CN118265785A - 靶向腺苷激酶的反义寡核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明提供了靶向腺苷激酶前mRNA的反义寡核苷酸化合物。这些反义寡核苷酸可用于治疗一系列神经病学疾病，诸如癫痫或神经病理性疼痛。提供了使用本发明的反义寡核苷酸治疗神经病学疾病的组合物和方法。

Description

靶向腺苷激酶的反义寡核苷酸

技术领域

本发明提供了靶向腺苷激酶的新的反义寡核苷酸化合物。这些化合物可用于治疗神经病学疾病，诸如癫痫或神经病理性疼痛。

背景技术

癫痫是一种严重的慢性神经病学病症，其特征在于复发性自发癫痫发作，影响全球约5000万人。

目前可用的抗癫痫药物会控制三分之二的患者的癫痫发作，但可能对潜在的病理生理学没有效果。其余三分之一的癫痫患者要么具有耐药性，要么遭受目前可用药物的严重副作用。

脑部手术、迷走神经刺激、颅内刺激和生酮饮食代表用于避免在没有足够药物治疗效果的情况下患者癫痫发作的替代方案，但仅适用于有限数量的耐药性癫痫患者，因此大多数患者在没有有效治疗选择的情况下仍在维持原状。

癫痫的发展被认为涉及离子通道和神经递质受体的表达改变、突触重塑、发炎、胶质增生和神经元死亡等。然而，我们对细胞和分子机制的理解仍然不完整。除了切除手术外，没有治疗会预防、改变或治愈(“抗致癫痫”)癫痫。同样，对于癫痫持续状态(SE)或可能导致脑伤害和癫痫的脑损伤(例如中风或创伤)后的后天性癫痫，也没有此类治疗。

因此，对于专门针对癫痫、神经病理性疼痛和可能导致脑损伤的其它神经性损伤发展的过程以及克服上述问题中的一些的治疗或预防措施的尚未得以满足的需求很高。

腺苷和腺苷激酶

腺苷是脑中的一种具有良好特征的内源性抗惊厥剂和癫痫发作终止剂。腺苷影响癫痫发作的发生(发作发生)、癫痫的发展及其进展(癫痫发生)。腺苷代谢的适应不良性变化，特别地星形胶质细胞酶腺苷激酶(ADK)的表达增加，在癫痫发生中起着重要作用。(Weltha et al，2019，The role of adenosine in epilepsy，Brain Res Bull 2019September，page 1-22。)

ADK在调节嘌呤核苷腺苷的细胞内和间质浓度方面起到核心作用，其表现出强大的心脏保护和神经保护作用。癫痫发作或中风后，腺苷激酶的表达在脑中发生快速协调的变化，导致腺苷的急性激增，这有助于最小化对脑的损伤。在N-末端不同的两种ADK同种型在哺乳动物细胞中表达。代替ADK短的(ADK-S)同种型的前四个氨基酸，长的同种型(ADK-L)含有额外的20-21个氨基酸。ADK-L中的N末端延伸起到核定位信号的作用。因此，在这两种同种型中，ADK-L靶向细胞核，而ADK-S定位在细胞质中。(Cui et al，2011，MolecularCharacterization of Chinese Hamster Cells Mutants Affected in AdenosineKinase and Showing Novel Genetic and Biochemical Characteristics，BMCBiochemistry 2011。)

此外，ADK表达的调节异常和由此导致的腺苷内稳态的破坏与广泛的神经病学和神经精神病学病理有关。在脑中，ADK主要在星形胶质细胞中表达，并且星形胶质细胞ADK是用于预测和预防癫痫发作的一个有潜力的靶标。在由侧位液压冲击伤诱导的严重创伤性脑损伤(TBI)的大鼠模型中也已鉴定到星形胶质细胞增生症和相关的ADK过度表达。此外，ADK的表达水平在很大程度上决定了脑对中风影响的脆弱性。腺苷及其受体激动剂也增强了睡眠和睡眠强度，而诸如咖啡因或茶碱的拮抗剂则能诱导不眠。

根据Boison等人的研究，ADK过度表达与认知障碍之间的联系可能与神经系统病况具有病理相关性，在神经系统病况中，ADK过表达已得以证实(癫痫)或疑似(阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症)。精神分裂症的腺苷假说假定腺苷信号传导功能不良可能归因于精神分裂症的病理生理学。在糖尿病中，腺苷内稳态在多个组织中在很大程度上被改变。

此外，腺苷受体信号传导的内稳态在炎症的调节和促炎性细胞因子的释放中至关重要。腺苷受体信号传导的内稳态对IBD的慢性炎症反应也具有极其重要的意义。腺苷/ADK调节系统在癌症中的作用可取决于癌症的类型。在肝癌细胞中发现ADK活性降低，表明增加的腺苷可能针对肝癌提供选择性优势。(Boison et al.，2013，Adenosine Kinase：Exploitation for Therapeutic Gain，Pharmacol Rev 65：906-943，July 2013。)

腺苷受体

抑制性腺苷A1受体的激活对癫痫、慢性疼痛和脑缺血有益，而促进性A2A受体的抑制具有极大的神经保护作用。(Boison et al，2008，Adenosine as a neuromodulator inneurological diseases，Curr Opin Pharmacol，2008 February。)

腺苷是一种神经调节物质，其通过最丰富的抑制性腺苷A1受体(A1R)和不太丰富但广泛存在的促进性A2AR起作用。通常假设A1R在神经保护中起着关键作用，因为它们减少谷氨酸释放并使神经元超极化。(Rodrigo A.Cunha，2005，Neuroprotection by adenosinein the brain：From A1 receptor activation to A2A receptor blockade，PurinergicSignalling(2005)1∶111-134。)

通过抑制腺苷激酶或用鞘内选择性A3AR激动剂激活A3AR来恢复脊髓中的A3AR信号传导，会防止化疗诱导的神经病理性疼痛(CINP)的发生。(Wahlman et al，2018，Chemotherapy-induced pain is promoted by enhanced spinal adenosine kinaselevels via astrocyte-dependent mechanisms，Pain.2018 Jun；159(6)：1025-1034。)

癫痫、神经保护和精神障碍

腺苷具有抗惊厥和神经保护作用。(Patodia et al，2020，Adenosine kinase andadenosine receptors A1R and A2AR in temporal lobe epilepsy are involved withhippocampal sclerosis and an association exists with risk factors for SUDEP，Epilepsia，page 787-797。)

在动物模型和从各种病因的难治性癫痫患者切除的人脑组织两者中，使用腺苷激酶抑制剂的局灶性腺苷增强疗法已被证明对减少癫痫发作有效。除了减少癫痫发作，腺苷增强疗法还可以缓解副发病变，如睡眠、认知或抑郁等。具有降低的ADK的转基因小鼠对急性脑损伤诱导的癫痫发生具有抗性。(Wang et al，2020，Role of Adenosine KinaseInhibitor in Adenosine Augmentation Therapy for Epilepsy：A Potential NovelDrug for Epilepsy，Current Drug Targets，abstract。)

根据Boison et al.2006，腺苷是一种具有神经保护和抗惊厥特性的脑活动的抑制性调节剂。因此，基于细胞的腺苷递送很大程度上有望成为癫痫和中风的新疗法。(Boison et al，2013，Adenosine kinase，epilepsy and stroke：mechanisms andtherapies，Trends Pharmacol Sci，Abstract。)腺苷激酶在介导与神经精神病学疾病相关的成年期行为中也具有发展性作用。(Osborne et al，2018，Developmental role ofadenosine kinase for the expression of sex-dependent neuropsychiatricbehaviour，Neuropharmacology，2018 October。)

精神分裂症、自闭症、ADHD

一项由Hai-Ying Shen等人的研究(2012)发现，通过药物抑制腺苷激酶的腺苷增强在小鼠中表现出抑制精神病药样活性。此外，转基因小鼠中ADK的过度表达与精神分裂症相关联的注意力障碍有关。(Hai-Ying Shen et al 2012，Adenosine augmentationameliorates psychotic and cognitive endophenotypes of schizophrenia，J ClinInvest，page 2567-2577。)

疼痛

根据Otsuguro等人(2015)，腺苷激酶抑制剂是用于控制疼痛的潜在候选者。(Otsuguro et a1，.2015，An adenosine kinase inhibitor，ABT-702，inhibits spinalnociceptive transmission by adenosine release via equilibrative nucleosidetransporters in rat，neuropharmacology volume 97，abstract。)腺苷激酶抑制剂在组织超兴奋性位点提高抑制性神经调节物质腺苷的细胞外浓度，并在疼痛和炎症的动物模型中产生抗伤害感受作用。此外，腺苷激酶抑制剂会产生特异性的抗高敏痛作用。(Jarvis etal，2002，Comparison of the ability of adenosine kinase inhibitors andadenosine receptor agonists to attenuate thermal hyperalgesia and reducemotor performance in rats，Pharmacology Biochemistry and Behavior vol 73，abstract。)

腺苷激酶抑制剂在各种伤害感受的动物模型中显示出抗伤害感受活性，并且新的腺苷激酶抑制剂A-134974有效地减少触觉异常性疼痛。(Zhu et al，2001，A-134974：anovel adenosine kinase inhibitor，relieves tactile allodynia via spinal sitesof action in peripheral nerve injured rats，Brain Research vol 905，abstract。)腺苷激酶抑制剂也已被证明在动物模型中提供有效的抗伤害感受、抗炎和抗惊厥活性，从而表明它们对疼痛、炎症、癫痫以及与细胞创伤和炎症相关的可能的其它中枢和外周神经系统疾病的潜在治疗效用。(Gomtsyan et al，2004，Non-nucleoside inhibitors ofadenosine kinase，Current Pharmaceutical Design，abstract。)

根据Bauser等人(2004)，腺苷激酶抑制对于多种病况是一种有吸引力的治疗方法，例如神经退行性变、癫痫发作、缺血、炎症和疼痛。(Bauser er al， 2004，Discoveryand optimization of 2-aryl oxazolo-pyrimidines as adenosine kinase inhibitorsusing liquid phase parallel synthesis，Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，abstract。)

