KR20160111529A

KR20160111529A - 노화 및 연령 관련 질환 및 증상의 치료를 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20160111529A
Application number: KR1020167024468A
Authority: KR
Inventors: 징 후앙; 랜달 친; 시몬 디프; 멜로디 와이 페이; 브렛 이 로메닉; 슈동 푸; 카렌 로이에; 로렌트 베르그네스; 마이클 이 정; 강 덩; 희준 황; 메이셩 지앙
Original assignee: 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 2014-02-12
Filing date: 2015-02-11
Publication date: 2016-09-26
Also published as: EP3104852A4; US20230218559A1; CN106163513A; US20190192470A1; WO2015123229A1; US20160354334A1; CN113082009A; EP3104852A1

Abstract

(a) 대상체의 노화 저해, 감소, 지연 또는 예방을 위한, (b) 대상체에서 연령 관련 질환의 치료, 저해, 감소, 또는 예방을 위한, 및/또는 (c) 대상체의 수명 증가를 위한, 대상체에 하나 이상의 글루타메이트 화합물, 예컨대 α-케토글루테이트, 및/또는 하나 이상의 글루타메이트 화합물, 예컨대 2-하이드록시펜탄디오에이트를 투여하는 단계를 포함하는 방법, 및 이들의 조성물이 본원에 개시된다.

Description

노화 및 연령 관련 질환 및 증상의 치료를 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING AGING AND AGE-RELATED DISEASES AND SYMPTOMS}

관련 출원들에 대한 교차 참조

본원은 그 전체가 참고로 본원에 편입된 2014 년 2 월 12 일에 출원된 US 61/939,092, 및 2014 년 3 월 19 일에 출원된 US 61/955,463의 이익을 청구한다.

EFS-WEB을 통해 제출된 서열목록에 대한 참조

1.74 kb 크기의 "20150211_034044_100WO1_seq_ST25"로 명명되고 2015 년 2 월 8 일에 생성되었으며 본 출원과 함께 EFS-Web을 통해 제출된 서열 목록의 ASCII 텍스트 파일 컨텐츠는 본원에 그 전체가 참고로 편입된다.

정부 지원의 인정

본 발명은 미국 국립의료원에 의해 수여된 CA124974 및 CA149774 하에 정부 지원으로 수행되었다. 정부는 본 발명에 있어서 일정 권리를 갖는다.

1. 발명의 분야

본 발명은 노화 및 연령 관련 질환의 치료에 관한 것이다.

2. 관련 기술의 설명

대사 및 노화는 밀접하게 연관된다. 자유 섭취에 비해, 식이 제한(DR) 또는 칼로리 제한(CR)은 진화적으로 다양한 유기체에서 일관되게 수명을 연장시키고 연령 관련 질환을 지연한다. 유사한 조건의 영양소 제한 및 영양소 또는 에너지 대사의 유전적 또는 약리학적 동요도 장수의 이점을 갖는다. 대부분 정의되지 않은 분자 기전을 이용하여 노화를 조정하는 몇몇 화합물이 확인되었다.

그러나 암, 당뇨병, 및 심혈관 질환을 포함하는 연령 관련 질환의 치료 및 대상체의 수명 연장을 위한 필요성이 여전히 존재한다.

발명의 요약

일부 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 ATP 합성효소의 촉매 코어의 베타 서브유닛, 예를 들면 ATP5B에 결합하는 하나 이상의 화합물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 노화 저해, 감소, 지연 또는 예방 방법에 대한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 ATP 합성효소의 활성을 저해하거나 감소시키는 하나 이상의 화합물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 노화 저해, 감소, 지연 또는 예방 방법에 대한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 ATP 합성효소의 촉매 코어의 베타 서브유닛, 예를 들면 ATP5B에 결합하고/하거나 대상체에서 ATP 합성효소의 활성을 저해하거나 감소시키는 하나 이상의 화합물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 연령-관련된 질환의 치료, 저해, 감소, 또는 예방 방법에 대한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 글루타레이트 화합물, 하나 이상의 글루타메이트 화합물, 또는 둘 모두를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 노화 저해, 감소, 지연 또는 예방 방법에 대한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 ATP 합성효소의 촉매 코어의 베타 서브유닛, 예를 들면 ATP5B에 결합하고/하거나 대상체에서 ATP 합성효소의 활성을 저해하거나 감소시키는 하나 이상의 화합물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 수명 증가 방법에 대한 것이다. 일부 구현예에서, 대상체의 수명은 미치료 대상체에 비해 최대 약 60% 또는 최대 약 70% 연장된다. 일부 구현예에서, 대상체는 동물이며, 이는 노화 또는 연령 관련 질환의 동물 모델일 수도 아닐 수도 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 선충, 설치류, 또는 비-인간 영장류이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, ATP 합성효소는 포유동물 ATP 합성효소, 인간 ATP 합성효소, 포유동물 미토콘드리아 ATP 합성효소, 또는 인간 미토콘드리아 ATP 합성효소이다.

일부 구현예에서, 대상체에 투여되는 화합물은 글루타레이트 화합물 또는 글루타메이트 화합물이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 글루타레이트 화합물 및 적어도 하나의 글루타메이트 화합물이 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체에 투여되는 화합물은 알파-케토글루타레이트(α-KG) 화합물이다. 일부 구현예에서, 대상체에 투여되는 화합물은 2-하이드록시글루타레이트(2-HG) 화합물이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 α-KG 화합물 및 적어도 하나의 2-HG 화합물이 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 화합물은 효과적인 양 또는 치료적으로 효과적인 양으로 투여된다. 일부 구현예에서, 효과적인 양 또는 치료적으로 효과적인 양의 하나 이상의 화합물은 주어진 기간에 걸친 몇몇 용량으로, 예를 들면 1 주 또는 그 초과 동안 1 일 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체에 투여되는 하나 이상의 화합물의 양은 대상체에서 α-케토글루타레이트 수준을 약 30-60%, 바람직하게는 약 45-55%, 더 바람직하게는 약 50% 증가시킨다. 일부 구현예에서, 화합물은 약 0.25-2, 바람직하게는 약 0.5-2, 더 바람직하게는 약 1-2, 가장 바람직하게는 약 2 그램/대상체 체중 킬로그램/1 일의 1 일 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체는 동물이며, 이는 노화 또는 연령 관련 질환의 동물 모델일 수도 아닐 수도 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 선충, 설치류, 또는 비-인간 영장류이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, ATP 합성효소는 포유동물 ATP 합성효소, 인간 ATP 합성효소, 포유동물 미토콘드리아 ATP 합성효소, 또는 인간 미토콘드리아 ATP 합성효소이다.

일부 구현예에서, 본 발명은 (a) 대상체의 노화 저해, 감소, 지연 또는 예방을 위한, (b) 대상체에서 연령 관련 질환의 치료, 저해, 감소, 또는 예방을 위한, 및/또는 (c) 대상체의 수명 증가를 위한 약제의 제조를 위해 ATP 합성효소의 촉매 코어의 베타 서브유닛에 결합하거나 ATP 합성효소의 활성을 저해하거나 감소시키는 적어도 하나의 화합물의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 대상체의 노화 저해, 감소, 지연 또는 예방에서; 대상체에서 연령 관련 질환의 치료, 저해, 감소, 또는 예방에서; 및/또는 대상체의 수명 증가에서 사용하기 위한 글루타레이트 화합물 또는 글루타메이트 화합물을 제공한다. 일부 구현예에서, 화합물은 글루타레이트 화합물 또는 글루타메이트 화합물이다. 일부 구현예에서, 화합물은 글루타레이트 화합물 및 글루타메이트 화합물이다. 일부 구현예에서, 화합물은 α-KG 화합물이다. 일부 구현예에서, 화합물은 2-HG 화합물이다. 일부 구현예에서, 화합물은 α-KG 화합물 및 2-HG 화합물이다. 일부 구현예에서, 화합물은 효과적인 양 또는 치료적으로 효과적인 양으로 제공된다. 일부 구현예에서, 약제는 분할 용량으로 제공된다. 일부 구현예에서, 효과적인 양 또는 치료적으로 효과적인 양은 분할 용량으로 제공된다. 일부 구현예에서, 대상체는 동물이며, 이는 노화 또는 연령-관련된 질환의 동물 모델일 수도 아닐 수도 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 선충, 설치류, 또는 비-인간 영장류이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, ATP 합성효소는 포유동물 ATP 합성효소, 인간 ATP 합성효소, 포유동물 미토콘드리아 ATP 합성효소, 또는 인간 미토콘드리아 ATP 합성효소이다.

