WO2020022499A1 - 老化の抑制、加齢性の疾患もしくは症状の予防、改善、もしくは治療、または寿命の延長のための組成物 - Google Patents

老化の抑制、加齢性の疾患もしくは症状の予防、改善、もしくは治療、または寿命の延長のための組成物 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a composition targeting Rubicon for inhibiting aging, preventing, ameliorating, or treating an age-related disease or condition, or extending life span.
  • the present invention also relates to a method for evaluating the probability that a test compound has an activity of suppressing aging, an activity of preventing, ameliorating, or treating an age-related disease or condition, or an activity of extending lifespan.
  • the present invention relates to a method for examining the degree of aging, the risk of developing an age-related disease or condition, or the risk of shortening the life span, and a molecule used in the examination.
  • Autophagy is an evolutionary conservation in which a double membrane structure called autophagosomes sequesters cytoplasmic materials, fuses them with lysosomes, and degrades their contents. This is the intracellular membrane traffic process. Autophagy was initially described as a bulk degradation system, but has been shown to selectively target aggregated proteins, lipids, damaged organelles, and invading bacteria. By degrading the target extensively, autophagy maintains cell homeostasis. As a result, dysfunction of autophagy has been implicated in many human diseases, including cancer, neurodegenerative diseases, and metabolic disorders.
  • Non-Patent Documents 1 to 3 C. elegans studies lead to the discovery of multiple conserved long-lived pathways, including mildly reduced insulin / IGF-1 signaling, caloric restriction, germline elimination, reduced mitochondrial respiration, and reduced TOR signaling Led. The point is that all of these interventions activate autophagy and extend the life of the animal in a manner that depends on the activated autophagy. And this suggests that autophagy is a convergence mechanism of many long-lived paths (Non-Patent Documents 4 and 5).
  • the present invention has been made in view of such a situation, and an object of the present invention is to identify a molecule that is the basis of a relationship between autophagy activity and aging. Another object of the present invention is to target the molecule to suppress aging, prevent, ameliorate, or treat age-related diseases or symptoms, or extend the lifespan. It is a further object of the present invention to test for the degree of aging, the risk of developing age-related diseases or symptoms, or the risk of shortening life span, by targeting the molecule.
  • the present inventors have previously identified Rubicon (Run domin Beclin-1 interacting and cysteine-rich containing protein), a negative regulator of autophagy, which inhibits the autophagosome-lysosomal fusion process ( Non-patent documents 6, 7). Thus, the present inventors examined whether Rubicon is involved in the mechanism underlying the relationship between autophagy activity and aging.
  • Rubicon acts downstream of MML-1 / Mondo, which is a convergent transcription factor involved in many lifespan paradigms.
  • Epistasis analysis also revealed that two major autophagy negative regulators, mTOR and Rubicon, control lifespan partially independently of each other.
  • Rubicon is a key molecule of aging through suppression of autophagy activity, targeting Rubicon, suppression of aging, prevention, amelioration of age-related diseases or symptoms, or
  • the present invention has been found to be capable of performing treatment, or extending the lifespan, and examining the degree of aging, the risk of developing age-related diseases or symptoms, or the risk of shortening the lifespan. Reached.
  • the present invention provides the following.
  • composition according to [1], wherein the molecule that suppresses the function of the Rubicon gene is a molecule according to any one of the following (a) to (c): RNA or DNA encoding the RNA (B) RNA or DNA binding to Rubicon protein (C) Antibodies that bind to Rubicon protein [3]
  • composition according to any one of [1] to [3], wherein the subject is a vertebrate.
  • a method for evaluating the probability that a test compound has an activity of suppressing aging in a subject, an activity of preventing, ameliorating, or treating an age-related disease or condition, or an activity of extending life span Contacting the test compound with the Rubicon protein, and detecting the binding of the test compound to the Rubicon protein; Including When a test compound binds to the Rubicon protein, it is evaluated that it is likely to have an activity of suppressing aging, an activity of preventing, ameliorating, or treating an age-related disease or condition, or an activity of extending life span. Way.
  • a method for evaluating the probability that a test compound has an activity of suppressing aging in a subject, an activity of preventing, ameliorating, or treating an age-related disease or condition, or an activity of extending lifespan A step of bringing a test compound into contact with a cell expressing the Rubicon gene; and a step of detecting the expression of the Rubicon gene in the cell; Including When the test compound reduces the expression of the Rubicon gene as compared to the case where the test compound is not contacted, the activity of suppressing aging, the activity of preventing, ameliorating, or treating an age-related disease or condition, or the longevity A method that is evaluated as probable to have a prolonged activity.
  • a method for evaluating the probability that a test compound has an activity of suppressing aging in a subject, an activity of preventing, ameliorating, or treating an age-related disease or condition, or an activity of extending lifespan Bringing a test compound into contact with a cell having DNA in which a reporter gene is functionally linked downstream of the promoter region of the Rubicon gene; and detecting the expression of the reporter gene in the cell; Including When the test compound decreases the expression of the reporter gene as compared to the case where the test compound is not contacted, the activity of suppressing aging, the activity of preventing, ameliorating, or treating an age-related disease or condition, or A method that is evaluated as probable to have an activity to extend life.
  • [8] A method for examining the degree of aging in a subject, the risk of developing an age-related disease or condition, or the risk of shortening the life span, Detecting the expression product of the Rubicon gene in the test sample, A method in which the level of aging, the risk of developing an age-related disease or condition, or the risk of shortening the lifespan is evaluated as high when the amount of the expression product of the Rubicon gene is higher than that of a control.
  • composition for detecting an expression product of a Rubicon gene, the composition comprising the following (a) or (b): (A) Oligonucleotide primer or oligonucleotide probe that binds to the transcription product of Rubicon gene (b) Antibody that binds to Rubicon protein
  • the present invention by suppressing the function of the Rubicon gene, aging can be suppressed, age-related diseases and symptoms can be prevented, ameliorated, or treated, or life can be prolonged through activation of autophagy. Becomes In particular, simply suppressing the function of a single gene can reduce metabolic bone disease, reduce bone density and bone volume / bone tissue volume ratio, improve bone morphology, and cause aggregation that causes neurodegenerative disease It is extremely surprising to be able to achieve a variety of effects, including reduced sexual proteins, reduced eye degeneration, and reduced motor function, improved stress tolerance, reduced organ fibrosis, and increased lifespan. It should be. Further, according to the present invention, by detecting the expression product of the Rubicon gene, it becomes possible to examine the degree of aging, the risk of developing the above-mentioned diseases and symptoms, or the risk of shortening the life span.
  • FIG. 2 shows that Elicons' Rubicon controls lifespan by adjusting autophagy.
  • (I) A photograph of the foregut at the L4 stage. Each RNAi is shown. Autophagosomes labeled with GFP :: LGG-1 (open arrows) were more abundant in CeRubicon knockdown, but stopped increasing with simultaneous knockdown of bec-1 / BeclinB1. The scale bar is 20 ⁇ m.
  • (Ii) Quantification of GFP :: LGG-1 points in the foregut under each knockdown condition. Values represent sample mean ⁇ standard error (n 3). P values (** P ⁇ 0.01) were determined relative to controls by one-way analysis of variance using Tukey's test.
  • FIG. 2 shows that knockdown of Rubicon in the whole body improves the age-dependent phenotype.
  • transgenic worms expressing polyQ35 :: YFP in the body wall muscle polyQ inclusion bodies (open arrows) accumulated at the stage of the fifth day in an age-dependent manner.
  • Knockdown of CeRubicon reduced the accumulation of inclusion bodies and simultaneous knockdown of bec-1 reversed the phenotype.
  • Each RNAi is shown.
  • the scale bar is 50 ⁇ m.
  • dRubicon-IR dRubicon knockdown
  • FIG. 4 shows that a decrease in the Rubicon level of neurons delays senescence.
  • (I) Graph showing that neuron CeRubicon knockdown effectively extended the worm life.
  • (Ii) A graph showing that the lifespan of female flies was extended by neuronal knockdown of dRubicon. Transgene expression of dRubicon-IR was induced by the pan-neuron elav-GAL4 driver.
  • FIG. 4 is a graph of qRT-PCR analysis showing MonoA expression after knockdown using the specified siRNA (right). Values represent sample mean ⁇ sem from three independent experiments against siLuc controls. P value (**** P ⁇ 0.0001) was determined by t-test.
  • FIG. 9 is a graph showing that double knockdown of CeRubicon and let-363 / mTOR further extends the service life as compared to the case of knocking down individual.
  • elegans Rubicon homologue (Y56A3A.16) is a phylogenetic tree generated by ClustalW analysis showing similarity to human KIAA00226 (Rubicon), human KIAA0226L, and Drosophila Rubicicon (CG12772).
  • Rubicon human KIAA00226
  • KIAA0226L human KIAA0226L
  • Drosophila Rubicicon CG12772.
  • Representative photographs of the pharyngeal muscle of MAH215 (mCherry :: GFP :: LGG-1) strain subjected to control or CeRubicon @ RNAi showing that autophagy flux was increased by knockdown of CeRubicon. is there.
  • FIG. 4 is a snapshot of a multiworm tracking analysis showing age related changes due to Rubicon knockdown. Under designated RNAi treatments, individual worm tracks and velocities were visualized.
  • (I) Graph showing that pharyngeal pumping speed does not change with CeRubicon knockdown.
  • IIi A graph showing the results of a heat stress tolerance assay. It was found that knockdown of CeRubicon did not alter resistance.
  • FIG. 2 is a diagram showing the contribution of Rubicon to lifespan control by a tissue-specific role. Shown is a graph of demographic analysis using multiple tissue-specific RNAi-sensitive strains such as (i) muscle (NR350), (ii) subcutaneous tissue (NR222) and (iii) intestine (VP303). CeRubicon knockdown of intestinal and subcutaneous tissues slightly but significantly increased lifespan. (I) Graph showing that the lifespan imparted by neuron knockdown of CeRubicon is extinguished by neuron atg-18 knockdown. (Ii) Population statistical analysis of neuron dRubicon knockdown in male flies.
  • Figure 4 is a graph showing the epistatic relationship between CeRubicon knockdown and multiple long-lived paths. Knockdown of CeRubicon also results in (i) eat-2 (caloric restriction), (ii) isp-1 (mitochondrial dysfunction), (iii) daf-2 (decreased insulin / IGF-1 signaling) and (Iv) The lifespan of glp-1 (germline lifespan) is not further extended. (I) Western blotting images showing that Rubicon protein levels in the kidney are reduced by caloric restriction for 6 months. (Ii) Graph showing qRT-PCR analysis of CeRubicon expression. Knocking down mml-1 and mxl-2 does not return CeRubicon expression to wild-type (N2) levels.
  • (I) is an alizarin-stained image
  • (ii) is a graph showing the ratio of alizarin-stained areas in wells. It is the graph and the electrophoresis image which show the result of having confirmed the enhancement of the autophagy in the osteoblast of the Rubicon deletion mouse
  • (I) is a photograph showing the results of CT analysis of bone morphology in Rubicon-deficient mice, Atg5-deficient mice, and Rubicon / Atg5-deficient mice.
  • (Ii) is a graph showing bone density in each mouse. 3 shows the results of evaluating bone density and bone volume / bone tissue volume ratio in a Rubicon-deficient osteoporosis model.
  • (I) is a CT image of the entire femur
  • (ii) is a CT image of the trabecular bone
  • (iii) is a graph showing the bone density and the bone volume / bone tissue volume ratio.
  • 4 is a graph showing the results of detection of mRNA expression of Notch downstream transcription factors and osteoblastic transcription factors in order to evaluate the relationship between autophagy and Notch signaling pathway in osteoblasts of Rubicon-deficient mice.
  • composition for controlling aging provides a composition for suppressing aging in a subject, preventing, ameliorating, or treating an age-related disease or condition, or extending lifespan, comprising a molecule that suppresses the function of the Rubicon gene as an active ingredient. I do.
  • “Rubicon” in the present invention is a negative regulator of autophagy that inhibits the autophagosome-lysosomal fusion process (Non-Patent Documents 6 and 7).
  • Rubicon in the present invention is not particularly limited in the organism from which it is derived (see FIG. 5A). For example, when the composition of the present invention is intended for humans, human Rubicon is targeted.
  • a typical amino acid sequence of human Rubicon protein is shown in SEQ ID NO: 2
  • a typical nucleotide sequence of cDNA encoding the protein is shown in SEQ ID NO: 1 (database registration number: NM_0146877.3).
  • the corresponding amino acid sequences of the corresponding Rubicon proteins of mouse, chicken, zebrafish, Drosophila, and nematode are shown in SEQ ID NOs: 3 to 7, respectively.
  • the Rubicon protein of the present invention comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, or added in the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 2 to 7, and is functionally Equivalent proteins are included.
  • “one or more” generally means within 20 amino acids (eg, within 10 amino acids, within 5 amino acids, within 3 amino acids, 1 amino acid).
  • “functionally equivalent” means having a function of negatively controlling autophagy (Non-Patent Documents 6 and 7).
  • the amino acid sequence of Rubicon in a species other than the above usually has an identity of 25% or more (for example, 30% or more, 35% or more, 40% or more) with the amino acid sequence of any of the above-mentioned species. , 45% or more, 50% or more, 55% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more), and similarity.
  • the Rubicon protein of the present invention includes proteins having the same or similar amino acid sequence as described in any of SEQ ID NOs: 2 to 7 and functionally equivalent thereto.
  • “functionally equivalent” means having a function of negatively controlling autophagy (Non-Patent Documents 6 and 7).
  • ⁇ “ Aging ”in the present invention means a change that occurs in an individual of an organism with aging.
  • An individual may develop various diseases and symptoms due to aging.
  • the “age-related disease or symptom” targeted by the present invention is not particularly limited as long as it is caused by the negative control of autophagy by Rubicon.
  • metabolic bone diseases such as osteoporosis, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, polyglutamine disease (eg, Huntington's disease, spinocerebellar degeneration), neurodegenerative diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), and organ fibers Dysfunction (eg, renal fibrosis, myocardial fibrosis), motor dysfunction (eg, weakness, decreased endurance, prolonged reaction time, decreased exercise speed, reduced dexterity, decreased deep sensation, decreased balance ability), Impaired cognitive function (eg, memory impairment, aphasia, apraxia, agnosia, executive dysfunction), decreased bone mass, bone density, bone volume / bone tissue volume ratio, altered bone morphology, eye degeneration, stress tolerance But is not limited thereto.
  • metabolic bone diseases such as osteoporosis, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, polyglutamine disease (eg, Huntington's disease, spinocerebellar degeneration), neurodegenerative diseases such as amyotrophic lateral sclerosis
  • life means the time from the birth of an organism to its death.
  • the life span in which one can sustain life independently of one's mind and body without relying on routine, continuous medical care and nursing care and live independently can be referred to as "healthy life expectancy”. Includes prolonged life due to prolonged healthy life expectancy.
  • suppression of gene function refers to suppression of gene translation product (protein) activity even if the mechanism is suppression of gene expression (for example, suppression of transcription or suppression of translation). There may be.
  • RNA that binds to a transcript of the Rubicon gene examples include, for example, RNA that binds to a transcript of the Rubicon gene, DNA that encodes the RNA, RNA or DNA that binds to the Rubicon protein, antibody or small molecule that binds to the Rubicon protein Examples include compounds and site-specific nucleases that edit the DNA sequence of the Rubicon gene or its expression control region or the RNA sequence of the transcript of the Rubicon gene.
  • RNA that binds to the transcription product of Rubicon gene or the DNA encoding the RNA is a dsRNA (double-stranded RNA) complementary to the transcription product of the gene encoding the Rubicon protein or the dsRNA.
  • dsRNA double-stranded RNA
  • siRNA is a double-stranded RNA consisting of short strands in a range that does not show toxicity in cells.
  • shRNA is single-stranded RNA in which a sense RNA and an antisense RNA are arranged with a spacer sequence, and a hydrogen bond is generated between the sense RNA and the antisense RNA in a cell or the like, and a shRNA is formed. It means that the sequence forms a hairpin structure, and that the hairpin structure can be converted into siRNA by cleavage in the cell.
  • the miRNA generally means a form of a single-stranded RNA, but as a specific embodiment, a form of a double-stranded RNA can be adopted.
  • the dsRNA is not particularly limited in its chain length as long as it can suppress the expression of the target gene and does not show toxicity, but it is usually 15 to 50 base pairs, preferably 15 to 35 base pairs. And more preferably 20 to 25 base pairs.
  • the affinity with mRNA can be increased and the off-target effect can be reduced.
  • the dsRNA or the DNA encoding the dsRNA does not need to be completely identical to the base sequence of the target gene, but is at least 70% or more, preferably 80% or more, and more preferably 90% or more (eg, 95%, 96% or more). %, 97%, 98%, 99% or more).
  • DsRNA can be prepared by, for example, chemically synthesizing each strand based on the sequence information of the Rubicon gene (eg, SEQ ID NO: 1).
  • the DNA encoding the dsRNA includes an antisense DNA encoding an antisense RNA for any region of a transcript (mRNA) of a target gene, and a sense DNA encoding a sense RNA for any region of the mRNA, An antisense RNA and a sense RNA can be expressed from the antisense DNA and the sense DNA, respectively.
  • DsRNA can also be prepared from these antisense RNA and sense RNA.
  • an antisense RNA and a sense RNA are expressed from the same vector
  • an antisense RNA expression cassette in which a promoter capable of expressing a short RNA such as a polIII system is linked upstream of the antisense DNA and the sense DNA, respectively.
  • a sense RNA expression cassette are constructed, and these cassettes are inserted into the vector in the same direction or in the opposite direction.
  • an expression system in which antisense DNA and sense DNA are arranged in opposite directions so as to face each other on different strands can be configured.
  • one double-stranded DNA in which the antisense RNA coding strand and the sense RNA coding strand are paired is provided, and on both sides thereof, the antisense RNA and the sense RNA can be expressed from the respective strands.
  • a promoter is provided in opposition.
  • a terminator is added to the 3 ′ end of each strand (antisense RNA coding strand, sense RNA coding strand).
  • it is provided.
  • the two promoters have different types.
  • antisense RNA and sense RNA are expressed from different vectors
  • antisense RNA expression in which promoters capable of expressing short RNAs such as polIII are linked upstream of antisense DNA and sense DNA, respectively.
  • a cassette and a sense RNA expression cassette are respectively constructed, and these cassettes are held in different vectors.
  • RNA that binds to the transcription product of Rubicon gene or the DNA encoding the RNA in the present invention, an antisense RNA complementary to the transcription product of Rubicon gene or a DNA encoding the RNA (antisense DNA).
  • Antisense RNA or antisense DNA inhibits the transcription, splicing, or translation process and suppresses the expression of the target gene (Hirashima and Inoue, "Replication and Expression of New Chemistry Experiment Course 2 ⁇ Nucleic Acid IV ⁇ Gene", (Edited by The Biochemical Society of Japan, Tokyo Kagaku Dojin, 319-347 (1993)), the antisense RNA or antisense DNA used in the present invention may suppress the expression of the target gene by any action.
  • the sequence of the antisense RNA or antisense DNA is preferably a sequence complementary to the transcription product of Rubicon, but may not be completely complementary as long as gene expression can be effectively inhibited.
  • the antisense RNA or antisense DNA preferably has 90% or more (eg, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more) complementarity to a target gene transcript. If the expression of the target gene can be suppressed and it does not show toxicity, the chain length is not particularly limited.
  • the length of antisense RNA or antisense DNA is usually 10 to 50 bases, preferably 12 to 30 bases. Although the production cost is increased, by increasing the chain length, the affinity for mRNA can be increased and the off-target effect can be reduced.
  • Antisense RNA or antisense DNA can be prepared, for example, by chemical synthesis based on the sequence information of the Rubycon gene.
  • RNA having a ribozyme activity that specifically cleaves the transcription product of the Rubicon gene, or DNA encoding the RNA can be mentioned.
  • Ribozymes include those having a size of 400 nucleotides or more, such as the group I intron type and M1 RNA contained in RNase P, and those having an active domain of about 40 nucleotides called hammerhead type or hairpin type ( Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, Protein Nucleic Acid Enzyme, 1990, 35, 2191).
  • any form of ribozyme can be used.
  • RNA or DNA that binds to Rubicon protein in the present invention is typically a nucleic acid aptamer.
  • DNA is preferable from the viewpoint of high stability in a living body.
  • Nucleic acid aptamers have, as structural features, at least one loop structure, a primary structure containing many deoxyguanosine (including guanosine and guanosine analogs), or a tetramer cluster structure of deoxyguanosine (so-called “G quartet structure”). May be included.
  • the nucleic acid aptamer may be either a double-stranded nucleic acid or a single-stranded nucleic acid, but is preferably a single-stranded nucleic acid.
  • the length of the nucleic acid aptamer is not particularly limited as long as it has a number of bases capable of specifically binding to the Rubicon protein, but is usually 10 to 100 bases, preferably 15 to 70 bases, more preferably Is 20 to 50 bases. Although the manufacturing cost increases, it is also possible to use a longer chain length.
  • nucleic acid aptamer used in the present invention can produce by appropriately selecting a known method.
  • Known methods include, for example, in vitro selection method (SELEX method) (Turk C. & Gold L., Science. 3; 249 (4968): 505-510 (1990), Green R. et al., Methods Compan Methods. Enzymol. 2: 75-86 (1991), Gold L. et al., Annu Rev Biochem 64: 763-97 (1995), Upoff KW et al., Curr. Opin. Struct. 281-288 (1996)).
  • SELEX method in vitro selection method
  • the nucleic acid molecule used as an active ingredient of the composition of the present invention may be appropriately selected from the viewpoints of improving stability in vivo, enhancing affinity with a target (mRNA or protein), or suppressing off-target effects.
  • Modified nucleic acids may be used in part or all.
  • a gapmer using a modified nucleic acid only at both ends can be used, if necessary.
  • a heteroduplex RNA can be used with one strand as a gapmer.
  • the chemical modification of the nucleic acid includes, for example, modification of the phosphate moiety, modification of the sugar moiety, and modification of the base moiety.
  • modifications include, for example, 5-methylation, 5-fluorination, 5-bromination, 5-iodination, N4-methylation of cytosine, 5-demethylation, 5-fluorination, Bromination, 5-iodination, N6-methylation of adenine, 8-bromination, N2-methylation of guanine, 8-bromination, phosphorothioation, methylphosphonation, methylthiophosphonation, chiral-methylphosphonation, phospho Examples thereof include logithioation, phosphoramidate, 2′-O-methylation, 2′-MOE, 2′-AP, and 2′-fluorination.
