KR20110056482A

KR20110056482A - 항바이러스 요법 반응의 예측

Info

Publication number: KR20110056482A
Application number: KR1020117002019A
Authority: KR
Inventors: 비톨드 필리포비츠; 마르쿠스 헤임; 야첵 크롤; 일로나 마르키에비츠; 막달레나 사라신-필리포비츠
Original assignee: 노파르티스 포르슝스티프퉁 쯔바이크니덜라쑹 프리드리히 미셔 인스티튜트 포 바이오메디칼 리서치; 유니버시티 하스피틀 바젤
Priority date: 2008-06-27
Filing date: 2009-06-26
Publication date: 2011-05-30
Also published as: EP2297357A1; WO2009156507A1; RU2011102818A; PL2297357T3; PT2297357E; US20130252233A1; ES2398500T3; AU2009264170A1; CN102159725A; BRPI0914316A2; MX2010014242A; JP2011525799A; CA2728816A1; EP2297357B1; US20110256534A1

Abstract

본원은 항바이러스 요법이 효과적인지 여부를 결정하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본원은 간이 바이러스에 감염된 대상체가 인터페론 (IFN) 활성의 자극을 포함하는 항바이러스 요법에 반응성일 가능성을 결정하기 위해, miRNA, 예를 들어 miR-122 또는 miR-296-5p를 사용하는 방법, 및 상기 결정을 수행하기 위한 키트를 제공한다.

Description

항바이러스 요법 반응의 예측{PREDICTION OF ANTIVIRAL THERAPY RESPONSE}

본 발명은 항바이러스 요법을 개선시키기 위한 치료, 및 항바이러스 요법이 효과적인지 여부를 결정하는 방법에 관한 것이다.

바이러스 감염은 건강에 심각한 위협이 되고 있고, 동물과 인간 발병률의 주요 원인인 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, C형 간염 바이러스 (HCV) 감염은 전세계적으로 만성 간 질환의 주요 원인이다. C형 간염의 중요하고도 놀라운 특징은 이것이 점점 만성화되간다는 것이다. 감염된 개체의 70％ 초과에서는, HCV가 수 십년 동안 지속적 감염으로서 확고히 자리잡게 되어 간경화와 간세포 암종을 유발시킬 수 있다.

HCV 생물학에 있어서 흥미로운 가설은 바이러스 NS3-4A 프로테아제가 바이러스 단백질을 프로세싱할 뿐만 아니라 바이러스 감염을 검출하고 유형 I 인터페론 (IFN)의 전사 활성화를 유도하는 세포내 감각 경로의 성분들을 절단 및 불활성화시킨다고 제안하고 있다. NS3-4A의 표적 중의 하나는, TLR3 (톨(toll)-유사 수용체 3)에 의한 엔도솜에서의 dsDNA 검출과 IFNβ의 유도 사이를 본질적으로 연결시키는, TRIF (IFNβ를 유도하는 TIR 도메인-함유 어댑터)이다. 보다 최근에는, 레티노산 유도성 유전자-I (RIG-I) 및 MDA5 (헬리카드(helicard))가 dsRNA의 세포내 센서로서 확인되었다. 두 센서는 카르디프(Cardif) (IPS-1, MAVS, VISA로도 공지됨)를 통해 신호전달하여 IFNβ 생성을 유도한다. 카르디프는 HCV NS3-4A에 의해 절단 및 불활성화될 수 있다. dsRNA의 세포내 센서로서 확인된 2개의 RNA 헬리카제 RIG-I 및 MDA5는 카르디프를 통해 IFNβ 생성을 유도하는 작용을 한다.

유형 I IFN은 선천적인 면역계의 중요한 성분일 뿐만 아니라, CHC에 대항하는 현재의 요법의 가장 중요한 성분이기도 하다. 현재의 표준 요법은 PEG화 IFNα (pegIFNα)를 매주 1회 피하 주사하고, 경구 항바이러스제인 리바비린을 매일 복용하는 것으로 이루어진다. 이러한 레지멘은 약 55％의 환자에서 전반적으로 지속적인 바이러스학적 반응 (SVR)을 달성시켜 주는데, 유전자형간에는 유의한 차이가 있다. SVR은 치료 동안 검출가능한 HCV RNA가 손실되고, 요법을 중단한 후 적어도 6개월 동안 이것이 지속적으로 부재하는 것으로서 정의된다. SVR을 달성한 환자를 대상으로 한 몇 가지 장기간 후속적인 연구 결과는 상기 반응이 95％가 넘는 환자에서 지속되는 것으로 입증되었다. SVR의 확률은 치료에 대한 초기 반응에 상당히 좌우된다. 요법 12주 후에 적어도 2 log₁₀만큼 바이러스 로드가 감소되는 것으로 정의되는, 조기 바이러스학적 반응 (EVR)을 나타내지 않는 환자는 SVR을 거의 발생시키지 않을 것이며, 이들 환자에서는 치료를 중단할 수 있다. 한편, EVR을 나타내는 환자는 치유될 가능성이 있으며, 이들 중의 65％가 SVR을 달성한다. 치료 4주 후에 혈청 HCV RNA가 검출가능하지 않은 것으로 정의되는, 신속한 바이러스학적 반응 (RVR)을 나타내는 환자의 경우에는 예후가 훨씬 더 좋다. 이들 중 85％가 넘게 SVR을 달성할 것이다. 불행하게도, 유전자형 1을 가진 환자의 20％ 미만 및 유전자형 2 또는 3을 가진 환자의 약 60％가 RVR을 나타낸다. 요법에 대한 초기 반응에 있어 중요한 숙주 요인은 현재 공지되어 있지 않다.

유형 I IFN은 수백개 유전자 (ISG, 인터페론 자극된 유전자)의 조절을 통해 그의 강력한 항바이러스 효과를 달성한다. ISG의 전사적 활성화는 휴지기 세포에서는 보통 합성되지 않는 단백질 및 세포 내에 비-바이러스 특이적 항바이러스 상태를 확립시켜 주는 단백질을 유도한다. 인터페론은 많은 사이토킨 및 성장 인자에 의해 사용된 세포 신호전달의 패러다임인 Jak-STAT 경로를 활성화시킴으로써 그의 합성을 유도한다. 모든 유형 I IFN은 동일한 세포 표면 수용체 (IFNAR)와 결합하고, 이러한 수용체 관련 야누스(Janus) 키나제 패밀리의 구성원 Jak1 및 Tyk2를 활성화시킨다. 이어서, 이러한 키나제는 인산화되고, 전사 1의 신호 변환인자 및 활성인자 (STAT1) 및 STAT2를 활성화시킨다. 이와 같이 활성화된 STAT는 핵 내로 전위되는데, 여기서는 이들이 ISG의 프로모터에서 특이적 DNA 요소와 결합한다. 많은 ISG는 항바이러스 활성을 지니고 있지만, 다른 것은 지질 대사, 아폽토시스, 단백질 분해 및 염증성 세포 반응에 관여한다. 많은 바이러스의 경우와 같이, HCV는 아마도 여러 수준에서 IFN계를 방해한다. IFN 유도된 Jak-STAT 신호전달은 HCV 단백질을 발현하는 세포 및 트랜스제닉(transgenic) 마우스에서 및 CHC 환자의 간 생검에서 억제된다. 시험관내에서는, HCV 단백질 NS5A 및 E2가 중요한 비특이적 항바이러스 단백질인 단백질 키나제 R (PKR)과 결합하여 이를 불활성화시킨다. 그러나, CHC 환자에게 치료적으로 적용된 IFN에 대한 반응에 있어 중요한 분자적 메카니즘은 현재 공지되어 있지 않다. (문헌 [Sarasin-Filipowicz et al., 2008, PNAS, 105(19):7034-7039]).

많은 상이한 수준에서 IFN 경로를 방해할 수 있는 HCV의 능력은 만성 감염의 확립을 성공시켜 주는데 기초가 되는 HCV 메카니즘인 것으로 예상된다 (문헌 [Gale, M., Jr. & Foy, E.M., Nature 436, 939-945 (2005)]). 그러나, 다소 역설적으로 말하자면, HCV에 급성 또는 만성적으로 감염된 침팬지에서는 수백개의 ISG가 간에서 유도된다 (문헌 [7 Bigger, C.B., et al., J Virol 78, 13779-13792 (2004)]). 그럼에도 불구하고, 내인성 IFN계가 활성화되었지만, 상기 바이러스는 만성적으로 감염된 동물로부터 제거되지 않는다. 이와 같이 침팬지를 이용하여 수득한 결과를 인간에게 외삽하기가 곤란한데, 이들 종간에는 HCV 감염의 병리생리학에 있어서 몇몇 중요한 차이가 있기 때문이다. HCV로 급성 감염된 대부분의 침팬지에서는 이러한 바이러스가 자발적으로 제거되는 반면, 인간에서의 감염은 대개 만성화된다. 한편, 만성적으로 감염된 침팬지는 IFN으로 거의 치료할 수 없는 반면, CHC 환자의 절반이 넘게 성공적으로 치료된다.

또한, 많은 CHC 환자의 치료전 간 생검에서 ISG가 유도되는 것으로 밝혀졌는데, 이는 HCV 감염으로 인해 내인성 IFN계가 활성화될 수 있음을 다시 한번 입증한다 (문헌 [(Chen, L., et al., Gastroenterology 128, 1437-1444 (2005)]). 특히, ISG의 발현이 상승되기 전의 환자는 초기 발현이 낮은 환자와 비교해서 치료에 불량하게 반응하는 경향이 있다 (문헌 [Chen, L., et al., Gastroenterology 128, 1437-1444 (2005)]). 이와 같이 치료에 대한 차별적 반응의 원인은 이해되지 않고 있다.

본 발명은 본 발명자들이 pegIFNα를 이용한 요법을 받기 전 및 받는 동안 만성 간염 환자의 간 생검 및 말초혈 단핵 세포 (PBMC)의 쌍을 이룬 샘플에서 IFN 유도된 신호전달 및 ISG 유도를 조사한 연구에 기초한다. 본 발명자들은 생화학적 및 분자상 데이터를 치료에 대한 반응과 추가로 상관 지었다. 이들의 작업은 첨부되는 실시예에 보다 상세히 제시되어 있다.

이전의 연구에서, 본 발명자들은 간이 바이러스에 감염된 몇몇 대상체가 "예비-활성화" 상태에 있으므로, IFN 신호전달 경로가 활성화된 ISG로의 자극 상태에 있음을 확립시켰다 (문헌 [Sarasin-Filipowicz et al., 2008, PNAS, 105(19):7034-7039]). 본 발명자들은 이러한 개체를 IFN 및 항바이러스제로 후속 치료한 경우에, 항바이러스 치료에 대해 불량한 반응을 나타내거나 반응을 전혀 나타내지 않는다는 것을 밝혀내었다. 이와는 달리, 감염된 또 다른 대상체 군은 IFN 수용체에 미리 자극 (및 ISG의 자극)되지 않은 것으로 여겨졌고, 이러한 군은 항바이러스 요법에 잘 반응하였다 (즉, 이들은 신속한 바이러스학적 반응 (RVR)을 나타내었음). 게다가, 대상체가 수많은 특이적 유전자 (이들 중의 몇몇은 ISG 유전자임)의 발현 수준에 따라서 RVR을 나타내는지 아니면 치료에 대해 불량한 반응자인지를 결정하는 것이 가능하다. 달리 말하면, 본 발명자들은 예후 유전적 마커인 유전자 세트 (그의 발현 수준은 대상체가 항바이러스 치료에 반응할 것인지를 예측함)를 확인하였다.

pegIFNα를 이용한 요법을 받기 전 및 받는 동안 만성 간염 환자의 간 생검 및 말초혈 단핵 세포 (PBMC)의 쌍을 이룬 샘플을 이용하는 추가의 연구에서, 본 발명자들은 환자의 마이크로RNA (miR)를 조사하였다.

마이크로RNA (miRNA)는 최종 생성물이 ~22 nt의 기능성 RNA 분자인 비-코딩 RNA 유전자 부류이다. 이는 내인적으로 코딩된 불완전 헤어핀 전구체로부터 단일 가닥 RNA로서 프로세싱된다. 이는 표적 mRNA의 3'-비번역 부위 (UTR)에 대한 염기쌍 형성을 통해 번역 억제를 거쳐 기능하는 것으로 보인다 (문헌 [Griffith-Jones et al., 2006, Nucleic Acids Research, Vol. 34, D140-D144]).

마이크로RNA (miRNA) 생합성은 복잡한 다단계 과정이다. 1차 miRNA 전사체는 RNA 폴리머라제 II에 의해 전사되고, 크기 범위는 수백 내지 수천 뉴클레오티드 길이일 수 있다 (pri-miRNA). miRNA는 2개의 게놈 공급원으로부터 시작될 수 있다. 일부의 miRNA는 단백질-코딩 유전자의 인트론 영역 내에 위치한다. 다른 것들은 비-코딩 RNA의 인트론 또는 엑손 내에 위치한다. 흥미롭게도, pri-miRNA가 단일 miRNA를 코딩할 수 있지만, 몇몇 miRNA의 클러스터를 함유할 수 있다. 이어서, pri-miRNA는 핵 리노뉴클레아제 III (RNase III) 엔도뉴클레아제인 드로셔(Drosha)에 의해 ~70 nt의 헤어핀 (pre-miRNA)으로 프로세싱된다. 이어서, pre-miRNA는 엑스포린(Exporin)5/RanGTP에 의해 핵으로부터 세포질로 유출된다. 세포질에서 제2 RNase III인 다이서(Dicer)는 그의 dsRBD 단백질 파트너와 함께 헤어핀의 스템 영역에서 pre-miRNA를 절단함으로써 ~21 뉴클레오티드 RNA-이중 가닥을 유리시킨다. miRNA 이중 가닥으로부터 하나의 가닥은 표적 유전자 발현을 억제시키는 단백질 복합체인 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC)로 유입되는 반면, 다른 하나의 가닥은 분해된다. 가닥 선택은 miRNA 이중 가닥의 국소적인 열역학적 안정성에 달려있다. 5' 말단이 덜 안정적으로 쌍을 형성하는 가닥이 RISC 복합체 내로 로딩된다. RISC 복합체 내로 로딩된 miRNA가 표적 mRNA의 3'-비번역 부위 (UTR)와 염기쌍을 형성함으로써 번역 억제를 거쳐 기능하는 것으로 보인다 (문헌 [Du, T. and Zamore, P.D. et al., micro-Primer: the biogenesis and function of microRNA. Development (2005) 132, 4645-4652]). 현재, 462개의 인간 miRNA 서열이 miRBase (http://microrna.sanger.ac.uk)에 기탁되어 있고, 이러한 목록은 800 마크에 이를 것이라고 제안하고 있다. 현재까지 확인된 다수의 miRNA는 생물학적 프로세싱의 조절 및 미세조정에서 복잡한 역할을 할 수 있음을 시사한다. 사실상, 몇몇 miRNA가 세포 증식 조절 (mir-125b 및 let-7), 조혈 B-세포 계열 운명 (mir-181), B-세포 생존 (mir-15a 및 mir-16-1), 뇌 패턴화 (mir-430), 췌장 세포 인슐린 분비 (mir-357), 지방세포 발생 (mir-375) 및 근육 증식 및 분화 (miR-1 및 miR-133)와 관련되어 있다. 다수의 miRNA는 암에 관여하는 게놈 영영에 위치한다. 예를 들어, mir-16-1 및 mir-15를 함유하는 클러스터는 대다수의 B-세포 만성 림프구성 백혈병에서는 결실되고 하향 조절된다 (B-CLL; 문헌 [Calin, G.A., et al., MicroRNA-cancer connection: The beginning of a new tale. Cancer Res.(2006) 66, 7390-7394]).

miRNA는 유전자 조절에 관여하는 것으로 보인다. lin-4 및 let-7을 비롯한 일부 miRNA는 표적 mRNA의 부분적으로 상보적인 3' 비번역 영역 (3' UTR)에 결합함으로써 단백질 합성을 억제한다. 식물에서 발견되는 스케어크로우(Scarecrow) miRNA를 비롯한 다른 것들은 siRNA와 같이 기능하고, 표적 전사체를 파괴하기 위해 완전히 상보적인 mRNA 서열과 결합한다 (문헌 [Grishok et al., 2001]).

