JPH10195098A - 新規ヌクレオチド類縁体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 生体内で酵素の加水分解を受けにくく、セン
ス鎖との結合能が高く、しかも合成が容易であるオリゴ
ヌクレオチド類縁体・アンチセンス分子を提供する。 【構成】 一般式： 【化１】 ［式中、Ｂは同一または異なってもよく、ピリミジンも
しくはプリン核酸塩基またはそれらの誘導体である］で
表されるヌクレオチド類縁体であるモノマー単位を１ま
たは２以上含有するオリゴまたはポリヌクレオチド類縁
体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規なヌクレオチド類縁
体に関し、更に詳細にはアンチセンス分子に適したヌク
レオチド類縁体に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】１９７８年アンチセンス分子がインフル
エンザウィルスの感染を阻害したとの報告が初めてなさ
れた。以後、ガン遺伝子発現やＡＩＤＳ感染を阻害した
との報告もなされている。アンチセンスオリゴヌクレオ
チドが望ましくない遺伝子の発現を特異的に制御するこ
とから、医薬品として近年、最も期待されている分野の
うちの一つである。

【０００３】アンチセンス法とは、ＤＮＡ→ＲＮＡ→タ
ンパク質という、いわゆるセントラルドグマの一連の流
れをアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて制御しよ
うという概念に基づいている。

【０００４】しかしながら、天然型オリゴヌクレオチド
をアンチセンス分子としてこの方法に適用した場合、生
体内の酵素により加水分解を受けたり、細胞膜透過性が
高くないなどの問題が生じた。そしてこれらを解消する
ために核酸誘導体が数多く合成され、研究が重ねられて
きた。例えば、リン原子上の酸素原子をイオウ原子に置
換したホスホロチオエート、メチル基に置換したメチル
ホスホネート、また最近になっては、リン原子も炭素原
子で置換したものやリボースを非環式骨格にした分子も
合成されている（F. Eckstein et al., Biochem., 18,
592(1979), P.S.Miller et al., Nucleic Acids Res.,
11, 5189 (1983), P.Herdewijn et al.,J. Chem. Soc.
Perkin Trans. 1, 1567 (1993), P.E. Nielsen et al.,
Science, 254, 1497 (1991))。

【０００５】しかし、いずれの場合も、生体内での安定
性またはオリゴヌクレオチドの合成の容易さ等の点で満
足のいく誘導体が得られていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】生体内で細胞膜透過性
が高く、酵素の加水分解を受けにくく、しかも合成が容
易であるアンチセンス分子用のヌクレオチド類縁体が提
供されることが望まれている。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の発明者等は、ア
ンチセンス法において有用であろう、核酸の糖部分を修
飾した核酸誘導体を設計し、それを合成してその有用性
を確認した。以下に本発明を説明する。

【０００８】本発明のヌクレオチド類縁体は下記の一般
式：

【化３】 ［式中、Ｂは同一または異なってもよく、ピリミジンも
しくはプリン核酸塩基またはそれらの誘導体である］で
表されるヌクレオチド類縁体であるモノマー単位を１ま
たは２以上含有するオリゴまたはポリヌクレオチド類縁
体である。

【０００９】このモノマー単位は一般式：

【化４】 ［式中、Ｂはピリミジンもしくはプリン核酸塩基又はそ
れらの類縁体であり、Ｙ₁及びＹ₂は同一もしくは異な
り、水素または水酸基の保護基である。保護基としては
公知のどのような基も使用できるが、好ましくはアルキ
ル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル
基、アリール基、アシル基、アラルキル基又はシリル基
である］で表わされるヌクレオシド類縁体もしくはそれ
らのアミダイト誘導体である。

【００１０】アルキル基とは炭素数１ー２０の直鎖また
は分枝鎖状のアルキル基を示し、例えば、メチル基、エ
チル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル
基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル
基、オクチル基、ノニル基、デシル基等があげられる。

