CN101031658A - 病毒和病毒相关mirna及其用途 - Google Patents

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Abstract

在此描述的是与病毒感染相关的新的多核苷酸。所述多核苷酸是miRNA和miRNA前体。公开了可用于那些医学状况的诊断、预后和治疗的相关方法和组合物。在此还描述的是可用于鉴定病毒感染的调节物的方法。

Description

病毒和病毒相关MIRNA及其用途
相关申请的交叉引用
[0001]本申请是2004年5月26日提交的美国专利申请No.10/709,739的部分继续申请，并且要求2004年10月4日提交的美国临时专利申请No.60/522,459和2005年3月25日提交的美国临时专利申请No.60/665,094的权利，通过引用将它们的每一个合并在此。
发明领域
[0002]本发明一般地涉及病毒microRNA分子并涉及一组与病毒感染相关的人类microRNA分子，以及与之相关或由此衍生的各种核酸分子。
发明背景
[0003]MicroRNA(miRNA)是涉及基因调节的约22个核苷酸的短RNA寡核苷酸。MicroRNA通过靶向mRNA以进行裂解或翻译抑制来调节基因表达。虽然miRNA存在于大范围的物种，包括C.elegans、果蝇和人类中，但它们仅在最近才被鉴定。更重要地，miRNA在疾病的发展和进行中的作用仅在最近才被理解。
[0004]作为它们的小尺寸的结果，miRNA难以使用标准的方法来鉴别。通过提取大量的RNA已经鉴别出有限数量的miRNA。还已经鉴定了促进视觉可辨别表型的呈现的miRNA。表达阵列数据显示了，miRNA在不同的发育阶段或在不同的组织中表达。miRNA对某些组织或处在有限的发育阶段的限制表明，迄今为止鉴定的miRNA可能仅是全部miRNA的一小部分。
[0005]近来已经开发了计算方法来鉴别基因组中其余miRNA。例如MiRscan和MiRseeker的工具已经鉴定出后来在实验上被证实的miRNA。根据这些计算工具，已经估计人类基因组含有200-255个miRNA基因。然而，这些估计基于这样的假定，即留待鉴别的miRNA将具有与已经鉴别的那些miRNA相同的性质。基于miRNA在哺乳动物生物学和疾病中的基础重要性，本领域需要鉴别未知的miRNA。本发明满足了这种需求并提供了大量的miRNA和它们的用途。迄今为止，没有检测到病毒miRNA。
发明概述
[0006]本发明涉及分离的核酸，所述分离的核酸包含pri-miRNA、pre-miRNA、miRNA、miRNA*、anti-miRNA或miRNA结合位点，或其变体的序列。所述核酸可以包含SEQ ID NO：4097721-4204913；表1、11-12或21-23中涉及的前体的序列；SEQ ID NO：1-1142416或4204914-4204915；表1、13-14或21-23中涉及的miRNA的序列；SEQ ID NO：1142417-4097720；表4、10或15-16中涉及的目标基因结合位点的序列；它们的互补物；或一序列，其包含与它们有至少70％同一性的至少12个连续核苷酸。所述分离的核酸长度可以是5-250个核苷酸。
[0007]本发明还涉及包含所述核酸的探针。所述探针可以包含与SEQ ID NO：1-1142416或4204914-4204915、表1、13-14或21-23中涉及的miRNA或其变体互补的至少8-22个连续核苷酸。所述探针也可以包含与在病毒感染中差异表达的人类miRNA或其变体互补的至少8-22个连续核苷酸。
[0008]本发明还涉及多个所述探针。所述多个探针可以包含至少十个所述探针。所述多个探针也可以包含至少100个所述探针。本发明还涉及包含探针或多个探针的组合物。本发明还涉及包含固体基底的生物芯片，所述基底包含多个所述探针。每个探针可以在空间上定义的地址处附着于所述基底上。所述生物芯片可以包含与病毒miRNA互补的探针。所述生物芯片也可以包含与人类miRNA互补的探针，所述人类miRNA以在病毒感染期间的表达为特征。
[0009]本发明还涉及检测疾病相关miRNA的差异表达的方法。可以提供生物样品并测量核酸的水平，所述核酸至少70％相同于SEQ IDNO：1-1142416或4204914-4204915；表1、13-14和21-23中涉及的miRNA的序列；或其变体。所述核酸的水平与对照相比的差异是差异表达的指示。
[0010]本发明还涉及鉴定调节病理状况的化合物的方法。可以提供能够表达核酸的细胞，所述核酸至少70％相同于SEQ ID NO：1-1142416或4204914-4204915；表1、13-14和21-23中涉及的miRNA的序列；或其变体。所述细胞可以与候选调节物接触，然后测量所述核酸的表达水平。所述核酸的水平与对照相比的差异确定所述化合物为与所述核酸相关的病理状况的调节物。
[0011]本发明还涉及抑制目标基因在细胞中的表达的方法。以足够抑制目标基因表达的数量向所述细胞中导入核酸。所述目标基因可以包含结合位点，所述结合位点基本上相同于表4、10或15-16中涉及的结合位点、或其变体。所述核酸可以包含SEQ ID NO：1-1142416或4204914-4204915；表1、13-14或21-23中涉及的miRNA的序列；或其变体的一部分。可以在体外或体内抑制目标基因的表达。
[0012]本发明还涉及提高目标基因在细胞中的表达的方法。以足够提高目标基因表达的数量向所述细胞中导入核酸。所述目标基因可以包含结合位点，所述结合位点基本上相同于表4、10或15-16中涉及的结合位点、或其变体。所述核酸的一部分可以基本上互补于SEQ IDNO：1-1142416或4204914-4204915；表1、13-14和21-23中涉及的miRNA的序列；或其变体。可以在体外或体内抑制目标基因的表达。可以在体外或体内提高目标基因的表达。
[0013]本发明还涉及治疗患有表6中所列失调的患者的方法，包括向有需要的患者施用核酸，所述核酸包含SEQ ID NO：1-760616的序列；表10中所列的序列；表17中所列的序列；或其变体。
[0014]本发明还涉及治疗患有病毒感染或病毒感染相关状况的患者的方法，包括向有需要的患者施用核酸，其中所述核酸的一部分基本上互补于SEQ ID NO：1-1142416或4204914-4204915；表1、13-14或21-23中涉及的miRNA的序列；或其变体。
附图的简要说明
[0015]附图1展现了miRNA的成熟的模型。
[0016]附图2A显示了HIV的5′UTR(U5R)，含有粗体的两个预测的miRNA。成熟的miRNA是下划线的，一个更靠近5′端(附图2B)，第二个更靠近3′端(附图2C)。最5′端的miRNA与称为TAR的已知HIV1 RNA结构匹配，TAT蛋白与之结合(Nature 1987.330：489-93)。类似的miRNA(GAM名称506033)也落于芯片上。根据T-tropic HIV-1(LAV-1)、B亚型的序列设计了这个miRNA探针，其与附图2B中所示miRNA有一个核苷酸的不同。附图2B和2C描述了存在于U5R中与预测的成熟miRNA探针杂交的miRNA寡核苷酸的Northern印迹分析。上部的箭头指明了完整的355nt U5R转录产物的分子大小。两个GAM RNA的预测的分子大小分别是22nt和17nt。下部的箭头指明了22nt分子标记物。泳道：1-Hela溶胞产物；2-在没有孵化的HeLa溶胞产物中的U5R转录产物；和3-与Hela溶胞产物孵化24小时的U5R转录产物。附图2D和2E呈现了与预测的成熟HIVmiRNA探针反应的HIV 1RNA的转录产物。在每个图中，显示了实验性的转录产物序列，预测的成熟miRNA是下划线的。呈现了miRNA前体的Northern印迹分析。证明一个miRNA前体转录产物是163nt，另一个miRNA前体转录产物是200nt。成熟miRNA的预测的分子大小都是24nt。标明了22nt分子标记物。泳道：1-在没有孵化的HeLa溶胞产物中的转录产物；和2-与Hela溶胞产物孵化24小时的转录产物。
[0017]附图3显示了Northern印迹的结果。呈现了在EBV感染的(B95/8EBV)和未感染的(pBMC)细胞中GAM506333和GAM506336的表达分布型。在与来自感染EBV的B-95/8细胞系的RNA杂交的miRNA微阵列上证明了这些miRNA的表达。在Northern印迹上将针对这些验证的miRNA预测物的探针与总RNA杂交。Northern印迹证实了在微阵列上这两个miRNA在受感染细胞中的高表达。