마이크로RNA에 대한 연구는, 과학자들이 이들 분자가 진핵 유전자 발현의 조절을 담당한다는 광범위한 역할을 확인하기 시작했기 때문에 증가하고 있다. 가장 이해되는 두 miRNA로서 lin-4 및 let-7은 씨. 엘레간스(C. elegans)에서 중요한 mRNA 패밀리의 번역을 조절함으로써 발현 시점을 조절한다 (문헌 [Pasquinelli, 2002]에서 고찰됨). 수백개의 miRNA가 씨. 엘레간스, 초파리, 마우스 및 인간에서 확인되었다. 유전자 발현을 조절하는 분자에 대해 예상되는 바와 같이, miRNA 수준은 조직과 발달 상태 사이에서 변화하는 것으로 확인되었다. 또한, 한 연구는 두 miRNA의 감소된 발현과 만성 림프구성 백혈병 사이의 강한 상관관계를 보여주며, 이는 miRNA와 암 사이의 관련성을 제공한다 (문헌 [Calin, 2002]). 상기 분야가 아직 새롭지만, miRNA가 더욱 고급 진핵세포에서의 유전자 발현을 조절하는 전사 인자만큼 중요할 수 있는 것으로 고찰된다.

세포 분화, 초기 발달 및 세포 프로세싱, 예컨대 아폽토시스 및 지방 대사에서 중대한 역할을 하는 miRNA의 몇몇 예가 있고, lin-4 및 let-7 둘 다 씨. 엘레간스의 발달 동안 유충 상태에서 또 다른 상태로의 진행을 조절한다 (문헌 [Ambros, 2003]). miR-14 및 밴텀(bantam)은 명백히 아폽토시스와 관련된 유전자의 발현을 조절함으로써 세포 사멸을 조절하는 초파리 miRNA이다 (문헌 [Brennecke et al., 2003], [Xu et al., 2003]). miR-14는 또한 지방 대사와 관련이 있었다 (문헌 [Xu et al., 2003]). Lsy-6 및 miR-273은 클리에모감각(cliemosensory) 뉴런에서 비대칭을 조절하는 씨. 엘레간스 miRNA이다 (문헌 [Chang et al., 2004]). 세포 분화를 조절하는 또 다른 동물 miRNA는 조혈 세포 분화를 지시하는 miR-181이다 (문헌 [Chen et al., 2004]). 이들 분자는 공지된 기능을 가진 모든 범위의 동물 miRNA를 나타낸다. miRNA의 기능의 개선된 이해는 정상 발달, 분화, 세포간 및 세포내 소통, 세포 주기, 혈관신생, 아폽토시스 및 많은 다른 세포 프로세싱에 기여하는 조절 네트워크를 확실히 밝힐 것이다. 많은 생물학적인 기능에서의 그들의 중요한 역할을 고려할 때, miRNA는 치료적 개입 또는 진단적 분석을 위해 중요한 점을 제공할 수 있다.

풍부한 간-특이적 miRNA인 miR-122는 HCV 레플리콘을 안정하게 발현하는 배양된 인간 간종양 Huh7 세포에서 HCV RNA의 효율적 복제에 중요하다 (문헌 [Jopling CL, Yi M, Lancaster AM, Lemon SM, Sarnow P. Science 2005;309:1577-1581]). 이러한 관찰은, HCV 감염에서 및 잠재적 치료 표적으로서 miR-122의 역할에 대한 많은 관심을 증가시켰다. 본원에서 설명된 바와 같이, CHC의 현재 요법은 리바비린과 조합된 PEG화 INFα (pegIFNα)로 이루어지지만, 치료는 환자의 ~55％만이 지속적인 바이러스학적 반응을 달성한다 (문헌 [Manns MP et al., Lancet 2001;358:958-965]; [Fried MW et al., N Engl J Med 2002;347:975-982]). miR-122 및 몇몇 다른 miRNA의 수준이 Huh7 간종양 세포 및 주요 마우스 간세포에서 IFN에 의해 조절되고, miRNA가 시험관내에서 HCV RNA 복제에 대해 IFN의 적어도 일부 효과를 매개할 수 있다는 것이 최근에 보고되었다 (문헌 [Pedersen IM et al., Nature 2007;449:919-922]). 지금까지 수행된 모든 실험은 배양된 세포의 HCV 복제에서 miR-122의 역할을 평가하였다. 만성 C형 간염 (CHC) 환자에서 miR-122의 상태를 결정하기 위해, 본 발명자들은 pegIFNα 및 리바비린으로의 치료가 진행중인 42명의 CHC 환자에서 수집한 간 생검에서 miR-122와 다른 miRNA의 수준을 비교하였다. 측정은 표준으로서 화학적으로 합성된 miRNA를 사용하는 정량적 PCR (qPCR)에 의해 수행하였다. 본 발명자들은 제12주째에 2 log₁₀ 넘게 바이러스 로드가 감소하면서 요법에 반응하지 않은, 1차 비-반응자 (PNR)로서 분류된 환자가 제12주째에 IFNα 및 검출불가능한 HCV RNA에 대한 강한 반응을 가진 환자보다 miR-122의 수준이 유의하게 낮았음을 발견하였다 (완전 조기 바이러스학적 반응; cEVR). PNR과 cEVR 환자간의 차이는 간 섬유증 단계와 무관하며, 이는 PNR 환자에서의 miR-122의 감소가 생검 물질에서 보다 낮은 비율의 간세포 때문이 아님을 나타낸다. 게다가, 군간 miR-122 발현의 차이는 여전히, miR-122가 간세포 특이적 알부민 mRNA로 정규화된 경우, miR-122 수준 및 치료에 대한 반응 사이에 직접적인 상관관계를 추가로 뒷받침하는 것이 분명했다.

임상 연구는 높은 HCV 바이러스 로드를 가진 환자가 요법에 덜 반응함을 보여주었다 (문헌 [Manns MP et al., Lancet 2001;358:958-965]; [Fried MW et al., N Engl J Med 2002;347:975-982]). miR-122가 Huh7 간종양 세포에서 HCV 복제에 중요하기 때문에, 본 발명자들이 비-반응자에서의 낮은 miR-122를 발견한 것은 놀라운 것이었다. 본 발명자들은 환자의 간 및 혈청에서 HCV RNA를 측정하였다. miR-122의 수준과 HCV 바이러스 로드 사이에는 상관관계가 없는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과는 시험관내에서 수득된 결과와 정반대이고, 생체내 HCV 복제에서 miR-122의 유의한 역할을 뒷받침하지 않는다 (예를 들면, HCV 요법의 경우 miR-122를 억제하는 것을 제안하는 WO-A-2007/112754 참조). 비-반응자에서 감소된 miR-122 수준은 miR-122가 음성적으로 조절된 IFN 표적 유전자라는 가능성을 제시한다. 사실상, CHC 환자의 생검에서 miR-122의 발현은 알려진 IFN-자극 유전자 (ISG)의 발현과 음의 상관관계를 보여준다.

요약하면, 본원의 놀라운 결과는, (i) IFN 요법에 비-반응성인 환자는 일반적으로 반응자들보다 miR-122 수준이 몇 배 더 낮고, (ii) pegIFNα의 투여는 환자 간의 miR-122 수준에 어떠한 유의한 효과도 없으며, (iii) 간내 miR-122와 HCV RNA 수준 사이에 상관관계가 존재하지 않음을 증명한다. Huh7 세포에서의 HCV 레플리콘 연구를 기반으로 하였기 때문에, 낮은 수준의 miR-122가 바이러스 수율을 감소시키고 요법에 유익하다는 것은 예상치 못한 것이다. 그럼에도 불구하고, miR-122 수준이 cEVR 환자보다 PNR에서 유의하게 낮다는 발견은, CHC 환자에서 IFN 요법의 결과를 예측하는데 있어서, 예를 들어 예비 활성화된 ISG와 함께 miR-122를 편리한 표지로서 적합하게 만든다 (문헌 [Sarasin-Filipowicz M et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2008, 105(19):7034-7039]; [Chen L et al., Gastroenterology 2005;128:1437-1444]; [Asselah T et al., Gut 2008;57:516-524]). 게다가, 현재의 결과는 또한 놀랍게도, (i) IFN 요법에 비-반응성인 환자가 일반적으로 반응자들보다 몇배 더 높은 수준의 miR-296-5p를 갖는다는 것을 증명한다. 이는 miR-296-5p, 보다 일반적으로 miRNA가 CHC 환자에서 IFN 요법의 결과를 예측하는데 사용될 수 있음을 증명한다.

이로써, 본 발명자들은 임상의가 간의 바이러스 감염으로 인해 고통받고 있는 대상체에 대한 치료 레지멘을 결정하는데 도움이 될 수 있는 miRNA를 기반으로 하는 방법을 개발할 수 있음을 실현하였다. 감염된 개체로부터의 miRNA, 예를 들면 miR-122 또는 miR-296-5p 수준을 대조군 (즉, 바이러스에 감염되지 않은 대상체)으로부터의 유전자 발현과 비교할 수 있다.

(대조군과 비교해서) 보다 낮은 수준의 miR-122 및/또는 보다 높은 수준의 miR-296-5p를 가진 감염 대상체는 치료 레지멘에 IFN을 사용하는 경우에 이득을 얻지 못할 것으로 예상되는 반면 (즉, 이들 개체는 RVR을 가진 것으로 예측되지 못할 것임), 대조군 발현과 비교해서 miR-122 및/또는 miR-296-5p의 수준이 거의 변경되지 않거나 상승된 감염 대상체는 IFN 요법으로부터 이득을 얻고 RVR을 가질 수 있다. 본 발명자들은 당업계에 공지된 시험관내 결과가 반대로 예측했기 때문에 이러한 상관관계를 이루는 것에 대해 놀라웠다.

간이 바이러스에 감염된 "반응자" 및 "비-반응자" 대상체에서의 유전자 발현 수준을 이전에 연구한 적이 있지만 (문헌 [Chen et al., (2005) Gastroenterology 128, 1437-1444]), 본 발명의 일부로서 수행된 조사에서는 예후 마커로서 작용하는지를 결정하기 위해 상당히 광범위한 유전자 세트를 연구하였다. 또한, 본 발명자들은 또한 예후 마커로서 상이한 miRNA가 사용될 수 있는지를 평가하였다. 게다가, 본 발명자들은 또한 항바이러스 치료 전 및 후에 취한 샘플에서 유전자 발현 및 miRNA 수준을 분석하였고, 이러한 정보를 이용하여 예후 유전적 마커를 확인하였지만, 이전의 연구는 치료 성과를 치료 전에 취한 샘플에 존재하는 유전자 발현 수준과 상관 짓는 일만 시도하였다. 따라서, 다음에 제시된 예후 유전적 마커를 확인시켜 주는 데이터 세트는 기존의 연구에서 보다 훨씬 더 완전하고 확실한 것으로 간주된다.

따라서, 본 발명의 제1 측면에서, miRNA의 발현 수준에 대해 대상체로부터의 샘플을 분석하는 단계, 및 대상체로부터의 샘플 중 상기 miRNA의 발현 수준을 대조군 샘플 중 상기 miRNA의 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 간이 바이러스에 감염된 대상체가 인터페론 (IFN) 활성의 자극을 포함하는 항바이러스 요법에 반응성일 가능성을 결정하는 방법이 제공된다.

본 발명의 일부 실시양태에서, miRNA는 miR-122이고, 대조군 샘플 중 miR-122 수준과 비교해서 대상체로부터의 샘플 중 miR-122의 보다 낮은 수준이, 대상체가 상기 항바이러스 요법에 반응성이지 않을 수 있음을 나타낸다.

상기 기재된 실시양태와 조합될 수 있는 본 발명의 일부 다른 실시양태에서, miRNA는 miR-296-5p이고, 대조군 샘플 중 miR-296-5p 수준과 비교해서 대상체로부터의 샘플 중 miR-296-5p의 보다 높은 수준이, 대상체가 상기 항바이러스 요법에 반응성이지 않을 수 있음을 나타낸다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 대조군 샘플 중 각각 miR-122 또는 miR-296-5p 수준과 비교해서 대상체로부터의 샘플 중 각각 miR-122의 변경되지 않거나 상승된 수준 및/또는 miR-296-5p의 변경되지 않거나 저하된 수준이, 대상체가 상기 항바이러스 요법에 반응성일 수 있음을 나타낸다.

본 발명의 방법이 단지 하나의 miRNA만을 사용하는 것으로 제한되지 않을 뿐만 아니라, 임의의 miRNA의 발현 수준과 miR-122 및/또는 miR-296-5p의 발현 수준의 조합, 또는 임의의 관련 miRNA, 특히 간이 바이러스에 감염된 대상체가 항바이러스 요법에 반응성일 가능성에 대한 예측력을 가진 임의의 miRNA의 조합을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 방법에서, 항바이러스 요법은 리바비린과 임의로 조합된 PEG화 IFNα (pegIFNα)일 수 있다.

게다가, 본 발명의 일부 실시양태에서, 바이러스 감염은 B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스 감염이다.

게다가, 본 발명의 방법에서 간 조직이 샘플로서 이용될 수 있다.

유리하게는, 본 발명의 방법에서 예측력을 증가시키기 위해 요법에 대한 대상체의 반응을 예측할 수 있는 유전자의 발현, 예를 들어 이전의 연구에 대해 일부 발명자들에 의해 공개된 일부 유전자 또한 분석할 수 있다 (문헌 [Sarasin-Filipowicz et al., 2008, PNAS, 105(19):7034-7039]). 상기 유전자 발현은 샘플 중 mRNA 유전자 전사체의 양 또는 상기 mRNA에서 유래된 cDNA의 양을 측정함으로써, 또는 예를 들어 특이적 결합 분자를 사용하여 샘플 중 유전자에 의해 코딩된 펩티드 또는 폴리펩티드의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어 인간이다.

본 발명 또한 miRNA, 예를 들어 miR-122 또는 miR-296-5p의 발현 수준을 대상체로부터의 샘플에서 분석하기 위한 수단, 및 임의로 대상체로부터의 샘플 중 상기 miRNA, 예를 들어 miR-122 또는 miR-296-5p의 수준을 대조군 샘플 중 상기 miRNA, 예를 들어 miR-122 또는 miR-296-5p의 수준과 비교하기 위한 수단을 포함하는, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트를 포함한다. 상기 키트는 요법에 대한 대상체의 반응을 예측할 수 있는 하나 이상의 유전자의 발현을 분석하기 위한 수단을 추가로 포함하고, 상기 수단이 요법에 대한 대상체의 반응을 예측할 수 있는 상기 하나 이상의 유전자를 대표하는 분자를 표적화할 수 있는 하나 이상의 특이적 결합 분자를 최종적으로 포함하고, 상기 특이적 결합 분자가 올리고뉴클레오티드 프로브, 항체 또는 압타머이며, 상기 샘플 중 유전자의 발현을 대조군 샘플 중 동일한 유전자의 발현과 비교하기 위한 수단을 임의로 포함한다.