【００１１】アルケニル基とは、炭素数２−２０の直鎖
または分枝鎖状のアルケニル基を示し、例えば、ビニル
基、アリル基、ブテニル基、ペンテニル基、ゲラニル
基、ファルネシル基等があげられる。

【００１２】アルキニル基とは、炭素数２−２０の直鎖
または分枝鎖状のアルキニル基を示し、例えば、エチニ
ル基、プロピニル基、ブチニル基等があげられる。

【００１３】シクロアルキル基とは、炭素数３−８のシ
クロアルキル基を示し、例えば、シクロプロピル基、シ
クロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、
シクロヘプチル基、シクロオクチル基等があげられる。
シクロアルキル基の環上の１つ以上の任意のメチレンが
酸素原子や硫黄原子あるいはアルキル基で置換された窒
素原子に置換された複素環基も含まれ、例えばテトラヒ
ドロピラニル基などがあげられる。

【００１４】アリール基とは、芳香族炭化水素基から水
素原子１個を除いた１価の置換基を意味し、例えば、フ
ェニル基、トリル基、キシリル基、ビフェニル基、ナフ
チル基、アントリル基、フェナントリル基等である。ま
た、アリール基の環上の炭素原子はハロゲン原子、低級
アルキル基、水酸基、アルコキシ基、アミノ基、ニトロ
基、トリフルオロメチル基等の１種以上の基によって置
換されていてもよい。置換基としてはハロゲン原子、水
酸基、アミノ基、アルコキシ基、アリールオキシ基等が
あげられる。

【００１５】アシル基としては、アセチル基、ホルミル
基、プロピオニル基、ベンゾイル基、ベンジルオキシカ
ルボニル基等があげられる。シリル基の例としては、ト
リアルキルシリル基があげられるが、好ましくは、トリ
メチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピ
ルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチル
ジフェニルシリル基等があげられ、更に好ましくはトリ
メチルシリル基である。

【００１６】アラルキル基とは、芳香族炭化水素で置換
されたアルキル基を意味し、好ましくはベンジル基、ト
リチル基である。各々の芳香環は置換されていてもよ
い。更に好ましいアラルキル基としては、４，４’−ジ
メトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基である。

【００１７】本発明における、ピリミジン又はプリン核
酸塩基とは、チミン、ウラシル、シトシン、アデニン、
グアニン及びそれらの誘導体である。

【００１８】本発明のヌクレオチド類縁体は次のように
合成できる。説明を簡明にするため、まず、上記の式中
Ｂがウラシルである化合物を例にとって説明する。

【００１９】（１）モノマーユニットの合成

【化５】 文献既知の化合物である２',３'−Ｏ−シクロヘキシリ
デンーウリジン（１）をｐ−トルエンスルホニルクロリ
ドと反応させて、化合物２を得る。次いで、この化合物
をＴＦＡ−Ｈ₂Ｏ中で撹拌することにより、４'−（ｐ−
トルエンスルホニルオキシメチル）ウリジンである化合
物３を得る。

【００２０】化合物３に４,４'−ジメトキシトリチルク
ロリドを反応させて、５’位の水酸基を保護した化合物
４を得る。さらに、ＮａＨＭＤＳと反応させることによ
り、５'−Ｏ−(４,４'−ジメトキシトリチル）−３'−
Ｏ,４'−メタノウリジン、化合物５を得る。

【００２１】（２）オリゴヌクレオチド類縁体の合成 化合物５に２−シアノエチルーＮ，Ｎ，Ｎ',Ｎ'−テト
ライソプロピルホスホロジアミダイトを作用させ、アミ
ダイト体（化合物６）を得、ＤＮＡシンセサイザーを用
いて種々のアンチセンスオリゴマー類縁体を合成する。
次いで、得られるアンチセンスオリゴマー類縁体を逆相
カラムを用いて精製し、精製物の純度を逆相ＨＬＰＣで
分析することにより、精製オリゴヌクレオチド類縁体の
生成を確認できる。

