CN112969709A - 靶向tia1的反义寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与编码哺乳动物T细胞限制性细胞内抗原‑1(TIA1)的核酸互补的反义寡核苷酸(寡聚物)，特别是靶向TIA1前体mRNA序列的反义寡核苷酸，其能够抑制TIA1的表达。TIA1表达的抑制有益于一系列医学疾患，所述医学疾患包括神经退行性疾病，诸如肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)或额颞叶痴呆。

Description

靶向TIA1的反义寡核苷酸
技术领域
本发明涉及与编码哺乳动物T细胞限制性细胞内抗原-1(TIA1)的核酸互补的反义寡核苷酸(寡聚物)，特别是靶向TIA1前体mRNA序列的反义寡核苷酸，其能够抑制TIA1的表达。TIA1表达的抑制有益于一系列医学疾患，这些医学疾患包括神经退行性疾病，诸如肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆和Tau蛋白病。
背景技术
许多神经退行性疾病的标志之一是大脑和中枢神经系统中蛋白质包涵体的积累。这些包涵体是蛋白质与其他细胞成分的不溶性聚集体，造成细胞损伤并且导致功能受损。已经发现，诸如Tau、α-突触核蛋白、亨廷顿蛋白和P-淀粉样蛋白等蛋白质均在大脑中形成包涵体，并且与许多神经退行性疾病(包括阿尔茨海默氏病和亨廷顿病)的发展有关。
神经退行性疾病也与应激颗粒(包含RNA和聚集的RNA结合蛋白)相关联。
T细胞限制性细胞内抗原-1(TIA-1)是一种RNA结合蛋白和核心成核应激颗粒蛋白。在应激颗粒形成过程中，成核后募集次级RNA结合蛋白以形成成熟应激颗粒，该应激颗粒是应激诱导的翻译抑制的关键成分。TIA1与神经病理学共同定位在患有神经退行性疾病的受试者的脑组织中(参见例如Maziuk等人，Acta Neuropathologica Communications2018 6：71)。Appicco等人，Nat Neurosci.2018 Jan；21(1)：72-80报道称，减少RNA结合蛋白TIA1可防止体内发生Tau介导的神经退行性病变。
肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)是一种复杂的神经退行性疾病，其遗传学特征在于罕见遗传变异的贡献不成比例得偏大。在大规模平行测序技术进步的推动下并且应用于大型患者-对照队列中，系统性鉴定构成ALS遗传结构的这些罕见变体已变得可行(Nguyen等人，Trends in Genetics June 2018，Vol.34，No.6)。
Mackenzie等人(Neuron 95，808-816，August 16，2017)报道，影响TIA1的低复杂度结构域的突变引起肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)和额颞叶痴呆(FTD)ALS以及ALS-FTD，并且与ALS相关的TIA1突变具有共同的神经病理学TDP-43标记，TIA1突变促进相分离并且损害应激颗粒动力学，并且因疾病而导致募集到动态不良应激颗粒的TDP-43变得固定和不溶。Hirsch-Reinshagen等人(Acta Neuropathologica Communications(2017)5：96)公开了带有Tia1突变的ALS/FTD的临床广泛的TDP-43神经病理学特征。
WO 2017/066657涉及TIA1的基于核酸的抑制剂。
发明目的
本发明人已经鉴定出TIA1转录本(TIA1)对体外或体内反义抑制特别有效的区域，并且提供了靶向TIA1前体mRNA或成熟mRNA的反义寡核苷酸(包括LNA缺口聚体寡核苷酸)。本发明鉴定出抑制人TIA1的寡核苷酸，其可用于治疗一系列医学疾患，这些医学疾患包括神经障碍，特别是与应激颗粒形成相关联的神经疾患。
发明内容
本发明提供了长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其靶向人TIA1靶核酸。本发明提供了TIA1前体mRNA内的一系列新型靶位点，并且进一步提供了反义寡核苷酸，这些反义寡核苷酸包含至少10个或更多个连续核苷酸，这些连续核苷酸与此类新型靶位点互补。本发明的反义寡核苷酸能够抑制表达人TIA1的细胞中人TIA1的表达。
本发明提供了长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其靶向人TIA1靶核酸，其中反义寡核苷酸能够抑制表达人TIA1的细胞中人TIA1的表达。
本发明提供了长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其靶向人TIA1靶核酸，其中所述反义寡核苷酸包含长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO 4-53组成的组的序列至少90％互补，诸如完全互补。
本发明提供了长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其靶向人TIA1靶核酸，其中所述反义寡核苷酸包含长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中连续核苷酸序列与选自(靶序列区域按其在SEQ ID NO 1中的靶核酸位置范围进行标识)列表A：8-23；33-52；54-96；103-139；148-162；164-195；212-358；360-393；403-423；456-478；491-507；509-538；571-606；604-627；637-658；660-685；687-712；714-729；744-765；792-843；845-873；875-916；931-950；955-971；973-991；1003-1029；1045-1081；1083-1101；1105-1150；1153-1288；1297-1318；1331-1368；1370-1389；1391-1465；1482-1521；1523-1557；1557-1579；1591-1605；1613-1669；1678-1698；1743-1787；1789-1816；1822-1855；1860-1892；1901-1918；1908-1929；1919-1961；1964-1987；1978-2002；2004-2018；2020-2049；2038-2052；2048-2068；2070-2086；2088-2115；2117-2134；2136-2166；2167-2207；2209-2224；2228-2260；2268-2337；2341-2362；2372-2387；2389-2403；2413-2468；2463-2480；2503-2537；2532-2547；2541-2558；2550-2573；2579-2624；2614-2634；2626-2644；2645-2671；2669-2695；2700-2718；2712-2747；2755-2780；2825-2876；2878-2904；2906-2935；2940-2961；2963-3006；3008-3035；3042-3056；3067-3086；3090-3106；3117-3135；3137-3213；3220-3272；3280-3305；3342-3440；3430-3448；3442-3461；3468-3514；3516-3544；3583-3635；3651-3678；3709-3730；3732-3756；3755-3783；3791-3805；3800-3833；3840-3859；3871-3889；3878-3898；3903-3932；3934-3952；3949-3963；3958-3987；4002-4044；4046-4060；4052-4088；4104-4130；4134-4248；4251-4270；4302-4324；4348-4383；4385-4455；4457-4529；4531-4551；4553-4625；4656-4694；4700-4717；4738-4771；4775-4790；4792-4837；4839-4901；4908-4959；4961-5004；5040-5085；5087-5147；5149-5170；5172-5203；5211-5225；5215-5230；5227-5256；5270-5284；5285-5311；5320-5335；5325-5341；5340-5356；5364-5388；5384-5437；5439-5484；5482-5515；5537-5560；5562-5610；5622-5670；5672-5692；5714-5779；5793-5812；5814-5888；5895-5931；5933-5959；5961-5975；6002-6016；6026-6064；6135-6171；6177-6195；6208-6232；6272-6299；6315-6341；6355-6401；6408-6428；6430-6452；6461-6483；6503-6571；6573-6635；6639-6659；6661-6685；6690-6708；6729-6747；6739-6757；6792-6892；6894-6913；6915-6960；6950-6967；6976-6994；7002-7031；7033-7047；7056-7095；7115-7151；7153-7174；7203-7220；7230-7244；7264-7293；7284-7318；7319-7348；7359-7402；7405-7442；7452-7474；7466-7487；7508-7524；7529-7544；7561-7611；7635-7655；7657-7681；7675-7701；7713-7732；7748-7774；7766-7783；7787-7829；7841-7863；7866-7890；7899-7920；7922-7936；7954-8016；8022-8058；8073-8088；8097-8119；8140-8155；8145-8189；8191-8208；8220-8241；8243-8290；8292-8308；8331-8401；8403-8423；8425-8441；8454-8494；8496-8525；8527-8549；8552-8574；8576-8604；8663-8720；8728-8771；8774-8825；8856-8922；8924-8942；8945-8982；9007-9041；9058-9077；9099-9149；9156-9171；9173-9187；9189-9207；9224-9243；9241-9277；9270-9289；9279-9299；9302-9323；9328-9366；9357-9401；9396-9412；9403-9419；9413-9427；9421-9443；9432-9473；9477-9529；9586-9601；9603-9618；9621-9635；9625-9648；9638-9653；9644-9658；9650-9693；9699-9741；9757-9786；9791-9820；9846-9870；9862-9881；9897-9924；9964-9983；9985-10052；10054-10090；10092-10171；10172-10190；10182-10199；10189-10207；10201-10241；10231-10253；10265-10303；10293-10314；10331-10351；10372-10403；10432-10459；10486-10500；10499-10513；10506-10520；10510-10526；10528-10550；10547-10564；10588-10614；10616-10639；10633-10655；10683-10728；10726-10777；10782-10796；10814-10844；10854-10869；10860-10887；10883-10898；10906-10925；10930-10951；10942-10978；10981-10996；11027-11068；11070-11135；11140-11163；11193-11208；1121O-11245；11264-11305；11297-11311；11324-11377；11386-11415；11404-11440；11432-11447；11449-11463；11477-11492；11493-11530；11590-11613；11615-11632；11634-11674；11694-11710；11743-11757；11746-11789；11793-11810；11800-11840；11858-11914；11908-11925；11921-11936；11938-11952；11987-12002；12024-12047；12092-12143；12145-12164；12167-12191；12193-12214；12223-12272；12266-12294；12312-12353；12355-12375；12386-12400；12416-12431；12439-12461；12472-12624；12642-12662；12673-12692；12685-12701；12694-12729；12748-12772；12788-12803；12823-12839；12841-12856；12864-12897；12899-12915；12926-12954；12956-12983；12985-13023；13025-13054；13130-13147；13158-13181；13190-13215；13237-13279；13304-13320；13311-13331；13322-13341；13343-13377；13384-13404；13406-13424；13418-13444；13456-13493；13493-13507；13524-13549；13551-13586；13588-13602；13620-13651；13659-13710；13723-13760；13764-13778；13781-13808；13806-13821；13810-13864；13865-13879；13886-13901；13894-13910；13903-13927；13955-13982；13998-14013；14016-14037；14040-14060；14878-14900；14898-14945；14941-14958；14960-14980；14982-15002；14997-15014；15003-15026；15028-15043；15058-15076；15068-15089；15090-15106；15128-15164；15408-15423；15422-15437；15439-15458；15468-15483；15474-15491；15495-15516；15526-15560；15562-15616；15618-15632；15634-15655；15675-15692；15704-15730；15732-15777；15783-15800；15814-15837；15829-15856；15845-15860；15862-15876；15881-15905；15921-15939；15941-15988；15990-16004；15995-16022；16011-16027；16019-16035；16045-16060；16078-16092；16086-16127；16127-16165；16197-16301；16293-16309；16301-16331；16324-16344；16347-16390；16404-16418；16411-16459；16474-16497；16499-16514；16530-16557；16548-16597；16599-16645；16661-16676；16678-16692；16702-16729；16741-16759；16774-16798；16810-16865；16867-16937；16944-16966；16988-17021；17023-17041；17043-17067；17088-17124；17126-17168