  • Hexitol nucleic acid HNA
  • cyclohexene nucleic acid CeNA
  • peptide nucleic acid PNA
  • glycol nucleic acid GAA
  • threose nucleic acid TAA
  • morpholino nucleic acid tricyclo-DNA (tcDNA)
  • 2'-O-methylated nucleic acid 2,2'-MOE (2'-O-methoxyethyl) nucleic acid
  • 2'-AP 2'-O-aminopropyl nucleic acid
  • 2'-fluorinated nucleic acid 2'F-arabino nucleic acid
  • BNA Bridged Nucleic Acid
  • BNA examples include ⁇ -L-methyleneoxy (4′-CH2-O-2 ′) BNA also called LNA (Locked Nucleic Acid (registered trademark), 2 ′, 4′-BNA).
  • ⁇ -D-methyleneoxy (4′-CH2-O-2 ′) BNA ethyleneoxy (4 ′-(CH2) 2-O-2 ′) BNA, also called ENA
  • ⁇ -D-thio (4 ′) -CH2-S-2 ') BNA aminooxy (4'-CH2-ON (R3) -2') BNA, oxyamino (4'-CH2-N also called 2 ', 4'-BNANC (R3) -O-2 ') BNA, 2', 4'-BNACOC, 3'amino-2 ', 4'-BNA and the like.
  • the “antibody that binds to the Rubicon protein” used in the present invention may be a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or a functional fragment of the antibody. “Antibodies” also includes all classes and subclasses of immunoglobulins.
  • a “functional fragment” of an antibody refers to a part (partial fragment) of the antibody that specifically recognizes a Rubicon protein. Specifically, Fab, Fab ', F (ab') 2, variable region fragment (Fv), disulfide-bonded Fv, single-chain Fv (scFv), sc (Fv) 2, diabody, multispecific antibody, And polymers thereof.
  • an immunized animal is immunized with an antigen (such as a target protein, a partial peptide thereof, or a cell expressing the same) and the antiserum is subjected to conventional means (eg, salting out, centrifugation, (Dialysis, column chromatography, etc.).
  • an antigen such as a target protein, a partial peptide thereof, or a cell expressing the same
  • Monoclonal antibodies can be obtained using the hybridoma method (Kohler & Milstein, Nature, 256: 495) (1975) or the recombinant DNA method (for example, PJ Delves, Antibody Production: Essential Technology, W.E., 1997). Shepherd & C. Dean Monoclonal Antibodies, OXFORD UNIVERSITY PRESS (2000), Bandamme AM et al., Eur. J. Biochem. 192: 767-775.
  • Antibodies that bind to Rubicon protein include chimeric antibodies, humanized antibodies, and human antibodies.
  • a chimeric antibody, a humanized antibody, or a human antibody is desirable from the viewpoint of reducing side effects.
  • a “chimeric antibody” is an antibody in which the variable region of a certain type of antibody is linked to the constant region of an antibody heterologous thereto.
  • a chimeric antibody immunizes a mouse with an antigen, cuts out an antibody variable region (variable region) that binds to the antigen from the mouse monoclonal antibody gene, and binds to a human bone marrow-derived antibody constant region (constant region) gene. It can be obtained by incorporating this into an expression vector and introducing it into a host to produce (for example, JP-A-8-280387, US Pat. No. 4,816,397, US Pat. No. 4,816,567, US Pat. No. 5807715).
  • a “humanized antibody” is an antibody in which the gene sequence of the antigen-binding site (CDR) of a non-human-derived antibody is transplanted (CDR-grafted) into a human antibody gene, and its production method is known (for example, EP239400). , EP 125023, WO 90/07861, WO 96/02576).
  • Human antibodies are antibodies in which all regions are derived from humans. In the production of human antibodies, it is possible to utilize transgenic animals (eg, mice) that can produce a repertoire of human antibodies by immunization. Techniques for producing human antibodies are known (eg, Jakobovits, A. et al., Nature 362, 255-258 (1993, LONBERG, N. & HUSZAR, D., INTERN. REV. IMMUNOL., 13, 65). -93 (1995), Marks JD et al., J Mol Biol. 5; 222 (3): 581-97 (1991), Mendez MJJet al., Nat Genet. 15 (2): 146-156 (1997), Tomizuka K.
  • transgenic animals eg, mice
  • Techniques for producing human antibodies are known (eg, Jakobovits, A. et al., Nature 362, 255-258 (1993, LONBERG, N. & HUSZAR, D., INTERN.
  • the "site-specific nuclease for editing the RNA sequence of the DNA of the Rubicon gene or its expression control region or the RNA sequence of the transcription product of the Rubicon gene” used in the present invention may be any site-specific nuclease that can edit the nucleic acid in a site-specific manner.
  • a CRISPR-Cas system containing Cas protein as a component is preferable.
  • the CRISPR-Cas system include CRISPR-Cas9, CRISPR-Cpf1 (Cas12a), CRISPR-Cas12b, CRISPR-CasX (Cas12e), CRISPR-Cas14, and the like.
  • site-specific nuclease artificial nucleases such as TALENs, ZFNs, and PPR (in a form fused with a base modifying enzyme) can also be used.
  • the “low molecular weight compound that binds to the Rubicon protein” used in the present invention may be a known compound or a compound identified by the evaluation method or screening method of the present invention described below.
  • composition of the present invention may be in the form of a pharmaceutical composition, food or drink (including animal feed), or a reagent used for research purposes (for example, in vitro or in vivo experiments).
  • the pharmaceutical composition can be formulated by a known pharmaceutical method.
  • injections, suppositories, capsules, tablets, pills, solutions, powders, granules, fine granules, film coatings, pellets, troches, sublinguals, chewables, buccals, pastes, syrups Parenteral or oral use as preparations, suspensions, elixirs, emulsions, coatings, ointments, plasters, cataplasms, transdermal preparations, lotions, inhalants, aerosols, etc. Can be.
  • pharmacologically acceptable carriers specifically, sterile water or physiological saline, vegetable oils, solvents, bases, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, pH adjusters, Flavoring agent, fragrance, excipient, vehicle, preservative, binder, diluent, tonicity agent, soothing agent, bulking agent, disintegrant, buffer, coating agent, lubricant, coloring agent, sweetness Agents, thickeners, flavoring agents, solubilizing agents or other additives can be appropriately combined. It can also be prepared in a form such as a liposome delivery system.
  • the administration form of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited and includes, for example, intravenous administration, intraarterial administration, intraperitoneal administration, subcutaneous administration, intradermal administration, intratracheal administration, rectal administration and intramuscular administration, and infusion. Administration, direct administration (for example, local administration to the affected area) and the like.
  • composition of the present invention may be combined with an auxiliary moiety that enhances a medically useful property.
  • auxiliary moiety that enhances a medically useful property.
  • Representative useful properties include, for example, facilitating delivery of the compound to a target area (e.g., the affected area), sustaining a therapeutic concentration of the compound at the target area, and enhancing the pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of the compound. Altering or improving the therapeutic index or safety profile of the compound, and the like.
  • Examples of molecules for delivery to the target region include a brain barrier permeable substance when the target region is the brain.
  • the brain barrier permeable substance include an anti-transferrin receptor antibody (for example, WO 2016/208695) and a glycoprotein consisting of 29 amino acids derived from rabies virus (Kumar P. et al., Nature. 20075; 448 (7149): 39-43 ⁇ (2007)).
  • known delivery molecules can be used depending on the target region such as the kidney and liver.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used in combination with other compositions used for suppressing aging, preventing, ameliorating, or treating age-related diseases or symptoms, or extending the lifespan.
  • the food or drink is, for example, a health food, a functional food, a food for specified health use, a dietary supplement, a food for the sick, a food additive, or an animal feed.
  • Foods and drinks can be ingested as the above-described composition, and can also be ingested as various foods and drinks.
  • Specific examples of foods and drinks include products containing oils such as edible oils, dressings, mayonnaise and margarine; soups, milk drinks, soft drinks, tea drinks, alcoholic drinks, drinks, jelly drinks, functional drinks, etc.
  • Liquid foods carbohydrate-containing foods such as rice, noodles and bread; processed livestock foods such as ham and sausage; fish processed foods such as kamaboko, dried fish and salted fish; processed vegetable foods such as pickles; half of jelly and yogurt Solid foods; fermented foods such as miso and fermented beverages; various confectionery products such as Western confectionery, Japanese confectionery, candy, gum, gummy, frozen dessert, frozen dessert; retort products such as curry, bean paste, Chinese soup; Examples include instant foods such as instant miso soup and foods compatible with microwave ovens. Furthermore, health foods and drinks prepared in the form of powder, granules, tablets, capsules, liquids, pastes or jellies are also included.
  • Production of food and drink can be carried out by production techniques known in the art.
  • one or more components effective for suppressing aging, preventing, ameliorating, or treating age-related diseases or symptoms, or extending the life may be added.
  • a multifunctional food or drink may be obtained by combining with a component exhibiting another function or another functional food.
  • the composition of the present invention can be used for animals including humans.
  • animals other than humans there is no particular limitation on animals other than humans, and various kinds of livestock, poultry, pets, laboratory animals, and the like can be used.
  • the animal is preferably a vertebrate, for example, mammals such as pigs, cows, horses, sheep, goats, dogs, cats, rabbits, hamsters, mice, rats, monkeys, and birds such as chickens, ducks, ostriches, ducks, etc. But not limited thereto.
  • Various laboratory organisms may be used for research purposes.
  • the amount of administration or ingestion is appropriately determined according to the type of the composition (medicine, food and drink, etc.), the type, age, weight, symptoms, health condition, and the like of the subject. Selected. Further, the dose of the composition of the present invention (effective ingredient equivalent amount) varies depending on the type of the active ingredient. For example, when the active ingredient is RNA or DNA, it is usually 0.1 ⁇ g to 10 mg. / Kg body weight, and when the active ingredient is an antibody, it is usually 1 to 10 mg / kg body weight. Also, the number of times of administration or ingestion per day is not particularly limited, and can be appropriately selected in consideration of various factors as described above. When the active ingredient is a DNA encoding an RNA that binds to a transcription product of the Rubicon gene, an expression construct may be prepared and administered so that an appropriate amount of RNA is expressed.
  • the invention thus comprises administering or ingesting a composition of the invention to a subject, suppressing aging in the subject, preventing, ameliorating, or treating an age-related disease or condition, or It also provides a way to extend life.
  • the composition of the present invention indicates that the composition is used for inhibiting aging, preventing, ameliorating, or treating an age-related disease or condition, or extending life. May be attached.
  • the label is attached to the product or instruction means that the label is attached to the product body, container, packaging, etc., or the instruction, package insert, advertisement, or other printed matter that discloses the product information. It means that the display is attached to the like.
  • the above indication may include information about the mechanism of action of the composition of the present invention. Such a mechanism includes, for example, promotion of autophagy by suppressing the function of the Rubicon gene.
  • the present invention provides a method for evaluating the likelihood that a test compound has an activity of suppressing aging in a subject, an activity of preventing, ameliorating, or treating an age-related disease or condition, or an activity of extending lifespan.
  • a method comprising the steps of: (a) contacting a test compound with a Rubicon protein; and (b) detecting the binding between the test compound and the Rubicon protein, is a first method of the evaluation method of the present invention.
  • a method comprising the steps of: (a) contacting a test compound with a Rubicon protein; and (b) detecting the binding between the test compound and the Rubicon protein, is a first method of the evaluation method of the present invention.
  • a test compound with a Rubicon protein is a first method of the evaluation method of the present invention.
  • the test compound may be a compound synthesized based on an in silico design based on the three-dimensional structure of the Rubicon protein.
  • the“ Rubicon protein ”used in the evaluation method of the present invention includes, for example, a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a partial peptide thereof.
  • the Rubicon protein in addition to the above-mentioned natural protein and its partial peptide, a modified or modified product thereof can be used as necessary.
  • other proteins eg, enzymes such as alkaline phosphatase (SEAP) and ⁇ -galactosidase, fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP), glutathione-S-transferase (GST) And a fusion protein with such a tag.
  • “Contact” between the test compound and the Rubicon protein can be performed by adding the test compound to the evaluation system or the like.
  • a known method can be appropriately used for “detection of the binding between the test compound and the Rubicon protein”. For example, there is a method in which the test compound is brought into contact with the immobilized Rubicon protein to identify a compound that binds to the Rubicon protein. As a means for detecting the binding between the test compound and the Rubicon protein, various known means can be used. An example of a suitable means is a biosensor utilizing the surface plasmon resonance phenomenon.
  • test compound is a synthetic low-molecular-weight compound library, for example, a high-throughput method using combinatorial chemistry technology (Wrighton NC, et al., Science, 26; 273 (5274) 458-464 (1996), Verdine, ⁇ GL ⁇ Nature 384 11-13 ⁇ (1996), Hogan JC, Jr Directed combinatorial chemical. Nature. ⁇ 384: 17-19 ⁇ (1996)).
  • test compound is a polynucleotide library, for example, the above-described in vitro selection method is used.
  • test compound is a gene library, for example, a Rubicon protein is expressed as a bait protein and used. Yeast two-hybrid systems can be used.
  • test compound when the test compound binds to the Rubicon protein, it is likely that the test compound has an activity of suppressing aging, an activity of preventing, ameliorating, or treating an age-related disease or condition, or an activity of extending life span. Be evaluated.
  • the present invention provides a method for evaluating the likelihood that a test compound has an activity of suppressing aging in a subject, an activity of preventing, ameliorating, or treating an age-related disease or condition, or an activity of extending lifespan.
  • An evaluation method of the present invention includes a method comprising: (a) contacting a test compound with a cell expressing a Rubicon gene; and (b) detecting expression of the Rubicon gene in the cell.
  • the “Rubicon gene” to be detected is not particularly limited in the organism from which it is derived, but in the development of a composition for humans, the human Rubicon gene is suitable.
  • the human gene for example, a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (for example, a gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1) can be targeted.
  • the “cell expressing the Rubicon gene” include, but are not limited to, RPE-1 cells, HEK293 cells, and HeLa cells as long as they are human cells.
  • the “contact” of the test compound with the cell expressing the Rubicon gene can be performed, for example, by adding the test compound to a culture solution of the cell.
  • Detection of gene expression may be detected at the transcription level (mRNA level) or at the translation level (protein level).
  • Methods for detection at the transcription level include, for example, RT-PCR, Northern blotting, in situ hybridization, dot blotting, RNase protection assay, and the like.
  • Methods for detecting at the translation level include, for example, Western blotting, radioimmunoassay, chemiluminescence immunoassay, chemiluminescence enzyme immunoassay, enzyme immunoassay, immunoprecipitation, immunochromatography, immunohistochemistry. Dynamic staining, imaging cytometry, flow cytometry, latex agglutination, mass spectrometry (MS), and the like.
  • the test compound when the test compound reduces the expression of the Rubicon gene as compared with the case where the test compound is not brought into contact with the test compound, the activity of suppressing aging, the age-related disease or condition is prevented, ameliorated, or treated. It is evaluated as having an activity or a prolongation of life.
  • the decrease in the expression of the Rubicon gene is determined by the amount of the Rubicon protein detected in the presence of the test compound (eg, the intensity of the band derived from the Rubicon protein), It can be evaluated by comparing the amount of the Rubicon protein detected in the absence of the compound (control value). That is, when the amount of Rubicon protein in the presence of the test compound is lower than the amount in the absence of the test compound (for example, 80% or less, 50% or less, 30% or less, and 10% or less of the control value) ) Can be evaluated as having a probability that the test compound has an activity of suppressing aging, an activity of preventing, ameliorating, or treating an age-related disease or condition, or an activity of extending life span. .
  • the expression can be evaluated using the expression amount in the absence of the test compound as a control value.
  • the present invention provides a method for evaluating the likelihood that a test compound has an activity of suppressing aging in a subject, an activity of preventing, ameliorating, or treating an age-related disease or condition, or an activity of extending lifespan.
  • A a step of bringing a test compound into contact with cells having DNA in which a reporter gene is operably linked downstream of the promoter region of the Rubicon gene; and (b) expression of the reporter gene in the cells.
  • “Rubicon gene promoter region” is a region that controls the transcription of the Rubicon gene, and means an upstream region of the Rubicon gene coding region to which a transcription factor can bind.
  • the "promoter region of the Rubicon gene” can be obtained by those skilled in the art, for example, by screening a genomic DNA library using the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a part thereof as a probe. When a vector in which a reporter gene is linked downstream of the obtained genomic DNA is prepared and introduced into an appropriate cell, if the expression of the reporter gene can be induced, the genomic DNA is transferred to the promoter of the Rubicon gene. Region can be identified.
  • the “reporter gene” is not particularly limited as long as its expression is detectable.
  • CAT gene lacZ gene
  • luciferase gene luciferase gene
  • ⁇ -glucuronidase gene GUS
  • the GFP gene can be mentioned.
  • the expression that the reporter gene is “functionally linked” downstream of the promoter region of the Rubicon gene means that expression of the reporter gene is induced by binding of a transcription factor to the promoter region of the Rubicon gene. It means that the promoter region of the Rubicon gene is linked to the reporter gene.
  • the “Rubicon gene”, “test compound”, and “contact” are the same as in the second embodiment.
  • the ⁇ cells '' used in the third embodiment may be any cells in which, when the reporter system is introduced, a transcription factor binds to a promoter region of a Rubicon gene, whereby expression of the reporter gene is induced. Examples include, but are not limited to, RPE-1 cells, HEK293 cells, HeLa cells, and the like.
  • the expression of the reporter gene can be detected by a method known to those skilled in the art according to the type of the reporter gene used.
  • the reporter gene is a CAT gene
  • the expression of the reporter gene can be detected by detecting acetylation of chloramphenicol by the gene product.
  • the reporter gene is the lacZ gene
  • the color of the dye compound is detected by the catalytic action of the gene expression product
  • the reporter gene is the luciferase gene
  • the chemiluminescence by the catalytic action of the gene expression product is detected.
  • the emission of glucuron and the color development of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -glucuronide are detected by the catalytic action of the gene expression product.
  • the expression of the reporter gene can be detected by detecting the fluorescence of the GFP protein.
  • test compound decreases the expression of the reporter gene as compared with the case where the test compound is not contacted, the activity of suppressing aging, the prevention, amelioration, or treatment of an age-related disease or condition is suppressed. Is evaluated to have a probable activity or an activity to extend the lifespan.
  • the decrease in the expression of the reporter gene is, for example, when the luciferase gene is used as the reporter gene, the intensity of the chemiluminescence detected in the presence of the test compound and the intensity of the chemiluminescence detected in the absence of the test compound. (Control value). That is, when the luminescence intensity in the presence of the test compound is lower than the luminescence intensity in the absence of the test compound (for example, 80% or less, 50% or less, 30% or less, and 10% or less of the control value).
  • the test compound has a probability of having an activity of suppressing aging, an activity of preventing, ameliorating, or treating an age-related disease or condition, or an activity of extending life span.
  • the expression can be evaluated using the expression level detected in the absence of the test compound as a control value.
  • the evaluation method of the present invention has been described.
  • binding to the Rubicon protein, reduction of the expression of the Rubicon gene, or the reporter gene By selecting a compound based on a decrease in expression as an index, it is possible to screen for a compound having an activity of suppressing aging, an activity of preventing, ameliorating, or treating an age-related disease or condition, or an activity of extending life span. . Therefore, the present invention also provides such a screening method.
  • Compounds identified by the evaluation method or screening method of the present invention are further evaluated for autophagy-promoting activity in cells or in animal experiments or clinical tests to verify whether or not they actually have the above activity. Is preferred.
  • improvement of a disease or a symptom in a model animal of an age-related disease or a symptom for example, bone mass, bone density, Decreased bone volume / bone tissue volume ratio and improved bone morphology, reduced cohesive proteins causing neurodegenerative diseases, reduced eye degeneration, and reduced motor function, increased stress tolerance, organs Fibrosis
  • the expression of the Rubicon gene was up-regulated in an age-dependent manner, suggesting that this may cause the onset of various age-related diseases and symptoms and the shortening of life span. Therefore, it is possible to examine the degree of aging, the risk of developing age-related diseases or symptoms, or the risk of shortening the life span, using the expression level of the Rubicon gene as an index. That is, the present invention is a method for examining the degree of aging in a subject, the risk of developing an age-related disease or condition, or the risk of shortening the life span, and detecting the expression product of the Rubicon gene in a test sample.
  • a method comprising assessing the degree of aging, the risk of developing an age-related disease or condition, or the risk of shortening lifespan when the amount of an expression product of the Rubicon gene is higher than that of a control.
  • the test method of the present invention can also be described as a method of providing information for diagnosis by a doctor or veterinarian or a method of assisting diagnosis by a doctor or veterinarian.
  • the test method of the present invention can be applied to animals including humans.
  • animals other than humans there is no particular limitation on animals other than humans, and various kinds of livestock, poultry, pets, laboratory animals, and the like can be used.
  • mammals such as pigs, cows, horses, sheep, goats, dogs, cats, rabbits, hamsters, mice, rats, monkeys, monkeys and the like, birds such as chickens, ducks, ostriches, ducks and the like, and the like.
  • Various laboratory organisms may be used for research purposes.
  • test sample in the test method of the present invention is a biological sample separated from a subject to be tested for the degree of aging, the risk of developing age-related diseases or symptoms, or the risk of shortening the life span.
  • the biological sample is not particularly limited as long as it contains the expression product (transcript and / or translation product) of the Rubicon gene, and examples thereof include liver and kidney cells.
  • Detection of a gene expression product may be performed on a transcript (mRNA) or on a translation product (protein).
  • Methods for detecting a transcript in a target include, for example, RT-PCR, Northern blotting, in situ hybridization, dot blotting, and RNase protection assay.
  • Methods for detecting translation products in a subject include, for example, Western blotting, radioimmunoassay, chemiluminescence immunoassay, chemiluminescence enzyme immunoassay, enzyme immunoassay, immunoprecipitation, immunochromatography, immunochromatography, Examples include histochemical staining, imaging cytometry, flow cytometry, latex agglutination, and mass spectrometry (MS).
  • the “onset risk” includes not only the risk relating to the occurrence of onset, but also the risk of early onset.
  • the amount of an expression product of the Rubicon gene in a sample isolated from an unaged individual or an individual not developing an age-related disease or condition can be used.
  • the present invention also provides a composition for detecting an expression product of a Rubicon gene in the above method, wherein the composition comprises the following (a) or (b): (A) Oligonucleotide primer or oligonucleotide probe that binds to the transcription product of Rubicon gene (b) Antibody that binds to Rubicon protein
  • the above oligonucleotide primer (hereinafter, simply referred to as “primer”) is a base of cDNA encoding Rubicon. Based on the sequence information (for example, SEQ ID NO: 1), a design may be made so that transcripts other than the transcription product of the Rubicon gene are minimized. Those skilled in the art can design such primers by a conventional method.
