CN102212555A - 一种可用于表达miR-122载体pSU6-miR-122的构建方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可用于表达miR-122载体pSU6-miR-122的构建方法及用途，其步骤是：a、化学合成寡核苷酸链，反义链与有义链互补，在5’端添加上AGCT以产生粘性突出末端；b、有义链、反义链退火,形成带BamHI和HindIII粘性末端的片段；c、将片段连接至载体pSilencer-2.1-U6，载体由BamHI和HindIII双酶切；d、转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞；e、筛选阳性克隆，得到表达miR-122的载体pSU6-miR-122质粒。该载体在抑制乙肝病毒的药物中的用途，抗乙肝病毒感染效率高，特异性强，对正常细胞无毒性，对乙肝病毒复制的抑制率为85.2%。
Description
技术领域：
本发明涉及分子生物学、病毒学和基因治疗领域，更具体涉及一种可用于表达miR-122载体的构建方法,该载体在抑制乙型肝炎病毒的药物中的用途。
背景技术：
乙型肝炎病毒（HBV) 是嗜肝DNA病毒（Hepadnavirus)科中哺乳动物病毒属的一员。HBV具有一个3.2kb的部分双链的基因组，包括4个开放型的阅读框架，分别为编码核壳的C基因、编码聚合酶的P基因、编码外膜蛋白的S基因和调节病毒基因转录水平的X蛋白。乙型肝炎病毒（HBV）感染可以引起急性和慢性肝病变。每年全世界死于由于乙肝病毒感染而导致的肝硬化或肝癌的人数超过1百万人。每年被该病毒感染的人数达5万人。全世界范围内，大约有20亿人被乙肝病毒感染过，有3亿5千万人是乙肝病毒的长期带病者。而中国则有1亿2千万人是病毒的长期携带者（刘崇柏等（1997）中国公共卫生学，13：515）。病毒病的治疗是一世界难题，没有很好的药物或方法。抗病毒药物的治疗已有近30 年的历史,由于病毒进入机体后,在宿主细胞内进行复制和繁殖,因此,能抑制病毒繁殖的药物对宿主细胞或机体有不同程度的损害,使得抗病毒药的发展缓慢。到目前为止,尚无令人完全满意的抗病毒药。如抗乙肝药物α干扰素是目前公认的治疗慢性乙型肝炎的首选药物,但其疗效仅可使25 %～40 %的病例获得有效答；拉米夫定对HBV DNA 的抑制作用及治疗HBV 感染的短期疗效已得到肯定，但长期应用可诱导HBV 产生耐药性。而近年来发展起来的microRNA技术在抑制病毒复制上效率高，特异性强，没有毒副作用。因而microRNA在抗病毒治疗上显示了诱人的前景。
MicroRNAs (miRNAs)是一种大小约21—25个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。研究发现miRNA的主要功能是调节生物体内在的与体生长、发育、疾病发生过程有关的基因的表达，据推测这种小分子调节着人类三分之一的基因。最新的研究结果表明：MiR-122是一种在肝脏组织中特异性表达的MicroRNA与病毒的复制有关。
发明内容：
本发明的目的是在于提供了一种可用于表达miR-122载体的构建方法，方法易行，操作简便，该载体能抑制乙型肝炎病毒复制.相比于化学合成miR-122,用载体表达更经济、更稳定，使用更方便。
本发明的另一个目的是在于提供了一种表达miR-122载体在制备或预防乙型肝炎病毒的药物中的用途，其最大的优点是抗乙型肝炎病毒感染效率高，特异性强，对正常细胞无毒性,抑制率为85.2%。
一种可用于表达miR-122的载体pSU6-miR-122的构建方法（抑制乙型肝炎病毒复制），其步骤是： （表达miR-122载体构建:请见图1)
a、化学合成寡核苷酸链，有义链：5’-GGATCCAGCTGTGGAGTGTCGAAATGGTGTTTGTGTCCAAACTATCAAACGCCATTTCAACACTAAATAGCTTTTTTGGAAA-3’
反义链：5‘-AGCTTTCCAAAAAAGCTATTTAGTGTTGAAATGGCGTTTGATAGTTTGGACACAAACACCATTTCGACACTCCACAGCTGG与有义链互补，且在5’端添加上AGCT以产生粘性突出末端.