본 발명의 방법이 임상의에게 상당히 유리할 것임을 인지해야 할 것이다. IFN은 단백질 성장 인자이고, IFN을 함유하는 제약 제제는 제조 비용이 많이 든다. 따라서, IFN이 적절하고 비용 효율적인 방식으로 사용되고 있다는 것을 임상의가 확신하는 것이 매우 중요하다. 게다가, 비용과 무관하게, 가능한 한 신속하게 간의 바이러스 감염을 제거하는 것이 종종 바람직하다. 따라서, 임상의가 IFN을 투여하고, 후속적으로 이것이 유익한 효과가 없다는 것을 발견한다면, 이는 시간 소모적이다 (사용중인 대체 요법을 소모할 수도 있음). 따라서, 본 발명의 방법은 임상의가 대상체의 두 집단을 확인할 수 있기 때문에 임상의에게 상당한 도움이 된다. 한 집단은 대조군과 비교해서 낮은 수준의 miR-122 및/또는 높은 수준의 miR-296-5p를 나타낼 것이고, 따라서 아마도 이들은 IFN으로의 치료로부터 이익을 얻지 못할 것이다. 대조군과 비교해서 정상 또는 상승된 수준의 miR-122 및/또는 정상 또는 낮은 발현 수준의 miR-296-5p를 가진 다른 집단은 IFN으로의 요법으로부터 이익을 얻을 것이다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 miRNA, 예를 들면 miR-122 또는 miR-296-5p의 수준을 조절하는 것을 포함하는, 간이 바이러스에 감염된 대상체가 인터페론 (IFN) 활성의 자극을 포함하는 항바이러스 요법에 반응성일 가능성을 결정하는 방법을 제공한다.

miRNA, 예를 들어 miR-122 또는 miR-296-5p의 수준은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 조절될 수 있다. 그와 같은 방법의 예는 예를 들어 WO-A-2006/137941, WO-A-2007/021896 또는 WO-A-2007/090073에서 확인할 수 있다.

"항바이러스 요법"이란 IFN 활성의 자극을 포함하는, 바이러스 감염을 감소시키기 위한 임의의 치료 레지멘을 의미한다. 이러한 레지멘은 유형 I IFN 활성을 자극하고/하거나 IFN 자극된 유전자 (ISG)를 유도하는 화합물의 사용을 포함한다. 상기 요법은 IFN 그 자체 또는 다른 IFN 수용체 효능제를 이용하여 치료하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 요법은 PEG화 IFNα (pegIFNα)를 사용할 수 있다.

상기 요법은 IFN 활성의 자극만을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명자들은 본 발명에 따른 방법이 IFN 활성의 자극인자를 공지된 항바이러스제와 함께 포함하는 조합 요법을 사용하는 것을 포함하는 항바이러스 요법의 유효성을 예측하는데 특히 유용하다는 것을 밝혀내었다. 많은 항바이러스제가 당분야에 공지되어 있고, 본 발명의 방법을 사용하여 수많은 상이한 조합 요법의 유효성을 평가할 수 있다. 그러나, 본 발명자들은 본 발명의 방법이 항바이러스제 리바비린과 함께 사용된 IFN 활성 자극인자를 이용한 요법의 유효성을 예측하는데 특히 유용하다는 것을 밝혀내었다.

한 실시양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 항바이러스 요법으로서 pegIFNα 및 리바비린의 유용성을 예측한다.

본 발명의 방법을 이용하여 간의 수많은 상이한 바이러스 감염 (예컨대, B형 간염 바이러스 및 C형 간염 바이러스 감염)에 대한 치료의 유효성을 평가할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 방법을 이용하여 C형 간염 바이러스 (HCV) 감염에 대한 요법의 유효성을 평가한다. 본 발명자들은 본 발명의 방법이 신속한 바이러스학적 반응 (RVR)을 가질 것으로 예상되는 대상체와 그렇지 않을 것으로 (비-RVR) 예상되는 대상체를 구별하는데 특히 유용하다는 것을 확인하였다.

본 발명에 따라서 사용될 수 있는, 대상체에서 miR-122의 발현을 대표하는 샘플은 대상체에서 miR-122의 상기 수준에 관한 정보를 제공해 줄 수 있는 임의의 샘플을 포함한다.

적합한 샘플의 예로는 생검, 외과적 수술 동안 절제된 샘플, 혈액 샘플, 뇨 샘플, 가래 샘플, 뇌척수 유체 샘플, 및 면봉에 묻힌 샘플 (예컨대, 타액 면봉 샘플)이 있다. 샘플 공급원은 대상체가 가질 수 있는 바이러스 감염 유형에 따라 좌우될 것임을 인지해야 할 것이다.

한 실시양태에서, 샘플은 간 조직으로부터의 것이다. 간 샘플은 상기 방법을 HCV 감염을 가진 대상체를 평가하는데 적용하는 경우에 특히 유익한 것으로 확인되었다. 본 발명자들이 miR-122의 수준을 분석함으로써 비-RVR 대상체로부터 RVR을 구별할 수 있었음을 발견한 것은 놀라웠다.

적합한 샘플에는 조직 박편, 예를 들어 조직학적 또는 동결된 박편이 포함될 수 있다. 이러한 박편이 유래된 대상체에서 miRNA, 예를 들면 miR-122 또는 miR-296-5p의 발현 수준을 대표하는 정보를 제공할 수 있도록 하는 방식으로 상기 박편을 제조할 수 있는 방법은 당업자에게 널리 공지될 것이고, 이는 유전자 발현을 조사하는 경우에 사용하도록 의도된 기술을 참고로 하여 선택해야 한다.

대상체로부터의 조직의 일부를 포함하는 샘플을 사용하는 것이 고려되긴 하지만, miRNA, 예를 들면 miR-122 또는 miR-296-5p의 수준을 대표하는 샘플이 이러한 조직으로부터 취한 적합한 추출물을 포함하는 것이 일반적으로 바람직할 수 있는데, 상기 추출물은 대상체에서 상기 miRNA, 예를 들면 miR-122 또는 miR-296-5p의 수준에 관한 정보를 제공하도록 조사할 수 있다. 대상체에서의 유전자 발현에 관한 정보를 제공할 수 있는 조직 추출물을 생성시키기 위해 사용될 수 있는 적합한 프로토콜은 당업자에게 널리 공지될 것이다. 바람직한 프로토콜은 유전자 발현을 조사하는 방식을 참고로 하여 선택될 수 있다.

간에서 유래된 샘플의 경우, 적절한 제조 단계는 실시예에 개시된다.

"대조군 샘플"이란 간의 바이러스 감염으로 인해 고통받고 있지 않는 개체로부터 유래된 샘플 (상기 대상체로부터의 샘플과 등가임)을 의미한다. 대조군 샘플을 구성하는 등가의 조직 또는 기관 샘플, 또는 이러한 샘플로부터의 추출물을 대조군 샘플 중 miRNA, 예를 들면 miR-122 또는 miR-296-5p의 수준에 관한 정보 공급원으로서 직접적으로 사용할 수 있긴 하지만, "이상적" 대조군 샘플에서 miRNA, 예를 들면 miR-122 또는 miR-296-5p의 발현 수준에 관한 정보가 기준 데이터의 형태로 제공되는 것으로 인식해야 할 것이고, 일반적으로 바람직할 것이다. 이러한 기준 데이터는 선택된 대조군 조직에서의 miRNA, 예를 들면 miR-122 또는 miR-296-5p의 수준을 나타내는 표의 형태로 제공될 수 있다. 대안적으로, 기준 데이터는 선택된 대조군 조직에서의 miRNA, 예를 들면 miR-122 또는 miR-296-5p의 수준을 나타내는 검색가능한 정보를 함유하는 컴퓨터 소프트웨어의 형태로 제공될 수 있다. 상기 기준 데이터는, 예를 들어 대상체에서의 적어도 miRNA, 예를 들면 miR-122 또는 miR-296-5p의 발현 수준을 대조군 조직 샘플에서의 상기 miRNA의 발현과 비교할 수 있게 해주는 알고리즘의 형태로 제공될 수 있다.

대조군 샘플 중 miRNA, 예를 들면 miR-122 또는 miR-296-5p의 수준을, 상기 대조군 샘플을 구성하는 조직 또는 기관 샘플의 프로세싱을 통하여 조사해야 하는 경우에는, 이러한 프로세싱을 대상체로부터 샘플을 프로세싱하는데 사용된 것과 동일한 방법을 이용하여 수행하는 것이 유익하다. 이와 같이 대상체 샘플과 대조군 샘플을 나란히 프로세싱하면, 이들 조직에서의 유전자 발현 비교가 서로에 대해 정규화될 것이라는 신뢰도가 더 커진다 (이는 조직을 프로세싱하고 유전자 발현을 조사하는 것으로 선택된 방법과 연관된 어떠한 가공물도 대상체 샘플과 대조군 샘플 둘 다에게 적용될 것이기 때문임).

본 발명에 따른 방법은 적어도 miR-122의 수준의 분석을 포함할 수 있다. miR-122의 변경된 수준을 항바이러스 요법의 유효성이 결정하는데 사용할 수 있다는 발견은 놀라운 것이다. 선행 기술에서 공개된 결과에 비추어 볼 때, 낮은 수준의 miR-122가 후속적인 IFN 치료에 대한 불량한 반응과 관련있을 것으로 전혀 예상되지 않았다.

이전의 연구에서, 본 발명자들은 발현 수준이 항바이러스 요법의 결과에 대한 예후 마커일 수 있는 상이한 유전자를 확인하였다. miR-122와 관련된 본 발명은 더욱 확실한 예측을 제공하기 위해 상기 유전자와 조합될 수 있다.

miRNA, 예를 들면 miR-122 또는 miR-296-5p의 존재, 부재 및/또는 수준을 연구할 수 있으며, 일반적으로 적절한 프로브 분자를 이용하여 검출할 것이다. 이러한 검출은 miRNA, 예를 들어 miR-122 또는 miR-296-5p의 존재, 부재 및/또는 수준에 관한 정보를 제공할 것이고, 이로써 대상체에서 생성된 miRNA, 예를 들면 miR-122 또는 miR-296-5p의 수준을 대조군 샘플에서 생성된 것과 비교할 수 있다. 일반적으로, 프로브는 직접적으로 또는 간접적으로 miRNA, 예를 들면 miR-122 또는 miR-296-5p에 특이적으로 결합할 수 있을 것이다. 이어서, 이러한 프로브의 결합을 평가하고, 이를 miRNA, 예를 들면 miR-122 또는 miR-296-5p의 수준과 상관지어, 대상체와 대조군 사이의 유효한 예후 비교가 가능하다.

"변경된 발현"에는 유전자 발현이 상기 논의된 바와 같이 대조군과 비교해서 샘플 중에서 상승 또는 감소되는 것 둘 다 포함된다.

역으로, "변경되지 않은 발현"에는 유전자 발현이 상기 논의된 바와 같이 대조군과 비교해서 샘플 중에서 상승 또는 감소되지 않는 것이 포함된다.

miRNA, 예를 들면 miR-122 또는 miR-296-5p의 수준의 평가, 및 유전자 발현이 변경되었는지 아니면 변경되지 않았는지 여부는 통상적인 통계적 분석 방법을 이용하여 수행할 수 있다.

표적 분자는 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 펩티드 또는 폴리펩티드의 양은 특이적 결합 분자, 예를 들어 항체를 이용하여 결정할 수 있다. 바람직한 예로, 샘플에 존재하는 특정 표적 단백질의 양은 샘플에서 표적 단백질의 생물학적 활성과 관련하여 평가될 수 있다. 이러한 방식으로 발현을 평가하고 비교하는 것은 효소 활성을 지닌 단백질 표적의 경우에 특히 적합하다. 샘플에 존재하는 단백질 표적의 양을 측정하는데 적합한 기술에는 압타머 및 항체-기재 기술, 예를 들어 방사성 면역검정 (RIA), 효소 결합 면역검정 (ELISA) 및 웨스턴 블롯팅이 포함되지만, 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 목적상 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 단일 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 지칭한다는 것을 이해해야 할 것이다. 게다가, 달리 요구되지 않는 한, 이들 용어는 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 기능할 수 있는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 포함해야 한다.

게다가, 본 발명에 따라 사용하기에 적합한 표적 핵산은 "전장" 핵산 (예를 들어, 전장 유전자 전사체)을 포함할 필요는 없지만, 단지 프로브 분자의 특이적 결합을 허용하기에 충분한 길이를 포함할 필요가 있다는 것을 이해해야 할 것이다.

본 발명의 방법의 실시양태에서는, 적합한 샘플로부터 취한 세포를 용해시킨 다음 (이는 퀴아겐 리미티드(Qiagen Ltd.)에 의해 생성되는 것과 같은 상업적으로 입수가능한 용해 완충제를 이용하여 달성될 수 있음), 상기 용해물을 상업적으로 입수가능한 핵산 분리 칼럼 (예컨대, 퀴아겐 리미티드에 의해 생산되는 RNeasy 미디 스핀 칼럼)을 이용하여 원심분리하는 공정에 의해 RNA 표적 분자를 단리하도록 샘플을 처리할 수 있다. 다른 RNA 추출 방법에는 문헌 [Chomczynski, P. and Sacchi, N. (1987) Analytical Biochemistry 162, 156. "Single Step Method of RNA Isolation by Acid Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction."]의 페놀 및 구아니딘 이소티오시아네이트 방법의 변형법이 포함된다. 이러한 방식으로 수득된 RNA는 적합한 표적 분자 그 자체를 구성할 수 있거나, 또는 miR-122의 수준을 대표하는 표적 분자를 생성하기 위한 주형으로서 제공될 수 있다.

더욱 확실한 예측 값을 갖기 위해 선택된 유전자의 발현을 평가하는 경우, 대상체 또는 대조군 샘플로부터 유래된 RNA를 예를 들어 슈퍼스크립트 시스템(Superscript System, 인비트로겐 코퍼레이션(Invitrogen Corp.))을 이용하여 cDNA 합성용 기질로서 사용할 수 있는 것이 바람직할 수 있다. 이어서, 이로써 생성되는 cDNA를 바이오어레이(BioArray) RNA 전사체 표지화 키트 (엔조 라이프 사이언시즈 인크.(Enzo Life Sciences Inc.)를 이용하여 비오티닐화 cRNA로 전환시킬 수 있고, 이러한 cRNA를 RNeasy 미니 키트 (퀴아겐 리미티드)를 이용하여 반응 혼합물로부터 정제할 수 있다. 유전자 발현을 대표하는 mRNA는 mRNA 추출 또는 정제를 필요로 하지 않으면서, 대상체 또는 대조군 샘플로부터 유래된 조직에서 직접적으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 관심 대상체 또는 대조군 샘플에 존재하고 이러한 샘플에서의 유전자 발현을 대표하는 mRNA는 이러한 조직의 적당히 고정된 박편 또는 생검을 이용하여 조사할 수 있다. 이러한 종류의 샘플 사용은 발현을 비교할 수 있는 신속성 측면에서 뿐만 아니라 샘플을 생성시키기 위해 사용될 수 있는 조직 프로세싱이 비교적 저렴하고 간단하다는 측면에서 이득을 제공할 수 있다. 계내 혼성화 기술은 이러한 종류의 조직 샘플에서의 유전자 발현을 조사하고 비교할 수 있는 바람직한 방법을 나타낸다. 대상체 또는 대조군 샘플 중 유전자 발현을 대표하는 RNA의 이용가능성을 유지시키는 관심 조직의 프로세싱 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 그러나, 대상체 또는 대조군 샘플 중 유전자 발현을 대표하는 mRNA를 추출하고 수집할 수 있는 기술 또한 당업자에게 널리 공지되어 있고, 본 발명자들은 이러한 기술이 본 발명에 따라서 유리하게 이용될 수 있다는 것을 확인하였다. 대상체 또는 대조군 샘플로부터 추출된 mRNA를 포함하는 샘플은 본 발명의 제3 측면의 방법에 사용하기에 바람직할 수 있는데, 이는 이러한 추출물이 원래의 조직을 포함하는 샘플에 대한 경우보다 더욱 용이하게 조사되는 경향이 있기 때문이다. 예를 들어, 유전자 발현을 비교할 수 있는 적합한 표적 분자는 대상체로부터의 조직 샘플 또는 대조군 조직의 샘플로부터 단리된 전체 RNA를 포함할 수 있다. 게다가, 추출된 RNA는 대상체 또는 대조군 샘플에서의 유전자 발현에 관한 정보를 증가시켜 줄 수 있는 확대된 mRNA 샘플을 생성시키도록 용이하게 증폭될 수 있다. mRNA 집단의 추출 및 증폭에 적합한 기술의 예는 널리 공지되어 있고, 다음에 보다 상세히 고려된다.