  • the length of the primer is usually 15 to 50 bases, preferably 15 to 30 bases, but may be longer depending on the method and purpose.
  • the oligonucleotide probe (hereinafter, simply referred to as “probe”), based on the base sequence information of the cDNA encoding Rubicon (for example, SEQ ID NO: 1), does not bind to transcripts other than the transcript of the Rubicon gene as much as possible. Should be designed. Those skilled in the art can design such a probe by a conventional method.
  • the length of the probe is usually 15 to 200 bases, preferably 15 to 100 bases, and more preferably 15 to 50 bases, but may be longer depending on the method and purpose.
  • primers and probes can be appropriately labeled and used.
  • Primers and probes can be prepared, for example, using a commercially available oligonucleotide synthesizer.
  • the probe can also be prepared as a double-stranded DNA fragment obtained by restriction enzyme treatment or the like.
  • the primers and probes may be composed of only natural nucleotides (deoxyribonucleotides (DNA) or ribonucleotides (RNA)). Nucleic acids may be used.
  • primers and probes can be appropriately labeled and used.
  • the detection can be performed using a secondary antibody or the like to which the labeling substance has been bound without binding the labeling substance to the antibody that binds to the Rubicon protein.
  • the “secondary antibody” is an antibody that is reactive with an antibody that binds to the Rubicon protein.
  • an antibody that binds to the Rubicon protein is prepared as a mouse antibody, an anti-mouse IgG antibody can be used as the secondary antibody.
  • Labeled secondary antibodies that can be used for antibodies derived from various species such as rabbits, goats, and mice are commercially available, and appropriate secondary antibodies may be used depending on the species from which the antibody that binds to Rubicon protein is derived. The next antibody can be selected and used. Instead of the secondary antibody, it is also possible to use protein G or protein A to which a labeling substance is bound.
  • the labeling substance is not particularly limited as long as it can be detected.
  • radioactive isotopes such as 125I, 131I, 3H, 14C, 32P, 33P, and 35S, alkaline phosphatase (ALP), and horseradish peroxidase (HRP) , ⁇ -galactosidase ( ⁇ -gal), etc.
  • fluorescent dyes such as fluorescein isothiocyanate (FITC) and rhodamine isothiocyanate (RITC), fluorescent proteins such as allophycocyanin (APC) and phycoerythrin (R-PE), avidin , Biotin, metal particles, latex and the like.
  • composition of the present invention may contain, as necessary, other components acceptable as reagents, such as sterile water, physiological saline, buffers, and preservatives, in addition to the above molecules as active ingredients.
  • other components acceptable as reagents such as sterile water, physiological saline, buffers, and preservatives, in addition to the above molecules as active ingredients.
  • the composition can be used as a kit in combination with other preparations required for the test.
  • Other samples include, for example, a substrate necessary for detection of a label, a positive control or a negative control, or a buffer used for diluting or washing a sample.
  • the kit may contain a substance that is labeled with a substance that binds to the antibody (eg, a secondary antibody, protein G, protein A, etc.). Further, the kit can include instructions for its use.
  • mice used in this example were maintained on a C57BL / 6J background, except for calorie restricted mice.
  • an adult-onset 40% calorie restriction protocol developed by Turturro et al. (Turturro, A. et al., J Gerontola-Biol 54, B492-B501 (1999)) was used.
  • Female BDF1 mice were individually housed in cages. The CR protocol continued until 9 months of age. Water was given ad libitum.
  • RNAi plates were obtained from 4-6 hours of egg lay on RNAi plates. From adult day one, life tests were set up at a density of 15-20 animals per plate and performed at 20 ° C. Worms were transferred to new plates every other day. Survival was also counted every other day. All RNAi life spans were performed from eggs. Deaths were recorded as not moving after stimulation with platinum wire. Hatching from inside, rupture of the vulva, or worms crawling off the plate were excluded. In TOR RNAi experiments, knockdown was performed from adults. Statistical analysis was performed with Excel (Microsoft) using the Mantel-Cox log rank method. Experimental flies were bred in a standard medium, bred for 48 hours after birth, and then screened using CO2 anesthesia. Without anesthesia, the vials were replaced with fresh food every 2-3 days and deaths were recorded until all flies had died.
  • RNA interference RNA interference was performed by supplying HT115 (DE3) bacteria transformed with vector L4440 that produces dsRNA against the target gene. Synchronized eggs were placed on designated RNAi plates containing IPTG and ampicillin. RNAi clones were obtained from Ahringer or Vidal RNAi libraries. The let-363 / TOR RNAi clone was kindly provided by Dr. Hansen (Sanford-Burnham Medical Research Institute). In double knockdown experiments, the same amount of bacteria is mixed for each RNAi and plated. Empty vector (L4440) and luciferase (L4440 :: Luc) RNAi were used as non-target controls.
  • RNA extraction and qRT-PCR Worm, fly, and mouse tissue samples were collected in TRIzol (Invitrogen) or QIAZOL (Qiagen). Total RNA was extracted using an RNeasy kit (QIAGEN). cDNA was generated using iScript (Bio-Rad) or PrimeScript RT reagent kit (Takara). qRT-PCR can be performed using Power SYBR Green (Applied Biosystems) on the ViiA7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) or CFX96 Real-Time PCR on a system with Applied Biosystems. This was performed using a kit (KAPA Biosystems). Four technical replicates were performed for each reaction. ama-1 (worm), Rpl32 (fly), 18s rRNA (mouse) and GAPDH (human) were used as internal controls.
  • Multiworm tracking analysis A 13 cm x 10 cm agar-filled plate was divided into four regions with equal areas. To prevent animals from moving between areas, each area was designated C.I. elegans aversion was stimulated with glycerol. Worms from one experimental group were placed in one of four regions, and multiple experimental groups were tested simultaneously. Using an adapted version of the multiworm tracker (Swierczek, NA et al, Nat Methods 8, 592-598 (2011)), The movement of the elegans on the agar plate was recorded. Exercise was recorded for 10 minutes and the data was organized and summarized after analyzing the recordings using Choreography (part of the multi-worm tracker software) and custom scripts.
  • Choreography part of the multi-worm tracker software
  • Fluorescence images of the KC layer were taken with a confocal microscope (Leica TCS SP8) and the number of GFP and / or mCherry puncta in a 25 ⁇ 50 ⁇ m region of interest containing 150-200 cells was counted. Three non-overlapping images were used for quantification of each KC layer.
  • the signal intensity of the HA staining was quantified using ImageJ 1.51s software.
  • Ten bilateral KC layers from five animals were analyzed for each group.
  • immunohistochemical staining for collagen I was performed on paraffin-embedded sections. After antigen retrieval by autoclaving in 0.01 mmol / L citrate buffer (pH 6.0) at 120 ° C. for 10 minutes, sections were blocked with 3% BSA in PBS for 60 minutes. The blocked sections were incubated overnight at 4 ° C.
  • prepared fibrils were diluted with sterile PBS and sonicated before intracerebral injection.
  • Eight to ten week old mice were anesthetized with chloral hydrate (250 mg / kg, intraperitoneal) and both hemispheres were stereotactically injected with recombinant ⁇ -Syn fibril (1 ⁇ l of 1 mg / ml) (coordinates: Bregma) +0.2 mm, +2.0 mm from the median line). Animals 10 months after birth were provided.
  • Frozen brain sections containing fibril-injected areas were obtained using a CM3050S cryostat (Leica Biosystems).
  • TRAP staining Bone marrow cells were cultured in 24-well plates, and induced into osteoclasts by adding M-CSF and RANKL. After fixing with 4% paraformaldehyde for 5 minutes and washing with distilled water, a 50 mM tartaric acid-containing buffer (Ph 5.0) and a coloring substance were added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 45 minutes. Staining by TRAP activity was observed with a microscope using BZ-X700 (Keyence).
  • ALP staining Cells were cultured in a 12-well plate in the primary culture system and in a 96-well plate in the cultured cell system in an osteogenic medium for 5 days.
  • the bone differentiation medium was prepared using ⁇ MEM supplemented with 10% FBS, 50 ⁇ g / ml L-ascorbate phosphate (Shigma), and 10 mM ⁇ -glycerophosphate (Shigma).
  • the cells were fixed with 4% paraformaldehyde (in 0.1 M cacodylate buffer; pH 7.3) for 30 minutes, Bromo-Chloro-Indoleyl phosphate / Nitro Blue, stained with Tetrazolium Chloride at 700 ° C., and added with K-37 ° C.
  • ⁇ Y56A3A To further determine whether knockdown of 16 enhances or blocks autophagic activity, a recently developed transgenic worm expressing tandem fluorescent LGG-1 (mCherry :: GFP :: LGG-1) was used. Thus, the autophagy flux was monitored (Non-Patent Document 1). Y56A3A. Knockdown of 16 significantly increased the number of autophagosomes (AP) and autolysosomes (AL) in intestinal and pharyngeal muscles (FIGS. 1B (i), (ii), 5B (i), (Ii)). This indicates that the autophagy flux is improved by knockdown. Combined with the fact that there is only one Rubicon homolog in zebrafish and Drosophila (FIG.
  • mice that had been calorie-restricted for 9 months showed reduced Rubicon expression in liver and kidney (FIGS. 4A (ii), 8B (i)).
  • knockdown of CeRubicon did not prolong the life of daf-2, glp-1, eat-2 and isp-1 any further (FIGS. 8A (i)-(iv)). This result indicates that Rubicon is regulated downstream of a number of lifespan paradigms, and that the lifespan of these animals is partially conferred by reduced Rubicon expression.
  • MML-1 / Mondo has been identified as one of the convergent transcription factors essential for a number of long-lived pathways (Nakamura, ⁇ S. et al., Nat Nat Commun 7, 10, 10944 (2016), Johnson, D. et al. W. et al., Plos Genet 10 (2014)).
  • knockdown of mml-1 abolishes autophagic activity and longevity in long-lived glp-1 animals with germline deficiency.
  • how mml-1 controls autophagy has not been fully characterized. Therefore, it was examined whether mml-1 is involved in the control of CeRubicon.
  • CeRubicon is still largely suppressed in other long-lived animals (FIG.
  • Nutrient sensor mTOR is inactivated in response to nutrient deficiency. Inhibition of mTOR also induces autophagy and prolongs the lifespan of many species (Kapahi, ⁇ P. et al., ⁇ Cell Metab 11, 11, 453-465 ⁇ (2010)). In addition, MML-1 regulates TOR activity by suppressing the leucine sensor lars-1 (Nakamura, S. et al., Supra). Thus, possible crosstalk between Rubicon and the mTOR pathway was examined. As a result, it was surprisingly found that double knockdown of CeRubicon and let-363 / mTOR further extended the lifespan compared to knockdown of either one alone (FIG. 4D).
  • Atg5-deficient mice had significantly reduced bone density.
  • the bone density of Rubicon / Atg5-deficient mice was reduced as well as that of Atg5-deficient mice (FIG. 11A). This fact indicates that bone formation in osteoblast-specific Rubicon-deficient mice occurs in an autophagy-dependent manner.
  • osteoblast-specific Rubicon-deficient mice showed osteoblastic changes. It was examined whether this contributed to improvement of osteoporosis by creating an osteoporosis model.
  • As the osteoporosis model a postmenopausal osteoporosis model created by removing bilateral ovaries and depleting female hormones for 4 weeks was used. As a result, in sham mice, osteoporosis was induced, bone density was reduced, and the bone volume / bone tissue volume ratio was also reduced, whereas in Rubicon-deficient mice, bone density and bone volume / bone tissue volume ratio were observed in an osteoporosis model. Improved significantly (FIG. 11B).
  • the Notch2 receptor deficiency reduces the nuclear translocation into the nucleus, and suppresses transcription factors downstream of Notch.
  • Hes and Hey downstream of Notch regulate the osteoblastic transcription factors Runx2 and Osterix negatively, so that Hes and Hey decrease and osteoblastic transcription factors such as Runx2 and Osterix increase, Osteoblast differentiation and bone formation are enhanced.
  • the present inventor predicts that in Rubicon-deficient osteoblasts, the degradation of Notch receptors is promoted by enhanced autophagy, whereby Hes and Hey downstream of Notch are reduced, and Runx2 and Osterix are further increased. did. Therefore, first, the expression of mRNA of Notch downstream transcription factor and osteoblastic transcription factor was confirmed.
  • the present invention by targeting Rubicon, aging associated with the time-dependent decline of autophagy is suppressed, and a wide range of age-related diseases or symptoms can be prevented, ameliorated, or treated.
  • the service life can be extended.

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Abstract

Ｒｕｂｉｃｏｎがオートファジー活性の抑制を介した老化に関与しており、それを標的として、老化の抑制、加齢性の疾患や症状の予防、改善、もしくは治療、または寿命の延長を行うことが可能であることを見出した。

Description

老化の抑制、加齢性の疾患もしくは症状の予防、改善、もしくは治療、または寿命の延長のための組成物