【００２２】化合物５のモノマーユニットは、オリゴヌ
クレオチド類縁体の中に１つ以上存在させることができ
る。また、オリゴヌクレオチド類縁体中の２カ所以上の
位置に、１又は２以上の天然ヌクレオチドを介して隔離
された状態で存在させても良い。本発明によれば、本発
明のヌクレオチド類縁体を必要な位置に必要な数（長
さ）で導入したアンチセンス分子を合成することができ
る。ヌクレオチド類縁体全体の長さとしてヌクレオシド
単位が２〜５０、好ましくは１０〜３０個である。

【００２３】このようなアンチセンス分子は、エキソヌ
クレアーゼに対してばかりでなく、エンドヌクレアーゼ
に対しても分解されにくく、生体への投与後、長く生体
内に存在することができる。そして、例えば、センス鎖
ＲＮＡと二重鎖を形成して病因となる生体内成分（タン
パク質）の形成（翻訳）を阻害したり、二重鎖ＤＮＡと
の間で三重鎖を形成してｍＲＮＡへの転写を阻害する。
また、感染したウィルスの増殖を阻害すると考えられ
る。

【００２４】これらのことから、本発明のヌクレオチド
類縁体を用いたアンチセンス分子は、抗腫瘍剤、抗ウィ
ルス剤をはじめとした遺伝子の働きを阻害して疾病を治
療する医薬品としての有用性が期待されている。

【００２５】本発明のヌクレオチド類縁体を用いたアン
チセンス分子は、例えば緩衝剤および／または安定剤等
の慣用の助剤を配合して非経口投与用製剤とすることが
できる。また、局所用の製剤としては、慣用の医薬用担
体を配合して軟膏、クリーム、液剤、または膏薬等に調
剤できる。

【００２６】

【実施例】本発明のヌクレオチド類縁体の合成を実施例
及び製造例により、さらに詳しく説明する。

【００２７】実施例１：モノマーユニットの合成 （１）２',３'−Ｏ−シクロヘキシリデンー４’−（ｐ
−トルエンスルホニルオキシメチル）ウリジン（化合物
２）の合成 窒素気流下、文献（G.H.Jones et al, J.Org.Chem., 4
4, 1309(1979)）既知の化合物１（９５６ｍｇ、２．７
０ｍｍｏｌ）の無水ピリジン（１３．５ｍｌ）溶液に室
温でｐ-トルエンスルホニルクロライド（７７１ｍｇ，
４.０５ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で５時間撹拌した。
反応液に飽和重曹水を加えた後、ベンゼンで３回抽出し
た。有機層を飽和食塩水で１回洗浄後、無水ＭｇＳＯ₄
にて乾燥した。溶媒を減圧留去し、ベンゼンで３回共沸
し、得られた粗生成体をシリカゲルカラムクロマトグラ
フィー（ＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨ＝１５：１）により精製
後、ベンゼン／ヘキサンにて再沈殿し、白色粉末（化合
物２）（８０８ｍｇ，１．５９ｍｍｏｌ，５９％）を得
た。

【００２８】mp104-106℃（benzene/hexane). IR(KBr):ν_max3326,2929,2850,1628,1577,1544,1437,13
11,1244cm^-1.¹ H-NMR(acetone-d₆):δ1.45-1.67(10H,m,cyclohexyl-),
2.45(3H,s,φ-CH₃ ),3.71(2H,ABq,J=11.5Hz,C5'-H₂),4.2
0(2H,ABq,J=10.5Hz,C4'-CH₂ OTs),4.92(1H,d,J₂'₃'=6.4H
z,C3'-H),5.05,5.06(1H,dd,J₁'₂'=3.7Hz,J₂'₃'=6.4Hz,C
2'-H),5.60(1H,d,J₄'₅'=7.3Hz,C4-H),5.75(1H,d,J₁'₂'=
3.7Hz,C1'-H),7.48(2H,d,J=8.2Hz,φ),7.77(1H,d,J₄'₅'
=7.8Hz,C5-H),7.81(2H,d,J=8.2Hz,φ),10.10(1H,s,NH).¹³ C-NMR(acetone-d₆):δ21.5,24.1,24.5,25.5,34.8,36.
9,63.5,69.7,82.5,84.7,87.8,92.9,102.9,115.4,128.8,
130.8,133.9,142.7,145.9,151.3,163.5. Mass(EI):m/z 481(M⁺-H₂O). Anal Calcd for C₂₃H₂₈N₂O₉S・1/3 H₂O:C,53.69;H,5.61;
N,5.44;S,6.22.Found:C,53.99;H,5.48;N,5.42;S,6.10.