예를 들어, 본 발명에 따라서 사용하기에 적합한 핵산 표적을 생성하는 핵산의 단리 및 정제 방법은 문헌 [Chapter 3 of Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993)]에 상세히 기재되어 있다.

유전자 발현을 조사하고 비교하기에 앞서 핵산 표적을 증폭시키는 것이 바람직한 경우에는, 샘플이 유래되는 대상체 또는 대조군 조직에서 증폭된 핵산의 상대적 빈도를 유지하거나 조절하는 방법을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

적합한 "정량적" 증폭 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 널리 공지된 한 예인 정량적 PCR은 그의 양이 대조군 샘플과 대상체 샘플간에 변하지 않는 것으로 공지된 조절 서열을 동시에 공동-증폭시키는 것을 포함한다. 이는 PCR 반응을 보정하기 위해 사용될 수 있는 내부 표준을 제공한다.

상기 요약된 방법 이외에도, 당업자는 유전자-전사체 특이적 생성물의 증폭을 신호 발생과 커플링시키는 임의의 방법이 정량화에 적합할 수 있음을 인지할 것이다. 바람직한 예는 mRNA에서 cDNA로의 초기 역전사를 도입시킴으로써 특이적 mRNA 전사체를 정확히 정량화하는데 적합하도록 만든 폴리머라제 연쇄 반응 (US 4683195 및 4683202)에 대한 편리한 개선책을 이용한다. 추가의 주요 개선책로 인해, 반응이 진행됨에 따라 축적되는 PCR 생성물을 실시간으로 측정할 수 있게 된다.

여러 경우에, 관련 샘플 중 표적 분자의 존재를 나타낼 수 있는 프로브 분자를 사용하여 대상체 또는 대조군 샘플 중 유전자 발현 정도를 평가하는 것이 바람직할 수 있다.

프로브는 조사될 유전자 발현의 생성물 (직접 또는 간접적임)을 기준으로 하여 선택될 수 있다. 적합한 프로브의 예에는 올리고뉴클레오티드 프로브, 항체, 압타머, 및 적합한 특이성을 지닌 결합 단백질 또는 소분자가 포함된다.

올리고뉴클레오티드 프로브가 프로브로서 이용될 수 있다. 적합한 올리고뉴클레오티드 프로브의 생성은 당업자에게 널리 공지되어 있다 (문헌 [Oligonucleotide synthesis: Methods and Applications, Piet Herdewijn (ed) Humana Press (2004)]). 올리고뉴클레오티드 및 변형된 올리고뉴클레오티드는 수많은 회사로부터 상업적으로 입수가능하다.

본 발명의 목적상 올리고뉴클레오티드 프로브는 한 가지 유형 이상의 화학적 결합을 통하여 상보적 서열의 핵산 표적 분자와 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 결합은 통상적으로, 상보적 염기 쌍 형성을 통하여, 보통 수소 결합 형성을 통하여 일어날 수 있다. 적합한 올리고뉴클레오티드 프로브는 천연 (즉, A, G, C, 또는 T) 또는 변형된 염기 (7-데아자구아노신, 이노신 등)를 포함할 수 있다. 또한, 포스포디에스테르 결합 이외의 연결을 이용하여 올리고뉴클레오티드 프로브(들) 내의 염기들을 연결시킬 수 있는데, 단 이러한 변동은 올리고뉴클레오티드 프로브가 그의 표적과 혼성화하는 것을 방해하지 않아야 한다. 따라서, 적합한 올리고뉴클레오티드 프로브는 구성 염기가 포스포디에스테르 연결이 아닌 펩티드 결합에 의해 연결된 펩티드 핵산일 수 있다.

본원에서 설명된 바와 같이, 마이크로RNA 분자 ("miRNA")는 일반적으로 21 내지 22 뉴클레오티드 길이이지만, 17 및 최고 25 뉴클레오티드 길이가 보고되어 있다. miRNA는 각각 더 긴 전구체 RNA 분자 ("전구체 miRNA")로부터 프로세싱된다. 전구체 miRNA는 비-단백질-코딩 유전자로부터 전사된다. 전구체 miRNA는 그들이 스템-루프- 또는 폴드-백-유사 구조체를 형성할 수 있게 하는 두 상보성 영역을 가지며, 상기 구조체는 동물에서 다이서로 불리는 효소에 의해 절단된다. 다이서는 리보뉴클레아제 III-유사 뉴클레아제이다. 프로세싱된 miRNA는 전형적으로 스템의 일부분이다.

프로세싱된 miRNA ("성숙 miRNA"로도 지칭됨)는 특정 표적 유전자를 하향 조절하기 위해 거대 복합체의 일부분이 된다. 동물 miRNA의 예에는 번역을 중지시키는 표적과 불완전하게 염기쌍을 형성하는 것이 포함된다 (문헌 [Olsen et al., 1999]; [Seggerson et al., 2002]). siRNA 분자는 또한 다이서에 의해, 그러나 긴 이중 가닥 RNA 분자로부터 프로세싱된다. siRNA가 동물 세포에서 자연적으로 발견되지 않지만, 이들은 상기 세포에서 mRNA 표적의 서열-특이적 절단을 지시하기 위해 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC)에서 기능을 할 수 있다 (문헌 [Denli et al., 2003]).

내인성 miRNA 분자의 연구는 예를 들어 미국 특허 출원 60/575,743에 기재되어 있다. 합성 miRNA miRNA는, 성숙 단일 가닥 RNA가 miRNA와 혼성화하는 mRNA의 번역을 조절하는 단백질 복합체에 의해 결합될 때, 세포에서 명백히 활성이다. 내인성 발현 miRNA와 동일한 방법으로 세포에 영향을 미치는 외인성 RNA 분자의 도입은, 내인성 성숙 miRNA와 동일한 서열의 단일 가닥 RNA 분자가 번역 조절을 용이하게 하는 단백질 복합체에 의해 흡수되는 것을 필요로 한다. 다양한 RNA 분자 고안이 평가되었다. miRNA 경로에 의해 목적하는 단일 가닥 miRNA의 흡수를 최대화하는 세 가지 일반적인 고안이 확인되었다. 세 가지 고안 중 적어도 하나를 갖는 miRNA 서열을 가진 RNA 분자는 합성 miRNA로서 지칭된다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 합성 miRNA는 한 RNA가 자연 발생 성숙 miRNA와 동일한 두 RNA 분자를 포함한다. 성숙 miRNA와 동일한 RNA 분자는 활성 가닥으로 지칭된다. 상보성 가닥으로 지칭되는 제2 RNA 분자는 활성 가닥에 적어도 부분적으로 상보적이다. 활성 및 상보성 가닥은, 세포에서 miRNA 활성화 직전에 단백질 복합체에 의해 결합되는 자연 발생 miRNA 전구체와 유사한, 합성 miRNA로 불리는 이중 가닥 RNA를 생성하기 위해 혼성화된다. 합성 miRNA의 활성의 최대화는, 번역 수준에서 유전자 발현을 조절하는 miRNA 단백질 복합체에 의해, 활성 가닥의 흡수를 최대화하고 상보성 가닥의 흡수를 최소화하는 것을 필요로 한다. 최적 miRNA 활성을 제공하는 분자 고안은 상보성 가닥에 대한 변형과 관련이 있다.

두 가지 고안은 상보성 가닥에서 화학적 변형을 도입시킨다. 제1 변형은 그의 5' 말단에서 포스페이트 또는 히드록실 이외의 화학적 기를 이용하여 상보적 RNA를 생성하는 것을 포함한다. 5' 변형의 존재는 명백히 상보성 가닥의 흡수를 제거하고, 후속적으로 miRNA 단백질 복합체에 의한 활성 가닥의 흡수를 우선적으로 한다. 5' 변형은 NH2, NHCOCH3, 비오틴 등을 비롯한 임의의 다양한 분자일 수 있다.

miRNA 경로에 의한 상보성 가닥의 흡수를 현저하게 감소시키는 두번째 화학적 변형 전략은 상보성 가닥의 처음 2-6 뉴클레오티드에서 당 변형으로 뉴클레오티드를 도입시키고 있다. 두번째 고안 전략에 해당하는 당 변형이 합성 miRNA 활성을 추가로 개선시키기 위해 첫번째 고안 전략에 해당하는 5' 말단 변형과 커플링될 수 있음을 주목해야 한다.

세번째 합성 miRNA 고안은 활성 가닥에 상보적이지 않은 상보성 가닥의 3' 말단에서 뉴클레오티드를 도입하는 것을 포함한다.

생성된 활성 및 상보적 RNA의 하이브리드는 활성 가닥의 3' 말단에서 매우 안정하지만, 활성 가닥의 5' 말단에서는 비교적 불안정하다. siRNA를 이용한 연구는, 5' 하이브리드 안정성이 RNA 간섭을 뒷받침하는 단백질 복합체에 의한 RNA 흡수의 주요 지시자이며, 이는 적어도 세포에서의 miRNA 경로와 관련이 있음을 나타낸다. 상보적 RNA 가닥에서 미스매치의 현명한 사용은 합성 miRNA의 활성을 현저하게 향상시킨다.

본원에서 설명된 바와 같이, 용어 "miRNA"는 일반적으로 단일 가닥 분자에 관한 것이지만, 특정 실시양태에서는 본 발명에서 실시되는 분자는 또한 동일한 단일 가닥 분자의 또 다른 영역 또는 또 다른 핵산에 대해 부분적으로 상보적인 (가닥 길이를 따라 10 내지 50％ 상보적인), 실질적으로 상보적인 (가닥 길이를 따라 50％ 초과 100％ 미만 상보적인) 또는 완전히 상보적인 영역 또는 추가의 가닥을 포함할 것이다. 따라서, 핵산은 분자를 포함하는 특정 서열의 하나 이상의 상보적인 또는 자체-상보적인 가닥(들) 또는 "상보체(들)"을 포함하는 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 전구체 miRNA는 최대 100％ 상보적인 자체-상보성 영역을 가질 수 있다.

합성 miRNA는 전형적으로 연구되는 성숙 miRNA와 서열이 동일한 활성 가닥, 및 상기 활성 가닥과 적어도 부분적으로 상보적인 상보성 가닥의 두 가닥을 포함한다. 활성 가닥은 생물학적으로 적절한 분자이고, mRNA 분해 또는 번역 조절을 통하여 번역을 조절하는 세포에서 복합체에 의해 우선적으로 흡수되어야 한다. 활성 가닥의 우선적인 흡수는 두 가지 심오한 결과를 갖는다: (1) 합성 miRNA의 관찰된 활성을 극적으로 증가시키고, (2) 상보성 가닥의 흡수 및 활성화에 의해 유도된 의도하지 않은 효과가 본질적으로 제거된다. 본 발명에 따르면, 여러 합성 miRNA 고안은 활성 가닥의 우선적인 흡수를 보장하는데 사용될 수 있다.

상보성 가닥의 5' 말단에서 포스페이트 또는 히드록실 이외의 안정한 잔기의 도입은 miRNA 경로에서 그의 활성을 손상시킨다. 이는 단지 합성 miRNA의 활성 가닥이 세포에서 번역을 조절하는데 사용될 것이라는 것임을 보장한다. 5' 변형에는 NH2, 비오틴, 아민기, 저급 알킬아민기, 아세틸기, 2 O-Me, DMTO, 플루오로세인, 티올 또는 아크리딘, 또는 이러한 유형의 관능성을 가진 임의의 다른 기를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.

다른 센스 가닥 변형. 합성 miRNA의 상보성 가닥에서 2'-0Me, NH2, 비오틴, 아민기, 저급 알킬아민기, 아세틸기, DMTO, 플루오로세인, 티올 또는 아크리딘, 또는 이러한 유형의 관능성을 가진 임의의 다른 기와 같은 뉴클레오티드 변형의 도입은 상보성 가닥의 활성을 제거하고, miRNA의 활성 가닥의 흡수를 개선시킬 수 있다.

siRNA에서와 같이 (문헌 [Schwarz 2003]), 합성 miRNA의 활성 가닥의 5' 및 3'의 상대적인 안정성은 miRNA 경로에 의해 활성의 흡수 및 활성화를 명백히 결정한다. 염기 미스매치의 전략적 배치에 의한 합성 miRNA의 활성 가닥의 5' 말단의 불안정화는 활성 가닥의 활성을 개선시키고, 본질적으로 상보성 가닥의 활성을 제거한다.

miRNA-1222로도 불리는 miR-122인 22-뉴클레오티드 마이크로RNA는 유전자 hcr로부터 전사된 간-특이적 비코딩 폴리아데닐화 RNA로부터 유래된다. hcr mRNA 내에 인접한 2차 구조체 뿐만 아니라 miR-122의 정확한 서열은 포유동물 종에서부터 어류까지 보존된다. 마우스 간에서 miR-122의 수준은 배발생 제17일 즈음에 최대의 절반 값으로 증가하고, 태어나기 전에 거의 평균 세포당 50,000 카피의 최대 수준에 이른다 (이는 모든 miRNA의 70％를 구성함) (문헌 [Chang et al., 2004]; [Lagos-Quintana et al., 2002]). 이는, 조직의 분화 상태의 유지를 담당할 수 있는 유전자 발현의 패턴을 수립하는데 중요한 것으로 생각되는 여러 조직-특이적 마이크로RNA 중 하나이다 (문헌 [Lagos-Quintana et al., 2002]; [Lim et al., 2005]).

본원에서 사용된 문구 "~와 특이적으로 혼성화하는"은 특정한 표적 뉴클레오티드 서열이 복합체 혼합물 (예컨대, 전세포 DNA 또는 RNA)에 존재하는 경우에 엄격한 조건하에 올리고뉴클레오티드 프로브가 상기 서열과 우선적으로 결합, 이중체 형성 또는 혼성화하는 것을 나타낸다. 한 실시양태에서는, 프로브가 특별한 표적 분자와만 결합, 이중체 형성 또는 혼성화할 수 있다.

용어 "엄격한 조건"은 프로브가 그의 표적 아서열과 혼성화하지만, 다른 서열과는 최소한도로 혼성화하는 조건을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 프로브는 엄격한 조건하에서 그의 표적 이외의 서열과는 혼성화하지 않을 수 있다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고, 상이한 상황하에서 상이할 것이다. 보다 긴 서열은 보다 고온에서 특이적으로 혼성화된다.