일부 구현예에서, 본 발명은 대상체에 치료적으로 효과적인 양의 하나 이상의 글루타레이트 화합물, 하나 이상의 글루타메이트 화합물, 또는 둘 모두를 투여하는 단계를 포함하는 암에 대한 대상체의 치료 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 대상체에 투여되는 화합물은 글루타레이트 화합물 또는 글루타메이트 화합물이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 글루타레이트 화합물 및 적어도 하나의 글루타메이트 화합물이 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체에 투여되는 화합물은 알파-케토글루타레이트(α-KG) 화합물이다. 일부 구현예에서, 대상체에 투여되는 화합물은 2-하이드록시글루타레이트(2-HG) 화합물이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 α-KG 화합물 및 적어도 하나의 2-HG 화합물이 대상체에 투여된다. 암이 신경아교종인 일부 구현예에서, 대상체에는 하나 이상의 α-KG 화합물이 투여되며, 임의의 2-하이드록시글루타레이트 화합물은 투여되지 않는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 화합물은 효과적인 양 또는 치료적으로 효과적인 양으로 투여된다. 일부 구현예에서, 치료적으로 효과적인 양의 하나 이상의 화합물은 주어진 기간에 걸쳐 몇몇 용량으로, 예를 들면 1 주 또는 그 초과 동안 1 일 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체에 투여되는 하나 이상의 화합물의 양은 대상체에서 α-케토글루타레이트 수준을 약 30-60%, 바람직하게는 약 45-55%, 더 바람직하게는 약 50% 증가시킨다. 일부 구현예에서, 화합물은 약 0.25-2, 바람직하게는 약 0.5-2, 더 바람직하게는 약 1-2, 가장 바람직하게는 약 2 그램/대상체 체중 킬로그램/1 일의 1 일 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체는 동물이며, 이는 노화 또는 연령 관련 질환의 동물 모델일 수도 아닐 수도 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 선충, 설치류, 또는 비-인간 영장류이다.

일부 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 연령 관련 심장 병태의 치료, 저해, 감소, 또는 예방 방법을 제공하며, 이는 대상체에 치료적으로 효과적인 양의 하나 이상의 글루타레이트 화합물, 하나 이상의 글루타메이트 화합물, 또는 둘 모두를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 글루타레이트 화합물 및 적어도 하나의 글루타메이트 화합물이 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체에 투여되는 화합물은 알파-케토글루타레이트(α-KG) 화합물이다. 일부 구현예에서, 대상체에 투여되는 화합물은 2-하이드록시글루타레이트(2-HG) 화합물이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 α-KG 화합물 및 적어도 하나의 2-HG 화합물이 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 치료적으로 효과적인 양의 하나 이상의 화합물은 주어진 기간에 걸쳐 몇몇 용량으로, 예를 들면 1 주 또는 그 초과 동안 1 일 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체에 투여되는 하나 이상의 화합물의 양은 대상체에서 α-케토글루타레이트 수준을 약 30-60%, 바람직하게는 약 45-55%, 더 바람직하게는 약 50% 증가시킨다. 일부 구현예에서, 화합물은 약 0.25-2, 바람직하게는 약 0.5-2, 더 바람직하게는 약 1-2, 가장 바람직하게는 약 2 그램/대상체 체중 킬로그램/1 일의 1 일 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체는 동물이며, 이는 노화 또는 연령 관련 질환의 동물 모델일 수도 아닐 수도 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 선충, 설치류, 또는 비-인간 영장류이다.

전술한 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명은 모두 단지 예시적이고 설명적인 것이며 청구되는 본 발명의 추가 설명을 제공하려는 것이다. 수반되는 도면은 본 발명의 추가 이해를 제공하기 위해 포함되며, 본 명세서에 편입되어 일부를 구성하고, 본 발명의 몇몇 구현예를 예시하며, 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하는 작용을 한다.

본 발명은 도면을 참조하여 추가로 이해되며, 여기서:
도 1, 패널 a-f는 α-KG가 C. 엘레간스의 성체 수명을 연장시킴을 나타낸다.
도 2, 패널 a-i는 α-KG가 ATP 합성효소에 결합하고 이를 저해함을 나타낸다.
도 3, 패널 a-g는 α-KG 장수가 ATP 합성효소 및 DR/TOR 축을 통해 매개됨을 나타낸다.
도 4, 패널 a-e는 α-KG에 의한 ATP 합성효소의 저해가 TOR 경로 활성에서 보존된 감소를 유도함을 나타낸다.
도 5, 패널 a-h는 α-KG의 보충이 C. 엘레간스 성체 수명을 연장시키지만 박테리아의 성장률, 또는 벌레의 식품 섭취, 인두 펌핑률 또는 번식 크기를 변화시키지 않음을 나타낸다. 패널 h에서, 각각의 세트에서의 첫 번째 막대는 비히클이다.
도 6, 패널 a-h는 a-KG가 ATP 합성효소의 b 서브유닛에 결합하며 다른 ETC 복합체가 아닌 복합체 V의 활성을 저해함을 나타낸다.
도 7, 패널 a-c는 올리고마이신 처리가 C. 엘레간스 수명을 연장시키고 let-363 의존적 방식으로 자가포식을 증강시킴을 나타낸다.
도 8, 패널 a-b는 a-KG 또는 atp-2 RNAi로 처리된 벌레에서의 산화적 스트레스 분석을 나타낸다.
도 9, 패널 a-c는 aak -2, daf -16, hif -1, vhl -1 또는 egl -9의 부재 하에서 α-KG의 수명을 나타낸다.
도 10, 패널 a-f는 a-KG가 TOR 경로 활성을 감소시키지만 TOR과 직접적으로 상호작용하지 않음을 나타낸다.
도 11, 패널 a-b는 자가포식이 ogdh -1 RNAi로 처리된 C. 엘레간스에서 증강됨을 나타낸다.
도 12는 α-KG DARTS 샘플에서 농축된 단백질을 나타내는 표이다. α-KG 샘플에서 적어도 15 개 스펙트럼을 가지고 적어도 1.5 배 농축된 단백질만을 나타낸다.
도 13은 α-KG 실험으로부터의 수명 데이타를 요약하는 표이다.
도 14, 패널 A-C는 2-HG가 성체 C. 엘레간스의 수명을 연장시킴을 나타낸다.
도 15, 패널 A-D는 2-HG가 ATP 합성효소에 결합하고 이를 저해함을 나타낸다. 패널 B에서, 상부 데이타 포인트는 비히클이고, 중간 데이타 포인트는 옥틸 (R)-2-HG이고, 하부 데이타 포인트는 옥틸 (S)-2-HG이다.
도 16, 패널 A-E는 IDH1(R132H) 세포에서 ATP 합성효소의 저해를 나타낸다.
도 17A는 U87/IDH1(R132H) 세포가 글루코스 기아에 대해 증가된 민감성을 가짐을 나타낸다(^***P < 0.001). 상부 라인은 IDH1(WT)이다.
도 17B는 옥틸 α-KG 처리된 U87 세포가 글루코스 기아 시 감소된 생존력을 보임을 나타낸다(^**** P < 0.0001). 우측에서, 상부에서부터 하부까지의 라인은 0 μM, 400 μM, 및 800 μM이다.
도 17C는 옥틸 (R)-2-HG 처리된 U87 세포가 글루코스 기아 시 감소된 생존력을 보임을 나타낸다(^*** P < 0.001). 우측에서, 상부에서부터 하부까지의 라인은 0 μM, 400 μM, 및 800 μM이다.
도 17D는 옥틸 (S)-2-HG 처리된 U87 세포가 글루코스 기아 시 감소된 생존력을 보임을 나타낸다(^* P < 0.05). 우측에서, 상부에서부터 하부까지의 라인은 0 μM, 400 μM, 및 800 μM이다.
도 17E는 ATP5B 녹다운이 U87 세포 성장을 저해함을 나타낸다(^***P = 0.0004). 상부 라인은 대조군이다.
도 17F는 HCT116 IDH1(R132H/+) 세포가 (R)-3-하이드록시부티레이트로 보충된 글루코스-비함유 배지에 대해 증가된 취약성을 보임을 나타낸다(^*** P < 0.001). 페어링되지 않은 t-테스트, 2-테일화, 2 개-샘플 비균등 분산 이용. 모든 경우 평균 ± s.d.가 도시된다. 상부 라인은 IDH1(+/+)이다.
도 17G는 ATP5B 녹다운을 갖는 U87 세포가 글루코스-비함유, 갈락토스-함유 배지에서 감소된 mTOR 복합체 1 활성을 보임을 나타낸다.
도 17H는 α-KG 또는 2-HG의 막-투과성 에스테라제-가수분해성 유사체로 처리된 U87 세포가 글루코스-비함유, 갈락토스-함유 배지에서 감소된 mTOR 복합체 1 활성을 보임을 나타낸다.
도 17I는 IDH1(R132H)을 안정되게 발현하는 U87 세포가 글루코스-비함유, 갈락토스-함유 배지에서 감소된 mTOR 복합체 1 활성을 보임을 나타낸다.
도 18, 패널 A-B는 2-HG가 전자 전달 사슬에서 전자 흐름에 영향을 미치지 않으며 ADP 내수송에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 패널 A에서, 상부 데이타 포인트는 비히클이며, 중간 데이타 포인트는 옥틸 (R)-2-HG이고, 하부 데이타 포인트는 옥틸 (S)-2-HG이다.
도 19, 패널 A-C는 2-HG가 세포 호흡을 저해함을 나타낸다.
도 20, 패널 A-D는 2-HG 축적된 세포의 세포 에너지 및 대사 프로파일을 나타낸다. 패널 C 및 D에서, 각각의 세트에서의 첫 번째 막대는 비히클이다.
도 21, 패널 A-B는 HCT116 IDH1(R132H/+) 세포가 대사 취약성 및 성장 저해를 보임을 나타낸다. 패널 A에서, ^**는 IDH1(R132H/+)이며; 패널 B에서, ^**는 IDH1(R132H/+)이다.
도 22, 패널 A-E는 ATP5B 녹다운, 옥틸 α-KG 또는 옥틸 2-HG의 처리, 또는 IDH1(R132H) 돌연변이 시의 세포 성장 저해를 나타낸다. 패널 A에서, ^*는 ATP5b siRNA이며; 패널 B에서, ^***는 400 μM이고 ^****는 800 μM이며; 패널 C에서, ^***는 400 μM이고 ^**는 800 μM이며; 패널 D에서, ^***는 400 μM이고 ^**는 800 μM이며; 패널 E에서, ^**는 IDH1(R132H)이다.
도 23은 옥틸 α-KG(200 μM)가 (이소프로테레놀)ISO-유도된 비대를 완전 폐지하였을(좌측 패널) 뿐만 아니라 ANF(심방 나트륨 이뇨 인자)(중간 패널), 및 BNP(뇌성 나트륨 이뇨 펩타이드)(우측 패널)의 ISO- 및 (페닐에프린)PE-유도된 과발현(상부 우측 패널)을 억제하였음 나타내는 그래프이다.
도 24는 α-KG-섭취 마우스(S1, S2)의 심장에서 단리된 미토콘드리아가 대조군 마우스(C1, C2)에서에 비해 더 낮은 상태 3 호흡을 보임을 나타내는 OCR 그래프이다. 상태 3u에서, 상부로부터 하부까지의 데이타 포인트는 C2, C1, S2, 및 S3이다.
도 25는 생체내 α-KG의 심장-보호 효과를 나타내는 그래프이다.
몇몇 이들 도면의 칼라 버전은 그 전체가 참고로 본원에 편입된 [Chin 등, (2014) Nature 510:397-401] 및 이에 관련된 확장된 데이타 도면에서 확인될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명은 대상체에 적어도 하나의 글루타레이트 화합물, 적어도 하나의 글루타메이트 화합물, 또는 둘 모두를 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 노화 및 연령 관련 질환의 치료 또는 저해 방법에 대한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 대상체에 적어도 하나의 글루타레이트 화합물, 적어도 하나의 글루타메이트 화합물, 또는 둘 모두를 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 수명 증가 방법에 대한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 노화 및 연령 관련 질환을 치료하거나 저해하기 위한 조성물에 대한 것이며, 상기 조성물은 적어도 하나의 글루타레이트 화합물, 적어도 하나의 글루타메이트 화합물, 또는 둘 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 대상체의 수명을 증가시키기 위한 조성물에 대한 것이며, 상기 조성물은 적어도 하나의 글루타레이트 화합물, 적어도 하나의 글루타메이트 화합물, 또는 둘 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 동물이며, 이는 노화 또는 연령 관련 질환의 동물 모델일 수도 아닐 수도 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 선충, 설치류, 또는 비-인간 영장류이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "연령 관련 질환"은 종종 노화에 관련되는 질환 및 장애를 나타내며, 암(예를 들면, 신경아교종, 백혈병, 림프종, 유방암, 전립선암, 폐암 등), 신경퇴행성 질환(예를 들면, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 치매 등), 근육감소증, 골감소증, 골다공증, 관절염, 죽상경화증, 심혈관 질환, 고혈압, 백내장, 노안, 녹내장, 2 형 당뇨병, 대사 증후군, 탈모증, 만성 염증, 면역노화, 연령 관련 시력 감퇴, 연령-관련 탈모, 가늘어짐, 및/또는 백발 등이 포함된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "연령 관련 심장 병태"는 심장 비대증, 심근병증, 심부전, 심장 비대증, 심근병증, 심부전, 및 심혈관 질환을 나타낸다.