脑炎

Rasmussen脑炎是一种罕见的神经病学病症，其特征在于大脑皮层和其它结构(最显著地海马体)的单侧炎症、进行性认知劣化和药物抵抗性局灶性癫痫。Luan等人表明，腺苷激酶的过度表达是Rasmussen脑炎的常见病理学标志，并且表明Rasmussen脑炎中神经元A1R的上调对于预防癫痫发作的扩散至关重要。此外，腺苷作为一种内源性神经调节物质，具有抗惊厥和抗炎作用，并且可以在癫痫继发认知受损时恢复认知功能。腺苷内稳态的破坏已与癫痫、炎症和认知功能障碍相关联。已经证明，腺苷受体和主要腺苷清除酶ADK的改变会造成癫痫中的腺苷内稳态的破坏。(Luan et al，2017，Upregulation of NeuronalAdenosine A1 Receptor in Human Rasmussen Encephalitis，J Neuropathol ExpNeurol vol 76，page 720-731。)

血管生成

靶向腺苷激酶以升高细胞内腺苷促进体外内皮细胞增殖和迁移以及离体血管发芽(sprouting)。此外，内皮特异性腺苷激酶敲除小鼠增加了视网膜血管生成，加速了伤口愈合，并对后肢缺血性损伤具有保护作用。(Xu et al.，2017，Intracellular adenosineregulates epigenetic programming in endothelial cells to promoteangiogenesis，EMBO Molecular Medicine，page 1263-1278。)

癌症

一项由Huang等人(2015)的研究表明，腺苷激酶参与了神经胶质瘤的进展，并且表明肿瘤周围组织中升高的腺苷激酶水平可能与神经胶质瘤中的癫痫有关。(Huang et al，2015，Adenosine deaminase and adenosine kinase expression in human glioma andtheir correlation with glioma-associated epilepsy，Molecular Medicine Reports12，page 6509-6516。)

糖尿病、炎症、心血管病症、肾脏病症和肺部病症

根据Pye等人(2014)，腺苷通过激活腺苷A2A受体在心血管疾病中提供抗炎作用；然而，腺苷的生理作用可能由于其被腺苷激酶磷酸化而受到限制。用腺苷激酶抑制剂ABY702的治疗降低了糖尿病小鼠的血糖水平，减少了糖尿病小鼠中的蛋白尿，肾小球损伤、肾炎的标志物以及足糖萼蛋白排泄水平。此外，降低了氧化应激指数。(Pye et al，2014，Adenosine Kinase Inhibition Protects The Kidney Against Streptozotocin-Induced Diabetes Through Anti-inflammatory and Anti-oxidant Mechanisms，Pharmacol Res。)

A1腺苷受体的激活通过改善肾脏血液动力学改变、减少肾小管坏死来针对急性肾损伤提供保护，并且其抑制可能促进慢性肾脏疾病模式中的毒素或药物代谢产物的清除。(Pandey et al，2021，“Adenosine an old player with new possibilities in kidneydiseases”：Preclinical evidences and clinical perspectives，Life Sciences vol265，abstract。)

在许多治疗领域，腺苷功能的调节被视为一种治疗选项，例如用于神经病理性疼痛、中风、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)和睡眠促进。(Knutsen et al，2007，TherapeuticAreas I：Central Nervous System，Pain，Metabolic Syndrome，Urology，Gastrointestinal and Cardiovascular，Comprehensive Medicinal Chemistry II，2007，https：//www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/adenosine-kinase-inhibitor，accessed 21-4-2021。)

发明内容

由于许多疾病无法以充分的方式得以治疗，或者在目前可用的治疗会导致严重的副作用的情况下，对神经病学疾病的改善性治疗的尚未得以满足的医疗需求很高。本发明的化合物是ADK的有效抑制剂，因此可用于治疗神经病学疾病诸如癫痫。在一些实施方式中，本发明的化合物抑制ADK的短同种型和长同种型两者。

附图说明

图1.基于ADK-LS敲低功效从最高敲低水平到最低敲低水平对ADK-LS反义寡核苷酸的排名。水平虚线描绘了经模拟处理的对照细胞中ADK-LS的水平(没有ADK-LS敲低)。黑色线表示70％敲低，并且灰色线表示80％敲低。竖直虚线示出了被选择用于进一步研究的ADK-LS反义寡核苷酸的截止点。n，N＝1，1-2，平均值±SEM。

图2.基于ADK-LS敲低功效从最高敲低水平到最低敲低水平对所选择的ADK-LS反义寡核苷酸的排名。水平虚线描绘了经模拟处理的对照细胞中ADK-LS的水平(没有ADK-LS敲低)。而灰色线示出了80％敲低。n，N＝2，3-4，平均值±SEM。

图3.剂量反应研究。水平虚线描绘了经模拟处理的对照细胞中ADK-LS的水平(没有ADK-LS敲低)，并且灰色线示出了80％敲低。n，N＝1-2，2-4，平均值±SEM。

图4.剂量反应曲线和IC₅₀值，3参数非线性曲线拟合，n，N＝2，4；描述了所有的技术重复。水平虚线描绘了50％敲低。

图5.用Seq ID 21处理的细胞的差异基因表达分析。火山图示出了经Seq ID 21和模拟处理的细胞之间的转录物水平，从而将经反义寡核苷酸处理的组和经模拟处理的组之间RNA表达的变化与差异表达的显著性相关联。x轴表示表达的相对变化，而y轴表示显著性。每个点表示特定的转录物。黑色点表示不显著的变化，而灰色点显示显著的值。ADK用黑色环突出显示。n＝3

图6.用Seq ID 71处理的细胞的差异基因表达分析。火山图示出了经Seq ID 71和模拟处理的细胞之间的转录物水平，从而将经反义寡核苷酸处理的组和经模拟处理的组之间RNA表达的变化与差异表达的显著性相关联。x轴表示表达的相对变化，而y轴表示显著性。每个点表示特定的转录物。黑色点表示不显著的变化，而灰色点显示显著的值。ADK用黑色环突出显示。n＝3

图7.ADK(两种同种型)的归一化mRNA表达值，n＝3

图8.反义寡核苷酸SEQ ID NO 21的潜在脱靶点的计算机分析，用于预测剪接的转录组(细胞质的；第1-4列)和未剪接的转录组(细胞核的，第5-8列)内的所有潜在靶位点。这是针对1)靶mRNA中与上述反义寡核苷酸(SEQ ID NO 21)的完全匹配结合位点，以及2)具有1、2、3或4个错配(INDEL)的结合位点进行的。将得到的预测脱靶点清单与RNA测序数据进行比较(上表，3nM和下表，30nM)，以确定是否有任何预测脱靶mRNA(第1行)在数据集中被表达(第2行)，并接着评估是否有任何表达的脱靶转录物被差异表达(第3行)，以及在数据集中此类转录物是否被上调(第4行和第5行)或者被下调(第6行和第7行)。

图9.反义寡核苷酸SEQ ID NO 71的潜在脱靶点的计算机分析，用于预测剪接的转录组(细胞质的；第1-4列)和未剪接的转录组(细胞核的，第5-8列)内的所有潜在靶位点。这是针对1)靶mRNA中与上述反义寡核苷酸(SEQ ID NO 71)的完全匹配结合位点，以及2)具有1、2、3或4个错配(INDEL)的结合位点进行的。将得到的预测脱靶点清单与RNA测序数据进行比较(上表，3nM和下表，30nM)，以确定是否有任何预测脱靶mRNA(第1行)在数据集中被表达(第2行)，并接着评估是否有任何表达的脱靶转录物被差异表达(第3行)，以及在数据集中此类转录物是否被上调(第4行和第5行)或者被下调(第6行和第7行)。

具体实施方式

在描述本发明的实施方式时，为了清楚起见，将采用特定的术语。然而，本发明并不旨在限于如此选择的特定术语，并且应当理解，每个特定术语包括以类似方式操作以实现类似目的的所有技术等同物。

术语“治疗有效量”，或“有效量”或“有效剂量”是指一定量的治疗剂，其给需要该治疗剂的个体赋予所需的治疗效果。有效量可在个体之间不同，这取决于待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的分类组、组合物的配方、施用方法、对个体医疗状况的评估以及其它相关因素。

术语“治疗”是指治疗药物的任何施用，其中该治疗药物包括部分或完全治愈或减轻给定疾病的一种或多种症状或特征的反义寡核苷酸。

在本发明的上下文中，术语“腺苷激酶转录物”是编码腺苷激酶的至少一种同种型的前mRNA或mRNA或其它转录物。即SEQ ID NO 1，其为腺苷激酶前mRNA。

如本文使用的术语“化合物”是指包含根据本发明的寡核苷酸的化合物。在一些实施方式中，除了本发明的寡核苷酸之外，化合物还可以包含其它元素。在非限制性实例中，此类其它元件可以是与寡核苷酸缀合或以其它方式结合的递送载体。

“反义寡核苷酸”是指具有允许与靶核酸的相应区域或区段杂交的核碱基序列的单链寡核苷酸。

在一些情况下，本发明的反义寡核苷酸是“混合聚体(mixmer)”，并且在一些情况中，本发明的反义寡核苷酸是“间隔聚体(gapmer)”。

“混合聚体”是包含核苷类似物(诸如LNA和DNA核苷)的混合物的反义寡核苷酸，并且其中反义寡核苷酸不包含具有多个核苷的内部区域，诸如不超过4或5个DNA核苷酸的连续链段。混合聚体不能募集RNA酶，诸如RNA酶H，而是通过与靶RNA结合并从而阻断其正常功能来发挥其作用。

“间隔聚体”是一种包含核苷的至少6或7个DNA核苷酸的连续链段(侧接有包含亲和性增强型核苷酸类似物(诸如LNA核苷)的核苷酸链段)的反义寡核苷酸。间隔聚体能够募集RNA酶，诸如RNA酶H，其中包含内部区域的核苷在化学上与包含外部侧翼的一个或多个核苷不同。

“核苷类似物”由例如Freier&Altmann；Nucl.Acid.Res.，1997，25，4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development，2000，3(2)，293-213进行描述，并且合适且优选的核苷类似物的实例由WO2007031091提供，它们通过引用并入本文。

“5-甲基胞嘧啶”是指用附接至5’位置的甲基修饰的胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶是一种通常取代反义寡核苷酸中的胞嘧啶的经修饰的核碱基。在本发明范围内的是，在本发明的寡核苷酸中，胞嘧啶被5-甲基胞嘧啶替换。