　本発明は、Ｒｕｂｉｃｏｎを標的とした、老化の抑制、加齢性の疾患もしくは症状の予防、改善、もしくは治療、または寿命の延長のための組成物に関する。また、本発明は、被検化合物が、老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性の評価方法に関する。さらに、本発明は、老化の程度、加齢性の疾患もしくは症状の発症のリスク、または寿命の短縮のリスクを検査する方法、および当該検査に用いられる分子に関する。
　マクロオートファジー（以降、単に、「オートファジー」と称する）は、オートファゴソームと呼ばれる二重膜構造が細胞質材料を隔離してリソソームと融合し、それらの内容物が分解される、進化的に保存された細胞内メンブレントラフィック過程である。当初、オートファジーは、バルク分解システムとして説明されていたが、凝集蛋白質、脂質、損傷オルガネラ、そして進入細菌も選択的に標的とすることが明らかになった。標的を幅広く分解することにより、オートファジーは細胞恒常性を維持する。その結果、オートファジーの機能障害は、がんや神経変性疾患、そして代謝障害を含む多くのヒトの疾患に関与してきた。
　最近の証拠は、オートファジーが動物の老化にも関わっていることを示している。多くの種において、オートファジー活性は老化に伴い低下する（非特許文献１～３）。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの研究は、インスリン／ＩＧＦ－１シグナル伝達の軽度の減少、カロリー制限、生殖細胞系列の除去、ミトコンドリア呼吸の減少、そしてＴＯＲシグナル伝達の減少を含む、複数の保存された長命経路の発見へと導いた。重要な点は、こうした介入の全てがオートファジーを活性化させ、この活性化したオートファジーに依存するように動物の寿命を延ばすことである。そして、このことはオートファジーが多くの長命経路の収束性機構であることを示唆している（非特許文献４、５）。
　しかしながら、このようなオートファジー活性と老化との関係が、どのような機構により成立しているのかは、いまだその詳細が明らかになっていない。
Ｃｈａｎｇ，　Ｊ．　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｌｉｆｅ　６，　１８４５９　（２０１７）． Ｕｄｄｉｎ，　Ｍ．　Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｇｅ　（Ｄｏｒｄｒ）　３４，　７５－８５　（２０１２）． Ｄｏｎａｔｉ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｇｅｒｏｎｔｏｌ　Ａ　Ｂｉｏｌ　Ｓｃｉ　Ｍｅｄ　Ｓｃｉ　５６，　Ｂ３７５－３８３　（２００１） Ｔｏｔｈ，　Ｍ．　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．　Ａｕｔｏｐｈａｇｙ　４，　３３０－３３８　（２００８） Ｍａｄｅｏ，　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ，　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　１２５，　８５－９３　（２０１５） Ｍａｔｓｕｎａｇａ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　ｃｅｌｌ　ｂｉｏｌｏｇｙ　１１，　３８５－３９６　（２００９） Ｚｈｏｎｇ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１１，　４６８－４７６　（２００９）
　本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、オートファジー活性と老化との関係の基礎となる分子を同定することにある。また、本発明は、当該分子を標的として、老化の抑制、加齢性の疾患や症状の予防、改善、もしくは治療、または寿命の延長を行うことを目的とする。さらなる、本発明の目的は、当該分子を標的として、老化の程度、加齢性の疾患や症状の発症のリスク、または寿命の短縮のリスクの検査を行うことにある。
　本発明者らは、これまでに、オートファゴソーム－リソソーム融合過程を阻害する、オートファジーの負の制御因子であるＲｕｂｉｃｏｎ（Ｒｕｎ　ｄｏｍａｉｎ　Ｂｅｃｌｉｎ－１　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を同定している（非特許文献６、７）。そこで、本発明者らは、Ｒｕｂｉｃｏｎが、オートファジー活性と老化との関係を基礎づける機序に関与しているか否かの検証を行った。
　その結果、Ｒｕｂｉｃｏｎの発現が、ワームおよびマウスの組織において老化に伴い増加することを見出した。これは、Ｒｕｂｉｃｏｎが年齢依存的に増加することでオートファジーが経時的に弱まり、それにより動物の健康寿命が短縮されることを示唆する。この考えは、Ｒｕｂｉｃｏｎのノックダウンにより、ワームおよびハエの寿命が延び、複数の年齢関連表現型が改善されたことからも裏付けられた。組織特異的な実験より、ニューロンにおけるＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンが、寿命に最も大きな効果を持つことも判明した。さらに、Ｒｕｂｉｃｏｎノックアウトマウスにおいては、共に主要な年齢発症表現型である腎臓の間質性線維症とα－シヌクレインの脳内蓄積とが減少した。また、Ｒｕｂｉｃｏｎの発現は、カロリー制限を含む複数の寿命延長条件によって、ワームおよびマウスの双方において抑制された。
　さらに、本発明者は、多数の寿命パラダイムに関わる収束転写因子であるＭＭＬ－１／Ｍｏｎｄｏの下流において、Ｒｕｂｉｃｏｎが作用することを見出した。また、エピスタシス解析により、２つの主要なオートファジーの負の制御因子であるｍＴＯＲおよびＲｕｂｉｃｏｎが、互いに部分的に独立して寿命を制御するということを明らかにした。
　以上から、本発明者は、Ｒｕｂｉｃｏｎが、オートファジー活性の抑制を介した老化の鍵となる分子であり、Ｒｕｂｉｃｏｎを標的として、老化の抑制、加齢性の疾患もしくは症状の予防、改善、もしくは治療、または寿命の延長を行うことや、老化の程度、加齢性の疾患もしくは症状の発症のリスク、または寿命の短縮のリスクを検査することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、より詳しくは、以下を提供するものである。
　［１］Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の機能を抑制する分子を有効成分とする、対象における老化の抑制、加齢性の疾患もしくは症状の予防、改善、もしくは治療、または寿命の延長のための組成物。
　［２］Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の機能を抑制する分子が、下記（ａ）～（ｃ）のいずれか１に記載の分子である、［１］に記載の組成物
（ａ）Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡまたは該ＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｂ）Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質に結合するＲＮＡまたはＤＮＡ
（ｃ）Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質に結合する抗体
　［３］加齢性の疾患もしくは症状が、代謝性骨疾患もしくはその症状、ストレス耐性の向上、または臓器の線維化である、［１］または［２］に記載の組成物。
　［４］対象が脊椎動物である、［１］から［３］のいずれかに記載の組成物。
　［５］被検化合物が、対象における老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
　被検化合物とＲｕｂｉｃｏｎタンパク質とを接触させる工程、および
　被検化合物とＲｕｂｉｃｏｎタンパク質との結合を検出する工程、
を含み、
　被検化合物が、前記Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質と結合する場合、老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性があると評価される方法。
　［６］被検化合物が、対象における老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
　Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程、および
　該細胞内におけるＲｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現を検出する工程、
を含み、
　被検化合物を接触させない場合と比較して、被検化合物がＲｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現を減少させる場合、老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性があると評価される方法。
　［７］被検化合物が、対象における老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
　Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子のプロモータ－領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞に、被検化合物を接触させる工程、および
　該細胞内における前記レポーター遺伝子の発現を検出する工程、
を含み、
　被検化合物を接触させない場合と比較して、被検化合物が前記レポーター遺伝子の発現を減少させる場合、老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性があると評価される方法。
　［８］対象における老化の程度、加齢性の疾患もしくは症状の発症のリスク、または寿命の短縮のリスクを検査する方法であって、
　被検試料におけるＲｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現産物を検出する工程を含み、
　Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現産物の量が対照と比較して高い場合に、老化の程度、加齢性の疾患もしくは症状の発症のリスク、または寿命の短縮のリスクが高いと評価される方法。
　［９］加齢性の疾患もしくは症状が、代謝性骨疾患もしくはその症状、ストレス耐性の向上、または臓器の線維化である、［５］から［８］のいずれかに記載の方法。
　［１０］対象が脊椎動物である、［５］から［９］のいずれかに記載の方法。
　［１１］［８］から［１０］のいずれかに記載の方法において、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現産物を検出するための組成物であって、下記（ａ）または（ｂ）を含む組成物。
（ａ）Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の転写産物に結合するオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブ
（ｂ）Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質に結合する抗体
　本発明によれば、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の機能を抑制することにより、オートファジーの活性化を介して、老化の抑制、加齢性の疾患や症状の予防、改善、もしくは治療、または寿命の延長が可能となる。特に、単一の遺伝子の機能を抑制するだけで、代謝性骨疾患の原因となる骨密度や骨体積/骨組織体積比の低下および骨形態の変化の改善、神経変性疾患の原因となる凝集性タンパク質の減少、目の変性の減少、および運動機能の低下の改善、ストレス耐性の向上、臓器の線維化の軽減、寿命の延長などの多様な効果をもたらすことができたことは、極めて驚くべきことである。また、本発明によれば、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現産物を検出することにより、老化の程度、上記疾患や症状の発症のリスク、または寿命の短縮のリスクを検査することも可能となる。
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＲｕｂｉｃｏｎが、オートファジーを調節することによって寿命を制御することを示す図である。（ｉ）Ｌ４段階の前腸の写真である。各ＲＮＡｉを示した。ＧＦＰ：：ＬＧＧ－１で標識されたオートファゴソーム（白抜き矢印）は、ＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンにおいてより豊富であったが、ｂｅｃ－１／Ｂｅｃｌｉｎ　１の同時ノックダウンによって増加が止まった。スケールバーは２０μｍである。（ｉｉ）各ノックダウン条件下での前腸におけるＧＦＰ：：ＬＧＧ－１の点を定量化したグラフである。値は、標本平均±標準誤差を表す（ｎ＝３）。Ｐ値（＊＊Ｐ＜０．０１）は、Ｔｕｋｅｙ検定を用いた一元配置分散分析により、対照に対して決定した。 （ｉ）対照またはＣｅＲｕｂｉｃｏｎ　ＲＮＡｉに供されたＭＡＨ２１５（ｍＣｈｅｒｒｙ：：ＧＦＰ：：ＬＧＧ－１）株における腸の代表的な写真である。オートファジーフラックスは、ＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンによって増加する。ＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンによって、オートファゴソーム（ＡＰ、ＧＦＰ＋　ｍＣｈｅｒｒｙ＋、白抜き矢印で示す）およびオートリソソーム（ＡＬ、ＧＦＰ－　ｍＣｈｅｒｒｙ＋、白抜きマゼンタの矢印で示す）の両方が増加する。（ｉｉ）各条件におけるＡＰおよびＡＬを定量化したグラフである。Ｐ値（＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）は、ｔ検定によって決定した。スケールバーは１０μｍである。 （ｉ）全蛍光が１日目と比較して７日目で増加することを示している、ＣｅＲｕｂｉｃｏｎ：：ＥＧＦＰを発現するトランスジェニックワームの写真である。スケールバーは５０μｍである。（ｉｉ）野生型ワームにおける１日目および７日目のＣｅＲｕｂｉｃｏｎ発現を示すｑＲＴ－ＰＣＲ分析のグラフである。３つの独立した実験からの標本平均±標準誤差が示されており、野生型Ｎ２の１日目のサンプルに対して規格化されている。Ｐ値（＊＊＊Ｐ＜０．００１）は、ｔ検定によって決定した。 ＣｅＲｕｂｉｃｏｎによって付与された寿命は、（ｉ）ｂｅｃ－１／Ｂｅｃｌｉｎ　１または（ｉｉ）ｕｎｃ－５１／ＵＬＫ１の同時ノックダウンによって消滅した。統計分析としてログランク検定を行った。 （ｉ）ｑＲＴ－ＰＣＲにより、トランスジェニックワームにおいてＣｅＲｕｂｉｃｏｎの発現が増加することを確認した結果を示すグラフである。（ｉｉ）ＣｅＲｕｂｉｃｏｎの過剰発現により、野生型ワームの寿命は短くなったことを示すグラフである。 全身におけるＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンが、年齢に依存した表現型を改善することを示す図である。体壁筋中でｐｏｌｙＱ３５：：ＹＦＰを発現するトランスジェニックワームにおいては、５日目の段階でｐｏｌｙＱ封入体（白抜き矢印）が年齢に依存して蓄積していた。ＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンによって封入体の蓄積が減少し、ｂｅｃ－１の同時ノックダウンによって表現型が元に戻った。各ＲＮＡｉを示した。スケールバーは５０μｍである。 （ｉ）図２Ａにおけるワーム１匹当たりのｐｏｌｙＱ封入物の数を示すグラフである。各実験で２０匹超のワームを分析し、実験を３回繰り返した。Ｐ値（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）は、ｔ検定によって決定した。（ｉｉ）５日目においてマルチワームトラッキング分析から算出された運動速度を示すグラフである。ＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンワームは、高い運動量を維持する。Ｐ値（＊Ｐ＜０．０５）は、ｔ検定によって決定した。（ｉｉｉ）ＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンによる、オートファジー依存的な酸化ストレス耐性の増加を示すグラフである。２時間に渡る４．４ｍＭのＨ２Ｏ２処理の後、指定のＲＮＡｉに供された野生型１日目のワームの生存を示すグラフである。Ｐ値（＊＊Ｐ＜０．０１）は、ｔ検定によって決定した。 ｄＲｕｂｉｃｏｎの全体は、雌ハエの寿命を大きく延長することを示すグラフである。 （ｉ）複眼の変性は、対照と比較して、膨張ｐｏｌｙＱ蛋白質ＭＪＤｔｒ－Ｑ７８ｓ（ｇｍｒ－ＧＡＬ４＞ＭＪＤｔｒ－Ｑ７８ｓハエ）を発現するハエのｄＲｕｂｉｃｏｎノックダウン（ｄＲｕｂｉｃｏｎ－ＩＲ）によって弱まったことを示す写真である。白抜き矢印は壊死した個眼を示す。スケールバーは１００μｍである。（ｉｉ）（ｉ）のｇｍｒ－ＧＡＬ４＞ＭＪＤｔｒ－Ｑ７８ｓハエにおける壊死した個眼の数を定量化したグラフである。各遺伝子型について２０個超の眼を分析した。Ｐ値（＊＊＊Ｐ＜０．００１）は、ｔ検定によって決定した。 （ｉ）腎臓におけるＲｕｂｉｃｏｎ蛋白質レベルが、２ヶ月齢のマウスと比較して、２０ヶ月齢のマウスで上昇したことを示すウェスタンブロッティング像である。ＷＴマウスおよびＲｕｂｉｃｏｎ　ＫＯ（ＫＯ）マウスからのウェスタンブロッティングにより、Ｒｕｂｉｃｏｎの特定のバンドが示される。（ｉｉ）（ｉ）に示すウエスタンブロッティングを定量化したグラフである。 （ｉ）２０ヶ月齢でのマウスの腎臓におけるＬＣ－３およびｐ６２を示すウエスタンブロッティング像である。（ｉｉ）コラーゲンＩ陽性領域が、ＷＴと比較してＲｕｂｉｃｏｎノックアウト（Ｒｕｂｉｃｏｎ　ＫＯ）腎臓において減少したことを示す２０ヶ月齢の腎臓の免疫組織化学画像である。Ｐ値（＊Ｐ＜０．０５）は、ｔ検定によって決定した。スケールバーは１００μｍである。 （ｉ）図２Ｆ（ｉｉ）におけるコラーゲンＩ陽性領域を定量化したグラフである。値は標本平均±標本平均の標準誤差（ＷＴ：ｎ＝５；Ｒｕｂｉｃｏｎ　ＫＯ：ｎ＝６）を表す。Ｐ値（＊Ｐ＜０．０５）は、ｔ検定によって決定した。（ｉｉ）２０ヶ月齢での腎臓における複数の線維症マーカー（ＴＧＦ－ｂ１、Ｃｏｌ１ａ１）のｑＲＴ－ＰＣＲ分析の結果を示すグラフである。値は標本平均±標本平均の標準誤差（ＷＴ：ｎ＝５；Ｒｕｂｉｃｏｎ　ＫＯ：ｎ＝６）を表す。Ｐ値（＊Ｐ＜０．０５）は、ｔ検定によって決定した。 ニューロンのＲｕｂｉｃｏｎレベルの低下により、老化が遅延することを示す図である。（ｉ）ニューロンＣｅＲｕｂｉｃｏｎノックダウンにより、ワームの寿命が効率的に延びたことを示すグラフである。（ｉｉ）ｄＲｕｂｉｃｏｎのニューロンノックダウンにより、雌ハエの寿命が延びたことを示すグラフである。ｄＲｕｂｉｃｏｎ－ＩＲのトランスジーン発現は、汎ニューロンｅｌａｖ－ＧＡＬ４ドライバーによって誘導された。 （ｉ）ｄＲｕｂｉｃｏｎのニューロンノックダウンにより、雌ハエの脳におけるケニオン細胞層内のＰｏｌｙＱ（ＭＪＤｔｒＱ７８ｗ）封入体が減少したことを示す写真である。スケールバーは１０μｍである。（ｉｉ）（ｉ）におけるＰｏｌｙＱ強度を定量化したグラフである。５匹の動物からのケニオン細胞層の両側層１０枚を分析した。Ｐ値（＊＊＊Ｐ＜０．００１）は、ｔ検定によって決定した。（ｉｉｉ）ニューロンにおけるｄＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンにより、雌ハエでのｐｏｌｙＱ発現による運動機能障害が改善されたことを示すグラフである。運動機能はクライミングアッセイによって評価した。データは標本平均±標準誤差を表す。Ｔｕｋｅｙの検定を用いた二元配置分散分析（ｅｌａｖ＿ＭＪＤｔｒＱ７８ｗ対ｅｌａｖ＿ＭＪＤｔｒＱ７８ｗ／Ｒｕｂｉｃｏｎ－ＩＲ）によりＰ値（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）を決定した。 （ｉ）マウスへの注入１０カ月後のリン酸化α－Ｓｙｎを含むレビー小体およびレビー神経突起状封入体（開いた矢じり）を示す写真である。それらは、Ｒｕｂｉｃｏｎノックアウト（Ｒｕｂｉｃｏｎｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ：Ｎｅｓｔｉｎ－Ｃｒｅ）マウスにおいて、対照（Ｒｕｂｉｃｏｎｆｌｏｘ／＋：Ｎｅｓｔｉｎ－Ｃｒｅ）と比較して、数が少なくなっていた。スケールバーは５００μｍである。（ｉｉ）リン酸化α－Ｓｙｎ陽性シグナルの数が少ない（１００未満）、中程度（１００～２００）、または多い（２００超）マウスの割合を示すグラフである。カイ二乗検定（Ｒｕｂｉｃｏｎｆｌｏｘ／＋：Ｎｅｓｔｉｎ－Ｃｒｅ、ｎ＝７；Ｒｕｂｉｃｏｎｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ：Ｎｅｓｔｉｎ－Ｃｒｅ、ｎ＝６）によりＰ値（＊Ｐ＜０．０５）を決定した。 Ｒｕｂｉｃｏｎが、複数の寿命延長条件によってダウンレギュレートされることを示す図である。（ｉ）ｄａｆ－２（ｅ１３７０）、ｅａｔ－２（ａｄ４６５）、およびｇｌｐ－１（ｅ２１４１）を含む複数の長命株におけるＣｅＲｕｂｉｃｏｎ発現を示すｑＲＴ－ＰＣＲ分析のグラフである。３つの独立した実験からの標本平均±標本平均の標準誤差が示されており、野生型Ｎ２の１日目のサンプルに対して規格化されている。高温（２５℃）に２日間晒すことにより、生殖細胞系列を持たないｇｌｐ－１の表現型を誘導した。Ｐ値（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）は、Ｔｕｋｅｙの検定を用いた一元配置分散分析によって決定した。（ｉｉ）９ヶ月間のカロリー制限（ＣＲ）を行った場合、自由（ＡＬ）摂食と比較して、腎臓におけるＲｕｂｉｃｏｎ蛋白質レベルが低下したことを示すウエスタンブロッティング像である。 （ｉ）指定のＲＮＡｉ処理に供された指定の株のワームにおいてＣｅＲｕｂｉｃｏｎ発現が生じたことを示すｑＲＴ－ＰＣＲ分析のグラフである。ｍｍｌ－１またはｍｘｌ－２がＲＮＡｉによってノックダウンされると、ｇｌｐ－１生殖細胞系列を持たないワームにおけるＣｅＲｕｂｉｃｏｎの抑制は消滅した。野生型Ｎ２の１日目のサンプルに対して、３つの独立した実験からの標本平均±標準誤差が示されている。Ｐ値（＊＊＊Ｐ＜０．００１）は、Ｔｕｋｅｙの検定を用いた一元配置分散分析によって決定した。（ｉｉ）野生型（Ｎ２）およびｍｍｌ－１　ＯＥ（ｍｍｌ－１過剰発現株）におけるＣｅＲｕｂｉｃｏｎを示すｑＲＴ－ＰＣＲ分析のグラフである。野生型Ｎ２の１日目のサンプルに対して、３つの独立した実験からの標本平均±標本平均の標準誤差が示されている。Ｐ値（＊Ｐ＜０．０５）は、ｔ検定によって決定した。 （ｉ）ＭｏｎｄｏＡ　ｓｉＲＮＡノックダウンがＲＰＥ－１細胞におけるＲｕｂｉｃｏｎ蛋白質レベルを有意に増加させたことを示すウエスタンブロッティング像である。（ｉｉ）Ｐｏ－Ｓで正規化したＲｕｂｉｃｏｎの相対値を示すグラフである（左）。指定のｓｉＲＮＡを用いたノックダウン後のＭｏｎｄｏＡ発現を示すｑＲＴ－ＰＣＲ分析のグラフである（右）。値は、ｓｉＬｕｃの対照に対する３つの独立した実験からの標本平均±標準誤差を示す。Ｐ値（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）はｔ検定によって決定した。 ＣｅＲｕｂｉｃｏｎおよびｌｅｔ－３６３／ｍＴＯＲの二重ノックダウンを行うと、個々をノックダウンする場合と比較して、さらに寿命が延びたことを示すグラフである。 Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＲｕｂｉｃｏｎ相同体（Ｙ５６Ａ３Ａ．１６）が、ヒトＫＩＡＡ００２２６（Ｒｕｂｉｃｏｎ）、ヒトＫＩＡＡ０２２６Ｌ、およびショウジョウバエＲｕｂｉｃｏｎ（ＣＧ１２７７２）と類似していることを示す、ＣｌｕｓｔａｌＷ解析によって生成された系統樹である。 （ｉ）オートファジーフラックスが、ＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンによって増加することを示した、対照またはＣｅＲｕｂｉｃｏｎ　ＲＮＡｉに供されたＭＡＨ２１５（ｍＣｈｅｒｒｙ：：ＧＦＰ：：ＬＧＧ－１）株の咽頭筋の代表的な写真である。ＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンによって、オートファゴソーム（ＡＰ、ＧＦＰ＋　ｍＣｈｅｒｒｙ＋、白抜き白色矢印で示す）およびオートリソソーム（ＡＬ、ＧＦＰ－　ｍＣｈｅｒｒｙ＋、白抜きマゼンタの矢印で示す）の両方が増加する。スケールバーは２０μｍである。（ｉｉ）各条件におけるＡＰおよびＡＬを定量化したグラフである。Ｐ値（＊＊Ｐ＜０．０１）は、ｔ検定によって決定した。 （ｉ）ＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンによって寿命は延長したが、ａｔｇ－１８の同時ノックダウンによって寿命は消滅したことを示すグラフである。（ｉｉ）ＲＮＡｉによるＣｅＲｕｂｉｃｏｎおよびａｔｇ－１８のノックダウン効率を示すｑＲＴ－ＰＣＲ分析のグラフである。対照ＲＮＡｉを有する野生型Ｎ２に対する、３つの独立した実験からの標本平均±標本平均の標準誤差を示す。 Ｒｕｂｉｃｏｎノックダウンによる年齢に関連した変化を示す、マルチワームトラッキング分析のスナップショットである。指定のＲＮＡｉ処理の下、個々のワームのトラックおよび速度を可視化した。 （ｉ）ＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンでは、咽頭ポンピング速度は変化しないことを示すグラフである。（ｉｉ）熱ストレス耐性アッセイの結果を示すグラフである。ＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンは耐性を変化させないことが判明した。 （ｉ）ｄＲｕｂｉｃｏｎがノックダウンによって大きくダウンレギュレートされたことを示すｑＲＴ－ＰＣＲ分析のグラフである。Ｐ値（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）は、ｔ検定によって決定した（ＷＴ：ｎ＝３；Ｒｕｂｉｃｏｎ－ＩＲ：ｎ＝４）。（ｉｉ）雄ハエにおけるｄＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンの個体数統計分析のグラフである。 （ｉ）脳のＫＣ層におけるオートファジーフラックスアッセイの結果を示す写真とグラフである。ｄＲｕｂｉｃｏｎノックダウンがオートファゴソーム（ＡＰ、白色矢印）およびオートリソソーム（ＡＬ、赤色矢印）を増加させたことを示す。値は標本平均±標本平均の標準誤差を表す。Ｐ値（＊＊Ｐ＜０．０１）は、ｔ検定によって決定した（対照についてはｎ＝６、ｄＲＵｂ－ＩＲ１についてはｎ＝８）。スケールバーは１０μｍである。（ｉｉ）Ｒｕｂｉｃｏｎ蛋白質レベルが、マウス肝臓では老化に伴い増加（２ヶ月対２０ヶ月）したことを示すウエスタンブロッティング像である。 Ｒｕｂｉｃｏｎの組織特異的役割による寿命制御への寄与を示す図である。（ｉ）筋肉（ＮＲ３５０）、（ｉｉ）皮下組織（ＮＲ２２２）および（ｉｉｉ）腸（ＶＰ３０３）といった複数の組織特異的なＲＮＡｉ感受性株を用いた個体数統計分析のグラフを示した。腸および皮下組織のＣｅＲｕｂｉｃｏｎノックダウンはわずかではあるが有意に寿命を延長した。 （ｉ）ＣｅＲｕｂｉｃｏｎのニューロンノックダウンによって付与される寿命が、ニューロンａｔｇ－１８ノックダウンによって消滅することを示すグラフである。（ｉｉ）雄ハエにおけるニューロンｄＲｕｂｉｃｏｎノックダウンの個体数統計分析のグラフである。 ＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンと複数の長命経路との間のエピスタティックな関係を示すグラフである。ＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンを行っても、（ｉ）ｅａｔ－２（カロリー制限）、（ｉｉ）ｉｓｐ－１（ミトコンドリア機能障害）、（ｉｉｉ）ｄａｆ－２（インスリン／ＩＧＦ－１シグナル伝達の低下）および（ｉｖ）ｇｌｐ－１（生殖細胞系列寿命）の寿命がさらに延長することはない。 （ｉ）６カ月間のカロリー制限により、腎臓におけるＲｕｂｉｃｏｎ蛋白質レベルが低下することを示すウェスタンブロッティング像である。（ｉｉ）ＣｅＲｕｂｉｃｏｎ発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示すグラフである。ｍｍｌ－１およびｍｘｌ－２をノックダウンしても、ＣｅＲｕｂｉｃｏｎ発現は野生型（Ｎ２）レベルに戻らない。 （ｉ）ＣｅＲｕｂｉｃｏｎをノックダウンしても、ｍＴＯＲの直接の標的である蛍光体Ｓ６キナーゼのレベルは変化しないことを示すウェスタンブロッティング像である。（ｉｉ）ＣｅＲｕｂｉｃｏｎがＴＯＲノックダウンによって変化しないことを示す、ＣｅＲｕｂｉｃｏｎ発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析のグラフである。 （ｉ）Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損マウスの大腿骨のＣＴ像である。スケールバーは、５００μｍを示す。（ｉｉ）Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損マウスの大腿骨の骨密度（ＢＭＤ）、骨体積/骨組織体積比（ＢＶ／ＴＶ）、および骨塩量（ＢＭＣ）を示すグラフである。野生型（ＷＴ）はＮ＝６であり、ノックアウトマウス（ＫＯ）はＮ＝５である。 （ｉ）Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損マウスにおける破骨細胞の分化をＴＲＡＰ染色で検出した写真である。スケールバーは、２００μｍを示す。（ｉｉ）ＴＲＡＰ陽性細胞数を測定した結果を示すグラフである。 （ｉ）Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損マウスにおける破骨細胞の骨吸収機能をピットフォーメーションアッセイで評価した。（ｉ）はＴＲＡＰ染色像であり、（ｉｉ）はウェルにおける相対吸収領域の割合を示すグラフである。 Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損マウスにおける骨芽細胞の分化能を評価した。（ｉ）はＡＬＰ染色像であり、（ｉｉ）はウェルにおけるＡＬＰ染色領域の割合を示すグラフである。 Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損マウスにおける骨芽細胞のミネラル化能を評価した結果を示す。（ｉ）はアリザリン染色像であり、（ｉｉ）はウェルにおけるアリザリン染色領域の割合を示すグラフである。 Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損マウスの骨芽細胞におけるオートファジーの亢進をＬＣ３ｆｌｕｘアッセイで確認した結果を示すグラフおよび電気泳動像である。 Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損マウスにおける骨密度の増加のオートファジー依存性を評価した結果を示す。（ｉ）はＲｕｂｉｃｏｎ欠損マウス、Ａｔｇ５欠損マウス、およびＲｕｂｉｃｏｎ／Ａｔｇ５欠損マウスにおける骨形態をＣＴ解析した結果を示す写真である。（ｉｉ）は各マウスにおける骨密度を示すグラフである。 Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損骨粗鬆症モデルにおけつ骨密度と骨体積/骨組織体積比を評価した結果を示す。（ｉ）は大腿骨全体のＣＴ像、（ｉｉ）は骨梁のＣＴ像、（ｉｉｉ）は骨密度と骨体積/骨組織体積比を示すグラフである。 Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損マウスの骨芽細胞におけるオートファジーとＮｏｔｃｈシグナル経路との関係を評価するため、Ｎｏｔｃｈ下流の転写因子と造骨性転写因子のｍＲＮＡの発現を検出した結果を示すグラフである。 Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損マウスの骨芽細胞におけるＮｏｔｃｈの分解を検出した結果を示す電気泳動像とグラフである。 Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損マウスにおける骨芽細胞にＮＩＣＤを過剰発現させ、その分化能をＡＬＰ染色で評価した結果を示す。（ｉ）はＡＬＰ染色像であり、（ｉｉ）はウェルにおけるＡＬＰ染色領域の割合を示すグラフである。 免疫沈降法によりＮＩＣＤとＬＣ３の結合を検出した結果を示す写真である。