【００２９】（２）４’−（ｐ−トルエンスルホニルオ
キシメチル）ウリジン（化合物３）の合成 上記の化合物２（１０７ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）をＴ
ＦＡ−Ｈ₂Ｏ（９８：２，１ｍｌ）中室温で１０分間撹
拌した。反応液を減圧留去し、エタノールを加えて３回
共沸した。得られた粗生成体をシリカゲルカラムクロマ
トグラフィー（ＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨ＝１０：１）によ
り精製し、白色粉末（化合物３）（８５．０ｍｇ，０．
２０ｍｍｏｌ，９４％）を得た。

【００３０】mp119-120℃. IR(KBr):ν_max3227,3060,2932,2837,1709,1508,1464,12
52,978,835,763,556cm^-1.¹H-NMR(acetone-d₆):δ 2.31
(3H,s,φ-CH₃ ),2.84(3H,s,OH),3.71(2H,s,C5'-H₂),4.1
3,4.20(2H,ABq,J=10.9Hz,C4'-CH₂ OTs),4.28,4.31(1H,d
d,J₁'₂'=8.6Hz,J₂'₃'=5.6Hz,C2'-H),4.36(1H,d,J₂'₃'=
5.6Hz,C3'-H),5.54(1H,d,J₄'₅'=7.9Hz,C4-H),5.75(1H,
d,J₁'₂'=6.6Hz,C1'-H),7.32(2H,d,J=7.9Hz),7.67(2H,d,
J=8.2Hz),7.70(1H,d,J₄'₅'=8.3Hz,C5-H),10.14(1H,s,N
H).¹³ C-NMR(acetone-d₆):δ21.5,63.7,70.8,72.7,74.6,86.
8,88.8,103.1,128.8,130.7,133.9,141.7,145.8,151.8,1
63.9. Mass(EI):m/z 256(M⁺-OTs).

【００３１】（３） ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキ
シトリチル）−４’−（ｐ−トルエンスルホニルオキシ
メチル）ウリジン（化合物４）の合成 上記化合物３（１．１３ｇ，２．６４ｍｍｏｌ）に無水
ピリジンを加えて３回共沸した後、無水ピリジン（１
４．５ｍｌ）溶液とし、窒素気流下、室温で４，４−ジ
メトキシトリチルクロライド（１．０７ｇ，３.１７ｍ
ｍｏｌ）を加え室温で１６時間撹拌した。

【００３２】反応溶液に飽和重曹水を加えた後、ＣＨ₂
Ｃｌ₂で３回抽出した。有機層を飽和食塩水で１回洗浄
後、無水ＭｇＳＯ₄にて乾燥した。溶媒を減圧留去し、
ベンゼンで２回共沸した後、得られた粗生成体をシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃：Ｅｔ₃Ｎ：
ＭｅＯＨ＝６０：２：０→６０：２：４）により精製
後、エタノール／ヘキサンにて再沈殿し、白色粉末（化
合物４）（８６８ｍｇ，１．０６ｍｍｏｌ，４１％）を
得た。