“2'-O-甲氧基乙基”(也称为2'-MOE和2'-O(CH～)～-OCH3)是指在呋喃糖环的2’位置的O-甲氧基-乙基修饰。

“2'-MOE核苷”(也称为2'-O-甲氧基乙基核苷)是指包含经2'-MOE修饰的糖部分的核苷。

“锁核酸”或“LNA”通常被称为不可触及的RNA，并且是一种经修饰的RNA核碱基。LNA核碱基的核糖部分被连接2’氧和4’碳的额外桥修饰。与传统的DNA或RNA寡核苷酸相比，LNA寡核苷酸对其互补链提供显著增加的亲和性。在一些方面，双环核苷类似物是LNA核苷酸，因此这些术语可以互换使用，并且在此类实施方式中，两者的特征在于核糖糖环的C2'和C4'之间存在接头基团(诸如桥)。当在本上下文中使用时，术语“LNA单元”、“LNA单体”、“LNA残基”、“锁核酸单元”或“锁核酸单体”或“锁核酸残基”是指双环核苷类似物。尤其在WO99/14226、WO 00/56746、WO 00/56748、WO 01/25248、WO 02/28875、WO 03/006475、WO2015071388和WO 03/095467中对LNA单元进行了描述。

“β-D-氧基LNA”是优选的LNA变体。

“双环核酸”或“BNA”或“BNA核苷”是指在核苷糖单元的4’和2’位置之间具有连接两个碳原子的桥，从而形成双环糖的核酸单体。此类双环糖的实例包括但不限于A)pt-L-亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')LNA，(B)P-D-亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')LNA，(C)亚乙基氧基(4’-(CH2)2-O-2')LNA，(D)氨基氧基(4'-CH2-O-N(R)-2')LNA和(E)氧基氨基(4'-CH2-N(R)-O-2’)LNA。

如本文所使用的，LNA化合物包括但不限于在糖的4’和2’位置之间具有至少一个桥的化合物，其中每个桥独立地包含1个或2-4个连接基团，该连接基团独立地选自-[C(R～)(R2)]-、-C(R～)＝C(R2)-、-C(R～)＝N、-C(＝NREM)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(Ri)q-、-S(＝O)和-N(R&)-；其中：x是0、1或2；n是1、2、3或4；每个R&和R2独立地是H、保护基、羟基、C＞＞C＞＞烷基、连接2’氧原子和4’碳原子的取代的C＞＞(-CHz-)基团，对此使用术语亚甲基氧基(4'-CH&-O-2')LNA。

此外，在双环糖部分在该位置具有亚乙基桥接基团的情况下，使用亚乙基氧基(4'-CH&CH&-O-2')LNA。n-L-亚甲基氧基(4'-CH&-O-2')(亚甲基氧基(4'-CH&-O-2')LNA的异构体)也包含在如本文所使用的LNA的定义内。

在一些实施方式中，核苷单元是选自β-D-氧基-LNA、α-L-氧基-LNA、β-D-氨基-LNA、α-L-氨基-LNA、β-D-硫代-LNA、α-L-硫代-LNA、5’-甲基LNA、β-D-ENA和α-L-ENA的清单中的LNA单元。

“cEt”或“限制性乙基”是指包含连接4’-碳和2’-碳的桥的双环糖部分，其中该桥具有式：4'-CH(CHq)-O-2’。

“限制性乙基核苷”(也称为cEt核苷)是指包含双环糖部分的核苷，该双环糖部分包含4'-CH(CH3)-O-2'桥。cEt及其一些特性在Pallan et al.Chem Commun(Camb).2012，August 25；48(66)：8195-8197中进行了描述。

“三环(tc)-DNA”属于构象限制性DNA类似物的类别，其对DNA和RNA表现出增强的结合特性。结构和生产方法在Renneberg et al.Nucleic Acids Res.2002 Jul 1；30(13)：2751-2757中可见。

如本文所提及的“2’-氟”是在糖环的2’位置包含氟基团的核苷。2’-氟化核苷酸在Peng et al.J Fluor Chem.2008 September；129(9)：743-766中进行了描述。

如本文所提及的“2'-O-甲基”是包括在糖环的2’位置包含-OCH3基团的糖的核苷。

在WO2013036868(通过引用并入本文)中描述了如本文所提及的“构象限制性核苷(CRN)”及其合成。CRN是经糖修饰的核苷，其中，与LNA类似，化学桥连接核糖的C2'和C4'碳。然而，在CRN中，C2'-C4'桥比在LNA分子中长一个碳。CRN的核糖中的化学桥将核糖锁定在固定位置，这进而限制了核碱基和磷酸基团的灵活性。在基于RNA或DNA的寡核苷酸内的CRN取代具有增加杂交亲和性和增强对核酸酶降解的抗性的优点。

如本文所提及的，“非锁定核酸”或“UNA”通常是非锁定核酸，其中核糖的C2-C3 C-C键已被去除，形成非锁定的“糖”残基(参见Fluiter et al.，Mol.Biosyst.，2009，10，1039，通过引用并入本文，和Snead et al.Molecular Therapy-Nucleic Acids(2013)2，e103；)。

在本发明的上下文中，“RNA治疗性化合物”是包含与靶RNA互补的连续核苷酸序列的化合物。RNA治疗性化合物可以是双链小干扰RNA(siRNA或dsRNA)或单链反义寡核苷酸。通过与靶RNA结合，RNA治疗性化合物能够阻断或调节靶RNA的表达。可以通过亲和性增强型核苷酸类似物或通过增加化合物稳定性的核苷酸间键对RNA治疗性化合物进行化学修饰。RNA治疗性化合物还可以包含甲基化胞嘧啶以抑制免疫刺激。

在本发明的上下文中，“基序”是反义寡核苷酸的未经修饰的序列。SEQ ID NO 83-161是SEQ ID NO 2-80的经修饰的反义寡核苷酸化合物的基序序列。

“靶区”是指一种或多种反义化合物所靶向的靶核酸的一部分。靶区是本发明的一部分，即SEQ ID NO 164-205是具有适合用根据本发明的治疗性反义寡核苷酸靶向的序列的靶区。

如本文所使用的“靶向递送”是指以下递送：其中反义寡核苷酸已经以促进在特定组织或细胞中的有效递送的方式进行配制，或者其中反义寡聚核苷酸已经以其它方式被例如修饰为包含靶向部分，或已经以其它方式被修饰以促进在特定靶细胞中的摄取。

本发明的反义寡核苷酸被设计为靶向腺苷激酶(ADK)。

如本文中使用的术语“腺苷激酶相关的神经病学疾病”是指其中疾病病理学与腺苷激酶活性的上调相关联，或其中腺苷激酶活性的下调将有益于疾病的治疗的疾病。

化合物

人ADK基因编码14个转录物，其中10个转录物是蛋白质编码型的，并且因此是反义寡核苷酸或siRNA的潜在靶标。设计了许多ASO以靶向ADK前mRNA(SEQ ID NO 1)。

在最广泛的意义上，本发明提供了与腺苷激酶(ADK)前mRNA(SEQ ID NO：1)互补的反义寡核苷酸或siRNA，其包含长度为10-30个核苷酸的序列，其中反义寡核苷酸包含至少一种亲和性增强型核苷酸类似物，并且其中所述反义寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯或类似的核苷间键。在一些实施方式中，本发明的反义寡核苷酸具有硫代磷酸酯核苷间键的替代物，诸如骨架可以是另一种类型的骨架，例如磷酸二酯键、磷酸三酯键、甲基膦酸酯键、氨基磷酸酯键(phosphoramidate linkage)、或它们的组合。在优选实施方式中，替代的核苷骨架适用于反义寡核苷酸的医疗用途。

在一些实施方式中，本发明的反义寡核苷酸被设计为靶向多于一种编码ADK形式的蛋白质。在优选实施方式中，本发明的反义核苷酸被设计为靶向至少两种编码ADK RNA的蛋白质。在最优选的实施方式中，本发明的反义寡核苷酸被设计为靶向ADK-前mRNA以下调诸如敲低至少ADK-S和ADK-L的表达。

例如，构建ASO以靶向SEQ ID NO：1的核苷酸26138-26158(SEQ ID NO 164)、28854-28871(SEQ ID NO 165)、31591-31612(SEQ ID NO 166)、49618-49648(SEQ ID NO167)、73335-73350(SEQ ID NO 168)、107401-107420(SEQ ID NO 169)、120681-120698(SEQ ID NO 170)、131066-131085(SEQ ID NO 171)、131102-131121(SEQ ID NO 172)、157279-157300(SEQ ID NO 173)、163465-163495(SEQ ID NO 174)、182053-182069(SEQID NO 175)、229825-229843(SEQ ID NO 176)、230316-230332(SEQ ID NO 177)、230388-230405(SEQ ID NO 178)、230484-230505(SEQ ID NO 179)、243036-243055(SEQ ID NO180)、243075-243090(SEQ ID NO 181)、266808-266823(SEQ ID NO 182)、267374-267393(SEQ ID NO 183)、267615-267634(SEQ ID NO 184)、288247-288266(SEQ ID NO 185)、302286-302305(SEQ ID NO 186)、370312-370331(SEQ ID NO 187)、374190-374206(SEQID NO 188)、404971-404990(SEQ ID NO 189)、405025-405044(SEQ ID NO 190)、411523-411541(SEQ ID NO 191)、431656-431673(SEQ ID NO 192)、434586-434605(SEQ ID NO193)、438147-4381 89(SEQ ID NO 194)、438340-438359(SEQ ID NO 195)、441016-441035(SEQ ID NO 196)、449173-449194(SEQ ID NO 197)、451654-451686(SEQ ID NO 198)、494676-494696(SEQ ID NO 199)、512508-512527(SEQ ID NO 200)、512544-512563(SEQID NO 201)、519054-519071(SEQ ID NO 202)、531984-532003(SEQ ID NO 203)、532784-532822(SEQ ID NO 204)和540164-557611(SEQ ID NO 205)。ASO的示例性序列在表1中进行了描述。ASO被设计为募集用于靶RNA切割的RNA酶H的间隔聚体。在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸与SEQ ID NO：164-205中的任一个互补。在一些实施方式中，本发明的反义寡核苷酸与SEQ ID NO：164-205中的任一个互补，并且能够调节、下调或敲低ADK-L和ADK-S两者的表达。在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸由基序组成或包含基序，该基序选自SEQ ID NO：83-161中任一个。在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸由基序组成或包含基序，该基序选自SEQ ID NO：83-161中任一个，并且包含至少一种亲和性修饰型核苷酸类似物和至少一种改变的核苷间键，诸如硫代磷酸酯键。

