CN114829603A

CN114829603A - 用于抑制scn9a表达的增强寡核苷酸

Info

Publication number: CN114829603A
Application number: CN202080088253.2A
Authority: CN
Inventors: 吕克·彼得森; 泽伦·V·拉斯穆森
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2022-07-29
Also published as: JP7288052B2; TW202136510A; AR120817A1; JP2022517475A; EP4077672A1; WO2021123086A1; US20210214727A1

Abstract

本发明涉及能够调节靶细胞中SCN9A表达的反义寡核苷酸。所述反义寡核苷酸与SCN9A mRNA杂交。本发明进一步涉及所述反义寡核苷酸的缀合物和药物组合物以及用于治疗或预防疼痛诸如外周疼痛的方法。

Description

用于抑制SCN9A表达的增强寡核苷酸

技术领域

本发明涉及与人SCN9A互补的反义寡核苷酸(ASO)，其用于抑制SCN9A核酸的表达。SCN9A编码电压门控钠通道Na_v1.7。SCN9A表达的抑制用于预防或治疗疼痛。

背景技术

电压门控钠通道(Na_vs)在可兴奋组织中起着至关重要的作用，它们的激活和开放导致动作电位的初始相位。Na_vs贯穿打开、关闭和失活状态的循环，以及它们与其他离子通道的活动的精密配合的关系，导致细胞内离子浓度的精确控制。

Na_v1.7是一种电压激活离子通道，几乎仅在小细胞外周感觉神经中表达。在感觉神经元中出现Na_v1.7条件性敲除的小鼠表现出镇痛表型(Nassar et al.，2004，Proc NatlAcad Sci U S A.2004 Aug 24；101(34)：12706-11)。Na_v1.7在人类痛觉中的作用通过自发性疼痛综合征遗传性红斑性肢痛症(IEM)((Yang et al.，J Med Genet.2004；41(3)：171-4)和阵发性极度疼痛症(PEPD)(Fertleman et al.，J Neurol NeurosurgPsychiatry.2006 Nov；77(11)：1294-5)之间的关联以及这些患者的Na_v1.7中的功能获得性突变得到证实(Cummins et al.，J Neurosci.2004；24(38)：8232-8236)。对Na_v1.7的进一步支持是通过鉴定导致先天性无痛症的功能丧失性突变产生的(Cox et al.，NatureAAA.2006；7121：894-8)。这些发现导致了许多用于鉴定Na_v1.7调节剂的小分子药物发现计划，但似乎找到具有高选择性和良好PK/PD特性的良好化合物一直具有挑战性。

US2016024208公开了针对Na_v1.7的人抗体。

WO02083945涉及用于乳腺癌的治疗的具有针对SCN5A以及任选地还有SCN9A的特定区域的反义序列的合成寡核苷酸。

US2007/212685涉及鉴定镇痛剂的方法，并且提到将在SCN9A的细胞中调节基因表达或基因转录本水平的特定化合物包括反义核酸。

US2010273857A涉及用于通过局部施用抑制针对Na_v1.7通道进行编码的氨基酸序列的表达或以其他方式抑制Nav1.7通道的功能的siRNA分子来治疗疼痛的方法、序列和核酸分子，并报告称，在背根神经节的外周感觉神经元中会发生Na_v1.7通道水平和/或功能的局部抑制。

WO12162732涉及用于调节钠通道，特别是电压门控钠通道的新型筛选测定。

KR20110087436公开了一种SCN9A反义寡核苷酸。

Mohan等人公开了靶向Na_v1.7的反义寡核苷酸，并且表征了ASO在啮齿动物的脊髓和背根神经节(DRG)中的药效学活性(Pain(2018)Volume 159·Number 1，p139-149)。

WO18051175公开了靶向部分人SCN9A前体mRNA的一部分的SCN9A反义肽核酸寡核苷酸。肽核酸衍生物在细胞中有效诱导SCN9AmRNA的剪接变体，并且用于治疗涉及Na_v1.7活性的疼痛或病症。

WO19243430公开了靶向SCN9A的LNA缺口聚体反义寡核苷酸。

因此，需要能有效抑制编码电压门控钠离子通道的核酸(诸如人SCN9A)的表达的反义寡核苷酸治疗，诸如用于预防或治疗疼痛。

发明目的

本发明鉴定了能够抑制SCN9A的表达并且可用于医药，诸如用于预防或治疗疼痛的新型寡核苷酸，诸如镇痛剂。本发明的化合物可用于预防或治疗外周疼痛。

发明内容

本发明提供了与SCN9A核酸互补并且能够抑制SCN9A核酸的表达的反义寡核苷酸，及其在医药中的用途。

本发明提供了一种反义寡核苷酸，其与人SCN9A前体mRNA(如SEQ ID NO：1所示)的区域互补，诸如完全互补，该区域选自SEQ ID NO：1的核苷酸97704-97732、103232-103259、151831-151847和151949-152006。

本发明的反义寡核苷酸的长度通常为12至24个核苷酸，并且包含至少12个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人SCN9A前体mRNA(如SEQ ID NO：1所示)的区域互补，诸如完全互补，该区域选自SEQ ID NO：1的核苷酸97704-97732、103232-103259、151831-151847和151949-152006。

本发明提供长度为10至30个核苷酸的反义寡核苷酸，其包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列100％相同：SEQ ID NO：28至52；或其至少14个连续核苷酸。

本发明提供长度为10至30个核苷酸的反义寡核苷酸，其包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列100％相同：SEQ ID NO：28至52；或其至少15个连续核苷酸。

本发明提供长度为10至30个核苷酸的反义寡核苷酸，其包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列100％相同：SEQ ID NO：28至52；或其至少16个连续核苷酸。

本发明提供了一种反义寡核苷酸，其包含与选自由以下项组成的组的序列100％相同的连续核苷酸序列：SEQ ID NO：28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38和39，或其至少14个连续核苷酸。

本发明提供了一种反义寡核苷酸，其包含选自由以下项组成的组的连续核苷酸序列：SEQ ID NO：28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38和39。

本发明提供了一种反义寡核苷酸，其包含与以下项100％相同的连续核苷酸序列：SEQ ID NO：29或其至少14、15、16或17个连续核苷酸。

本发明提供了一种反义寡核苷酸，其包含与以下项100％相同的连续核苷酸序列：SEQ ID NO：31或其至少14、15、16、17或18个连续核苷酸。

本发明提供了一种反义寡核苷酸，其包含与以下项100％相同的连续核苷酸序列：SEQ ID NO：33或其至少14、15、16、17、18或19个连续核苷酸。

本发明提供了一种反义寡核苷酸，其包含与以下项100％相同的连续核苷酸序列：SEQ ID NO：39或其至少14、15、16、17或18个连续核苷酸。

本发明提供了一种反义寡核苷酸，其包含与以下项100％相同的连续核苷酸序列：SEQ ID NO：47或其至少14、15、16、17或18个连续核苷酸。

本发明提供了一种反义寡核苷酸，其包含与以下项100％相同的连续核苷酸序列：SEQ ID NO：48或其至少14、15、16、17或18个连续核苷酸。

本发明提供了一种反义寡核苷酸，其包含选自由以下化合物ID组成的组的化合物的连续核苷酸：No#29_15、29_10、29_22、39_6、39_1、39_2、39_7、31_1、31_3、31_4、31_5、33_1、33_2、33_3、47_1、48_8、29_24、29_25、29_26、39_9、39_10、48_10、29_35、29_34、39_17、39_18、39_19、39_20和29_11。

在一些实施例中，反义寡核苷酸不是选自由以下化合物ID组成的组的反义寡核苷酸：No：29_33、39_13、48_9、29_33、39_13、48_9、29_33、39_13和48_9。

本发明提供了一种选自表1中列出的组的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了一种选自表3中列出的组的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图1的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号29_15的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图2的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号29_10的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图3的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号29_22的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图4的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号39_6的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图5的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号39_1的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图6的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号39_2的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图7的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号39_7的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图8的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号31_1的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图9的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号31_3的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图10的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号31_4的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图11的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号31_5的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图12的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号33_1的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图13的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号33_2的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图14的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号33_3的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图15的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号47_1的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图16的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号48_8的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图17的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号29_24的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图18的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号29_25的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图19的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号29_26的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图20的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号39_9的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图21的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号39_10的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图22的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号48_10的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图23的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号29_35的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图24的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号29_34的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图25的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号39_17的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图26的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号39_18的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图27的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号39_19的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图28的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号39_20的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图29的反义寡核苷酸或其药用盐。本发明提供了化合物ID号29_11的反义寡核苷酸或其药用盐。

表1.化合物表-HELM注释格式

Helm注释索引：

[LR](G)是β-D-氧基-LNA鸟嘌呤核苷，

[LR](T)是β-D-氧基-LNA胸腺嘧啶核苷，

[LR](A)是β-D-氧基-LNA腺嘌呤核苷，

[LR]([5meC]是β-D-氧基-LNA 5-甲基胞嘧啶核苷，

[dR](G)是DNA鸟嘌呤核苷，

[dR](T)是DNA胸腺嘧啶核苷，

[dR](A)是DNA腺嘌呤核苷，

[dR]([C]是DNA胞嘧啶核苷，

[mR](G)是2′-O-甲基RNA鸟嘌呤核苷，

[mR](U)是2′-O-甲基RNA DNA尿嘧啶核苷，

[mR](A)是2′-O-甲基RNA DNA腺嘌呤核苷，

[mR]([C]是2′-O-甲基RNA DNA胞嘧啶核苷，

[sP]是硫代磷酸酯核苷间键。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸可包含一个或多个缀合物基团，即反义寡核苷酸可为反义寡核苷酸缀合物。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸由连续核苷酸序列组成。

在另一方面，本发明提供了包含本发明的反义寡核苷酸和药用稀释剂、载体、盐和/或佐剂的药物组合物。

本发明提供了本发明的反义寡核苷酸的药用盐。在一些实施例中，药用盐选自由钠盐、钾盐和铵盐组成的组。

本发明提供了本发明的反义寡核苷酸的药物溶液，其中该药物溶液包含本发明的反义寡核苷酸和药用溶剂，诸如磷酸盐缓冲盐水。

本发明提供了以固体粉末形式的本发明的反义寡核苷酸，诸如冻干粉末的形式。

本发明提供了包含根据本发明的反义寡核苷酸以及与所述反义寡核苷酸共价连接的至少一个缀合物部分的缀合物。

本发明提供了本发明的反义寡核苷酸的药用盐，或根据本发明的缀合物。

本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸的药用盐，其中该药用盐是钠盐或钾盐。

本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含本发明的反义寡核苷酸或本发明的缀合物、或本发明的盐，以及药用稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。

本发明提供了用于抑制表达SCN9A的靶细胞中SCN9A表达的方法，所述方法包括向所述细胞施用有效量的本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐或本发明的组合物。该方法可为体内方法或体外方法。