；17171-17212；17201-17219；17208-17223；17225-17315；17307-17325；17355-17371；17365-17380；17381-17404；17416-17433；17429-17444；17435-17472；17506-17525；17528-17544；17559-17585；17588-17633；17624-17638；17641-17663；17678-17742；17732-17862；17864-17942；17980-17996；17992-18012；18004-18018；18019-18047；18038-18053；18057-18083；18074-18125；18118-18135；18140-18163；18165-18179；18180-18197；18194-18221；18214-18241；18272-18329；18331-18350；18353-18369；18379-18403；18396-18422；18432-18457；18464-18490；18502-18537；18526-18560；18564-18588；18592-18606；18603-18622；18648-18673；18675-18696；18712-18727；18717-18731；18741-18796；18798-18818；18845-18861；18860-18892；18881-18896；18886-18904；18909-18952；18949-18963；18966-18980；18999-19013；19003-19021；19023-19038；19040-19056；19058-19093；19123-19139；19153-19179；19189-19206；19208-19269；19284-19298；19300-19337；19332-19371；19373-19421；19438-19664；19666-19696；19698-19726；19752-19767；19776-19805；19817-19862；19860-19880；19887-19949；19953-19989；19991-20118；20120-20439；20441-20548；20550-20575；20579-20642；20644-20687；20689-20738；20740-20869；20871-20998；21029-21080；21082-21170；21196-21218；21234-21252；21274-21322；21324-21351；21379-21443；21464-21497；21499-21574；21600-21617；21638-21665；21669-21691；21693-21751；21811-21847；21849-21870；21872-21893；21895-21930；21935-21974；21976-21995；21997-22017；22019-22036；22044-22102；22107-22143；22154-22180；22179-22199；22202-22222；22224-22238；22240-22286；22288-22304；22313-22340；22342-22367；22382-22409；22421-22445；22461-22497；22500-22529；22531-22583；22597-22648；22653-22675；22681-22716；22718-22768；22770-22787；22790-22821；22835-22856；22858-22878；22880-22923；22934-22948；22950-23417；23419-23446；23460-23547；23562-23622；23624-23783；23785-23821；23823-23940；23942-23957；23959-23973；23975-23991；23993-24116；24134-24158；24223-24238；24239-24254；24254-24278；24278-24295；24298-24316；24318-24412；24418-24447；24451-24476；24475-24496；24492-24527；24558-24585；24581-24597；24593-24618；24607-24622；24633-24658；24660-24681；24675-24700；24702-24731；24734-24748；24743-24757；24759-24779；24794-24837；24868-24899；24894-24909；24934-24967；24957-24991；25012-25090；25092-25116；25118-25143；25154-25170；25181-25204；25213-25233；25253-25276；25278-25318；25309-25324；25326-25345；25344-25363；25394-25415；25439-25496；25498-25514；25571-25591；25608-25640；25660-25678；25680-25703；25705-25738；25738-25759；25759-25781；25794-25816；25818-25842；25833-25875；25889-25921；25911-25926；25930-25958；25953-25970；25964-25979；25990-26023；26027-26066；26070-26087；26089-26103；26122-26144；26146-26161；26187-26241；26243-26262；26276-26300；26302-26332；26332-26356；26358-26391；26388-26451；26453-26480；26516-26536；26538-26583；26586-26601；26590-26628；26617-26652；26659-26673；26674-26700；26709-26724；26726-26752；26778-26812；26814-26841；26839-26862；26852-26872；26877-26898；26900-26923；26925-26996；26996-27020；27053-27096；27095-27110；27123-27162；27167-27181；27175-27190；27200-27253；27244-27258；27255-27269；27260-27274；27276-27297；27312-27335；27337-27356；27357-27378；27380-27399；27425-27442；27435-27456；27449-27465；27455-27481；27481-27505；27523-27560；27553-27568；27571-27591；27592-27622；27624-27641；27645-27660；27694-27720；27725-27772；27785-27811；27813-27828；27848-27881；27885-27905；27907-27922；27933-28001；28003-28043；28059-28082；28098-28145；28148-28216；28219-28235；28267-28288；28284-28318；28321-28343；28351-28378；28387-28407；28402-28431；28433-28454；28443-28470；28471-28485；28481-28495；28494-28509；28511-28527；28564-28589；28591-28613；28615-28642；28644-28662；28679-28706；28719-28735；28754-28773；28775-28801；28803-28841；28838-28852；28867-28884；28889-28905；28900-28925；28953-28984；29039-29072；29074-29114；29126-29153；29155-29172；29190-29234；29236-29265；29270-29302；29330-29372；29394-29478；29489-29523；29525-29543；29558-29623；29625-29654；29670-29724；29724-29744；29750-29773；29811-29861；29893-29911；29938-29958；29949-29976；29978-30005；30020-30036；30030-30052；30052-30075；30070-30097；30138-30160；30149-30164；30168-30189；30223-30292；30306-30335；30337-30357；30363-30383；30395-30409；30412-30442；30454-30471；30488-30523；30524-30556；30565-30609；30611-30645；30650-30732；30730-30746；30748-30792；30804-30822；30834-30854；30864-30885；30887-30933；30944-30964；30957-30972；30969-30994；30985-31005；31017-31061；31073-31097；31104-31121；31123-31143；31137-31177；31174-31206；31210-31239；31240-31255；31247-31269；31262-31277；31270-31292；31288-31340；31342-31360；31358-31398；31388-31403；31401-31417；31446-31465；31478-31492；31555-31578；31580-31606；31608-31654；31659-31825；31827-31862；31864-31898；31900-31939；31941-31971；31973-32019；32021-32041；32043-32096；32116-32275；32277-32342；32354-32375；32377-32444；32446-32476；32479-32529；32566-32595；32619-32636；32630-32705；32707-32739；32764-32787；32779-32850；32845-32887；32889-32926；32932-32955；32957-32987；33009-33051；33071-33103；33108-33345；33347-33483；33500-33542；33544-33579；33581-33644；33646-33686；33679-33707；33709-33790；33792-33818；33820-33856；33858-33889；33891-33910；33912-33954；33956-33980；34002-34030；34033-34086；34088-34107；34109-34126；34131-34186；34188-34207；34209-34324；34329-34360；34364-34397；34399-34413；34416-34435；34448-34490；34492-34517；34519-34536；34538-34576；34578-34592；34607-34630；34640-34670；34672-34686；34688-34703；34729-34745；34740-34773；34773-34790；34792-34809；34804-34821；34824-34861；34872-34891；34882-34902；34893-34945；34950-34971；34973-34991；34985-35003；35006-35021；35038-35061；35062-35076；35077-35123；35141-35166；35167-35185；35205-35230；35233-35257；35259-35282；35296-35318；35327-35360；35369-35408；35423-35452；35454-35479；35543-35597；35614-35649；35643-35657；35699-35735；35743-35898；35900-35943；35945-36269；36271-36285；36287-36344；36347-36370；36374-36417；36411-36458；36460-36486；36489-36656；36658-36678；36693-36895；36918-37046；37061-37096；37098-37133；37135-37199；37201-37233；37242-37272；37279-37309；37311-37337；37339-37353；37355-37415；37419-37438；37440-37458；37477-37497；37504-37523；37541-37559；37561-37596；37598-37627；37632-37676；37712-37746；37749-37769；37770-37849；37851-37903；37905-37956；37958-37972；37974-38002；38004-38082；38099-38148；38150-38174；38177-38221；38221-38255；38257-38300；38308-38380；38396-38457；38495-38509；和38540-38554组成的组的SEQ ID NO 1的区域至少90％互补，诸如完全互补。
本发明提供了长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其靶向人TIA1靶核酸，其中所述反义寡核苷酸包含长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中连续核苷酸序列与选自由(靶序列区域按其在SEQ ID NO 1中的靶核酸位置范围进行标识)列表B：26-44；49-63；183-202；222-266；275-297；332-353；376-390；2019-2035；2721-2746；3802-3827；4069-4085；6139-6167；6372-6388；6739-6755；9403-9418；9854-9872；10374-10400；10633-10648；10743-10759；11040-11056；11392-11406；11502-11518；12483-12503；12506-12524；12535-12595；12607-12624；12613-12627；12687-12701；12753-12768；12881-12895；13088-13120；13604-13629；14881-14897；15136-15152；15429-15443；15782-15796；16086-16121；16364-16380；16418-16432；16425-16439；16433-16453；16702-16718；17341-17360；17490-17504；17605-17621；17852-17868；17888-17915；17992-18009；18402-18420；18703-18717；19155-19171；19333-19347；19349-19386；19467-19490；19492-19507；19510-19628；19635-19662；19811-19834；19887-19910；20126-20142；20155-20182；20184-20201；20203-20346；20366-20386；20400-20414；20747-20767；20801-20816；20835-20851；20904-20923；21048-21064；22992-23008；23014-23030；23056-23072；23093-23108；23123-23138；23188-23215；23217-23368；23502-23525；23666-23691；23745-23767；23840-23865；23896-23911；24026-24040；24042-24058；24066-24113；24713-24727；24901-24915；25989-26005；26508-26525；26514-26536；26527-26541；26842-26856；28243-28260；28487-28507；28901-28925；31247-31266；31688-31752；31754-31782；31852-31885；31904-31924；31951-31966；32179-32195；32361-32393；32395-32426；33144-33159；33173-33196；33198-33229；33261-33277；33282-33300；33840-33854；33993-34007；34002-34029；34135-34150；34170-34186；34194-34231；35167-35181；35298-35319；35880-35896；35908-35923；35925-35943；35962-35976；36011-36034；36043-36077；36073-36093；36095-36116；36136-36156；36158-36193；36195-36209；36229-36251；36287-36304；36306-36325；36472-36486；36508-36525；36563-36577；36579-36605；36608-36627；36637-36652；36658-36680；36861-36889；36956-36978；37010-37050；37099-37127；37173-37187；37417-37434；37715-37746；37751-37779；37798-37813；37815-37836；37853-37869；37880-37894；38279-38296；38352-38373；38422-38436；38467-38500；和38720-38735组成的组的SEQ ID NO 1的区域至少90％互补，诸如完全互补。