在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸是间隔聚体，其中反义寡核苷酸包含至少五个连续DNA核苷酸的连续链段。用于医疗目的的反义寡核苷酸的尺寸事关紧要，因此根据本发明的反义寡聚核苷酸针对此类用途被设计为有用。在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸长度为10-30个核苷酸，并且在一些实施方式中，反义寡核苷酸的长度为14-20个，诸如14-19个核苷酸。

反义寡核苷酸的功效取决于稳定性、对靶RNA的亲和性和其它因素。在反义寡核苷酸中存在亲和性增强型核苷类似物(诸如LNA)提供了此类优点。在优选实施方式中，在本发明的反义寡核苷酸中使用的亲和性增强型核苷酸类似物选自LNA、三环-DNA、2’-氟、2'-O-甲基、2’甲氧基乙基(2'MOE)、2’-环乙基(cET)、UNA、2’氟和构象限制性核苷(CRN)的清单。在一些实施方式中，此类寡核苷酸可以包含LNA、DNA以及三环-DNA、2’-氟、2'-O-甲基、2’甲氧基乙基(2'MOE)、2’环乙基(cET)、UNA、2’氟和构象限制性核苷(CRN)中的一个或多个的组合。

在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸包含至少一个LNA。在一些实施方式中，反义寡核苷酸包含20-55％的LNA。在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸是LNA/DNA寡核苷酸，但还包含一个或多个核苷，该核苷是三环-DNA、2’-氟、2’-O-甲基、2’甲氧基乙基(2'MOE)、2’环乙基(cET)、UNA、2’氟和构象限制性核苷(CRN)中的任一个。

在一些优选实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸包含LNA，其中LNA是β-D-氧基-LNA。

表1包含所选择的序列的ASO设计的非限制性实例。相同的方法可以应用于本文公开的任何其它序列。间隔聚体被构建为包含锁核酸-LNA(大写字母)。例如，间隔聚体可以在5’端和3’端具有β-脱氧LNA，并具有硫代磷酸酯骨架。但LNA也可以被任何其它核苷酸类似物取代，并且骨架可以是其它类型的骨架(例如，磷酸二酯键、磷酸三酯键、甲基膦酸酯键、氨基磷酸酯键或它们的组合)。在表1中，在化合物命名中，大写字母表示经修饰的核苷酸，诸如LNA核苷酸(β-D-氧基、α-L-氧基、β-D-氨基或β-D-硫代-LNA或其它经修饰的核苷酸，诸如cEt、cMOE、UNA或ENA)，并且小写字母表示DNA核苷酸。因此，由TCTttcctacttaaGG(SEQ IDNO：30)表示的序清单示具有5'-T和3’-G的3-11-2 16聚体(16mer)修饰的核苷酸-DNA-经修饰的核苷酸间隔聚体，诸如3-11-2 LNA-DNA-LNA间隔聚体。一些ASO可以是如本文其它地方所述的交替侧翼间隔聚体。在一些实施方式中，具有9个核苷酸间隔的交替侧翼间隔聚体的所选择的实例为SEQ ID NO 5、21和51。

在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸被设计为使得所有的核苷间键是硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，本发明提供了一系列有效的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸是SEQ ID NO 2-80中的任一个。在一些实施方式中，本发明提供了一种选自SEQ IDNO 4、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 37、SEQ ID NO 50、SEQ IDNO51、SEQ ID NO 53、SEQ ID NO 59、SEQ ID NO 60、SEQ ID NO 63、SEQ ID NO 66、SEQ IDNO 67、SEQ ID NO 68、SEQ ID NO 69、SEQ ID NO 70、SEQ ID NO 71、SEQ ID NO 72、SEQ IDNO 73、SEQ ID NO 74、SEQ ID NO 75、SEQ ID NO 76、SEQ ID NO 77、SEQ ID NO 78、SEQ IDNO 79和SEQ ID NO 80(本身)的清单的反义寡核苷酸，以及包含此类反义寡核苷酸的缀合物，包含此类反义寡核苷酸的组合物，和它们用于治疗的预期用途，如在本申请中所述的。此外，使用本发明的反义寡核苷酸的治疗方法也被本发明涵盖。

在表1中，所列出的ASO总是沿5’至3’的方向进行描绘。因此，ASO的5’端与表中的前mRNA“结束”编号杂交，而ASO的3’端与表中的前mRNA“起始”编号杂交。在一些实施方式中，本发明的反义寡核苷酸包含基序或由基序组成，该基序为SEQ ID NO：83-161中任一个的基序。在一些实施方式中，本发明的反义寡核苷酸包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：2-80中任一个的化合物。

表1：与SEQ ID NO：1互补的连续核碱基序列基序(SEQ ID NO 83-161)以及基于基序序列设计的特异性ASO化合物(SEQ ID NO 2-80)的清单。

在“ASO化合物”中，大写字母是核苷酸类似物，诸如LNA，诸如β脱氧-LNA。小写字母表示DNA。C可以是5’甲基-胞嘧啶。在一个实施方式中，SEQ ID NO 2-80中的所有核苷间键是硫代磷酸酯。在一个实施方式中，SEQ ID NO 2-80中的所有核苷间键是硫代磷酸酯，大写字母是LNA，诸如β脱氧LNA，小写字母表示DNA并且C’是5’甲基-胞嘧啶。

在一些实施方式中，本发明的化合物是siRNA。在一些实施方式中，siRNA包含经修饰的核苷酸。在一些实施方式中，经修饰的核苷酸选自以下的组：脱氧核苷酸、3’-末端脱氧胸苷(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2’-氟修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、非锁定核苷酸、构象限制性核苷酸、限制性乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、2'-C-烷基修饰的核苷酸、2’-羟基修饰的核苷酸、2’-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、吗啉基核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、1，5-失水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包含5’-硫代磷酸酯基团的核苷酸、包含5’-甲基膦酸酯基团的核苷酸、包含5’-磷酸酯或5’磷酸酯模拟物的核苷酸、包含膦酸乙烯酯的核苷酸、包含腺苷乙二醇核酸(GNA)的核苷酸、包含胸苷乙二醇核酸(GNDA)S-异构体的核苷酸、包含2-羟基甲基-四氢呋喃-5-磷酸酯的核苷酸、包含2’-脱氧胸苷-3’磷酸酯的核苷酸、包含2’-脱氧鸟苷-3’-磷酸酯的核苷酸和连接到胆固醇基衍生物和十二烷酸双癸酰胺基团的末端核苷酸；以及它们的组合。

在一些实施方式中，本发明的siRNA包含经修饰的核苷酸，该核苷酸选自2’-脱氧-2'-氟修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、3’-末端脱氧胸苷核苷酸(dT)、锁核苷酸、无碱基核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、吗啉基核苷酸、包含氨基磷酸酯的核苷酸以及包含非天然碱基的核苷酸。

组合物和用途

本发明的化合物用于组合物中，诸如本发明的药物组合物中，并用作药物，以及用于治疗、减轻、改善、抢先性(pre-emptive)治疗、预防性、疾病改变性或治愈性治疗本文公开的疾病，诸如神经病学病症，包括癫痫。在一些实施方式中，本发明的抗腺苷激酶化合物是预防性的、疾病改变性的、治愈性的、减少疾病的症状(包括改善的癫痫发作控制以及减少焦虑和抑郁以及认知障碍)。

在一些实施方式中，本发明的化合物被包含在组合物，诸如用于治疗疾病的药物组合物中，该疾病是其中腺苷激酶活性的调节有益于疾病或疾病参数的预防性、治愈性或疾病改变性治疗、预防、减轻或改善的疾病。在一些实施方式中，治疗、预防、减轻或改善是治愈性的。在一些实施方式中，治疗、预防、减轻或改善是疾病改变性的。在一些实施方式中，治疗、预防、减轻或改善是预防性的。

可由化合物和组合物治疗、减轻、改善、抢先性治疗或预防性治疗的疾病在非限制性实例中包括中枢神经系统(CNS)或外周神经系统(PNS)的疾病，包括神经病学病症、神经退行性病症、神经发育障碍或精神病学疾病。在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸或组合物用作神经保护剂。

在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸或组合物用于治疗、减轻、抢先性治疗或预防CNS或PNS的疾病、神经病学病症、神经退行性病症、神经发育障碍、与细胞创伤和炎症相关的中枢和外周神经系统疾病、神经元损伤、海马损伤、创伤性脑损伤、记忆障碍、海马硬化症、帕金森病、多发性硬化症、急性脊髓损伤、肌萎缩性侧索硬化症、共济失调、贝尔氏麻痹、腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie Tooth)、头痛、Horton头痛、偏头痛、皮克病、进行性核上性麻痹、多系统变性、运动神经元疾病、亨廷顿病、朊病毒疾病、克雅氏症(creutzfeldt-jakob disease)、皮质基底节变性、原发性进行性失语症或它们的症状或影响。

在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸或组合物用于治疗癫痫。

在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸或组合物用于治疗癫痫发作。

在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸或组合物用于治疗、减轻、抢先性治疗或预防癫痫和/或癫痫发作，优选地治疗抗性癫痫，获得性、遗传性和/或特发性癫痫，治疗抵抗性癫痫综合征，耐药性癫痫，药学抵抗性局灶性癫痫，自发性癫痫发作，治疗抵抗性癫痫发作，局灶性癫痫，全身性癫痫或癫痫持续状态。

在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸或组合物用于治疗、减轻、抢先性治疗或预防癫痫、耐药性癫痫、药物抵抗性局灶性癫痫、癫痫发作、自发性癫痫发作、治疗抵抗性癫痫发作、局灶性癫痫(优选地其中所述局灶性癫痫集中在额叶、顶叶、枕叶或颞叶)、全身性癫痫(优选地其中所述全身性癫痫选自失神性癫痫、肌阵挛性癫痫发作、强直-阵挛性癫痫发作、强直性癫痫发作、失张力性癫痫发作、阵挛性癫痫发作和肌痉挛)、癫痫持续状态、由急性脑损伤诱导的癫痫发生、常染色体显性遗传的夜发性额叶癫痫、缓慢睡眠期间的持续棘波、dravet综合征、中风后发展的癫痫、癫痫性脑病、痴笑样癫痫、失神性癫痫、良性新生儿癫痫发作、Jeavons综合征、青少年肌阵挛性癫痫、Landau-Kleffner综合征、Lennox-Gastaut综合征、内侧颞叶癫痫、肌阵挛性站立不能性癫痫(myoclonic astaticepilepsy)、Ohtahara综合征、Panayiotopoulos综合征、PCDH19综合征、伴有中央颞部棘波的良性儿童癫痫、Sturge-Weber综合征、症状性局灶性癫痫、短暂性癫痫性健忘症和West综合征和/或胶质瘤相关癫痫。