본원에서 사용된 바와 같이, 대상체에서 "노화"를 치료하거나 저해하는 방법 및 조성물은 노화와 관련된 증상을 치료하거나 저해하는 것들이다. 노화와 관련된 증상에는 암, 콜레스테롤 축적, 동맥 벽 경직, 증가된 혈압, 면역노화, 근육 손실, 골 손실, 관절염, 골다공증, 기억 상실, 청력 손실, 시력 감퇴, 증가된 주름, 탈모/가늘어짐/백발, 감소된 스트레스 내성, 치매, 청력 손실, 시력 손실, 운동성 손실, 근육 강도 및 스태미너 손실, 허약, 피로, 감염에 대해 증가된 감수성, 건조 및/또는 주름진 피부, 및 변경된 수면 패턴 및 생물학적 주기가 포함된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "글루타레이트 화합물"은 α-KG 화합물, 2-HG 화합물, 및 하기 구조식 I을 갖는 화합물 그리고 이들의 약제학적으로 허용가능한 용매화물, 염, 전구약물, 및 대사물을 나타낸다:

[화학식 I]

여기서

Ra 및 Rb 각각은 독립적으로 음전하, H, 직쇄형 또는 분지형 C1-C10 알킬, 또는 직쇄형 또는 분지형 C1-C10 알케닐이고,

Rc는 임의로 존재하며, 존재한다면 Rc는 H, 직쇄형 또는 분지형 C1-C10 알킬, 또는 직쇄형 또는 분지형 C1-C10 알케닐이고, 부재한다면 Z는 이중 결합이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "글루타메이트 화합물"은 하기 구조식 II를 갖는 화합물 및 이들의 약제학적으로 허용가능한 용매화물, 염, 전구약물, 및 대사물을 나타낸다:

[화학식 II]

여기서

Ra 및 Rb 각각은 독립적으로 음전하, H, 직쇄형 또는 분지형 C1-C10 알킬, 또는 직쇄형 또는 분지형 C1-C10 알케닐이다. α-KG는 글루타메이트 탈수소효소를 이용해서 산화적 탈아미노화에 의해 글루타메이트로부터 보전적으로, 그리고 글루타메이트가 공통 아미노 공여체인 피리독살 포스페이트-의존적 아미노교환 반응의 생성물로서 생산될 수 있으므로, 글루타메이트는 α-KG의 전구약물이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "C1-C10 알킬"은 1-10 탄소 원자를 갖는 알킬을 나타내며, "C1-C10 알케닐"은 1-10 탄소 원자를 갖는 알케닐을 나타낸다.

본원에서 사용된 바와 같이, "α-KG 화합물"은 α-케토글루타레이트(α-케토글루타레이트), α-케토글루타레이트의 유도체(예를 들면, [MacKenzie 등(2007) Mol Cell Biol 27(9):3282-3289]에 나타낸 유도체), α-케토글루타레이트의 유사체(예를 들면, 포스포네이트 유사체(예를 들면, [Bunik 등(2005) Biochemistry 44(31): 10552-61]에 인용된 것들), α-케토글루타레이트의 에스테르(예를 들면, 디메틸 α-케토글루타레이트 및 옥틸 α-케토글루타레이트), 및 다양한 종 특이적 유사체, 예를 들면 인간 α-케토글루타레이트, 돼지 α-케토글루타레이트, 쥣과 α-케토글루타레이트, 소 α-케토글루타레이트 등을 나타낸다. 본원에서 사용된 바와 같이, 약어 "KG"가 용어 "케토글루타레이트"를 나타내기 위해 사용될 수 있으며, 예를 들면 α-케토글루타레이트는 α-KG로 약칭된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "2-HG 화합물"은 2-하이드록시글루타르산, 2-하이드록시펜탄디오에이트, 및 그것의 골격 구조의 일부로서 2-하이드록시펜탄디오에이트를 갖는 화합물을 나타내며, 1-알킬-(S)-2-하이드록시펜탄디오에이트, 1-알킬-(R)-2-하이드록시펜탄디오에이트, 1-알케닐-(S)-2-하이드록시펜탄디오에이트, 1-알케닐-(R)-2-하이드록시펜탄디오에이트, 5-알킬-(S)-2-하이드록시펜탄디오에이트, 5-알킬-(R)-2-하이드록시펜탄디오에이트, 5-알케닐-(S)-2-하이드록시펜탄디오에이트, 및 5-알케닐-(R)-2-하이드록시펜탄디오에이트가 포함되고, 여기서 알킬은 직쇄형 또는 분지형 C1-C10 알킬이고 알케닐은 직쇄형 또는 분지형 C1-C10 알케닐이다. 일부 구현예에서, 2-HG 화합물은 1-옥틸-(S)-2-하이드록시펜탄디오에이트, 1-옥틸-(R)-2-하이드록시펜탄디오에이트, 5-옥틸-(S)-2-하이드록시펜탄디오에이트, 또는 5-옥틸-(R)-2-하이드록시펜탄디오에이트이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 약어 "HG"는 용어 "하이드록시펜탄디오에이트"를 나타내기 위해 사용될 수 있으며, 예를 들면 2-하이드록시펜탄디오에이트는 2-HG로 약칭된다.

