2’-플루오로(2’-F) C 및 U이고; dC, dA 및 dT는 2′-데옥시 C, A 및 T이고; s는 포스포로티오에이트 결합이거나;
    b)센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’-csusacggagAfCfGfugguguuugu-3’을 포함하고, 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열 5’- asdCsaadAcdAccacdGuCfuccguagscsc -3’를 포함하되,
    여기서, a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C 및 U이고; Cf 및 Uf는 2′-데옥시-2’-플루오로(2’-F) C 및 U이고; dC, dA 및 dG는 2′-데옥시 C, A 및 G이고; s는 포스포로티오에이트 결합인, dsRNA 제제.
  56. 제50항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드를 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
  57. 제56항에 있어서, 리간드가 dsRNA 제제의 센스 가닥의 3' 말단에 접합되는, dsRNA 제제.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 리간드는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 유도체인, dsRNA 제제.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드는 1가, 2가, 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체인, dsRNA 제제.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 리간드는 다음인, dsRNA 제제.
  61. 제60항에 있어서, dsRNA 제제가 하기 개략도에 도시된 것과 같이 리간드에 접합되고,

    상기 식에서, X는 O 또는 S인, dsRNA 제제.
  62. 제61항에 있어서, X는 O인, dsRNA 제제.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제를 함유하는 세포.
  64. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제를 포함하는, 케토헥소키나아제(KHK)를 암호화하는 유전자의 발현을 억제하기 위한 약제학적 조성물.
  65. 제64항에 있어서, dsRNA 제제가 비완충 용액에 존재하는, 약제학적 조성물.
  66. 제65항에 있어서, 비완충 용액은 식염수 또는 물인, 약제학적 조성물.
  67. 제64항에 있어서, 상기 dsRNA 제제가 완충 용액에 존재하는, 약제학적 조성물.
  68. 제67항에 있어서, 완충 용액이 아세테이트, 시트레이트, 프롤라민, 카르보네이트 또는 포스페이트, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 약제학적 조성물.
  69. 제68항에 있어서, 완충 용액은 포스페이트 완충 식염수(PBS)인, 약제학적 조성물.
  70. 세포 내에서 케토헥소키나아제(KHK) 유전자의 발현을 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제, 또는 제64항 내지 제69항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물과 세포를 접촉시킴으로써, 세포 내에서 KHK 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 세포가 대상체 내에 존재하는, 방법.
  72. 제71항에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
  73. 제71항 또는 제72항에 있어서, 대상체는 KHK-관련 장애를 갖고 있는, 방법.
  74. 제73항에 있어서, KHK-관련 장애는, 비알코올성 지방간 질환(NAFLD) 및 비알코올성 지방간염(NASH)으로 이루어진 군으로부터 선택된, 간 질환인, 방법.
  75. 제73항에 있어서, KHK-관련 장애는, 고지질혈증, 고LDL 콜레스테롤, 저HDL 콜레스테롤, 고중성지방혈증, 식후고중성지방혈증, 지방세포 기능장애, 내장 지방 침착, 비만 및 대사 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된, 이상지질혈증인, 방법.
  76. 제73항에 있어서, KHK-관련 장애는, 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병 및 포도당 불내증으로 이루어진 군으로부터 선택된, 혈당 조절 장애인, 방법.
  77. 제73항에 있어서, KHK-관련 장애는, 고혈압 및 내피 세포 기능장애로 이루어진 군으로부터 선택된, 심혈관 질환인, 방법.
  78. 제73항에 있어서, KHK-관련 장애는, 급성 신장 장애, 관상 기능장애, 근위 세관에 대한 전염증성 변화 및 만성 신장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된, 신장 질환인, 방법.
  79. 제73항에 있어서, KHK-관련 장애는 고요산혈증인, 방법.
  80. 제73항에 있어서, KHK-관련 장애는 통풍인, 방법.
  81. 제56항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA 제제와 세포를 접촉시키는 단계가 KHK의 발현을 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%만큼 억제하는, 방법.