b、 有义链、反义链退火,形成带BamHI和HindIII粘性末端的片段；
c、 将以上片段连接至载体pSilencer-2.1-U6（购自Ambion公司：载体由BamHI和HindIII双酶切）；
d、 转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞（Stbl3菌株购自Invitrogen公司）；
e、 筛选阳性克隆，并测序鉴定。得到能表达miR-122的载体pSU6-miR-122质粒。
该质粒转染HepG2.2.15细胞后，其乙型肝炎病毒表面抗原的表达量降低65-68%，乙型肝炎病毒E抗原的表达量降低77-80%，对病毒衣壳(capsid)相连结的乙型肝炎病毒基因组DNA（复制中间体）的抑制率为84.2-86.4%。
一种表达miR-122的载体pSU6-miR-122在制备治疗或预防（抑制）乙型肝炎病毒的药物中的用途，其步骤是：
1) miR-122抑制乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎病毒E抗原(HBeAg)表达：将 pSU6-miR-122转染HepG2.2.15细胞，24小时后用ELISA试剂盒检测HBsAg和HBeAg(检测试剂盒购于上海科华生物工程)。
2) miR-122抑制乙型肝炎病毒基因组的转录和病毒复制，用pSU6-miR-122与带1.3倍长HBV基因的表达载体pHBV1.3（chen y and wu j）共转染HepG2细胞，24小时后用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测与病毒衣壳(capsid)相连结的乙型肝炎病毒基因组DNA(检测试剂盒购于深圳匹基公司)。
发明优点和效果
本发明的目的是提供一种表达miR-122的载体的构建方法，这种载体能在细胞内抑制乙型肝炎病毒的复制，具有应用于制备抗乙型肝炎病毒药物的前景。其最大的优点是抗乙型肝炎病毒感染效率高，特异性强，对正常细胞无毒性，是极具潜在临床应用价值的生物制剂，为乙型肝炎病毒感染的有效治疗提供了新的途径和方法。对乙型肝炎病毒复制的抑制率为85.2%。
附图说明
图1为一种显示表达miR-122的载体pSU6-miR-122的构建流程图。
首先化学合成表达miR-122前体模版DNA片段的有义链和反义链，并将二者退火形成带BamHI和HindIII粘性末端的双链片段，再将这个片段与经BamHI和HindIII双酶切载体pSilencer-2.1-U6连接，构成表达miR-122的载体我们给他取名为pSU6-miR-122。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版）（New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,2005）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：
下面结合附图对本发明作进一步详细描述：
一种可用于表达miR-122载体pSU6-miR-122的构建方法，其步骤是：
a、 化学合成寡核苷酸链，有义链（SEQ ID NO.1）：5’-GGATCCAGCTGTGGAGTGTCGAAATGGTGTTTGTGTCCAAACTATCAAACGCCATTTCAACACTAAATAGCTTTTTTGGAAA-3’
反义链（SEQ ID NO.2）：5‘-AGCTTTCCAAAAAAGCTATTTAGTGTTGAAATGGCGTTTGATAGTTTGGACACAAACACCATTTCGACACTCCACAGCTGG与有义链互补，且在5’端添加上AGCT以产生粘性突出末端.