在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸或组合物用于治疗、减轻、抢先性治疗或预防疼痛，优选地其中所述疼痛是慢性疼痛、神经病理性疼痛、化疗诱导的神经病理性疼痛、偏头痛、头痛、痛觉过敏、异常性疼痛和/或纤维肌痛。

在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸或组合物用于治疗疼痛。

在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸或组合物用于治疗、减轻、抢先性治疗或预防疼痛、慢性疼痛、神经病理性疼痛、化疗诱导的神经病理性疼痛、偏头痛(包括具有先兆的偏头痛和没有先兆的偏头痛)、原发性头痛、紧张性头痛、集群性头痛、Horton头痛、慢性日常头痛、窦性头痛、创伤后头痛、运动性头痛、持续性偏头痛、睡眠性头痛、痛觉过敏、热性痛觉过敏、异常性疼痛、触觉异常性疼痛和/或纤维肌痛。

在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸或组合物用于治疗、减轻、抢先性治疗或预防精神障碍、认知障碍、睡眠障碍、心血管障碍、呼吸障碍、癌症、肾脏病症、炎症或代谢障碍。

在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸或组合物用于治疗、减轻、抢先性治疗或预防精神障碍、神经精神病性障碍、焦虑、抑郁、双相情感障碍、注意力缺陷多动障碍、注意力缺陷障碍、自闭症、阿斯伯格综合征、Tourette综合征、精神分裂症、偏执型精神分裂症、青春型精神分裂症、紧张型精神分裂症、未分化型精神分裂症、残余型精神分裂症、单纯性精神分裂症或未指明型精神分裂症。

在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸或组合物用于治疗、减轻、抢先性治疗或预防认知障碍、认知损害、痴呆、阿尔茨海默病、血管性痴呆、额颞叶痴呆或路易体痴呆。

在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸或组合物用于治疗、减轻、抢先性治疗或预防睡眠障碍。

在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸或组合物用作睡眠调节剂。

在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸或组合物用于促进睡眠。

在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸或组合物用于治疗、减轻、抢先性治疗或预防心血管病症、外周动脉疾病、术后心房颤动、心力衰竭、慢性心力衰竭、脑出血诱导的脑损伤、中风、脑缺血或局部缺血。

在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸或组合物用于治疗、减轻、抢先性治疗或预防呼吸系统病症、哮喘或慢性阻塞性肺病。

在一些实施方式中，本发明的反义寡核苷酸或组合物用于治疗、减轻、抢先性治疗或预防癌症、神经系统中的癌症、胶质瘤、胶质母细胞瘤、肝癌或癌症转移。

在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸或组合物用于治疗、减轻、抢先性治疗或预防肾脏病症、肾损伤、肾脏炎症、蛋白尿或肾小球损伤。

在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸或组合物用于治疗、减轻、抢先性治疗或预防炎症。

在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸或组合物用于治疗、减轻、抢先性治疗或预防炎症性病症、氧化应激、炎症、细胞凋亡、关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎以及与这些病况相关的疼痛、脑炎、脑膜炎、人Rasmussen脑炎、大脑皮层和/或海马体炎症、进行性认知劣化、结肠炎、溃疡性结肠炎或炎症性肠病。

在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸或组合物用于治疗、减轻、抢先性治疗或预防代谢障碍，优选地糖尿病，更优选地1型或2型糖尿病。

在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸或组合物用于治疗、减轻、抢先性治疗或预防Prader-Willis综合征、Anglemans综合征、神经纤维瘤病、血管生成相关疾病、血管生成促进、视网膜病症(优选地糖尿病视网膜病变)或听力丧失。

在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸或组合物通过全身施用、鞘内施用、向CNS中的心室内施用、或静脉施用来施用。

在一些实施方式中，本发明的反义寡核苷酸或组合物与一种或多种其它活性药物成分组合用于治疗本发明的疾病中的任一种。

根据一个实施方式，本发明涉及根据本发明的反义寡核苷酸的用途，其中其它活性药物成分是针对治疗本发明的疾病而制成的成分。

根据一个实施方式，本发明涉及根据本发明的反义寡核苷酸的用途，其中其它药物成分是反义寡核苷酸。

根据一个实施方式，本发明涉及根据本发明的反义寡核苷酸的用途，其中其它药物成分是靶向miR-27b或miR-134或两者的反义寡核苷酸。

根据一个实施方式，本发明涉及一种药物组合物，其包含有效剂量的根据本发明的反义寡核苷酸和药学上可接受的载体。在一些此类实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸缀合，即与递送媒介物或另一种治疗分子或以某种方式增强根据本发明的反义寡核苷酸的功效的分子缀合。

根据一个实施方式，本发明涉及一种包含有效剂量的根据本发明的反义寡核苷酸的药物组合物，其中所述反义寡核苷酸是唯一的活性药物成分。

在一些实施方式中，抗腺苷激酶化合物可以有利地与其它疗法一起用于待由抗腺苷激酶组合物治疗的特定疾病。在一些实施方式中，本发明的抗腺苷激酶化合物用于与本申请中提及的神经病学疾病的其它疗法组合使用。

在一些实施方式中，本发明的抗腺苷激酶化合物，与用于神经病学疾病，特别地癫痫、疼痛或中风或它们的并存症的治疗、减轻、改善、抢先性治疗、预防、疾病改变或治愈性治疗的其它疗法一起组合，用于神经病学疾病，特别地癫痫、疼痛或中风的治疗、减轻、改善、抢先性治疗、预防、疾病改变或治愈性治疗。

因此，本发明的抗腺苷激酶反义寡核苷酸可以与一种或多种其它疗法组合使用。在一些实施方式中，所述其它疗法是抗miR-27b反义寡核苷酸。在一些实施方式中，所述其它疗法是抗miR-134反义寡核苷酸。在一些实施方式中，所述其它疗法在哺乳动物中，诸如在人中诱导Nrf-2/ARE途径。在一些实施方式中，抗腺苷激酶反义寡核苷酸组合物将与抗miR27b反义寡核苷酸、抗miR-134反义寡核苷酸和诱导Nrf-2/are途径的疗法中的一种或多种组合使用。

在一些实施方式中，本发明的靶向腺苷激酶的反义寡核苷酸用于其中它们是唯一活性成分的组合物中，并且在一些实施方式中，它们用于包含其它活性药物成分的组合物中。

本发明提供药物组合物，其包含本发明的抗腺苷激酶反义寡核苷酸化合物，还包含药学上可接受的载体。

在一些实施方式中，本发明的药物组合物包含抗腺苷激酶反义寡核苷酸作为唯一的活性药物成分。在一些实施方式中，在本发明的药物组合物中存在一种或多种活性药物成分。

剂量

表述“有效剂量”表示将实现所需效果的药物的剂量。在本发明的上下文中，所需效果是降低腺苷激酶的活性。例如当使用导致ADK mRNA或ADK前mRNA降解的寡核苷酸时，腺苷激酶活性的降低可以通过测量腺苷激酶的水平来测量。

本发明的化合物以有效剂量使用，并且组合物包含有效剂量的本发明的化合物。

在一些实施方式中，每次给药时施用的化合物的剂量，诸如单位剂量，在0.001mg/kg至25mg/kg的范围内。

在一些实施方式中，有效剂量是在连续施用剂量之间的时间段内足以将腺苷激酶或其活性下调至显著水平(诸如对受试者具有治疗益处的水平)的剂量。

在一些实施方式中，可以将本发明的药物组合物制成为用于施用以提供初始剂量积累期，这可能取决于疾病病理学，之后可以是维持剂量方案以用于维持化合物在受试者中(诸如在受试者的靶组织中)的浓度的目的，这将有效地治疗疾病。剂量的有效性可以在实例中通过观察指示疾病状态的疾病参数来测量，或根据靶组织，可以通过观察各种组织参数(诸如腺苷激酶的活性)来测量，或在替代实例中借助血浆中可测量的疾病状态依赖性参数来测量。

药物递送

各种递送系统是已知的，并且可以用于施用本发明的治疗剂。施用方法包括但不限于皮下施用、静脉内施用、肠胃外施用、鼻部施用、肺部施用、直肠施用、阴道施用、子宫内施用、尿道内施用、施用于眼睛、施用于耳朵、皮肤施用、皮内施用、肌内施用、腹膜内施用、硬膜外施用、心室内施用、大脑内施用、鞘内施用或口服施用或直接施用至脑或脑脊液中。组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过经上皮或粘膜皮肤组织(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与或不与其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身性的或局部性的。此外，可期望通过任何合适的途径将本发明的组合物施用到中枢神经系统中，包括心室内和鞘内施用。心室内注射可以通过例如附接到储器(诸如Ommaya或其它储器方法)的心室内导管来促进。也可以采用肺部施用，例如，通过使用吸入器或喷雾器，以及具有雾化剂的制剂。优选地，治疗剂被递送到CNS或PNS。

递送手段包括吸入递送、通过注射器或微型渗透泵直接到肌肉中的肌内递送、通过注射器和微型渗透泵直接施用到腹膜的腹膜内施用、通过注射器直接在皮肤下施用的皮下施用、直接施用到脑中的脑室的脑室内施用(通过注射或使用附接到渗透泵的小导管)。此外，可以制备植入物(例如小的硅植入物)，该植入物将被放置在肌肉中或直接放置在脊髓上。可期望将本发明的组合物局部施用到需要治疗的区域；这可以例如但不限于通过局部应用、通过注射、借助于导管、借助于栓剂或借助于植入物来实现，所述植入物可以是多孔、无孔或凝胶状材料，包括膜诸如硅橡胶膜，或纤维。