"약제학적으로 허용가능한 용매화물"은 명시된 화합물의 생물학적 유효성을 보유하는 그러한 화합물의 용매화물 형태를 나타낸다. 용매화물의 예에는 물, 이소프로판올, 에탄올, 메탄올, 디메틸 설폭사이드, 에틸 아세테이트, 아세트산, 에탄올아민, 또는 아세톤과 조합된 본 발명의 화합물이 포함된다. 유기 화학 분야의 숙련가는 많은 유기 화합물이 이들이 반응하거나 이들이 침전 또는 결정화되는 용매와 복합체를 형성할 수 있음을 인정할 것이다. 이들 복합체는 "용매화물"로 공지되어 있다. 예를 들면, 물과의 복합체는 "수화물"로 공지되어 있다. 화학식 I 및 II의 화합물의 용매화물은 본 발명의 범위 내이다. 또한 많은 유기 화합물이 1 초과의 결정 형태로 존재할 수 있음이 유기 화학 분야의 숙련가에 의해 인정될 것이다. 예를 들면, 결정 형태는 용매화물 별로 변할 수 있다. 따라서, 화학식 I 및 II의 화합물 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 용매화물의 모든 결정 형태는 본 발명의 범위 내이다.

용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 본 발명의 화합물로 치료되는 대상체에 대해 약리학적으로 허용가능하고 실질적으로 비독성인 염 형태를 나타낸다. 약제학적으로 허용가능한 염에는 적합한 비독성 유기 또는 무기산 또는 무기 염기로부터 형성된 종래의 산-부가 염 또는 염기-부가 염이 포함된다. 예시적인 산-부가 염에는 무기산, 예컨대 염화수소산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 설팜산, 인산, 및 질산에서 유도된 것들, 및 유기산, 예컨대 p-톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 에탄-디설폰산, 이세티오산, 옥살산, p-브로모페닐설폰산, 카본산, 석신산, 시트르산, 벤조산, 2-아세톡시벤조산, 아세트산, 페닐아세트산, 프로피온산, 글라이콜산, 스테아르산, 락트산, 말산, 타르타르산, 아스코르브산, 말레산, 하이드록시말레산, 글루탐산, 살리실산, 설파닐산, 및 푸마르산에서 유도된 것들이 포함된다. 예시적인 염기-부가 염에는 수산화암모늄에서 유도된 것들(예를 들면, 4 차 수산화암모늄, 예컨대 테트라메틸수산화암모늄), 무기 염기, 예컨대 알칼리 또는 알칼리토-금속(예를 들면, 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘, 또는 마그네슘) 하이드록사이드에서 유도된 것들, 및 비독성 유기 염기, 예컨대 염기성 아미노산에서 유도된 것들이 포함된다.

"약제학적으로 허용가능한 전구약물"은 생리적 조건 하에 또는 가용매분해에 의해 명시된 화합물로 또는 이러한 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염으로 전환될 수 있는 화합물이다. "약제학적 활성 대사물"은 명시된 화합물 또는 그것의 염의 체내 대사를 통해 생산된 약리학적 활성 생성물을 나타낸다. 화합물의 전구약물 및 활성 대사물은 당해분야에서 공지된 일상적인 기술을 이용해서 확인될 수 있다. 예를 들면, [Bertolini, G. 등(1997) J. Med. Chem. 40:2011-2016; Shan, D. 등, J. Pharm. Sci., 86(7):765-767; Bagshawe K.,(1995) Drug Dev. Res. 34:220-230; Bodor, N.,(1984) Advances in Drug Res. 13:224-331; Bundgaard, H., Design of Prodrugs(Elsevier Press, 1985) 및 Larsen, I. K., Design and Application of Prodrugs, Drug Design and Development(Krogsgaard-Larsen 등 eds., Harwood Academic Publishers, 1991)]을 참고하라.

일부 구현예에서, 대상체에 투여되는 글루타레이트 화합물의 양은 치료적으로 효과적인 양 또는 효과적인 양이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "효과적인 양"은 위약에 비해 관측가능한 차이를 일으키는 용량이다. "치료적으로 효과적인 양"은 대상체에 투여될 때, (i) 특정한 질환, 병태, 또는 장애를 치료하거나 저해하고, (ii) 특정한 질환, 병태, 또는 장애의 하나 이상의 증상을 약화시키거나, 완화시키거나, 제거하고, 및/또는 (iii) 대조군에 비해 특정한 질환, 병태, 또는 장애의 하나 이상의 증상의 개시를 저해하거나 지연하는 본 발명의 하나 이상의 화합물의 양을 나타낸다. 치료적으로 효과적인 양의 본 발명의 하나 이상의 화합물은 요인, 예컨대 주어진 화합물(들), 약제학적 제형, 투여 경로, 질환 또는 장애의 유형, 질환 또는 장애의 정도, 및 치료받는 대상체의 정체에 따라 변할 것이지만, 그럼에도 불구하고 당해분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들면, 글루타레이트 화합물, 글루타메이트 화합물, 또는 둘 모두의 "치료적으로 효과적인 양"은 하나 이상의 대조군 대상체에 비해 주어진 대상체의 수명을 연장시키고/시키거나 연령 관련 증상의 개시를 지연하거나 저해하는 양이다.

일부 구현예에서, 치료적으로 효과적인 양의 하나 이상의 글루타레이트 화합물 및/또는 하나 이상의 글루타메이트 화합물은 약 0.25-2, 약 0.5-2, 약 1-2, 또는 약 2 그램/대상체 체중 킬로그램/1 일의 1 일 용량으로 투여된다. 숙련가는 비제한적으로 질환 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 대상체의 일반 건강 및/또는 연령 및 존재하는 다른 질환을 포함하는 일정 요인이 대상체를 효과적으로 치료하기 위해 필요한 투여량에 영향을 미칠 수 있음을 인정할 것이다.

본 명세서에서 보여진 바와 같이, 대상체에서 α-KG 수준을 약 50% 증가시킨 용량이 수명에서 최대 증가를 일으켰다(최대 약 70%). 따라서 일부 구현예에서, 대상체에 투여되는 하나 이상의 글루타레이트 화합물 및/또는 하나 이상의 글루타메이트 화합물의 양은 대상체에서 α-KG 수준의 약 50% 증가를 일으키는 양이다.

치료적으로 효과적인 양은 일정 기간에 걸쳐 단회 용량 또는 다회 용량으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 대상체는 하나 이상의 글루타레이트 화합물 및/또는 하나 이상의 글루타메이트 화합물로 적어도 1 회 치료될 수 있다. 그러나, 대상체는 주어진 치료 기간 동안 약 1 주 1 회 내지 약 1 일 1 회 하나 이상의 글루타레이트 화합물 및/또는 하나 이상의 글루타메이트 화합물로 치료될 수 있다. 치료 기간의 길이는 다양한 요인, 예컨대 질환 또는 장애의 중증도, 본 발명의 하나 이상의 화합물 또는 이들의 조합의 농도 및 활성에 의존할 것이다. 치료를 위해 사용되는 하나 이상의 화합물의 효과적인 투여량은 특정한 치료 과정에 걸쳐 증가하거나 감소할 수 있음이 또한 인정될 것이다.

대상체에 투여될 하나 이상의 글루타레이트 화합물 및/또는 하나 이상의 글루타메이트 화합물이 약제학적 제형으로 제공될 수 있다. 약제학적 제형은 원하는 투여 방식을 위해 적절한 단위-투여량 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 약제학적 제형은 경구, 직장, 코, 국소(구강 및 설하 포함), 질, 및 비경구(피하, 근육내, 정맥내, 및 진피내 포함)를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로는 수령체의 병태 및 연령, 치료될 병태의 성질 및 본 발명의 주어진 화합물(들)과 함께 변할 수 있음이 인정될 것이다. 일부 구현예에서, 투여 경로는 경구이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 글루타레이트 화합물 및/또는 하나 이상의 글루타메이트 화합물은 식품 형태로 제공된다.

약제학적 제형에서 사용되는 글루타레이트 화합물 및/또는 글루타메이트 화합물의 실제 투여량은 사용되는 특정한 화합물(들), 제형화되는 특정한 조성물, 투여 방식, 및 특정한 부위, 대상체, 및 치료받는 질환에 따라 변할 것임이 인정될 것이다. 주어진 조건 세트에 대한 최적의 투여량은 주어진 화합물에 대한 실험 데이타 측면에서 투여량 결정 시험을 이용해서 당해분야의 숙련가에 의해 확인될 수 있다. 전구약물의 투여는 완전 활성 형태의 중량 수준과 화학적으로 동등한 중량 수준으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 제형은 치료적으로 효과적인 양의 본 발명의 하나 이상의 화합물, 및 불활성, 약제학적으로 허용가능한 캐리어 또는 희석제를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 언어 "약제학적으로 허용가능한 캐리어"는 약제학적 투여와 양립가능한 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅, 항균제, 및 항진균제, 등장성 제제 및 흡수 지연제 등을 포함하려는 것이다. 이용되는 약제학적 캐리어는 고체 또는 액체일 수 있다. 예시적인 고형 캐리어는 락토스, 수크로스, 탈크, 젤라틴, 한천, 펙틴, 아카시아, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등이다. 예시적인 액체 캐리어는 시럽, 땅콩 오일, 올리브 오일, 물 등이다. 유사하게, 캐리어 또는 희석제에는 당해분야에 공지된 시간-지연 또는 시간-방출 물질, 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트가 단독으로 또는 왁스, 에틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 메틸메타크릴레이트 등과 함께 포함될 수 있다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당해분야에 공지되어 있다.