本发明提供了一种长度为10-30个核苷酸的LNA反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中连续核苷酸序列与选自由SEQ IDNO 4-53组成的组的序列至少90％互补，诸如完全互补，其中反义寡核苷酸能够抑制表达人TIA1的细胞中人TIA1的表达。
本发明提供了一种长度为10-30个核苷酸的缺口聚体反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO 4-53组成的组的SEQ ID至少90％互补，诸如完全互补，其中反义寡核苷酸能够抑制表达人TIA1的细胞中人TIA1的表达。
本发明提供了一种长度为10-30个核苷酸的LNA缺口聚体反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO 4-53组成的组的SEQ ID至少90％互补，诸如完全互补，其中反义寡核苷酸能够抑制表达人TIA1的细胞中人TIA1的表达。
本发明提供了一种长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中连续核苷酸序列与SEQ ID NO 11所示的序列或SEQ ID NO 12所示的序列至少90％互补，诸如完全互补，其中反义寡核苷酸能够抑制表达人TIA1的细胞中人TIA1的表达。
本发明提供了一种长度为10-30个核苷酸的LNA反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中连续核苷酸序列与SEQ ID NO 11所示的序列或SEQ ID NO 12所示的序列至少90％互补，诸如完全互补，其中反义寡核苷酸能够抑制表达人TIA1的细胞中人TIA1的表达。
本发明提供了一种长度为10-30个核苷酸的缺口聚体反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中连续核苷酸序列与SEQ IDNO 11所示的序列或SEQ ID NO 12所示的序列至少90％互补，诸如完全互补，其中反义寡核苷酸能够抑制表达人TIA1的细胞中人TIA1的表达。
本发明提供了一种长度为10-30个核苷酸的LNA缺口聚体反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中连续核苷酸序列与SEQID NO 11所示的序列或SEQ ID NO 12所示的序列至少90％互补，诸如完全互补，其中反义寡核苷酸能够抑制表达人TIA1的细胞中人TIA1的表达。
本发明提供了一种长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中连续核苷酸序列与SEQ ID NO 11至少90％互补，诸如完全互补，其中反义寡核苷酸能够抑制表达人TIA1转录本的细胞中人TIA1转录本的表达。
本发明提供了一种长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中连续核苷酸序列与SEQ ID NO 12至少90％互补，诸如完全互补，其中反义寡核苷酸能够抑制表达人TIA1转录本的细胞中人TIA1转录本的表达。
本文所提及或要求保护的本发明的寡核苷酸可以是药用盐的形式。
本发明提供了一种缀合物，其包含根据本发明所述的寡核苷酸以及与所述寡核苷酸共价连接的至少一个缀合物部分。
本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的寡核苷酸或缀合物以及药学上允许的稀释剂、溶剂、运载体、盐和/或佐剂。
本发明提供了一种在体内或体外调节表达TIA1的靶细胞中TIA7表达的方法，该方法包括以有效量向所述细胞施用本发明的寡核苷酸或缀合物或药物组合物。
本发明提供了一种用于治疗或预防疾病的方法，该方法包含向患有或易患该疾病的受试者施用治疗或预防上有效量的本发明的寡核苷酸、缀合物或药物组合物。
在一些实施例中，疾病为神经退行性疾病，诸如神经退行性疾病。
在一些实施例中，疾病选自由以下项组成的组：肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、Tau蛋白病诸如原发性Tau蛋白病、额颞叶痴呆伴帕金森综合征(FTDP-17)、额颞叶变性-痴呆(FTLD-TDP)、亨廷顿病、克雅病以及脊髓性肌萎缩症、运动神经元病、Tau蛋白病、阿尔茨海默氏病和范伦德远端肌病。
在一些实施例中，疾病为肌萎缩性脊髓侧索硬化症。
在一些实施例中，疾病为Tau蛋白病，诸如原发性Tau蛋白病。
在一些实施例中，疾病为额颞叶痴呆(FTD)。本发明提供了用于医药的根据本发明的寡核苷酸、缀合物或药物组合物。
本发明提供了用于治疗或预防神经退行性疾病的本发明的寡核苷酸、缀合物或药物组合物。
本发明提了本发明的寡核苷酸、缀合物或药物组合物制备用于治疗或预防神经退行性疾病的用途。
定义
寡核苷酸
如本文所用，术语“寡核苷酸”定义为如技术人员通常理解的包含两个或多个共价联接的核苷的分子。这样的共价结合的核苷也可以称为核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常在实验室中通过固相化学合成然后纯化的方式制备。当提及寡核苷酸的序列时，提及的是共价联接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的寡核苷酸是人造的，并且是化学合成的，并且通常是纯化或分离的。本发明的寡核苷酸可包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸。
反义寡核苷酸
如本文所用，术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸，特别是与靶核酸上的连续序列杂交来调节靶基因的表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的，因此不是siRNA或shRNA。优选地，本发明的反义寡核苷酸是单链的。应当理解，本发明的单链寡核苷酸可以形成发夹或分子间双链体结构(相同寡核苷酸的两个分子之间的双链体)，只要跨寡核苷酸全长内部或之间自身互补性的程度小于50％。
连续核苷酸序列
术语“连续核苷酸序列”是指与靶核酸互补的寡核苷酸区域。该术语在本文中与术语“连续核碱基序列”和术语“寡核苷酸基序序列”互换使用。在一些实施例中，寡核苷酸的所有核苷酸构成连续核苷酸序列。在一些实施例中，寡核苷酸包含连续核苷酸序列，诸如F-G-F′缺口聚体区域，并且可以任选地包含其他核苷酸，例如可以用于将官能团附接至连续核苷酸序列的核苷酸连接基区域。核苷酸连接基区域可以与靶核酸互补或可以不互补。冒险地，连续核苷酸序列与靶核酸100％互补。
核苷酸
核苷酸是寡核苷酸和多核苷酸的结构单元，并且出于本发明的目的，包括天然存在的和非天然存在的核苷酸。在自然界中，核苷酸诸如DNA和RNA核苷酸包括核糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸基团(其在核苷中不存在)。核苷和核苷酸也可以可互换地称为“单元”或“单体”。
修饰的核苷
如本文所用，术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与同等的DNA或RNA核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或多种修饰而被修饰的核苷。在一个优选实施例中，修饰的核苷包含修饰的糖部分。术语修饰的核苷在本文中还可与术语“核苷类似物”或修饰的“单元”或修饰的“单体”互换使用。具有未修饰的DNA或RNA糖部分的核苷在本文中称为DNA或RNA核苷。如果允许Watson Crick碱基配对，则DNA或RNA核苷的碱基区域中修饰的核苷通常仍称为DNA或RNA。
修饰的核苷间键
如技术人员通常所理解的，术语“修饰的核苷间键”定义为除磷酸二酯(PO)键以外的键，其将两个核苷共价偶联在一起。因此，本发明的寡核苷酸可包含修饰的核苷间键。在一些实施例中，与磷酸二酯键相比，修饰的核苷间键增加了寡核苷酸的核酸酶抗性。对于天然存在的寡核苷酸，核苷间键包括在相邻核苷之间产生磷酸二酯键的磷酸基团。修饰的核苷间键特别可用于稳定寡核苷酸供体内使用，并且可以在本发明寡核苷酸中的DNA核苷或RNA核苷区域(例如在缺口聚体寡核苷酸的缺口区域内部)以及在修饰的核苷区域(例如，区域F和区域F′)中起到保护免受核酸酶剪切的作用。
在一个实施例中，寡核苷酸包含一个或多个由天然磷酸二酯修饰的核苷间键，例如一个或多个修饰的核苷间键，其例如对核酸酶的攻击更具抗性。核酸酶抗性可以通过在血清中孵育寡核苷酸或通过使用核酸酶抗性测定(例如蛇毒磷酸二酯酶(SVPD))来确定，两者均是本领域中众所周知的。能够增强寡核苷酸的核酸酶抗性的核苷间键称为抗核酸酶核苷间键。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键被修饰，诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少80％、诸如至少90％的寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的核苷间键是抗核酸酶核苷间键。在一些实施例中，寡核苷酸的所有核苷间键或其连续核苷酸序列都是抗核酸酶核苷间键。应当认识到的是，在一些实施例中，将本发明的寡核苷酸与非核苷酸官能团诸如缀合物连接的核苷可以是磷酸二酯。
优选的修饰的核苷间键合是硫代磷酸酯。
硫代磷酸酯核苷间键由于核酸酶抗性、有益的药代动力学和易于制造而特别有用。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键是硫代磷酸酯，诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少80％、诸如至少90％的寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的核苷间键是硫代磷酸酯。在一些实施例中，所述寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的全部核苷间键均为硫代磷酸酯。
抗核酸酶键合，例如硫代磷酸酯键合，在与靶核酸形成双链体时能够募集核酸酶的寡核苷酸区域中特别有用，诸如缺口聚体的区域G。然而，硫代磷酸酯键还可用于非核酸酶募集区域和/或亲和力增强区域，诸如缺口聚体的区域F和F′。在一些实施例中，缺口聚体寡核苷酸可在区域F或F′或同时在区域F和F′中包含一个或多个磷酸二酯键合，其中区域G中的核苷间键合可以完全是硫代磷酸酯。
有利地，寡核苷酸的连续核苷酸序列中的所有核苷间键合都是硫代磷酸酯键合。
应当认识到的是，如EP2 742 135中所公开的，反义寡核苷酸可包含其他核苷间键合(除磷酸二酯和硫代磷酸酯以外)，例如烷基膦酸酯/甲基膦酸酯间核苷，其根据EP2 742135可以例如以其他方式被DNA硫代磷酸酯的缺口区域中所耐受。
核碱基
术语核碱基包括存在于核苷及核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤及鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。在本发明的背景中，术语“核碱基”也涵盖修饰的核碱基，其可以不同于天然存在的核碱基，但是在核酸杂交期间起作用。在此背景中，“核碱基”是指天然存在的核碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。此类变体例如描述于Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research第45卷第2055页和Bergstrom(2009)CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.371.4.1中。
在一些实施例中，该核碱基部分通过如下方式进行修饰：将嘌呤或嘧啶改变为经修饰的嘌呤或嘧啶，诸如经取代的嘌呤或经取代的嘧啶，诸如选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2′硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤及2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。
核碱基部分可以由每一个相应核碱基的字母代码来表示，例如A、T、G、C或u，其中每一个字母可以任选地包括具有同等功能的修饰的核碱基。例如，在示例性的寡核苷酸中，核碱基部分选自A、T、G、C和5-甲基胞嘧啶。任选地，对于LNA缺口聚体，可以使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。
修饰的寡核苷酸
术语“修饰的寡核苷酸”描述了一种寡核苷酸，其包含一个或多个糖修饰的核苷和/或修饰的核苷间键。术语“嵌合”寡核苷酸是在文献中已用于描述具有修饰的核苷的寡核苷酸的术语。
互补性
术语“互补性”描述了核苷/核苷酸的Watson-Crick碱基配对的能力。Watson-Crick碱基对是鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。应当理解的是，寡核苷酸可包含具有修饰的核碱基的核苷，例如，经常使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，因此，术语互补性涵盖未修饰的和修饰的核碱基之间的Watson Crick碱基配对(参见例如Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research第45卷第2055页和Bergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.371.4.1)。