　＜老化の抑制などのための組成物＞
　本発明は、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の機能を抑制する分子を有効成分とする、対象における老化の抑制、加齢性の疾患もしくは症状の予防、改善、もしくは治療、または寿命の延長のための組成物を提供する。
　本発明における「Ｒｕｂｉｃｏｎ」は、オートファゴソーム－リソソーム融合過程を阻害する、オートファジーの負の制御因子である（非特許文献６、７）。本発明におけるＲｕｂｉｃｏｎは、その由来する生物を特に問わない（図５Ａを参照のこと）。例えば、本発明の組成物がヒトを対象とする場合においては、ヒトのＲｕｂｉｃｏｎが標的となる。ヒトのＲｕｂｉｃｏｎタンパク質の典型的なアミノ酸配列を配列番号：２に、該タンパク質をコードするｃＤＮＡの典型的な塩基配列を配列番号：１に示す（データベース登録番号：ＮＭ＿０１４６８７．３）。また、対応するマウス、ニワトリ、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、線虫の各Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質の典型的なアミノ酸配列を、順に配列番号：３～７にに示す。
　なお、Ｒｕｂｉｃｏｎの配列には、個体差や変異が生じうる。従って、本発明におけるＲｕｂｉｃｏｎタンパク質には、配列番号：２～７のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列からなり、機能的に同等なタンパク質が含まれる。ここで「１もしくは複数」とは、通常、２０アミノ酸以内（例えば、１０アミノ酸以内、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、１アミノ酸）である。また、「機能的に同等」とは、オートファジーを負に制御する機能を有することを意味する（非特許文献６、７）。
　また、ＢＬＡＳＴＰ　２．８．０＋（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　Ｓ．Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２５：３３８９－３４０２　（１９９７）、Ａｌｔｓｃｈｕｌ　Ｓ．Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＢＳ　Ｊ．　２７２：５１０１－５１０９　（２００５））のデフォルト設定での比較（Ｍａｘスコア）において、異なる種間におけるＲｕｂｉｃｏｎの同一性（同一アミノ酸割合）および類似性（類似アミノ酸割合）は、マウスとヒトの間で、それぞれ８５％と８９％（Ｇａｐｓ　２％）、ヒトとニワトリの間で、それぞれ７３％と８１％（Ｇａｐｓ　２％）、ニワトリとゼブラフィッシュの間で、それぞれ５６％と６６％（Ｇａｐｓ　１０％）、ゼブラフィッシュとショウジョウバエの間で、それぞれ３９％と５７％（Ｇａｐｓ　６％）、ショウジョウバエと線虫の間で、それぞれ２９％と４７％（Ｇａｐｓ　６％）であった。従って、上記以外の種におけるＲｕｂｉｃｏｎのアミノ酸配列は、上記種のいずれかのＲｕｂｉｃｏｎのアミノ酸配列との間で、通常、同一性が２５％以上（例えば、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上）であり、類似性が４５％以上（例えば、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上）であると考えられる。従って、本発明におけるＲｕｂｉｃｏｎタンパク質には、配列番号：２～７のいずれかに記載のアミノ酸配列と上記の同一性または類似性のアミノ酸配列を有し、機能的に同等なタンパク質が含まれる。ここで「機能的に同等」とは、オートファジーを負に制御する機能を有することを意味する（非特許文献６、７）。
　本発明における「老化」とは、加齢とともに生物の個体に起こる変化を意味する。個体は、老化によって様々な疾患や症状を発症しうる。本発明の対象とする「加齢性の疾患または症状」としては、Ｒｕｂｉｃｏｎによるオートファジーの負の制御に起因する限り、特に制限はない。例えば、骨粗鬆症などの代謝性骨疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、ポリグルタミン病（例えば、ハンチントン病、脊髄小脳変性症）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性疾患、臓器の線維化（例えば、腎臓の線維化、心筋の線維化）、運動機能不全（例えば、筋力低下、持久力低下、反応時間延長、運動速度の低下、巧緻性低下、深部感覚低下、バランス能力低下）、認知機能の低下（例えば、記憶障害、失語、失行、失認、遂行機能障害）、骨量や骨密度・骨体積/骨組織体積比の低下、骨形態の変化、目の変性、ストレス耐性の低下などが挙げられるが、これらに制限されない。また、本発明における「寿命」とは、生物が生まれてから死ぬまでの時間を意味する。日常的、継続的な医療、介護に依存しないで、自分の心身で生命を維持し、自立した生活ができる生存期間を、特に「健康寿命」と称するが、本発明における「寿命の延長」には、健康寿命の延長による寿命の延長が含まれる。
　実際、本実施例において、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の機能を抑制することにより、寿命が延長されることが認められているが、併せて、代謝性骨疾患の原因となる骨量や骨密度・骨体積/骨組織体積比の低下および骨形態の変化の改善、神経変性疾患の原因となる凝集性タンパク質の減少、目の変性の減少、および運動機能の低下の改善、ストレス耐性の向上、臓器の線維化の軽減など、多くの加齢性の疾患や症状の抑制効果も認められている。
　本発明における「遺伝子の機能の抑制」は、その機序が、遺伝子の発現の抑制（例えば、転写の抑制、翻訳の抑制）であっても、遺伝子の翻訳産物（タンパク質）の活性の抑制であってもよい。
　「Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の機能を抑制する分子」としては、例えば、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡまたは該ＲＮＡをコードするＤＮＡ、Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質に結合するＲＮＡまたはＤＮＡ、Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質に結合する抗体や低分子化合物、およびＲｕｂｉｃｏｎ遺伝子やその発現制御領域のＤＮＡの塩基配列あるいはＲｕｂｉｃｏｎ遺伝子の転写産物のＲＮＡ配列を編集する部位特異的ヌクレアーゼなどが挙げられる。
　本発明における「Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡまたは該ＲＮＡをコードするＤＮＡ」の一つの態様は、Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質をコードする遺伝子の転写産物と相補的なｄｓＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ）または該ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡである。
　本発明に用いるｄｓＲＮＡとしては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｐｉｎ　ＲＮＡ）、またはｍｉＲＮＡが好ましい。ｓｉＲＮＡは、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる２本鎖ＲＮＡである。また、ｓｈＲＮＡは、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとがスぺーサー配列を配置した１本鎖のＲＮＡであり、細胞内などでセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとの間で水素結合が生じ、スぺーサー配列がヘアピン構造となるもので、該ヘアピン構造が細胞内で切断されることにより、ｓｉＲＮＡとなり得るものを意味する。ｍｉＲＮＡは、一般的には、１本鎖ＲＮＡの形態を意味するが、具体的な実施形態としては、２本鎖ＲＮＡの形態を採用することができる。
　ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子の発現を抑制することができ、かつ、毒性を示さなければ、その鎖長に特に制限はないが、通常、１５～５０塩基対であり、好適には１５～３５塩基対であり、さらに好適には２０～２５塩基対である。より鎖長を長くすることにより、ｍＲＮＡとの親和性を高め、オフターゲット効果を減少させることができる。
　ｄｓＲＮＡまたは該ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡは、標的遺伝子の塩基配列と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を有する。
　ｄｓＲＮＡは、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の配列情報（例えば、配列番号：１）を基に、例えば、それぞれの鎖を化学合成して調製することが可能である。ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡは、標的遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）のいずれかの領域に対するアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスＤＮＡと、該ｍＲＮＡのいずれかの領域のセンスＲＮＡをコードしたセンスＤＮＡを含み、該アンチセンスＤＮＡおよび該センスＤＮＡより、それぞれアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡを発現させることができる。これらのアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡよりｄｓＲＮＡを作製することもできる。
　ｄｓＲＮＡの発現システムをベクターなどに保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡを発現させる場合と、異なるベクターからそれぞれアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡを発現させる場合がある。同一のベクターからアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡを発現させる構成においては、例えば、アンチセンスＤＮＡおよびセンスＤＮＡの上流にそれぞれｐｏｌIII系のような短いＲＮＡを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスＲＮＡ発現カセットとセンスＲＮＡ発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入する。
　また、異なる鎖上に対向するように、アンチセンスＤＮＡとセンスＤＮＡとを逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンスＲＮＡコード鎖とセンスＲＮＡコード鎖とが対となった一つの二本鎖ＤＮＡが備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとを発現し得るようにプロモーターを対向して備える。この場合には、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンスＲＮＡコード鎖、センスＲＮＡコード鎖）の３’末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモーターの種類は異なっていることが好ましい。
　また、異なるベクターからアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡを発現させる構成においては、例えば、アンチセンスＤＮＡおよびセンスＤＮＡの上流にそれぞれｐｏｌIII系のような短いＲＮＡを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスＲＮＡ発現カセットとセンスＲＮＡ発現カセットとをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させる。
　本発明における「Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡまたは該ＲＮＡをコードするＤＮＡ」の他の態様としては、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡまたは該ＲＮＡをコードするＤＮＡ（アンチセンスＤＮＡ）が挙げられる。
　アンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制するが（平島および井上，「新生化学実験講座２　核酸IV　遺伝子の複製と発現」，日本生化学会編，東京化学同人，３１９－３４７　（１９９３））、本発明で用いられるアンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡは、いずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。
　アンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡの配列は、Ｒｕｂｉｃｏｎの転写産物と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。アンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の相補性を有する。標的遺伝子の発現を抑制することができ、かつ、毒性を示さなければ、その鎖長に特に制限はない。アンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡの長さは、通常、１０～５０塩基であり、好ましくは、１２～３０塩基である。製造コストは増大するが、より鎖長を長くすることにより、ｍＲＮＡとの親和性を高め、オフターゲット効果を減少させうる。
　アンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡは、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の配列情報を基に、例えば、化学合成により調製することが可能である。
　なお、本発明における「Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡまたは該ＲＮＡをコードするＤＮＡ」の、さらなる他の態様としては、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡ、または該ＲＮＡをコードするＤＮＡを挙げることができる。リボザイムには、グループＩイントロン型や、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子、蛋白質核酸酵素、１９９０年、３５巻、２１９１ページ）。本発明においては、いずれの形態のリボザイムも利用することができる。
　本発明における「Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質に結合するＲＮＡまたはＤＮＡ」は、典型的には、核酸アプタマーである。核酸アプタマーとしては、生体内における安定性が高いという観点から、ＤＮＡが好ましい。
　核酸アプタマーは、構造的特徴として、少なくとも１つのループ構造、デオキシグアノシン（グアノシン、グアノシンアナログを含む）を多く包含する一次構造、または、デオキシグアノシンが４量体クラスター構造（いわゆる「Ｇカルテット構造」）を含んでいてもよい。また、核酸アプタマーは、２本鎖からなる核酸および１本鎖からなる核酸のいずれでもよいが、１本鎖からなる核酸が好ましい。
　核酸アプタマーの長さは、Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質に特異的に結合することができる塩基数を有していれば、特に制限はないが、通常、１０～１００塩基、好ましくは、１５～７０塩基、より好ましくは２０～５０塩基である。製造コストは増大するが、より鎖長を長いものを使用することも可能である。
　本発明に用いる核酸アプタマーは、当業者であれば、公知の手法を適宜選択して製造することができる。公知の手法としては、例えば、インビトロセレクション法（ＳＥＬＥＸ法）（Ｔｕｅｒｋ　Ｃ．　＆　Ｇｏｌｄ　Ｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ．　３；２４９（４９６８）：５０５－５１０　（１９９０）、Ｇｒｅｅｎ　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｏｍｐａｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　２：７５－８６　（１９９１）、Ｇｏｌｄ　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　６４：７６３－９７　（１９９５）、Ｕｐｈｏｆｆ　Ｋ．Ｗ．　ｅｔ　ａｌ．，，　Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｓｔｒｕｃｔ．　Ｂｉｏｌ．　６：２８１－２８８　（１９９６））が挙げられる。
　本発明の組成物の有効成分として用いられる核酸分子においては、生体内における安定性向上、標的（ｍＲＮＡやタンパク質）との親和性増強、あるいはオフターゲット効果の抑制などの観点から、適宜、その一部または全部において修飾型核酸を用いてもよい。例えば、アンチセンス核酸においては、必要に応じて、両端のみに修飾型核酸を用いたギャップマーを利用することもできる。二重鎖ＲＮＡにおいても、例えば、一方の鎖をギャップマーとしてヘテロ二重鎖ＲＮＡとすることもできる。
　核酸の化学修飾には、例えば、リン酸部の修飾、糖部の修飾、および塩基部の修飾が含まれる。このような修飾としては、例えば、シトシンの５－メチル化、５－フルオロ化、５－ブロモ化、５－ヨード化、Ｎ４－メチル化、チミジンの５－デメチル化、５－フルオロ化、５－ブロモ化、５－ヨード化、アデニンのＮ６－メチル化、８－ブロモ化、グアニンのＮ２－メチル化、８－ブロモ化、ホスホロチオエート化、メチルホスホネート化、メチルチオホスホネート化、キラル－メチルホスホネート化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化、２’－Ｏ－メチル化、２’－ＭＯＥ化、２’－ＡＰ化、２’－フルオロ化などが挙げられる。また、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ)、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、モルホリノ核酸、トリシクロ－ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）、２’－Ｏ－メチル化核酸、２’－ＭＯＥ（２’－Ｏ－メトキシエチル）化核酸、２’－ＡＰ（２’－Ｏ－アミノプロピル）化核酸、２’－フルオロ化核酸、２’Ｆ‐アラビノ核酸（２'－Ｆ－ＡＮＡ）、ＢＮＡ（架橋化核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）といった修飾核酸の利用も可能である。
　ＢＮＡとしては、例えば、ＬＮＡ（ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（登録商標）、２’，４’－ＢＮＡ）とも称されるα－Ｌ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＢＮＡまたはβ－Ｄ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＢＮＡ、ＥＮＡとも称されるエチレンオキシ（４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’）ＢＮＡ、β－Ｄ－チオ（４’－ＣＨ２－Ｓ－２’）ＢＮＡ、アミノオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（Ｒ３）－２’）ＢＮＡ、２’，４’－ＢＮＡＮＣとも称されるオキシアミノ（４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ、２’，４’－ＢＮＡＣＯＣ、３’アミノ－２’，４’－ＢＮＡなどが挙げられる。
　核酸の化学修飾については、例えば、文献（例えば、小比賀聡ら，日本薬理誌，１４８，１００～１０４　（２０１６）、井上貴雄，Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ　３１―１，　１０～２２　（２０１６））や特許公報（例えば、特開平１０－３０４８８９号公報、国際公開第２００５／０２１５７０号、特開平１０－１９５０９８号公報、特表２００２－５２１３１０号公報、国際公開第２００７／１４３３１５号、国際公開第２００８／０４３７５３号、国際公開第２００８／０２９６１９号、国際公開第２００８／０４９０８５号）を参照のこと。
　本発明において用いられる「Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質に結合する抗体」は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、また、抗体の機能的断片であってもよい。また、「抗体」には、免疫グロブリンのすべてのクラスおよびサブクラスが含まれる。抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、およびこれらの重合体などが挙げられる。
　抗体は、ポリクローナル抗体であれば、抗原（標的蛋白質、その部分ペプチド、またはこれらを発現する細胞など）で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィーなど）によって、精製して取得することができる。また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ　＆　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，　Ｎａｔｕｒｅ，　２５６：４９５　（１９７５））や組換えＤＮＡ法（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　（１９９７）、ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ　＆　Ｃ．Ｄｅａｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，　ＯＸＦＯＲＤ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＰＲＥＳＳ　（２０００）、Ｖａｎｄａｍｍｅ　Ａ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１９２：７６７－７７５　（１９９０））によって作製することができる。
　Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質に結合する抗体には、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体が含まれる。抗体を治療薬としてヒトに投与する場合は、副作用低減の観点から、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体が望ましい。
　「キメラ抗体」は、ある種の抗体の可変領域とそれとは異種の抗体の定常領域とを連結した抗体である。キメラ抗体は、例えば、抗原をマウスに免疫し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（可変領域）を切り出して、ヒト骨髄由来の抗体定常部（定常領域）遺伝子と結合し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより取得することができる（例えば、特開平８－２８０３８７号公報、米国特許第４８１６３９７号公報、米国特許第４８１６５６７号公報、米国特許第５８０７７１５号公報）。
　「ヒト化抗体」は、非ヒト由来の抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ）の遺伝子配列をヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）した抗体であり、その作製方法は、公知である（例えば、ＥＰ２３９４００、ＥＰ１２５０２３、ＷＯ９０／０７８６１、ＷＯ９６／０２５７６を参照）。
　「ヒト抗体」は、すべての領域がヒト由来の抗体である。ヒト抗体の作製においては、免疫することで、ヒト抗体のレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を利用することが可能である。ヒト抗体の作製手法は、公知である（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　３６２，　２５５－２５８　（１９９３、ＬＯＮＢＥＲＧ，　Ｎ．　＆　ＨＵＳＺＡＲ，　Ｄ．，　ＩＮＴＥＲＮ．　ＲＥＶ．　ＩＭＭＵＮＯＬ．，　１３，　６５－９３　（１９９５）、Ｍａｒｋｓ　Ｊ．Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．　５；２２２（３）：５８１－９７　（１９９１）、Ｍｅｎｄｅｚ　Ｍ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ　Ｇｅｎｅｔ．　１５（２）：１４６－１５６　（１９９７）、Ｔｏｍｉｚｕｋａ　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．　Ｊａｎ　１８；９７（２）：７２２－７２７　（２０００）、特開平１０－１４６１９４号公報、特開平１０－１５５４９２号公報、特許２９３８５６９号公報、特開平１１－２０６３８７号公報、特表平８－５０９６１２号公報、特表平１１－５０５１０７号公報）。
　本発明において用いられる「Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子やその発現制御領域のＤＮＡの塩基配列あるいはＲｕｂｉｃｏｎ遺伝子の転写産物のＲＮＡ配列を編集する部位特異的ヌクレアーゼ」としては、部位特異的に核酸を編集できるものであれば制限はないが、Ｃａｓタンパク質を構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が好ましい。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系としては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｂ、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＸ（Ｃａｓ１２ｅ）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１４などを利用することができる。部位特異的ヌクレアーゼとしては、その他、ＴＡＬＥＮｓ、ＺＦＮｓ、あるいはＰＰＲ（塩基修飾酵素と融合した形態）などの人工ヌクレアーゼを利用することもできる。
　本発明において用いられる「Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質に結合する低分子化合物」は、公知の化合物であっても、後述の本発明の評価方法やスクリーニング方法で同定される化合物であってもよい。