药物组合物

本发明还提供了药物组合物。此类组合物可以包含治疗有效量的治疗剂，诸如治疗有效量的本发明的反义寡核苷酸或siRNA，诸如SEQ ID NO：2-80中的任一个，以及药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的”可定义为经监管机构批准。监管机构可以例如是欧洲药品管理局、联邦或州政府，或者在美国药典或其它公认的药典中列出的用于动物，更特别地用于人的监管机构。术语“治疗有效量”可定义为导致对病症或疾病的发展或发生的临床显著抑制、改善或逆转的治疗剂的量。术语“载体”可以是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药物载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物通过静脉内施用时，水可以是优选的载体。盐水溶液以及右旋糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别地用于可注射溶液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可以含有润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等形式。组合物可以被配制为栓剂，具有传统的粘合剂和载体诸如甘油三酯。口服制剂可以包括标准载体，诸如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这种组合物可以含有治疗有效量的优选地以纯化形式的治疗剂，以及合适量的载体，从而为患者提供适当施用的形式。制剂可适合施用模式。用于静脉内给药的组合物可以是在无菌等渗水性缓冲剂中的溶液。在必要的情况下，组合物还可以包含增溶剂，和局部麻醉剂诸如利多卡因，以缓解注射部位的疼痛。成分可以单独供应，或以单位剂量的形式混合在一起，例如，作为在密闭地密封的容器(诸如指示活性剂的量的安瓿或小袋)中的干燥的冻干粉或无水浓缩物。在待通过输注施用组合物的情况下，可以用含有无菌药物级水或盐水的输注瓶进行配药。在通过注射施用组合物的情况下，可以提供一安瓿的无菌注射用水或盐水，从而在施用之前将成分混合。

实施例

实施例1.包含例如LNA核苷酸的寡核苷酸的合成在文献中是众所周知的。可以使用WO2007/11275的实施例1和2中提及的方法进行LNA单体和寡核苷酸的合成。

可以使用WO2007/112754的实施例4中提及的方法进行LNA寡核苷酸在人或大鼠血浆中的稳定性的评估。用经LNA修饰的反义寡核苷酸处理培养的细胞可以使用WO2007/11275的实施例6中提及的方法来进行。

实施例2.使用WO2007/112754的实施例10中提及的方法从培养的细胞和组织中进行RNA分离和表达分析。使用在(Djebali et al.Nature 489：101-108或Chu etal.Nucleic Acid Ther.22：271-274或Wang et al.Nature Reviews Genetics 10：57-6)中提及的方法从培养的细胞和组织进行基于RNAseq的转录谱分析。

实施例3：细胞培养

贴壁人乳腺腺癌细胞系MCF7(ECACC号：86012803)购自ATCC(目录号HTB-22^TM)，并在Nunc^TM EasYFlask^TM细胞培养烧瓶(目录号：159910，Thermo Fischer Scientific，Waltham，MA，USA)中在Eagle最低必需培养基(目录号：M2279，Sigma Aldrich，St.Louis，MO，USA)中维持，该Eagle最低必需培养基供应有10％胎牛血清(目录号：F4135，SigmaAldrich，St.Louis，MO，USA)、1％非必需氨基酸(目录号：11140050，Thermo FischerScientific，Waltham，MA，USA)、1％L-谷氨酰胺(目录号：G7513，Sigma Aldrich，St.Louis，MO，USA)和1％青霉素/链霉素(目录号：P4333，Sigma Aldrich，St.Louis，MO，USA)。在37℃将细胞保存在加湿的5％CO2培养箱中，并且使其每周传代两次。

实施例4：反义寡核苷酸化合物文库的初步筛选

设计了79个反义寡核苷酸的文库，用于腺苷激酶(长同种型和短同种型)(ADK-LS)。反义寡核苷酸由IDT(Coralville，Iowa，USA)合成，并将其在无菌条件下在无核酸酶的水(目录号：AM9938，Thermo FischerScientific，Waltham，MA，USA)中稀释至500μM的储备浓度。将重悬的寡核苷酸在-20℃储存。

转染前一天，将MCF7细胞以1.25×10⁵个细胞/孔接种在24孔Nunc^TM细胞-培养物处理的多培养皿(目录号：142475，Thermo Fischer Scientific，Waltham，MA，USA)中。在转染当天，在转染前一小时去除细胞培养基，并添加475μL的维持培养基。将所有寡核苷酸在Opti-MEM(目录号：31985-070，Thermo Fischer Scientific，Waltham，MA，USA)中稀释至10nM的最终孔浓度。将Lipofectamine^TM RNAiMAX(目录号：13778150，Thermo FischerScientific，Waltham，MA，USA)在Opti-MEM中稀释至1.5μL的最终孔浓度。将等量的RNAiMAX和反义寡核苷酸溶液合并，并使其温育5分钟，然后将25μL的混合物添加到孔中。作为实验对照，使用乱序的对照寡核苷酸和经RNAiMAX模拟物处理的细胞。转染48小时后，按照制造商的说明，使用RNeasy微型试剂盒(目录号：74106，Qiagen，Hilden，Germany)进行RNA提取。按照制造商的说明，使用Superscript IV逆转录酶(目录号：18090010，Thermo FischerScientific，Waltham，MA，USA)进行逆转录，包括通过ezDNase^TM(目录号：11766051，ThermoFischer Scientific，Waltham，MA，USA)去除gDNA，并使用随机六聚体引物(目录号：SO142，Thermo Fischer Scientific，Waltham，MA，USA)。按照制造商的说明，在QuantStudio 6Flex(Applied Biosystems，Waltham，MA，USA)上使用由Integrated DNA Technologies(Newark，NJ，USA)合成的Taqman测定试剂盒和Taqman^TMUniversal预混液II(无UNG)(目录号：4440040，Thermo Fischer Scientific，Waltham，MA，USA)(表1)进行qPCR。将所有的测定都设计为跨外显子的，并且通过引物的blast来确认特异性，并且使用五倍稀释系列来测试引物的效率。将Hprt1用作管家基因。所使用的ADK测定法检测所有mRNA变体。

表1 qPCR引物和探针

所有数据均在Microsoft Excel中进行计算，并在Prism版本9.1.1(GraphPad，SanDiego，CA，USA)中进行可视化。使用ΔΔCt方法分析qPCR结果，使用仅用RNAiMAX模拟处理的细胞作为参照。第一次筛选(图1)是两个技术重复的情况下用n＝1进行的，并被描绘为平均值±SEM。选择了前11个候选者，并在后续实验(n，N＝2，3-4)中确认了ADK-LS mRNA敲低的水平，在图2中被描绘为平均值±SEM。

实施例5：所选择的反义寡核苷酸对ADK-LS的剂量范围性敲低

如实施例4进行转染和qPCR，不同之处在于，反义寡核苷酸浓度为5、1或0.2nM。重复实验，得到一至两个生物重复，其中对每个生物重复进行一至两次技术重复。

图3示出了剂量反应研究的结果。

实施例6：确定所选择的ADK-LS反义寡核苷酸在培养的细胞系中的IC₅₀值

如实施例6进行转染和qPCR，不同之处在于，用范围为90nM至0.004nM的3倍稀释的反义寡核苷酸浓度转染细胞。在Graphpad Prism(版本9.0.2，Graphpad Software)中相对于log(M)绘制如通过qPCR确定的ADK-LS的相对水平。使用3-参数非线性拟合和以nM计的IC₅₀值来拟合剂量-反应曲线。重复实验，得到一至两个生物重复，其中对每个生物重复进行一至两次技术重复。

图4示出了ADK-LS反义寡核苷酸的剂量反应曲线和IC₅₀值。

实施例7：在培养细胞系中的RNA测序

如以上实验进行细胞转染，不同之处在于，反义寡核苷酸浓度分别为3和30nM。重复实验，得到三个生物重复。使用miRNeasy微型试剂盒(目录号：217004，Qiagen)从细胞沉淀中分离RNA，通过使用不含RNA酶的DNA酶组(目录号：79254，Qiagen)去除污染物基因组DNA。使用生物分析仪2100(目录号：5067-1511，Agilent technologies，Santa Clara，CA，USA)上的RNA纳米芯片评价最终的RNA质量。分离的RNA样品是rRNA耗竭型的，并被制备用于使用SMARTer Strand Total RNA Sample Prep Kit-HI Mammalian(目录号：38229000，Takara Bio Europa)进行测序。使用RiboGone进行rRNA耗竭，并且剩余的RNA使用AMPureXP珠(目录号A63881，Beckman Coulter，Brea，CA，USA)进行纯化，并根据制造商的方案进行文库构建。在Pippin Prep(Sage Science，Inc.Beverly，MA，USA)上对最终的文库进行尺寸筛选(150-500bp)，使用Qubit和高灵敏度芯片(Agilent)在生物分析仪2100上对其进行质量控制，并使用KAPA文库定量试剂盒(Kapa Biosystems，Wilmington，MA，USA)对其进行定量。在Novogene(Cambridge，UK)的Novaseq 6000 S4上进行RNA测序。

通过去除衔接子序列并使用Trim-Galore(v0.4.1)修剪掉具有低于20的Phred得分的低质量碱基来对测序数据进行预处理。使用FastQC和MultiQC¹进行质量控制，以确保高质量数据。

通过使用STAR²将经筛选的读数映射到人基因组(hg19)来进行基因表达的量化。使用软件FeatureCounts以使用来自Gencode V37³的基因注释来量化映射到每个基因的读数数量。

使用在R中DESeq2对基因表达水平进行差异表达分析⁴。

通过使用GGGenome作为参考的计算机分析，发现了每种反义寡核苷酸的预测的基因靶标⁵。

将每种反义寡核苷酸的序列与来自参考序列(RefSeq)的成熟的剪接的mRNA序列(剪接)和未剪接的前mRNA序列(剪接前)进行匹配(最多总共允许三个插入、缺失或错配)。将每种反义寡核苷酸匹配的插入、缺失和错配的总和表示为“距离”(d)，其代表预测的靶位点的质量d＝0是指完全匹配，而d＝3是指在反义寡核苷酸和(前)mRNA之间结合时有三个插入、缺失或错配。将预测的mRNA和前mRNA反义寡核苷酸靶向与来自RNA测序的基因表达和差异表达分析进行比较，以估计哪些基因由于反义寡核苷酸脱靶而被差异表达。所有的绘图都在R中进行。

为了评价反义寡核苷酸处理对ADK表达的影响，将表达水平进行归一化，并在样本上进行比较(图7)。

为了评价ADK-LS反义寡核苷酸对整个转录组的影响，进行了差异基因表达分析，并在火山图中对所得数据进行了可视化(图5(SEQ ID NO 21)和图6(SEQ ID NO71))。

为了检查RNA表达的变化是否可归因于1)由靶向转录组中的其它序列的直接影响或2)直接作用的下游次要结果，使用反义寡核苷酸序列进行初步的计算机分析，以预测1)剪接的转录组(细胞质)和2)未剪接的转录组(细胞核)内的所有潜在靶位点。这是针对具有0、1、2或3个插入、缺失或失配的靶位点(统称为距离(d))进行的。对于反义寡核苷酸与ADKRNA结合，仅观察到距离为0。结果在图8(SEQ ID NO 21)和图9(SEQ ID NO71)中进行了绘制。