일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대한 열 융점 (Tm)보다 약 5℃ 낮도록 선택될 수 있다. Tm은 표적 핵산에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브의 50％가 평형에서 표적 핵산과 혼성화하는 온도 (규정된 이온 강도, pH 및 핵산 농도하에서)이다. 표적 핵산이 일반적으로 Tm에서 과량으로 존재할 것이기 때문에, 평형에서 프로브의 50％가 점유된다. 예를 들어, 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 적어도 약 0.01 내지 1.0 M의 Na⁺ 이온 농도 (또는 다른 염)이고, 온도가 짧은 프로브 (예를 들어, 10 내지 50개 뉴클레오티드)의 경우에 약 30℃ 이상인 조건일 것이다. 엄격한 조건은 또한 예를 들어 포름아미드와 같은 탈안정화제를 첨가함으로써 달성될 수 있다.

올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 적합한 대표적 샘플 중에서 상보성 핵산 서열 (즉, 핵산 표적)을 검출할 수 있다. 이러한 상보적 결합은 올리고뉴클레오티드를 이용하여 특정 유전자의 발현을 검출함으로써, 이러한 발현을 비교할 수 있게 해주는 대부분의 기술의 기초를 형성한다. 일부 적합한 기술은 다중 유전자의 발현을 병행해서 정량화시킬 수 있고, 이에는 종의 증폭 및 정량화를 실시간으로 커플링시키는 기술, 예를 들어 정량적 역전사 PCR 기술, 및 증폭된 종의 정량화가 증폭 후에 일어나는 기술, 예를 들어 어레이 기술이 포함된다.

어레이 기술은 대상체 또는 대조군 샘플을 대표하는 샘플을 다수개의 올리고뉴클레오티드 프로브와 혼성화시키는 것을 포함하는데, 각 프로브가 개시된 유전자 또는 유전자들과 우선적으로 혼성화한다. 어레이 기술은, 예를 들어 그의 물리적 위치 (예를 들어, 아피메트릭스 인크.(Affymetrix Inc.)에 의해 상업적으로 공급되는 2차원적 어레이 내의 그리드)에 의해, 또는 또 다른 특징과의 연합 (예를 들어 일루미나 인크.(Illumina Inc.) 또는 루미넥스 인크.(Luminex Inc.)에 의해 상업적으로 공급되는 표지된 비드)에 의해 특이적 올리고뉴클레오티드 서열의 독특한 확인을 제공한다. 올리고뉴클레오티드 어레이는 계내에서 합성할 수 있거나 (예를 들어, 아피메트릭스 인크.에 의해 상업적으로 공급되는 광 유도 합성에 의함), 또는 예비-형성하고, 접촉 또는 잉크-제트 기술 (애질런트(Agilent) 또는 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)에 의해 상업적으로 공급됨)에 의해 스폿팅할 수 있다. 완전 또는 부분 cDNA 서열이 어레이 기술용 프로브 (클론텍(Clontech)에 의해 상업적으로 공급됨)로서 제공될 수도 있다는 것이 당업자에게는 명백할 것이다.

올리고뉴클레오티드 프로브를 블롯팅 기술, 예를 들어 서던 블롯팅 또는 노던 블롯팅에 사용하여 유전자 발현을 검출 및 비교할 수 있다 (예를 들어, 유전자 발현을 대표하는 cDNA 또는 mRNA 표적 분자를 통해서 이루어짐). 서던 또는 노던 블롯팅 기술에 사용하기 적합한 기술 및 시약은 당업자에게 널리 공지될 것이다. 간략하게 언급하면, DNA (서던 블롯팅의 경우) 또는 RNA (노던 블롯팅의 경우) 표적 분자를 포함하는 샘플을, 아크릴아미드 또는 아가로스 등의 물질의 겔을 침투시킬 수 있는 그들의 능력에 따라서 분리시킨다. 겔의 침투는 모세관 작용 또는 전기장의 활성에 의해 구동될 수 있다. 일단 표적 분자의 분리가 달성되면, 이들 분자를 박막 (전형적으로, 나일론 또는 니트로셀룰로스)에 옮긴 후, 상기 막 상에 고정화시킨다 (예를 들어, 베이킹 또는 자외선 조사에 의해 이루어짐). 이어서, 올리고뉴클레오티드 프로브를 막과 결합된 표적 분자와 혼성화시킴으로써 유전자 발현을 검출 및 비교할 수 있다.

특정의 상황하에서는, 유전자 발현을 비교하기 위해 전형적인 혼성화 프로토콜을 사용하는 것이 문제를 유발시키는 것으로 입증될 수 있다. 예를 들어, 블롯팅 기술은 분자량이 대략 동일한 둘 이상의 유전자 생성물 또는 miRNA를 구별하는데 어려움이 있을 수 있는데, 이는 이와 같이 크기가 유사한 생성물은 겔을 이용하여 분리하기가 어렵기 때문이다. 따라서, 이러한 상황하에서는 대체 기술, 예를 들어 다음에 기재된 기술을 사용하여 유전자 발현을 비교하는 것이 바람직할 수 있다.

대상체에서 유전자 발현 및/또는 miRNA 수준을 대표하는 샘플 중 유전자 발현은 고밀도 올리고뉴클레오티드 어레이 기술을 이용하여 적합한 핵산 샘플 내의 전체 전사체 수준을 기준으로 하여 평가할 수 있다. 이러한 기술은 올리고뉴클레오티드 프로브를, 예를 들어 공유적 부착에 의해 고체 지지체에 매어 두는 어레이를 이용한다. 고체 지지체 상에 고정화된 이들 올리고뉴클레오티드 프로브 어레이는 유전자 발현을 비교하기 위해 본 발명의 방법 및 키트에 사용될 바람직한 성분을 나타낸다. 이러한 다수의 프로브를 이러한 방식으로 부착시켜 다수의 유전자 또는 miRNA의 발현을 비교하는데 적합한 어레이를 제공할 수 있다. 따라서, 이러한 올리고뉴클레오티드 어레이가 목적하는 경우 하나 초과의 miRNA 및/또는 유전자의 발현을 비교하는 실시양태에서 특히 바람직할 수 있음을 인식할 것이다.

유전자 발현을 대표하는 핵산 표적을 비교하는데 사용될 수 있는 다른 적합한 방법론에는 핵산 서열 기재 증폭 (NASBA), 또는 롤링 서클 DNA 증폭 (RCA)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

프로브가 용이하게 검출될 수 있도록 이를 표지시키는 것이 통상 요망된다. 본 발명에 따라서 사용하기 적합한 프로브 또는 표적을 표지화시키는데 사용될 수 있는 검출가능한 부분의 예에는 분광, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물이 포함된다. 적합한 검출가능한 부분에는 각종 효소, 보결 분자단, 형광성 물질, 발광성 물질, 생물 발광성 물질, 방사성 물질 및 비색 물질이 포함된다. 이들 검출가능한 부분은 달리 표시되지 않는 한 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 모든 유형의 프로브 또는 표적에 도입시키는데 적합하다.

적합한 효소의 예에는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제가 포함되고, 적합한 보결 분자단 복합체의 예에는 스트렙타빈/비오틴 및 아비딘/비오틴이 포함되며, 적합한 형광성 물질의 예에는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오로레세인, 단실 클로라이드, 피코에리트린, 텍사스 레드, 로다민, 그린 형광성 단백질 등이 포함되며, 발광성 물질의 예에는 루미놀이 포함되고, 생물 발광성 물질의 예에는 루시퍼라제, 루시페린, 및 애쿠오린이 포함되며, 적합한 방사성 물질의 예에는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S, ³H, ¹⁴C, 또는 ³²P가 포함되고, 적합한 비색 물질의 예에는 콜로이드상 금 또는 착색 유리 또는 플라스틱 (예를 들어, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드가 포함된다.

이러한 표지를 검출하는 수단은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 방사성 표지는 사진촬영 필름 또는 신틸레이션 계수기를 이용하여 검출할 수 있고, 형광 마커는 방출된 빛을 검출하기 위해 광검출기를 이용하여 검출할 수 있다. 효소적 표지는 전형적으로 효소에 기질을 제공하고, 이러한 기질에 대한 효소 작용에 의해 생성된 반응 생성물을 검출함으로써 검출하고, 비색 표지는 착색 표지를 단순히 가시화함으로써 검출한다.

본 발명의 한 실시양태에서는, 형광 표지된 프로브 또는 표적을 레이저 공촛점 스캐너를 이용하여 스캐닝하고 형광 검출할 수 있다.

표지된 핵산 프로브 또는 표적의 경우에 적합한 표지화는 혼성화 전, 동안 또는 후에 수행할 수 있다. 한 실시양태에서, 핵산 프로브 또는 표적을 혼성화 전에 표지시킨다. 형광 표지가 또한 바람직한데, 이를 사용하는 경우, 핵산 프로브와 그의 핵산 표적의 혼성화를 정량화하는 것은 혼성화된 형광 표지된 핵산으로부터 형광을 정량화하는 것이다. 정량화는 핵산 내로 도입된 합텐과 결합하는 형광 표지된 시약으로부터 이루어질 수 있다.

본 발명의 실시양태에서는, 적합한 분석 소프트웨어, 예를 들어 마이크로어레이 분석 슈트 (아피메트릭스 인크.)를 이용하여 혼성화를 달성할 수 있다.

효과적인 정량화는 어레이를 자동으로 스캐닝해줄 수 있는 자동화 스테이지가 장착될 수 있고, 형광 강도 정보의 자동화 측정, 기록 및 후속 가공을 위한 데이터 수집 시스템이 장착될 수 있는 형광 현미경을 이용하여 달성할 수 있다. 이러한 자동화기의 적합한 배열은 통상적이고, 당업자에게 널리 공지되어 있다.

한 실시양태에서, 핵산에 부착된 하나 이상의 검출가능한 부분을 검출함으로써 혼성화된 핵산을 검출한다. 검출가능한 부분은 당업자에게 널리 공지된 수많은 수단에 의해 도입시킬 수 있다. 그러나, 한 실시양태에서, 이러한 부분을 샘플 핵산 (프로브 또는 표적)을 제조하는데에 있어 증폭 단계 동안에 동시에 도입시킨다. 따라서 예를 들어, 검출가능한 부분으로 표지시킨 프라이머 또는 뉴클레오티드를 이용하는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)이 상기 부분으로 표지시킨 증폭 생성물을 제공할 것이다. 대안적인 실시양태에서는, 형광 표지된 뉴클레오티드 (예를 들어, 플루오레세인-표지된 UTP 및/또는 CTP)를 이용하는 전사 증폭으로 인해, 상기 표지가 전사된 핵산 내로 도입된다.

대안적으로, 적합한 검출가능한 부분을 원래의 핵산 샘플 (예를 들어, 관심 조직으로부터의 mRNA, 폴리A mRNA, cDNA 등)에 직접 첨가하거나 또는 본래의 핵산 증폭을 완료시킨 후에 증폭 생성물에 직접 첨가할 수 있다. 형광 표지와 같은 표지를 핵산에 부착시키는 수단은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어 핵산의 키나제 분해에 의한 닉(nick) 번역 또는 말단-표지화 (예를 들어, 표지된 RNA를 수반함) 및 샘플 핵산을 표지 (예를 들어 적합한 형광단)와 연결시켜 주는 핵산 링커의 후속 부착 (라이게이션)이 포함된다.

본 발명의 방법이 인간 대상체와 관련해서 사용하기에 가장 적합하긴 하지만, 이는 또한 비-인간 동물 (예를 들어 말, 개, 소, 낙타)에서 바이러스 감염을 치료하는 과정을 결정하는데 유용할 수 있다는 것을 인지해야 할 것이다.

이전의 연구에서, 본 발명자들은 내인성 IFN계가 많은 감염 환자에서 지속적으로 활성화됨을 확립시켰다. 게다가, 본 발명자들은 예비-활성화 IFN계를 가진 환자와 IFN 요법에 대한 불량한 반응을 상관 짓는 것이 놀라웠다. 이러한 발견은 직관에 반대되는데, 이는 IFNα 요법 동안에는 활성 선천성 면역계가 바이러스를 제거하는데 도움이 될 것으로 예상되었기 때문이다.

본 발명자들은 간 생검에서 ISG 발현을 분석하였고, 일부 환자에서는 HCV가 놀랍게도 내인성 IFN계를 유도하고 (차단하는 것이 아님), 다른 환자에서는 HCV가 내인성 IFN계를 유도하지 않지만 (TRIF 및/또는 카르디프를 절단함으로써 이루어질 수 있음), 이러한 차이가 만성 감염을 유지시킬 수 있는 HCV의 능력에 강한 영향력을 미치지 못한다고 추가로 결론지었다.

IFN계의 예비-활성화가 없는 환자에서, 본 발명자들은 pegIFNα2b가 간에서 4시간 이내에 많은 ISG의 강력한 최대 (이하) 상향 조절을 유도하였음을 발견하였다. 놀랍게도, 이러한 고 ISG 발현 수준은 제4주째에 신속한 바이러스학적 반응을 나타내지 않았던 환자의 치료전 생검에 이미 존재하였다.

또한, 내인성 IFN계의 예비-활성화는 유전자형 2 또는 3에 감염된 환자의 간 생검 보다 HCV 유전자형 1 (및 4)에 감염된 환자의 간 생검에서 보다 자주 발견된 것으로 밝혀졌다. 이는 흥미로운 것인데, 이것은 유전자형 2 및 3 감염은 환자의 80％ 초과에서 치유될 수 있는 반면, 유전자형 1 감염 환자는 50％ 미만이 치유될 수 있는 것으로 널리 공지되어 있기 때문이다. 내인성 IFN계의 예비-활성화 빈도와 정도가 HCV 유전자형에 좌우된다는 본 발명자들의 발견은 HCV 유전자형의 상이한 치료 감수성에 대한 설명을 제공해준다.

본 발명자들은 HCV가 IFN 신호전달을 방해함으로써, 요법에 대한 반응에 손상을 가한다는 것을 상기 데이터가 확립시켰음을 인식하였다. 게다가, HCV에 의한 IFNα 신호전달의 억제는, 내인성 IFN계의 강력한 예비-활성화가 HCV의 자발적 제거를 야기시키지 않는 이유를 설명하고 있다. 본 발명자들은 어떠한 가설에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, IFNα가 HCV에 감염된 간세포에서 항바이러스 상태를 유도하지 않았음을 의미한다고 믿고 있다. 이어서, 많은 환자의 간에서 관찰된 ISG의 상향 조절은 감염되지 않은 간세포에서만 일어날 것이다. 간 생검에서 발견된 ISG의 강력한 유도는 이러한 모델과 양립될 수 있는데, 이는 감염된 간세포 보다 감염되지 않은 간세포가 더 많기 때문이다. 카르디프 및/또는 TRIF를 절단시키는데 성공적이 못한 바이러스에 감염된 간세포에서는 IFNβ 생성이 일어날 것이다. HCV에 의해 유도된 Jak-STAT 경로 억제 때문에, 분비된 IFNβ는 이들 감염된 간세포에서 항바이러스 상태를 유도하지 않을 것이지만, 감염되지 않은 이웃 세포에서만은 그렇치 않다.

"감소시킨다"는 것은 ISG의 발현 수준이 대조군 조직에서의 발현 수준과 유의하게 상이하지 않도록 작용제가 ISG의 자극을 감소시키는데 유효하다는 것을 의미한다.