글루타레이트 화합물 및 글루타메이트 화합물의 독성 및 치료적 효능은 세포 배양 또는 실험 동물에서, 예를 들면 LD₅₀(집단의 50%에 대해 치명적인 용량) 및 ED₅₀(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위한 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 간 용량 비가 치료 지수이며, 이는 비 LD₅₀/ED₅₀으로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있지만, 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적 손상을 최소화함으로써 부작용을 감소시키기 위해, 이환 조직 부위로 이러한 화합물을 표적화하는 전달 시스템을 설계하는 데 주의를 기울여야 한다.

세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이타는 인간에서 사용하기 위한 투여량 범위를 제형화하는데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없이 ED₅₀을 포함하는 순환 농도 범위 내에 놓인다. 투여량은 이용되는 투여량 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 변할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 임의의 화합물에 있어서, 치료적으로 효과적인 용량은 세포 배양 검정으로부터 최초 산정될 수 있다. 세포 배양에서 결정된 바와 같은 IC₅₀(즉, 증상의 절반-최대 저해를 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위한 용량이 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하기 위해 사용될 수 있다. 혈장 중 수준은, 예를 들면 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.

α-KG가 성체 C. 엘레간스 의 수명을 연장시킴

내인성 소분자에 의한 노화 조절에 대한 식견을 얻기 위해, 정상 대사물 및 비정상적 질환-관련된 대사물을 C. 엘레간스 모델을 사용하여 성체 수명에 대한 이들의 효과에 대해 스크리닝하였다. TCA 사이클 중간체 α-KG(그러나 이소시트레이트 또는 시트레이트는 아님)가 노화를 지연시키고 C. 엘레간스의 수명을 약 50% 연장시킴이 발견되었다(도 1, 패널 a, 도 5, 패널 a). 세포에서, α-KG(또는 2-옥소글루타레이트, 도 1, 패널 b)는 이소시트레이트 탈수소효소(IDH)에 의해 촉매되는 산화적 탈카복실화에 의해 이소시트레이트로부터 생산된다. α-KG는 농도-의존적 방식으로 야생형 N2 수명을 연장시켰으며, 8 mM α-KG가 최대 수명 연장을 일으키고(도 1, 패널 c); 8 mM이 모든 후속 C. 엘레간스 실험에서 사용된 농도였다. 8 mM α-KG 플레이트 상 벌레에서 비히클 플레이트 상에서에 비해 α-KG 농도에서 약 50% 증가가 존재하거나(도 5, 패널 b), 또는 균질한 분포를 가정하여 약 160 μM 대 약 110 μM이다. α-KG는 수명을 연장시킬 뿐만 아니라 연령 관련 표현형, 예컨대 신속한, 공동작용 신체 운동의 감퇴를 지연시킨다(보충 비디오 1 및 2, WorldWideWeb.natureDOTCOM/nature/journal/v510/n7505/fig_tab/nature13264_SV1.HyperTextMarkupLanguage 및 WorldWideWeb.natureDOTCOM/nature/journal/v510/n7505/fig_tab/nature13264_SV2.HyperTextMarkupLanguage 에서 인터넷 상에서 이용 가능하며, 여기서 "WorldWideWeb"은 "www"이고, "DOTCOM"은 ".com"이고, "HyperTextMarkupLanguage"는 "html"임). 성체 단계에서의 α-KG 보충이 장수를 위해 충분하다(도 5, 패널 c).

박테리아 식품의 희석 또는 사멸은 벌레 수명을 연장시키는 것으로 나타났으나, α-KG에 의한 수명 증가는 변경된 박테리아 증식, 생존력, 또는 대사에 기인하지 않는다(도 1, 패널 d-e, 도 5, 패널 d). 동물은 또한 α-KG-처리된 식품을 덜 바람직한 것으로 보지 않았고(도 5, 패널 e-f), α-KG의 존재 하에 식품 섭취, 인두 펌핑, 탐색 행동, 신체 크기, 또는 번식 크기에 있어서 유의미한 변화가 없었다(도 5, 패널 e-h, 데이타는 나타내지 않음).

세포에서, α-KG는 TCA 사이클에서 주요 조절 포인트인 α-KG 탈수소효소(ogdh-1에 의해 인코딩됨)에 의해 석시닐-CoA 및 CO₂로 탈카복실화된다. ogdh -1 RNAi에 의한 α-KG 수준 증가(도 5, 패널 b)도 박테리아 식품과 무관한 장수에 대한 α-KG의 직접적 효과와 일치하게 벌레 수명을 연장시킨다(도 1, 패널 f).

α-KG에 의한 장수의 분자 기전(들)을 조사하기 위해, 비편향 생화학적 접근법 DARTS를 이용하였다. 배양하기 쉬운 인간 세포주(Jurkat)를 DARTS를 위한 단백질 공급원으로 사용하였다(도 2, 패널 a). 질량 분광분석법으로 α-KG 처리된 샘플에 존재하는 가장 풍부하고 농축된 단백질 중에서 ATP 합성효소 촉매 코어의 베타 서브유닛인 ATP5B를 확인하였다(도 12); 더 적은 정도이기는 해도 상동성 알파 서브유닛 ATP5A도 농축되었다. α-KG 및 ATP5B 간 상호작용을 추가 세포주를 사용해서 확인하였고(도 2, 패널 b, 데이타는 나타내지 않음), C. 엘레간 스 오르쏘로그 ATP-2에 대해 확증하였다(도 6, 패널 a).

α-KG는 소 심장 미토콘드리아로부터 복합체 IV가 아닌 복합체 V의 활성을 저해한다(도 2, 패널 c, 도 6, 패널 b, 데이타는 나타내지 않음). 이러한 저해는 또한 생존 포유동물 세포에서(도 2, 패널 d, 데이타는 나타내지 않음) 그리고 생존 선충에서(도 2, 패널 e), 감소된 ATP 수준에 의해 입증되는 바와 같이 쉽게 검출된다. 수반하여, 산소 소비율이 atp-2 녹다운 시나리오(도 6, 패널 c)와 유사하게 낮아진다(도 2, 패널 f-g). α-KG에 의한 다른 ETC 복합체가 아닌 복합체 V의 특이적 저해는 호흡 조절 분석에 의해 추가로 확인된다(도 2, 패널 h, 도 6, 패널 d-h).

α-KG에 의한 저해 기전을 이해하기 위해, ATP 합성효소의 효소 저해 속도론을 연구하였다. α-KG(옥틸 α-KG로부터 방출됨)는 ATP 합성효소의 유효 V _max 및 K _m을 둘 다 감소시켜 비경쟁적 저해를 시사한다(도 2, 패널 i).

α-KG에 의한 장수에 대한 ATP-2의 유의성을 결정하기 위해, α-KG가 주어진 atp-2( RNAi ) 성체의 수명을 측정하였다. atp-2( RNAi ) 동물은 대조군보다 더 길게 생존한다(도 3, 패널 a). 그러나, 이들의 수명은 α-KG에 의해 추가 연장되지 않아서(도 3, 패널 a), ATP-2가 α-KG의 장수 이점에 관여됨을 시사한다. 그에 반해서, 더 길게 생존한 인슐린/IGF-1 수용체 daf -2(e1370) 돌연변이체 벌레의 수명은 α-KG에 의해 추가 증가된다(도 3, 패널 b). 놀랍게도, ATP 합성효소의 저해제인 올리고마이신도 성체 벌레의 수명을 연장시킨다(도 7, 패널 a). α-KG에 의한 ATP-2의 직접적 결합, 관련된 효소 저해, ATP 수준 및 산소 소비의 감소, 수명 분석, 및 atp-2 녹다운 또는 올리고마이신 처리에 대한 다른 유사성(또한 도 8을 참고)은 α-KG가 ATP-2를 표적화함으로써 수명을 연장시킬 수 있음을 실증한다.

손상된 인두 펌핑을 갖는 DR의 모델인 eat-2( ad1116 ) 동물의 수명을 α-KG가 연장시키지 않으며(도 3, 패널 c), 이에 따라 식품 섭취를 감소시킨 것으로 나타났다. eat-2 돌연변이체의 장수에는 장수에 대한 DR 효과의 중요한 매개체인 TOR/let-363이 관여된다. 마찬가지로, α-KG는 CeTOR ( RNAi ) 동물의 수명을 증가시키지 않는다(도 3, 패널 d). AMP-활성화된 단백질 키나제(AMPK)는 세포 에너지 상태의 또 하나의 보존된 주요 센서이다. AMPK/aak -2 및 FoxO 전사 인자 DAF-16은 모두 C. 엘레간스 섭취 희석된 박테리아에서 DR-유도된 장수를 매개하지만, 어느 것도 eat-2 모델에서 수명 연장을 위해 필요하지 않다. aak -2(도 9, 패널 a) 및 daf -16(도 3, 패널 e) 돌연변이체에서, α-KG의 장수 효과는 N2에서 보다 작은 것으로 나타나서(P < 0.0001), α-KG 장수에 부분적으로 AMPK 및 FoxO가 관여됨을 제시한다; 그럼에도 불구하고, 수명은 aak -2(24.3%, P < 0.0001) 및 daf -16(29.5%, P < 0.0001) 돌연변이체 또는 RNAi 동물(도 3, 패널 e, 도 9, 패널 a-b, 데이타는 나타내지 않음)에서 α-KG에 의해 유의미하게 증가되어, 장수에서 α-KG에 의한 AMPK-FoxO 독립적 효과를 시사한다.