[0018]附图4显示了EBV表达的miRNA的验证。
[0019]附图5显示了EBV miRNA的敲除。
详细说明
[0020]本发明提供了病毒和病毒相关miRNA、其前体、其靶点的核苷酸序列，和相关的序列。这种核酸对于诊断目的，以及对于修饰目标基因表达是有用的。根据以下的发明的说明，本发明的其他方面对于技术人员将变得明显。
1.定义
[0021]在公开和描述当前化合物、产品和组合物和方法之前，要理解的是在此使用的专有名词仅是为了描述特定实施方式的目的，而不意图是限制性的。要注意的是，如在本说明书和附随的权利要求中使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数的指代物，除非上下文明显有相反指示。进一步要注意的是术语“和”和“或”可能涵盖连接(conjunctive)和析取(disjunctive)的含义，除非上下文中明显有相反指示。
[0022]如在此使用的“动物”可以指鱼类、两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳动物，例如，小鼠、大鼠、兔、山羊、猫、狗、牛、猿和人类。
[0023]如在此使用的“附着的”或“固定化的”当用于探针和固相支持物时，可以指在所述探针和所述固相支持物之间的结合在结合、洗涤、分析和移除的条件下是足够稳定的。所述结合可以是共价的或非共价的。共价键可以在探针和固相支持物之间直接形成，或者可以通过交联剂形成，或通过在固相支持物或探针上或在这两个分子上包含特异性反应基团来形成。非共价结合可以是静电的、亲水性的和疏水性相互作用的一种或多种。包括在非共价结合中的有分子例如链霉抗生物素蛋白与支持物的共价连接以及生物素化的探针与该链霉抗生物素蛋白的非共价结合。固定化作用也可以包括共价和非共价相互作用的组合。
[0024]如在此使用的“生物样品”可以指包含核酸的生物学组织或液体的样品。这种样品包括，但不限于，分离自动物的组织。生物样品也可以包括组织切片，例如活组织和尸检样品的切片、为组织学目的采取的冷冻切片、血液、血浆、血清、痰、大便、眼泪、粘液、毛发和皮肤。生物样品也可以包括外植体和来自患者组织的原始的和/或转化的细胞培养物。可以通过从动物上移除细胞的样品来提供生物样品，但也可以通过使用早先分离的细胞(例如，在其他时间和/或为其他目的，由他人分离的)，或体内进行本发明的方法来完成。也可以使用档案组织(archival tissues)，例如具有治疗或结局历史的那些。
[0025]如在此使用的“互补物”或“互补”可以指在核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对。
[0026]“差异表达”可以指在细胞和组织之内和之间的时序和/或细胞基因表达模式方面的定性或定量的差异。因而，差异表达的基因可以在性质上具有其表达的改变，包括活化或钝化，例如，在正常组织对比疾病组织中。相对于另一状态，基因可以在特定状态被打开或关闭，因而允许比较两个或多个状态(states)。定性调节的基因将在状态或细胞类型内展现出表达模式，这可以通过标准技术检测。某些基因将在一种状态或细胞类型中表达，而不在两者中都表达。做为选择，表达中的差异可以是定量的，例如，在表达被调节的情况中，或是增量调节的，导致增加数量的转录产物，或是减量调节的，导致降低数量的转录产物。表达差异的程度仅仅需要大到足够通过标准表征技术来定量，例如表达阵列、定量的逆转录酶PCR、northern分析和RNase保护。
[0027]在此使用的“基因”可以是包含转录和/或翻译调节序列和/或编码区和/或非翻译序列(例如，内含子，5′-和3′-非翻译序列)的基因组基因。基因的编码区可以是编码氨基酸序列或功能性RNA，例如tRNA、rRNA、催化RNA、siRNA、miRNA和反义RNA的核苷酸序列。基因也可以是相应于编码区(例如，外显子和miRNA)的mRNA或cDNA，任选的包含连接于其上的5′-或3′-非翻译序列。基因也可以是体外产生的扩增的核酸分子，包含全部或部分编码区和/或连接其上的5′-或3′-非翻译序列。
[0028]在此使用的“宿主细胞”可以是天然发生的细胞或转化的细胞，其含有载体并支持所述载体的复制。宿主细胞可以是培养的细胞、外植体、体内细胞，等等。宿主细胞可以是原核细胞，例如E.coli，或真核细胞例如酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞，例如CHO，HeLa。
[0029]如在此使用的“同一的”或“同一性”在两个或多个核酸或多肽序列的上下文中，可以指序列具有指定百分比的核苷酸或氨基酸在指定区域上是相同的。通过比较两个序列的最佳比对、比较在指定区域上的两个序列、确定在两个序列上出现同样残基的位置数目来产生匹配位置的数目、用匹配位置的数目除以指定区域中位置的总数、将结果乘以100来产生序列同一性百分比，可以计算该百分比。在两个序列的长度不同或比对产生交错的末端以及指定的比较区域仅包括单个序列的情况下，单个序列的残基被包括到计算分母中，而不是分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)考虑为是等同的。可以人工地或通过使用计算机序列算法例如BLAST或BLAST 2.0来进行同一性计算。
[0030]如在此使用的“抑制”可以指防止、压制、镇压、降低或消除。
[0031]如在此使用的“标记”可以指可通过分光的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、化学的或其他物理的手段检测的成分。例如，有用的标记包括32P、荧光染料、电子密集试剂、酶(例如，通常在ELISA中使用的)、生物素、毛地黄毒苷或半抗原和其他可检测的实体。标记可以在任何位置掺入到核酸和蛋白质中。
[0032]在此使用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”可以指共价连接在一起的至少两个核苷酸。本领域技术人员将理解的是，对单个链的描述也定义了互补链的序列。因而，核酸还包括所描述的单链的互补链。本领域技术人员还理解的是，核酸的许多变体可以用于与给定核酸相同的目的。因而，核酸还包括基本上同一的核酸和其互补物。本领域技术人员还将理解的是，单链提供了探针的探针，探针可以在严格杂交条件下与目标序列杂交。因而，核酸还包括在严格杂交条件下杂交的探针。
[0033]核酸可以是单链或双链的，或可以含有双链和单链序列的部分。核酸可以是DNA，基因组的和cDNA的，RNA或杂交物，其中所述核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、次黄苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可以通过化学合成方法或通过重组方法获得。
[0034]核酸一般包含磷酸二酯键，尽管可包括这样的核酸类似物，该类似物可具有至少一个不同的键，例如，氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O-甲基亚磷酰胺键以及肽核酸主链和键。其他类似物核酸包括具有正主链、非离子主链和非核糖主链的那些，包括美国专利号5,235,033和5,034,506(其在此引用作为参考)中描述的类似物核酸。核酸的一个定义也包括包含一个或多个非天然发生的或经修饰的核苷酸的核酸。经修饰的核苷酸类似物也可位于例如核酸分子的5’-末端和/或3’-末端。核苷酸类似物的代表性实例可选自糖或主链经修饰的核糖核苷酸。然而，应当指出，核碱基(nucleobase)经修饰的核糖核苷酸，即这样的核糖核苷酸也是合适的，该核糖核苷酸包含非天然发生的而不是天然发生的核碱基，例如在5位置上经修饰的尿苷或胞苷，例如5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷；在8位置上经修饰的腺苷和鸟苷，例如8-溴鸟苷；脱氮核苷酸，例如7-脱氮-腺苷；O-和N-烷基化核苷酸，例如N6-甲基腺苷。2′-OH基可被选自H、OR、R、卤、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基团取代，其中R是C1-C6的烷基、链烯基或炔基，且卤是F、Cl、Br或I。可因各种原因进行核糖磷酸主链的修饰，例如为了在生理学环境中增加这些分子的稳定性和半衰期或为了用作生物芯片上的探针。可制备天然发生的核酸和类似物的混合物；可选择地，可制备不同核酸类似物的混合物和天然发生的核酸和类似物的混合物。