상기 작용제는 간의 수많은 상이한 바이러스 감염, 예를 들어 B형 간염 바이러스 및 C형 간염 바이러스 감염을 치료하는데 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 작용제를 사용하여 C형 간염 바이러스 (HCV) 감염을 예방 또는 감소시킨다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 작용제의 예에는 IFNα 폴리펩티드와 결합하여 IFN 기능적 활성을 방지할 수 있는 작용제, 예를 들어 항체 및 그의 단편 및 유도체 (예를 들어, 도메인 항체 또는 Fab)가 포함된다. 대안적으로, 상기 작용제는 IFNα 수용체 (예를 들어, IFNAR1, IFNAR2a, b, 또는 c)에서 길항제로서 작용함으로써 IFN계에 대한 경쟁적 억제제로서 작용할 수 있다. 대안적으로, 상기 작용제는 IFN 경로에서 효소 또는 다른 분자를 억제할 수 있다. 대안적으로, 상기 작용제가 mRNA의 감소, 및 그에 따른 IFNα 폴리펩티드의 감소를 유발하는 방식으로 IFNα 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA와 결합할 수 있다. 대안적으로, 상기 작용제는 IFNα 폴리펩티드를 코딩하는 전사된 mRNA의 양의 감소를 유발하는 방식으로 IFNα를 코딩하는 핵산 서열과 결합할 수 있다. 예를 들어, 상기 작용제는 IFNα 유전자의 코딩 또는 비-코딩 영역에, 또는 IFN의 DNA 5' 또는 3'에 결함함으로써, 단백질의 발현을 감소시킬 수 있다.

수많은 상이한 인간 인터페론 α 폴리펩티드 서열이 존재한다. 컨센서스 서열은 결정되었다. 당업자는 이러한 정보를 이용하여 IFNα 폴리펩티드에 대한 결합제를 개발할 수 있다.

상기 작용제가 IFNα 폴리펩티드에 결합하는 경우, 상기 작용제가 그의 천연 형태로 정확하게 폴딩된 단백질에 의해 규정된 에피토프와 결합하는 것이 바람직하다. 종들간에 및 또한 유전자형들간에 일부 서열 가변성이 존재할 수 있다는 것을 인지해야 할 것이다. 따라서, 다른 바람직한 에피토프는 유전자의 변이체로부터의 등가 영역을 포함할 것이다. 추가의 IFN 폴리펩티드로부터의 등가 영역은 상기 요약된 서열 유사성 및 동일성 도구, 및 데이터베이스 조사 방법을 이용하여 확인할 수 있다.

항체는 항원을 동물에게 주사함으로써 폴리클로날 혈청으로서 생성될 수 있다. 예를 들면, 폴리클로날 항체는 당분야에 공지된 기술을 이용하여 동물 (예를 들어, 토끼)에 항원 (예를 들어, 모든 IFNα 폴리펩티드 또는 그의 단편)을 접종함으로써 생성될 수 있다.

대안적으로, 항체가 모노클로날일 수 있다. 통상적인 하이브리도마 기술을 이용하여 이러한 항체를 생성할 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 모노클로날 항체를 생성하는데 사용되는 항원은 폴리클로날 혈청을 생성하기 위해 사용되는 것과 동일할 수 있다.

가장 간단한 형태의 항체 또는 이뮤노글로불린 단백질은 보통 항체의 γ-이뮤노글로불린 (IgG) 부류로써 예시되는 Y형 분자이다. 상기 분자는 2개의 동일한 중쇄 (H) 및 2개의 동일한 경쇄 (L) (각각 대략 50 kD 및 25 kD임)의 4개의 폴리펩티드 쇄로 이루어진다. 각 경쇄는 디술파이드 및 비공유 결합에 의해 중쇄와 결합된다 (H-L). 2개의 동일한 H-L 쇄 조합물은 2개의 H 쇄간의 유사한 비공유적 및 디술파이드 결합에 의해 서로 연결시켜 기본 4개 쇄 이뮤노글로불린 구조물 (H-L)₂를 형성시킨다.

경쇄 이뮤노글로불린은 하나의 V-도메인 (V_L) 및 하나의 불변 도메인 (C_L)으로 이루어지는 반면, 중쇄는 하나의 V-도메인, 및 H 쇄 이소형에 따라 3개 또는 4개의 C-도메인 (C_H1, C_H2, C_H3 및 C_H4)으로 이루어진다.

각 경쇄 또는 중쇄의 N-말단 영역은 서열상 상당히 다양한 가변 (V) 도메인이고, 항원에 대한 특이적 결합을 담당한다. 항원에 대한 항체 특이성은 실제적으로, 초가변 루프 또는 상보성 결정 영역 (CDR)으로서 공지된 V-영역 내의 아미노산 서열에 의해 결정된다. 각각의 H 및 L 쇄 V 영역은 이러한 CDR을 3개 보유하고, 이는 항체의 항원 결합 부위를 형성하는 6개 모두의 조합물이다. 덜 가변적이고 초가변 루프를 지지해 주는 나머지 V-영역 아미노산은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리운다.

가변 도메인을 벗어난 영역 (C-도메인)은 서열 면에서 비교적 일정하다. 본 발명에 따르는 항체를 명확히 규명하는 특징은 V_H 및 V_L 도메인이라는 것을 인지해야 할 것이다. C_H 및 C_L 도메인의 정확한 성질은 전적으로 본 발명에 결정적이지 않다는 것을 추가로 인지해야 할 것이다. 사실상, 본 발명에서 사용하기에 바람직한 항체는 극히 상이한 C_H 및 C_L 도메인을 가질 수 있다. 추가로, 다음에 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 바람직한 항체 기능적 유도체는 C-도메인을 수반하지 않는 가변 도메인을 포함할 수 있다 (예를 들어, scFV 항체).

한 종에서 생성된 항체, 특히 mAb는 상이한 종을 치료하는데 사용하는 경우에 몇 가지 심각한 단점을 지니는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 뮤린 항체를 인간에게 사용하는 경우, 이는 혈청에서의 순환성 반감기가 짧아지는 경향이 있고, 치료하고자 하는 환자의 면역계에 의해 외래 단백질로서 인식될 수 있다. 이로써, 원치않는 인간 항-마우스 항체 (HAMA) 반응이 발생할 수도 있다. 이는 항체를 자주 투여해야 하는 경우에 특히 문제를 일으키는데, 이로 인해 항체의 청소율이 증강될 수 있거나, 그의 치료 효과가 차단될 수 있거나 또는 과민증 반응을 유도시킬 수 있기 때문이다. 이들 요인은 마우스 모노클로날 항체를 인간 요법에 사용하는 것을 제한시키고, 인간화 항체를 생성하기 위한 항체 조작 처리 기술 개발을 촉진시켰다.

따라서, IFN 활성을 감소시킬 수 있는 항체가 인간 대상체에서 HCV 감염을 치료하기 위한 치료제로서 사용되어야 하는 경우에는, 비-인간 공급원의 항체 및 그의 단편을 인간화시키는 것이 바람직하다.

인간화는 V 영역 서열 (예를 들어, 비-인간 하이브리도마에서 생성된 모노클로날 항체로부터 유래됨)을 인간 항체로부터의 C 영역 (및 이상적으로는 V 영역으로부터의 FR) 서열로 스플라이싱함으로써 달성할 수 있다. 이로써 생성되는 '조작된' 항체는 이들이 유래된 비-인간 항체보다 인간에서 덜 면역원성이므로, 임상적 사용에 더욱 잘 적합하다.

인간화 항체는 키메라 모노클로날 항체일 수 있는데, 이는 재조합 DNA 기술을 이용하여 설치류 이뮤노글로불린 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 대체시킨 것이다. 이어서, 키메라 H 쇄 및 L 쇄 유전자를 적합한 조절 요소를 함유하는 발현 벡터 내로 클로닝하고, 포유동물 세포 내로 유도하여, 완전히 글리코실화된 항체를 생성할 수 있다. 이러한 프로세싱에 적절한 인간 H 쇄 C 영역 유전자를 선택함으로써, 항체의 생물학적 활성을 미리 결정할 수 있다. 본 발명에 따라 이러한 키메라 분자는 암을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다.

항체의 추가의 인간화는 항체의 CDR-이식화 또는 재형성을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 비-인간 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR (이는 항체의 항원 결합 부위를 형성함)을 인간 항체의 상응하는 프레임워크 영역에 이식함으로써 생성된다.

인간화 항체 단편은 본 발명에 따라서 사용하기에 바람직한 작용제를 나타낸다. IFNα 폴리펩티드 또는 IFN 수용체 상의 에피토프를 인식하는 인간 FAb는 가변 쇄 인간 항체의 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인할 수 있다. 당분야에 공지된 기술 (예를 들어, 모르포시스(Morphosys) 또는 캠브리지 안티바디 테크놀로지(Cambridge Antibody Technology)에 의해 개발됨)을 이용하여 본 발명에 따른 작용제로서 사용될 수 있는 Fab를 생성시킬 수 있다. 간략하게 언급하면, 단일 쇄 Fv 라이브러리로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 Fab 디스플레이 벡터 내로 전이시킴으로써 인간 조합 Fab 항체 라이브러리를 생성시킬 수 있다. 이 라이브러리는 2.1 x 10¹⁰의 상이한 항체 단편을 수득할 수 있다. 이어서, 펩티드를 "미끼"로서 사용하여 목적하는 결합 특성을 지닌 라이브러리로부터 항체 단편을 확인할 수 있다.

도메인 항체 (dAb)는 본 발명의 상기 실시양태에 따라서 사용될 수 있는 또 다른 바람직한 작용제를 나타낸다. dAb는 항체의 가장 작은 기능적 결합 단위이고, 인간 항체의 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역에 상응한다. 이러한 dAb는 분자량이 약 13 kDa일 수 있다 (완전 항체 크기의 약 1/10 (또는 그 미만)에 상응함).

압타머는 본 발명의 제3 또는 제4 측면의 또 다른 바람직한 작용제를 나타낸다. 압타머는 특이적 서열-의존성 형태를 취하며 압타머와 리간드 사이에 적당한 열쇠-자물쇠(lock-and-key) 일치를 기반으로 하는 특이적 표적 리간드에 결합하는 핵산 분자이다. 전형적으로, 압타머는 단일 또는 이중 가닥 DNA 분자 (ssDNA 또는 dsDNA) 또는 단일 가닥 RNA 분자 (ssRNA)를 포함할 수 있다. 압타머를 사용하여 핵산 표적과 비-핵산 표적 둘 다와 결합할 수 있다. 따라서, IFNα의 활성 또는 발현을 인식하여 이를 감소시키는 압타머가 생성될 수 있다. 적합한 압타머는 무작위 서열 풀로부터 선택될 수 있는데, 이로부터 선별된 표적 분자와 고 친화성으로 결합하는 특이적 압타머를 확인할 수 있다. 목적하는 특이성을 지닌 압타머를 생성 및 선별하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 이에는 SELEX (지수적 강화에 의한 리간드의 계통적 진화) 공정이 포함된다. 간략하게 언급하면, 올리고뉴클레오티드의 대형 라이브러리를 생성시켜, 시험관내 선별과 폴리머라제 연쇄 반응을 통한 후속 증폭의 반복적 공정에 의해 다량의 기능적 핵산을 단리시킬 수 있다.

안티센스 분자는 환자를 치료하는데 사용하기 위한 또 다른 바람직한 작용제를 나타낸다. 안티센스 분자는 전형적으로 유전자에 의해 생성된 상보성 핵산 서열과 특이적으로 결합하고 이를 불활성화시켜, 상기 유전자를 효과적으로 작동 "중지"시킬 수 있는 단일 가닥 핵산이다. 상기 분자는 "안티센스"로 지칭되는데, 이는 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, "센스" 서열로 불리는 상기 유전자의 mRNA에 상보적이기 때문이다. 안티센스 분자는 전형적으로, DNA, RNA 또는 화학적 유사체의 길이가 15 내지 35개 염기이다. 안티센스 핵산을 실험적으로 사용하여 mRNA와 결합하고 특이적 유전자의 발현을 방지시켰다. 이로써, 암, 당뇨병 및 염증성 질환을 치료하기 위한 약물로서 "안티센스 요법"이 개발되었다. 안티센스 약물은 최근에, 인간 치료용으로 US FDA에 의해 승인되었다. 따라서, IFN 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 안티센스 분자를 고안함으로써, 세포에서의 IFNα 폴리펩티드의 발현을 감소시키고, 이로써 IFNα 활성을 감소시키고 HCV 감염에서 관찰된 예비-활성화를 감소시키는 것이 가능할 것이다. IFNα 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 도 8에 제공되어 있다.

종종 소형 간섭 RNA 또는 침묵 RNA로 공지된 소형 간섭 RNA (siRNA)는 본 발명의 제3 또는 제4 측면에 따라서 사용하기 위한 추가의 바람직한 작용제를 나타낸다. 상기 설명된 바와 같이, 본 발명자들은 IFN계의 예비-활성화가 항바이러스 요법에 대한 내성과 연관이 있음을 인식하였다. 따라서, IFNα 발현을 감소시킬 수 있는 siRNA 분자가 HCV 감염을 치료하기 위한 약물의 제조에서 상당히 유용한 것은 명백하다. siRNA는 RNA 간섭 경로 (RNAi)에 관여함으로써, siRNA가 특이적 유전자의 발현 감소를 유도시킬 수 있거나 또는 이러한 mRNA의 번역을 특이적으로 방해함으로써 이러한 mRNA의 의해 코딩된 단백질의 발현을 억제시킬 수 있는, 20 내지 25개 뉴클레오티드 길이의 RNA 분자 부류이다. siRNA는 널리 규정된 구조, 즉 어느 한 말단 상에 2-nt 3' 오버행을 가진 RNA의 소형 (통상적으로, 21-nt) 이중 가닥을 갖는다 (dsRNA). 각 가닥은 5' 포스페이트기와 3' 히드록실기 (-OH)를 갖는다. 생체내에서는 이러한 구조가, 긴 dsRNA 또는 헤어핀 RNA를 siRNA로 전환시키는 효소인 다이서에 의한 프로세싱의 결과이다. siRNA는 또한, 관심 유전자의 특이적 녹다운을 유발시키는 각종 형질감염 방법에 의해 세포 내로 외적으로 (인공적으로) 도입될 수 있다. 본질적으로, 그의 서열이 공지된 임의의 유전자는 적당하게 재단된 siRNA와의 서열 상보성을 기준으로 하여 표적화시킬 수 있다. 본질적으로 임의의 관심 유전자를 녹다운시킬 수 있는 능력을 고려해 보면, siRNA를 통한 RNAi는 기초 및 응용 생물학 둘 다에서 상당한 관심을 불러 일으켰다. 각종 생물학적 경로에서 중요한 유전자를 확인하도록 고안된 대규모 RNAi 스크린의 개수가 증가하고 있다. 질환 과정이 또한 다중 유전자의 활성에 좌우되기 때문에, 몇몇 상황하에서는 siRNA를 이용하여 유전자의 활성을 작동 중지시키는 것이 치료적 이득을 야기시킬 것으로 예상된다. 따라서, 이러한 발견으로 인해, 생물의학적 조사 및 약물 개발을 위해 RNAi를 이용하는 것에 대한 관심이 급증하였다. 최근에 제I상 치료적 RNAi 시험 결과, siRNA가 널리 관용되고 적합한 약동학적 특성을 지니고 있는 것으로 입증되었다. 따라서, siRNA 및 관련 RNAi 유도 방법은 예측할 수 있는 미래에 중요한 신규 부류의 약물이 될 전망이다. IFNα 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 대해 고안된 siRNA 분자를 사용하여 IFNα의 발현을 감소시킬 수 있고, 이로써 IFN계의 예비-활성화가 감소된다. 따라서, 이러한 본 발명의 측면의 한 실시양태는 상기 작용제가 IFNα 폴리펩티드에 대한 상보성 서열을 갖는 siRNA 분자라는 것이다.

이러한 정보를 이용하여, IFNα 폴리뉴클레오티드에 대한 상보성 서열을 가진 siRNA 분자를 고안하는 것이 당업자에게는 간단하고 잘 알려져 있다. 예를 들어, 간단한 인터넷 조사만으로도 siRNA 분자를 고안하는데 사용될 수 있는 수많은 웹사이트를 알아낼 수 있다.