本发明提供了一种用于治疗或预防患有或可能患有疼痛(诸如人的疼痛)的受试者的方法，该方法包括施用治疗或预防有效量的本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐或本发明的组合物，诸如预防或减轻疼痛。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐或本发明的组合物用于慢性疼痛、神经病性疼痛、炎性疼痛或自发性疼痛的治疗。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐或本发明的组合物用于感受伤害性疼痛的治疗。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐或本发明的组合物用于选自由糖尿病性神经病变、癌症、颅神经痛、带状疱疹后神经痛和手术后神经痛组成的组的病症引起或与之相关联的疼痛的治疗。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐或本发明的组合物用于由遗传性红斑性肢痛症(EIM)、或阵发性极度疼痛症(PEPD)或三叉神经痛引起或相关的疼痛的治疗的用途。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐或本发明的组合物用于神经性疼痛、慢性疼痛的治疗，以及感受伤害性疼痛(例如神经减压)或神经病性疼痛(例如糖尿病性神经病变)、内脏痛或混合性疼痛的一般治疗中的用途。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐或本发明的组合物在治疗下背痛或炎性关节炎中的用途。

本发明提供了用于医药中的本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的组合物或盐。

在另一方面，本发明提供了用于抑制表达SCN9A的靶细胞中SCN9A表达的方法，其通过向所述细胞施用有效量的本发明的反义寡核苷酸或组合物来实施。在另一方面，本发明提供了用于通过向表达SCN9A的靶细胞施用有效量的本发明的反义寡核苷酸或组合物来抑制靶细胞中SCN9A表达的体内或体外方法的方法。该细胞可例如是人细胞，诸如神经元细胞、诸如外周神经细胞或原代神经元细胞。

在另一方面，本发明提供用于治疗或预防选自由诸如外周疼痛的疼痛组成的组疾病或预防诸如外周疼痛的疼痛的方法，其包括向患有或易患疼痛(诸如外周疼痛)的受试者施用治疗或预防本发明的有效量的反义寡核苷酸。

在另一方面，本发明提供了本发明的反义寡核苷酸、缀合物或药物组合物，其用于制备用于治疗或预防疼痛诸如外周疼痛的药物。

在另一方面，本发明提供了本发明的反义寡核苷酸、缀合物或药物组合物，其用于制造镇痛剂。

本发明提供了用于治疗疼痛(诸如外周疼痛)的本发明的反义寡核苷酸。

本发明提供了用作镇痛剂的本发明的反义寡核苷酸。

在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防疼痛的方法，该方法包括向患有或易患疼痛的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的反义寡核苷酸。

在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防外周疼痛的方法，该方法包括向患有或易患外周疼痛的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的反义寡核苷酸。

序列表

与本申请一起提交的序列表通过引用并入本文。序列表中列出的反义寡核苷酸序列基序示出为DNA序列。应当注意，在本文公开的一些测试化合物中，使用了具有尿嘧啶或胸腺嘧啶碱基的2′-O-甲基RNA核苷(用尿嘧啶替代胸腺嘧啶碱基)。

附图说明

图1化合物ID NO#29_15

图2化合物ID NO#29_10

图3化合物ID NO#29_22

图4化合物ID NO#39_6

图5化合物ID NO#39_1

图6化合物ID NO#39_2

图7化合物ID NO#39_7

图8化合物ID NO#31_1

图9化合物ID NO#31_3

图10化合物ID NO#31_4

图11化合物ID NO#31_5

图12化合物ID NO#33_1

图13化合物ID NO#33_2

图14化合物ID NO#33_3

图15化合物ID NO#47_1

图16化合物ID NO#48_8

图17化合物ID NO#29_24

图18化合物ID NO#29_25

图19化合物ID NO#29_26

图20化合物ID NO#39_9

图21化合物ID NO#39_10

图22化合物ID NO#48_10

图23化合物ID NO#29_35

图24化合物ID NO#29_34

图25化合物ID NO#39_17

图26化合物ID NO#39_18

图27化合物ID NO#39_19

图28化合物ID NO#39_20

图29化合物ID NO#29_11

图30.低冲洗量与高冲洗量。图表显示了在16mg化合物给药后暴露量与高(左)和低(右)冲洗量的函数。每个DRG数据点源于来自一个食蟹猴(N＝3)的两个DRG的汇集。所有数据点均来自在单次16mg剂量的化合物ID NO#31_1后14天处死的食蟹猴。

图31.背根神经节暴露作为给药后天数的函数。每个数据点都是对来自食蟹猴(N＝3)的两个DRG的汇集。所有数据均来自低冲洗量组和单剂量16mg化合物ID NO#31_1。

定义

寡核苷酸

如本文所用，术语“寡核苷酸”如本领域技术人员通常理解的那样被定义为包含两个或更多个共价连接的核苷的分子。此类共价结合的核苷也可被称为核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常是在实验室中通过先经固相化学合成后再加以纯化和分离而制备。当提及寡核苷酸的序列时，提及的是共价联接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的寡核苷酸是人造的，是化学合成的，通常是纯化或分离的。本发明的寡核苷酸可包含一个或多个修饰的核苷，诸如2′糖修饰的核苷。本发明的寡核苷酸可包含一个或多个修饰的核苷间键，诸如一个或多个硫代磷酸酯核苷间键。

反义寡核苷酸

如本文所用，术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸特别是与靶核酸上的连续序列杂交来调节靶基因表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的，因此不是siRNA或shRNA。优选地，本发明的反义寡核苷酸为单链的。应理解的是，只要序列内或序列间自身互补的程度低于跨寡核苷酸全长的50％，本发明的单链寡核苷酸便可形成发夹或分子间双链体结构(同一寡核苷酸的两个分子之间的双链体)。

在一些实施例中，本发明的单链反义寡核苷酸可不含未修饰的RNA核苷。

优选地，本发明的反义寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核苷或核苷酸，诸如2′糖修饰的核苷。此外，优选的是未修饰的核苷是DNA核苷。

连续核苷酸序列

术语“连续核苷酸序列”是指与靶核酸互补的反义寡核苷酸的区域。该术语在本文中与术语“连续核碱基序列”和术语“寡核苷酸基序序列”可互换使用。在一些实施例中，寡核苷酸的所有核苷构成连续核苷酸序列。在一些实施例中，寡核苷酸包含连续核苷酸序列，诸如F-G-F′缺口聚体区域，并且可任选地包含其他核苷酸，例如可用于将官能团(例如缀合物基团)附着至连续核苷酸序列的核苷酸接头区域。核苷酸接头区域可与靶核酸互补或不互补。在一些实施例中，反义寡核苷酸的核碱基序列是连续核苷酸序列。

核苷酸和核苷

核苷酸和核苷是寡核苷酸和多核苷酸的组成部分，并且出于本发明的目的，包括天然存在的和非天然存在的核苷酸和核苷。在自然界中，核苷酸，诸如DNA和RNA核苷酸包含核糖糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸基团(其不存在于核苷中)。核苷和核苷酸也可以可互换地称为“单元”或“单体”。

修饰的核苷

如本文所用，术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与等同的DNA或RNA核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或多种修饰而被修饰的核苷。有利地，本发明的反义寡核苷酸的一种或多种修饰的核苷包含修饰的糖部分。术语“修饰的核苷”在本文中还可与术语“核苷类似物”或修饰的“单元”或修饰的“单体”互换使用。具有未修饰的DNA或RNA糖部分的核苷在本文中被称为DNA或RNA核苷。在DNA或RNA核苷的碱基区域中具有修饰的核苷如果允许沃森克里克(Watson Crick)碱基配对，则通常仍称为DNA或RNA。

修饰的核苷间键

如技术人员通常所理解的，术语“修饰的核苷间键”定义为除磷酸二酯(PO)键以外的键，其将两个核苷共价偶联在一起。本发明的寡核苷酸因此可包含一个或多个修饰的核苷间键，诸如一个或多个硫代磷酸酯核苷间键，或一个或多个二硫代磷酸酯核苷间键。

在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的至少50％的核苷间键是硫代磷酸酯，诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少75％、诸如至少80％或诸如至少90％的寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的核苷间键是硫代磷酸酯。在一些实施例中，寡核苷酸的所有核苷间键或其连续核苷酸序列是硫代磷酸酯。

再一些有利的实施例中，寡核苷酸的连续核苷酸序列的所有核苷间键都是硫代磷酸酯，或寡核苷酸的所有核苷间键都是硫代磷酸酯键。

应当认识到，如EP 2 742 135中所公开的，反义寡核苷酸可包含其他核苷间键(除磷酸二酯、硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯以外)，例如烷基膦酸酯/甲基膦酸酯核苷间，其根据EP 2 742 135可以例如以其他方式被DNA硫代磷酸酯的间隔区域中所耐受。

核碱基

术语“核碱基”包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。在本发明的上下文中，术语核碱基还包括修饰的核碱基，其可不同于天然存在的核碱基，但在核酸杂交过程中为功能性的。在此上下文中，“核碱基”是指天然存在的核碱基，诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。此类变体例如描述于Hirao等人(2012)，Accounts of Chemical Research，第45卷第2055页和Bergstrom(2009)CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry，增刊37 1.4.1中。

在一些实施例中，通过以下方式修饰核碱基部分：将嘌呤或嘧啶改变为修饰的嘌呤或嘧啶，诸如取代的嘌呤或取代的嘧啶，诸如选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2’-硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。

核碱基部分可由每个相应核碱基的字母代码来表示，例如A、T、G、C或U，其中每个字母可任选地包括具有同等功能的修饰的核碱基。例如，在示例性的寡核苷酸中，核碱基部分选自A、T、G、C和5-甲基胞嘧啶。任选地，对于LNA缺口聚体，可使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。

修饰的寡核苷酸

术语“修饰的寡核苷酸”描述了包含一个或多个糖修饰的核苷和/或修饰的核苷间键的寡核苷酸。术语“嵌合”寡核苷酸是已在文献中用于描述包含修饰的核苷和DNA核苷的寡核苷酸的术语。本发明的反义寡核苷酸优选地是嵌合寡核苷酸。

互补性

术语“互补性”描述了核苷/核苷酸的沃森克里克碱基配对的能力。沃森克里克碱基对为鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。应当理解，寡核苷酸可包含具有修饰的核碱基的核苷，例如经常使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，因此，术语互补性涵盖未修饰的核碱基和修饰的核碱基之间的沃森克里克碱基配对(参见例如Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research，第45卷第2055页和Bergstrom(2009)CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry，增刊37 1.4.1)。

如本文所用，术语“互补性百分比”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的与参考序列(例如靶序列或序列基序)互补的核苷酸的比例(以百分比表示)，该核酸分子跨连续核苷酸序列。因此，通过计数两个序列之间(当与靶序列5′-3′和3′-5′的寡核苷酸序列比对时)互补(形成Watson Crick碱基对)的对准的核碱基数，将其除以寡核苷酸中核苷酸的总数，然后乘以100，来计算互补性的百分比。在此类比较中，未比对(形成碱基对)的核碱基/核苷酸被称为错配。在计算连续核苷酸序列的互补性百分比时，不允许插入和删除。应当理解，在确定互补性时，只要保留了形成Watson Crick碱基配对的核碱基的功能能力，就不考虑核碱基的化学修饰(例如，在计算互补性百分比时，认为5′-甲基胞嘧啶与胞嘧啶相同)。