[0035]此处所用的“可操作地连接”可以指基因的表达在空间上与其连接的启动子的控制之下。启动子可位于在其控制之下的基因的5’(上游)或3′(下游)。启动子和基因之间的距离可以和在该启动子来源的基因中该启动子与其控制的基因之间的距离大致相同。如在本领域中已知的，可调节该距离中的变化而不丧失启动子的功能。
[0036]此处所用的“探针”可以指这样的寡核苷酸，该寡核苷酸能够通过一种或多种类型的化学键，通常通过互补碱基配对，通常通过氢键的形成来结合互补序列的目标核酸。依赖于杂交条件的严格度，探针可以结合不完全和该探针序列互补的目标序列。可存在任何数目的碱基对错配，该碱基对错配干扰目标序列和本发明的单链核酸之间的杂交。然而，如果突变的数目这样大以致于即使在杂交条件的最低严格度下也不能发生杂交，那么所述序列不是互补的目标序列。探针可以是单链的或部分单链和部分双链的。目标序列的结构、组成和性质决定探针的链型(strandedness)。可直接标记探针或间接标记探针，例如用链霉抗生物素蛋白复合物可随后结合的生物素标记探针。
[0037]此处所用的“启动子”可以指能够在细胞中赋予、激活或增强核酸表达的合成的或天然衍生的分子。启动子可包含一个或多个进一步增强表达和/或改变相同基因的空间表达和/或时间表达的特异性调节元件。启动子也可包含远端增强子或阻抑物元件，其可位于离转录的起始位点多达几千碱基对的位置。启动子可来源于这样的来源，该来源包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物。启动子可组成型地调节基因组分的表达，或关于在其中发生表达的细胞、组织或器官，或关于在其中发生表达的发育阶段，或在响应外界刺激，例如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂中差异地调节基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵基因-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子及CMV IE启动子。
[0038]此处所用的“选择标记”可以指任何这样的基因，该基因为这样的细胞赋予表型，在该细胞中，表达该基因以帮助鉴定和/或选择用基因构建体转染或转化的细胞。选择标记的代表性实例包括氨苄青霉素抗性基因(Ampr)、四环素抗性基因(Tcr)、细菌卡那霉素抗性基因(Kanr)、zeocin抗性基因、赋予对抗生素aureobasidin A的抗性的AURI-C基因、膦丝菌素抗性基因、新霉素磷酸转移酶基因(nptII)、潮霉素抗性基因、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因、编码绿色荧光蛋白的基因和萤光素酶基因。
[0039]在此使用的“严格杂交条件”可以指一些条件，在这些条件下第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，目标)杂交，例如在核酸的复杂混合物中，而不与其他序列杂交。严格条件是序列依赖性的，在不同环境中是不同的。一般地，选择严格条件为比定义的离子强度pH下特定序列的热熔点(Tm)低约5-10℃。Tm可以是温度(在定义的离子强度、pH和核酸浓度下)，在该温度下50％与目标互补的探针与目标序列杂交处于平衡状态(目标序列过量存在，在Tm时，50％的探针被占据处于平衡状态)。严格条件可以是其中盐浓度低于约1.0M钠离子，一般约0.01-1.0M钠离子浓度(或其他盐)，pH 7.0到8.3，对于短探针(例如，约10-50个核苷酸)温度至少约30℃，对于长探针(例如，大于50个核苷酸)至少约60℃的条件。严格条件也可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺来达到。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可以是至少2到10倍的背景杂交。示范性的严格杂交条件包括以下的：50％甲酰胺、5x SSC和1％SDS，在42℃孵化，或5x SSC、1％SDS、在65℃孵化，在0.2x SSC和0.1％SDS中在65℃洗涤。
[0040]在此使用的“基本上互补”可以指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多个核苷酸的区域上第一序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同于第二序列的互补物，或者两个序列在严格杂交条件下杂交。
[0041]在此使用的“基本上同一的”可以指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多个核苷酸或氨基酸的区域上第一和第二序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同，或者对于核酸来说，如果第一序列基本上互补于第二序列的互补物。
[0042]如在此使用的“目标(target)”可以指在严格杂交条件下可被一个或多个探针结合的多核苷酸。
[0043]在此使用的“终止子”可以指转录单位末端的序列，其指示转录的终止。终止子可以是含有多聚腺苷酸信号的3′-非翻译DNA序列，其可以促进多聚腺苷酸序列添加到初始转录产物的3′-末端。终止子可以来源于包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。终止子的代表性实例包括SV40多聚腺苷酸信号、HSV TK多聚腺苷酸信号、CYC1终止子、ADH终止子、SPA终止子、Agrobacteriumtumefaciens的胭脂碱合酶(NOS)基因终止子、花椰菜花叶病毒(CaMV)35S基因的终止子、来自Zea mays的zein基因终止子、Rubisco小亚基基因(SSU)基因终止子序列、地三叶草矮化病毒(SCSV)基因序列终止子、ρ-独立的E.coli终止子、和lacZα终止子。
[0044]在此使用的“治疗(treat)”或“治疗(treating)”当涉及保护动物免于状况时，是指防止、压制、抑制或消除所述状况。防止所述状况包括在所述状况发作之前向动物施用本发明的组合物。压制所述状况包括在所述状况的诱导之后但在其临床显现之前向动物施用本发明的组合物。抑制所述状况包括在所述状况的临床显现之后向动物施用本发明的组合物从而所述状况被减轻或阻止恶化。消除所述状况包括在所述状况的临床显现之后向动物施用本发明的组合物从而所述动物不再遭受所述状况。
[0045]在此使用的“载体”可以指含有复制起点的核酸序列。载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体、或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体或整合到宿主基因组中的载体。
2.MicroRNA
[0046]虽然不受理论的限制，在附图1中显示了哺乳动物miRNA的成熟的当前模型。编码miRNA的基因可以被转录，引起称为pri-miRNA的miRNA前体的产生。pri-miRNA可以是包含多个pri-miRNA的多顺反子RNA的部分。pri-miRNA可以形成具有茎和环的发夹结构。如在附图1中指明的，所述茎可以包括错配的碱基。
[0047]pri-miRNA的发夹结构可由Drosha识别，其是RNase III核酸内切酶。Drosha可以识别pri-miRNA中的末端环并裂解大约两个螺旋转角(turns)到茎中，来产生称为pre-miRNA的60-70nt前体。Drosha可以裂解pri-miRNA，带有RNase III核酸内切酶典型的交错切割(staggered cut)，产生具有5′磷酸和～2个核苷酸的3′突出的pre-miRNA茎环。茎的大约一个螺旋转角(～10个核苷酸)延伸超过Drosha裂解位点，可能是有效加工所必需的。然后pre-miRNA可以通过Ran-GTP和输出受体Exportin-5从核主动转运到细胞质。
[0048]pre-miRNA可由Dicer识别，其也是RNase III核酸内切酶。Dicer可以识别pre-miRNA的双链茎。Dicer也可以识别茎环基部的5′磷酸和3′突出。Dicer可在距离茎环基部两个螺旋转角处切除末端环，从而留下另外的5′磷酸和大约2个核苷酸的3’突出端。产生的siRNA样双链体，其可以包含错配，包含成熟的miRNA和称为miRNA*的类似大小的片段。miRNA和miRNA*可以来自pri-miRNA和pre-miRNA的相对的臂。miRNA*序列可以在克隆的miRNA的库中发现，但一般地频率比miRNA低。