本文所用术语“％互补”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的核苷酸百分比数，其中在给定位置，所述核酸分子(例如寡核苷酸)与不同的核酸分子(例如靶核酸或靶序列)在给定位置处的连续核苷酸序列互补(即与之形成Watson Crick碱基对)。通过以下方式计算百分比：(与靶序列5′-3′和寡核苷酸序列从3′-5′对齐时)计数两个序列之间形成配对的对齐碱基的数目，除以寡核苷酸中核苷酸的总数并且乘以100。在这种比较中，未对准(形成碱基对)的核碱基/核苷酸被称为错配。优选地，计算连续核苷酸序列的互补性％时不允许插入和删除。
术语“完全互补”是指100％的互补性。
同一性
本文所用的术语“同一性”意指核酸分子(例如寡核苷酸)中的连续核苷酸序列中与参考序列(例如序列基序)相同的核苷酸所占的比例(以百分比表示)，所述核酸分子跨越所述连续核苷酸序列。因此，通过计算两个序列(例如在本发明的化合物的连续核苷酸序列中和在参考序列中)相同的比对碱基(匹配)数，将该数除以比对区域的核苷酸总数再乘以100来计算同一性百分比。因此，同一性百分比＝(匹配数x 100)/比对区域(例如连续核苷酸序列)长度。计算连续核苷酸序列的同一性百分比时不允许进行插入和删除。应当理解的是，在确定同一性时，只要核碱基形成沃森克里克碱基配对的功能留存，即可不考虑核碱基的化学修饰(例如在计算％同一性时，5′-甲基胞嘧啶与胞嘧啶视为相同)。
杂交
如本文所用，术语“杂交”(hybridizing/hybridizes)应当理解为两条核酸链在相对链上的碱基对之间形成氢键从而形成双链体(例如寡核苷酸和靶核酸)。两条核酸链之间结合的亲和力是杂交的强度。其通常用解链温度(Tm)来描述，所述解链温度定义为一半寡核苷酸与靶核酸形成双链体时的温度。在生理条件下，Tm不与亲和力严格成正比(Mergny和Lacroix，2003，Oligonucleotides 13：515-537)。标准状态吉布斯自由能ΔG°更能准确代表结合亲和力，并且与反应的离解常数(Kd)之间具有ΔG°＝-RTln(Kd)的关系，其中R是气体常数，而T是绝对温度。因此，寡核苷酸与靶核酸之间反应的非常低的ΔG°体现所述寡核苷酸与靶核酸之间的强势杂交。ΔG°是与含水浓度为1M、pH为7、温度为37℃的反应关联的能量。寡核苷酸与靶核酸的杂交是自发性反应，而自发性反应的ΔG°小于零。ΔG°可以通过实验来测量，例如，通过使用如Hansen et al.，1965，Chem.Comm.36-38及Holdgate等人2005年在Drug Discov Today中所描述的等温滴定微量热(ITC)法。本领域技术人员将知道，市面上可购得用于测量ΔG°的商用设备。ΔG°还可采用数值方式进行估计，通过利用SantaLucia于1998年在Proc Natl Acad Sci USA.95：1460-1465使用Sugimoto等人，1995，Biochemistry 34：11211-11216和McTigue等人，2004，Biochemistry 43：5388-5405中描述的适当推导的热力学参数进行数值评估。为了具有通过杂交调节其预期的核酸靶标的可能性，对于长度为10-30个核苷酸的寡核苷酸，本发明的寡核苷酸以低于-10kcal的ΔG°估值与靶核酸杂交。在一些实施例中，杂交的程度或强度是以标准状态吉布斯自由能ΔG°来测量。对于长度为8-30个核苷酸的寡核苷酸，寡核苷酸可与靶核酸以低于-10kcal，诸如低于-15kcal、诸如低于-20kcal和诸如低于-25kcal的ΔG°估值杂交。在一些实施例中，所述寡核苷酸以-10至-60千卡，诸如-12至-40千卡，诸如自-15至-30千卡或-16至-27千卡，诸如-18至-25千卡的估计ΔG°值杂交至靶核酸。
靶核酸
根据本发明，靶核酸是编码哺乳动物TIA1的核酸，并且可以例如是基因、TIA1RNA、mRNA和前体mRNA、成熟mRNA或cDNA序列。因此，该靶标可以称为TIA1靶核酸。
合适地，靶核酸编码TIA1蛋白，特别是哺乳动物TIA1，诸如编码本文所提供的SEQID NO 1的前体mRNA或mRNA序列的人TIA1基因。
在一些实施例中，靶标可以是食蟹猴TIA1前体mRNA(在本文中示为SEQ ID NO 2)或小鼠TIA1前体mRNA(在本文中示为SEQ ID NO 3)。应当认识到的是，本发明人鉴定出的靶位点可同时存在于SEQ IDNO 1、SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3中。
4-53。
在一些实施例中，靶核酸选自由以下项组成的组：SEQ ID NO 1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或其天然存在的变体(例如，编码哺乳动物TIA1蛋白的TIA1序列)。
若在研究或诊断中使用本发明的寡核苷酸，则该靶核酸可为cDNA或源自DNA或RNA的合成核酸。
对于体内或体外应用，本发明的寡核苷酸通常抑制表达TIA1靶核酸的细胞中TIA1靶核酸的表达。
在一些实施例中，靶细胞或表达人TIA1的细胞为体外细胞系或细胞培养物；有关合适的细胞系列表，参见实例。在一些实施例中，表达人TIA1的细胞为U2OS细胞或来源于iPSC的运动神经元细胞。
在一些实施例中，靶细胞为运动神经元，诸如上运动神经元或下运动神经元(例如，可以是用于治疗ALS的化合物的靶细胞)。在一些实施例中，靶细胞为皮质神经元(例如，可以是用于治疗FTD或Tau蛋白病诸如原发性Tau蛋白病的化合物的靶细胞)。
本发明的寡核苷酸的核碱基的连续序列通常与TIA1靶核酸互补，如在整个寡核苷酸的长度上测量的，任选地，除了一个或两个错配以外，并且任选地排除可以将寡核苷酸与任选的官能团链接的基于核苷酸的连接基区域，诸如缀合物或其他非互补性末端核苷酸(例如区域D′或D″)。靶核酸为信使RNA，诸如成熟mRNA或编码哺乳动物TIA1蛋白诸如人TIA1的前体mRNA，例如人TIA1前体mRNA序列，诸如公开为SEQ ID NO 1序列的前体mRNA序列；应当理解，靶RNA序列以尿嘧啶(U)碱基代替胸腺嘧啶碱基(T)。
示例性靶核酸
物种 RNA类型 SEQ ID NO
人类 前体mRNA 1
食蟹猴 前体mRNA 2
小鼠 前体mRNA 3
Figure BDA0003044970660000191
在一些实施例中，本发明的寡核苷酸靶向SEQ ID NO 1。在一些实施例中，本发明的寡核苷酸与SEQ ID NO 1互补，并且能够抑制表达人TIA1前体mRNA的细胞中人TIA1前体mRNA的表达。
在一些实施例中，本发明的寡核苷酸靶向SEQ ID NO 2。在一些实施例中，本发明的寡核苷酸与SEQ ID NO 2互补，并且能够抑制表达食蟹猴TIA1前体mRNA的细胞中食蟹猴TIA1前体mRNA的表达。
在一些实施例中，本发明的寡核苷酸靶向SEQ ID NO 3。在一些实施例中，本发明的寡核苷酸与SEQ ID NO 3互补，并且能够抑制表达小鼠TIA1前体mRNA的细胞中小鼠TIA1前体mRNA的表达。
靶序列
本文所用的术语“靶序列”意指存在于靶核酸中的核苷酸的序列，其包含与本发明的寡核苷酸为互补的核碱基序列。在一些实施例中，靶序列由靶核酸上的区域组成，所述区域具有与本发明的寡核苷酸的连续核苷酸序列互补的核碱基序列。
本文提供了许多靶序列区域，如人TIA1前体mRNA的区域所定义的区域(使用SEQID NO 1作为参考)，这些区域可以由本发明的寡核苷酸靶向。
在一些实施例中，所述靶序列比单一寡核苷酸的互补序列更长，并且可以例如代表所述靶核酸的被本发明的若干寡核苷酸所靶向的优选区域。
本发明的寡核苷酸包含与靶核酸(诸如靶核酸的子序列，诸如本文所述的靶序列)互补或杂交的连续核苷酸序列。
寡核苷酸包含与靶核酸分子中存在的靶序列互补的连续核苷酸序列。连续核苷酸序列(以及因此靶序列)包含至少10个连续核苷酸，诸如9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30个连续核苷酸，诸如12-25个连续核苷酸，诸如14-18个连续核苷酸。
靶序列区域
本发明人已鉴定出可以被本发明的寡核苷酸靶向的TIA1靶核酸的特别有效的序列，这些序列称为靶位点或靶序列区域。因此，本发明的反义寡核苷酸可包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列包含至少10个连续核苷酸，诸如至少12个连续核苷酸，这些连续核苷酸与靶位点区域互补，诸如完全互补。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 4。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 5。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 6。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 7。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 8。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 9。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 10。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 11。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 12。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 13。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 14。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 15。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 16。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 17。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 18。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 19。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 20。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 21。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 22。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 23。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 24。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 25。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 26。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 27。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 28。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 29。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 30。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 31。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 32。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 33。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 34。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 35。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 36。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 37。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 38。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 39。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 40。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 41。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 42。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 43。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 44。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 45。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 46。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 47。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 48。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 49。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 50。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 51。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 52。
在一些实施例中，靶位点区域为SEQ ID NO 53。
在进一步方面，本发明提供了长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中连续核苷酸序列与SEQ IDNO 1的外显子区域至少90％互补，诸如完全互补。本发明提供了长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中连续核苷酸序列与选自由81-256；12486-12582；17807-17905；19343-19397；19570-19602；20839-20926；24032-24107；31667-31775；32162-32257；32369-32453；33167-33290；34170-34312；35816-38457组成的组的SEQ ID NO 1至少90％互补，诸如完全互补。
在进一步方面，本发明提供了长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中连续核苷酸序列与SEQ IDNO 1的内含子区域至少90％互补，诸如完全互补；本发明提供了长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中连续核苷酸序列与选自由256-12486；12582-17807；17905-19343；19397-19570；19602-20839；20926-24032；24107-31667；31775-32162；32257-32369；32453-33167；33290-34170；and 34312-35816组成的组的SEQ ID NO 1至少90％互补，诸如完全互补。