术语“完全互补”是指100％互补性。

同一性

如本文所用，术语“同一性”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的与参考序列(例如序列基序)相同的核苷酸比例(以百分比表示)，该核酸分子跨连续核苷酸序列。因此，通过计数两个序列(在本发明的化合物的连续核苷酸序列中和在参考序列中)相同(匹配)的对准核碱基数，将该数除以寡核苷酸的核苷酸总数再乘以100，来计算同一性百分比。因此，同一性百分比＝(匹配数×100)/比对区域的长度(例如，连续核苷酸序列)。在计算连续核苷酸序列的同一性百分比时，不允许插入和删除。应当理解，在确定同一性时，只要保留了形成Watson Crick碱基配对的核碱基的功能能力，就不考虑核碱基的化学修饰(例如，在计算同一性百分比时，认为5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶相同)。

杂交

如本文所用，术语“杂交”(hybridizing/hybridizes)应当理解为两条核酸链(例如寡核苷酸和靶核酸)在相反链上的碱基对之间形成氢键，从而形成双链体。两条核酸链之间结合的亲和力为杂交的强度。它通常根据解链温度(T_m)来描述，该解链温度被定义为一半寡核苷酸与靶核酸形成双链体的温度。在生理条件下，T_m并非确实与亲和力严格成比例(Mergny与Lacroix，2003年，Oligonucleotides 13：515-537)。标准状态Gibbs自由能ΔG°为结合亲和力的更精确表示，并且通过ΔG°＝-RTln(K_d)与反应的解离常数(K_d)相关，其中R为气体常数并且T为绝对温度。因此，寡核苷酸和靶核酸之间反应的非常低的ΔG°反映了寡核苷酸和靶核酸之间的强杂交。ΔG°为与反应相关的能量，其中水性浓度为1M，pH为7并且温度为37℃。寡核苷酸与靶核酸的杂交为自发反应，并且对于自发反应，ΔG°小于零。ΔG°可实验上测量，例如，可利用如Hansen等人，1965，Chem.Comm.36-38和Holdgate等人，2005，Drug Discov Today中所述的等温滴定量热法(ITC)方法测量。本领域的技术人员将知道商业设备可用于ΔG°测量。也可以通过使用如SantaLucia，1998，Proc Natl Acad SciUSA.95：1460-1465所述的最近相邻模型，适当使用Sugimoto等人，1995，Biochemistry 34：11211-11216和McTigue等人，2004，Biochemistry 43：5388-5405描述的推导的热力学参数进行估计。为了具有通过杂交调节其预期的核酸靶标的可能性，对于长度为10至30个核苷酸的寡核苷酸，本发明的寡核苷酸与靶核酸以低于-10kcal的估计ΔG°值杂交。在一些实施例中，杂交的程度或强度通过标准状态Gibbs自由能ΔG°测量。对于长度为8-30个核苷酸的寡核苷酸，寡核苷酸可与靶核酸以低于-10kcal、诸如低于-15kcal、诸如低于-20kcal和诸如低于-25kcal的估计ΔG°值杂交。在一些实施例中，寡核苷酸以-10至-60kcal，诸如-12至-40、诸如-15至-30kcal或-16至-27kcal，诸如-18至-25kcal的ΔG°估值与靶核酸杂交。

靶标

如本文所用，术语“靶标”用于指人钠电压门控通道α亚基9(SCN9A)，以及编码人SCN9A的核酸，如本文SEQ ID NO：1所示。SCN9A核酸编码称为Na_v1.7的钠通道的α亚基。

靶核酸

根据本发明，靶核酸是编码人SCN9A的核酸，并且可以例如是基因、RNA、mRNA和前体mRNA、成熟的mRNA或cDNA序列。该靶标因此可以称为SCN9A靶核酸。对于体外和体内用途，优选的靶核酸是编码SCN9A的前体mRNA或mRNA。如果在研究或诊断中采用本发明的寡核苷酸，则靶核酸可以是cDNA或衍生自DNA或RNA的合成核酸。

优选的靶基因是人SCN9A，例如人SCN9A前体mRNA(参见表2中提供的遗传坐标，并且如本文SEQ ID NO：1所示。

表2：人类和食蟹猴SCN9A靶基因的基因组和装配信息

在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO：1的转录物变体-即从人染色体基因座编码的SCN9A基因转录的转录物(坐标在表2中确定)。

靶序列

本文所用的术语“靶序列”意指存在于靶核酸中的核苷酸的序列，其包含与本发明的反义寡核苷酸为互补的核碱基序列。在一些实施例中，靶序列由靶核酸上具有与本发明反义寡核苷酸的连续核苷酸序列互补的核碱基序列的区域组成。靶核酸的这一区域可以互换地称为靶标核苷酸序列、靶序列或靶标区域。在一些实施例中，靶序列比单个寡核苷酸的互补序列更长，并且可以例如代表靶核酸的优选区域，其可以被本发明的几种反义寡核苷酸靶向。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列是互补的，诸如与选自核苷酸SEQ ID NO：1的97704-97732、103232-103259、151831-151847和151949-152006的靶序列互补。

本发明的反义寡核苷酸包含与靶核酸(诸如本文所述的靶序列)互补和杂交的连续核苷酸序列。

与反义寡核苷酸互补的靶序列通常包含至少10个核苷酸的连续核碱基序列。该连续核苷酸序列的长度介于10至30个核苷酸，诸如12至30个、诸如14至20个、诸如长度为15至18个连续核苷酸、诸如长度为15、16、17个连续核苷酸。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸在跨反义寡核苷酸的全长上与靶序列完全互补。

靶细胞

如本文所用，术语“靶细胞”是指表达靶核酸的细胞。在一些实施例中，靶细胞可以是体内或体外的。在一些实施例中，靶细胞是哺乳动物细胞，诸如啮齿动物细胞，诸如小鼠细胞或大鼠细胞，或灵长类动物细胞，诸如猴细胞或人细胞。

通常，靶细胞表达SCN9A mRNA，诸如SCN9A前体mRNA或SCN9A成熟的mRNA。对于实验评估，可以使用表达包含靶序列的核酸的靶细胞。

对于反义寡核苷酸靶向作用，通常不考虑SCN9A mRNA的聚腺苷(poly A)尾部。

本发明的反义寡核苷酸通常能够抑制SCN9A靶核酸在表达SCN9A靶核酸的细胞(靶细胞)中的表达，例如体内或体外。

本发明的反义寡核苷酸的核碱基的连续序列在反义寡核苷酸的长度上测量的结果通常与SCN9A靶核酸互补，诸如完全互补，诸如SEQ ID NO：1，任选的是排除可以将反义寡核苷酸联接至诸如缀合物等任选官能基团或其他非互补末端核苷酸(例如区域D或D′)。靶核酸可以例如是编码SCN9A的信使RNA，诸如成熟的mRNA或前体mRNA。

天然存在的变体

术语“天然存在的变体”是指SCN9A基因或转录本的变体，其源自与靶核酸相同的遗传基因座，但是可能例如由于遗传密码的简并性导致编码相同氨基酸的密码子的多样性而不同，或由于前体mRNA的可变剪接、或存在多态性诸如单核苷酸多态性(SNP)和等位基因变体而不同。基于与寡核苷酸足够互补序列的存在，本发明的寡核苷酸因此可以靶向靶核酸及其天然存在的变体。

在一些实施例中，天然存在的变体与哺乳动物SCN9A靶核酸具有至少95％，诸如至少98％或至少99％的同源性，诸如选自由SEQ ID NO：1组成的组的靶核酸。在一些实施例中，天然存在的变体与SEQ ID NO：1的人SCN9A靶核酸具有至少99％的同源性。

表达的抑制

如本文所用，术语“表达的抑制”应理解为，寡核苷酸抑制靶细胞中SCN9A的数量或活性的能力的总称。活性的抑制可以通过测量SCN9A前体mRNA或SCN9A mRNA的水平，或通过测量细胞中SCN9A或SCN9A活性的水平来确定。因此，可以在体外或体内确定表达的抑制。SCN9A表达的抑制也可以通过测量Na_v1.7活性或蛋白质水平来确定。

通常，通过比较由于向靶细胞施用有效量的反义寡核苷酸而导致的对活性的抑制并将该水平与从未施用反义寡核苷酸的靶细胞(对照实验)获得的参考水平或已知的参考水平(例如，在施用有效量的反义寡核苷酸之前的表达的水平，或预先确定的或以其他方式已知的表达水平)进行比较来确定表达的抑制。

例如，对照实验可以是动物或人，或用盐水组合物或参考寡核苷酸(通常是乱序对照)处理的靶细胞。

术语抑制(名词)或抑制(动词)也可称为下调、降低、抑制、减少、减低SCN9A的表达。

表达的抑制可能例如通过降解前体mRNA或mRNA(例如，使用RNaseH募集寡核苷酸，例如缺口聚体)发生。

高亲和力修饰的核苷

高亲和力修饰的核苷是一种经修饰的核苷，当并入反义寡核苷酸中时，可增强反义寡核苷酸对其互补靶的亲和力，例如以解链温度(Tm)所测定的。本发明的高亲和力修饰的核苷优选地使每一经修饰的核苷的解链温度增加介于+0.5℃至+12℃之间，更优选地是介于+1.5℃至+10℃之间，最优选地是介于+3℃至+8℃之间。许多高亲和力修饰的核苷是本领域已知的，并且包括例如许多2′取代的核苷以及锁定的核酸(LNA)(参见例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443和Uhhmann；Curr.Opinion in DrugDevelopment，2000，3(2)，293-213)。

糖修饰

与DNA和RNA中发现的核糖部分相比时，本发明的反义寡核苷酸可包含一种或多种具有经修饰的糖部分(即糖部分的修饰)的核苷。

已经制备了许多具有核糖糖部分的修饰的核苷，主要目的为改善寡核苷酸的某些特性，诸如亲和力和/或核酸酶抗性。

此类修饰包括其中核糖环结构如下被修饰的那些：例如通过用己糖环(HNA)或通常在核糖环上的C2和C4碳之间具有双基桥的双环(LNA)或通常在C2和C3碳之间缺乏键的未连接的核糖环(例如UNA)替换。其他糖修饰的核苷包括，例如，双环己糖核酸(WO2011/017521)或三环核酸(WO2013/154798)。修饰的核苷还包括其中糖部分被非糖部分替换的核苷，例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下。

糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基改变为除氢以外的基团或DNA和RNA核苷中天然存在的2′-OH基团而进行的修饰。例如，可在2′、3′、4′或5′位置引入取代基。

2′糖修饰的核苷

2′糖修饰的核苷为在2′位置具有除H或-OH以外的取代基的核苷(2′取代的核苷)，或包含能够在2′碳和核糖环中的第二个碳之间形成桥的2′连接的双基，诸如LNA(2′-4′双基桥连)核苷。