实施方式

1.一种RNA治疗性化合物，包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与腺苷激酶转录物内的核酸序列互补。

2.根据实施方式1的RNA治疗性化合物，该RNA治疗性化合物与腺苷激酶转录物内的核酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％互补。

3.根据实施方式1或2的RNA治疗性化合物，其中腺苷激酶转录物是SEQ ID NO：1。

4.根据实施方式1-3的RNA治疗性化合物，其中RNA治疗性化合物与SEQ ID NO：164-205中的任一个互补。

5.根据实施方式1-4中任一项的RNA治疗性化合物，其中化合物能够降低表达腺苷激酶蛋白的人细胞中腺苷激酶蛋白表达。

6.根据实施方式5的RNA治疗性化合物，其中与未暴露于化合物的人细胞中的ADK蛋白表达相比，将ADK蛋白表达减少至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。

7.根据实施方式1-6中任一项的RNA治疗性化合物，该RNA治疗性化合物能够降低表达ADK转录物的人或哺乳动物细胞中的ADK转录物(例如，mRNA)表达。

8.根据实施方式7的RNA治疗性化合物，其中与未暴露于化合物的人细胞中的ADK转录物表达相比，将ADK转录表达减少至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。

9.根据实施方式1-8中任一项的RNA治疗性化合物，其中该化合物是反义寡核苷酸或siRNA。

10.根据实施方式9的反义寡核苷酸或siRNA，其中该反义寡核苷酸或者siRNA包含一种或多种亲和性增强型核苷类似物。

11.根据实施方式10的反义寡核苷酸或siRNA，其中反义寡核苷酸中的核苷类似物中的一种或多种包括2'-O-烷基-RNA；2'-O-甲基RNA(2'-OMe)；2’-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(2'-MOE)；2’-氨基-DNA；2’-氟-RNA；2’-氟-DNA；阿糖基核酸；2’-氟ANA、双环核苷类似物(LNA)；或它们的组合，或其中siRNA中的核苷类似物中的一种或多种包括2’-脱氧-2'-氟修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、3’-末端脱氧胸苷核苷酸(dT)、锁核苷酸、无碱基核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、吗啉基核苷酸、包含氨基磷酸酯的核苷酸和包含非天然碱基的核苷酸。

12.根据实施方式10或11的反义寡核苷酸或siRNA，其中核苷类似物中的一种或多种是亲和性增强型2’糖修饰的核苷。

13.根据实施方式12的反义寡核苷酸或siRNA，其中亲和性增强型2’糖修饰的核苷是LNA。

14.根据实施方式13的反义寡核苷酸或siRNA，其中LNA选自由以下组成的组：受限的乙基核苷(cEt)、2’，4’-受限的2'-O-甲氧基乙基(cMOE)、u-L-LNA、P-DLNA、2'-O，4'-C-亚乙基-桥式核酸(ENA)、氨基LNA、氧基-LNA、硫代-LNA以及它们的任何组合。

15.根据实施方式1-14中任一项的反义寡核苷酸或siRNA，其中反义寡核苷酸或者siRNA包含一个或多个5’-甲基-胞嘧啶核碱基。

16.一种与ADK-前mRNA(SEQ ID NO：1)互补的反义寡核苷酸，包含长度为10-30个核苷酸的序列，其中反义寡核苷酸具有至少一种亲和性增强型核苷酸类似物。

17.根据实施方式16的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含至少一个核苷间键，该核苷间键选自硫代磷酸酯、或磷酸二酯键、磷酸三酯键、甲基膦酸酯键或氨基磷酸酯键中的任一个。

18.根据实施方式16或17)的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸与ADK-L和ADK-S前mRNA两者互补。

19.根据实施方式16-18中任一项的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸能够下调诸如敲低ADK-L和ADK-S的表达。

20.根据实施方式16-19中任一项的反义寡核苷酸，该反义寡核苷酸包含与SEQ IDNO：164-205中的任一个互补的基序。

21.根据实施方式20的反义寡核苷酸，其中基序是SEQ ID NO：83-161中的任一个。

22.根据实施方式16-21中任一项的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸是间隔聚体，并且包含至少五个连续DNA核苷酸的链段。

23.根据实施方式16-22中任一项的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸包含长度为14-20个核苷酸的序列。

24.根据实施方式16-23中任一项的反义寡核苷酸，其中亲和性增强型核苷酸类似物选自LNA、三环-DNA、2’-氟、2'-O-甲基、2’甲氧基乙基(2'-MOE)、2’环乙基(cET)、UNA、2’氟和构象限制性核苷(CRN)的清单。

25.根据实施方式16-24中任一项的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸包含至少一种LNA。

26.根据实施方式16-25中任一项的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸包含20-55％的LNA。

27.根据实施方式26的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸还含一种或多种核苷，该核苷是三环-DNA、2’-氟、2’-O-甲基、2’甲氧基乙基(2'-MOE)、2’环乙基(cET)、UNA、2’氟和构象限制性核苷(CRN)中的任一个。

28.根据实施方式16-27中任一项的反义寡核苷酸，其中LNA是β-D-氧基LNA。

29.根据实施方式16-28中任一项的反义寡核苷酸，其中所有的核苷间键都是硫代磷酸酯键，并且所有的经修饰的胞嘧啶都是5’-甲基-胞嘧啶。

30.根据实施方式16-29中任一项的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸是SEQ IDNO 2-80中的任一个，诸如SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 21、SEQID NO 37、SEQ ID NO 50、SEQ ID NO 51、SEQ ID NO 53、SEQ ID NO 59、SEQ ID NO 60、SEQID NO 63、SEQ ID NO 66、SEQ ID NO 67、SEQ ID NO 68、SEQ ID NO 69、SEQ ID NO 70、SEQID NO 71、SEQ ID NO 72、SEQ ID NO 73、SEQ ID NO 74、SEQ ID NO 75、SEQ ID NO 76、SEQID NO 77、SEQ ID NO 78、SEQ ID NO 79或SEQ ID NO 80中的任一个。

31.一种组合物，包含根据实施方式1-15的RNA治疗性化合物或根据实施方式16-30中任一项的反义寡核苷酸。

32.根据实施方式1-15中任一项的RNA治疗性化合物或根据实施方式16-30中任一项的反义寡核苷酸或根据实施方式31的组合物，用作药物使用。

33.根据实施方式1-15中任一项的RNA治疗性化合物或根据实施方式16-30中任一项的反义寡核苷酸或根据实施方式31的组合物，其中所述RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物用作药物使用，优选地其中所述药物用于其中受益于ADK活性改变的疾病的预防性、治愈性或疾病改变性治疗、减轻、抢先性治疗或预防。

34.根据实施方式1-15中任一项的RNA治疗性化合物或根据实施方式16-30中任一项的反义寡核苷酸或根据实施方式31的组合物，其中所述RNA治疗性、反义寡核苷酸或组合物用于减少或敲低ADK诸如ADK L/S在细胞或个体中诸如在人或哺乳动物中的表达。

35.根据实施方式1-31中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，其中该使用是用于预防性、治愈性或疾病改变性治疗、减轻、改善、抢先性治疗或预防CNS或PNS疾病。

36.根据实施方式1-31中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，其中所述反义寡核苷酸或者所述组合物是用于预防性、治愈性或疾病改变性治疗、减轻、抢先性治疗或预防CNS或PNS的疾病，诸如精神病学病症、神经病学病症、神经退行性病症或神经发育障碍。

37.根据实施方式1-31中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，用作神经保护剂使用。

38.根据实施方式1-31中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，用于预防性、治愈性或疾病改变性治疗、减轻、抢先性治疗或预防CNS或PNS的疾病、精神病学病症、神经病学病症、神经退行性病症、神经发育障碍、与细胞创伤和炎症相关的中枢和外周神经系统疾病、神经元损伤、海马损伤、创伤性脑损伤、记忆障碍、海马硬化症、帕金森病、多发性硬化症、急性脊髓损伤、肌萎缩性侧索硬化症、共济失调、贝尔氏麻痹、腓骨肌萎缩症、头痛、Horton头痛、偏头痛、皮克病、进行性核上性麻痹、多系统变性、运动神经元疾病、亨廷顿病、朊病毒疾病、克雅二氏症、皮质基底节变性、原发性进行性失语症或者它们的症状或影响。

39.根据实施方式1-31中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，用于预防性、治愈性或疾病改变性治疗癫痫。

40.根据实施方式1-31中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，用于预防性、治愈性或疾病改变性治疗癫痫发作。

41.根据实施方式1-31中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，其中所述反义寡核苷酸或者所述组合物是用于预防性、治愈性或疾病改变性治疗、减轻、抢先性治疗或预防癫痫和/或癫痫发作，优选地治疗抗性癫痫，获得性、遗传性和/或特发性癫痫，治疗抵抗性癫痫综合征，耐药性癫痫，药学抵抗性局灶性癫痫，自发性癫痫发作，治疗抵抗性癫痫发作，局灶性癫痫，全身性癫痫或癫痫持续状态。

42.根据实施方式1-31中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，用于预防性、治愈性或疾病改变性治疗、减轻、抢先性治疗或预防癫痫、耐药性癫痫、药物抵抗性局灶性癫痫、癫痫发作、自发性癫痫发作、治疗抵抗性癫痫发作、局灶性癫痫(优选地其中所述局灶性癫痫集中在额叶、顶叶、枕叶或颞叶)、全身性癫痫(优选地其中所述全身性癫痫选自失神性癫痫、肌阵挛性癫痫发作、强直-阵挛性癫痫发作、强直性癫痫发作、失张力性癫痫发作、阵挛性癫痫发作和肌痉挛)、癫痫持续状态、由急性脑损伤诱导的癫痫发生、常染色体显性遗传的夜发性额叶癫痫、缓慢睡眠期间的持续棘波、dravet综合征、中风后发展的癫痫、癫痫性脑病、痴笑样癫痫、失神性癫痫、良性新生儿癫痫发作、Jeavons综合征、青少年肌阵挛性癫痫、Landau-Kleffner综合征、Lennox-Gastaut综合征、内侧颞叶癫痫、肌阵挛性站立不能性癫痫、Ohtahara综合征、Panayiotopoulos综合征、PCDH19综合征、伴有中央颞部棘波的良性儿童癫痫、Sturge-Weber综合征、症状性局灶性癫痫、短暂性癫痫性健忘症和West综合征和/或胶质瘤相关癫痫。