"siRNA 분자"에는 이중 가닥의 20 내지 25개 뉴클레오티드 길이의 RNA 분자 뿐만 아니라, siRNA 분자를 구성하는 2개의 단일 RNA 가닥 각각이 포함된다.

예를 들어, siRNA는 헤어핀 RNA (shRNA)의 형태로 사용된다. 이러한 shRNA는 스페이서 서열 (예를 들어, 약 9개 뉴클레오티드의 서열)에 의해 연결된 2개의 상보성 siRNA 분자를 포함할 수 있다. 이러한 상보성 siRNA 분자는 이들이 함께 결합되도록 폴딩될 수 있다.

IFNα 폴리펩티드를 코딩하는 RNA 또는 DNA를 절단할 수 있는 리보자임은 본 발명의 제3 또는 제4 측면의 또 다른 바람직한 작용제를 나타낸다.

"대상체"는 척추동물, 포유동물, 가축 또는 인간일 수 있다. 치료하고자 하는 대상체가 인간인 것이 바람직하다. 이러한 경우에는, 작용제가 인간 요법에 가장 잘 맞도록 고안될 수 있다 (예를 들어, 상기 논의된 바와 같은 항체의 인간화). 그러나, 상기 작용제를 사용하여 다른 수의학적 관심 동물 (예를 들어, 말, 낙타, 소, 개 또는 고양이)을 치료할 수도 있다는 것을 인지해야 할 것이다.

본원에서 지칭된 "제약상 허용되는 비히클"은 제약 조성물을 제형화하는데 유용한 것으로 당업자에게 공지된 임의의 생리학적 비히클이다.

기술자가 본 발명의 제1 측면의 방법을 수행하는데 요구되는 각종 요소들을 키트에 도입시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 한 측면에 따르면,

(i) miRNA, 예를 들어 miR-122 또는 miR-296-5p의 발현 수준을 대상체로부터의 샘플에서 분석하기 위한 수단; 및 임의로,

(ii) 대상체로부터의 샘플 중 상기 miRNA, 예를 들어 miR-122 또는 miR-296-5p의 수준을 대조군 샘플 중 상기 miRNA, 예를 들어 miR-122 또는 miR-296-5p의 수준과 비교하기 위한 수단

을 포함하는, 간이 바이러스에 감염된 대상체가 인터페론 (IFN) 활성의 자극을 포함하는 항바이러스 요법에 대해 반응성일 가능성을 결정하기 위한 키트가 제공된다.

"miRNA, 예를 들어 miR-122 또는 miR-296-5p의 수준을 대상체로부터의 샘플에서 분석하기 위한 수단"에는 샘플에서 miRNA, 예를 들어 miR-122 또는 miR-296-5p 수준을 대표하는 분자를 표적화할 수 있는 특이적 결합 분자가 포함된다. 일부 실시양태에서는, 이러한 특이적 결합 분자가 올리고뉴클레오티드 프로브, 항체, 압타머, 또는 상기 언급된 결합 단백질 또는 소분자이다.

"대상체로부터의 샘플 중 상기 miRNA, 예를 들어 miR-122 또는 miR-296-5p의 수준을 대조군 샘플 중 상기 miRNA, 예를 들어 miR-122 또는 miR-296-5p의 수준과 비교하기 위한 수단"에는 본 발명의 제1 측면에서 상기에 언급된 대조군 샘플이 포함된다. 이에는 또한, 본원에 언급된 대조군 기준 데이터가 포함된다.

본 발명의 키트는 또한

(iii) miRNA, 예를 들어 miR-122 또는 miR-296-5p의 발현 수준을 분석하기 위한 적절한 완충제 및 시약을 포함할 수 있다.

키트에 제공된 완충제 및 시약은 액상 형태일 수 있고, 일부 실시양태에서는 예비-측정된 분취액으로서 제공될 수 있다. 대안적으로, 완충제 및 시약이 희석을 위해 농축된 형태 (또는 심지어 분말 형태)일 수 있다.

본원 (임의의 첨부되는 특허청구범위, 요약서 및 도면 포함)에 기재된 모든 특징, 및/또는 이로써 기재된 임의의 방법 또는 공정의 모든 단계는 이러한 특징들 및/또는 단계들 중의 적어도 일부가 상호 배제되는 조합을 제외하고는, 어떠한 조합으로든지 상기 임의의 측면과 조합될 수 있다.

본 발명은 이제 다음 실시예 및 도면을 참고로 하여 추가로 기재될 것이다:

도 1. 만성 C형 간염 (CHC) 환자의 간에서 miR-122 발현

(A) miR-122 수준은 완전 조기 바이러스학적 반응 (cEVR)을 가진 환자에서보다 pegIFNα 요법에 대한 1차 비-반응자 (PNR)에서 유의하게 감소된다. 42명의 CHC 환자 및 간 질환이 없는 6명의 대조군 환자의 간에서 miR-122의 양을 RT-qPCR에 의해 측정하였고, 카피/10pg 전체 RNA로 표현하였다. 16명의 PNR과 26명의 cEVR 환자간의 차이는 양방향 맨 휘트니 t-테스트(two-tailed Mann Whitney t-test)에 의해 측정되는 바와 같이 통계적으로 유의하다 (p<0.0001). cEVR 환자와 대조군간에 유의한 차이가 전혀 없다.

(B) RNase 보호 검정은 PNR과 cEVR 환자간의 miR-122 수준 차이를 확인시켜 준다. 4명의 대조군 환자 및 8명의 CHC 환자 (4명의 PNR 및 4명의 cEVR; 패널의 상단에 도시된 환자 수)로부터 생성된 RNA는 miR-122 (상부 패널) 및 let-7b (중간 패널)에 특이적인 프로브에 의해 분석되었다. 하부 패널에서 막대는 각각의 환자에 대해 정량적인 포스포르이미징(PhosporImaging)에 의해 측정되는, miR-122와 let-7b RNA 사이의 상대적인 비 (상부 및 하부 패널에 도시된 것과 유사한 두 실험으로부터의 평균)를 나타낸다. PNR 환자는 cEVR 및 대조군 환자보다 3-4배 낮은 miR-122 수준을 나타낸다.

(C) 혈청 HCV RNA 수준은 간내 miR-122 발현과 상관관계가 없다. 혈청 바이러스 로드 (ml당 국제 단위)는 로그 규모로 플로팅된다 (y-축). 상관관계는 상관 계수 r = 0.15로 유의하지 않다 (p = 0.35).

(D) 간내 HCV RNA 수준은 miR-122 발현과 상관관계가 없다. 간내 HCV RNA (전체 간 RNA (㎍) 당 카피)는 로그 규모로 플로팅된다 (y-축). 상관관계는 유의하지 않다 (p = 0.06, 상관 계수 r = -0.29).

(E) PegIFNα의 투여는 인간 간의 miR-122 수준에 대한 유의한 효과를 갖지 않는다. CHC를 가진 6명의 cEVR 및 5명의 PNR 환자로부터의 쌍을 이룬 인간 간 생검에서 miR-122 수준 (카피/10pg 총 RNA)은 RT-qPCR에 의해 측정하였다. 첫번째 간 생검 (- pegIFNα)은 치료 개시 이전에 수행되었다. 두번째 생검 (+ pegIFNα)은 첫번째 pegIFNα 주사 4시간 후에 수행되었다. 다이아그램은 각각의 환자의 쌍을 이룬 간 샘플 (선으로 연결됨)에서 miR-122의 수준을 보여준다.

도 2. 만성 C형 간염 (CHC) 환자의 간에서 miR-296-5p 발현.

miR-296-5p 수준은 완전 조기 바이러스학적 반응 (cEVR)을 가진 환자에서보다 pegIFNα 요법에 대한 1차 비-반응자 (PNR)에서 유의하게 높다. 42명의 CHC 환자 및 간 질환이 없는 6명의 대조군 환자의 간에서 miR-296-5p의 양은 RT-qPCR에 의해 측정되었고, 카피/10pg 전체 RNA로 표현된다. 16명의 PNR과 26명의 cEVR 환자간의 차이는 양방향 맨 휘트니 t-테스트에 의해 측정된 바와 같이 통계적으로 유의하 (p<0.0001).

<실시예>

환자 샘플 및 C형 간염 치료

2006년 10월부터 2008년 3월까지, 유니버시티 호스피탈 바셀(University Hospital Basel)의 외래 환자 간 클리닉에 보내진 CHC 환자를 대상으로 하여, 조사 목적으로 그들의 진단용 간 생검의 일부 사용을 허락해 달라고 요청하였다. PEG화-IFNα2b (pegIFNα; 페그인트론(PegIntron), 에섹스 케미 아게(Essex Chemie AG), 스위스) 및 리바비린 (레베톨(Rebetol), 에섹스 케미 아게, 스위스; 중량 기재 투여: <65 kg, 800 mg/d; 65-85 kg, 1 g/d; >85 kg, 1.2 g/d)으로 치료된 42명의 환자는 반복된 RNA 추출에 이용가능한 충분한 간 생검 물질을 가졌다. 이들 모두는 백인이었다. 이들 42명의 환자 중 11명이 pegIFNα를 첫번째 주사한지 4시간 후에 두번째 간 생검을 진행하도록 동의하였다. 이 프로토콜은 유니버시티 호스피탈 바셀의 윤리 위원회에 의해 승인되었고 모든 환자로부터 동의서를 얻었다. 치료를 개시하기 전과, 코바스 앰플리프렙/코바스 택맨(COBAS AmpliPrep/COBAS Taqman®) HCV-테스트 (로슈 몰레큘라 시스템즈(Roche Molecular Systems))를 사용한 치료 제4주 및 제12주째에 혈청 HCV RNA를 정량화하였다. 메타비르(Metavir) 분류 체계에 따른 HCV 간 생검의 조직학적 분류 및 단계화는 유니버시티 호스피탈 바셀의 병리학 연구소에 수행되었다. 비-CHC 건강한 대조군 조직을 국소 병변의 초음파-유도 간 생검을 실시한 6명의 환자로부터 얻었으며, 국소 병변을 벗어난 정상 간 조직으로부터의 생검에 대한 동의서를 제출하였다. 이들 환자는 정상적인 간 수치를 가졌으며, 간 병리상태의 부재가 모든 대조군 샘플에 대해 조직학적으로 확인되었다.

간 조직 및 Huh7 세포에서 정량화를 위한 miRNA의 선별

miR-122 뿐만 아니라, Huh-7 세포 및 인간 및 마우스 간 샘플에서 IFN 효과의 정량화 및 분석을 위해 선별된 miRNA는 miR-1, miR-196, miR-296, miR-351 및 miR-448이었으며, 이들 모두 페더슨(Pedersen) 등에 의해 INF 유도가능한 것으로 보고되었다 (문헌[Pedersen IM et al., Nature 2007;449:919-922]). miR-1을 제외하고, 이들 각각의 형질감염은 또한 Huh7 세포에서 HCV 레플리콘 RNA의 양을 저하시키는 것으로 보고되었다 (문헌 [Pedersen IM et al., Nature 2007;449:919-922]). HCV 레플리콘 RNA 수율의 감소를 유도하는 것으로 보고된 또 다른 miRNA는 miR-431이지만, 이 miRNA의 정량화를 위한 검정이 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)로부터 입수가능하지 않았고 지금까지 이 miRNA가 간 또는 간종양 세포에서 발현된 것으로 확인되지 않았기 때문에, 상기 miRNA는 분석하지 않았다. 마찬가지로, miR-30은 다중 형태 (miR-30a, b, c, d 및 e)로 존재하지만, 분석된 형태가 페더슨 등에 의해 구체화되지 않았기 때문에, 이를 분석하지 않았다. 또한, 이 miRNA의 과다발현이 HCV RNA 수율에 어떠한 영향도 미치지 않았다 (문헌 [Pedersen IM et al., Nature 2007;449:919-922]). 페더슨 등에 의해 분석된 특이적 miR-196 및 miR-296 형태가 지적된 적이 없었지만, 본 발명자들은 miR-196b (인간 간종양 세포에서 확인된 두 miR-196-특이적 클론은 miR-196a가 아니라 miR-196b를 나타냄) 및 miR-296-5p (페더슨 등에 의해서도 사용된 어플라이드 바이오시스템즈 택맨® 마이크로RNA 검정은 miR-296-3p가 아니라 miR-296-5p에 대해 이용가능함)를 정량화를 위해 선별하였다. miR-196b를 제외하고, 분석된 다른 miRNA (miR-1, miR-296, miR-351 및 miR-448)를 나타내는 클론은 인간 간 또는 간종양 세포로부터 전혀 단리된 적이 없었다 (참고문헌 3). Let-7b 및 miR-15a를 대조군 miRNA로서 선별하였으며, 이들의 수준은 CHC에서 또는 IFN 치료에 의해 영향을 받을 것으로 예상되지 않았다.

소형 RNA의 RNA 추출, 역전사 및 실시간 qPCR 정량화

Huh7 및 Huh7.5 세포로부터의 전체 및 소형 RNA 분획을 각각 제조자의 프로토콜에 따라 트리졸(Trizol) 및 미르바나(mirVana™) miRNA 단리 키트 (암비온(Ambion), 텍사스주 오스틴)를 이용하여 추출하였다. 인간 또는 마우스 간으로부터의 전체 RNA는 트리졸 시약 중에서 10-30 mg의 동결된 조직을 균질화함으로써 단리하였다. RNA 농도는 나노드롭(NanoDrop) 분광광도계 (나노드롭 테크놀로지즈(NanoDrop Technologies), USA)를 이용하여 정량화되었다. 인간 및 마우스 물질에서 let-7b, miR-15a, miR-122, miR-1, miR-196b, miR-296-5p, miR-351 및 miR-448 발현의 분석을 위해 (마우스 및 인간에서 이들 miRNA의 서열은 동일함), 어플라이드 바이오시스템 택맨® 마이크로RNA 검정 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈, 캘리포니아주 포스터 시티)을 이용하였다. 역전사효소 (RT) 반응을 1 x RT 완충제, 5 ng의 RNA, 50 nM의 miRNA-특이적 RT 프라이머, 0.25 mM의 각각의 dNTP, 0.25 U/㎕의 RNase 억제제 및 3.33 U/㎕의 멀티스크라이브(MultiScribe) RT를 함유한 7.5 ㎕의 최종 부피에서 16℃에서 30 분 동안, 42℃에서 30 분 동안, 85℃에서 5 분 동안 인큐베이션한 다음, 4℃에서 유지하였다. 비-주형 대조군을 비롯한 모든 RT 반응은 3벌식으로 작업하였다. 실시간 PCR은 어플라이드 바이오시스템즈 프리즘 7000 서열 검출 시스템을 사용하여 수행하였다. 10 ㎕ PCR은 0.67 ㎕ RT 생성물, 1x 택맨 유니버셜 PCR 마스터 믹스, 및 택맨® 마이크로RNA 검정의 프라이머 및 프로브 믹스 1 ㎕를 포함하였다. 반응은 96-웰 광학 플레이트에서 95℃에서 6 분 동안, 이어서 95℃에서 15 초 동안 및 60℃에서 60초 동안의 40회 사이클로 인큐베이션하였다. Ct 값은 디폴트 역가 설정을 이용하여 결정되었다. 역가 사이클 (Ct)은 형광이 고정된 역가를 통과하는 분별 사이클 횟수로 규정된다.

정규화 및 miRNA 카피 개수 추정.