事实上，人们已花费很多精力开发2′糖取代的核苷，并且发现许多2′取代的核苷掺入反义寡核苷酸后具有有益的特性。例如，2′修饰的糖可以提供增强的结合亲和力和/或增加的对反义寡核苷酸的核酸酶抗性。2′取代的修饰的核苷的实例是2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2′-氨基-DNA、2′-氟-RNA和2′-F-ANA核苷。有关进一步的实例，请参见例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development，2000，3(2)，293-213以及Deleavey和Damha，Chemistry and Biology 2012，19，937。下面为一些2′取代的修饰的核苷的示意图。

关于本发明，2′取代的糖修饰的核苷不包括像LNA那样的2′桥连的核苷。

锁定的核酸核苷(LNA核苷)

“LNA核苷”为2′-修饰的核苷，其包含联接所述核苷的核糖糖环的C2′和C4′的双基(也称为“2′-4′桥”)，其限制或锁定核糖环的构象。这些核苷在文献中也被称为桥连核酸或双环核酸(BNA)。当将LNA掺入互补RNA或DNA分子的反义寡核苷酸中时，核糖构象的锁定与杂交的增强亲和力(双链体稳定化)有关。这可通过测量反义寡核苷酸/互补双链体的解链温度来常规确定。

非限制性的示例性LNA核苷公开于WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO2008/150729、Morita等人，Bioorganic&Med.Chem.Lett.12，73-76，Seth etal.J.Org.Chem.2010，Vol 75(5)pp.1569-81和Mitsuoka et al.，Nucleic AcidsResearch 2009，37(4)，1225-1238以及Wan和Seth，J.Medical Chemistry 2016，59，9645-9667中。

其他非限制性的示例性LNA核苷公开于方案1中。

方案1：

特定的LNA核苷是β-D-氧基-LNA、6′-甲基-β-D-氧基LNA诸如(S)-6′-甲基-β-D-氧基-LNA(ScET)和ENA。一种特别有利的LNA是β-D-氧基-LNA。

示例性核苷，具有HELM注释

DNA核苷

β-D-氧基-LNA核苷

2′-O-甲基核苷

具有HELM注释的示例性p硫代磷酸酯核苷间键

[sP].

虚线表示每个核苷与5′或3′硫代磷酸酯核苷间键之间的共价键。在5′末端核苷，5′虚线表示与氢原子的键(形成5′末端-OH基团)。在3′末端核苷，3′虚线表示与氢原子的键(形成3′末端-OH基团)。

RNase H活性和募集

反义寡核苷酸的RNase H活性是指当其与互补RNA分子形成双链体时募集RNase H的能力。WO01/23613提供了用于确定RNase H活性的体外方法，该方法可用于确定募集RNase H的能力。如果在向反义寡核苷酸提供互补靶核酸序列时具有以下初始速率(以pmol/l/min计)，则一般认为其能够募集RNase H，该初始速率是使用WO01/23613(通过引用在此并入)的实例91至95提供的方法学，使用具有与所测试的经修饰的寡核苷酸相同的碱基序列但在反义寡核苷酸中的所有单体之间仅包含具有硫代磷酸酯键的DNA单体的寡核苷酸确定的初始速率的至少5％，诸如至少10％或超过20％。为了用于确定RNase H活性，可从Creative

(与大肠杆菌中表达的His标签融合的重组人RNASEH1)获得重组人RNase H1。

缺口聚体

本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可以是缺口聚物，也称为缺口聚物反义寡核苷酸或缺口聚物设计。缺口聚体一般用于通过RNase H介导的降解来抑制靶核酸。缺口聚体寡核苷酸包含至少三个不同的结构区域，即′5->3′方向的5′-侧翼、缺口和3′侧翼F-G-F′。“缺口”区域(G)包含一段使缺口聚体能够募集RNase H的连续DNA核苷酸。该缺口区域的侧翼是包含一个或多个糖修饰的核苷(优选地是高亲和力糖修饰的核苷)的5′侧翼区域(F)，以及包含一个或多个糖修饰的核苷(优选地是高亲和力糖修饰的核苷)的3′侧翼区域(F′)。区域F和F′中的一个或多个糖修饰的核苷增强缺口聚体对靶核酸的亲和力(即，亲和力增强的糖修饰的核苷)。在一些实施例中，区域F和F′中的一个或多个糖修饰的核苷是2′糖修饰的核苷，诸如高亲和力的2′糖修饰，诸如独立地选自LNA和2′-MOE。

在缺口聚体设计中，缺口区域的5′和3′最末端核苷是DNA核苷，分别位于5′(F)或3′(F′)区域的糖修饰核苷附近。侧翼可进一步定义为在距缺口区域最远的端，即在5′侧翼的5′端和3′侧翼的3′端，具有至少一个糖修饰的核苷。

区域F-G-F′形成连续核苷酸序列。本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可包含式F-G-F′的缺口聚体区域。

缺口聚体设计F-G-F′的总长度可以是例如12至32个核苷，诸如13至24个核苷，诸如14至22个核苷，诸如14至17个核苷，诸如16至18个核苷。

举例而言，本发明的缺口聚体寡核苷酸可由下式代表：

F_1-8-G_5-16-F′_1-8，诸如

F_1-8-G_7-16-F′_2-8

前提条件是缺口聚体区域F-G-F′的总长度至少为12，诸如至少14个核苷酸。

在本发明的方面，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列由式5′-F-G-F′-3′的缺口聚体组成或包含式5′-F-G-F′-3′的缺口聚物，其中区域F和F′独立地包含1-8个核苷或由1至8个核苷组成，其中1至4个经2′糖修饰且限定F和F′区域的5′和3′端，并且G为能够募集RNaseH的介于6个与16个核苷之间的区域。

区域F、G和F′进一步定义如下，并且可结合到F-G-F′式中。

LNA缺口聚体

LNA缺口聚体是其中区域F和F′中的一者或两者包含LNA核苷或由LNA核苷组成的缺口聚体。β-D-氧基缺口聚体是其中区域F和F′中的一者或两者包含β-D-氧基LNA核苷或由其组成的缺口聚体。

在一些实施例中，LNA缺口聚体具有下式：[LNA]_1-5-[区域G]-[LNA]_1-5，其中区域G是或包含能够募集RNase H的连续DNA核苷区域.

MOE缺口聚体

MOE缺口聚体是其中区域F和F1由MOE核苷所构成的缺口聚体。在一些实施例中，MOE缺口聚体的设计为[MOE]_1-8-[区域G]_5-16-[MOE]_1-8，诸如[MOE]_2-7-[区域G]_6-14-[MOE]_2-7，诸如[MOE]_3-6-[区域G]_8-12-[MOE]_3-6，其中区域G具有如缺口聚体定义中的定义。具有5-10-5设计(MOE-DNA-MOE)的MOE缺口聚体已广泛用于本技术领域中。

混合型翼缺口聚体

混合型翼缺口聚体为以下LNA缺口聚体，其中区域F和区域F′中的一者或两者包含2′取代的核苷，诸如独立地选自由以下项组成的组的2′取代的核苷：2′-O-烷基-RNA单元、2′-O-甲基-RNA、2′-氨基-DNA单元、2′-氟-DNA单元、2′-烷氧基-RNA、MOE单元、阿糖核酸(ANA)单元和2′-氟-ANA单元诸如MOE核苷。在一些实施例中，其中区域F和F′中的至少一者或区域F和F′两者均包含至少一个LNA核苷，区域F和F′的其余核苷独立地选自由MOE和LNA组成的组。在一些实施例中，其中区域F或F′中的至少一者或区域F和F′两者均包含至少两个LNA核苷，区域F和F′的其余核苷独立地选自由MOE和LNA组成的组。在一些混合型翼的实施例中，区域F和F′中的一者或两者可进一步包含一个或多个DNA核苷。

交替侧翼缺口聚体

侧翼区域可包含LNA和DNA核苷两者，并且由于其包含LNA-DNA-LNA核苷的交替基序，因此称为“交替侧翼”。包含此种交替侧翼的缺口聚体称为“交替侧翼缺口聚体”。因此，“交替侧翼缺口聚体”是LNA缺口聚体寡核苷酸，其中至少一个侧翼(F或F′)除LNA核苷以外还包含DNA。在一些实施例中，区域F或F′中的至少一者或两者都包含LNA核苷和DNA核苷两者。在此类实施例中，侧翼区域F或F′，或F和F′两者，包含至少三个核苷，其中F和/或F′区域的5′和3′最末端核苷为LNA核苷。

反义寡核苷酸中的区域D′或D″

本发明的反义寡核苷酸可在一些实施例中包含或由所述寡核苷酸的所述连续核苷酸序列以及其他的5′和/或3′核苷组成，所述连续核苷酸序列与所述靶核酸(诸如缺口聚体区域F-G-F′)互补。所述其他的5′和/或3′核苷可与或不与所述靶核酸为完全互补。此类其他的5′和/或3′核苷在本文中可称为区域D′和D″。

出于将连续核苷酸序列(诸如缺口聚体)与缀合物部分或另一个官能团接合的目的，可以使用添加区域D′或D″。当用于将连续核苷酸序列与缀合物部分接合时，其可用作可生物裂解的接头。另选地，其可用于提供核酸外切酶保护或促进合成或制造。

可以将区域D′和D″分别连接到区域F的5′端或区域F′的3′端，以生成下式：D′-F-G-F′、F-G-F′-D″或D′-F-G-F′-D″。在这种情况下，F-G-F′是反义寡核苷酸的缺口聚体部分，且区域D′或D″构成反义寡核苷酸的单独部分。

区域D′或D″可以独立地包含1个、2个、3个、4个或5个另外的核苷酸或由其组成，它们可以与靶核酸互补或不互补。与F或F′区域相邻的核苷酸不是糖修饰的核苷酸，诸如DNA或RNA或这些的碱基修饰形式。D′或D″区域可以用作核酸酶敏感的可生物裂解的接头(参见接头的定义)。在一些实施例中，另外的5′和/或3′端核苷酸与磷酸二酯键连接，并且是DNA或RNA。WO2014/076195中公开了适合用作区域D′或D″的基于核苷酸的可生物裂解的接头，其包括例如磷酸二酯连接的DNA二核苷酸。WO2015/113922中公开了在聚寡核苷酸构建体中可生物裂解的接头的用途，其中它们被用于在单个反义寡核苷酸内连接多个反义构建体(例如缺口聚体区域)。

在一个实施例中，本发明的反义寡核苷酸除构成缺口聚体的连续核苷酸序列外还包含区域D′和/或D″。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸可由下式代表：