[0049]虽然最初作为与miRNA*的双链种类出现，miRNA可最终作为单链的RNA掺入到称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的核糖核蛋白复合物中。各种蛋白可以形成RISC，其可以产生关于对miRNA/miRNA*双链体的特异性、目标基因的结合位点、miRNA的活性(抑制或激活)、miRNA/miRNA*双链体的哪条链被加载到RISC中的可变性。
[0050]当miRNA：miRNA*双链体的miRNA链被加载到RISC中时，miRNA*可以被除去和降解。加载到RISC中的miRNA：miRNA*双链体的链可能是其5′端配对不够紧密的链。当miRNA：miRNA*的两端都具有大约相等的5′配对时，miRNA和miRNA*都可能具有基因沉默活性。
[0051]RISC可以根据miRNA和mRNA之间互补性的高水平来识别目标核酸，特别是通过miRNA的核苷酸2-8。仅在动物中报道了一个案例，其中miRNA和它目标之间的相互作用是沿着miRNA的完整长度的。这是就mir-196和Hox B8显示的，它进一步显示了mir-196介导了Hox B8 mRNA的裂解(Yekta et al 2004，Science 304-594)。另外，这种相互作用仅在植物中是已知的(Bartel & Bartel 2003，PlantPhysiol 132-709)。
[0052]许多研究已经关注在miRNA和它的mRNA目标之间为达到有效抑制翻译的碱基配对需求(由Bartel 2004，Cell 116-281综述)。在哺乳动物细胞中，miRNA的前8个核苷酸可能是重要的(Doench &Sharp 2004 GenesDev 2004-504)。然而，microRNA的其他部分也可能参与mRNA结合。此外，在3′的足够的碱基配对可以补偿5′的不充分的配对(Brennecke at al，2005 PLoS 3-e85)。计算研究，分析结合到完整基因组上的miRNA已经表明了miRNA的5′处的碱基2-7在目标结合中的特定作用，但是通常为“A”的第一个核苷酸的作用也被认可了(Lewis et at 2005 Cell 120-15)。类似地，核苷酸1-7或2-8被Krek等用于鉴别和验证目标(2005，Nat Genet 37-495)。
[0053]mRNA中的目标位点可以在5′UTR、3′UTR中，或在编码区中。有趣地，通过识别相同的或多个位点，多个miRNA可以调节相同的mRNA目标。在大多数遗传鉴别的目标中多个miRNA互补性位点的存在可以表明，多个RISC的协作作用提供了最有效的翻译抑制。
[0054]通过两种机制的一种：mRNA裂解或翻译抑制，miRNA可以指导RISC下调基因表达。如果mRNA与miRNA具有某种程度的互补性，miRNA可以指定mRNA的裂解。当miRNA指导裂解时，切割可以位于miRNA的残基10和11的核苷酸配对之间。做为选择，如果miRNA不具有与miRNA的必需程度的互补性，那么miRNA可以抑制翻译。翻译抑制在动物中可能是更为普遍的，因为动物可能具有更低程度的互补性。
[0055]应注意的是，在任何一对miRNA和miRNA*的5′和3′末端中可能存在变异性。这种变异性可能是由于Drosha和Dicer的酶处理对于裂解位点的变异性。在miRNA和miRNA*的5′和3′末端的变异性也可能由于pri-miRNA和pre-miRNA的茎结构中的错配。茎链的错配可能产生不同发夹结构的群体。茎结构中的变异性也可能引起Drosha和Dicer的裂解产物中的变异性。
3.核酸
[0056]本发明涉及分离的核酸，包含在SEQ ID NO：1-4204915中涉及的核苷酸序列，表1、4、10-14和21-23中涉及的序列，和其变体。所述变体可以是参考核苷酸序列的互补物。所述变体也可以是基本上相同于参考核苷酸序列的核苷酸序列或其互补物。所述变体也可以是在严格条件下与参考核苷酸序列、其互补物、或与其基本上同一的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
[0057]所述核酸可以是10到100个核苷酸的长度。所述核酸可以是至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80或90个核苷酸的长度。所述核酸可以使用如下所述的合成基因来合成或在细胞中表达(体外或体内)。所述核酸可以合成为单链分子并与基本上互补的核酸杂交来形成双链体，其被认为是本发明的核酸。所述核酸可以以单链或双链形式导入到细胞、组织或器官中，或能够使用本领域技术人员公知的方法通过合成基因被表达，包括如美国专利No.6,506,559中描述的，通过引用将其合并在此。
a.Pri-miRNA
[0058]本发明的核酸可以包含pri-miRNA或其变体的序列。pri-miRNA序列可以包含45-250、55-200、70-150或80-100个核苷酸。pri-miRNA的序列可以包含以下所列的pre-miRNA、miRNA和miRNA*。pri-miRNA也可以包含miRNA或miRNA*和其互补物，和其变体。pri-miRNA可以包含至少19％腺嘌呤核苷酸，至少16％胞嘧啶核苷酸，至少23％胸腺嘧啶核苷酸和至少19％鸟嘌呤核苷酸。
[0059]pri-miRNA可以形成发夹结构。发夹可以包含基本上互补的第一和第二核酸序列。第一和第二核酸序列可以是37-50个核苷酸。第一和第二核酸序列可以由8-12个核苷酸的第三序列分隔。发夹结构可能具有低于-25Kcal/mole的自由能，根据使用缺省参数的Vienna算法计算，如Hofacker et al.，Monatshefte f.Chemie 125：167-188(1994)中描述的，通过引用将其内容合并在此。发夹可以包含4-20、8-12或10个核苷酸的末端环。
[0060]pri-miRNA的序列可以包含SEQ ID NO：4097721-4204913、表1中涉及的前体、表11-12和21-23中涉及的序列的序列、或其变体。
b.Pre-miRNA
[0061]本发明的核酸也可以包含pre-miRNA或其变体的序列。pre-miRNA序列可以包含45-90、60-80或60-70个核苷酸。pre-miRNA的序列可以包含以下所列的miRNA和miRNA*。pre-miRNA也可以包含miRNA或miRNA*和其互补物，和其变体。pre-miRNA的序列也可以是pri-miRNA排除了从该pri-miRNA的5′末端和3′末端起的0-160个核苷酸的序列。
[0062]pre-miRNA的序列可以包含SEQ ID NO：4097721-4204913、表1中涉及的前体、表11-12和21-23中涉及的序列的序列、或其变体。
c.MiRNA
[0063]本发明的核酸也可以包含miRNA、miRNA*或其变体的序列。miRNA序列可以包含13-33、18-24或21-23个核苷酸。miRNA的序列可以是pre-miRNA的前13-33个核苷酸。miRNA的序列可以是pre-miRNA的最后13-33个核苷酸。
[0064]miRNA的序列可以包含SEQ ID NO：1-1142416或4204914-4204915、表1中涉及的miRNA、表11-12和21-23中涉及的序列的序列、或其变体。
d.Anti-miRNA
[0065]本发明的核酸也可以包含能够阻断miRNA或miRNA*的活性的anti-miRNA的序列。anti-miRNA可以包含总共5-100或10-60个核苷酸。anti-miRNA也可以包含总共至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个核苷酸。anti-miRNA的序列可以包含(a)基本上相同于miRNA的5′的至少5个核苷酸，和基本上互补于所述miRNA的5′末端的目标位点的侧翼区域的至少5-12个核苷酸，或(b)基本上相同于miRNA的3′的至少5-12个核苷酸，和基本上互补于所述miRNA的3′末端的目标位点的侧翼区域的至少5个核苷酸。
[0066]anti-miRNA的序列可以包含SEQ ID NO：1-1142416或4204914-4204915，表1、13-14或21-23中涉及的miRNA的序列，或其变体的互补物。