CeTOR ( RNAi ) 동물의 수명을 추가 연장시키는데 있어서 α-KG의 무능은 α-KG 처리 및 TOR 불활성화가 동일한 경로를 통해(α-KG가 TOR 상이나 그 업스트림에 작용하며), 또는 다운스트림 효과기 상에 수렴되는 독립적인 기전 또는 병렬 경로를 통해 수명을 연장시킴을 시사한다. 첫 번째 모델은 TOR 경로가 α-KG 처리 시 덜 활성일 것임을 예측하는 반면, 후자 모델이 사실인 경우에는 TOR이 α-KG 처리에 의해 영향받지 않을 것이다. 첫 번째 모델을 지지하며, TOR 경로 활성이 옥틸 α-KG로 처리된 인간 세포에서 감소되는 것으로 나타났다(도 4, 패널 a, 도 10, 패널 a-b). 그러나, α-KG는 TOR와 직접적으로 상호작용하지 않는다(도 10, 패널 d-e). α-KG 장수에서 TOR의 관여와 일치하게, FoxA 전사 인자 PHA-4가 마찬가지로 α-KG-유도된 장수에 관여된다(도 3, 패널 f). 게다가, TOR 저해에 의해 및 DR에 의해 모두 활성화되는 자가포식이 GFP:LGG-1 반점의 우세로 표시되는 바와 같이 α-KG(또는 ogdh -1 RNAi) 및 atp-2( RNAi ) 동물로 처리된 벌레에서 현저하게 증가된다(도 4, 패널 b-c, 도 10, 패널 c, 도 11). 자가포식은 옥틸 α-KG로 처리된 포유동물 세포에서도 유도되었다(도 10, 패널 f). 더욱이, α-KG는 atp-2( RNAi ) 또는 CeTOR ( RNAi ) 벌레 중 어느 것에서도 유의미하게 더 큰 자가포식을 일으키지 않는다(도 4, 패널 b-c). 데이타는 α-KG가 ATP 합성효소의 저해를 통해 TOR 경로 활성을 감소시킨다는 추가 증거를 제공한다. 유사하게, 자가포식은 올리고마이신에 의해 유도되며, 올리고마이신은 CeTOR ( RNAi ) 벌레에서 자가포식을 강화하지 않는다(도 7, 패널 b-c).

α-KG는 대사물일 뿐만 아니라 큰 패밀리의 디옥시게나제에 대한 공동-기질이다. 저산소증 유도성 인자(HIF-1)는 이들 효소 중 하나인 프롤릴 4-하이드록실라제(PHD) EGL-9에 의해 개질된 후, 폰 힙펠-린다우(VHL) 단백질에 의해 분해된다. α-KG는 hif -1, egl -9, 및 vhl -1에 기능상실 돌연변이를 갖는 동물의 수명을 연장시키는 것으로 나타났고(도 3, 패널 g, 도 9, 패널 c), 그렇게 함으로써 이러한 경로가 α-KG에 의한 수명 연장에서 주요한 역할을 담당하지 않음을 제시한다. 그럼에도 불구하고, 다른 α-KG 결합 표적이 또한 수명 연장에서 역할을 담당할 수 있다.

단리된 신생아 랫트 심근세포에서 이소프로테레놀-유도된 비대에 대한 옥틸 α-KG의 보호 효과를 조사하였다. 신생아 랫트의 심근세포를 콜라게나제 소화에 의해 단리하고, 10% 우태 혈청(FCS) 함유 DMEM 중에 밤새 배양한 다음 배양 배지를 무혈청 고-글루코스 인슐린-트랜스페린-나트륨 셀레나이트(ITS)로 바꾸었다. 심근세포의 비대를 48 시간 동안 1 mM 이소프로테레놀(ISO) 또는 페닐에프린(PE)으로 세포를 처리하여 유도하였다. 도 23에 나타낸 바와 같이, 옥틸 α-KG(200 μM)는 ISO-유도된 비대(좌측 패널)를 완전히 폐지했을뿐만 아니라 비대 관련된 마커, 심방 나트륨 이뇨 인자(ANF) 및 뇌성 나트륨 이뇨 펩타이드(BNP)의 ISO- 및 PE-유도된 과발현(우측 패널)을 억제하여, α-KG에 의한 심장-보호 및 항-비대 효과를 시사하였다.

동물에서 옥틸 α-KG의 생체- 및 경구-이용률을 시험하기 위해, 동물에 옥틸 α-KG를 섭취시키고 옥틸 α-KG의 분자 및 세포 효과, 특히 그것의 미토콘드리아 ATP 합성효소(복합체 V) 활성 저해가 생체내 반복될 수 있는지 여부를 평가하였다. 마우스에 1 주 동안 옥틸 α-KG(1.5 mg/체중 g) 또는 옥탄올(대조군)이 사전-혼합된 사료 식이를 섭취시켰다. 동물은 옥틸 α-KG 또는 옥탄올의 5 일 섭취 후 생리적으로 또는 행동적으로 비정상성을 나타내지 않았다. 마우스를 희생시키고 심장을 수확하여 미토콘드리아를 단리하였다. 산소 소비율(OCR)을 Seahorse XF-24 분석기(Seahorse Bioscience)를 이용해서 측정하였다. 도 24에 나타낸 바와 같이, α-KG-섭취 마우스(S1, S2)로부터 단리된 미토콘드리아는 대조군 마우스(C1, C2)로부터에 비해 더 낮은 상태 3 호흡을 나타내어 직접적으로 단리된 미토콘드리아 상에서 옥틸 α-KG의 효과를 반영하였다. 옥틸 α-KG 섭취 마우스에서 상태 3 호흡 감소는 옥틸 α-KG가 체내에서 섭취되고, 흡수되고, 분배되어 그것의 세포 표적 상에 작용하도록 α-KG를 방출할 수 있음을 시사한다.

생체내 α-KG의 심장-보호 효과를 조사하였다. 삼투 미니-펌프(Alzet, 모델 1004)를 이용해서 30 ㎍/체중 g/1 일의 용량으로 3 주 동안 이소프로테레놀의 만성 주입에 의해 비대 및 심부전을 유도하였다. 8 주령 DBA2/J 암컷 마우스를 이러한 연구를 위해 사용하였다. 마우스를 연구 3 주 동안 사료에 매일 0.5 mg/체중 g으로 옥틸 α-KG를 섭취시켰다. 심장 크기 및 심장 대 체중 비를 평가함으로써 실험 말기에 ISO-유도된 심장 비대 및 심근병증을 결정하였다. 도 25의 좌측 패널에 나타낸 바와 같이, 실험 말기에 심장(mg)/체중(g) 비는 대조군 그룹에 대해 5.32 ± 0.26(n=4)이었고, ISO- 및 옥탄올 처리된 그룹에 대해 7.26 ± 0.12(n=3)였고, ISO 및 옥틸 α-KG 처리된 그룹에 대해 6.81 ± 0.24(n=6)(평균, STEDV)였다. ISO-처리된 마우스는 심장 크기 및 심장 대 체중 비에서 현저한 증가를 나타낸 반면, ISO-처리된 마우스는 옥틸 α-KG로 처리된 경우 유의미하게 감소된 심장 크기 및 심장 대 체중 비를 나타내었다.

보다 중요하게는, 심장 출력을 평가하고 심장 박출률을 심장초음파검사에 의해 결정하였다. 처리 전 기저 수준에 대한 심장 EF는 55.1% ± 2.6(n=14)이었다. 도 25의 우측 패널에 나타낸 바와 같이, 연구 말기(3 주)에 심장 EF는 비-ISO 대조군 그룹(n=2)에 대해 54.5% + 0.9였고, ISO-처리된 그룹(옥탄올 함유)(n=3)에 대해 49.2% ± 1.9였고, ISO + 옥틸 α-KG 처리된 그룹(n=6)에 대해 53.8% ± 2.3이었다. 3 주 후 대조군 그룹(비-ISO + 옥탄올)에 대한 EF는 처리 전 기저 수준에 필적한다. ISO-처리된 그룹의 EF는 비-ISO 그룹에 비해 유의미하게 감소된다. 놀랍게도, ISO + 옥틸 α-KG의 EF는 비-ISO 그룹 수준으로 회복된다. 이들 결과는 α-KG가 ISO-유도된 심장 비대를 유의미하게 감소시키고 실험 심부전 동물 모델에서 심장 출력을 회복시킬 수 있음을 나타낸다.