靶细胞
本文所用的术语“靶细胞”是指正在表达靶核酸的细胞。在一些实施例中，所述靶细胞可以是体内或体外的。在一些实施例中，所述靶细胞是哺乳动物细胞，诸如啮齿动物细胞，诸如小鼠细胞或大鼠细胞，或灵长类动物细胞，诸如猴子细胞或人类细胞。在一些实施例中，靶细胞为神经细胞，诸如脑细胞。在一些实施例中，靶细胞为运动神经元，例如上运动神经元或下运动神经元。在一些实施例中，靶细胞为皮质神经元。应当理解，在体外评估抑制TIA1表达的能力的过程中，靶细胞可以是体外原代细胞或体外细胞培养物。对于体内使用，诸如在治疗中，靶细胞合适地位于体内。
在优选的实施例中，靶细胞表达TIA1 mRNA，诸如TIA1前体mRNA，例如SEQ ID NO 1或TIA1成熟mRNA(用于靶向外显子的化合物)。对于反义寡核苷酸靶向，通常不考虑TIA1mRNA的聚腺苷酸(poly A)尾部。
自然产生变体
术语“天然存在的变体”是指TIA1基因或转录物的变体，其源自与靶核酸相同的遗传基因座，但是可能例如由于遗传密码的简并性导致编码相同氨基酸的密码子的多样性而不同，或由于前体mRNA的选择性剪接、或存在多态性诸如单核苷酸多态性(SNP)和等位基因变体而不同。基于存在与所述寡核苷酸充分互补的序列，本发明的寡核苷酸可因此靶向靶核酸及其自然产生变体。
智人TIA1基因位于染色体2：70，209，444-70，248，660逆向链中(GRCh38：CM000664.2)。
在一些实施例中，天然存在的变体与哺乳动物TIA1靶核酸(诸如选自由SEQ IDNO：1组成的组的靶核酸)具有至少95％、诸如至少98％或至少99％的同源性。在一些实施例中，天然存在的变体与SEQ ID NO：1的人TIA1靶核酸具有至少99％的同源性。
表达的调节
如本文所用，术语“表达的调节”应理解为，与施用寡核苷酸之前的TIA1或TIA1mRNA的量相比，寡核苷酸改变TIA1蛋白或TIA1 mRNA的量的能力的总称。替代地，可以通过参考对照实验来确定表达的调节。如普遍所知，对照是以盐水组合物(无寡核苷酸)处理的单个或靶细胞，或是以非靶向寡核苷酸(模拟品)处理的单个或靶细胞。
一种优选的调节类型是寡核苷酸抑制、下调、降低、阻遏、去除、停止、阻断、阻止、减少、减低、避免或终止TIA1表达的能力，例如通过降解TIA1 mRNA来实现。
高亲和力修饰的核苷
高亲和力修饰的核苷是一种经修饰的核苷，当并入所述寡核苷酸中时，可增强所述寡核苷酸对其互补靶的亲和力，例如以解链温度(Tm)所测定的。本发明的高亲和力修饰的核苷优选地使每一经修饰的核苷的解链温度增加+0.5至+12℃，更优选地是+1.5至+10℃，最优选地是+3至+8℃。许多高亲和力修饰的核苷是本领域已知的，并且包括例如许多2’取代的核苷以及锁定核酸(LNA)(参见例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development，2000，3(2)，293-213)。
糖修饰
与DNA和RNA中发现的核糖部分相比时本发明的寡聚物可包含一种或多种具有修饰的糖部分(即糖部分的修饰)的核苷。
已经制备了许多具有核糖部分的修饰的核苷，主要目的是改善寡核苷酸的某些性质，诸如亲和力和/或核酸酶抗性。
这些修饰包括对核糖环结构的修饰，例如替代为己糖环(HNA)或双环，其通常在核糖环(LNA)上的C2与C4碳原子之间具有双基桥(biradicle bridge)，或通常在C2与C3碳原子之间无键的未连接的核糖环(例如UNA)。其他糖修饰的核苷包括，例如，双环己糖核酸(WO2011/017521)或三环核酸(WO2013/154798)。修饰的核苷还包括其中糖部分被替换为非糖部分的核苷，例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下。
糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基更改为氢以外的基团或天然存在于DNA和RNA核苷中的2′-OH基团所做出的修饰。例如，可以在2′、3′、4′或5′位置引入取代基。
2′糖修饰的核苷。
2′糖修饰的核苷是在2′位置具有除H或-OH以外的取代基的核苷(2′取代的核苷)或包含能够在核糖环中的2′碳与第二碳之间形成桥的2′连接的双基的核苷，诸如LNA(2′-4′双基桥接的)核苷。
事实上，人们已花费很多精力开发2′取代的核苷，并且发现许多2′取代的核苷并入寡核苷酸后具有有益的特性。例如，2′修饰的糖可以提供增强的结合亲和力和/或增加的对寡核苷酸的核酸酶抗性。2′取代修饰的核苷的实例包括2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2′-氨基-DNA、2′-氟-RNA及2′-F-ANA核苷。有关进一步的实例，请参见例如Freier与Altmann；Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development，2000，3(2)，293-213和Deleavey和Damha，Chemistry and Biology 2012，19，937。下面是一些2′取代的修饰的核苷的示意图。
Figure BDA0003044970660000251
关于本发明，2′取代不包括2′桥接的分子如LNA。
锁定核酸(LNA)
“LNA核苷”是一种2′-修饰的核苷，其包含连接所述核苷的核糖环的C2′和C4′的双基(也称为“2′-4′桥”)，其限制或锁定核糖环的构象。这些核苷在文献中也称为桥连核酸或双环核酸(BNA)。将LNA掺入互补RNA或DNA分子的寡核苷酸中时，核糖构象的锁定与杂交的增强亲和力(双链体稳定化)有关。这可以常规地通过测量寡核苷酸/互补双链体的解链温度确定。
非限制性示例性LNA核苷公开于：WO 99/014226，WO 00/66604，WO 98/039352，WO2004/046160，WO 00/047599，WO 2007/134181，WO 2010/077578，WO 2010/036698，WO2007/090071，WO 2009/006478，WO 2011/156202，WO 2008/154401，WO 2009/067647，WO2008/150729；Morita等人，Bioorganic&Med.Chem.Lett.12，73-76，Seth等人J.Org.Chem.2010，Vol75(5)pp.1569-81和Mitsuoka等人，Nucleic Acids Research 2009，37(4)，1225-1238和Wan和Seth，J.Medical Chemistry 2016，59，9645-9667中。
其他非限制性的示例性LNA核苷公开于方案1中。
方案1：
Figure BDA0003044970660000261
特别的LNA核苷为β-D-氧基-LNA、6′-甲基-β-D-氧基LNA，诸如(S)-6′-甲基-β-D-氧基-LNA(ScET)及ENA。
一种特别有利的LNA是β-D-氧基-LNA。
RNA酶H活性和募集
反义寡核苷酸的RNA酶H活性是指其与互补RNA分子形成双链体时募集RNA酶H的能力。WO01/23613提供了用于确定RNA酶H活性的体外方法，其可以用于确定募集RNA酶H的能力。如果寡核苷酸在提供互补靶核酸序列时具有的初始速率是使用WO01/23613(通过引用并入本文)示例91至95提供的方法测量(以pmol/l/min计)具有与所测试修饰的寡核苷酸相同的碱基序列但仅包含在寡核苷酸中所有单体之间均具有硫代磷酸酯键合的DNA单体的寡核苷酸初始速率的至少5％，诸如至少10％或超过20％时，则一般认为能够募集RNA酶H。为了用于确定RNA酶H活性，可从Lubio Science GmbH，Lucerne，Switzerland获得重组人RNA酶H1。
缺口聚体
本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可以是缺口聚体。反义缺口聚体一般用于通过RNA酶H介导的降解来抑制靶核酸。缺口聚体寡核苷酸包含至少三个不同的结构区域，分别为“5-＞3”方向的5′侧翼、缺口和3′侧翼F-G-F′。“缺口”区域(G)包含一段使寡核苷酸能够募集RNA酶H的连续DNA核苷酸。该缺口区域的侧翼是包含一个或多个糖修饰的核苷(优选地是高亲和力糖修饰的核苷)的5′侧翼区域(F)，以及包含一个或多个糖修饰的核苷(优选地是高亲和力糖修饰的核苷)的3′侧翼区域(F′)。区域F和F′中的一个或多个糖修饰的核苷增强寡核苷酸对靶核酸的亲和力(即，亲和力增强的糖修饰的核苷)。在一些实施例中，区域F和F′中的一个或多个糖修饰的核苷是2′糖修饰的核苷，诸如高亲和力的2′糖修饰、诸如独立地选自LNA和2′-MOE。
在缺口聚体设计中，缺口区域的5′和3′最末端核苷是DNA核苷，分别位于5′(F)或3′(F′)区域的糖修饰核苷附近。侧翼可进一步定义为在距缺口区域最远的末端，即在5′侧翼的5′端和3′侧翼的3′端，具有至少一个糖修饰的核苷。
区域F-G-F′形成连续核苷酸序列。本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可包含式F-G-F′的缺口聚体区域。
缺口聚体设计F-G-F′的总长度可以是例如12至32个核苷，诸如13至24个核苷，诸如14至22个核苷，诸如14至17个核苷，诸如16至18个核苷。
举例而言，本发明的缺口聚体寡核苷酸可由下式代表：
F1-8-G5-16-F’1-8，诸如
F1-8-G7-16-F′2-8
前提条件是缺口聚体区域F-G-F’的总长度至少为12，诸如至少14个核苷酸。
区域F、G和F′为进一步定义如下，并且可结合到F-G-F′式中。
缺口聚体-区域G
缺口聚体的区域G(缺口区域)是使得寡核苷酸能够募集RNA酶H、诸如人RNA酶H1的核苷(通常是DNA核苷)的区域。RNA酶H是一种细胞酶，可识别DNA和RNA之间的双链体，并酶促RNA分子裂解。适当的缺口聚体可具有长度为至少5或6个连续DNA核苷，诸如5-16个连续DNA核苷，诸如6-15个连续DNA核苷，诸如7-14个连续DNA核苷，诸如8-12个连续DNA核苷酸，诸如长度为8-12个连续DNA核苷酸的缺口区域(G)。在一些实施例中，缺口区域G可由6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个连续DNA核苷组成。在一些情况下，缺口区域中的一个或多个胞嘧啶(C)DNA可能发生甲基化(例如，当DNA c后接DNA g时)，此类残基被标注为5-甲基-胞嘧啶(meC)。在一些实施例中，缺口区域G可由6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个连续的硫代磷酸酯连接的DNA核苷组成。在一些实施例中，缺口中的所有核苷间键是硫代磷酸酯键。
虽然传统的缺口聚体具有DNA缺口区域，但是有许多当它们用于缺口区域内时允许RNA酶H募集经修饰的核苷的实例。已报道当包含在缺口区域内时能够募集RNA酶H的修饰的核苷包括，例如，α-L-LNA、C4′烷基化的DNA(如PCT/EP2009/050349和Vester等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.18(2008)2296-2300，两者均通过引用并入本文)、阿拉伯糖衍生的核苷例如ANA和2′F-ANA(Mangos等人，2003J.AM.CHEM.SOC.125，654-661)、UNA(未锁定的核酸)(如Fluiter等人，Mol.Biosyst.，2009，10，1039中所述，通过引用并入本文)。UNA是非锁核酸，通常其中核糖的C2和C3之间的键已被除去，形成非锁的“糖”残基。在这种缺口聚体中使用的经修饰的核苷可为当引入缺口区域时采用2′内(类DNA)结构(2′endo(DNA like)structure)的核苷，即允许RNA酶H募集的修饰。在一些实施例中，本文所述的DNA缺口区域(G)可任选地含有1至3个糖修饰的核苷，其在引入缺口区域时采用2′内(类DNA)结构。
区域G-“缺口-中断者(Gap-breaker)”
备选地，有许多关于插入经修饰的核苷的报导，其赋予缺口聚体的缺口区域3′内构象，同时保留一些RNA酶H活性。此类具有以下缺口区域的缺口聚体称作“缺口破坏者(gap-breaker)”或“妨碍缺口的(gap-disrupted)”缺口聚体，该缺口区包含一个或多个3′内式修饰的核苷，参见例如WO2013/022984。缺口破坏者寡核苷酸在缺口区域内部保留足够的DNA核苷区域以允许募集RNA酶H。缺口破坏者寡核苷酸设计募集RNA酶H的能力一般具有序列特异性或甚至化合物特异性-参见Rukov等人2015 Nucl.Acids Res.Vol.43pp.8476-8487，该文献公开了在一些情况下提供更特异的靶RNA切割作用的募集RNA酶H的“缺口破坏者”寡核苷酸。用于缺口破坏者寡核苷酸的缺口区域内部的修饰的核苷可例如为赋予3′内式构象的修饰的核苷诸如2-O-甲基(OMe)或2′-O-MOE(MOE)核苷或β-D LNA核苷(核苷的核糖糖环的C2′和C4′之间的桥处于β构象)诸如β-D-氧基LNA或ScET核苷。
与上述含有区域G的缺口聚体一样，缺口中断者或缺口破坏中断缺口聚体的缺口区域在缺口的5′端(邻近区域F区3′核苷)具有DNA核苷，及在缺口的3′端(邻近区域F′的5′核苷)具有DNA核苷。包含中断缺口的缺口聚体通常在缺口区域的5′端或3′端保留至少3或4个连续DNA核苷的区域。
缺口中断者寡核苷酸的示例性设计包括
F1-8-[D3-4-E1-D3-4]-F′1-8
F1-8-[D1-4-E1-D3-4]-F′1-8
F1-8-[D3-4-E1-D1-4]-F′1-8
其中区域G在括号[Dn-Er-Dm]内，D是DNA核苷的连续序列，E是经修饰的核苷(缺口中断者或缺口中断核苷)，并且F和F′是如本文所定义的侧翼区域，并且条件是缺口聚体区域F-G-F′的整体长度为至少12、诸如长度为至少14个核苷酸。
在一些实施例中，缺口中断缺口聚体的区域G包含至少6个DNA核苷，诸如6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个DNA核苷。如上所述，DNA核苷可为连续的或可任选地散布有一个或多个经修饰的核苷，条件是缺口区域G能够介导RNA酶H募集。
缺口聚体-侧翼区域，F及F′
区域F紧邻区域G的5′DNA核苷。区域F的3′最末端核苷是糖修饰的核苷，诸如高亲和力糖修饰的核苷，例如2′取代的核苷，诸如MOE核苷或LNA核苷。
区域F′紧邻区域G的3′DNA核苷。区域F′的5′最末端核苷是糖修饰的核苷，诸如高亲和力糖修饰的核苷，例如2′取代的核苷，诸如MOE核苷或LNA核苷。
区域F长度为1-8个连续核苷酸，诸如长度为2-6个、诸如3-4个连续核苷酸。有利地，区域F的5′最末端核苷是糖修饰的核苷。在一些实施例中，区域F的两个5′最末端核苷是糖修饰的核苷。在一些实施例中，区域F的5′最末端核苷是LNA核苷。在一些实施例中，区域F的两个5′最末端核苷是LNA核苷。在一些实施例中，区域F的两个5′最末端核苷是2′取代的核苷，诸如两个3′MOE核苷。在一些实施例中，区域F的5′最末端核苷是2′取代的核苷，诸如MOE核苷。
区域F′长度为2-8个连续核苷酸，诸如长度为3-6个、诸如4-5个连续核苷酸。优选地的是，在实施例中，区域F′的3′最末端核苷是糖修饰的核苷。在一些实施例中，区域F′的两个3′最末端核苷是糖修饰的核苷。在一些实施例中，区域F′的两个3′最末端核苷是LNA核苷。在一些实施例中，区域F′的3′最末端核苷是LNA核苷。在一些实施例中，区域F′的两个3′最末端核苷是2′取代的核苷，诸如两个3′MOE核苷。在一些实施例中，区域F′的3′最末端核苷是2′取代的核苷，诸如MOE核苷。
应当注意，当区域F或F′的长度为一时，优选地，它是LNA核苷。
在一些实施例中，区域F和F′独立地由糖修饰的核苷的连续序列组成或包含糖修饰的核苷的连续序列。在一些实施例中，区域F的糖修饰的核苷可独立地选自2′-O-烷基-RNA单元、2′-O-甲基-RNA、2′-氨基-DNA单元、2′-氟-DNA单元、2′-烷氧基-RNA、MOE单元、LNA单元、阿糖核酸(ANA)单元和2′-氟-ANA单元。
在一些实施例中，区域F和F′独立地包含LNA和2′取代的修饰核苷两者(混合型翼设计)。
在一些实施例中，区域F和F′仅由一种类型的糖修饰的核苷组成，诸如仅由MOE组成或仅由β-D-氧基LNA组成或仅由ScET组成。这样的设计也称为均匀侧翼或均匀缺口聚体设计。