e.目标的结合位点
[0067]本发明的核酸也可以包含目标miRNA结合位点或其变体的序列。目标位点序列可以包含总共5-100或10-60个核苷酸。目标位点序列可以包含SEQ ID NO：1142417-4097720，表4、10或15-16中涉及的目标基因结合位点的序列，或其变体的至少5个核苷酸。
4.合成基因
[0068]本发明还涉及合成基因，包含与转录和/或翻译调节序列可操作连接的本发明的核酸。合成基因可能能够修改具有本发明的核酸的结合位点的目标基因的表达。可以在细胞、组织或器官中修改目标基因的表达。通过标准的重组技术，所述合成基因可以被合成或由天然发生的基因获得。所述合成基因也可以包含位于所述合成基因序列的转录单位的3′-末端处的终止子。所述合成基因也可以包含可选择标记。
5.载体
[0069]本发明还涉及包含本发明的合成基因的载体。所述载体可以是表达载体。表达载体可以包含其他元件。例如，所述表达载体可以具有两个复制系统，容许它在两种有机体中维持，例如，在用于表达的哺乳动物或昆虫细胞中，和在用于克隆和扩增的原核宿主中。对于整合表达载体，表达载体可以含有至少一个与宿主细胞基因组同源的序列，优选地，两个侧翼于所述表达构建体的同源序列。通过选择合适的同源序列包含在载体中，整合载体可以针对宿主细胞中的特定基因座。载体也可以包含选择性标记基因来容许选择转化的宿主细胞。
6.宿主细胞
[0070]本发明还涉及包含本发明的载体的宿主细胞。所述细胞可以是细菌、真菌、植物、昆虫或动物细胞。
7.探针
[0071]本发明还涉及包含本发明的核酸的探针。探针可以用于筛选和诊断方法，如下所阐明的。探针可以连接或固定到固体基底上，例如生物芯片。
[0072]探针可以具有8到500、10到100或20到60个核苷酸的长度。所述探针也可以具有至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280或300个核苷酸的长度。所述探针可以进一步包含10-60个核苷酸的接头序列。
8.生物芯片
[0073]本发明还涉及生物芯片。生物芯片可以包含固体基底，其包含连接的本发明的探针或多个探针。所述探针可以能够在严格杂交条件下与目标序列杂交。所述探针可以附着在基底上空间上定义的地址处。每个目标序列可以使用超过一个探针，使用重叠的探针或探针针对特定目标序列的不同片段。所述探针可以能够和与单个失调相关的目标序列杂交。
[0074]探针可以以各种方式附着到生物芯片上，本领域的技术人员将能够理解。探针可以先合成，随后附着到生物芯片上，或者可以直接在生物芯片上合成。
[0075]固体基底可以是一种材料，其可以被修饰以含有离散的单个位点以适合于探针的连接或缔合，并可接受至少一种检测方法的检测。基底的代表性实例包括玻璃和修饰的或功能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸树脂类、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨基甲酸酯、TeflonJ，等等)、多糖、尼龙或硝化纤维素、树脂、硅石或基于硅石的材料包括硅和修饰的硅、碳、金属、无机玻璃和塑料。基底可以容许光学检测而没有可测量的荧光。
[0076]基底可以是平面的，虽然也可以使用其他的基底结构。例如，探针可以置于试管的内表面上，用于流通样品分析以最小化样品体积。类似地，基底可以是柔性的，例如弹性泡沫，包括由特殊塑料制成的闭合小室泡沫。
[0077]生物芯片和探针可以用化学官能团衍生化，用于随后两者的连接。例如，可以用化学官能团包括但不限于氨基、羧基、氧基或硫醇基来衍生生物芯片。使用这些官能团，可以直接地或使用接头间接地，用探针上的官能团对探针进行连接。通过5′末端、3′末端，或通过内部核苷酸，探针可以附着于固体支持物上。
[0078]探针也可以非共价地附着到固相支持物上。例如，可以产生生物素化的寡核苷酸，其可以结合于共价包被有链霉抗生物素蛋白的表面，产生附着。做为选择，可以使用例如光聚作用和光刻法的技术在表面上合成探针。
9.miRNA表达分析
[0079]本发明还涉及鉴定与疾病或病理状况例如病毒感染相关的miRNA的方法，包括用本发明的探针或生物芯片接触生物样品，并检测杂交的数量。PCR可以用来扩增样品中的核酸，这可以提供更高的敏感性。
[0080]鉴定与对照相比在病理细胞中过量表达或减量表达的miRNA的能力可以提供高分辨率的、高灵敏度的数据集，这可以用于诊断、治疗、药物开发、药物遗传学、生物传感器开发领域和其他相关领域。通过当前方法产生的表达分布型(expression profile)可以是针对许多miRNA的样品状态的“指纹”。虽然两种状态可能具有某种类似地表达的特定miRNA，同时地评估许多miRNA容许产生代表细胞状态特征的基因表达分布型。也就是说，正常组织可以区别于患病组织。通过比较已知的不同疾病状态中的组织的表达分布型，可以获得有关在这些状态的每一种中哪些miRNA是相关的的信息。然后，可以进行或证实诊断，来确定组织样品是否具有正常组织或患病组织的表达分布型。这可以提供相关状况的分子诊断。
10.测定表达水平
[0081]本发明还涉及测定疾病相关miRNA的表达水平的方法，包括用本发明的探针或生物芯片接触生物样品并测量杂交的数量。疾病相关miRNA的表达水平在许多方面是信息性的。例如，与对照相比疾病相关miRNA的差异表达可以用作患者患有疾病的诊断。疾病相关miRNA的表达水平也可以用于监视患者的治疗和疾病状态。此外，疾病相关miRNA的表达水平可以容许筛选用于改变与疾病相关的特定表达分布型或抑制与疾病相关的表达分布型的药物候选物。
[0082]通过使包含目标核酸的样品与包含连接的探针的生物芯片接触，所述探针足够地互补于所述目标核酸，并且检测在对照水平以上与探针的杂交，可以检测目标核酸。
[0083]通过将要检查的核酸固定到固相支持物，例如尼龙膜上，并使标记的探针与样品杂交，也可以检测目标核酸。类似地，通过将标记的探针固定到固相支持物上，并与包含标记的目标核酸的样品杂交，也可以检测目标核酸。在洗涤以除去非特异性杂交之后，可以检测标记。
[0084]通过用标记的探针接触渗透化的(permeabilized)细胞或组织样品来容许与目标核酸的杂交，也可以原位地检测目标核酸。在洗涤以除去非特异性结合的探针之后，可以检测标记。
[0085]这些分析可以是直接杂交分析，或可以包含夹心分析，其包括使用多个探针，一般地在美国专利No.5,681,702；5,597,909；5,545,730；5,594,117；5,591,584；5,571,670；5,580,731；5,571,670；5,591,584；5,624,802；5,635,352；5,594,118；5,359,100；5,124,246和5,681,697中阐明，通过引用将每一个合并在此。
[0086]可使用各种杂交条件，包括上述的高严格条件、中等严格条件和低严格条件。可在只允许探针和目标杂交的严格条件下进行测定。可通过改变这样的步骤参数来控制严格度，所述步骤参数是热力学变量，包括，但不限于温度、甲酰胺浓度、盐浓度、离液盐浓度pH或有机溶剂浓度。
[0087]可以各种方法进行杂交反应。可同时或以不同顺序依次加入反应的组分。此外，反应可包括许多种其他试剂。这些试剂包括盐、缓冲液、中性蛋白例如清蛋白、去污剂等，所述试剂可用于帮助最佳杂交和检测，和/或减少非特异性相互作用或背景相互作用。依赖于样品的制备方法和目标的纯度，适当时，也可使用在其他方面提高测定的功效的试剂，例如蛋白酶的抑制剂、核酸酶的抑制剂和抗微生物剂。
a.诊断
[0088]本发明还涉及诊断方法，包括检测生物样品中疾病或感染相关miRNA的差异表达水平。所述miRNA可以是病毒miRNA，其可以在感染的受试者中表达。所述miRNA也可以来自受试者，由于病毒感染其表达水平被修改了。样品可以来自患者。患者的疾病状态的诊断使得能够预后和选择治疗策略。进一步的，通过测定短暂表达的miRNA分子可以将细胞的发育阶段分类。
[0089]可以进行标记的探针与组织阵列的原位杂交。当比较个体和标准之间的指纹时，技术人员可以根据发现进行诊断、预后或预测。进一步理解的是，指明诊断的基因可以不同于指明预后的那些，细胞状况的分子分布型可以区分易起反应的状况或难治的状况或，或可以预测结局。
b.药物筛选
[0090]本发明还涉及筛选治疗剂的方法，包括用候选物治疗剂接触能表达疾病相关miRNA的病理细胞，并评估药物候选物对疾病相关miRNA的表达分布型的影响。在鉴定差别表达的miRNA之后，可以进行各种分析。可以筛选测试化合物调节疾病相关miRNA的基因表达的能力。调节包括基因表达的提高和降低。