【００３３】mp104-105℃（Et₂O/hexane). IR(KBr):ν_max3396,2937,2737,2675,2493,1691,1474,13
97,1173,1035cm^-1.¹ H-NMR(acetone-d₆):δ2.41(3H,s,φ-CH₃ ),3.22,3.33(2
H,ABq,J=9.9Hz,C5'-H₂),3.79(6H,s,p-OCH₃ -φ),4.29(1
H,dd,J₁'₂'=6.3Hz,J₂'₃'=5.6Hz,C2'-H),4.34,4.41(2H,A
Bq,J=11.2Hz,C4'-CH₃ OTs),4.40(1H,d,J₂'₃'=5.6Hz,C3'-
H),5.35(1H,d,J₄'₅'=8.3Hz,C4-H),5.82(1H,d,J₁'₂'=6.3
Hz,C1'-H),6.89(4H,d,J=8.9Hz,p-CH₃O-φ),7.26-7.41(7
H,m),7.43(1H,d,J₄'₅'=8.3Hz,C5-H),7.70(2H,d,J=8.3H
z).¹³ C-NMR(acetone-d₆):δ21.6,55.5,64.6,70.7,72.7,74.
3,85.8,87.8,88.9,102.8,114.0,127.7,128.7,128.8,13
0.7,130.9,131.0,133.9,141.1,145.5,151.4,159.7,163.
3. Anal Calcd for C₃₈H₃₈N₂O₁₁S・1/3 H₂O:C,61.95;H,5.2
9;N,3.80;S,4.34.Found:C,62.37;H,5.26;N,3.60;S,4.1
5.

【００３４】（４）５'−Ｏ−（４，４'−ジメトキシト
リチル）−３'−Ｏ，４'−メタノウリジン（化合物５）
の合成 窒素気流下、化合物４（７３５ｍｇ，０．９０ｍｍｏ
ｌ）の無水ＴＨＦ（１１．１ｍｌ）中に室温でＮａＨＭ
ＤＳ（８．９６ｍｍｏｌ）の無水ベンゼン溶液（４ｍ
ｌ）を加え、室温で４８時間撹拌した。反応溶液に飽和
重曹水を加え、ＣＨ₂Ｃｌ₂にて３回抽出した。有機層を
飽和食塩水で１回洗浄した後、無水ＭｇＳＯ₄にて乾燥
した。

【００３５】溶媒を減圧留去し、得られた粗生成体をシ
リカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃：Ｅｔ₃
Ｎ：ＭｅＯＨ＝６０：２：０→６０：２：４）により精
製後、エタノール／ヘキサンにて再沈殿し、白色粉末
（化合物５）（２６１ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ，５２
％）を得た。

【００３６】mp120-121℃（Et₂O/hexane). IR(KBr):ν_max3395,3222,3062,2930,1693,1508,1461,13
85,1298,1252,1177,1034cm^-1.¹ H-NMR(acetone-d₆):δ2.92(1H,br s,OH),3.47,3.51(2
H,ABq,J=10.3Hz,C5'-H₂),3.85(6H,s,p-OCH₃ -φ),4.36(1
H,dd,J₁'₂'=4.3Hz,J₂'₃'=4.3Hz,C2'-H),4.52,4.83(2H,A
Bq,J=7.7Hz,C4'-CH₂ O-),5.11(1H,d,J₂'₃'=4.3Hz,C3'-
H),5.57(1H,d,J₄'₅'=7.7Hz,C4-H),6.51(1H,d,J₁'₂'=7.7
Hz,C1'-H),6.96(4H,d,J=8.6Hz,p-CH₃O-φ),7.39-7.41(7
H,m,φ),7.52(2H,d,J=5.1Hz,φ),7.71(1H,d,J₄'₅'=8.6H
z,C5-H).¹³ C-NMR(acetone-d₆):δ55.4,64.1,75.5,79.0,85.5,86.
2,87.1,88.8,103.3,113.7,113.9,127.6,128.4,128.6,12
8.8,129.9,130.9,131.1,136.3,136.4,141.2,145.7,151.
6,159.6,163.4. Mass(EI):m/z 558(M⁺),303(DmTr⁺),256(M⁺-DmTr),227(M
⁺-DmTrOCH₂).