F-G-F′；特别是F_1-8-G_5-16-F′_2-8

D′-F-G-F′，特别是D′_1-3-F_1-8-G_5-16-F′_2-8

F-G-F′-D″，特别是F_1-8-G_5-16-F′_2-8-D″_1-3

D′-F-G-F′-D″，特别是D′_1-3-F_1-8-G_5-16-F′_2-8-D″_1-3

在一些实施例中，区域D′与区域F之间的核苷间键是磷酸二酯键。在一些实施例中，区域F′与区域D″之间的核苷间键是磷酸二酯键。

缀合物

如本文所用，术语“缀合物”是指与非核苷酸部分(缀合物部分或区域C或第三区域)共价连接的反义寡核苷酸。缀合物部分可以与反义寡核苷酸共价连接，任选地经由接头基团，例如区域D′或D″。

反义寡核苷酸缀合物及其合成也已报导在Manoharan的综述中(Antisense DrugTechnology，Principles，Strategies，and Applications，S.T.Crooke，ed.，Ch.16，MarcelDekker，Inc.，2001and Manoharan，Antisense and Nucleic Acid Drug Development，2002，12，103)。

在一些实施例中，所述非核苷酸部分(缀合物部分)选自由碳水化合物(例如GalNAc)、细胞表面受体配体、药物、激素、亲脂性物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素(例如细菌毒素)、维生素、病毒蛋白质(例如衣壳)或其组合组成的组。

接头

键或接头是两个原子之间的连接，其经由一个或多个共价键将一个目标化学基团或区段与另一个目标化学基团或区段连接。缀合物部分可直接或通过连接部分(例如接头或系链)连接到寡核苷酸。接头用于将第三区域诸如缀合物部分(区域C)与第一区域共价连接，该第一区域例如与靶核酸互补的反义寡核苷酸或连续核苷酸序列(区域A)。

在本发明的一些实施例中，本发明的缀合物或反义寡核苷酸缀合物可以任选地包含位于与靶核酸互补的反义寡核苷酸或连续核苷酸序列(区域A或第一区域)和缀合物部分(区域C或第三区域)之间的接头区域(第二区域或区域B和/或区域Y)。

区域B是指包含生理上不稳定的键或由其组成的可生物裂解的接头，该键在哺乳动物体内通常遇到的条件下或与之相似的条件下可裂解。生理上不稳定的接头经历化学转化(例如裂解)的条件包括化学条件，诸如pH、温度、氧化或还原条件或试剂，以及在哺乳动物细胞中遇到的盐浓度或与之相似的盐浓度。哺乳动物细胞内条件还包括通常存在于哺乳动物细胞中的酶活性，诸如来自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶的酶活性。在一个实施例中，可生物裂解的接头对S1核酸酶裂解敏感。在一些实施例中，核酸酶敏感接头包含1至5个核苷，诸如包含至少两个连续磷酸二酯键的DNA核苷。包含可生物裂解的接头的磷酸二酯的详细说明请参阅WO2014/076195。

区域Y是指不一定是可生物裂解的但主要用于将缀合物部分(区域C或第三区域)与反义寡核苷酸(区域A或第一区域)共价连接的接头。区域Y接头可以包含重复单元诸如乙二醇、氨基酸单元或氨基烷基的链结构或寡聚物。本发明的反义寡核苷酸缀合物可以由以下区域性元件A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C或A-Y-C构成。在一些实施例中，接头(区域Y)为氨基烷基(诸如C2-C36氨基烷基基团)，包括例如C6至C12氨基烷基基团。在一些实施例中，接头(区域Y)是C6氨基烷基基团。在一些实施例中，接头为NA。

治疗

本文所用的术语“治疗”是指既存疾病(例如本文所指的疾病或病症)的治疗或疾病的阻止(即预防)。因此将认识到，在一些实施例中，本文所指的治疗可以是预防性的。

具体实施方式

本发明的反义寡核苷酸

本发明的反义寡核苷酸是靶向SCN9A的反义寡核苷酸。

反义寡核苷酸

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸能够通过抑制或调降靶标的表达而对其产生调节的效果。优选地，与靶标的正常表达水平相比，这种调节产生至少20％的表达抑制，更优选地与靶标的正常表达水平相比，至少30％、至少40％、至少50％的抑制。在一些实施例中，在将0.031μM、0.1μM和0.4μM反义寡核苷酸施加到SK-N-AS细胞后，本发明的反义寡核苷酸可以能够在体外将SCN9A mRNA的表达水平抑制至少60％或70％。在一些实施例中，在将0.031μM、0.1μM和0.4μM寡核苷酸施加到SK-N-AS细胞后，本发明的反义寡核苷酸能够在体外将SCN9A蛋白质的表达水平抑制至少50％。适当地，实例中提供了可用于测量SCN9ARNA或蛋白质抑制的测定(例如参见实例1及实例3)。在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸能够以不超过1μM，更优选不超过0.5μM的半最大有效浓度(EC50)抑制细胞中靶RNA或蛋白质的表达水平。例如，在将寡核苷酸施加到SK-N-AS细胞后，反义寡核苷酸能够以不超过0.3μM，诸如不超过0.20μM，诸如不超过0.15μM，诸如不超过0.10μM，诸如不超过0.08μM，诸如不超过0.07μM，诸如不超过0.06μM、0.05μM、0.04μM或0.03μM的EC50抑制SCN9A mRNA(或蛋白质)的表达水平。在一些实施例中，反义寡核苷酸能够以0.03μM至0.15μM的范围内，诸如在0.05μM至0.10μM的范围内，诸如约0.07μM的EC50抑制SK-N-AS细胞中SCN9A mRNA的表达水平。适当地，这可以在实例3中提供的测定中进行评估。

本发明的反义寡核苷酸还可能够以对靶核酸例如SCN9A mRNA的高选择性为特征。在一些实施例中，反义寡核苷酸可以在表达包含靶序列的核酸的靶细胞中减少很少数或零个脱靶核酸的表达，诸如不超过20个，诸如不超过15个，诸如不超过12个，诸如不超过10个，诸如不超过8、7、6、5、4、3、2或1个脱靶基因，或零个脱靶基因，例如当以对应于该反义寡核苷酸在SK-N-AS细胞中的EC50约50倍的浓度施加到靶细胞时。应当理解的是，“脱靶基因”包括不是SCN9A基因或基因转录本(例如mRNA)但其表达被反义寡核苷酸降低的任何基因或基因转录本。优选地，当以约3μM的浓度的施加到人类神经元细胞时，例如，人iCellGlutaNeuron(参见表10)，反义寡核苷酸可以减少不超过5个、诸如不超过3个、诸如不超过1个、诸如零个脱靶基因的表达。实例4中提供了用于评估反义寡核苷酸的选择性的合适测定。在一些实施例中，脱靶基因可以定义为当在实例4的测定中测试时，相对于对照条件(调整后的p值＜0.05)具有降低的表达，任选地，基于结合亲和力预测还属于前1％的预测脱靶基因或还能够结合到相应的未剪接转录本(有1个错配)。

通过反义寡核苷酸的连续核苷酸序列与靶核酸之间的杂交触发靶标调节。在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸包含反义寡核苷酸和靶核酸之间的错配。尽管错配，与靶核酸的杂交仍可足以显示出所需的SCN9A表达的调节。由错配导致降低的结合亲和力可以优选地通过寡核苷酸中核苷酸数量的增加和/或能够提高与靶标的结合亲和力的修饰核苷数量的增加来补偿，所述修饰核苷诸如存在于寡核苷酸序列中的2′糖修饰的核苷，包括LNA。

本发明的一方面涉及反义寡核苷酸，其包含长度为10个至30个核苷酸的连续核苷酸序列，该序列与SCN9A前体mRNA(诸如SEQ ID NO：1)或由其衍生的转录变体至少90％互补。

在一些实施例中，反义寡核苷酸包含长度为10个至30个核苷酸的连续序列，该序列与靶核酸的区域或靶序列至少90％互补，诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％或100％互补。

如果本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列与靶核酸的区域完全互补(100％互补)，或者在一些实施例中可包含反义寡核苷酸与靶核酸之间的一个或两个错配，则是优选的。

在一些实施例中，反义寡核苷酸包含长度为10个至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其与SEQ ID NO：1中存在的靶核酸区域至少90％互补，诸如完全(或100％)互补，所述区域选自由以下项组成的组：选自SEQ ID NO：1的核苷酸97704-97732、103232-103259、151831-151847和151949-152006。

在一些实施例中，反义寡核苷酸包含长度为14个至20个核苷酸的连续核苷酸序列，其与SEQ ID NO：1中存在的靶核酸区域完全(或100％)互补，所述区域选自由以下项组成的组：选自SEQ ID NO：1的核苷酸97704-97732、103232-103259、151831-151847和151949-152006。

在一些实施例中，反义寡核苷酸包含长度为15个核苷酸的连续核苷酸序列，其与SEQ ID NO：1中存在的靶核酸区域完全(或100％)互补，所述区域选自由以下项组成的组：选自SEQ ID NO：1的核苷酸97704-97732、103232-103259、151831-151847和151949-152006。

在一些实施例中，反义寡核苷酸包含长度为16个核苷酸的连续核苷酸序列，其与SEQ ID NO：1中存在的靶核酸区域完全(或100％)互补，所述区域选自由以下项组成的组：选自SEQ ID NO：1的核苷酸97704-97732、103232-103259、151831-151847和151949-152006。

在一些实施例中，反义寡核苷酸包含长度为17个核苷酸的连续核苷酸序列，其与SEQ ID NO：1中存在的靶核酸区域完全(或100％)互补，所述区域选自由以下项组成的组：选自SEQ ID NO：1的核苷酸97704-97732、103232-103259、151831-151847和151949-152006。

在一些实施例中，反义寡核苷酸包含长度为18个核苷酸的连续核苷酸序列，其与SEQ ID NO：1中存在的靶核酸区域完全(或100％)互补，所述区域选自由以下项组成的组：选自SEQ ID NO：1的核苷酸97704-97732、103232-103259、151831-151847和151949-152006。

在一些实施例中，反义寡核苷酸包含长度为19个核苷酸的连续核苷酸序列，其与SEQ ID NO：1中存在的靶核酸区域完全(或100％)互补，所述区域选自由以下项组成的组：选自SEQ ID NO：1的核苷酸97704-97732、103232-103259、151831-151847和151949-152006。

在一些实施例中，反义寡核苷酸包含长度为20个核苷酸的连续核苷酸序列，其与SEQ ID NO：1中存在的靶核酸区域完全(或100％)互补，所述区域选自由以下项组成的组：选自SEQ ID NO：1的核苷酸97704-97732、103232-103259、151831-151847和151949-152006。

在一些实施例中，反义寡核苷酸包含长度为21个核苷酸的连续核苷酸序列，其与SEQ ID NO：1中存在的靶核酸区域完全(或100％)互补，所述区域选自由以下项组成的组：选自SEQ ID NO：1的核苷酸97704-97732、103232-103259、151831-151847和151949-152006。

在一些实施例中，反义寡核苷酸包含长度为22个核苷酸的连续核苷酸序列，其与SEQ ID NO：1中存在的靶核酸区域完全(或100％)互补，所述区域选自由以下项组成的组：选自SEQ ID NO：1的核苷酸97704-97732、103232-103259、151831-151847和151949-152006。