在一些实施例中，区域F或F′或者F和F′的所有核苷均为LNA核苷，诸如独立地选自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷。在一些实施例中，区域F由1-5个，诸如2-4个、诸如3-4个、诸如1个、2个、3个、4个或5个连续的LNA核苷组成。在一些实施例中，区域F和F′的所有核苷都是β-D-氧基LNA核苷。
在一些实施例中，区域F或F′或者F和F′的所有核苷都是2′取代的核苷，诸如OMe或MOE核苷。在一些实施例中，区域F由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个连续的OMe或MOE核苷组成。在一些实施例中，仅一个侧翼区域可以由2′取代的核苷，诸如OMe或MOE核苷组成。在一些实施例中，5′(F)侧翼区域由2′取代的核苷诸如OMe或MOE核苷组成，而3′(F′)侧翼区域包含至少一个LNA核苷，诸如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。在一些实施例中，3′(F′)侧翼区域由2′取代的核苷，诸如OMe或MOE核苷组成，而5′(F)侧翼区域包含至少一个LNA核苷，诸如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。
在一些实施例中，区域F和F′的所有修饰的核苷都是LNA核苷，诸如独立地选自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷，其中区域F或F′或者F和F′可以任选地包含DNA核苷(交替侧翼，有关更多详细信息，请参见这些的定义)。在一些实施例中，区域F和F′的所有修饰核苷均为β-D-氧基LNA核苷，其中区域F或F′或者F和F′可以任选地包含DNA核苷(交替侧翼，有关更多详细信息，请参见这些的定义)。
在一些实施例中，区域F和F′的5′和3′最末端核苷是LNA核苷，诸如β-D-氧基LNA核苷或ScET核苷。
在一些实施例中，区域F和区域G之间的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施例中，区域F′和区域G之间的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施例中，区域F或F′、F和F′的核苷之间的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
LNA缺口聚体
LNA缺口聚体是其中区域F和F′中的一者或两者包含LNA核苷或由LNA核苷组成的缺口聚体。β-D-氧基缺口聚体是其中区域F和F′中的一者或两者包含β-D-氧基LNA核苷或由其组成的缺口聚体。
在一些实施例中，LNA缺口聚体具有下式：[LNA]1-5-[区域G]-[LNA]1-5，其中区域G如在缺口聚体区域G定义中的定义。
MOE缺口聚体
MOE缺口聚体是其中区域F及F′由MOE核苷所构成的缺口聚体。在一些实施例中，MOE缺口聚体设计为[MOE]1-8-[区域G]-[MOE]1-8，诸如[MOE]2-7-[区域G]5-16-[MOE]2-7，诸如[MOE]3-6-[区域G]-[MOE]3-6，其中区域G如缺口聚体定义中的定义。具有5-10-5设计(MOE-DNA-MOE)的MOE缺口聚体已广泛用于本技术领域中。
混合型翼缺口聚体
混合翼型缺口聚体是LNA缺口聚体，其中区域F和F′中的一者或两者包含2′取代的核苷，诸如独立地选自′-O-烷基-RNA单元、2′-O-甲基-RNA、2′-氨基-DNA单元、2′-氟-DNA单元、2′-烷氧基-RNA、MOE单元、阿糖核酸(ANA)单元和2′-氟-ANA单元组成的组的2′取代的核苷，诸如MOE核苷。在一些实施例中，其中区域F及F′中的至少一者或区域F及F′两者均包含至少一个LNA核苷，区域F及F′的其余核苷独立选自以MOE及LNA组成的组。在一些实施例中，其中区域F或F′中的至少一者或区域F及F′两者均包含至少两个LNA核苷，区域F及F′的其余核苷独立选自以MOE及LNA组成的组。在一些混合型翼的实施例中，区域F及F′中的一者或两者可进一步包含一个或多个DNA核苷。
混合型翼缺口聚体设计已公开于WO2008/049085及WO2012/109395，该两者在此以引用方式并入。
交替侧翼缺口聚体
具有交替性侧翼的缺口聚体是指LNA缺口聚体寡核苷酸，其中至少一个侧翼(F或F′)在一个或多个LNA核苷之外还包含DNA。在一些实施例中，区域F或F′中的至少一者或两者都包含LNA核苷及DNA核苷这两者。在此类实施例中，侧翼区域F或F′，或F和F′两者，包含至少三个核苷，其中F和/或F′区域的5′及3′最末端核苷为LNA核苷。
在一些实施例中，区域F或F′中的至少一者或两者都包含LNA核苷及DNA核苷这两者。在此类实施例中，侧翼区域F或F′或F和F′两者包含至少三个核苷，其中F或F′区域的5′和3′最末端核苷为LNA核苷，并且在区域F或F′(或区域F和F′两者)的5′和3′最末端LNA核苷之间至少存在一个DNA核苷。
寡核苷酸中的区域D′或D″
本发明的寡核苷酸可在一些实施例中包含或由所述寡核苷酸的所述连续核苷酸序列以及其他的5′和/或3′核苷组成，所述连续核苷酸序列与所述靶核酸互补，所述连续核苷酸序列如是缺口聚体F-G-F′。所述其他的5′和/或3′核苷可与或不与所述靶核酸为完全互补。此类其他的5′和/或3′核苷本文中可称为区域D′及D″。
出于将连续核苷酸序列(诸如缺口聚体)与缀合物部分或另一个官能团接合的目的，可以使用添加区域D′或D″。当用于将连续核苷酸序列与缀合物部分接合时，其可用作可生物裂解的连接基。可替代地，它可以用于提供核酸外切酶保护或使合成或制造变得容易。
可以将区域D′和D″分别附接于区域F的5′端或区域F′的3′端，以生成下式D′-F-G-F′、F-G-F′-D″或D′-F-G-F′-D″的设计。在这种情况下，F-G-F′是寡核苷酸的缺口聚体部分，而区域D′或D″构成寡核苷酸的单独部分。
区域D′或D″可以独立地包含1个、2个、3个、4个或5个另外的核苷酸或由其组成，它们可以与靶核酸互补或不互补。与F或F′区域相邻的核苷酸不是糖修饰的核苷酸，诸如DNA或RNA或这些的碱基修饰形式。D′或D″区域可以用作核酸酶敏感的可生物裂解的连接基(参见连接基的定义)。在一些实施例中，另外的5′和/或3′端核苷酸与磷酸二酯键联接，并且是DNA或RNA。适于用作区域D′或D″的核苷酸基生物可切断型连接基可参照WO2014/076195的公开，举例而言可包括磷酸二酯连接DNA二核苷酸。生物可切断型连接基在聚寡核苷酸构造中的使用可参照WO2015/113922的公开，在该案中其用于连接单一寡核苷酸中的多重反义构造(例如缺口聚体区域)。
在一实施例中，本发明的寡核苷酸除包含构成所述缺口聚体的连续核苷酸序列之外，还包含区域D′和/或D″。
在一些实施例中，本发明的寡核苷酸可由下式代表：
F-G-F′；特别是F1-8-G5-16-F′2-8
D’-F-G-F’，特别是D’1-3-F1-8-G5-16-F’2-8
F-G-F’-D”，特别是F1-8-G5-16-F’2-8-D”1-3
D’-F-G-F’-D”，特别是D’1-3-F1-8-G5-16-F’2-8-D”1-3
在一些实施例中，所述区域D′与区域F之间的核苷间键是磷酸二酯键。在一些实施例中，所述区域F′与区域D″之间的核苷间键是磷酸二酯键。
缀合物
如本文所用，术语“缀合物”是指与非核苷酸部分(缀合物部分或区域C或第三区域)共价联接的寡核苷酸。
本发明的寡核苷酸与一个或多个非核苷酸部分的缀合可以改善该寡核苷酸的药理学，例如，通过影响寡核苷酸的活性、细胞分布、细胞摄取或稳定性实现。在一些实施例中，缀合物部分通过改善寡核苷酸的细胞分布、生物利用度、代谢、排泄、渗透性和/或细胞摄取来修饰或增强寡核苷酸的药代动力学性质。特别地，缀合物可使寡核苷酸靶向特定的器官、组织或细胞类型，并且由此增强寡核苷酸在这种器官、组织或细胞类型中的有效性。同时，缀合物可用于降低寡核苷酸在非靶细胞类型、组织或器官中的活性，例如脱靶活性或在非靶细胞类型、组织或器官中的活性。
在一个实施例中，非核苷酸部分(缀合物部分)选自由以下项组成的组：碳水化合物、细胞表面受体配体、药物物质、激素、亲脂物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素(例如细菌毒素)、维生素、病毒蛋白(例如衣壳)或它们的组合。
连接基
键或连接基是两个原子之间的连接，其经由一个或多个共价键将一个目标化学基团或区段与另一个目标化学基团或区段联接。缀合物部分可直接或通过连接部分(例如连接基或系链)附接于寡核苷酸。连接基用于将第三区域诸如缀合物部分(区域C)与第一区域共价连接，该第一区域是例如寡核苷酸或连续核苷酸序列或缺口聚体F-G-F′(区域A)。
在本发明的一些实施例中，本发明的缀合物或寡核苷酸缀合物可以任选地包含位于与靶核酸互补的寡核苷酸或连续核苷酸序列(区域A或第一区域)和缀合物部分(区域C或第三区域)之间的连接基区域(第二区域或区域B和/或区域Y)。
区域B是指包含生理上不稳定的键或由其组成的可生物剪切的连接基，该键在哺乳动物体内通常遇到的条件下或与之相似的条件下可剪切。生理上不稳定的连接基经历化学转化(例如剪切)的条件包括化学条件，诸如pH、温度、氧化或还原条件或试剂，以及在哺乳动物细胞中遇到的盐浓度或与之相似的盐浓度。哺乳动物细胞内条件还包括通常存在于哺乳动物细胞中的酶活性，诸如来自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶的酶活性。在一个实施例中，可生物剪切的连接基对S1核酸酶剪切敏感。包含DNA磷酸二酯的可生物剪切的连接基详细描述于WO 2014/076195(此处通过引用并入)中，也参见本文中的区域D’或D″。
区域Y是指不必为可生物剪切的但主要用于将缀合物部分(区域C或第三区域)共价连接至寡核苷酸(区域A或第一区域)的连接基。区域Y连接基可以包含重复单元诸如乙二醇、氨基酸单元或氨基烷基的链结构或寡聚物。本发明的寡核苷酸缀合物可以由以下区域性元件A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C或A-Y-C构成。在一些实施例中，连接基(区域Y)为氨基烷基诸如C2-C36氨基烷基基团，包括例如C6至C12氨基烷基基团。在一个优选实施例中，连接基(区域Y)是C6氨基烷基基团。
治疗
本文所用的术语“治疗”意指治疗既有疾病(例如本文所提及的疾病或疾患)，或防范疾病，也就是预防。因此应知，在一些实施例中，本文中所称的治疗可以是预防性的。
具体实施方式
本发明涉及靶向TIA1表达的寡核苷酸诸如反义寡核苷酸。
本发明的靶向TIA1表达的寡核苷酸能够与表达TIA1靶核酸的细胞中表达的TIA1杂交并且抑制其表达。
TIA1靶核酸可以是哺乳动物TIA1 mRNA或前体RNA，诸如人TIA1 mRNA或前体RNA，例如来源于智人T细胞限制性细胞内抗原-1(TIA1)的前体RNA或mRNA、染色体2：70，209，444-70，248，660上的RefSeqGene(GRCh38：CM000664.2)：另外参见EnsemblENSG00000116001(SEQ ID NO 1)。
本发明的寡核苷酸能够抑制表达靶核酸诸如TIA1 mRNA的细胞中TIA1靶核酸诸如TIA1 mRNA的表达。
在一些实施例中，本发明的寡核苷酸能够抑制表达靶核酸的细胞中TIA1靶核酸的表达，从而与细胞中TIA1靶核酸(例如，mRNA)的表达水平相比，降低TIA1靶核酸(例如，mRNA)的水平，使其抑制率达到至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。实例1提供了一种合适的测定方法，该测定方法用于评估本发明的寡核苷酸抑制靶核酸表达的能力。合适地，在体外(诸如裸露体外测定)对化合物抑制靶核酸表达的能力进行评估，例如根据实例1所述进行评估。
本发明的一个方面涉及一种反义寡核苷酸，诸如LNA反义寡核苷酸缺口聚体，其包含长度为10个至30个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与SEQ ID NO 1和/或选自由SEQ ID NO 4-53组成的组的序列至少90％互补，诸如完全互补。
在一些实施例中，寡核苷酸包含一个长度为10个至30个核苷酸的连续序列，该连续序列与靶核酸或靶序列的一个区域为至少90％互补，诸如至少91％，诸如至少92％，诸如至少93％，诸如至少94％，诸如至少95％，诸如至少96％，诸如至少97％，诸如至少98％或100％互补。
在一些实施例中，本发明的寡核苷酸包含长度为12-24个诸如13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，个或23个连续核苷酸的连续核苷酸序列，其中连续核苷酸序列与SEQ IDNO1完全互补。
在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列为缺口聚体，诸如LNA缺口聚体、混合翼缺口聚体或交替性侧翼缺口聚体。
在一些实施例中，根据本发明所述的反义寡核苷酸包含至少10个连续核苷酸、诸如至少12个连续核苷酸、诸如至少13个连续核苷酸、诸如至少14个连续核苷酸、诸如至少15个连续核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与SEQ ID NO 1完全互补。
在一些实施例中，根据本发明所述的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列的长度少于20个核苷酸。在一些实施例中，根据本发明所述的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列的长度为12-24个核苷酸。在一些实施例中，根据本发明所述的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列的长度为12-22个核苷酸。在一些实施例中，根据本发明所述的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列的长度为12-20个核苷酸。在一些实施例中，根据本发明所述的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列的长度为12-18个核苷酸。在一些实施例中，根据本发明所述的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列的长度为12-16个核苷酸。
有利地，在一些实施例中，介于连续核苷酸序列的核苷之间的核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列与SEQ ID NO 1完全互补。
在一些实施例中，连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO 4-53组成的组的序列完全互补。
在一些实施例中，反义寡核苷酸为包含式5′-F-G-F′-3′的连续核苷酸序列的缺口聚体寡核苷酸，其中区域F和F′独立地包含1-8个糖修饰的核苷，并且G为能够募集RNA酶H的介于5个与16个之间的核苷的区域。
在一些实施例中，区域F和F′的糖修饰的核苷独立地选自由以下项组成的组：′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA、2′-氨基-DNA、2′-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2′-氟-ANA和LNA核苷。
在一些实施例中，区域G包含5-16个连续DNA核苷。
在一些实施例中，其中反义寡核苷酸为缺口聚体寡核苷酸，诸如LNA缺口聚体寡核苷酸。
在一些实施例中，LNA核苷为β-D-氧基LNA核苷。
在一些实施例中，介于连续核苷酸序列之间的核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。
本发明的示例性序列基序和基序序列列于下表中，另外参见实例中的表A：
Figure BDA0003044970660000381
Figure BDA0003044970660000391
Figure BDA0003044970660000401