　本発明の組成物は、医薬組成物、飲食品（動物用飼料を含む）、あるいは研究目的（例えば、インビトロやインビボの実験）に用いられる試薬の形態であり得る。
　医薬組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、注射剤、坐剤、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤などとして、非経口的または経口的に使用することができる。これら製剤化においては、薬理学上許容される担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、ｐＨ調節剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤などと適宜組み合わせることができる。また、リポソーム送達系などの形態で調製することもできる。
　本発明の医薬組成物の投与形態としては特に制限はなく、例えば、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、気道内投与、直腸投与および筋肉内投与、輸液による投与、直接投与（例えば、患部への局所投与）などが挙げられる。
　本発明の医薬組成物は、医療上の有用な特性を増進する補助部分と結合してもよい。代表的な有用な特性としては、例えば、標的領域(例えば、患部)に対する化合物の送達を促進すること、標的領域において化合物の治療濃度を持続させること、化合物の薬物動態特性や薬力学的特性を改変すること、または化合物の治療指数または安全性プロフィールを改善することなどが挙げられる。
　標的領域への送達用の分子としては、例えば、標的領域が脳の場合には、脳関門透過物質が挙げられる。脳関門透過物質としては、例えば、抗トランスフェリン受容体抗体（例えば、国際公開第２０１６／２０８６９５号公報）や狂犬病ウィルス由来の２９アミノ酸からなる糖タンパク質（Ｋｕｍａｒ　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ．　２００７　５；４４８（７１４９）：３９－４３　（２００７）参照）が知られている。その他、腎臓や肝臓などの標的領域に応じて、公知の送達用の分子を用いることができる。
　また、本発明の医薬組成物は、老化の抑制、加齢性の疾患もしくは症状の予防、改善、もしくは治療、または寿命の延長に用いられる他の組成物と併用してもよい。
　本発明の組成物を飲食品として用いる場合、当該飲食品は、例えば、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、病者用食品、食品添加物、あるいは動物用飼料であり得る。飲食品は、上記のような組成物として摂取することができる他、種々の飲食品として摂取することもできる。飲食品の具体例としては、食用油、ドレッシング、マヨネーズ、マーガリンなどの油分を含む製品；スープ類、乳飲料、清涼飲料水、茶飲料、アルコール飲料、ドリンク剤、ゼリー状飲料、機能性飲料などの液状食品；飯類、麺類、パン類などの炭水化物含有食品；ハム、ソーセージなどの畜産加工食品；かまぼこ、干物、塩辛などの水産加工食品；漬物などの野菜加工食品；ゼリー、ヨーグルトなどの半固形状食品；みそ、発酵飲料などの発酵食品；洋菓子類、和菓子類、キャンディー類、ガム類、グミ、冷菓、氷菓などの各種菓子類；カレー、あんかけ、中華スープなどのレトルト製品；インスタントスープ，インスタントみそ汁などのインスタント食品や電子レンジ対応食品などが挙げられる。さらには、粉末、穎粒、錠剤、カプセル剤、液状、ペースト状またはゼリー状に調製された健康飲食品も挙げられる。
　飲食品の製造は、当該技術分野に公知の製造技術により実施することができる。当該飲食品においては、老化の抑制、加齢性の疾患もしくは症状の予防、改善、または治療、または寿命の延長に有効な１種もしくは２種以上の成分を添加してもよい。また、他の機能を発揮する成分あるいは他の機能性食品と組み合わせることによって、多機能性の飲食品としてもよい。
　本発明の組成物は、ヒトを含む動物を対象として使用することができる。ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物などを対象とすることができる。動物は、好ましくは脊椎動物であり、例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、マウス、ラット、サルなどの哺乳類、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒルなどの鳥類などが挙げられるが、これらに制限されない。研究目的であれば、様々な実験用生物であってもよい。
　本発明の組成物を投与または摂取する場合、その投与または摂取の量は、組成物の種類（医薬品、飲食品など）、対象の種類、年齢、体重、症状、健康状態などに応じて、適宜選択される。また、本発明の組成物の投与量（有効成分換算量）は、有効成分の種類に応じても異なるが、例えば、有効成分がＲＮＡまたはＤＮＡである場合には、通常、０．１μｇ～１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、有効成分が抗体である場合には、通常、１～１０ｍｇ／ｋｇ体重である。また、１日あたりの投与または摂取の回数としても、特に制限はなく、前記のような様々な要因を考慮して、適宜選択することができる。有効成分がＲｕｂｉｃｏｎ遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡをコードするＤＮＡである場合には、適切な量のＲＮＡが発現するように、発現構築物を作製して投与すればよい。
　本発明は、このように、本発明の組成物を対象に投与する、または摂取させることを特徴とする、対象における老化の抑制、加齢性の疾患もしくは症状の予防、改善、もしくは治療、または寿命の延長の方法をも提供する。
　本発明の組成物（医薬品、飲食品、試薬など）またはその説明書は、老化の抑制、加齢性の疾患もしくは症状の予防、改善、もしくは治療、または寿命の延長に用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品または説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。上記表示においては、本発明の組成物の作用機序についての情報を含むことができる。このような機序としては、例えば、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の機能の抑制によるオートファジーの促進などが挙げられる。
　＜被検化合物が老化を抑制する活性などを有する蓋然性の評価＞
　－Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質への結合を指標とする方法－
　後述の実施例において示す通り、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の機能を抑制することにより、代謝性骨疾患の原因となる骨量や骨密度・骨体積/骨組織体積比の低下および骨形態の変化の改善、神経変性疾患の原因となる凝集性タンパク質の減少、目の変性の減少、および運動機能の低下の改善、ストレス耐性の向上、臓器の線維化の軽減などの様々な加齢性の疾患もしくは症状が改善し、寿命が延長することが判明した。従って、老化の抑制、加齢性の疾患もしくは症状の予防、改善、もしくは治療、または寿命の延長のための組成物の開発のための一つのステップとして、Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質に結合する化合物を同定することは有効である。すなわち、本発明は、被検化合物が、対象における老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、（ａ）被検化合物とＲｕｂｉｃｏｎタンパク質とを接触させる工程、および（ｂ）被検化合物とＲｕｂｉｃｏｎタンパク質との結合を検出する工程、を含む方法を、本発明の評価方法の第一の態様として提供する。
　本発明の評価方法の対象とする「被検化合物」としては特に制限はなく、例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、ポリヌクレオチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液および培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物、または動物から採取した抽出物などが挙げられる。被検化合物は、Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質の立体構造を基にしたｉｎ　ｓｉｌｉｃｏでのデザインを基に合成したものであってもよい。
　本発明の評価方法において使用する「Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質」は、ヒトタンパク質の場合は、例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質やその部分ペプチドが挙げられる。Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質は、前記天然型のタンパク質やその部分ペプチドに加え、必要に応じて、その改変体や修飾体などを用いることができる。例えば、検出や精製を容易にするために、他の蛋白質（例えば、アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、β－ガラクトシダーゼなどの酵素、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）などの蛍光蛋白質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などのタグ）との融合蛋白質を用いることができる。被検化合物とＲｕｂｉｃｏｎタンパク質との「接触」は、当該評価系への被検化合物の添加などにより行うことができる。
　「被検化合物とＲｕｂｉｃｏｎタンパク質との結合の検出」には、公知の手法を適宜採用することができる。例えば、固定したＲｕｂｉｃｏｎタンパク質に、これら被検化合物を接触させ、Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質に結合する化合物を同定する方法が挙げられる。被検化合物とＲｕｂｉｃｏｎタンパク質との結合を検出する手段としては、様々な公知の手段を利用することができるが、好適な手段の一例として、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーが挙げられる。
　被検化合物が合成低分子化合物ライブラリーである場合には、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループット法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ　Ｎ．Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ．　２６；２７３（５２７４）　４５８－４６４　（１９９６）、Ｖｅｒｄｉｎｅ，　Ｇ．Ｌ．　Ｎａｔｕｒｅ　３８４　１１－１３　（１９９６）、Ｈｏｇａｎ　Ｊ.Ｃ．，　Ｊｒ　Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．　Ｎａｔｕｒｅ．　３８４：１７－１９　（１９９６））を利用することができる。また、被検化合物がポリヌクレオチドライブラリーである場合には、例えば、前述のインビトロセレクション法を、被検化合物が遺伝子ライブラリーである場合には、例えば、Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質をベイトタンパク質として発現させて利用する酵母ツーハイブリッドシステムを、それぞれ利用することができる。
　以上の結果、被検化合物がＲｕｂｉｃｏｎタンパク質に結合する場合、老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性があると評価される。
　－Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現量の減少を指標とする方法－
　後述の実施例において示す通り、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現が年齢依存的にアップレギュレートされ、これが様々な加齢性の疾患や症状の発症の起因となることが示唆された。従って、老化の抑制、加齢性の疾患もしくは症状の予防、改善、もしくは治療、または寿命の延長のための組成物の開発のための一つのステップとして、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現量を減少させる化合物を同定することが有効である。すなわち、本発明は、被検化合物が、対象における老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、（ａ）Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程、および（ｂ）該細胞内におけるＲｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現を検出する工程、を含む方法を、本発明の評価グ方法の第二の態様として提供する。
　第二の態様において用いる「被検化合物」については、第一の態様と同様である。検出の対象となる「Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子」としては、その由来する生物を特に問わないが、ヒトを対象とする組成物の開発においては、ヒトのＲｕｂｉｃｏｎ遺伝子が好適である。ヒト遺伝子としては、例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子（例えば、配列番号：１に記載の塩基配列からなる遺伝子）を対象とすることができる。また、「Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子を発現する細胞」としては、ヒト細胞であれば、例えば、ＲＰＥ－１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられるが、これらに制限されない。Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子を発現する細胞への被検化合物の「接触」は、例えば、前記細胞の培養液への被検化合物の添加などにより行うことができる。
　「Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現の検出」には、公知の手法を用いることができる。「遺伝子の発現の検出」は、転写レベル（ｍＲＮＡレベル）で検出してもよく、翻訳レベル（タンパク質レベル）で検出してもよい。転写レベルで検出する方法としては、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ドットブロット法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法などが挙げられる。また、翻訳レベルで検出する方法としては、例えば、ウェスタンブロット法、放射免疫測定法、化学発光免疫測定法、化学発光酵素免疫測定法、酵素免疫測定法、免疫沈降法、イムノクロマトグラフィー、免疫組織化学的染色法、イメージングサイトメトリー、フローサイトメトリー、ラテックス凝集法、質量分析法（ＭＳ）などが挙げられる。
　以上の結果、被検化合物を接触させない場合と比較して、被検化合物がＲｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現を減少させる場合、老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性があると評価される。
　Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現の減少は、例えば、ウェスタンブロット法を用いた場合においては、被検化合物存在下で検出されるＲｕｂｉｃｏｎタンパク質の量（例えば、Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質に由来するバンドの強さ）と、被検化合物非存在下で検出されるＲｕｂｉｃｏｎタンパク質の量（対照値）とを比較することにより評価することができる。すなわち、被検化合物存在下におけるＲｕｂｉｃｏｎタンパク質の量が被検化合物非存在下の量と比較して低い場合（例えば、対照値の８０％以下、５０％以下、３０％以下、１０％以下の場合）には、該被検化合物が、老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性があると評価することができる。前記発現の検出において、ウェスタンブロット法以外の方法を用いる場合も同様に、被検化合物非存在下における前記発現量を対照値として用いて評価することができる。
　－レポーター系－
　被検化合物がＲｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現レベルを減少させるか否かの評価は、レポーター遺伝子を用いた系で行うこともできる。すなわち、本発明は、被検化合物が、対象における老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、（ａ）Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子のプロモータ－領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞に、被検化合物を接触させる工程、および（ｂ）該細胞内における前記レポーター遺伝子の発現を検出する工程、を含む方法を、本発明の評価方法の第三の態様として提供する。
　「Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子のプロモータ－領域」は、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の転写を制御する領域であり、転写因子が結合することのできるＲｕｂｉｃｏｎ遺伝子のコーディング領域の上流領域を意味する。「Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子のプロモータ－領域」は、当業者であれば、例えば、配列番号：１に記載の塩基配列またはその一部をプローブとしたゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより取得することができる。取得したゲノムＤＮＡの下流にレポーター遺伝子を結合したベクターを調製して、適当な細胞内に導入した場合に、当該レポーター遺伝子の発現を誘導することができれば、当該ゲノムＤＮＡを、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子のプロモータ－領域として同定することができる。
　「レポーター遺伝子」としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β－グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）およびＧＦＰ遺伝子を挙げることができる。
　ここで、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子のプロモータ－領域の下流にレポーター遺伝子が「機能的に結合した」とは、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。
　なお、「Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子」、「被検化合物」、および「接触」は、前記第二の態様と同様である。第三の態様において使用する「細胞」としては、当該レポーター系を導入した場合に、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導される細胞であればよく、例えば、ＲＰＥ－１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられるが、これらに制限されない。
　レポーター遺伝子の発現は、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により検出することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現を検出することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による化学発光を検出することにより、また、ＧＵＳである場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるグルクロンの発光や５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－グルクロニド（Ｘ－Ｇｌｕｃ）の発色を検出することにより、さらに、ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現を検出することができる。
　以上の結果、被検化合物を接触させない場合と比較して、被検化合物が前記レポーター遺伝子の発現を減少させる場合、老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性があると評価される。
　レポーター遺伝子の発現の減少は、例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いる場合においては、被検化合物存在下で検出される化学発光の強度と、被検化合物非存在下で検出される化学発光の強度（対照値）とを比較することにより評価することができる。すなわち、被検化合物存在下における発光強度が被検化合物非存在下における発光強度と比較して低い場合（例えば、対照値の８０％以下、５０％以下、３０％以下、１０％以下の場合）には、該被検化合物が、老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性があると評価することができる。前記発現の検出において、ルシフェラーゼ遺伝子以外のレポーター遺伝子を用いる場合も同様に、被検化合物非存在下で検出される前記発現量を対照値として用いて評価することができる。
　以上、本発明の評価方法について説明したが、複数の被検化合物に対して、本発明の評価方法を実施して、上記のＲｕｂｉｃｏｎタンパク質への結合、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現の減少、あるいはレポーター遺伝子の発現の減少を指標に化合物を選択すれば、老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。従って、本発明は、このようなスクリーニング方法をも提供する。
　本発明の評価方法やスクリーニング方法によって同定された化合物については、さらに、細胞におけるオートファジーの促進活性を評価したり、動物実験や臨床試験において、実際に、上記活性を有するか否かを検証することが好ましい。動物実験としては、例えば、後述の実施例において示すように、加齢性の疾患や症状のモデル動物における当該疾患や症状の改善（例えば、代謝性骨疾患の原因となる骨量や骨密度・骨体積/骨組織体積比の低下および骨形態の変化の改善、神経変性疾患の原因となる凝集性タンパク質の減少、目の変性の減少、および運動機能の低下の改善、ストレス耐性の向上、臓器の線維化の軽減など）あるいは寿命の延長などが挙げられる。
　＜老化の程度などの検査＞
　後述の実施例において示す通り、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現が年齢依存的にアップレギュレートされ、これが様々な加齢性の疾患や症状の発症や寿命の短縮の起因となることが示唆された。従って、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現量を指標に、老化の程度、加齢性の疾患や症状の発症のリスク、または寿命の短縮のリスクを検査することが可能である。すなわち、本発明は、対象における老化の程度、加齢性の疾患もしくは症状の発症のリスク、または寿命の短縮のリスクを検査する方法であって、被検試料におけるＲｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現産物を検出する工程を含み、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現産物の量が対照と比較して高い場合に、老化の程度、加齢性の疾患もしくは症状の発症のリスク、または寿命の短縮のリスクが高いと評価される方法を提供する。本発明の検査方法は、医師や獣医師などによる診断のための情報を提供する方法、あるいは医師や獣医師などによる診断を補助する方法と表現することもできる。
　本発明の検査方法は、ヒトを含む動物を対象とすることができる。ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物などを対象とすることができる。具体的には、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、マウス、ラット、サルなどの哺乳類、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒルなどの鳥類などが挙げられるが、これらに制限されない。研究目的であれば、様々な実験用生物であってもよい。
　本発明の検査方法における「被検試料」は、老化の程度、加齢性の疾患もしくは症状の発症のリスク、または寿命の短縮のリスクを検査する対象から分離された生物学的試料である。生物学的試料は、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現産物（転写産物および／または翻訳産物）を含む限り、特に制限はないが、例えば、肝臓や腎臓の細胞などが挙げられる。
　「Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現産物の検出」には、公知の手法を用いることができる。「遺伝子の発現産物の検出」は、転写産物（ｍＲＮＡ）を対象に検出してもよく、翻訳産物（タンパク質）を対象に検出してもよい。転写産物を対象に検出する方法としては、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ドットブロット法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法などが挙げられる。また、翻訳産物を対象に検出する方法としては、例えば、ウェスタンブロット法、放射免疫測定法、化学発光免疫測定法、化学発光酵素免疫測定法、酵素免疫測定法、免疫沈降法、イムノクロマトグラフィー、免疫組織化学的染色法、イメージングサイトメトリー、フローサイトメトリー、ラテックス凝集法、質量分析法（ＭＳ）などが挙げられる。
　こうしてＲｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現産物を検出した結果、被検試料中のＲｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現産物の量が対照と比較して高い場合、対象が、老化の程度、加齢性の疾患または症状の発症のリスク、または寿命の短縮のリスクが高いと評価される。ここで「発症リスク」には、発症の有無に関するリスクのみならず、発症の早期化のリスクが含まれる。対照としては、例えば、老化していない個体や加齢性の疾患または症状を発症していない個体から分離した試料におけるＲｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現産物の量を利用することができる。
　また、本発明は、上記方法において、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現産物を検出するための組成物であって、下記（ａ）または（ｂ）を含む組成物を提供する。
（ａ）Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の転写産物に結合するオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブ
（ｂ）Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質に結合する抗体
　上記オリゴヌクレオチドプライマー（以下、単に「プライマー」と称する）は、ＲｕｂｉｃｏｎをコードするｃＤＮＡの塩基配列情報（例えば、配列番号：１）に基づき、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の転写産物以外の転写産物が極力増幅されないように設計すればよい。このようなプライマー設計は、当業者であれば、常法により行うことができる。プライマーの長さは、通常１５～５０塩基長、好ましくは１５～３０塩基長であるが、手法および目的によってはこれより長くてもよい。
　上記オリゴヌクレオチドプローブ（以下、単に「プローブ」と称する）は、ＲｕｂｉｃｏｎをコードするｃＤＮＡの塩基配列情報（例えば、配列番号：１）に基づき、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の転写産物以外の転写産物に極力結合しないように設計すればよい。このようなプローブ設計は、当業者であれば、常法により行うことができる。プローブの長さは、通常、１５～２００塩基長、好ましくは１５～１００塩基長、さらに好ましくは１５～５０塩基長であるが、手法および目的によってはこれより長くてもよい。また、プライマーおよびプローブは、適宜標識して用いることができる。
　プライマーおよびプローブは、例えば、市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理などによって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。また、プライマーおよびプローブは、天然のヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）やリボヌクレオチド（ＲＮＡ））のみから構成されていてもよいが、必要に応じて、一部または全部において、上記した化学修飾された核酸を用いてもよい。また、プライマーおよびプローブは、適宜標識して用いることができる。
　Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質に結合する抗体は、直接法により、Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質を検出する場合、通常、標識物質を結合させた抗体が用いられる。一方、間接法により、Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質を検出する場合、Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質に結合する抗体には標識物質を結合させず、標識物質が結合した二次抗体などを利用して検出することができる。ここで「二次抗体」とは、Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質に結合する抗体に対して反応性を示す抗体である。例えば、Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質に結合する抗体をマウス抗体として調製した場合には、二次抗体として抗マウスＩｇＧ抗体を使用することができる。ウサギ、ヤギ、マウスなどの様々な生物種に由来する抗体に対して、使用可能な標識二次抗体が市販されており、Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質に結合する抗体の由来する生物種に応じて、適切な二次抗体を選択して使用することができる。二次抗体に代えて、標識物質を結合させたプロテインＧやプロテインＡなどを用いることも可能である。
　標識物質としては、検出可能であれば、特に制限はないが、例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓなどの放射性同位元素、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、βガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）などの酵素、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）などの蛍光色素、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）やフィコエリスリン（Ｒ－ＰＥ）などの蛍光タンパク質、アビジン、ビオチン、金属粒子、ラテックスなどが挙げられる。
　本発明の組成物においては、有効成分としての上記分子の他、必要に応じて、滅菌水や生理食塩水、緩衝剤、保存剤など、試薬として許容される他の成分を含むことができる。
　また、当該組成物は、当該検査に必要な他の標品と組み合わせてキットとすることもできる。他の標品としては、例えば、標識の検出に必要な基質、陽性対照や陰性対照、あるいは試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液などが挙げられる。また、標識されていない抗体を標品とした場合には、当該抗体に結合する物質（例えば、二次抗体、プロテインＧ、プロテインＡなど）を標識化したものを、キットに含めることができる。さらに、キットには、その使用説明書を含めることができる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　［材料と方法］
　（１）Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの飼育条件と株
　線虫は、特記しない限り、大腸菌株ＯＰ５０を有する線虫飼育培地（ＮＧＭ）寒天プレート上において、標準的な技術を用いて２０℃で培養した。本実施例では、以下のワーム株を使用した。
　Ｎ２（ＷＴ）；　ＤＡ２１２３，　ａｄＩｓ２１２２［ｌｇｇ－１ｐ：：ＧＦＰ：：ｌｇｇ－１＋ｒｏｌ－６（ｓｕ１００６）］　；　ＡＭ１４０，　ｒｍＩｓ１３２［ｕｎｃ－５４ｐ：：Ｑ３５：：ＹＦＰ］；　ＴＵ３４０１，　ｓｉｄ－１（ｐｋ３３２１）　Ｖ；　ｕＩｓ６９［ｐＣＦＪ９０（ｍｙｏ－２ｐ：：ｍＣｈｅｒｒｙ）＋ｕｎｃ－１１９ｐ：：ｓｉｄ－１］；　ＶＰ３０３，　ｒｄｅ－１（ｎｅ２１９）　Ｖ；　ｋｂＩｓ７［ｎｈｘ－２ｐ：：ｒｄｅ－１＋ｒｏｌ－６（ｓｕ１００６）］．　ＮＲ３５０，　ｒｄｅ－１（ｎｅ２１９）　Ｖ；　ｋｚＩｓ２０［ｈｌｈ－１ｐ：：ｒｄｅ－１＋ｓｕｒ－５ｐ：：ＮＬＳ：：ＧＦＰ］；　ＮＲ２２２，　ｒｄｅ－１（ｎｅ２１９）　Ｖ；　ｋｚＩｓ９［（ｐＫＫ１２６０）　ｌｉｎ－２６ｐ：：ＮＬＳ：：ＧＦＰ＋（ｐＫＫ１２５３）　ｌｉｎ－２６ｐ：：ｒｄｅ－１＋ｒｏｌ－６（ｓｕ１００６）］；　ＣＢ１３７０，　ｄａｆ－２（ｅ１３７０）ＩＩＩ；　ＤＡ４６５，　ｅａｔ－２（ａｄ４６５）　ＩＩ；　ＣＢ４０３７，　ｇｌｐ－１（ｅ２１４１ｔｓ）ＩＩＩ；　ＯＰ１９８，　ｕｎｃ－１１９（ｅｄ３）　ＩＩＩ；　ｗｇＩｓ１９８［ｍｍｌ－１：：ＴＹ１：：ＥＧＦＰ：：３ｘＦＬＡＧ（９２Ｃ１２）＋ｕｎｃ－１１９（＋）］；　ＭＱ８８７，　ｉｓｐ－１（ｑｍ１５０）ＩＶ；　ＭＡＨ２１５，　ｓｑＩｓ１１［ｌｇｇ－１ｐ：：ｍＣｈｅｒｒｙ：：ＧＦＰ：：ｌｇｇ－１＋ｒｏｌ－６］．
　（２）プラスミド構築およびトランスジェネシス
　ＣｅＲｕｂｉｃｏｎ：ＥＧＦＰ翻訳融合構築物については、ＣｅＲｕｂｉｃｏｎ　４ｋｂ内在性プロモーターに加えてコーディング配列を、ＥＧＦＰタグを含むｐＤＣ４ベクターにクローニングした。構築物のマイクロインジェクションを、共注入マーカーｍｙｏ－２ｐ：：ｍＣｈｅｒｒｙとともに実施し、ＣｅＲｕｂｉｃｏｎ：：ＥＧＦＰを生成させた。
　（３）マウス
　ＣＡＧ－ＣｒｅマウスおよびＮｅｓｔｉｎ－Ｃｒｅマウスは、ジャクソン研究所および宮崎純一博士の研究所（大阪大学）からそれぞれ入手した。ＣＡＧ－ＣｒｅマウスをＲｕｂｉｃｏｎｆｌｏｘマウス（Ｔａｎａｋａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　６４，　１９９４－２０１４　（２０１６））と交配させて、全体Ｒｕｂｉｃｏｎ欠失マウスを作製した。作製したＲｕｂｉｃｏｎ－アレルを有するマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型株に５回戻し交配した後、Ｒｕｂｉｃｏｎ＋／－マウスとの間でインタークロスさせてＲｕｂｉｃｏｎ－／－マウスおよび野生型対照を作製した。Ｎｅｓｔｉｎ－ＣｒｅマウスをＲｕｂｉｃｏｎｆｌｏｘマウスと交配させて、脳内で特異的にＲｕｂｉｃｏｎのホモ接合欠損を有するマウスを作製した。本実施例で使用した全てのマウスは、カロリー制限マウスを除いて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドで維持した。これらの実験では、Ｔｕｒｔｕｒｒｏら（Ｔｕｒｔｕｒｒｏ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｇｅｒｏｎｔｏｌ　ａ－Ｂｉｏｌ　５４，　Ｂ４９２－Ｂ５０１　（１９９９））によって開発された成人発症の４０％カロリー制限プロトコルを用いた。雌のＢＤＦ１マウスをケージ内で個別に飼育した。ＣＲプロトコルは、９ヶ月齢まで継続した。水は自由に与えた。
　（４）ハエストックおよび培養条件
　ハエは、標準的なコーンミール－寒天－酵母ベースの培地において、２５℃で飼育した。ＵＡＳ－ＭＪＤｔｒ－Ｑ２７（＃８１４９）、ＵＡＳ－ＭＪＤｔｒ－Ｑ７８ｓ（＃８１５０、眼変性用）、ＵＡＳ－ＭＪＤｔｒ－Ｑ７８ｗ（＃８１４１）、ＵＡＳ－ＧＦＰ－ＩＲ（＃９３３０）、ＵＡＳ－ｄＲｕｂｉｃｏｎ（ＣＧ１２７７２）－ＩＲ（＃４３２７６）、ＵＡＳ－ＧＦＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ａｔｇ８ａ（＃３７７４９）、ｄａ－ＧＡＬ４（＃５５８４９）およびｅｌａｖ－ＧＡＬ４ｃ１５５（＃４５８）を有するハエを、Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ　Ｓｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒから得た。ｇｍｒ－ＧＡＬ４を有するトランスジェニックハエ系統がこれまでに報告されている（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１８，　６７６７－６７７５　（１９９９））。
　（５）個体数統計分析
　ワームについては、ＲＮＡｉプレート上で４～６時間の産卵から同期した卵を得た。１日目の成体から、寿命試験をプレート当たり１５～２０匹の密度でセットアップし、２０℃で行った。ワームは一日おきに新しいプレートに移した。生存率も１日おきにカウントした。全てのＲＮＡｉ寿命は、卵から実施した。死亡は、プラチナワイヤーで刺激した後、一切の動きがないものとして記録した。内部からの孵化や外陰部の破裂、またはプレートから這い上がったワームは除外した。ＴＯＲ　ＲＮＡｉ実験では、成体よりノックダウンを行った。Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘログランク法を用いて、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）で統計的解析を行った。実験用ハエを標準培地で飼育し、誕生後４８時間交配させた後、ＣＯ２麻酔を用いて選別した。麻酔することなく、２～３日ごとにバイアルを新鮮な食べ物に交換し、すべてのハエが死ぬまで死亡を記録した。
　（６）ＲＮＡ干渉
　ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、標的遺伝子に対してｄｓＲＮＡを産生するベクターＬ４４４０により形質転換されたＨＴ１１５（ＤＥ３）細菌を供給することによって実施した。同調した卵を、ＩＰＴＧおよびアンピシリンを含む指定のＲＮＡｉプレート上に置いた。ＲＮＡｉクローンは、Ａｈｒｉｎｇｅｒ氏またはＶｉｄａｌ氏のＲＮＡｉライブラリーから得た。ｌｅｔ－３６３／ＴＯＲ　ＲＮＡｉクローンは、Ｈａｎｓｅｎ博士（Ｓａｎｆｏｒｄ－Ｂｕｒｎｈａｍ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）より供与された。二重ノックダウン実験では、各ＲＮＡｉに対して同量の細菌を混合し、プレートに播種する。空ベクター（Ｌ４４４０）およびルシフェラーゼ（Ｌ４４４０：：Ｌｕｃ）ＲＮＡｉを非標的対照として用いた。
　（７）ＲＮＡ抽出およびｑＲＴ－ＰＣＲ
　ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）またはＱＩＡＺＯＬ（Ｑｉａｇｅｎ社）中で、ワーム、ハエ、およびマウスの組織サンプルを採取した。ＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ｉＳｃｒｉｐｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）またはＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ試薬キット（タカラ社）を用いてｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＶｉｉＡ７　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）上でＰｏｗｅｒ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、またはＣＦＸ９６　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）上でＫＡＰＡ　ＳＹＢＲ　Ｆａｓｔ　ｑＰＣＲキット（ＫＡＰＡ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行った。各反応につき、４回のテクニカルレプリケートを行った。ａｍａ－１（ワーム）、Ｒｐｌ３２（ハエ）、１８ｓ　ｒＲＮＡ（マウス）およびＧＡＰＤＨ（ヒト）を内部対照として用いた。
　（８）マルチワームトラッキング分析
　１３ｃｍ×１０ｃｍの寒天充填プレートを、等しい面積を有する４つの領域に分割した。動物が領域間を移動するのを防ぐために、各領域を、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの嫌悪刺激であるグリセロールで囲んだ。ある実験群からのワームを４つの領域のうちの１つに配置し、多数の実験群を同時に試験した。マルチワームトラッカーの適合バージョン（Ｓｗｉｅｒｃｚｅｋ，　Ｎ．　Ａ．　ｅｔ　ａｌ，　Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　８，　５９２－５９８　（２０１１））を用いて、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの寒天プレート上の運動を記録した。運動を１０分間記録し、Ｃｈｏｒｅｏｇｒａｐｈｙ（マルチワームトラッカーソフトウェアの一部）とカスタム作成スクリプトを使用して記録を分析した後、データを整理し、要約した。動物のトラックは、記録中、最後の２分間における各フレームの重心位置の時系列として収集した。トラッカーによる動物の認識を安定させるために、最初の８分間は無視した。Ｃｈｏｒｅｏｇｒａｐｈｙフィルター（シャドーレスおよび－ｔ１０）を用いて画像のアーティファクトを回避した。個体の速度は、一連の重心間の距離の合計をトラックの継続時間で割ったものとして算出した。実験群は、動物のトラックの長さで重み付けした標本平均およびその標準誤差を用いて要約した。
　（９）クライミングアッセイ
　クライミングアッセイは、公表されているプロトコル（Ｓｕｚｕｋｉ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｕｍａｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２４，　６６７５－６６８６　（２０１５））にわずかな改変を加えたものに従って行った。１０～２０匹のハエを、麻酔なしの円錐形ガラス管（長さ１５ｃｍ；直径２．５ｃｍ）に入れた。ハエを管の底まで落としてから１０秒後、各鉛直領域のハエの数を数え、以下のように点数をつけた。点数０（０～２ｃｍ）、１（２～３．９ｃｍ）、２（４～５．９ｃｍ）、３（６～７．９ｃｍ）、４（８～９．９ｃｍ）、５（１０～１５ｃｍ）。３つの試験を２０秒間隔で各群に対して行い、クライミングの点数を以下のようにして算出した。各スコアにハエの数を乗じたものをハエの総数で割り、３つの試験の平均点を算出した。結果は、３～９回の独立した実験で得られた点数の標本平均±標準誤差として表した。
　（１０）顕微鏡使用および定量化
　オートファジー活性をモニタするために、Ｌ４段階のＧＦＰ：：ＬＧＧ－１およびｍＣｈｅｒｒｙ：：ＧＦＰ：：ＬＧＧ－１動物を０．１％アジ化ナトリウムで麻酔し、オリンパスＦＶ１０００共焦点顕微鏡を用いて画像を取得した。これらの画像を用いて、前腸領域または咽頭領域のＧＦＰおよび／またはｍＣｈｅｒｒｙ　ｐｕｎｃｔａを計数し、定量化した。ＣｅＲｕｂｉｃｏｎ：：ＥＧＦＰおよびＱ３５：：ＹＦＰワームについては、氷冷した空のプレート上に整列したワーム全体の蛍光画像を、ＤＰ８０　ＣＣＤカメラを備えた実体顕微鏡ＳＺＸ１６（オリンパス）で撮影し、ワーム当たりのｐｏｌｙＱ凝集物の数を勘定した。
　（１１）ハエの眼の撮像
　ＣＣＤカメラ（ＤＰ２２、オリンパス）を備えた立体顕微鏡モデルＳＺＸ１６（オリンパス）を用いて、１日齢の成体雌ハエの光学顕微鏡画像を撮影した。１つの複眼に対する壊死した個眼の数を各遺伝子型についてカウントした。
　（１２）ハエのオートファジーフラックス
　摂食状態を一致させるために、ｄａ－ＧＡＬ４ドライバーの下で、且つ、ｄＲｕｂｉｃｏｎ－ＩＲが存在するまたは存在しない状況下で、ＧＦＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ａｔｇ８ａを発現する４日齢のハエを、０．７５％寒天により１５時間飢餓状態にし、４時間再摂取させた。脳を解剖し、ＰＢＳ中の４％ホルマリン内に固定し、８０％グリセロールで一晩インキュベートし、次いで、ＤＡＰＩ　フルオロマウント－Ｇ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）で封入した。共焦点顕微鏡（ライカ社ＴＣＳ　ＳＰ８）によりＫＣ層の蛍光画像を撮影し、１５０～２００個の細胞を含む２５×５０μｍの関心領域中のＧＦＰおよび／またはｍＣｈｅｒｒｙ　ｐｕｎｃｔａの数をカウントした。３つのオーバーラップしない画像を各ＫＣ層の定量化に使用した。
　（１３）ストレス耐性アッセイ
　１日目の成体ワームを、酸化ストレス（空のプレート中４．４ｍＭのＨ２Ｏ２）または熱ストレス（３５℃）にそれぞれ３時間または７時間さらし、生存したワームをカウントした。各条件につき３０匹のワームを使用し、実験を３回繰り返した。
　（１４）ウェスタンブロッティング
　ホモジナイザーを用いて、ワームまたはマウスの組織を溶解緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％ＮＰ－４０、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル［Ｒｏｃｈｅ社］）中で溶解した。遠心分離した後、得られた上澄みを蛋白質定量化およびウエスタンブロッティングに供した。ワームおよびマウス組織の蛋白質溶解物をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離してＰＶＤＦ膜に転写し、次いでこれをブロックして特異的な一次抗体と共にインキュベートした。マウス組織のウエスタンブロッティングに使用した一次抗体および希釈物は以下の通りである。
　Ｒｕｂｉｃｏｎ（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、＃８４６５，１：５００）、ＬＣ３（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、＃２７５５，１：１０００）、ｐ６２（株式会社医学生物学研究所、ＰＭ０４５，１：　１０００）、ホスホｐ７０　Ｓ６キナーゼ（Ｔｈｒ３９８）（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、＃９２０９，１：５００）、およびβ－アクチン（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ａ５３１６，１，８０００）。
　（１５）免疫組織化学
　ハエについては、成体の雌の脳（羽化から３日後）を解剖し、ＰＢＳ中の４％ホルマリン内に固定し、ＰＢＳ／Ｔ（ＰＢＳ中０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）中の５０％ブロックエース（大日本住友製薬株式会社）でブロックし、抗ＨＡ抗体（３Ｆ１０，１：５００、Ｓｉｇｍａ社）と共にインキュベートした後、ＨＡタグでＭＪＤｔｒＱ７８蛋白質を染色した。免疫染色をＡｌｅｘａ４８８標識抗ラット抗体で視覚化し、核をＤＡＰＩで染色した。ケニオン細胞層（ＫＣ層）の画像を、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７８０、Ｚｅｉｓｓ社）を使用して撮影した。ＨＡ染色のシグナル強度を、ＩｍａｇｅＪ　１．５１ｓソフトウェアを用いて定量化した。５匹の動物からの両側ＫＣ層１０枚を、各群について分析した。マウスでは、コラーゲンＩの免疫組織化学染色をパラフィン包埋切片上で行った。０．０１ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）中、１２０℃で１０分間オートクレーブすることによる抗原回収の後、切片をＰＢＳ中の３％ＢＳＡで６０分間ブロックした。ブロックした切片を、一次抗体である抗コラーゲンＩ（ａｂｃａｍ社、ａｂ３４７１０，１：４００）と共に４℃で一晩インキュベートし、室温で３０分間インキュベートした後、ＨＲＰ－ジアミノベンジジン化合物（株式会社ニチレイ）を用いて検出を行った。切片をヘマトキシリンで対比染色した。
　（１６）組換えα－ｓｙｎフィブリルの注入および検出
　フィブリルの注入およびその検出は、これまでに報告されている（Ｌｕｋ，　Ｋ．　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　３３８，　９４９－９５３　（２０１２）、Ｗａｔａｎａｂｅ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｕｔｏｐｈａｇｙ　１３，　１３３－１４８　（２０１７））。
　具体的には、脳内注入の前に、調製済みフィブリルを滅菌ＰＢＳで希釈して超音波処理した。８～１０週齢のマウスを抱水クロラール（２５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔し、両半球に組換えα－Ｓｙｎフィブリル（１ｍｇ／ｍｌの１μｌ）を定位的に注入した（座標：ブレグマに対して＋０．２ｍｍ、正中線から＋２．０ｍｍ）。出生後１０ヵ月の動物を供した。ＣＭ３０５０Ｓクライオスタット（Ｌｅｉｃａ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、フィブリル注入領域を含む凍結脳切片を得た。切片を、マウスモノクローナル抗体ｐＳｙｎ＃６４（希釈、１：１０００、和光純薬工業株式会社）と、続いてＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８標識二次抗体（希釈液、１：１０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と共にインキュベートし、検出を行った。Ｂｉｏｒｅｖｏ　ＢＺ－９０００（株式会社キーエンス）で画像を取得し、定量化した。
　（１７）細胞培養
　ＲＰＥ－１細胞を、６ウェル当たり５．０×１０４個の密度で播種した。１日後、ルシフェラーゼおよびＭｏｎｄｏＡ（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社）に対し、２０ｎＭのｓｉＲＮＡで細胞を処理した。４８時間に渡るｓｉＲＮＡ処理の後、ＲＰＥ１細胞をサンプル緩衝液中で溶解し、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングに供した。Ｒｕｂｉｃｏｎの蛋白質レベルをウエスタンブロッティングによって定量化した。ｓｉＲＮＡ処理の１日前に、ＲＰＥ－１細胞を、６ウェル当たり５．０×１０４個の密度で播種した。
　（１８）統計分析
　結果は、標本平均±標準誤差として示した。統計的検定は、ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）またはＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｏｆｆｉｃｅ　２０１１）を用いたＴｕｋｅｙの検定またはｔ検定による一元または二元配置分散分析を通じて行った。
　（１９）ＴＲＡＰ染色
　骨髄細胞を２４ウェルプレートに培養し、Ｍ－ＣＳＦとＲＡＮＫＬを添加することで破骨細胞へ誘導した。４％　ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで５分間固定し蒸留水でｗａｓｈ後、５０ｍＭ酒石酸含有緩衝液（Ｐｈ５．０）と発色気質を加え３７℃で４５分間反応させた。ＴＲＡＰ活性による染色はＢＺ－Ｘ７００（Ｋｅｙｅｎｃｅ）で検鏡観察した。
　（２０）Ｐｉｔ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ
　オステオアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ　＃３９８８）に骨髄細胞を培養し、Ｍ－ＣＳＦとＲＡＮＫＬを添加することで破骨細胞へ誘導。破骨細胞が骨基質を溶解することで吸収窩（Ｐｉｔ）が形成され、ＢＺ－Ｘ７００（Ｋｅｙｅｎｃｅ）で検鏡観察した。
　（２１）ＡＬＰ染色
　初代培養系では１２ウェルプレート、培養細胞系では９６ウェルプレートにおいて骨分化培地で５日間細胞培養した。骨分化培地はαＭＥＭ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ　ｗｉｔｈ　１０％　ＦＢＳ，　５０μｇ／ｍｌ　Ｌ－ａｓｃｏｒｂａｔｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｓｈｉｇｍａ），　１０ｍＭ　β－ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｓｈｉｇｍａ）で作成した。４％　ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（ｉｎ　０．１Ｍ　ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ　；　ｐＨ　７．３）で３０分固定し、Ｂｒｏｍｏ－Ｃｈｌｏｒｏ－Ｉｎｄｏｌｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ／Ｎｉｔｒｏ　Ｂｌｕｅ　Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅを添加し３７℃で２０分間染色後、ＢＺ－Ｘ７００（Ｋｅｙｅｎｃｅ）で検鏡観察した。
　（２２）アリザリン染色
　初代培養系では１２ウェルプレート、培養細胞系では９６ウェルプレートにおいて骨分化培地で４週間細胞培養した。骨分化培地はαＭＥＭ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ　ｗｉｔｈ　１０％　ＦＢＳ，　５０μｇ／ｍｌ　Ｌ－ａｓｃｏｒｂａｔｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｓｈｉｇｍａ），　１０ｍＭ　β－ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｓｈｉｇｍａ）で作成した。骨分化培地は２日毎に培地交換し、４％　ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（ｉｎ　０．１Ｍ　ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ　；　ｐＨ　７．３）で３０分固定した。０．１Ｍ　ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ　７．３）でｗａｓｈし、Ａｌｉｚａｒｉｎ　Ｒｅｄ　Ｓ（ｐＨ　４．０）で５分間染色後、蒸留水で再度ｗａｓｈした。ウェルを乾燥させ、ＢＺ－Ｘ７００（Ｋｅｙｅｎｃｎｅ）で検鏡観察した。
　（２３）Ｂｏｎｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ
　Ｃ５７ＢＬ／６　バックグラウンドの１２週齢のオスマウスを解析に使用した。ただし、骨粗鬆症モデルにおいては９週齢のメスマウスから卵巣を摘出し、４週間後に骨形態を計測した。骨形態はマウスの大腿骨遠位端をＣＴスキャンした（小・中型実験動物用３ＤマイクロＸ線ＣＴ／ＣｏｓｍｏＳｃａｎ　ＡＸ；Ｒｉｇａｋｕ）。その後、３ＤマイクロＣＴデータをＴＲＩ／３Ｄ－ＢＯＮソフトウェア（ＲＡＴＯＣ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）で解析し骨形態解析を行なった。
　［実施例］
　（１）Ｒｕｂｉｃｏｎによるオートファジーの調節を介した寿命の制御
　Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＲｕｂｉｃｏｎ相同体を探索し、Ｙ５６Ａ３Ａ．１６が、ヒトＲｕｂｉｃｏｎ（ＫＩＡＡ０２２６）、ヒトＫＩＡＡ０２２６Ｌ（最近、Ｐａｃｅｒと同定）（Ｃｈｅｎｇ，　Ｘ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　６５，　１０２９－１０４３　（２０１７））、およびショウジョウバエＲｕｂｉｃｏｎ（ｄＲｕｂｉｃｏｎ、ＣＧ１２７７２）（Ｂａｎｒｅｔｉ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｄｅｖ　Ｃｅｌｌ　２８，　５６－６９　（２０１４））との配列類似性を有することを見出した（図５Ａ）。
　哺乳類においては、Ｒｕｂｉｃｏｎはオートファジーを阻害するが、Ｐａｃｅｒはオートファジーを正常進行させるのに必要とされる。そこで、次に、これら２つの蛋白質のどちらが、よりＹ５６Ａ３Ａ．１６に機能的に類似しているかの検討を行った。Ｒｕｂｉｃｏｎノックダウン哺乳類細胞においてこれまでに観察されたように（非特許文献６）、ＲＮＡｉによるＹ５６Ａ３Ａ．１６のノックダウンにより、オートファゴソームマーカーであるＧＦＰ：：ＬＧＧ－１ドットの数が腸細胞において大きく増加した（図１Ａ（ｉ）,（ｂ））。この増加は、自食小胞核形成において機能するｂｅｃ－１／Ｂｅｃｌｉｎ　１の同時ノックダウンによって完全に消滅した。この事実は、Ｙ５６Ａ３Ａ．１６のノックダウンにより自食液胞が増加したことを示唆している（図１Ａ（ｉ），（ｉｉ））。
　Ｙ５６Ａ３Ａ．１６のノックダウンがオートファジー活性を増強するかブロックするかをさらに判別するために、タンデム蛍光ＬＧＧ－１（ｍＣｈｅｒｒｙ：：ＧＦＰ：：ＬＧＧ－１）を発現する最近開発されたトランスジェニックワームを用いて、オートファジーフラックスをモニタした（非特許文献１）。Ｙ５６Ａ３Ａ．１６のノックダウンにより、腸および咽頭筋におけるオートファゴソーム（ＡＰ）およびオートリソソーム（ＡＬ）の数が大きく増加することが認められた（図１Ｂ（ｉ），（ｉｉ）、図５Ｂ（ｉ），（ｉｉ））。これはオートファジーフラックスがノックダウンにより向上すること示している。ゼブラフィッシュとショウジョウバエにＲｕｂｉｃｏｎ相同体が１つしかないという事実と合わせると（図５Ａ）（Ｂａｎｒｅｔｉ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｄｅｖ　Ｃｅｌｌ　２８，　５６－６９　（２０１４））、この結果は、Ｙ５６Ａ３Ａ．１６がＲｕｂｉｃｏｎの先祖相同体を表していることを意味する（従って、Ｙ５６Ａ３Ａ．１６を「ＣｅＲｕｂｉｃｏｎ」と称する）。興味深いことに、ＣｅＲｕｂｉｃｏｎ：：ＥＧＦＰトランスジェニックワームおよびｑＲＴ－ＰＣＲ分析を用いた遺伝子発現実験により、ＣｅＲｕｂｉｃｏｎが若いワーム（１日目）と比較して古いワーム（７日目）においてアップレギュレートされるいることが判明した（図１Ｃ（ｉ），（ｉｉ））。これらの結果から、オートファジーの負の制御因子であるＲｕｂｉｃｏｎが年齢に依存して増加することが、オートファジーが年齢に依存して弱まる原因となり得るという仮説を導いた。そして、この考えの通り、ＲＮＡｉによるＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンは、野生型ワームの寿命を大きく延ばした（図１Ｄ（ｉ），（ｉｉ）、図５Ｃ（ｉ））。ＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンは、咽頭ポンピング速度を変化させず、ＲＮＡｉを含む細菌が適切に取り込まれることを示している（図６Ｂ（ｉ））。Ｒｕｂｉｃｏｎ転写レベルは、これらの動物において正常レベルの約５０％にまで低下した（図５Ｃ（ｉｉ））。