【００３７】（５）２’−Ｏ−［２−シアノエトキシ
（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−５'−Ｏ−
(４，４'−ジメトキシトリチル）−３'−Ｏ，４'−メタ
ノウリジン（化合物６）の合成 化合物５（２６１ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ）、ジイソプ
ロピルアンモニウムテトラゾリド（３９．９ｍｇ，０．
２３ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ₃ＣＮで３回共沸した後、無
水ＣＨ₃ＣＮ−無水ＴＨＦ（５：１、１０ｍｌ）溶媒と
し、窒素気流下、２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−
テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．１８ｍ
ｌ，０．５６ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分撹拌し
た。

【００３８】溶媒を減圧留去し、得られた粗生成体をシ
リカゲルカラムクロマトグラフィー（無水ＡｃＯＥｔ：
Ｅｔ₃Ｎ＝１００：４）により精製後、無水ジエチルエ
ーテル／ヘキサンにて再沈殿し、白色粉末（化合物６）
（３４０ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ，１００％）を得た。

【００３９】mp94-96℃（Et₂O/hexane). IR(KBr):ν_max2966,2252,2049,1697,1607,1509,1460,12
98,1253,1038.³¹ P-NMR(acetone-d₆):δ150.8,151.2.

【００４０】実施例２：オリゴヌクレオチド類縁体の合
成

【化６】 （１）５’−ＧＣＧＸＴＴＴＴＴＧＣＴ−３’（ＸＴ
５）の合成 ３’−水酸基が支持体に結合した５’−Ｏ−ジメトキシ
トリチルチミジン（０．２μｍｏｌ）のジメトキシトリ
チル基（ＤＭＴｒ基）をトリクロロ酢酸によって脱保護
し、その５’−水酸基に５’−Ｏ−ジメトキシトリチル
デオキシシチジン２−シアノエチルホスホアミダイト誘
導体をテトラゾールにより縮合し、未反応の５’−水酸
基を無水酢酸と４−ジメチルアミノピリジン、２，４，
６−コリジンでアセチル化した後、ヨウ素と２，４，６
−コリジン、水によりリンを酸化した。

【００４１】同様に脱保護、縮合、アセチル化、酸化を
繰り返した。（４員環アミダイト誘導体も他のアミダイ
ト誘導体と同様に用いることができた。）最後の５’−
Ｏ−ジメトキシトリチルデオキシグアノシン２−シアノ
エチルホスホアミダイト誘導体を縮合し、酸化して得ら
れた１２−ｍｅｒのオリゴマー（ここまでの工程はPhar
macia社製ＤＮＡ合成装置Gene Assembler Plusにより行
なった。）を濃アンモニア水１ｍｌによって支持体から
切り出すとともに、リンからシアノエチル基をはずし、
さらにアデニン、グアニン、シトシンの保護基をはずし
た。

【００４２】得られた５’−Ｏ−ジメトキシトリチルオ
リゴヌクレオチドは、逆相カラム（Millipore,Oligo-Pa
k^TMSP)上でトリフルオロ酢酸５ｍｌによりＤＭＴｒ基を
はずし、引き続き精製を行ない、目的の５’−ＧＣＧＸ
ＴＴＴＴＴＧＣＴ−３’（ＸＴ５）（０．０２ｍｍｏ
ｌ，１０％）を得た。得られたオリゴヌクレオチド類縁
体の純度は逆相ＨＰＬＣにより確認した。

【００４３】（２）５’−ＧＣＧＴＴＸＴＴＴＧＣＴ−
３’（Ｔ２ＸＴ３）の合成 （１）と同様にして、目的の５’−ＧＣＧＴＴＸＴＴＴ
ＧＣＴ−３’（Ｔ２ＸＴ３）（０．０４ｍｍｏｌ，２０
％）を得た。

【００４４】（３）５’−ＧＣＧＴＴＴＸＴＴＧＣＴ−
３’（Ｔ３ＸＴ２）の合成 （１）と同様にして、目的の５’−ＧＣＧＴＴＴＸＴＴ
ＧＣＴ−３’（Ｔ３ＸＴ２）（０．０３ｍｍｏｌ，１５
％）を得た。

【００４５】（４）５’−ＧＣＧＴＴＴＴＴＸＧＣＴ−
３’（Ｔ５Ｘ）の合成 （１）と同様にして、目的の５’−ＧＣＧＴＴＴＴＴＸ
ＧＣＴ−３’（Ｔ５Ｘ）（０．０２ｍｍｏｌ，１０％）
を得た。