在一些实施例中，反义寡核苷酸包含与选自由SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26和27组成的组的靶核酸的区域至少90％互补，诸如至少95％互补的连续核苷酸序列。

在一些实施例中，反义寡核苷酸包含与选自由SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26和27组成的组的靶核酸的区域完全(或100％)互补的连续核苷酸序列。

本发明的反义寡核苷酸包含与靶核酸的区域(诸如本文所述的靶序列)互补或杂交的连续核苷酸序列。

与治疗性反义寡核苷酸互补或杂交的靶核酸序列通常包含一段至少10个核苷酸的连续核碱基。该连续核苷酸序列的长度介于12个至70个核苷酸，诸如12个至50个、诸如13个至30个、诸如14个至25个、诸如14个至20个连续核苷酸之间。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列在其长度上包含10个至30个核苷酸或由其组成，诸如在长度上包含从12个至25个，诸如11个至22个，诸如从12个至20个，诸如从14个至18个或14个至16个连续核苷酸或由其组成。

在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含22个或更少的核苷酸(诸如20个或更少的核苷酸，诸如18个或更少的核苷酸，诸如14、15、16或17个核苷酸)或由其组成。应当理解的是，本文中给出的任何范围均包括范围的端点。因此，如果说反义寡核苷酸包含10个至30个核苷酸，则包括10个和30个核苷酸两者。

在一些实施例中，所述连续核苷酸序列在长度上包含10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个连续核苷酸或由其组成。

在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含选自SEQ ID NO：28-52的序列或由其组成。在一些实施例中，连续核苷酸序列在长度上包含12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或22个连续核苷酸或由其组成。

在优选地的实施例中，本发明的反义寡核苷酸包含一个或多个糖修饰的核苷，诸如一个或多个2′糖修饰的核苷，诸如一个或多个2′糖修饰的核苷独立地选自2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA、2′-氨基-DNA、2′-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2′-氟-ANA和LNA核苷。如果一个或多个修饰的核苷是锁定的核酸(LNA)，则是优选的。

在一些实施例中，连续核苷酸序列包含LNA核苷。

在一些实施例中，连续核苷酸序列包含LNA核苷和DNA核苷。

在一些实施例中，连续核苷酸序列包含LNA核苷和DNA核苷以及2′-O-甲基RNA核苷。

在一些实施例中，连续核苷酸序列包含LNA核苷和DNA核苷以及2′-O-甲基RNA核苷，并且连续核苷酸键的每个核苷之间的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。

在一些实施例中，连续核苷酸序列包含2′-O-甲氧基乙基(2′MOE)核苷。

在一些实施例中，连续核苷酸序列包含2′-O-甲氧基乙基(2′MOE)核苷和DNA核苷。

优选地，反义寡核苷酸的3′末端核苷或其连续核苷酸序列是2′糖修饰的核苷。

优选地，反义寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键，例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。

在一些实施例中，连续核苷酸序列中的至少一个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。

在一些实施例中，连续核苷酸序列中的至少一个核苷间键是二硫代磷酸酯核苷间键。

在一些实施例中，连续核苷酸序列中的至少一个核苷间键是磷酸二酯核苷间键。

在一些实施例中，连续核苷酸序列中的所有核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。

在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的至少75％核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。

在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的所有核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。

在本发明的一个有利的实施例中，本发明的反义寡核苷酸能够募集RNase H，诸如RNase H1。在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列是一个缺口聚体。

在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列，包含式5′-F-G-F′-3′的缺口聚体或由其组成。

在一些实施例中，区域G由6个至16个DNA核苷组成。

在一些实施例中，区域F和F′各自包含至少一个LNA核苷。

表3：本发明提供以下反义寡核苷酸化合物

其中没带下划线的大写字母为β-D-氧基LNA核苷，小写字母为DNA核苷，所有LNA C均为5-甲基胞嘧啶，所有核苷间键均为硫代磷酸酯核苷间键，并且带下划线的大写字母为2′-O-甲基RNA核苷。

药用盐

在另一方面，本发明提供了反义寡核苷酸或其缀合物的药用盐，诸如药用钠盐、铵盐或钾盐。

制造方法

在另一方面，本发明提供了用于制造本发明的反义寡核苷酸的方法，该方法包括使核苷酸单元反应并由此形成包含在反义寡核苷酸中的共价连接的连续核苷酸单元。优选地，该方法使用亚磷酰胺化学方法(参见例如Caruthers et al，1987，Methods inEnzymology vol.154，pages 287-313)。在另一个实施例中，该方法进一步包括使连续核苷酸序列与缀合部分(配体)反应以将缀合物部分共价附着到反义寡核苷酸。在另一方面，提供了一种用于制造本发明的组合物的方法，该方法包括将本发明的反义寡核苷酸或缀合的反义寡核苷酸与药用稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂混合。

药物组合物

在另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含前述反义寡核苷酸和/或反义寡核苷酸缀合物或其盐以及药用稀释剂、载体、盐和/或佐剂中的任一者。药用稀释剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)，且药用盐包括但不限于钠盐和钾盐。在一些实施例中，药用稀释剂是无菌磷酸盐缓冲盐水或无菌碳酸钠缓冲液。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸是在药用稀释剂中的溶液形式，例如溶解在PBS或碳酸钠缓冲液中。在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸或其药用盐为固体形式，诸如粉末、诸如冻干粉末。在一些实施例中，反义寡核苷酸可以预先配制在溶液中，或者在一些实施例中，可以是干粉(例如冻干粉)的形式，其可以在施用前溶解在药用稀释剂中。

适当地，例如反义寡核苷酸能够以0.1-100mg/ml(诸如1-10mg/ml)的浓度溶解在药用稀释剂中。

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸配制成介于0.5-100mg之间(诸如1mg-50mg或2-25mg)的单位剂量。

在一些实施例中，反义寡核苷酸以50-300μM的浓度在药用稀释剂中使用。

本发明的反义寡核苷酸或反义寡核苷酸缀合物可与药用活性或惰性物质混合，用以制备药物组合物或制剂。药物组合物的组成和配制方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径、疾病程度或施用剂量。

药物组合物(诸如溶液)可以通过常规的灭菌技术进行灭菌，或者可以进行无菌过滤。所得的溶液可以包装后直接使用或冻干，在施用前将冻干的制剂与无菌水性载体混合。制剂的pH通常为介于3至11之间，更优选地介于5和9之间或介于6和8之间，并且最优选地介于7和8之间，诸如7至7.5。可以将固体形式的所得组合物包装在多个单剂量单元中，每一个单元包含固定量的一种或多种上述试剂，诸如在片剂或胶囊的密封包装中。固体形式的组合物也可以灵活的量包装在容器中，诸如在设计用于局部适用的乳膏或软膏的可挤压管中。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸或反义寡核苷酸缀合物是前药。特别地，对于反义寡核苷酸缀合物，一旦前药被递送至作用位点例如靶细胞，缀合物部分就从反义寡核苷酸上裂解下来。

应用

本发明的反义寡核苷酸可作为研究试剂使用，例如用于诊断、治疗和预防。

在研究中，此类反义寡核苷酸可用于特异性调节细胞(例如体外细胞培养物)和实验动物中Na_v1.7或在某些方面Na_v1.8蛋白质的合成，从而有助于靶标的功能分析或对其作为治疗干预靶标的可用性的评估。通常，通过降解或抑制产生蛋白质的mRNA从而防止蛋白质形成，或通过降解或抑制产生蛋白质的基因或mRNA来实现靶标调节。

如果在研究或诊断中采用本发明的反义寡核苷酸，则靶核酸可以是cDNA或衍生自DNA或RNA的合成核酸。

本发明提供了在表达SCN9A的靶细胞中调节SCN9A表达的体内或体外方法，其包括向所述细胞施用有效量的本发明的反义寡核苷酸。

在一些实施例中，靶细胞是哺乳动物细胞，特别是人细胞。靶细胞可以是形成哺乳动物组织的一部分的体外细胞培养物或体内细胞。在优选的实施例中，靶细胞存在于外周神经系统中，诸如背根神经节。

在诊断中，寡核苷酸可用于通过northern印迹、原位杂交或类似技术检测并定量细胞和组织中的SCN9A表达。

治疗应用

本发明的反义寡核苷酸或本发明的反义寡核苷酸缀合物、盐或药物组合物可施用于动物或人以预防或治疗疼痛，诸如慢性疼痛、神经病性疼痛、炎性疼痛、自发性疼痛，或感受伤害性疼痛。本发明的反义寡核苷酸或本发明的缀合物、盐或药物组合物可用作局部镇痛剂。

可以用本发明的反义寡核苷酸或本发明的反义寡核苷酸缀合物、盐或药物组合物治疗的疼痛可以是周围神经系统中的疼痛信号。与具有显着外周成分的疼痛相关联的适应症包括例如糖尿病性神经病变、癌症、颅神经痛、带状疱疹后神经痛和手术后神经痛。

可以使用本发明的反义寡核苷酸、反义寡核苷酸缀合物、药物组合物或盐来预防、治疗或改善的疼痛可以例如选自由以下项组成的组：与遗传性红斑性肢痛(EIM)、阵发性极度疼痛障碍(PEPD)、三叉神经痛、神经性疼痛(neurophathic)、慢性疼痛相关联的疼痛，但也包括伤害性(例如神经减压术)、神经病性(neuropathic)疼痛(例如糖尿病性神经病变)、内脏痛或混合性疼痛的一般治疗。

本发明提供本发明的反义寡核苷酸、反义寡核苷酸缀合物、组合物或盐用于预防或治疗疼痛的用途，诸如慢性疼痛、神经病性疼痛、炎性疼痛、自发性疼痛或感受伤害性疼痛。

本发明进一步涉及本发明的反义寡核苷酸、反义寡核苷酸缀合物或药物组合物用于制造用于治疗或预防疼痛的药物的用途，诸如慢性疼痛、神经病性疼痛、炎性疼痛、自发性疼痛或感受伤害性疼痛。

本发明提供用作局部镇痛剂的本发明的反义寡核苷酸、反义寡核苷酸缀合物、药物组合物或盐。

本发明提供了本发明的反义寡核苷酸、反义寡核苷酸缀合物、药物组合物或盐用于制造局部镇痛剂的用途。

本发明提供了本发明的反义寡核苷酸、反义寡核苷酸缀合物、药物组合物或盐，其用于预防或治疗与遗传性红斑性肢痛症(EIM)、阵发性极度疼痛症(PEPD)、三叉神经痛、神经性疼痛、慢性疼痛相关联的疼痛，但也包括伤害性(例如神经减压术)、神经病性疼痛(例如糖尿病性神经病变)、内脏痛或混合性疼痛的一般治疗的用途。

本发明进一步涉及本发明的反义寡核苷酸、反义寡核苷酸缀合物或药物组合物用于制造药物的用途，所述药物用于治疗或预防与遗传性红斑性肢痛症(EIM)、阵发性极度疼痛症(PEPD)、三叉神经痛、神经性疼痛、慢性疼痛相关联的疼痛，但也包括伤害性(例如神经减压术)、神经病性疼痛(例如糖尿病性神经病变)、内脏痛或混合性疼痛的一般治疗。