b、 有义链、反义链退火,形成带BamHI和HindIII粘性末端的片段；
c、 将b步骤获得的片段连接至载体pSilencer-2.1-U6（购自Ambion公司：载体由BamHI和HindIII双酶切）；
d、 转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞（Stbl3菌株购自Invitrogen公司）；
e、 筛选阳性克隆，并测序鉴定。得到能表达miR-122的载体pSU6-miR-122质粒。
该质粒转染HepG2.2.15细胞后，其乙型肝炎病毒表面抗原的表达量降低67.3%，乙型肝炎病毒E抗原的表达量降低78.6%，对病毒衣壳(capsid)相连结的乙型肝炎病毒基因组DNA（复制中间体）的抑制率为85.2%。
实施例2：
一种表达miR-122的载体pSU6-miR-122在制备治疗或预防乙型肝炎病毒的药物中的用途，其步骤是：
A、pSU6-miR-122抑制乙型肝炎病毒HBsAg和HBeAg表达：
B、将 pSU6-miR-122转染HepG2.2.15细胞，24小时后用ELISA试剂盒检测HBsAg和HBeAg(检测试剂盒购于上海科华生物工程)，HBsAg水平下降67.3%，HBeAg水平下降78.5%。
实施例3：
一种表达miR-122载体pSU6-miR-122在制备治疗或预防乙型肝炎病毒的药物中的应用，其步骤是：
A、pSU6-miR-122抑制乙型肝炎病毒基因组的转录和病毒复制，用pSU6-miR-122与带1.3倍长HBV基因的表达载体pHBV1.3共转染HepG2细胞；
24小时后用qRT-PCR检测与capsid相连结的乙型肝炎病毒基因组DNA（cccDNA）的水平下降85.2%(检测试剂盒购于深圳匹基公司)。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉大学
<120> 一种可用于表达miR-122载体pSU6-miR-122的构建方法及用途
<130> 一种可用于表达miR-122载体pSU6-miR-122的构建方法及用途
<160> 2
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ggatccagct gtggagtgtc gaaatggtgt ttgtgtccaa actatcaaac gccatttcaa 60
cactaaatag cttttttgga aa 82
<210> 2
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
agctttccaa aaaagctatt tagtgttgaa atggcgtttg atagtttgga cacaaacacc 60
atttcgacac tccacagctg g 81
Claims (2)
1.一种可用于表达miR-122载体pSU6-miR-122的构建方法，其步骤是：
a、化学合成寡核苷酸链，有义链：5’-GGATCCAGCTGTGGAGTGTCGAAATGGTGTTTGTGTCCAAACTATCAAACGCCATTTCAACACTAAATAGCTTTTTTGGAAA-3’
反义链：5‘-AGCTTTCCAAAAAAGCTATTTAGTGTTGAAATGGCGTTTGATAGTTTGGACACAAACACCATTTCGACACTCCACAGCTGG与有义链互补，且在5’端添加上AGCT以产生粘性突出末端；
b、 有义链、反义链退火,形成带BamHI和HindIII粘性末端的片段；
c、 将（b）步骤的片段连接至载体pSilencer-2.1-U6，载体由BamHI和HindIII双酶切；
d、 转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞；
e、 筛选阳性克隆，并测序鉴定，得到表达miR-122的载体pSU6-miR-122质粒。
2.权利要求1中所述的一种载体pSU6-miR-122在制备治疗或预防乙型肝炎病毒的药物中的应用。
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| CN 201110091757 CN102212555A (zh) | 2011-04-12 | 2011-04-12 | 一种可用于表达miR-122载体pSU6-miR-122的构建方法及用途 |
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Publications (1)
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| CN (1) | CN102212555A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN103088026A (zh) * | 2013-02-01 | 2013-05-08 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 抗乙型肝炎病毒人工miRNA及其组合 |
Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| WO2009156507A1 (en) * | 2008-06-27 | 2009-12-30 | Novartis Forschungsstiftung Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research | Prediction of antiviral therapy response |
| CN101954094A (zh) * | 2010-10-11 | 2011-01-26 | 天津医科大学 | miR-199a-3p在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用 |
-
2011
- 2011-04-12 CN CN 201110091757 patent/CN102212555A/zh active Pending
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