[0091]测试化合物或药物候选物可以是有待测试其直接或间接改变疾病表型或疾病相关miRNA的表达的能力的任何分子，例如，蛋白质、寡肽、小的有机分子、多糖、多核苷酸等等。药物候选物包括许多化学类别，例如具有超过100和低于约500、1,000、1,500、2,000或2,500道尔顿的分子量的小的有机分子。候选化合物可以包含与蛋白质的结构性相互作用，特别是氢键作用所必需的官能团，一般包括至少胺、羰基、羟基或羧基，优选的至少两个功能性化学基团。候选试剂可以包含被一个或多个上述官能团取代的环状碳或杂环结构和/或芳香族或多芳香结构。候选试剂也可以在生物分子，包括肽、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、结构类似物或其组合中找到。
[0092]可就结合疾病相关miRNA的能力或调节其活性的能力筛选潜在的调节剂的组合文库。组合文库可以是多种化合物的集合，所述化合物是通过组合许多化学结构单元例如试剂进行的化学合成或生物合成产生的。组合化学文库的制备和筛选对本领域技术人员来说是熟知的。这些组合化学文库包括，但不限于，编码的肽的肽文库、苯并二氮杂类、diversomers例如乙内酰脲类、苯并二氮杂类和二肽、vinylogous多肽、小化合物文库的类似有机综合体(syntheses)、寡氨基甲酸酯(oligocarbamates)、和/或肽基磷酸酯、核酸文库、肽核酸文库、抗体文库、糖类文库和小有机分子文库。
11.基因沉默
[0093]本发明还涉及使用本发明的核酸来降低目标基因在细胞、组织或器官中的表达的方法。通过表达本发明的核酸，可以降低目标基因的表达，所述核酸包含与所述目标mRNA的一个或多个结合位点基本上互补的序列。所述核酸可以是miRNA或其变体。所述核酸也可以是pri-miRNA、pre-miRNA或其变体，其可以被加工产生miRNA。表达的miRNA可以与目标mRNA上基本上互补的结合位点杂交，其可以引起RISC介导的基因沉默的活化。采用过量表达miRNA的研究的实例是Yekta et al 2004，Science 304-594，通过引用将其合并在此。本领域的普通技术人员将认识到，本发明的核酸可以用于使用本领域公知的反义方法以及美国专利No.6,506,559和6,573,099中描述的RNAi方法来抑制目标基因的表达，通过引用将它们合并在此。
[0094]目标基因可以是病毒基因，其可以通过表达病毒或人类miRNA来降低。目标基因也可以是在病毒感染时表达的人类基因，其可以通过表达病毒或人类miRNA来降低。基因沉默的目标可以是引起第二蛋白质的沉默的蛋白质。通过抑制目标基因的表达，可以提高第二蛋白质的表达。Esau et al 2004 JBC 275-52361和Cheng et al 2005Nucleic Acids Res.33-1290研究了有效抑制miRNA表达的实例，通过引用将它们合并在此。
12.基因增强
[0095]本发明还涉及使用本发明的核酸来提高目标基因在细胞、组织或器官中的表达的方法。通过表达本发明的核酸可以提高目标基因的表达，所述核酸包含与pri-miRNA、pre-miRNA、miRNA或其变体基本上互补的序列。所述核酸可以是anti-miRNA。anti-miRNA可以与pri-miRNA、pre-miRNA或miRNA杂交，从而降低它的基因抑制活性。通过表达本发明的核酸也可以提高目标基因的表达，所述核酸与目标基因中结合位点的一部分基本上互补，从而所述核酸与结合位点的结合可以防止miRNA结合。
[0096]目标基因可以是病毒基因，它的表达可以降低病毒的传染性。目标基因也可以是人类基因，它的表达可以降低病毒的传染性或提高对病毒感染的抗性或免疫性。
13.治疗
[0097]本发明还涉及使用本发明的核酸作为疾病或失调，例如与病毒感染相关的那些的调节物或目标的方法。一般地，要求保护的核酸分子可以用做基因表达的调节物，所述基因至少部分地互补于所述核酸。进一步的，miRNA分子可以作为治疗性筛选过程的目标，例如miRNA分子的抑制或活化可能调节细胞分化过程，例如细胞凋亡。
[0098]此外，现有miRNA分子可以用作制造序列修饰的miRNA分子的起始材料，以修改其目标特异性，例如，癌基因、多药物抗性基因或另一个治疗目标基因。进一步的，miRNA可以被修饰，目的是它们被加工然后作为双链siRNA产生，其再次针对治疗性相关目标。此外，miRNA分子可以用于组织重编程过程(tissue reprogrammingprocedures)，例如，通过将miRNA分子表达入不同的细胞类型或干细胞可以转化分化的细胞系。
14.组合物
[0099]本发明还涉及包含本发明的核酸和任选的药学上可接受的载体的药物组合物。所述组合物可以用于诊断或治疗应用。可以通过已知的方法进行药物组合物的施用，其中核酸被体外或体内地导入期望的目标细胞。通常使用的基因转移技术包括磷酸钙、DEAE-葡聚糖、电穿孔、显微注射、病毒方法和阳离子脂质体。
15.试剂盒
[0100]本发明还涉及包含本发明的核酸连同任何或所有以下物质的试剂盒：分析试剂、缓冲液、探针和/或引物，和无菌盐水或另一种药学上可接受的乳剂和悬浮基质。此外，所述试剂盒还包括指导材料，含有对于实践本发明的方法的指导(例如，方案)。
                        实施例1
                       预测miRNA
[00100]我们使用了与美国专利申请No.60/522,459、10/709,577和10/709,572中描述的那些方法类似的三种计算方法就潜在的miRNA编码基因检查了许多病毒基因组用于预测miRNA，通过引用将其内容合并在此。通过热力学稳定性以及结构的和上下文的特征，对预测的发夹和潜在的miRNA计分。通过使用在Sanger数据库中已经验证的miRNA来校准算法。
1.第一次和第二次筛选
[0100]表11和12显示了来自第一次计算筛选的每个预测的发夹的序列(“PRECURSOR SEQUENCE”)、序列标识符(“PRECURSEQ-ID”)和来源有机体(“GAM ORGANISM”)，连同预测的miRNA(“GAM NAME”)。表13和14显示了每个miRNA(“GAMNAME”)的序列(“GAM RNA SEQUENCE”)和序列标识符(“GAMSEQ ID”)，以及来源有机体(“GAM ORGANISM”)和Dicer切割位置(“GAM POS”)。
2.第三次筛选
[0101]表1列出了特定病毒基因组(“V”；也参见表10)的第三次计算性筛选的每个预测的发夹(“HID”)的SEQ ID NO。表1还列出了每个发夹的基因组位置(“Hairpin Location”)。基因组位置的格式是<链><起始位置>的拼接。基因位置基于NCBI-Entrez核苷酸数据库。Entrez核苷酸数据库是来自几个来源，包括GenBank、RefSeq和PDB的序列的集合。表10显示了为用于这个筛选的每个基因组呈现的登记号码和build(version)。
[0102]表1也列出了每个预测的miRNA和miRNA*的SEQ ID NO(“MID”)。表1还列出了如Hofacker et al.，Monatshefte f.Chemie125：167-188，1994中描述的，按0-1(1，发夹是最可靠的)的尺度的每个发夹的预测分值级别(“P”)。表1还列出了每个P分值的值从背景发夹计算出的p值(“Pval”)。所有p-值都是显著的-低于0.05。如表1所示，存在少数例子其中Pval是0.0。在这些情况的每一个中，数值小于0.0001。通过将测试的发夹的palgrade与没有预选发夹的其他序列的palgrade相比较，来计算p-值。
[0103]表1还列出了miRNA是否通过表达分析验证了(“E”)(Y＝是，N＝否)，如表2中详述的。表1还列出了miRNA是否通过测序验证了(“S”)(Y＝是，N＝否)，如表3中详述的。如果在预测的和测序的miRNA之间在序列上存在差异，则呈现测序的序列。应注意到，未能测序或检测miRNA的表达不一定意味着miRNA不存在。这种未检测的miRNA可能在测试的那些组织以外的组织中表达。此外，这种未检测的miRNA可能在测试组织中表达，但与那些实验细胞相比处在不同的阶段或在不同的条件下表达。