本发明提了根据本发明所述的反义寡核苷酸，诸如长度为12-24个核苷、诸如14-18个核苷的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列包含至少12个、诸如至少14个、诸如至少15个连续核苷酸，这些连续核苷酸存在于选自由SEQID NO 54-103组成的组的序列。
本发明提供了根据本发明所述的LNA缺口聚体，其包含选自由SEQ ID NO 54-103组成的连续核苷酸序列或由所述连续核苷酸序列组成。
本发明提供了选自下组的反义寡核苷酸，该组由以下各项组成：
CCttctcatataaaaCACA；CTTtactacactccCT；CCACtaattcttaaaattTC；CCaacaattacttcTCAA；CTGatttacaacctcATC；TATttttctccaaaattCC；CTCAttcatccaacaaatAA；CACtaaaacatcctaaaaCC；TTCCattctttactctttAA；ACActatattctacctaATC；CCtttcccattaaaaaATTT；ACCTtccatttaacattAC；ATCtaccattcaacaaaCAC；TGTaacttaatcttCCT；CAtcctaaccttattatTAT；CCctaacattcctatTTA；CCttcaatctaatcTTTA；ACcttgaatactccTCA；TTCActacctcccaaAT；ATCtcacacacaataatCAC；CTCAcacacaataatcaCT；ATAtattcctttacataCAA；TATAttcctttacatacaAC；ATattcctttacatacaACT；TATTcctttacatacaacTT；ATtcctttacatacaaCTTT；GCCaacatttatccAC；CCAacatttatccACT；CTaaaactccataccTCA；CCcagacattacacCA；CCagacattacaccaTTC；AGAcattacaccatTCA；AAacagtaatcccTTCA；ACAgtaatcccttcaCT；CAGtaatcccttcacTT；AGtaatcccttcacttTA；TAatcccttcactttaTAT；TATTaacacaaacacattCA；ACAcaaacacattcaatCAT；CACAaacacattcaatcaTA；ACAaacacattcaatcaTAT；CAaacacattcaatcaTATC；TGAcaaatcctaaTCT；TTAccttacccattaTC；TAccttacccattatcTT；TACccttacatccATA；AAAtacccttacatccaTAA；ACccttacatccaTAAT；CCTtacatccataatcAT；和CTTAcatccataatcatTT；其中大写字母为LNA核苷，并且小写字母为DNA核苷。在一些实施例中，连续核苷序列中的所有核苷间键均为硫代磷酸酯核苷间键。任选地，LNA胞嘧啶可以是5-甲基胞嘧啶。任选地，DNA胞嘧啶可以是5-甲基胞嘧啶。
本发明提供了选自下组的反义寡核苷酸，该组由以下各项组成：
CCttctcatataaaaCACA；CTTtactacactccCT；CCACtaattcttaaaattTC；CCaacaattacttcTCAA；CTGatttacaacctcATC；TATttttctccaaaattCC；CTCAttcatccaacaaatAA；CACtaaaacatcctaaaaCC；TTCCattctttactctttAA；ACActatattctacctaATC；CCtttcccattaaaaaATTT；ACCTtccatttaacattAC；ATCtaccattcaacaaaCAC；TGTaacttaatcttCCT；CAtcctaaccttattatTAT；CCctaacattcctatTTA；CCttcaatctaatcTTTA；ACcttgaatactccTCA；TTCActacctcccaaAT；ATCtcacacacaataatCAC；CTCAcacacaataatcaCT；ATAtattcctttacataCAA；TATAttcctttacatacaAC；ATattcctttacatacaACT；TATTcctttacatacaacTT；ATtcctttacatacaaCTTT；GCCaacatttatccAC；CCAacatttatccACT；CTaaaactccataccTCA；CCcagacattacacCA；CCagacattacaccaTTC；AGAcattacaccatTCA；AAacagtaatcccTTCA；ACAgtaatcccttcaCT；CAGtaatcccttcacTT；AGtaatcccttcacttTA；TAatcccttcactttaTAT；TATTaacacaaacacattCA；ACAcaaacacattcaatCAT；CACAaacacattcaatcaTA；ACAaacacattcaatcaTAT；CAaacacattcaatcaTATC；TGAcaaatcctaaTCT；TTAccttacccattaTC；TAccttacccattatcTT；TACccttacatccATA；AAAtacccttacatccaTAA；ACccttacatccaTAAT；CCTtacatccataatcAT；和CTTAcatccataatcatTT；其中大写字母为β-D-氧基-LNA核苷，并且小写字母为DNA核苷，其中寡核苷酸中的所有核苷间键均为硫代磷酸酯核苷间键，并且所有LNA胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶。
进一步有利的靶位点区域
本发明提供了根据本发明所述的反义寡核苷酸，诸如长度为12-24个核苷、诸如12-18个核苷的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列包含至少14个诸如至少15个连续核苷酸，其与选自由列表A中的靶序列区域组成的组的靶位点区域完全互补。
本发明提了根据本发明所述的反义寡核苷酸，诸如长度为12-24个核苷、诸如12-18个核苷的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列包含至少14个诸如至少15个连续核苷酸，这些连续核苷酸与选自由列表B中的靶序列区域组成的组的靶位点区域完全互补。
根据本发明所述的反义寡核苷酸，其中列表A或列表B中的靶序列区域为缺口聚体寡核苷酸，诸如LNA缺口聚体寡核苷酸。
制造方法
在又一方面，本发明提供用以制造本发明的寡核苷酸的方法，所述方法包含使核苷酸单元进行反应，借此在所述寡核苷酸中形成共价链接连续核苷酸单元。优选地，所述方法是利用亚磷酰胺化学(见例如Caruthers等人，1987年，Methods in Enzymology第154卷，第287-313页)。在又一实施例中，所述方法进一步包含使所述连续核苷酸序列与一缀合部分(配体)反应，以使缀合物部分共价附接至所述寡核苷酸。在又一方面，提供一种用以制造本发明组合物的方法，所述方法包含将本发明的寡核苷酸或缀合寡核苷酸与药学上允许的稀释剂、溶剂、运载体、盐和/或佐剂混合。
药物组合物
在又一方面，本发明提供的药物组合物包含任一上述寡核苷酸和/或寡核苷酸缀合物或其盐以及药学上允许的稀释剂、运载体、盐和/或佐剂。药用稀释剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)，而药用盐包括但不限于钠盐及钾盐。在一些实施例中，所述药用稀释剂为无菌磷酸盐缓冲盐水。在一些实施例中，所述寡核苷酸用于所述药用稀释剂的浓度为50至300μM溶液。
根据本发明所述的化合物可以以其药用盐形式存在。术语“药用盐”是指常规的酸加成盐或碱加成盐，其保留本发明化合物的生物学有效性和性质，并且由合适的无毒有机或无机酸或有机或无机碱形成。酸加成盐包括(例如)那些衍生自无机酸诸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸的盐，和那些衍生自有机酸诸如对甲苯磺酸、水杨酸、甲磺酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸等的盐。碱加成盐包括衍生自铵、钾、钠和季铵氢氧化物的盐，诸如像是四甲基氢氧化铵。将药物化合物化学修饰成盐是药物化学家熟知的技术，以获得化合物的物理和化学稳定性、吸湿性、流动性和溶解性改善。例如，描述于Bastin，Organic Process Research&Development 2000，4，427-435或Ansel，In：Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第6版(1995)，第196页及第1456-1457页。例如，本文中所提供的化合物的药用盐可为钠盐。
适合用于本发明的制剂可参阅Remington的Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company，Philadelphia，Pa.，第17版，1985。有关药物递送方法的简要综述，请参阅例如Langer(Science 249：1527-1533，1990)。WO 2007/031091进一步针对药用稀释剂、载体及佐剂提供适当且优选的实例(在此以引用方式并入)。WO2007/031091对于适当剂量、制剂、施用途径、组合物、剂型、与其他治疗剂的组合、前驱药物制剂等方面也有讨论。
本发明的寡核苷酸或寡核苷酸缀合物可与药学上允许的的活性或惰性物质混合，用以制备药物组合物或制剂。组合物及用以形成药物组合物制剂的方法取决于若干标准，包括但不限于，施用途径、疾病程度或要施用的剂量。
这些组合物可经由常规消毒技术消毒或经过滤灭菌。如此制成的水溶液可经包装用于使用，或经冻干，施用前先将冻干制剂与无菌水性载体结合。制剂的pH通常介于3和11之间，更优选地是介于5和9之间或是介于6和8之间，最优选地是介于7和8之间，诸如7至7.5。制成的固态组合物可包装成多个单剂单元，每个单元包含固定量的上述一种或多种试剂，诸如在片剂或胶囊的密封包装中。也可将固态组合物装入容器中，以利灵活调整用量，诸如装入便于局部施用乳霜或软膏的挤压管。
在一些实施例中，本发明的寡核苷酸或寡核苷酸缀合物为前驱药。特别在寡核苷酸缀合物方面，待前驱药递送至如靶细胞等作用位点之后，便将缀合物部分自寡核苷酸上切断。
应用
本发明的寡核苷酸可于例如诊断学、治疗法及预防法等领域用作研究试剂。
在研究中，此类寡核苷酸可用于在细胞(例如体外细胞培养物)和实验动物中特异性地调节TIA1蛋白的合成，从而有助于靶的功能分析或评估其作为治疗干预靶的可用性。通常，通过降解或抑制产生蛋白质的mRNA，从而阻止蛋白质形成，或通过降解或抑制产生蛋白质的基因或mRNA的调节剂来实现靶调节。
若在研究或诊断中使用本发明的寡核苷酸，则该靶核酸可为cDNA或源自DNA或RNA的合成核酸。
本发明提供了在表达TM1的靶细胞中调节TIA1表达的体内或体外方法，其包括向所述细胞施用有效量的本发明的寡核苷酸。
在一些实施例中，所述靶细胞是哺乳动物细胞，特别是人类细胞。所述靶细胞可为体外细胞培养物或为哺乳动物组织中的体内细胞形成部分。
在诊断中，寡核苷酸可用于通过Northern印迹、原位杂交或类似技术检测并定量细胞和组织中的TIA1表达。
对于治疗，可通过调节TIA1的表达来治疗怀疑患有疾病或疾患的动物或人。
本发明提供用以治疗或预防疾病的方法，所述方法包含向患有或易患该疾病的受试者施用治疗或预防上有效量的本发明寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或药物组合物。
本发明还涉及如本文中定义而可用作药物的寡核苷酸、组合物或缀合物。
依据本发明的寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或药物组合物通常是以有效量施用。
本发明还提供如所描述的本发明的寡核苷酸或寡核苷酸缀合物在制造用以治疗本文中所述疾患的药物上的用途，或提供治疗本文中所提及的疾患的方法。
在一些实施例中，疾病或疾患为神经退行性疾病，诸如神经退行性疾病。
在一些实施例中，疾病选自由以下项组成的组：肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、Tau蛋白病诸如原发性Tau蛋白病、额颞叶痴呆伴帕金森综合征(FTDP-17)、额颞叶变性-痴呆(FTLD-TDP)、亨廷顿病、克雅病以及脊髓性肌萎缩症、运动神经元病、阿尔茨海默氏病和范伦德远端肌病。
在一些实施例中，疾病为肌萎缩性脊髓侧索硬化症。
在一些实施例中，疾病为额颞叶痴呆(FTD)。
本发明提供了用于医药的根据本发明的寡核苷酸、缀合物或药物组合物。
如本文所指，疾病或疾患与TIA1的表达相关联。在一些实施例中，疾病或疾患可以与TIA1基因中的突变相关联。因此，在一些实施例中，靶核酸为TIA1序列的突变形式。
本发明的方法优选用于治疗或预防由TIA1的异常水平和/或活性引起的疾病。
本发明进一步涉及如本文所定义的寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或药物组合物在制备用于治疗TIA1的异常水平和/或活性的药物中的用途。
施用
本发明的寡核苷酸或药物组合物可以局部或肠内或肠胃外(诸如静脉内、皮下、肌肉内、脑内、脑室内或鞘内)施用。
在一个优选实施例中，本发明的寡核苷酸或药物组合物通过肠胃外途径施用，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注，鞘内或颅内，例如脑内或脑室内、玻璃体内施用。
在一些实施例中，将活性寡核苷酸或寡核苷酸缀合物通过鞘内施用。在一些实施例中，将活性寡核苷酸或寡核苷酸缀合物通过脑室内施用。在一些实施例中，将活性寡核苷酸或寡核苷酸缀合物通过脑施用。
在一些实施例中，本发明的寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或药物组合物以0.1-15mg/kg，诸如0.2-10mg/kg、诸如0.25-5mg/kg的剂量施用。施用可以是每周一次、每两周一次、每三周一次或甚至每月一次。
组合疗法
在一些实施例中，本发明的寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或药物组合物是用以与另一治疗剂进行结合治疗。所述治疗剂可例如为用以照护上述疾病或疾患的标准品。
实例
化合物和序列：参见表A中列出的本发明的示例性序列基序和化合物
细胞系
表B，用于TIA1反义寡核苷酸体外筛选的不同细胞系的详细信息。
Figure BDA0003044970660000461
Figure BDA0003044970660000471
Figure BDA0003044970660000481
也可以在来源于iPSC的运动神经元中评估化合物。
实例1：测试浓度为25μM和5μM的表A所列化合物的LNA寡核苷酸在U2OS细胞系中的体外功效。
使用表X中列出的50种LNA寡核苷酸，在人细胞系U2OS中进行寡核苷酸筛选。U2OS细胞系购自ATCC(商品目录号：HTB-96)，并且按照供应商的建议维持在37℃和5％CO2的加湿培养箱中。对于筛选测定，使用供应商推荐的培养基(MCCoy 5A培养基[产品目录号M8403]、10％FBS[产品目录号F7524]、1.5mM谷氨酰胺[产品目录号G8541]、25μg/mL庆大霉素[产品目录号G1397])，将细胞接种在96孔板中。在96孔形式中，将细胞/孔数量优化为7000个细胞/孔。
将细胞孵育24小时，然后添加浓度为5μM或25μM的寡核苷酸(溶解于PBS中)。加入寡核苷酸后3天，收获细胞。
根据制造商的说明，使用Qiagen RNeasy 96试剂盒(74182)提取RNA。使用qScriptXLT一步式RT-qPCR ToughMix Low ROX，95134-100(Quanta Biosciences)进行cDNA合成和qPCR。使用来自Thermo Fisher Scientific的FAM标记的TaqMan测定法在与VIC标记的GAPDH对照物的多重反应中定量靶转录物水平。进行了对所关注TIA1(Hs00234977m1(FAM-MGB))的靶转录物和管家基因GAPDH(4326317EVIC-MGB探针)的TaqMan引物测定法。使用技术双重复模式设置，n＝2个独立的生物学副本。
表X中显示了相对TIA1 mRNA表达水平，以相对于对照物(PBS处理的细胞)的百分比表示，即，值越低，抑制作用越大。