【００４６】（５）５’−ＧＣＧＸＸＴＴＴＴＧＣＴ−
３’（Ｘ２Ｔ４）の合成 （１）と同様にして、目的の５’−ＧＣＧＸＸＴＴＴＴ
ＧＣＴ−３’（Ｘ２Ｔ４）（０．０３ｍｍｏｌ，１５
％）を得た。

【００４７】（６）５’−ＧＣＧＴＴＸＸＴＴＧＣＴ−
３’（Ｔ２Ｘ２Ｔ２）の合成 （１）と同様にして、目的の５’−ＧＣＧＴＴＸＸＴＴ
ＧＣＴ−３’（Ｔ２Ｘ２Ｔ２）（０．０３ｍｍｏｌ，１
５％）を得た。

【００４８】（７）５’−ＧＣＧＴＴＴＴＸＸＧＣＴ−
３’（Ｔ４Ｘ２）の合成 （１）と同様にして、目的の５’−ＧＣＧＴＴＴＴＸＸ
ＧＣＴ−３’（Ｔ４Ｘ２）（０．０３ｍｍｏｌ，１５
％）を得た。

【００４９】（８）５’−ＧＣＧＸＸＸＸＸＸＧＣＴ−
３’（Ｘ６）の合成 （１）と同様にして、目的の５’−ＧＣＧＸＸＸＸＸＸ
ＧＣＴ−３’（Ｘ６）（０．０３ｍｍｏｌ，１５％）を
得た。

【００５０】実験例１：融解温度（Ｔｍ）の測定 実施例２で合成した種々のアンチセンス分子であるオリ
ゴマー鎖（アンチセンス鎖）とセンス鎖とをアニーリン
グ処理したもののＴｍを測定することにより、アンチセ
ンスのハイブリッド形成能を調べた。

【００５１】終濃度をそれぞれ、ＮａＣｌ １００ｍ
Ｍ、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍＭ、
アンチセンス鎖４μＭ、センス鎖４μＭとしたサンプル
溶液（５００μＬ）を沸騰水中に浴し、１０時間かけて
室温まで冷却した。分光光度計（Shimadzu,ＵＶ−２１
００ＰＣ）のセル室内に結露防止のために窒素気流を通
し、サンプル溶液を５℃まで徐々に冷却し、さらに２０
分間５℃に保った後、測定を開始した。温度は９０℃ま
で毎分０．２℃ずつ上昇させ、０．１℃間隔で２６０ｎ
ｍにおける紫外部吸収を測定した。なお温度上昇により
濃度が変化するのを防ぐため、セルは蓋付きのものを用
い、サンプル溶液表面に鉱油を１滴添加し測定を行っ
た。

【００５２】測定に用いたアンチセンス鎖及びセル鎖の
配列を次に示す。

【００５３】なお、本明細書では便宜上天然ヌクレオシ
ドをＴ，Ｃ，Ａ，Ｇのように大文字で表記し、本発明に
おける類縁体をそれぞれｔ，ｃ，ａ，ｇのように小文字
で表記する。

【００５４】

【表１】

【００５５】実験例２：酵素耐性の測定 天然型及び非天然型の下記のオリゴヌクレオチドについ
て、オリゴヌクレオチドを３’側から分解するエキソヌ
クレアーゼに対する耐性を調べた。

【００５６】１５分間３７℃に保ったオリゴヌクレオチ
ドのバッファー溶液（１０μＭ，４００μｌ）に、蛇毒
ホスホジエステラーゼのバッファー溶液（０．００３Ｕ
／ｍｌ，４００μｌ）を混合した。オリゴマーの分解に
よる紫外部吸収（２６０ｎｍ）の増加をＳＨＩＭＡＤＺ
Ｕ ＵＶ−２１００ＰＣを用い、３７℃で経時的に測定
した。用いたバッファーの組成はＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．６）０．１Ｍ，ＮａＣｌ ０．１Ｍ，ＭｇＣｌ₂
１４ｍＭであり、測定前に十分に脱気した。