각각의 샘플에 대해 측정된 Ct 값은 3벌식 반응으로부터 계산된 U6 RNA로부터 수득한 평균 Ct에 대해 정규화하였다. miRNA 카피 개수를 측정하기 위해, let-7b, miR-15a, miR-122, miR-1, miR-196b, miR-296-5p, miR-351 및 miR-448 miRNA에 상응하는 폴리아크릴아미드-겔-전기영동 (PAGE)에 의해 정제된 올리고리보뉴클레오티드 (마이크로신트(Microsynth), 스위스)를 이용하여 표준 곡선을 생성하였다. 합성 RNA 투입은 1.3 aM (반응당 7 카피와 동등함) 내지 13 pM (반응당 7 x 10⁷ 카피) 범위였고, 반응은 상기 기재된 어플라이드 바이오시스템즈 프리즘 7000을 사용하여 택맨® 마이크로RNA 검정에 의해 2벌식으로 분석하였다. 단리된 합성 miRNA를 이용하여 수행된 표준화를 추가로 유효화하기 위해, HeLa 세포 또는 마우스 망막으로부터의 5 ng의 전체 RNA를 함유하는 반응을 합성 miR-122의 농도를 증가시키면서 (1.3 aM -> 13 pM) 수행하였고, 택맨® 마이크로RNA 검정에 의해 분석하였다. miR-122는 합성 miR-122 RNA의 첨가없이 대조군 반응에 의해 측정된 바와 같이 HeLa 및 마우스 망막 세포에서 발현되지 않다. "담체" RNA (데이터는 나타내지 않음)의 부재 또는 존재하에 수득된 표준 곡선간에 차이가 전혀 관찰되지 않았다. 상이한 반응으로부터 수득된 Ct 값은 적절한 표준화 곡선을 이용하여 간 조직으로부터의 10 pg의 전체 RNA당 또는 단일 Huh7 세포당 특이적 miRNA의 절대적 카피 개수로 전환되었다. 나타난 바와 같이, miRNA의 회수율은 간세포-특이적 알부민 mRNA의 수준을 위해 추가로 정규화되었다. 인간 알부민 RT-qPCR에 사용된 프라이머는 TTGGAAAAATCCCACTGCAT (서열 1) 및 CTCCAAGCTGCTCAAAAAGC (서열 2)이었다. SYBR-PCR 반응은 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스 (어플라이드 바이오시스템즈, 캘리포니아주 포스터 시티)를 이용하여 수행되었다. Huh7 세포당 개별 miRNA의 카피 개수를 측정하기 위해, 세포당 전체 RNA의 회수율은 세가지 상이한 절차에 의해 계산되었다. 첫번째 두 절차의 경우, 제조자 (샤르페 시스템(Scharfe System), 독일)의 프로토콜에 따라 CASY1 세포 카운터를 이용하여 세포를 계수하였고, 기지 개수의 세포로부터의 RNA를 트리졸 또는 미르바나 키트를 이용하여 추출하였다. 세번째 절차에서, 세포를 현미경하에 트리졸에 의해 추출된 RNA에서 계수하였다. 세가지 모든 절차를 RNA 추출을 위한 상이한 개수의 세포를 이용하여 3벌식으로 수행하였다. RNA 회수율을 측정하기 위해 샘플에 ³²P-표지된 RNA를 첨가하였다. 이 절차에서 세포당 하기하는 전체 RNA의 양을 수득하였다: 13.8 +/- 3.5 pg, 14.52 +/- 2.65 pg 및 13,98 +/- 2.37 pg. 14.1 pg/세포의 평균 값을 추가의 계산을 위해 사용하였다. 이 값은 간세포 및 간종양 세포에서 miR-122의 함량을 계산하기 위해 챙(Chang) 등에 의해 이전에 사용된 세포당 25 pg의 RNA보다 낮은 것이다. 그러나, 이는 상이한 발달 단계에서 마우스 T 림프구 (0.67 내지 6.82 pg/세포) 또는 마우스 ES 세포 (20 pg/세포)에 대해 계산된 값의 범위에 속한다. 세포당 소형 RNA (< 200 nt) 함량을 측정하기 위해, 상이한 절차에 의해 수득한 전체 Huh7 세포 RNA를 미르바나™ 키트에 의해 분별화하였다. 단일 Huh7 세포가 1.125 pg의 소형 RNA (세포당 1.05 내지 1.2 pg 범위의 측정의 평균)를 함유하는 것으로 계산되었다. 브라운(Brown) 등에 의해 측정된 것과 유사한 이 값을 이용하여 세포당 miRNA 카피에 대한 10 pg의 소형 RNA당 miRNA 카피 개수를 다시 계산하였다 (어플라이드 바이오시스템 택맨® 검정을 또한 이용하여 브라운 등에 의해 측정됨). 본 발명자들은 어플라이드 바이오시스템 택맨® 검정에 의해 측정된 세포당 miRNA 카피의 값이 RNase 보호에 의해 측정된 것보다 낮은 경향이 있음을 주목하였다 (본 발명자들의 공개되지 않은 결과). 이는 어플라이드 바이오시스템 택맨® 시스템이 동일한 효능을 가진 특이적 miRNA의 개별 3'-말단 서열 변이체를 검출하지 않는다는 사실 때문이다 (공개되지 않은 결과).

RNase 보호 검정에 의한 miRNA 검출

RNase 보호 검정 (RPA)은 제조자의 지시에 따라 미르바나 miRNA 프로브 구조물 및 검출 키트 (암비온)를 이용하여 수행되었다. RPA 프로브의 제조에 사용된 프라이머는 let-7b, TGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTTCCTGTCTC (서열 3); 및 miR-122, TGGAGTGTGACAATGGTGTTTGTCCTGTCTC (서열 4)이었다. 간략하게, RPA 반응은 내부 표지되고 PAGE에 의해 정제된 RPA 프로브 5 fmol (100,000 cpm) 및 전체 간 RNA 1 ㎍을 함유하였다. 혼성화는 42℃에서 밤새 수행하였고, RNase A/T1 절단은 37℃에서 20 분 동안 수행하였다. 보호된 단편은 변성 조건하에 12％ PAGE, 이어서 포스포르이미저 (PhosphorImager, 타이푼(Typhoon), 몰레큘라 다이나믹스(Molecular Dynamics)) 정량화에 의해 분석하였다.

ISG mRNA 수준의 측정

인간 또는 마우스 간 조직으로부터 추출된 전체 RNA를 IFN 작용의 척도로서 "고전적인" ISG mRNA (PKR, OAS1, STAT1 및 SOCS1)의 정량화에 사용하였다. RNA는 랜덤 헥사머 (프로메가(Promega)) 및 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재하에 몰로니쥐 백혈병 바이러스 역전사 효소 (프로메가 바이오사이언시즈, 인크.(Promega Biosciences, Inc.), 스위스 발리젤렌)에 의해 역전사되었다. 반응은 70℃에서 5 분 동안, 이어서 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였고, 95℃에서 5 분 동안 가열함으로써 중단시켰다. SYBR-PCR 반응은 게놈 DNA의 증폭을 피하기 위해 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스 (어플라이드 바이오시스템즈) 및 엑손-인트론 연결에 걸쳐있는 프라이머를 이용하여 수행되었다. 하기 프라이머를 마우스 (m) 유전자를 위해 사용하였다: 리보솜 단백질 L-19 (mRPL-19), ATCCGCAAGCCTGTGACTGT (서열 5) 및 TCGGGCCAGGGTGTTTTT (서열 6); mPKR, TGATAACGAAAACAAGGTGGATTG (서열 7) 및 ACAAGGCCTATGTAGTTACCAACGA (서열 8); mOAS1, CACCCA GTGAGGGTCTCCAA (서열 9) 및 CCCTTGAGTGTGGTGCCTTT (서열 10); mSTAT1, CGGCGCAGAGAGATTTGC (서열 11) 및 AGCTGAAACGACTGGC TCTCA (서열 12). 인간 (h) 유전자를 위한 프라이머는 다음과 같다: 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (hGAPDH); GCTCCTCCTGTTCGACAGTCA (서열 13) 및 ACCTTCCCCATGGTGTCTGA (서열 14), hPKR, TGATTATCTGCGTGCATTTTGG (서열 15) 및 GCTGAAAGATCACCAGCCATTT (서열 16); hOAS1, TGATGCCCTGGGTCAGTTG (서열 17) 및 TCGGTGCACTCCTCGATGA (서열 18); hSOCS1, CCCCTTCTGTAGGATGGTAGCA (서열 19) 및 TGCTGTGGAGACTGCATTGTC (서열 20); hSTAT1 TCCCCAGGCCCTTGTTG (서열 21) 및 CAAGCTGCTGAAGTTGGTACCA (서열 22); hIP10, CGATTCTGATTTGCTGCCTTAT (서열 23) 및 GCAGGTACAGCGTACGGTTCT (서열 24); hUSP18, CTCAGTCCCGACGTGGAACT (서열 25) 및 ATCTCTCAAGCGCCATGCA (서열 26); hIFI27, CCTCGGGCAGCCTTGTG (서열 27) 및 AATCCGGAGAGTCCAGTTGCT (서열 28). 사이클 역가 값의 차이 (ΔCt)는 관심 전사체의 Ct 값으로부터 내부 대조군의 역할을 하는 hGAPDH 또는 mRPL-19의 Ct 값을 차감함으로써 유래되었다. 모든 반응은 어플라이드 바이오시스템즈 프리즘 7000 서열 검출 시스템을 사용하여 2벌식으로 작업하였다. mRNA 발현 수준은 2^-ΔCt의 식을 이용하여 ΔCt 값으로부터 hGAPDH 또는 mRPL-19와 관련하여 계산되었다. 쌍을 이룬 간 생검 샘플에서 발현의 변화는 2＾(ΔCt B-1-ΔCt B-2)의 식에 따른 변화 배수로서 계산되었다. .

간내 HCV RNA의 정량화

42명의 CHC 및 6명의 대조군 환자의 생검으로부터 단리된 1 ㎍의 전체 RNA를 모든 HCV 아형의 시험관내 정량화를 위해 고안된 병원체 특이적 RT 프라이머 믹스 (HCV를 위한 정량화 키트, 프라이머다자인 리미티드(PrimerDesign Ltd), 영국 사우샘프턴)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 역전사시켰다. HCV RNA는 병원체 특이적 프라이머/프로브 믹스 (프라이머다자인 리미티드) 및 택맨® 유니버셜 PCR 마스터 믹스 (어플라이드 바이오시스템즈, 로슈에 의해 제조됨, 미국 뉴저지주)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 정량화되었다. 형광은 어플라이드 바이오시스템즈 7000 서열 검출 시스템의 FAM 채널을 통해 검출하였고, 1 ㎍의 전체 RNA당 HCV RNA의 카피는 병원체 양성 대조군 주형 (프라이머다자인 리미티드)을 사용하여 수득된 표준 곡선에 따라 계산되었다.

SEQUENCE LISTING <110> Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute for Biomdeical Research University Hospital, Basel <120> Prediction of Antiviral Therapy Response <130> 52675 <160> 28 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ttggaaaaat cccactgcat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ctccaagctg ctcaaaaagc 20 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tgaggtagta ggttgtgtgg ttcctgtctc 30 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 tggagtgtga caatggtgtt tgtcctgtct c 31 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 atccgcaagc ctgtgactgt 20 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 tcgggccagg gtgttttt 18 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 tgataacgaa aacaaggtgg attg 24 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 8 acaaggccta tgtagttacc aacga 25 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 9 cacccagtga gggtctccaa 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 10 cccttgagtg tggtgccttt 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 11 cggcgcagag agatttgc 18 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 12 agctgaaacg actggctctc a 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gctcctcctg ttcgacagtc a 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 accttcccca tggtgtctga 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 tgattatctg cgtgcatttt gg 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 gctgaaagat caccagccat tt 22 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 tgatgccctg ggtcagttg 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 tcggtgcact cctcgatga 19 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 gctgaaagat caccagccat tt 22 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 tgctgtggag actgcattgt c 21 <210> 21 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 tccccaggcc cttgttg 17 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 caagctgctg aagttggtac ca 22 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 cgattctgat ttgctgcctt at 22 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 gcaggtacag cgtacggttc t 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 ctcagtcccg acgtggaact 20 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 atctctcaag cgccatgca 19 <210> 27 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 cctcgggcag ccttgtg 17 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 aatccggaga gtccagttgc t 21

Claims

(a) miRNA의 발현 수준에 대해 대상체로부터의 샘플을 분석하는 단계, 및
(b) 대상체로부터의 샘플 중 상기 miRNA의 발현 수준을 대조군 샘플 중 상기 miRNA의 수준과 비교하는 단계
를 포함하는, 간이 바이러스에 감염된 대상체가 인터페론 (IFN) 활성의 자극을 포함하는 항바이러스 요법에 반응성일 가능성을 결정하는 방법.
제1항에 있어서, miRNA가 miR-122이고, 대조군 샘플 중 miR-122 수준과 비교해서 대상체로부터의 샘플 중 miR-122의 보다 낮은 수준이, 대상체가 상기 항바이러스 요법에 반응성이지 않을 수 있음을 나타내는 것인 방법.
제1항에 있어서, miRNA가 miR-296-5p이고, 대조군 샘플 중 miR-296-5p 수준과 비교해서 대상체로부터의 샘플 중 miR-296-5p의 보다 높은 수준이, 대상체가 상기 항바이러스 요법에 반응성이지 않을 수 있음을 나타내는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 대조군 샘플 중 각각 miR-122 및/또는 miR-296-5p 수준과 비교해서 대상체로부터의 샘플 중 각각 miR-122의 변경되지 않거나 상승된 수준 및/또는 miR-296-5p의 변경되지 않거나 저하된 수준이, 대상체가 상기 항바이러스 요법에 반응성일 수 있음을 나타내는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항바이러스 요법이 리바비린과 임의로 조합된 PEG화 IFNα (pegIFNα)를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 감염이 B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스 감염인 방법.
제4항에 있어서, 상기 바이러스가 C형 간염 바이러스인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 간 조직을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 대한 대상체의 반응을 예측할 수 있는 유전자의 발현을 또한 분석하는 방법.
제9항에 있어서, 유전자 발현을 샘플 중 mRNA 유전자 전사체의 양, 또는 상기 mRNA로부터 유래된 cDNA의 양을 측정함으로써 결정하는 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서, 유전자 발현을 샘플 중 유전자에 의해 코딩된 펩티드 또는 폴리펩티드의 양을 측정함으로써 결정하는 방법.
제11항에 있어서, 펩티드 또는 폴리펩티드의 양을 특이적 결합 분자를 이용하여 결정하는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 방법.
(i) miRNA, 예를 들어 miR-122 또는 miR-296-5p의 발현 수준을 대상체로부터의 샘플에서 분석하기 위한 수단; 및 임의로,
(ii) 대상체로부터의 샘플 중 상기 miRNA, 예를 들어 miR-122 또는 miR-296-5p의 수준을 대조군 샘플 중 상기 miRNA, 예를 들어 miR-122 또는 miR-296-5p의 수준과 비교하기 위한 수단
을 포함하는, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 키트.
제14항에 있어서, 요법에 대한 대상체의 반응을 예측할 수 있는 하나 이상의 유전자의 발현을 분석하기 위한 수단을 추가로 포함하고, 상기 수단이 요법에 대한 대상체의 반응을 예측할 수 있는 상기 하나 이상의 유전자를 대표하는 분자를 표적화할 수 있는 하나 이상의 특이적 결합 분자를 최종적으로 포함하고, 상기 특이적 결합 분자가 올리고뉴클레오티드 프로브, 항체 또는 압타머이며, 상기 샘플 중 유전자의 발현을 대조군 샘플 중 동일한 유전자의 발현과 비교하기 위한 수단을 임의로 포함하는 키트.