2-HG가 성체 C. 엘레간스 의 수명을 연장시킴

2-HG가 α-KG와 구조적 유사성을 나타내지만(도 14, 패널 A), 2-HG는 신경 장애, 암, 및 다양한 연령 관련 질환에 관련된다. 따라서, 2-HG를 이용한 다양한 실험을 수행하여 2-HG가 감소된 장수를 유도하는지 여부를 결정하였다. 놀랍게도, (R)-2-HG 및 (S)-2-HG는 둘 다 C. 엘레간스의 수명을 α-KG와 필적하는 정도로 증가시킨다(도 14, 패널 B-C).

DARTS 분석은 2-HG가 ATP5B를 표적화함을 나타낸다. 구체적으로, (R)-2-HG 및 (S)-2-HG가 둘 다 ATP5B에 결합하는 것으로 나타났다(도 15, 패널 A, 데이타는 나타내지 않음). α-KG와 마찬가지로, 2-HG는 ATP 합성효소(복합체 V)를 저해한다(도 15, 패널 B). 이러한 저해는 2-HG가 다른 전자 전달 사슬(ETC) 복합체(도 18, 패널 A) 또는 미토콘드리아 내로의 ADP 내수송(도 18, 패널 B)을 저해하지 않으므로 특이적인 것이다. 2-HG에 의한 ATP 합성효소의 저해도 생존 세포에서 쉽게 검출된다; α-KG 또는 2-HG의 막-투과성 옥틸 에스테르를 이용한 U87 교모세포종 세포(야생형 IDH1/2) 처리는 잘-확립된 ATP 합성효소 저해제 올리고마이신(도 19, 패널 A)의 이용에서와 같이, 미토콘드리아 산화적 인산화 조건 하에 감소된 세포 ATP 함량을 야기한다(도 15, 패널 C). 총 및 ATP 합성효소-연관 산소 소비율이 모두 처리된 세포에서 감소된다(도 15, 패널 D 및 도 19, 패널 B-C).

약 200 μM의 정상 세포 농도에서, (R)-2-HG는 ATP 합성효소의 유의미한 저해를 유도하지 않을 것이다. 그러나 (R)-2-HG가 천연 내인성 수준의 10-100 배로 축적되는 IDH1 또는 IDH2 돌연변이를 갖는 신경아교종 환자에서는 ATP 합성효소의 저해가 가능할 것이다. 이러한 아이디어를 시험하기 위해, 신경아교종에서 가장 흔한 IDH 돌연변이인 IDH1(R132H)을 안정되게 발현하는 U87 세포를 사용하였다. 상술된 옥틸 2-HG 처리된 세포와 유사하게, U87/IDH1(R132H) 세포는 동종 IDH1(WT)-발현 U87 세포에 비해 감소된 ATP 함량 및 산소 소비율을 나타낸다(도 16, 패널 A-B). 유사한 결과가 HCT116 IDH1(R132H/+) 세포에서 수득되었다(도 20, 패널 A). 세포내 (R)-2-HG 수준은 대조군 세포에 비해 IDH1(R132H)을 발현하는 U87 및 HCT116 세포에서 약 50-100 배 더 높으며(도 16, 패널 C, 및 도 20, 패널 B), 옥틸 (R)-2-HG로 처리한 세포(도 16, 패널 D) 및 IDH1-돌연변이체 종양 샘플에서 확인된 (R)-2-HG 수준 증가와 필적한다. 이들 데이타는 돌연변이체 IDH1 암 세포에서 (R)-2-HG에 의한 ATP 합성효소 및 미토콘드리아 호흡의 저해와 일치한다.

대사물 2-HG는 TCA 사이클 및 관련된 아미노산 대사 경로에 연관된다(도 16, 패널 E). 옥틸 2-HG 처리 시의 잠재적인 대사 변화를 탐색하기 위해, 옥틸 2-HG 처리된 세포에서의 대사물 수준을 LC-MS에 의해 측정하였다. 2-HG는 옥틸 2-HG 처리 후 약 20-100 배 축적되는 것으로 나타났다(도 16, 패널 D, 및 도 20, 패널 C). 2-HG의 축적에 비해, TCA 사이클 대사물 또는 관련된 아미노산에서 극적인 변화는 없었다(< 2-배)(도 16, 패널 D, 및 도 20, 패널 C). 유사하게, 옥틸 α-KG 처리된 샘플에서 α-KG의 축적이 대사 프로파일에서 가장 현저한 변화이다(도 20, 패널 D). 정적 대사 프로파일은 2-HG(또는 α-KG) 처리된 세포에서 관측된 생체에너지 전이(및 신호전달 변화, 아래 참고)가 전반적인 대사 효과보다는 2-HG(또는 α-KG)에 의한 ATP 합성효소의 직접적인 저해로 야기된다는 개념을 뒷받침한다.

미토콘드리아 전자 전달 사슬(ETC)의 말단 성분(복합체 V)으로서, ATP 합성효소는 세포 에너지의 주요 공급원이며 산화적 인산화를 위한 단독 부위이다. 당분해가 예컨대 글루코스 결핍 조건 하에 저해되면, 세포는 ATP 공급원으로서 미토콘드리아 호흡에 의존하게 된다. 따라서 돌연변이체 IDH1 암 세포에서 ATP 합성효소 및 미토콘드리아 호흡의 내재적 저해는 이들 암에 대해 가능한 아킬레스 건을 제시한다. 이러한 아이디어를 뒷받침하여, 글루코스-비함유, 갈락토스-함유 배지에서 배양되는 경우, 예를 들면 호흡이 일차 에너지 공급원인 경우, IDH1(R132H) 세포는 급격하게 감소된 세포 생존력을 나타낸다(도 17, 패널 A 및 도 21, 패널 A). 이들 결과는 IDH1(R132H) 돌연변이체 세포의 글루코스 결핍에 대한 특별한 민감성을 시사한다. 돌연변이체 세포주는 FBS 결핍에 민감하지 않아서(데이타는 나타내지 않음), 글루코스 결핍에 대한 그것의 증가된 취약성이 특이적임을 시사한다. 유사한 대사 취약성이 옥틸 α-KG 또는 옥틸 2-HG로 처리된 U87 세포에서(도 17, 패널 B-D) 그리고 ATP5B 녹다운 세포에서(도 17, 패널 E) 분명하다. 이들 조사결과는 IDH1(R132H) 돌연변이를 갖는 암 세포가 ATP 합성효소 셧 다운 결과 미토콘드리아 호흡을 이용하지 못함으로 인해 또한 글루코스 제한과 비슷한 영양 조건에 특히 민감할 수 있음을 시사한다.

복잡한 유기체에서, 글루코스 제한은 케톤증을 통해 달성될 수 있고, 여기서 세포는 에너지를 위해 케톤체(글루코스 대신)를 사용한다. 케톤증은 근육 및 다른 조직에서 단백질을 이화로부터 보존하면서 신체가 그것의 비교적 오래 지속되는 지방 저장소로부터 에너지를 유도하기 위한 생존 방식으로 장기적인 기아(또는 공복) 시 천연 유도된다. 케톤증은 또한 저-탄수화물-고-지방 "케톤 생성 식이"를 통해 시행될 수 있으며, 이는 암에 대한 이점을 나타냈다. 이에 대한 하나의 이유는 종양 세포가 성장 및 생존을 위해 글루코스에 크게 의존한다는 것일 수 있다. 케톤체의 대사는 전적으로 미토콘드리아의 산화적 인산화에 의존하므로, 하나의 예측은 케톤체가 이들의 유일한 에너지 공급원인 경우 암 세포에서 ATP 합성효소(또는 다른 ETC 성분)의 저해가 생존 약점을 부여할 것이라는 것이다. U87 세포는 에너지를 위해 케톤체를 이용할 수 없으므로, IDH1 돌연변이의 효과를 직접 평가하기 위해 돌연변이체 IDH1을 발현하는 돌연변이 HCT116 세포를 사용하였다. 케톤체 (R)-3-하이드록시부티레이트를 함유하는 케톤 생성(글루코스-비함유) 배지에서 배양되는 경우, IDH1 돌연변이체 HCT116 세포는 친계 세포에 비해 생존력에서 현저한 감소를 나타내어(도 17, 패널 F), IDH 돌연변이체 세포의 대사적 약점을 표명하였다. 이들 결과는 돌연변이체 IDH 암 세포에서 2-HG 축적이 ATP 합성효소 저해를 일으킨다는 사실을 추가로 뒷받침할 뿐만 아니라 암 치료에서 신규한 대사성 치료 전략을 제시한다.