43.根据实施方式1-31中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，用于预防性、治愈性或疾病改变性治疗、减轻、抢先性治疗或预防疼痛，优选地其中所述疼痛是慢性疼痛、神经病理性疼痛、化疗诱导的神经病理性疼痛、偏头痛、头痛、痛觉过敏、异常性疼痛和/或纤维肌痛。

44.根据实施方式1-31中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，用于预防性、治愈性或疾病改变性治疗疼痛。

45.根据实施方式1-31中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，用于预防性、治愈性或疾病改变性治疗、减轻、抢先性治疗或预防疼痛、慢性疼痛、神经病理性疼痛、化疗诱导的神经病理性疼痛、偏头痛(包括具有先兆的偏头痛和没有先兆的偏头痛)、原发性头痛、紧张性头痛、集群性头痛、Horton头痛、慢性日常头痛、窦性头痛、创伤后头痛、运动性头痛、持续性偏头痛、睡眠性头痛、痛觉过敏、热性痛觉过敏、异常性疼痛、触觉异常性疼痛和/或纤维肌痛。

46.根据实施方式1-31中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，用于预防性、治愈性或疾病改变性治疗、减轻、抢先性治疗或预防精神障碍、认知障碍、睡眠障碍、心血管障碍、呼吸障碍、癌症、肾脏病症、炎症或代谢障碍。

47.根据实施方式1-31中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，用于预防性、治愈性或疾病改变性治疗、减轻、抢先性治疗或预防精神障碍、神经精神病学病症、焦虑、抑郁、双相情感障碍、注意力缺陷多动障碍、注意力缺陷障碍、自闭症、阿斯伯格综合征、Tourette综合征、精神分裂症、偏执型精神分裂症、青春型精神分裂症、紧张型精神分裂症、未分化型精神分裂症、残余型精神分裂症、单纯性精神分裂症或未指明型精神分裂症。

48.根据实施方式1-31中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，用于预防性、治愈性或疾病改变性治疗、减轻、抢先性治疗或预防认知障碍、认知损害、痴呆、阿尔茨海默病、血管性痴呆、额颞叶痴呆或路易体痴呆。

49.根据实施方式1-31中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，用于预防性、治愈性或疾病改变性治疗、减轻、抢先性治疗或预防睡眠障碍。

50.根据实施方式1-31中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，用作睡眠调节剂使用。

51.根据实施方式1-31中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，用于睡眠促进。

52.根据实施方式1-31中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，用于预防性、治愈性或疾病改变性治疗、减轻、抢先性治疗或预防心血管病症、外周动脉疾病、术后心房颤动、心力衰竭、慢性心力衰竭、脑出血诱导的脑损伤、中风、脑缺血或局部缺血。

53.根据实施方式1-31中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，用于预防性、治愈性或疾病改变性治疗、减轻、抢先性治疗或预防呼吸系统病症、哮喘或慢性阻塞性肺病。

54.根据实施方式1-31中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，用于预防性、治愈性或疾病改变性治疗、减轻、抢先性治疗或预防癌症、神经系统中的癌症、胶质瘤、胶质母细胞瘤、肝癌或癌症转移。

55.根据实施方式1-31中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，用于预防性、治愈性或疾病改变性治疗、减轻、抢先性治疗或预防肾脏病症、肾损伤、肾脏炎症、蛋白尿或肾小球损伤。

56.根据实施方式1-31中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，用于预防性、治愈性或疾病改变性治疗、减轻、抢先性治疗或预防炎症。

57.根据实施方式1-31中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，用于预防性、治愈性或疾病改变性治疗、减轻、抢先性治疗或预防炎症性病症、氧化应激、炎症、细胞凋亡、关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎(以及与这些病况相关的疼痛)、脑炎、脑膜炎、人Rasmussen脑炎、大脑皮层和/或海马体炎症、进行性认知劣化、结肠炎、溃疡性结肠炎或炎症性肠病。

58.根据实施方式1-31中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，用于治疗、减轻、抢先性、预防性、治愈性或疾病改变性治疗或预防代谢障碍，优选地糖尿病，更优选地1型或2型糖尿病。

59.根据实施方式1-31中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，用于预防性、治愈性或疾病改变性治疗、减轻、抢先性治疗或预防Prader-Willis综合征、Anglemans综合征、神经纤维瘤病、血管生成相关疾病、血管生成促进、视网膜病症(优选地糖尿病视网膜病变)或听力丧失。

60.根据前述实施方式中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，其中通过全身施用、皮下施用、鼻部施用、鞘内施用、向CNS中的心室内施用、或静脉内施用来施用所述反义寡核苷酸或组合物。

61.根据前述实施方式中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或组合物，用于与一种或多种其它活性药物成分组合使用以用于预防性、治愈性或疾病改变性治疗根据实施方式33-60中任一项的疾病。

62.根据实施方式61的使用，其中其它活性药物成分是制成用于预防性、治愈性或疾病改变性治疗实施方式33-60中任一项的疾病的成分。

63.根据实施方式61或62的使用，其中其它药物成分是靶向miR-27b或miR-134的反义寡核苷酸。

64.一种药物组合物，包含有效剂量的根据前述实施方式中任一项的反义寡核苷酸和药学上可接受的载体。

65.一种药物组合物，包含有效剂量的根据前述实施方式中任一项的RNA治疗性化合物，诸如反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸是唯一的活性药物成分。

66-根据实施方式64或65的药物组合物，其中该组合物用于根据实施方式33-63中任一项来使用。

67.根据实施方式64-66中任一项的药物组合物，其中该组合物用于鞘内施用或用于脑室内施用。

68.根据实施方式67的药物组合物，其中所述组合物在泵中施用，优选地其中所述泵是微型泵，更优选地其中所述微型泵是微型渗透泵。

69.根据实施方式67-69中任一项的药物组合物，其中所述组合物用于由心室内导管促进的心室内施用，优选地其中所述导管附接到储器，优选地其中所述储器是Ommaya储器。

70.根据实施方式64-69中任一项的药物组合物，其中所述组合物以1天、2天、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119或120天中任一个的间隔施用。

71.根据实施方式64-68中任一项的药物组合物，其中所述组合物以1-200天、10-190天、20-180天、30-170天、40-160天、50-150天、60-140天、70-130天、80-120天、90-110天或优选地约100天的间隔施用。

72.根据实施方式1-31中任一项的反义寡核苷酸或组合物，用于治疗根据实施方式33-60中任一项的疾病的方法。

73.一种通过使用根据实施方式1-30中任一项的RNA治疗性化合物、反义寡核苷酸或根据实施方式31的组合物或根据实施方式64-71中任一项的药物组合物治疗根据实施方式33-60中任一项的疾病的方法。

74.根据实施方式33-63中任一项的使用，或根据实施方式73的方法，其中治疗是预防性、治愈性或疾病改变性中的任一种。

75.一种通过使用根据实施方式16-30中任一项的反义寡核苷酸或根据实施方式31的组合物来诊断根据实施方式33-59中任一项的疾病的方法。

Claims (17)

1.一种RNA治疗性化合物，包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与腺苷激酶转录物内的核酸序列互补。

2.根据权利要求1所述的RNA治疗性化合物，其中所述腺苷激酶转录物为SEQ ID NO：1。

3.根据权利要求1或2所述的RNA治疗性化合物，其中所述化合物是与ADK前mRNA(SEQID NO：1)互补的反义寡核苷酸，并且其中所述反义寡核苷酸具有至少一种亲和性增强型核苷酸类似物，并且其中所述反义寡核苷酸包含选自硫代磷酸酯键、磷酸二酯键、磷酸三酯键、甲基膦酸酯键或氨基磷酸酯键中的任一种的至少一种核苷间键。

4.根据权利要求3所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸与ADK-L和ADK-S前mRNA两者互补。

5.根据权利要求3或4所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸能够下调诸如敲低ADK-L和ADK-S的表达。

6.根据权利要求3-5中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含长度为14-20个核苷酸的序列。

7.根据权利要求3-6中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述亲和性增强型核苷酸类似物选自LNA、三环-DNA、2’-氟、2'-O-甲基、2’-甲氧基乙基(2'-MOE)、2’-环乙基(cET)、UNA、2’-氟和构象限制性核苷(CRN)的清单。

8.根据权利要求3-7中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含至少一种LNA。

9.根据权利要求3-8中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸与SEQ IDNO 164-205中的一个互补。

10.根据权利要求3-9中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含SEQID NO 83-161中的任一个或由SEQ ID NO 83-161中的任一个组成。

11.根据权利要求3-8中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸是SEQ IDNO 2-80中的任一个。

12.根据权利要求3-8中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸选自SEQID NO 4、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 37、SEQ ID NO 50、SEQID NO 51、SEQ ID NO 53、SEQ ID NO 59、SEQ ID NO 60、SEQ ID NO 63、SEQ ID NO 66、SEQID NO 67、SEQ ID NO 68、SEQ ID NO 69、SEQ ID NO 70、SEQ ID NO 71、SEQ ID NO 72、SEQID NO 73、SEQ ID NO 74、SEQ ID NO 75、SEQ ID NO 76、SEQ ID NO 77、SEQ ID NO 78、SEQID NO 79或SEQ ID NO 80中的任一个。

13.根据权利要求10-12中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所有的核苷间键是硫代磷酸酯，所有修饰的核苷酸是LNA，诸如β-d-氧基LNA，并且LNA胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。

14.根据权利要求1或2所述的RNA治疗性化合物或根据权利要求3-13中任一项所述的反义寡核苷酸，用于在减少或敲低ADK诸如ADKL/S在细胞或在个体诸如在人或哺乳动物中的表达中使用。

15.根据权利要求1或2所述的RNA治疗性化合物或根据权利要求3-13中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述化合物用于作为药物使用。

16.根据权利要求1或2所述的RNA治疗性化合物或根据权利要求3-13中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述化合物用于预防性、治愈性或疾病改变性治疗、减轻、改善、抢先性治疗或预防CNS或PNS疾病。

17.根据权利要求1或2所述的RNA治疗性化合物或根据权利要求3-13中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述化合物用于预防性、治愈性或疾病改变性治疗、减轻、改善、抢先性治疗或预防癫痫或神经病理性疼痛；用于预防性、治愈性或疾病改变性治疗癫痫或神经病理性疼痛。