治疗方法

本发明提供治疗或预防患有疼痛或可能患有疼痛的受试者诸如人的疼痛的方法，其包括向患有疼痛或易患有疼痛的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的反义寡核苷酸、反义寡核苷酸缀合物或药物组合物，所述疼痛诸如慢性疼痛、神经病性疼痛、炎性疼痛、自发性疼痛或感受伤害性疼痛。

例如，治疗方法可以在患有选自由糖尿病性神经病变、癌症、颅神经痛、带状疱疹后神经痛和手术后神经痛组成的组的适应症的受试者中进行。

本发明的方法可以用于治疗和缓解疼痛，诸如与遗传性红斑性肢痛症(EIM)、阵发性极度疼痛障碍(PEPD)、三叉神经痛、神经性疼痛、慢性疼痛相关联的疼痛，但也包括伤害性(例如神经减压术)、神经病性疼痛(例如糖尿病性神经病变)、内脏痛或混合性疼痛的一般治疗。

本发明的方法优选用于治疗或预防由Na_v1.7介导的疼痛。

施用

本发明的反义寡核苷酸、反义寡核苷酸缀合物或药物组合物可以经由肠胃外施用来施用。

在一些实施例中，施用途径是皮下或静脉内。

在一些实施例中，施用途径选自由以下项组成的组：静脉内、皮下、肌肉内、脑内、硬膜外、脑室内眼内、鞘内施用和经孔施用。

在一些有利的实施例中，施用是通过鞘内施用、或硬膜外施用或经孔施用。

优选地，本发明的反义寡核苷酸、反义寡核苷酸缀合物或药物组合物是鞘内施用。

本发明还提供本发明的反义寡核苷酸，或其反义寡核苷酸缀合物，诸如本发明的药用盐或组合物用于制造用于预防或治疗疼痛的药物的用途，其中所述药物是鞘内施用的剂型。

本发明还提供如所描述的本发明的反义寡核苷酸或反义寡核苷酸缀合物用于制造用于预防或治疗疼痛的药物的用途，其中所述药物是鞘内施用的剂型。

本发明还提供本发明的反义寡核苷酸，或其反义寡核苷酸缀合物，诸如本发明的药用盐或组合物，作为预防或治疗疼痛的药物使用，其中所述药物是鞘内施用的剂型。

本发明还提供本发明的反义寡核苷酸或反义寡核苷酸缀合物，作为预防或治疗疼痛的药物使用，其中所述药物是鞘内施用的剂型。

联合疗法

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸、反义寡核苷酸缀合物或药物组合物是用于与另一治疗剂联合治疗。治疗剂可以例如是上述疾病或病症的护理标准。在一些实施例中，本发明的化合物与可与本发明的化合物或组合物的同时施用或独立地施用的小分子镇痛剂联合使用。本发明的化合物与小分子镇痛剂的联合治疗的一个优点是小分子镇痛剂具有快速起效的疼痛缓解活性，通常作用持续时间短(数小时-天)，而本发明化合物具有延迟起效的活性(通常几天甚至一周+)，但作用持续时间较长(几周-几个月，例如2+、3+或4个月+)。

实例

实例1：以单一浓度在SK-N-AS细胞系中测试靶向SCN9A的反义寡核苷酸的体外功效

SK-N-AS细胞已按照供应商的建议保存在加湿的孵育箱中。供应商和推荐的培养条件报告在表4中。

表4

对于测定，将细胞接种在培养基中的96孔板中，并如报告在表4中所述孵育，然后添加溶解在5μL PBS中的反义寡核苷酸。反义寡核苷酸的终浓度在下表6中给出。

在添加反义寡核苷酸后72小时收获细胞(参见表4)。根据制造商的说明，使用PureLink^TM Pro 96 RNA纯化试剂盒(Thermo Fisher Scientific)提取RNA，并在50μL水中洗脱。随后将RNA用无DNase/RNase的水(Gibco)稀释10倍，并加热至90℃保持一分钟。

对于基因表达分析，使用qScript^TM XLT One-Step RT-qPCR

LowROX^TM(Quantabio)在双链体设置中进行一步法RT-qPCR。用于qPCR的引物测定在表5中针对靶标和内源性对照品两者进行了整理。

表5

表6：相对人SCN9A mRNA表达水平显示为对照的百分比(PBS处理的细胞)

实例2：选自实例1的化合物的Caspase分析

小鼠3T3细胞在DMEM中培养，HepG2细胞在MEM中培养。所有培养基均补充有10％(v/v)胎牛血清。细胞在37℃和5％CO₂下培养。转染前一天，将细胞接种在96孔板中的100μL不含抗生素的生长培养基中，其密度在转染时导致60％-70％的细胞融合。

2000(Invitrogen)用于在96孔板中转染。反义寡核苷酸在Opti-MEM^TM(Invitrogen)中稀释至所需浓度，总体积为25μL，并与25μL转染复合物(0.25μL

2000和24.75μL Opti-MEM^TM)混合。孵育20分钟后，向溶液中加入50μL无抗生素培养基并混合。从孔中除去培养基后，将100μL反义寡核苷酸：转染剂溶液添加到细胞中并孵育24小时(LNA-ASO转染)。所有处理均重复三次进行。根据制造商在VICTOR3^TM读板器(Perkin Elmer)上的说明，使用

3/7 Assay(Promega)在寡核苷酸转染24小时后测定Caspase-3/7活性。结果如表7所示。

实例3：在浓度响应试验中在SK-N-AS细胞系中测试靶向SCN9A的反义寡核苷酸的体外效力

SK-N-AS细胞按照供应商的建议保存在加湿的孵育箱中。供应商和推荐的培养条件报告在实例1的表4中。

对于测定，将细胞接种在培养基中的96孔板中，并如报告在表4中所述孵育，然后添加溶解在5μL PBS中的反义寡核苷酸。对于浓度响应实验，表9中的寡核苷酸在细胞生长培养基中以10步3.16倍(1/2log)稀释液稀释至最终浓度(从31.6μM到0.001μM)。这允许测试8种化合物pr。96孔板留下16个带有PBS对照的孔。

对于基因表达分析，使用qScript^TM XLT One-Step RT-qPCR

LoWROX^TM(Quantabio)在双链体设置中进行一步法RT-qPCR。用于qPCR的引物测定在表8中针对靶标和内源性对照品两者进行了整理。

表8

SCN9A mRNA的数量基于每个qPCR板上的标准曲线计算。标准曲线的输入RNA是来自同一细胞板(如上所述)上经PBS处理的孔的RNA。将数量标准化为在同一孔中运行的内源性对照基因(GUSB)测定的计算数量。相对靶标数量＝QUANTITY_靶基因(SCN9A)/QUANTITY_内源性对照基因(GUSB)。每个孔的RNA敲除通过除以同一板上所有PBS处理孔的中位数计算。标准化靶标数量＝(相对靶标数量/[平均值]相对靶标数量]_pbs_孔)*100。

为了生成表9中的EC50值，使用四参数Sigmoidal剂量-响应模型从SCN9A的标准化靶标数量拟合曲线。

表9.在浓度响应实验中测试的化合物的EC50。

实例4：测试化合物选择性和潜在的脱靶特征

测试选定的化合物(31_1、39_9和29_25)影响预期SCN9A靶标以外的其他靶标的倾向。

使用以下材料：

·人iCell GlutaNeurons，StemCell Technology GNC-301-030-001，Lot#101442(R1034)

·RhLaminin-521，Biolamina#LN521，100μg/mL

·Brainphys神经元培养基，StemCell Technology#05790

·iCell神经补充剂B#M1029

·iCell神经系统补充剂#M1031

·N2补充剂100x，Thermo Fisher Scientific#17502-048

·24孔培养板，Costar#3524

·来自Engelbreth-Holm-Swarm鼠肉瘤基底膜的层粘连蛋白，Sigma#L2020，1mg/mL

·处理化合物：31_1、39_9和29_25，5mM储备在PBS中，+4℃

·10x HBSS，含Ca2+/Mg2+，Gibco#14065-049

·RLT加裂解缓冲液，Qiagen#1053393+1％b-mEtOH，Sigma#M7522

根据制造商的方案(StemCell Technology)，通过解冻人iCell GlutaNeurons的冷冻细胞悬液制备人iPSC衍生的皮质谷氨酸能神经元(hGN)。将新鲜解冻的细胞重新悬浮在生长培养基(96mL BrainPhys Neuronal培养基；2mL iCell神经补充剂B；1mL iCell神经系统补充剂；1mL N2补充剂，100x)中并接种在24孔板中，接种密度为375,000个细胞/孔。通过向每个孔中加入400μL/孔的1xHBSS(包含10μg/mL层粘连蛋白-521)并在37℃下孵育4小时，将24孔板新涂有层粘连蛋白。细胞培养条件总结在表10中。在培养的第一周，每天更换50％的培养基。在第一周后直到开始添加化合物(第14天)，每隔一天更换50％的培养基。

表10

细胞培养14天后，将测试化合物(31_1、39_9和29_25)直接添加到细胞生长培养基中至其终浓度：3μM和30μM。这些浓度大致对应于SK-N-AS细胞中SCN9a的EC50值的50倍和500倍。孵育72小时后，除去培养基，将细胞在600μL/孔1％b-mEtoH/RLT缓冲液中裂解，然后在-80℃储存直至总RNA分离。

RNA测序分析：

使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)从iPSC衍生的谷氨酸能神经元中分离总RNA，并根据制造商的说明使用TruSeq Stranded mRNA试剂盒(Illumina)进一步加工成测序文库。在NovaSeq仪器(Illumina)上对文库进行测序(2×50bp)。为了估计基因表达水平，通过使用短读段比对器GSNAP将双末端RNASeq读段映射到人类基因组(hg19)上。通过应用SAMtools1.5版和定制的内部工具，将一个基因的所有RefSeq转录变体的映射读段组合成一个值，即每个基因的读段计数。随后，根据Mortazavi等人(Nat Methods 2008 Jul；5(7)：621-8)，通过测序文库大小和基因长度对读段计数进行标准化，表示为rpkms(每百万测序读段中每千碱基转录本的映射读段的数值)。推导出负二项回归模型以校正包含协变量的潜在混杂因素。差异基因表达分析的目的对比是：针对载体，每种LNA以两种不同浓度(3μM和30μM)。每个条件有4个重复。该实现是在R中使用DESeq2包(Love MI，et al.，Genome Biology 2014；15：550 et seq.)进行的。

进行了两个分析。第一分析查看了与对照相比显示出表达变化的所有基因，经调整p值/FDR阈值为0.05。第二分析集中于脱靶候选基因，这些基因被定义为下调(定义为logFC＜0和经调整p值＜0.05)和(i)基于结合亲和力预测的前1％的预测脱靶基因或(ii)与相应的未剪接转录物有1个错配。