[0104]表1还列出了miRNA是否在至少一种疾病中显示了差别表达(“D”)(Y＝是，N＝否)，如表2中详述的。表1还列出了miRNA是否存在于(“F”)(Y＝是，N＝否)Sanger DB Release 6.0(April 2005)(http://nar.oupjournals.org/)中，如在人类或小鼠中预测的或在人类中检测的。如以上讨论的，在Sanger数据库中列出的miRNA是预测算法的组分和用于输出的对照。
[0105]表1也列出了特定病毒的那些发夹的遗传位置簇(geneticlocation cluster)(“LC”)，所述发夹相互之间相距在1,000个核苷酸之内。具有相同LC的每种miRNA享有共同的遗传簇。重叠的那些发夹没有被聚簇。表1还列出了种子簇(“SC”)来通过它们的种子2-7的精确匹配来给miRNA分组，不考虑来源病毒。具有相同SC的每个miRNA具有相同的种子。对于6个核苷酸的种子长度的论述，参见Lewis et al.，Cell，120；15-20(2005)。
                       实施例2
                     预测目标基因
[0106]然后将来自实施例1的三种计算性筛选的预测的miRNA用于预测人类和病毒目标基因和它们的结合位点，使用类似于美国专利申请No.60/522,459、10/709,577和10/709,572中描述的那些的两种计算方法，用于预测miRNA，通过引用将其内容合并在此。
1.第一次和第二次筛选
[0107]表15和16列出了来自第一次计算性筛选的预测的目标基因(“TARGET”)和结合位点序列(“TARGET BINDING SITESEQUENCE”)和结合位点序列标识符(“TARGET BINDING SITESEQ-ID”)，以及目标的来源有机体(“TARGET ORGANISM”)。
2.第三次筛选
a.人类目标基因
[0108]表4列出了根据第三次计算性筛选，来自特定病毒(V)的每个miRNA(MID)的预测的人类目标基因和它的发夹(HID)。目标基因的名称取自NCRI Reference Sequence release 9(http://www.ncbi.nlm.nih.gov；Pruitt et al.，Nucleic Acids Res，33(1)：D501-D504，2005；Pruitt et al.，Trends Genet.，16(1)：44-47，2000；和Tatusova et al.，Bioinformatics，15(7-8)：536-43，1999)。通过具有7核苷酸miRNA种子(位置2-8)的完美互补匹配和UTR上的A(总共＝8个核苷酸)，来鉴定目标基因。对于鉴定目标基因的论述，参见Lewis et al.，Cell，120：15-20，(2005)。对于足以满足miRNA到UTR的结合的种子的论述，参见Lim Lau et al.，(Nature 2005)和Brenneck et al，(PLoS Biol 2005)。
[0109]当每个基因存在几个转录产物时，结合位点筛选仅考虑每个UTR的前4000个核苷酸，并考虑最长的转录产物。这种过滤将转录产物的总数从23626降低到14239。表4列出了每个目标基因的预测的结合位点的SEQ ID NO。结合位点的序列包括结合位点的5′和3′的20个核苷酸，因为它们位于剪接的mRNA上。在那些结合位点被2个外显子包含的情况中，包括了来自两个外显子的5′和3′末端的20个核苷酸。
[0110]表5显示了特定病毒(“V”)的miRNA(“MID”)/发夹(“HID”)通过它们的人类目标基因与疾病之间的关系。疾病的名称取自OMIM。对于将发夹所处的宿主基因与疾病相联系的理论的论述，参见Baskerville and Bartel，RNA，11：241-247(2005)和Rodriguezet al.，Genome Res.，14：1902-1910(2004)。表5显示了与疾病相关的miRNA目标基因的数量(“N”)。表5也显示了与疾病有关的基因的总数(“T”)，其取自预测具有miRNA的结合位点的基因。表5还显示了T中N的百分比和超几何分析的p值(“Pval”)。在pval被列为0.0的情况中，是指该值小于0.0001。对于超几何分析的参考文献，参见Schaum′s Outline of Elements of Statistics II：InferentialStatistics。表7显示了表5和6的疾病代码。
b.病毒目标基因
[0111]类似于以上在表4中对于人类目标基因描述的数据，表10列出了根据第三次计算性筛选的、来自相同的特定病毒(V)的每个miRNA(MID)的预测的病毒目标基因和它的发夹(HID)。病毒结合位点的预测使用了完整基因而不是如在表4中的UTR，在以上对于人类目标基因描述的方法中表10。如果已知它们在病毒生活周期中具有作用，候选物目标基因被包括到筛选中。在参与病毒生活周期的病毒基因上具有结合位点的那些miRNA，它们可能影响可能与病毒有关系的疾病。
[0112]人类疱疹病毒1和2与由疱疹病毒引起的几种炎症性疾病相关，在一种情况中标志为腰以上的(以及口和唇的)皮肤或粘膜上的水泡群，在另一种情况中为生殖器上的这种水泡。人类疱疹病毒4(Epstein-Barr病毒)引起传染性单核细胞增多症并与Burkitt′s淋巴瘤和鼻咽癌有关。HIV毒株与获得性免疫缺陷综合征(AIDS)有关。乙型和丙型肝炎病毒引起肝脏的炎症。
                       实施例3
                      验证miRNA
[0113]为了证实实施例1中预测的发夹和miRNA，我们使用了类似美国专利申请No.60/522,459、10/709,577和10/709,572中描述的那些的高通过量微阵列检测了各种组织中的表达，通过引用将其内容合并在此。对于每种预测的前体miRNA，测试了来自发夹的每个茎的成熟miRNA。
1.表达分析-集合1和集合2
[0114]表17-19列出了检测miRNA序列的微阵列表达分析的结果(“GAM RNA SEQUENCE”)。
2.表达分析-集合3
[0115]表2显示了第三个预测集的发夹(“HID”)，其是通过检测来自特定病毒(“V”)的相关miRNA(“MID”)的表达来验证的，并且显示了检测了表达的组织的代码(“Tissue”)。当相同组织中的相同miRNA有超过一个的分值时，仅呈现具有更高分值的那个。
[0116]组织和疾病代码分别在表6和表7中列出。表8显示了基因和疾病之间的关系。这允许将所有的miRNA与疾病联系起来。表4为每个miRNA分配了至少一个目标基因。表5呈现了表4和OMIM的统计分析的结果，来描述miRNA和疾病之间的显著关系。表8基本上是OMIM的压缩版本。它为每个基因列出了与之相关的所有的疾病数字代码。
[0117]所有公开的组织都给出了病毒疾病的指示。测量到病毒的显著表达的事实意味着在这个组织中它可能涉及了病毒疾病。例如，当来自HIV的mir在T细胞系中表达时，它可能对AIDS有影响。当然，细胞系仅代表了组织的特征的子集，因为它是在器官中起作用的，然而我们可以象在细胞系中测量的一样从表达得出结论。
[0118]表2还显示了芯片表达分值级别(500-65000的范围)(“S”)。500的阈值被用于消除非显著的信号，通过来自不同实验的MirChip探针信号将分值标准化。在实验之间荧光材料的强度中的变化可能是由于在RNA制备或标记效率中的变化。我们根据在每个样品中miRNA的总数是相对固定的假定来进行标准化。首先我们从每个探针的原始信号中减去背景信号，其中背景信号被定义为400。然后，我们将每个miRNA探针信号除以所有miRNA的平均信号，结果乘以10000，并加回400的背景信号。因而，根据定义，在每个实验中所有miRNA探针信号的总和是10400。
[0119]表2还显示了在标准化的分值上计算的标准化信号的统计分析(“Spval”)。对于每个miRNA，我们使用了来自预测的miRNA的完全列表的相关对照组。每个miRNA具有带有错配的探针的内部对照。相关对照组含有具有类似的C和G百分比(绝对差＜5％)的探针以具有类似的Tm。探针信号P值是与具有相同或更高信号的相关对照组探针的比值。结果是p-值≤0.05和分值高于500。在SPVal被列为0.0的情况中，该值小于0.0001。
3.测序-集合3
[0120]为了进一步验证第二次预测的发夹(“HID”)，通过类似美国专利申请No.60/522,459、10/709,577和10/709,572中描述的测序方法验证了许多miRNA，通过引用将其内容合并在此。表3显示了通过在指定组织(“Tissue”)中测序来自病毒(“V”)的miRNA(MID)而验证的发夹(“HID”)。