表C：抗TIA1化合物的体外功效(2次独立生物学实验的平均值与标准偏差)。将TIA1 mRNA水平标准化为GAPDH，并显示为相对于对照物(PBS处理的细胞)的百分比。
Figure BDA0003044970660000491
Figure BDA0003044970660000501
Figure BDA0003044970660000511
Figure BDA0003044970660000521
Figure BDA0003044970660000531
Figure BDA0003044970660000541
Figure BDA0003044970660000551
Figure BDA0003044970660000561
Figure IDA0003044970710000011
Figure IDA0003044970710000021
Figure IDA0003044970710000031
Figure IDA0003044970710000041
Figure IDA0003044970710000051
Figure IDA0003044970710000061
Figure IDA0003044970710000071
Figure IDA0003044970710000081
Figure IDA0003044970710000091
Figure IDA0003044970710000101
Figure IDA0003044970710000111
Figure IDA0003044970710000121
Figure IDA0003044970710000131
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Claims (24)

1.一种长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸或其药用盐，其中所述反义寡核苷酸包含长度为10-30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO 1至少90％互补，例如完全互补，其中所述反义寡核苷酸能够抑制表达人TIA7的细胞中人TIA1的表达。
2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO4至SEQ ID NO 53组成的组的序列至少90％互补，例如完全互补。
3.根据权利要求1至3中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与SEQID NO 1的区域完全互补，所述区域选自由列表A中的区域组成的组。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与SEQID NO 1的区域完全互补，所述区域选自由列表B中的区域组成的组。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸为包含式5′-F-G-F′-3′的连续核苷酸序列的缺口聚体寡核苷酸，其中区域F和F′独立地包含1个至8个糖修饰的核苷，并且G为能够募集RNA酶H的介于5个与16个之间的核苷的区域。
6.根据权利要求5所述的反义寡核苷酸，其中区域F和F′的所述糖修饰的核苷独立地选自由以下项组成的组：2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA、2′-氨基-DNA、2′-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2′-氟-ANA和LNA核苷。
7.根据权利要求5或6所述的反义寡核苷酸，其中区域G包含5-16个连续DNA核苷。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸为LNA缺口聚体寡核苷酸。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述LNA核苷为β-D-氧基LNA核苷。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的反义寡核苷酸，其中介于所述连续核苷酸序列之间的核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含选自由以下项组成的组的连续核苷酸序列：54-103。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含或由连续核苷酸序列组成，所述连续核苷酸序列选自由以下项组成的组：
CCttctcatataaaaCACA(SEQ ID NO 54)；CTTtactacactccCT(SEQ ID NO 55)；CCACtaattcttaaaattTC(SEQ ID NO56)；CCaacaattacttcTCAA(SEQ ID NO 57)；CTGatttacaacctcATC(SEQ ID NO 58)；TATttttctccaaaattCC(SEQ ID NO 59)；CTCAttcatccaacaaatAA(SEQ ID NO 60)；CACtaaaacatcctaaaaCC(SEQ ID NO 61)；TTCCattctttactctttAA(SEQ ID NO 62)；ACActatattctacctaATC(SEQ ID NO 63)；CCtttcccattaaaaaATTT(SEQ ID NO 64)；ACCTtccatttaacattAC(SEQ ID NO 65)；ATCtaccattcaacaaaCAC(SEQ ID NO66)；TGTaacttaatcttCCT(SEQ ID NO 67)；CAtcctaaccttattatTAT(SEQ ID NO 68)；CCctaacattcctatTTA(SEQ ID NO69)；CCttcaatctaatcTTTA(SEQ ID NO 70)；ACcttgaatactccTCA(SEQ ID NO 71)；TTCActacctcccaaAT(SEQ ID NO 72)；ATCtcacacacaataatCAC(SEQ ID NO 73)；CTCAcacacaataatcaCT(SEQ ID NO 74)；ATAtattcctttacataCAA(SEQ ID NO 75)；TATAttcctttacatacaAC(SEQ ID NO 76)；ATattcctttacatacaACT(SEQ ID NO 77)；TATTcctttacatacaacTT(SEQ ID NO 78)；ATtcctttacatacaaCTTT(SEQ ID NO 79)；GCCaacatttatccAC(SEQ ID NO 80)；CCAacatttatccACT(SEQ ID NO 81)；CTaaaactccataccTCA(SEQ ID NO 82)；CCcagacattacacCA(SEQ ID NO83)；CCagacattacaccaTTC(SEQ ID NO 84)；AGAcattacaccatTCA(SEQ ID NO 85)；AAacagtaatcccTTCA(SEQ ID NO 86)；ACAgtaatcccttcaCT(SEQ ID NO 87)；CAGtaatcccttcacTT(SEQ ID NO 88)；AGtaatcccttcacttTA(SEQ ID NO 89)；TAatcccttcactttaTAT(SEQ ID NO 90)；TATTaacacaaacacattCA(SEQ ID NO 91)；ACAcaaacacattcaatCAT(SEQ ID NO 92)；CACAaacacattcaatcaTA(SEQ ID NO 93)；ACAaacacattcaatcaTAT(SEQ ID NO 94)；CAaacacattcaatcaTATC(SEQ ID NO 95)；TGAcaaatcctaaTCT(SEQ ID NO 96)；TTAccttacccattaTC(SEQ ID NO 97)；TAccttacccattatcTT(SEQ ID NO 98)；TACccttacatccATA(SEQ ID NO 99)；AAAtacccttacatccaTAA(SEQ ID NO 100)；ACccttacatccaTAAT(SEQ ID NO 101)；CCTtacatccataatcAT(SEQ ID NO 102)；和CTTAcatccataatcatTT(SEQ ID NO 103)，其中大写字母代表LNA核苷，小写字母代表DNA核苷。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含或由连续核苷酸序列组成，所述连续核苷酸序列选自由以下项组成的组：
CCttctcatataaaaCACA(SEQ ID NO 54)；CTTtactacactccCT(SEQ ID NO 55)；CCACtaattcttaaaattTC(SEQ ID NO 56)；CCaacaattacttcTCAA(SEQ ID NO 57)；CTGatttacaacctcATC(SEQ ID NO 58)；TATttttctccaaaattCC(SEQ ID NO 59)；CTCAttcatccaacaaatAA(SEQ ID NO 60)；CACtaaaacatcctaaaaCC(SEQ ID NO 61)；TTCCattctttactctttAA(SEQ ID NO 62)；ACActatattctacctaATC(SEQ ID NO 63)；CCtttcccattaaaaaATTT(SEQ ID NO 64)；ACCTtccatttaacattAC(SEQ ID NO 65)；ATCtaccattcaacaaaCAC(SEQ ID NO 66)；TGTaacttaatcttCCT(SEQ ID NO 67)；CAtcctaaccttattatTAT(SEQ ID NO 68)；CCctaacattcctatTTA(SEQ ID NO 69)；CCttcaatctaatcTTTA(SEQ ID NO 70)；ACcttgaatactccTCA(SEQ ID NO 71)；TTCActacctcccaaAT(SEQ ID NO 72)；ATCtcacacacaataatCAC(SEQ ID NO 73)；CTCAcaeacaataatcaCT(SEQ ID NO 74)；ATAtattcctttacataCAA(SEQ ID NO 75)；TATAttcctttacatacaAC(SEQ ID NO 76)；ATattcctttacatacaACT(SEQ ID NO 77)；TATTcctttacatacaacTT(SEQ ID NO 78)；ATtcctttacatacaaCTTT(SEQ ID NO 79)；GCCaacatttatccAC(SEQ ID NO 80)；CCAacatttatccACT(SEQ ID NO 81)；CTaaaactccataccTCA(SEQ ID NO 82)；CCcagacattacacCA(SEQ ID NO 83)；CCagacattacaccaTTC(SEQ ID NO 84)；AGAcattacaccatTCA(SEQ ID NO 85)；AAacagtaatcccTTCA(SEQ ID NO 86)；ACAgtaatcccttcaCT(SEQ ID NO 87)；CAGtaatcccttcacTT(SEQ ID NO 88)；AGtaatcccttcacttTA(SEQ ID NO 89)；TAatcccttcactttaTAT(SEQ ID NO 90)；TATTaacacaaacacattCA(SEQ ID NO 91)；ACAcaaacacattcaatCAT(SEQ ID NO 92)；CACAaacacattcaatcaTA(SEQ ID NO 93)；ACAaacacattcaatcaTAT(SEQ ID NO 94)；CAaacacattcaatcaTATC(SEQ ID NO 95)；TGAcaaatcctaaTCT(SEQ ID NO 96)；TTAccttacccattaTC(SEQ ID NO 97)；TAccttacccattatcTT(SEQ ID NO 98)；TACccttacatccATA(SEQ ID NO 99)；AAAtacccttacatccaTAA(SEQ ID NO 100)；ACccttacatccaTAAT(SEQ ID NO 101)；CCTtacatccataatcAT(SEQ ID NO 102)；和CTTAcatccataatcatTT(SEQ ID NO 103)，其中大写字母代表β-D-氧基LNA核苷，小写字母代表DNA核苷，其中每个LNA胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶，并且其中介于所述核苷之间的核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。
14.一种缀合物，其包含权利要求1-13中任一项所述的寡核苷酸，以及至少一个缀合物部分，所述缀合物部分共价连接至所述寡核苷酸。
15.一种药物组合物，其包含权利要求1-13所述的寡核苷酸或权利要求14所述的缀合物，以及药学上允许的稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。
16.一种用于在表达TIA1的靶细胞中调节TIA1表达的体内或体外方法，所述方法包括向所述细胞施用有效量的根据权利要求1-13中任一项所述的寡核苷酸或根据权利要求14所述的缀合物或根据权利要求15所述的药物组合物。
17.一种用于治疗或预防疾病的方法，所述方法包括向患有或易患所述疾病的受试者施用治疗或预防上有效量的根据权利要求1-13中任一项所述的寡核苷酸或根据权利要求14所述的缀合物或根据权利要求15所述的药物组合物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述疾病为神经障碍，诸如选自由以下项组成的组的神经障碍：肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、Tau蛋白病(例如原发性Tau蛋白病)、额颞叶痴呆伴帕金森综合征(FTDP-17)、额颞叶变性-痴呆(FTLD-TDP)、亨廷顿病、克雅病以及脊髓性肌萎缩症、运动神经元病、Tau蛋白病、阿尔茨海默氏病和范伦德远端肌病。
19.根据权利要求1-13中任一项所述的寡核苷酸或根据权利要求14所述的缀合物或根据权利要求15所述的药物组合物，其用于医药中。
20.根据权利要求1-13中任一项所述的寡核苷酸或根据权利要求14所述的缀合物或根据权利要求15所述的药物组合物，其用于治疗或预防选自由以下项组成的组的神经障碍：肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、Tau蛋白病(例如原发性Tau蛋白病)、额颞叶痴呆伴帕金森综合征(FTDP-17)、额颞叶变性-痴呆(FTLD-TDP)、亨廷顿病、克雅病以及脊髓性肌萎缩症、运动神经元病、Tau蛋白病、阿尔茨海默氏病和范伦德远端肌病。
21.根据权利要求1-13中任一项所述的寡核苷酸或根据权利要求14所述的缀合物或根据权利要求15所述的药物组合物用于制备治疗或预防神经障碍的药物的用途，所述神经障碍为诸如选自由以下项组成的组的神经障碍：肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、额颞叶痴呆伴帕金森综合征fFTDP-17)、额颞叶变性-痴呆(FTLD-TDP)、Tau蛋白病(诸如原发性Tau蛋白病)、亨廷顿病、克雅病以及脊髓性肌萎缩症、运动神经元病、Tau蛋白病、阿尔茨海默氏病和范伦德远端肌病。
22.根据权利要求17-21中任一项所述的方法的用途，其中所述神经障碍为肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)。
23.根据权利要求17-21中任一项所述的方法的用途，其中所述神经障碍为Tau蛋白病，例如原发性Tau蛋白病。
24.根据权利要求17-21中任一项所述的方法的用途，其中所述神经障碍为额颞叶变性-痴呆(FTLD-TDP)。
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