表11总结了两个分析的总体结果，而表12和表13分别显示了第一和第二分析的结果的更多细节。数据显示，化合物31_1和39_9对SCN9A敲低具有很强的选择性。在3μM时，化合物31_1的候选脱靶基因为零。

表11.与3μM或30μM化合物孵育后下调或上调的基因总数。

*与对照条件相比，显示表达降低的基因，经调整p值＜0.05，并且(i)是基于结合亲和力预测的前1％的预测脱靶基因或(ii)可以结合到相应的未剪接转录本(有1个错配)。

与对照相比，在表达水平上显示差异的基因。p值＜0.05。

表12. 3uM指定化合物处的失调基因。

表13

*定义为下调基因(定义为logFC＜0和经调整p值＜0.05)，即(i)基于结合亲和力预测的前1％的预测脱靶基因或(ii)可以结合到相应的未剪接转录本(有1个错配)。

实例5：化合物31_1的体内测试

本研究的目的是评估耐受性并优化化合物31_1向食蟹猴(Macaca fascicularis)背根神经节(DRG)的递送(比较高冲洗量与低冲洗量(鞘内剂量注射后))，以及在多个时间点获得DRG中的药代动力学(PK)和药效动力学(PD)读数。剂量水平将保持“自适应”(即交错给药并根据新发现的结果调整剂量)。选择该施用途径是因为它是预期的人类治疗途径并且是可以为DRG提供最佳的化合物递送的途径。

方法

尽可能根据现有的社会群体和分层体重，将研究动物分配到六组，分别表示为组1至组6，每组三只研究动物。

通过鞘内团注1.0mL化合物31_1溶液，随后以0.5mL/kg体重(组1和组2)或0.1mL/kg(组3至组6)的人工脑脊液(aCSF)冲洗，对动物给药。有关详细信息，参见表14。在施用前，收集至少0.5mL CSF(在可行的情况下达到近似剂量体积)并用于CSF分析。

组1和组5：在给药阶段的第43天进行终末期处死。组2、组3和组4：在给药阶段的第15天进行终末期处死。组6：在给药阶段的第64天进行终末期处死。

组织收集

在处死时，在脊柱区域的每个水平处(腰椎、胸椎、颈椎)从每侧(左、右)收集两对DRG，记录所有DRG样品的确切重量。从脊髓中，从腰椎、胸椎和颈椎区域解剖两个样品(最多50mg，记录确切重量)。从大脑中，从以下大脑区域中的每个区域解剖四个样品(最多50mg，记录确切重量)：额叶皮质、枕叶皮质、小脑、海马体。将所有样品放入适当标记的2.0mLPrecellys均质管中，在液氮中速冻并在-70℃或以下储存直至进一步分析。

将样品均质化，用于生物分析。以冷冻在Precellys管中的形式接收所有组织，并将800μl冰冷的细胞破碎缓冲液(PARIS Kit，Catalog#AM1921，Ambion by LifeTechnologies)添加到每个管中。样品在Precellys均质器上均质化(程序取决于组织类型)。匀浆被分成等分试样，用于例如通过hELISA进行RNA分离和暴露分析。

通过hELISA进行暴露分析

材料和方法

试剂和材料如表15所示。将匀浆置于室温(RT)并涡旋，然后加入稀释板。作为用于hELISA的参考标准品，将化合物31_1掺入来自未给药样品的匀浆池中。准备好掺入浓度，使其接近样品的反义寡核苷酸(ASO)含量(通常在～10倍以内)。

样品在5×SSCT缓冲液中稀释。CSF早期时间点的稀释因子范围从5倍(低浓度血浆)到10,000倍稀释。组织样品至少稀释10倍。在每个板上运行与样品基质和稀释因子匹配的适当标准品。将样品和标准品添加到所需设置的稀释板中，并进行稀释系列。将300μL样品/标准品加捕获检测溶液添加到第一孔中，并将150μL捕获检测溶液添加到其余孔中。通过依次转移150μL液体，进行标准品和样品的两倍稀释系列(6步)。稀释的样品在稀释板上在室温下孵育30分钟。

表15.用于化合物31_1的hELISA分析的试剂。

表16.用于化合物31_1的hELISA定量的探针。

类型	修饰	碱基序列	糖修饰
				捕获探针	5′-生物素缀合的	5′-GAAATGGT-3′	完整的LNA修饰的
检测探针	3′-地高辛缀合的	5′-TAAAAETG-3′	完整的LNA修饰的

接下来，将100μL液体从稀释板转移至链霉亲和素板。将板在室温下孵育1小时，同时轻轻搅拌(板振荡器)。用300μL的2 x SSCT缓冲液对孔抽吸并洗涤3次。向每个孔中加入100μL在PBST(同一天制备)中以1∶4000稀释的抗DIG-AP，并在室温下轻轻搅拌孵育1小时。

然后用300μL的2 x SSCT缓冲液对孔抽吸并洗涤3次。最后，向每个孔中加入100μL新制备的底物(AP)溶液。

轻轻搅拌孵育30分钟后，在615nm处用分光光度计测量显色反应的强度。将原始数据从阅读器(Gen5 2.0软件)导出为excel格式，并在excel中进一步分析。使用GraphPadPrism 6软件和逻辑4PL回归模型生成标准曲线。数据点报告为技术重复的平均值。

结果

数据显示，高冲洗量和低冲洗量均在食蟹猴所有腰椎、颈椎和胸椎区域DRG中产生化合物31_1的高暴露(图30)。此外，右侧和左侧DRG的暴露没有显著差异。低冲洗量导致所有分析的大脑区域(额叶皮质、小脑和海马体)的暴露低得多，而高冲洗量导致所有大脑区域的高暴露(图30)。

在给药后14天的时间点达到最高测量暴露，其中C_max在腰椎DRG中超过1000nM(图31)。

通过RNA测序进行表达分析

根据制造商的方案，使用PARIS试剂盒(Catalog#AM1921，Ambion by LifeTechnologies)从组织匀浆中分离RNA。

使用核糖体消耗方案进行测序，获得了2000万个双末端(PE)读段(2×101bp)。在质量评估后进行数据分析，包括去除短读段(读段＜50个核苷酸)和低于Q30的质量。PE读段映射到食蟹猴基因组(参考序列Macaca_fascicularis_5.0(macFas5)，可从UCSC基因组浏览器下载)，并使用软件CLC Genomic Workbench 20版进行基因表达分析。

在先前的研究中已经发现了一组基因，其表达与盐水处理的动物中SCN9A的表达相关。这组基因称为“HK基因”，每个HK基因的表达与SCN9A的Pearson相关性大于0.95。用GM_HK计算并表示盐水处理的动物中HK基因的几何平均值。在每个样品中，GM_HK用于通过以下公式(公式I)标准化SCN9A(X)的表达，其中X_盐水是盐水处理的动物中SCN9A的表达：

鉴于腰椎DRG中的高测量暴露和化合物的效力，可以预期对靶标的有效抑制。

Claims

1.长度为10个至30个核苷酸的反义寡核苷酸，其包含长度为10个至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与选自SEQ ID NO：1的核苷酸97704-97732、103232-103259、151831-151847和151949-152006的人SCN9A前体mRNA的区域完全互补。

2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与选自由SEQ IDNO：29、31、33、39、47和48组成的组的序列100％相同。

3.根据权利要求1或2所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列100％相同：SEQ ID NO：28-52；或其至少14个连续核苷酸。

4.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸不是选自由化合物IDNO29_33、39_13、48_9、29_33、39_13、48_9、29_33、39_13和48_9组成的组的反义寡核苷酸。

5.反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸选自表1或表3所列的化合物。

6.图1所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

7.图2所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

8.图3所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

9.图4所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

10.图5所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

11.图6所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

12.图7所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

13.图8所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

14.图9所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

15.图10所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

16.图11所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

17.图12所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

18.图13所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

19.图14所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

20.图15所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

21.图16所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

22.图17所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

23.图18所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

24.图19所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

25.图20所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

26.图21所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

27.图22所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

28.图23所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

29.图24所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

30.图25所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

31.图26所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

32.图27所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

33.图28所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

34.图29所示的反义寡核苷酸，或其药用盐。

35.缀合物，其包含：根据权利要求1至34中任一项所述的反义寡核苷酸，以及共价连接至所述反义寡核苷酸的至少一个缀合物部分。

36.根据权利要求1至34中任一项所述的反义寡核苷酸或根据权利要求35所述的缀合物的药用盐。

37.根据权利要求36所述的反义寡核苷酸的药用盐，其中所述药用盐为钠盐或钾盐。

38.药物组合物，其包含根据权利要求1至34中任一项所述的反义寡核苷酸、或根据权利要求35所述的缀合物，或根据权利要求36或37所述的药用盐，以及药用稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。

39.用于在表达SCN9A的靶细胞中抑制SCN9A表达的方法，所述方法包括向所述细胞施用有效量的根据权利要求1至34中任一项所述的反义寡核苷酸、或根据权利要求35所述的缀合物或根据权利要求36或37所述的药用盐。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述方法是体内方法或体外方法。

41.用于治疗或预防患有疼痛或可能患有疼痛的受试者诸如人的疼痛的方法，其包括施用治疗或预防有效量的根据权利要求1至34中任一项所述的反义寡核苷酸、或根据权利要求35所述的缀合物或根据权利要求36或37所述的药用盐，诸如以预防或减轻所述疼痛。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述疼痛是

a.慢性疼痛、神经病性疼痛、炎性疼痛、自发性疼痛；或

b.感受伤害性疼痛；或

c.由选自由糖尿病性神经病变、癌症、颅神经痛、带状疱疹后神经痛和手术后神经痛组成的组的病症引起或与之相关联的疼痛；或

d.由遗传性红斑性肢痛症(EIM)或阵发性极度疼痛症(PEPD)或三叉神经痛引起或与之相关联的疼痛；或

e.神经性疼痛、慢性疼痛，但也包括感受伤害性疼痛(例如神经减压术)或神经病性疼痛(例如糖尿病性神经病变)、内脏痛或混合性疼痛的一般治疗；或

f.下背痛或炎性关节炎。

43.根据权利要求1至34中任一项所述的反义寡核苷酸、或根据权利要求35所述的缀合物或根据权利要求36或37所述的药用盐，其用于药物。

44.根据权利要求1至34中任一项所述的反义寡核苷酸、或根据权利要求35所述的缀合物或根据权利要求36或37所述的药用盐，其用于治疗或预防或减轻疼痛，诸如根据权利要求42的a、b、c、d、e或f部分定义的疼痛。

45.根据权利要求1至34中任一项所述的反义寡核苷酸、或根据权利要求35所述的缀合物或根据权利要求36或37所述的药用盐用于制备药物的用途，所述药物用于治疗、预防或减轻疼痛，诸如根据权利要求42的a、b、c、d、e或f部分定义的疼痛。

46.根据权利要求45所述的用途，其中所述疼痛为下背痛或炎性关节炎。