4.Northern分析
[0121]通过Northern分析验证了一组miRNA，如附图2和3所示。
                      实施例4
                   miRNA的差异表达
1.病毒miRNA
[0122]表20提供了验证的病毒miRNA，其被证明与健康人类组织或人类衍生的细胞系相比，在患病的人类组织或人类衍生的细胞系中是差异表达的。使用以上描述的miRNA微阵列验证了所有miRNA序列。对于Alzheimer病，在患病的和健康的人类扁桃体、扣带皮质(cingulate cortex)、尾状核、苍白球、后顶叶皮质(posterior parietalcortex)和上顶叶皮质(superior parietal cortex)的组织的混合物中研究了GAM RNA表达，显示了所有脑部区域被Alzheimer病变轻度、中度或重度地影响。对于Parkinson病，在来自患病的和健康人类组织的实质黑质组织中研究了GAM RNA表达。用Clade A人类免疫缺陷病毒(HIV)的T-tropic临床分离物感染了MT2细胞系，而健康对照没被感染。用M-tropic Clade B HIV感染cMagi细胞系，而健康对照没被感染。用HSV或HSV2感染人类成纤维细胞(TC)，或不进行感染并充当对照。GAM RNA SEQUENCE：成熟的“diced”GAM RNA的序列(5′到3′)。CHIP SEQUENCE是寡核苷酸的序列，包括置于微阵列上的预测的GAM RNA(不包括用作相对于微阵列表面的分离物的非基因组序列)。
DISEASE：其中GAM RNA是差异表达的疾病，BAL是指M-tropicHIV1亚型B实验室菌株，BLAI是指T-tropic HIV-1(LAV-1)，亚型B；SIGNAL(HEALTHY)：在包含未被指定疾病影响的人类组织或人类衍生的细胞系的样品中微阵列上GAM RNA的信号；SIGNAL(DISEASE)：在包含被指定疾病影响的人类组织或人类衍生的细胞系的样品中微阵列上GAM RNA的信号。
2.人类miRNA
[0123]表21列出了miRNA的表达数据，如下：HID：发夹SEQ IDNO；MID：MiRNA SEQ ID NO；Tissue：测试的组织；S：芯片表达分值分级(范围＝100-65000)；Dis.Diff.Exp.：疾病相关的差异表达和所测试的组织；R：疾病相关表达的比例(范围＝0.01-99.99)；缩写：Brain Mix A——Alzheimer中影响的脑组织的混合物；Brain Mix B——所有脑组织的混合物；和Brain SN——实质黑质(SubstantiaNigra)。表22和23提供了关于差异表达的miRNA的细节，如下：HID：发夹SEQ ID NO；Hairpin_Loc：发夹基因组位置，连成一串的<chr id><strand>space<start position>(例如，19+135460000意思是chr19+链，起始位置135460000)；C：进化中的保守性(Yes/No和当数据不可用时为″-″；Yes-保守水平高于阈值0.7)；T：基因组类型，基因间的(G)，内含子(I)，外显子(E)；MID：MiRNA SEQ IDNO；Target Gene，Disease：目标基因(HUGO数据库)和相关疾病(OMIM数据库)；P：预测分值分级，范围0-9；E：芯片表达信息-Yes/No(Y/N)；S：通过测序验证-Yes/No(Y/N)；HID：发夹SEQ IDNO。表24提供了表21-23中涉及的序列的序列。
                      实施例4
                  EBVmiRNA的分析
1.验证表达
[0124]附图4显示了在EBV(Epstein′s Barr病毒)miRNA中预测的miRNA的表达的验证；表达验证。测试了三个细胞系。两个是新感染的正常B细胞(PBMC-1/2-EBV)，和一个EBV转化的细胞系(B-95-8)。这3个细胞系展现出相同程度的EBV感染(附图4A)。然而，与新感染的B细胞相比，EBV-miR-RG-1和-2在B-95-8细胞系中是高表达的(附图4B)。
2.表达的敲除
[0125]附图5显示了EBV miRNA的敲除。向B-95-8细胞系中添加针对EBV-miR-RG-1的2-O-Methyl结果是表达EBV抗原的细胞的显著下降。向B-95-8细胞系中添加针对EBV-miR-RG-2的2-O-Methyl，具有中度的效果，稍微提高EBV表达。

Claims (16)

1.一种分离的核酸，包含选自以下构成的组的序列的一部分：
(a)SEQ ID NO：4097721-4204913；
(b)表1、11-12和21-23中涉及的前体的序列；
(c)SEQ ID NO：1-1142416或4204914-4204915；
(d)表1、13-14和21-23中涉及的miRNA的序列；
(e)SEQ ID NO：1142417-4097720；
(f)表4、10和15-16中涉及的目标基因结合位点的序列；
(g)(a)-(h)的互补物；
(h)包含至少70％相同于(a)-(h)的至少12个连续核苷酸的核苷酸序列；
其中所述核酸长度是5-250个核苷酸。
2.包含权利要求1的核酸的探针。
3.权利要求2的探针，其中所述核酸包含与SEQ ID NO：1-1142416或4204914 4204915、表1、13-14或21-23中涉及的miRNA或其变体互补的至少8-22个连续核苷酸。
4.权利要求2的探针，其中所述核酸包含与在病毒感染中差异表达的人类miRNA互补的至少8-22个连续核苷酸。
5.选自由权利要求3或4的探针构成的组的多个探针。
6.权利要求5的多个探针，包含至少10个探针。
7.权利要求5的多个探针，包含至少100个探针。
8.一种组合物，包含权利要求5-7的任一项的多个探针。
9.包含固体基底的生物芯片，所述基底包含权利要求5-7的任一项的多个探针，其中每个探针在空间定义的地址处附着在所述基底上。
10.检测病毒感染相关miRNA的差异表达的方法，包括：
(a)提供生物样品；和
(b)测量核酸的水平，所述核酸至少70％相同于(i)SEQ ID NO：1-1142416或4204914-4204915，(ii)表1、13-14和21-23中涉及的miRNA的序列，或(iii)(i)-(ii)的变体，
其中所述核酸的水平与对照相比的差异是差异表达的指示。
11.鉴别调节病毒感染的化合物的方法，包括：
(a)提供能够表达核酸的细胞，所述核酸至少70％相同于(i)SEQ ID NO：1-1142416或4204914-4204915，(ii)表1、13-14和21-23中涉及的miRNA的序列，或(iii)(i)-(ii)的变体；
(b)用候选调节物接触细胞；
(c)测量所述核酸的表达水平，
其中所述核酸的水平与对照相比的差异确定所述化合物为与所述核酸相关的病理状况的调节物。
12.抑制细胞中目标基因的表达的方法，包括以足够抑制所述目标基因表达的量将核酸导入所述细胞，其中所述目标基因包含基本上相同于表4、10或15-16中涉及的结合位点或其变体的结合位点，和其中所述核酸包含(i)SEQ ID NO：1-1142416或4204914-4204915，(ii)表1、13-14或21-23中涉及的miRNA的序列，或(iii)(i)-(ii)的变体的一部分。
13.权利要求12的方法，其中所述表达在体外或体内被抑制。
14.提高细胞中目标基因的表达的方法，包括以足够提高所述目标基因表达的量将核酸导入所述细胞，其中所述目标基因包含基本上相同于表4、10或15-16中涉及的结合位点或其变体的结合位点，和其中所述核酸的一部分基本上互补于(i)SEQ ID NO：1-1142416或4204914-4204915，(ii)表1、13-14或21-23中涉及的miRNA的序列，或(iii)(i)-(ii)的变体。
15.权利要求14的方法，其中表达在体外或体内被抑制。
16.治疗患有病毒感染或病毒感染相关状况的患者的方法，包括向有需要的患者施用核酸，其中所述核酸的一部分基本上互补于(i)SEQID NO：1-1142416或4204914-4204915，(ii)表1、13-14或21-23中涉及的miRNA的序列，或(iii)(i)-(ii)的变体。
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