【００５７】測定に用いたオリゴヌクレオチドの配列を
以下に示す。 天然鎖 ５’−ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ−３’ Ｘ２ ５’−ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＸＸＣ−３’

【００５８】半減期（ｔ_1/2）の測定 測定開始時（ｔ＝０）及び紫外部吸収（２６０ｎｍ）の
増加が認められなくなった時点での紫外部吸収値の平均
値を示す時間を半減期（ｔ_1/2）とした。結果は次の通
りである。オリゴヌクレオチド ｔ_1/2（秒） 天然鎖 ３５０ Ｘ２ １３９０

【００５９】また、紫外部吸収の経時変化を示すチャー
トを図１（天然鎖）及び図２（Ｘ２）に示した。天然鎖
は酵素反応開始後、約３０分で紫外部吸収値が一定とな
り、Ｘ２では約９０分で一定となった。

【００６０】

【配列表】

出願人の氏名：今西武 発明の名称：新規ヌクレオチド類縁体 整理番号： 出願番号： 出願日：平成９年１１月１７日 優先権番号：特願平８−３０６５８５号 優先日：平成８年１１月１８日 配列の数：１０

【００６１】配列番号：１ 配列の長さ：１２ 配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： ５’−ＧＣＧＸＴＴＴＴＴＧＣＴ−３’

【００６２】配列番号：２ 配列の長さ：１２ 配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： ５’−ＧＣＧＴＴＸＴＴＴＧＣＴ−３’

【００６３】配列番号：３ 配列の長さ：１２ 配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： ５’−ＧＣＧＴＴＴＸＴＴＧＣＴ−３’

【００６４】配列番号：４ 配列の長さ：１２ 配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： ５’−ＧＣＧＴＴＴＴＴＸＧＣＴ−３’

【００６５】配列番号：５ 配列の長さ：１２ 配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： ５’−ＧＣＧＸＸＴＴＴＴＧＣＴ−３’

【００６６】配列番号：６ 配列の長さ：１２ 配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： ５’−ＧＣＧＴＴＸＸＴＴＧＣＴ−３’

【００６７】配列番号：７ 配列の長さ：１２ 配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： ５’−ＧＣＧＴＴＴＴＸＸＧＣＴ−３’

【００６８】配列番号：８ 配列の長さ：１２ 配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： ５’−ＧＣＧＸＸＸＸＸＸＧＣＴ−３’

【００６９】配列番号：９ 配列の長さ：１３ 配列の型：ヌクレオチド 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： ５’−ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ−３’

【００７０】配列番号：１０ 配列の長さ：１３ 配列の型：ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： ５’−ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＸＸＣ−３’

【図面の簡単な説明】

【図１】 天然型のオリゴヌクレオチドをエキソヌクレ
アーゼで分解した時の紫外部吸収（２６０ｎｍ）の経時
変化を示すチャートである。

【図２】 本発明のオリゴヌクレオチド（Ｘ２）をエキ
ソヌクレアーゼで分解した時の紫外部吸収（２６０ｎ
ｍ）の経時的変化を示すチャートである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式： 【化１】 ［式中、Ｂは同一または異なってもよく、ピリミジンも
   しくはプリン核酸塩基またはそれらの誘導体である］で
   表されるモノマー単位を１または２以上含有するオリゴ
   またはポリヌクレオチド類縁体。
2. 【請求項２】 上記オリゴヌレオチドもしくはポリヌク
   レオチドが合計２〜５０個のヌクレオチド単位からなる
   ことを特徴とする請求項１記載のオリゴまたはポリヌク
   レオチド類縁体。
3. 【請求項３】 一般式： 【化２】 ［式中、Ｂはピリミジンもしくはプリン核酸塩基又はそ
   れらの類縁体であり、Ｙ₁及びＹ₂は同一もしくは異な
   り、水素または水酸基の保護基である］で表わされるヌ
   クレオシド類縁体。