　哺乳類細胞では、Ｒｕｂｉｃｏｎはオートファジーとエンドサイトーシスの両方を抑制することが示されているが、オートファジー制御因子であるｂｅｃ－１／Ｂｅｃｌｉｎ　１、ｕｎｃ－５１／ＵＬＫ１、およびａｔｇ－１８／ＡＴＧ１８をＣｅＲｕｂｉｃｏｎと共にＲＮＡｉによりノックダウンすると、寿命の増加は完全に消滅した（図１Ｄ（ｉ），（ｉｉ）、図５Ｃ（ｉ））。これは、ＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンによって付与された寿命の向上がオートファジー活性に依存することを示す。反対に、ＣｅＲｕｂｉｃｏｎの過剰発現により野生型ワームの寿命が短くなった（図１Ｅ（ｉ），（ｉｉ））。
　以上の結果は、ＣｅＲｕｂｉｃｏｎが、オートファジー活性を調節することによって、寿命を制御することを示唆する。
　（２）全身Ｒｕｂｉｃｏｎノックダウンによる年齢に依存した表現型の改善
　Ｒｕｂｉｃｏｎのノックダウンが他の年齢発症表現型に影響を与えるか否かを検討した。体壁筋中でポリグルタミン（ｐｏｌｙＱ）－ＹＦＰを発現するワームは、ｐｏｌｙＱ融合蛋白質の年齢発症凝集を示す（Ｍｏｒｌｅｙ，　Ｊ．　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９９，　１０４１７－１０４２２９　（２００２））。ＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンは凝集のレベルを低下させたが、ｂｅｃ－１／Ｂｅｃｌｉｎ　１の同時ノックダウンは減少を戻した。これはＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンが、オートファジー依存的にｐｏｌｙＱ融合蛋白質の凝集を減少させることを示している（図２Ａ，図２Ｂ（ｉ））。
　運動量は年齢と共に低下し、速度は寿命とよく相関している（Ｈａｈｍ，　Ｊ．　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　６，　ｄｏｉ：ＡＲＴＮ　８９１９）。マルチワームトラッキングシステムにより、個々のワームのトラックをモニタし、運動速度を計算することができた（Ｓｗｉｅｒｃｚｅｋ，　Ｎ．　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　８，　５９２－５９８　（２０１１））。この分析により、ＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンが、オートファジー依存的に運動量の年齢に依存した低下を減速させることが明らかになった（図２Ｂ（ｉｉ）、図６Ａ）。
　多くの長命動物は、酸化ストレスおよび熱ストレスを含む複数のストレスに対する耐性を示すことが多い。我々は、ＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンにより、酸化ストレス耐性がオートファジー依存的に増加することを見出した（図２Ｂ（ｉｉｉ））。他方、熱ストレス耐性は変化しない（図６Ｂ（ｉｉ））。これは、ＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンがストレス耐性に関して異なる下流アウトプットを与えることを示す。
　Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおける発見を拡張するために、Ｒｕｂｉｃｏｎノックダウンがハエの寿命も延長するか否かを検討した。その結果、ショウジョウバエＲｕｂｉｃｏｎ（ｄＲｕｂｉｃｏｎ）の全体ノックダウンは、脳内のオートファジーフラックスを大きく増加させ、雌特異的に寿命を延長した（図２Ｃ、図６Ｃ（ｉ），（ｉｉ），Ｄ（ｉ））。特にｄＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンにより、ＭＪＤｔｒ－Ｑ７８（膨張グルタミン管を含むＭＪＤ／ＳＣＡ３の短縮型）ｐｏｌｙＱ疾患モデル雌ハエにおける複眼の変性が改善された（図２Ｄ（ｉ），（ｉｉ））。ｍＴＯＲキナーゼ処理の阻害剤であるラパマイシンは、雄マウスよりも雌マウスで多く増加する。したがって、この観察は、動物の寿命に対するオートファジーの性的二型の寄与を反映している可能性がある。
　Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓと同様、腎臓および肝臓におけるＲｕｂｉｃｏｎ蛋白質レベルが、高齢マウス（２０ヶ月齢）において、若年マウス（２ヶ月）よりも高いことを見出した（図２Ｅ（ｉ），（ｉｉ）、図６Ｄ（ｉｉ））。マウスにおける動物老化に関するＲｕｂｉｃｏｎの役割を理解するために、ＬＣ３－ＩＩのレベルが高く、且つ、オートファジー基質ｐ６２のレベルが低い、つまり基礎的なオートファジーが活性化したＲｕｂｉｃｏｎ全体ノックアウトマウスを開発した（図２Ｆ（ｉ））。進行性線維症は、腎臓老化の組織学的特徴である（Ｙａｍａｍｏｔｏ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｕｔｏｐｈａｇｙ　１２，　８０１－８１３　（２０１６））。Ｒｕｂｉｃｏｎ全体ノックアウトマウスにおいては、コラーゲンＩの免疫組織化学によって決定されるように、年齢関連線維症が減少していた（図２Ｆ（ｉｉ），図２Ｇ（ｉ））。この表現型は、線維性マーカーをコードするｍＲＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲ検出によって確認された（図２Ｇ（ｉｉ））。要するに、Ｒｕｂｉｃｏｎのノックダウンまたは欠失により、ワーム、ハエ、およびマウスにおける年齢関連表現型が改善された。
　（３）ニューロンにおけるＲｕｂｉｃｏｎレベルの低下による老化の遅延
　どの組織のＣｅＲｕｂｉｃｏｎが、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの寿命制御を担っているかを検討した。ＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウン用に、ＴＵ３４０１（ニューロン特異的、ｓｉｄ－１系を使用）（Ｃａｌｉｘｔｏ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　７，　５５４－Ｕ１０２　（２０１０））、ＮＲ３５０（筋肉）、ＶＰ３０３（腸）、およびＮＲ２２２（皮下組織）を含む組織特異的なＲＮＡｉ感受性株を使用した（図３Ａ（ｉ）、図７Ａ（ｉ）～（ｉｉｉ））（Ｑａｄｏｔａ，　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ　４００，　１６６－１７３　（２００７））。神経細胞におけるＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンが寿命を最も効率的に延ばした（図３Ａ（ｉ））。一方、ＣｅＲｕｂｉｃｏｎの皮下組織および腸ノックダウンがそれよりも低い程度ではあるが大きく寿命を延ばした（図７Ａ（ｉ）～（ｉｉｉ））。神経細胞は、通常、ＲＮＡｉノックダウンに耐性があるため、野生型ワームのＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンによって付与される寿命延長は、皮下組織、腸、および他の未同定組織からの組み合わせ効果を反映している可能性がある（図１Ｄ（ｉ），（ｉｉ）、図５Ｃ（ｉ））。
　次に、ＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンによるニューロンのオートファジー作用の増加が、動物の寿命を延ばすのに十分であるか否かを検討した。その結果、神経細胞におけるＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンによって付与された寿命向上は、ａｔｇ－１８／ＷＩＰＩの同時ノックダウンによって完全に消滅した（図７Ｂ（ｉ））。これは、オートファジーのニューロン活性化が寿命を延ばすのに十分であることを示唆する。同様に、ショウジョウバエのＲｕｂｉｃｏｎのニューロン特異的ノックダウンもまた、雌ハエの寿命を延長する（図３Ａ（ｉｉ）、図７Ｂ（ｉｉ））。さらに、Ｒｕｂｉｃｏｎノックダウンは、雌の脳ニューロンにおいてｐｏｌｙＱ封入体を減少させ（図３Ｂ（ｉ），（ｉｉ））、ｐｏｌｙＱ細胞毒性によって加速される運動機能の年齢関連低下を和らげることを見出した（図３Ｂ（ｉｉｉ））。
　オートファジーは、パーキンソン病を含む幾つかの老化に伴う神経変性障害に関与している。散発性および家族性のパーキンソン病では、影響を受けたニューロンはα－シヌクレイン（α－Ｓｙｎ）を含む封入体を発現する。上昇したこの蛋白質の量は、パーキンソン病を引き起こすのに十分である。α－Ｓｙｎが過剰発現し、且つ、ミスフォールドした凝集し易い形態は、オートファジーによって分解される。従って、ニューロンにおけるＲｕｂｉｃｏｎの欠失によるオートファジーの強制活性化が、脳におけるα－Ｓｙｎの凝集を防止するのに十分であるかどうかを検討した。この可能性を探るため、これまでに報告されているように（Ｌｕｋ，　Ｋ．　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　３３８，　９４９－９５３　（２０１２）、Ｗａｔａｎａｂｅ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｕｔｏｐｈａｇｙ　１３，　１３３－１４８　（２０１７））、対照およびＲｕｂｉｃｏｎニューロン（Ｎｅｓｔｉｎ－ｃｒｅ）ノックアウトマウスの線条体に予備形成したα－Ｓｙｎフィブリルを注入し、１０ヶ月後、レビー小体およびレビー神経突起状α－Ｓｙｎ封入体の形成を比較した。注目すべきことに、リン酸化α－Ｓｙｎ陽性シグナルのレベルは、ニューロン特異的Ｒｕｂｉｃｏｎノックアウトマウスにおいて大きく減少し（図３Ｃ（ｉ），（ｉｉ））、これはニューロンＲｕｂｉｃｏｎ欠失がα－シヌクレイン病変の拡大を抑制したことを示唆している。これらの結果は、ニューロンのノックダウンは多数の生物における老化表現型を改善するのに十分であることを示唆する。
　（４）複数の寿命延長条件におけるＲｕｂｉｃｏｎのダウンレギュレーション
　Ｒｕｂｉｃｏｎの発現が、複数の寿命延長条件によって変更されるか否かを検討した。ワームでは、複数の異なる長命経路および対応する長命変異体がよく特徴づけられている。これらには、インスリン／ＩＧＦ－１シグナル伝達（ｄａｆ－２）、生殖細胞系列の除去（ｇｌｐ－１）、カロリー制限（ｅａｔ－２）およびミトコンドリア機能障害（ｉｓｐ－１）の減少が含まれる（Ｋｅｎｙｏｎ，　Ｃ．　Ｊ．　Ｎａｔｕｒｅ　４６４，　５０４－５１２　（２０１０））。ＣｅＲｕｂｉｃｏｎ発現は、野生型と比較して、これらの長命ワームの全てにおいて抑制された（図４Ａ（ｉ）、図８Ｂ（ｉｉ））。さらに、９カ月間のカロリー制限を受けたマウスは、肝臓および腎臓におけるＲｕｂｉｃｏｎ発現の低下を示した（図４Ａ（ｉｉ）、図８Ｂ（ｉ））。また、ＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンは、ｄａｆ－２、ｇｌｐ－１、ｅａｔ－２およびｉｓｐ－１の寿命をそれ以上延長しないことを見出した（図８Ａ（ｉ）～（ｉｖ））。この結果は、Ｒｕｂｉｃｏｎが多数の寿命パラダイムの下流で制御され、これらの動物の寿命がＲｕｂｉｃｏｎ発現の減少によって部分的に付与されることを示している。
　ワームにおいて、ＭＭＬ－１／Ｍｏｎｄｏは、多数の長命経路に必須の収束転写因子の１つとして同定されている（Ｎａｋａｍｕｒａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ　Ｃｏｍｍｕｎ　７，　１０９４４　（２０１６）、Ｊｏｈｎｓｏｎ，　Ｄ．　Ｗ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｌｏｓ　Ｇｅｎｅｔ　１０　（２０１４））。特に、ｍｍｌ－１のノックダウンは、生殖細胞系列が欠損した長命ｇｌｐ－１動物のオートファジー活性および寿命を消滅させる。しかし、どのようにｍｍｌ－１がオートファジーを制御するかは、完全には特徴付けられていない。そこで、ＣｅＲｕｂｉｃｏｎの制御に、ｍｍｌ－１が関与するか否かを検討した。興味深いことに、他の長命動物においてＣｅＲｕｂｉｃｏｎが依然として大きく抑制されはいるが（図８Ｂ（ｉｉ））、ｇｌｐ－１動物におけるＣｅＲｕｂｉｃｏｎの抑制は、ｍｍｌ－１またはそのヘテロ二量体パートナーであるｍｘｌ－２のノックダウン後に完全に戻った（図４Ｂ（ｉ））。さらに、緩やかな寿命の延長をもたらすｍｍｌ－１の過剰発現（上記、Ｎａｋａｍｕｒａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．）は、野生型と比較してＣｅＲｕｂｉｃｏｎ発現を減少させた（図４Ｂ（ｉｉ））。また、Ｒｕｂｉｃｏｎの転写レベルは変化しなかったものの、ＭＭＬ－１の哺乳動物相同体であるＭｏｎｄｏＡのノックダウンにより、哺乳類細胞におけるＲｕｂｉｃｏｎ蛋白質レベルは上昇した（図４Ｃ（ｉ），（ｉｉ））。これらの結果は、Ｒｕｂｉｃｏｎが、特に、生殖細胞系列寿命の文脈においてＭＭＬ－１／ＭｏｎｄｏＡの下流に制御されることを示しており、この制御は哺乳動物において保存されていると考えられる。
　栄養素センサーｍＴＯＲは栄養素の欠乏に応じて不活性化される。またｍＴＯＲの阻害はオートファジーを誘導し、多数の種の寿命を延長する（Ｋａｐａｈｉ，　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｔａｂ　１１，　４５３－４６５　（２０１０））。加えて、ＭＭＬ－１は、ロイシンセンサーｌａｒｓ－１を抑制することによってＴＯＲ活性を制御する（上記、Ｎａｋａｍｕｒａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．）。そこで、ＲｕｂｉｃｏｎとｍＴＯＲ経路との間の可能なクロストークを検討した。その結果、驚くべきことに、ＣｅＲｕｂｉｃｏｎおよびｌｅｔ－３６３／ｍＴＯＲの二重ノックダウンが、いずれか一方のみのノックダウンと比較して、さらに寿命を延長することが判明した（図４Ｄ）。ＣｅＲｕｂｉｃｏｎのノックダウンはＴＯＲ活性に影響を及ぼさないが、ＴＯＲノックダウンはＣｅＲｕｂｉｃｏｎ発現を変化させない（図８Ｃ（ｉ），（ｉｉ））。これらの結果は、オートファジーの２つの主要な負の制御因子であるＴＯＲおよびＲｕｂｉｃｏｎが、部分的に独立した下流機構を介して寿命に寄与することを示す。
　（５）Ｒｕｂｉｃｏｎによるオートファジーを介した骨代謝の調節
　全身のＲｕｂｉｃｏｎ欠損マウスの大腿骨をＣＴで撮影したところ、Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損マウスでは大腿骨の骨密度（ＢＭＤ）、骨体積/骨組織体積比（ＢＶ／ＴＶ）、骨塩量（ＢＭＣ）が有意に上昇した（図９Ａ）。そこで、破骨細胞と骨芽細胞の初代培養系を作成し、それぞれの分化能と機能を評価した。破骨細胞の分化はＴＲＡＰ染色で評価し、Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損破骨細胞では分化が亢進していた（図９Ｂ）。また、破骨細胞の骨吸収機能をピットフォーメーションアッセイで評価したところ、Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損骨芽細胞では骨吸収機能が亢進していた（図９Ｃ）。次に、骨芽細胞の分化能とミネラル化機能を初代培養系及び培養細胞系で検討した。培養細胞系におけるＲｕｂｉｃｏｎ欠損細胞は、Ｃｒｉｓｐｅｒ－Ｃａｓ９　ｓｙｓｔｅｍで作成している。分化能をＡＬＰ染色で評価したところ、Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損骨芽細胞では分化能が優位に上昇していた（図９Ｄ）。また、ミネラル化機能をアリザリン染色で評価したところ、Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損骨芽細胞ではミネラル化機能が亢進していた（図９Ｅ）。全身のＲｕｂｉｃｏｎ　ＫＯマウスでは、破骨細胞と骨芽細胞はともに、分化能および機能が亢進しているが、Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損マウスにおいては大腿骨の骨形態が増強していることから、骨芽細胞の機能がより重要であると推測された。また、Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損骨芽細胞においてオートファジーが亢進しているかどうかをＬＣ３ｆｌｕｘアッセイで確認した。その結果、Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損骨芽細胞は、栄養条件下、飢餓条件下の両方においてＬＣ３　ｆｌｕｘが亢進した（図１０）。
　骨芽細胞特異的マウス作成にあたり、Ｏｓｔｅｒｉｘ－ｃｒｅマウスとＲｕｂｉｃｏｎｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスを掛け合わせ、Ｒｕｂｉｃｏｎｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｏｓｔｅｒｉｘ－Ｃｒｅマウスを作成した。同時に、Ｏｓｔｅｒｉｘ－ｃｒｅマウスを、Ａｔｇ５ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスおよびＲｕｂｉｃｏｎｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ａｔｇ５ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスとも掛け合わせ、骨芽細胞特異的Ａｔｇ５欠損マウスとＲｕｂｉｃｏｎ／Ａｔｇ５欠損マウスを作成し、骨形態をＣＴ解析した。その結果、骨芽細胞特異的Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損マウスでは、骨密度が優位に増加した。一方で、骨芽細胞特異的Ａｔｇ７欠損マウスでは、骨密度が低下すると報告されているが（Ｌｉ，　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｕｔｏｐｈａｇｙ　１４（１０），　１７２６－１７４１　（２０１８））、本実験でも、Ａｔｇ５欠損マウスでは優位に骨密度が低下した。加えて、Ｒｕｂｉｃｏｎ／Ａｔｇ５欠損マウスでは、骨密度がＡｔｇ５欠損マウスと同等に低下した（図１１Ａ）。この事実は、骨芽細胞特異的Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損マウスにおける骨形成が、オートファジー依存的に起こっていることを示している。
　本実施例では、骨芽細胞特異的Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損マウスが造骨性の変化を示したが、これが骨粗鬆症改善に寄与するのか骨粗鬆症モデルを作成して検討した。骨粗鬆症モデルとしては、両側卵巣を摘出して、４週間、女性ホルモンを枯渇させることによって作成した閉経後骨粗鬆症モデルを用いた。その結果、シャムマウスでは、骨粗鬆症が誘導され、骨密度が低下し、骨体積/骨組織体積比も低下したのに対して、Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損マウスでは骨粗鬆症モデルにおいて骨密度と骨体積/骨組織体積比が優位に改善した（図１１Ｂ）。
　Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損マウスにおいてオートファジー依存的に造骨性変化が認められ、Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損骨芽細胞では、オートファジー、分化、及び造骨性機能が亢進していた。この事実から、骨芽細胞の分化にオートファジーが関与していることが示唆された。これまで骨芽細胞の分化には、ｗｎｔ、ＢＭＰ、あるいはＮｏｔｃｈのシグナル経路が関与していることが知られているがＺａｎｏｔｔｉ，　Ｓ．　＆　Ｃａｎａｌｉｓ，　Ｅ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　３０（４），　８８６－８９６　（２０１０）、Ｍｕｇｕｒｕｍａ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，　２３２（９），　２５６９－２５８０　（２０１７））、本実施例では、Ｎｏｔｃｈのシグナル経路に注目した。なぜなら、骨芽細胞特異的Ｎｏｔｃｈ２欠損マウス（Ｎｏｔｃｈは１～４までアイソフォームがあり、骨芽細胞にはＮｏｔｃｈ２が高発現している）は、造骨性の変化を示し、骨芽細胞の分化と機能も亢進することや、Ｎｏｔｃｈレセプターがオートファジー依存性に減少することが既に報告されていたからである（Ｙｏｒｇａｎ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｏｎｅ　８７（Ｃ），　１３６－１４６　（２０１６）、Ｗｕ，　Ｘ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　７，　１－１７　（２０１６）、Ｃａｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　２４（２２），　２６６０－２６７３　（２０１５））。既報において、骨芽細胞のＮｏｔｃｈ２欠損マウスが造骨性変化を示すメカニズムは以下のように報告されている。すなわち、Ｎｏｔｃｈ２レセプター欠損により核内移行するＮＩＣＤが低下し、Ｎｏｔｃｈ下流の転写因子が抑制される。Ｎｏｔｃｈ下流のＨｅｓやＨｅｙは、造骨性の転写因子であるＲｕｎｘ２やＯｓｔｅｒｉｘを負に制御しているため、ＨｅｓやＨｅｙが減少することによりＲｕｎｘ２やＯｓｔｅｒｉｘなどの造骨性転写因子が増加し、骨芽細胞の分化能と骨形成機能が亢進する。そこで、本発明者は、Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損骨芽細胞では、亢進したオートファジーによりＮｏｔｃｈレセプターの分解が促進することで、Ｎｏｔｃｈ下流のＨｅｓやＨｅｙが減少し、さらにＲｕｎｘ２やＯｓｔｅｒｉｘが増加していると予想した。そこで、まず、Ｎｏｔｃｈ下流の転写因子と造骨性転写因子のｍＲＮＡの発現を確認したところ、Ｎｏｔｃｈ下流のＨｅｙ１、ＨｅｙＬ、Ｈｅｓ１、Ｈｅｓ３、Ｈｅｓ７では、Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損骨芽細胞でｍＲＮＡの発現が低下し、Ｒｕｎｘ２やＯｓｔｅｏｃａｌｓｉｎなど造骨性転写因子では、ｍＲＮＡの発現が増加していることが判明した（図１２Ａ）。さらに、Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損骨芽細胞でＮｏｔｃｈ２とＮＩＣＤが分解されているかを、ウェスタンブロッティングで観察したところ、リソソーム阻害によるＮｏｔｃｈ２とＮＩＣＤのｆｌｕｘがＲｕｂｉｃｏｎ欠損骨芽細胞で増加し、Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損細胞では、よりＮｏｔｃｈ２とＮＩＣＤが分解されていることが示唆された（図１２Ｂ）。
　Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損骨芽細胞では、ＮｏｔｃｈレセプターとＮＩＣＤの分解が亢進していたが、Ｒｕｂｉｃｏｎの下流でＮＩＣＤが機能しているか不明であった。そこで、Ｒｕｂｉｃｏｎ欠損骨芽細胞にＮＩＣＤを過剰発現させ、その分化能をＡＬＰ染色で評価したところ、野生型骨芽細胞と同等に分化が抑制された。この事実から、Ｒｕｂｉｃｏｎの下流でＮＩＣＤが制御されていることが判明した（図１３Ａ）。ＮＩＣＤには２箇所のＬＩＲモチーフがあるため、オートファジーの基質になっている可能性が考えられた。そこで、Ｆｌａｇタグを付加したＮＩＣＤを用い、免疫沈降法によりＮＩＣＤとＬＣ３の結合を確認した。Ｆｌａｇで免疫沈降して、ＬＣ３をイムノブロッティングにより検出した結果、ＬＣ３とＮＩＣＤが直接結合していることが判明した（図１３Ｂ）。
　以上説明したように、本発明によれば、Ｒｕｂｉｃｏｎを標的として、オートファジーの経時的な減弱に伴う老化を抑制し、加齢性の疾患または症状を幅広く、予防、改善、または治療することや寿命を延長することが可能となる。また、Ｒｕｂｉｃｏｎを標的として、老化の程度、これら疾患または症状の発症のリスク、あるいは寿命の短縮のリスクを検査することも可能となる。従って、本発明は、特に、医療分野に大きく貢献しうるものである。

Claims (11)

  1. 　Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の機能を抑制する分子を有効成分とする、対象における老化の抑制、加齢性の疾患もしくは症状の予防、改善、もしくは治療、または寿命の延長のための組成物。
  2. 　Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の機能を抑制する分子が、下記（ａ）～（ｃ）のいずれか１に記載の分子である、請求項１に記載の組成物
    （ａ）Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡまたは該ＲＮＡをコードするＤＮＡ
    （ｂ）Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質に結合するＲＮＡまたはＤＮＡ
    （ｃ）Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質に結合する抗体
  3. 　加齢性の疾患もしくは症状が、代謝性骨疾患もしくはその症状、ストレス耐性の向上、または臓器の線維化である、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 　対象が脊椎動物である、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
  5. 　被検化合物が、対象における老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
    　被検化合物とＲｕｂｉｃｏｎタンパク質とを接触させる工程、および
    　被検化合物とＲｕｂｉｃｏｎタンパク質との結合を検出する工程、
    を含み、
    　被検化合物がＲｕｂｉｃｏｎタンパク質と結合する場合、老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性があると評価される方法。
  6. 　被検化合物が、対象における老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
    　Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程、および
    　該細胞内におけるＲｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現を検出する工程、
    を含み、
    　被検化合物を接触させない場合と比較して、被検化合物がＲｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現を減少させる場合、老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性があると評価される方法。
  7. 　被検化合物が、対象における老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
    　Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子のプロモータ－領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞に、被検化合物を接触させる工程、および
    　該細胞内における前記レポーター遺伝子の発現を検出する工程、
    を含み、
    　被検化合物を接触させない場合と比較して、被検化合物が前記レポーター遺伝子の発現を減少させる場合、老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性があると評価される方法。
  8. 　対象における老化の程度、加齢性の疾患もしくは症状の発症のリスク、または寿命の短縮のリスクを検査する方法であって、
    　被検試料におけるＲｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現産物を検出する工程を含み、
    　Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現産物の量が対照と比較して高い場合に、老化の程度、加齢性の疾患もしくは症状の発症のリスク、または寿命の短縮のリスクが高いと評価される方法。
  9. 　加齢性の疾患もしくは症状が、代謝性骨疾患もしくはその症状、ストレス耐性の向上、または臓器の線維化である、請求項５か８のいずれかに記載の方法。
  10. 　対象が脊椎動物である、請求項５から９のいずれかに記載の方法。
  11. 　請求項８から１０のいずれかに記載の方法において、Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の発現産物を検出するための組成物であって、下記（ａ）または（ｂ）を含む組成物。
    （ａ）Ｒｕｂｉｃｏｎ遺伝子の転写産物に結合するオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブ
    （ｂ）Ｒｕｂｉｃｏｎタンパク質に結合する抗体
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