  82. 제70항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, KHK 발현의 억제가 대상체의 혈청 내 KHK 단백질 수준을 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%만큼 감소시키는, 방법.
  83. 케토헥소키나아제(KHK) 발현의 감소로 혜택을 받을 질환 또는 장애를 갖고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 대상체에게 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제 또는 제64항 내지 제69항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여함으로써, KHK 발현의 감소로 혜택을 받을 장애를 갖고 있는 대상체를 치료하는, 방법.
  84. 케토헥소키나아제(KHK) 발현의 감소로 혜택을 받을 장애를 갖고 있는 대상체에서 적어도 하나의 증상을 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 대상체에게 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제 또는 제64항 내지 제69항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 예방학적 유효량을 투여함으로써, KHK 발현의 감소로 혜택을 받을 장애를 갖고 있는 대상체에서 적어도 하나의 증상을 예방하는, 방법.
  85. 제83항 또는 제84항에 있어서, 장애는 KHK-관련 장애인, 방법.
  86. 제85항에 있어서, KHK-관련 장애는, 비알코올성 지방간 질환(NAFLD) 및 비알코올성 지방간염(NASH)으로 이루어진 군으로부터 선택된, 간 질환인, 방법.
  87. 제85항에 있어서, KHK-관련 장애는, 고지질혈증, 고LDL 콜레스테롤, 저HDL 콜레스테롤, 고중성지방혈증, 식후고중성지방혈증, 지방세포 기능장애, 내장 지방 침착, 비만 및 대사 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된, 이상지질혈증인, 방법.
  88. 제85항에 있어서, KHK-관련 장애는, 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병 및 포도당 불내증으로 이루어진 군으로부터 선택된, 혈당 조절 장애인, 방법.
  89. 제85항에 있어서, KHK-관련 장애는, 고혈압 및 내피 세포 기능장애로 이루어진 군으로부터 선택된, 심혈관 질환인, 방법.
  90. 제85항에 있어서, KHK-관련 장애는, 급성 신장 장애, 관상 기능장애, 근위 세관에 대한 전염증성 변화 및 만성 신장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된, 신장 질환인, 방법.
  91. 제85항에 있어서, KHK-관련 장애는 고요산혈증인, 방법.
  92. 제85항에 있어서, KHK-관련 장애는 통풍인, 방법.
  93. 제83항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
  94. 제93항에 있어서, 대상체는 신장 기능이 손상되었거나 손상되기 쉬운, 방법.
  95. 제83항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 dsRNA 제제를 투여하는 단계가 하나 이상의 혈청 지질의 감소 및/또는 KHK 단백질 축적의 감소를 유발하는, 방법.
  96. 제83항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 dsRNA 제제를 투여하는 단계가 과당 대사를 감소시키는, 방법.
  97. 제83항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA 제제가 약 0.01mg/kg 내지 약 50mg/kg의 용량으로 대상체에게 투여되는, 방법.
  98. 제83항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA 제제가 대상체에게 피하 투여되는, 방법.
  99. 제83항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체로부터의 시료(들)에서 KHK 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  100. 제99항에 있어서, 대상체 시료(들)의 KHK 수준이 혈중 또는 혈청 시료(들)의 KHK 단백질 수준인, 방법.
  101. 제83항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체로부터의 시료(들)에서 과당 대사 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  102. 제83항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체로부터의 시료(들)에서 요산 수치를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  103. 제83항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체로부터의 시료(들)에서 혈청 지질 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  104. 제83항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, KHK-관련 장애의 치료를 위한 추가 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  105. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제 또는 제64항 내지 제69항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 포함하는 키트.
  106. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제 또는 제64항 내지 제69항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 포함하는 바이알.
  107. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제 또는 제64항 내지 제69항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 포함하는 주사기.
  108. 제1항 내지 제62항의 dsRNA 제제 중 어느 하나의 안티센스 가닥을 포함하는 RNA-유도 침묵 복합체(RISC).
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