TOR 신호전달을 감소시키는 ATP 합성효소 저해제, 옥틸 α-KG 또는 올리고마이신을 이용한 처리와 유사하게, S6K 및 4E-BP1을 포함하는 mTOR 복합체 1 기질의 인산화는 ATP5B 녹다운 세포(도 17, 패널 G), 2-HG의 옥틸 에스테르로 처리된 세포(도 17, 패널 H), 및 IDH1(R132H) 발현 세포(도 17, 패널 I)에서 감소되는 것으로 나타났다. 이들 결과는 ATP 합성효소의 저해가 벌레 및 초파리에서 수득된 결과와 일치하게 세포에서 감소된 mTOR 활성으로 이어짐을 시사한다. TOR은 세포 성장의 주요 조절물질이므로, ATP 합성효소-저해된 세포에서의 감소된 mTOR 경로 활성은 가능한 세포 성장 정지를 예측한다. 사실상, ATP5B 녹다운 세포가 단독 당 공급원으로서 갈락토스와 배양되는 경우, 예를 들면 이들이 ATP 생산을 위해 미토콘드리아 호흡에 의존하게 되는 경우, 성장은 완전히 정지된다(도 17, 패널 E). 글루코스 배지에서도, 감소된 세포 성장이 쉽게 검출가능하다(도 22, 패널 A). 옥틸 α-KG 또는 옥틸 2-HG를 이용한 처리는 유사하게 U87 세포 성장을 저해한다(도 22, 패널 B-D). 2-HG에 의한(그리고 α-KG에 의한) 성장 저해가 또한 A549 및 Jurkat, 불멸화된 비-악성 HEK 293 세포, 및 정상 인간 2 배체 섬유아세포 WI-38을 포함하는 시험된 다른 암 세포주에서 관측되어(데이타는 나타내지 않음), 성장 저해에 대한 기전이 보편적일 수 있고, 과잉의 2-HG가 성장 저해성 대사물로 작용할 수 있음을 제시한다. 돌연변이체 IDH1(R132H)을 발현하는 U87 및 HCT116 세포 둘 다에서 유사한 성장 저해가 분명하다(도 22, 패널 E 및 도 21, 패널 B). 이들 데이타는 함께 돌연변이체 IDH1 세포에서 ATP 합성효소 및 mTOR의 일치하는 저해 상태를 제시한다.

요약하면, α-KG와 유사하게, 2-HG의 두 거울상이성질체는 모두 ATP 합성효소에 결합하여 이를 저해하고 C. 엘레간스의 수명을 연장시킨다. 이들 관련된 대사물에 의한 ATP 합성효소의 저해는 미토콘드리아 호흡 및 mTOR 신호전달을 감소시킨다. 2-HG 및 α-KG는 둘 다 광범위한 성장-저해 효과를 나타내며 글루코스 제한 조건에서 암 세포 생존력을 감소시킨다. 본원에서의 실험은 2-HG가 암에서 중요성을 갖는 다양한 α-KG 결합 인자를 간섭하는 암대사물이지만, 2-HG는 또한-ATP 합성효소 및 mTOR 신호전달 다운스트림의 저해를 통해-종양 세포 성장 및 생존력을 감소시키는 작용을 함을 제시한다.

하기 예는 본 발명을 제한하려는 것이 아니라 예시하도록 의도된다.

실시예

선충 균주 및 유지. 카에노르하브디티스 엘레간스 균주를 당해분야에서 공지된 방법을 이용하여 유지하였다. 하기 균주를 사용하였다:

세포 배양

U87 세포를 10% 우태 혈청(FBS) 및 10 mM 글루코스가 보충된 글루코스-비함유 DMEM(Life technologies, 11966-025), 또는 나타낸 경우 10% FBS 및 10 mM 갈락토스가 보충된 글루코스-비함유 DMEM 중에 배양하였다. IDH1(R132H) 돌연변이체 또는 IDH1(WT)을 발현하는 U87 세포는 보고된 바와 같다(Li 등, Neuro Oncol 15, 57-68). 정상 인간 2 배체 섬유아세포 WI-38(ATCC, CCL-75)을 10% FBS가 보충된 EMEM(ATCC, 30-2003)으로 배양하였다. HEK293, A549, 및 HeLa 세포를 10% FBS가 보충된 DMEM(Life technologies, 11966-065)으로 배양하였다. Jurkat 및 HCT116 세포를 10% FBS가 보충된 RPMI(Life technologies, 11875-093) 중에 배양하였다. 모든 세포를 37℃ 및 5% CO₂에서 배양하였다. 세포를 제조자의 설명서에 따라 Thermo Scientiric DharmaFECT 형질감염 시약 1을 사용하여 나타낸 siRNA로 형질감염시켰다. 녹다운 효율을 성장 저해 검정의 첫 번째 및 마지막 날에 면역블롯팅에 의해 확인하였다.

화합물

1-옥틸 α-KG, 옥틸 (S)-2-HG, 및 옥틸 (R)-2-HG를 당해분야에서 공지된 방법을 이용하여 합성하였다. [Jung & Deng, J Org Chem 77, 11002-11005(2012); Albert 등, Synthesis-Stuttgart, 635-637(1987); 및 Cancer Cell 19, 17-30(2011)]을 참고하라. 합성 방법에 대한 개질은 하기와 같다:

옥틸 α-KG의 합성

간단히, 1-옥탄올(0.95 ml, 6.0 mmol), DMAP(37 mg, 0.3 mmol), 및 DCC(0.743 g, 3.6 mmol)를 0℃에서 건조 CH₂Cl₂(6.0 ml) 중 1-사이클로부텐-1-카복실산(0.295 g, 3.0 mmol)의 용액에 첨가하였다. 1 시간 동안 교반한 후, 용액이 실온으로 가온되도록 두고, 다시 8 시간 동안 교반하였다. 침전물을 여과하고 에틸 아세테이트(3 X 100 ml)로 세정하였다. 조합된 유기상을 물 및 염수로 세정하고 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조하였다. 80/1 헥산/에틸 아세테이트로 용출하는 실리카 겔상 플래시 칼럼 크로마토그래피로 옥틸 사이클로부트-1-엔카복실레이트를 맑은 오일로 얻었다(0.604 g, 96%). CH₂Cl₂(10 ml) 중 이러한 오일(0.211 g, 1.0 mmol)의 -78℃ 용액을 용액이 파란색이 될 때까지 O₃/O₂로 버블링하였다. 잔류 오존을 O₂를 이용한 버블링으로 방출하고 반응물을 실온으로 가온하고 다시 1 시간 동안 교반하였다. 디메틸 설파이드(Me₂S, 0.11 ml, 1.5 mmol)를 혼합물에 첨가하고 이를 다시 2 시간 동안 교반하였다. CH₂Cl₂를 진공에서 제거하고 조생성물을 t-BuOH(3.0 ml) 중 2-메틸-2-부텐(0.8 ml)의 용액에 용해시켰다. 이것에 H₂O(1.0 ml) 중 나트륨 아염소산염(0.147 g, 1.3 mmol) 및 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 1 수화물(0.179 g, 1.3 mmol)을 함유하는 용액을 적가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음 에틸 아세테이트(3 X 50 ml)로 추출하였다. 조합된 유기상을 물 및 염수로 세정하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조하였다. 5/1 헥산/에틸 아세테이트로 용출하는 실리카 겔상 플래시 칼럼 크로마토그래피로 옥틸 α-KG를 얻었고, 이는 냉장 보관 시 옅은 색의 고체가 되었다(0.216 g, 84%).

5- 옥틸 L- Glu (( S )-2-아미노-5-( 옥틸옥시 )-5- 옥소펜탄산 )의 합성

L-글루탐산(0.147 g, 1.0 mmol) 및 무수 황산나트륨(0.1 g)을 옥탄올(2.0 ml)에서 용해시킨 다음 테트라플루오로붕산-디메틸 에테르 복합체(0.17 ml)를 첨가했다. 현탁된 혼합물을 밤새 21℃에서 교반하였다. 무수 THF(5 ml)를 혼합물에 첨가하고 이를 두꺼운 활성탄 패드를 통해 여과하였다. 무수 트리에틸아민(0.4 ml)을 맑은 여액에 첨가하여 유백색 슬러리를 수득하였다. 에틸 아세테이트(10 ml)를 이용한 분쇄 시, 모노에스테르 모노산이 침전되었다. 침전물을 수집하고, 추가 에틸 아세테이트(2 X 5 ml)로 세정하고, 진공에서 건조하여 원하는 생성물 5-옥틸 L-Glu(0.249 g, 96%)를 백색 고체로 얻었다. ^lH NMR(500 MHz, 아세트산-d₄): δ 4.12(dd, J = 6.6, 6.6 Hz, 1H), 4.11(t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.64(m, 2H), 2.26(m, 2H), 1.64(m, 2H), 1.30(m, 10H), 0.89(t, J = 7.0 Hz, 3H). ¹³C NMR(125 MHz, 아세트산-d₄): 175.0, 174.3, 66.3, 55.0, 32.7, 30.9, 30.11, 30.08, 29.3, 26.7, 26.3, 23.4, 14.4.

5- 옥틸 D- Glu (( R )-2-아미노-5-( 옥틸옥시 )-5- 옥소펜탄산 )의 합성

반대 거울상이성질체, 즉 5-옥틸 D-Glu의 합성을 D-글루탐산으로 시작해서 정확히 동일한 절차에 의해 수행하였다. 분광 데이타는 거울상이성질체 화합물에서와 동일하였다.

5- 옥틸 α-KG (5-( 옥틸옥시 )-2,5- 디옥소펜탄산 )의 합성

1-벤질 5-옥틸 2-옥소펜탄디오에이트: 0℃로 냉각한 H₂O(6.0 ml) 및 아세트산(2.0 ml) 중 5-옥틸 L-Glu(0.249 g)의 용액에 수성 아질산나트륨(0.207 g, 4 ml H₂O 중 3.0 mmol) 용액을 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 서서히 실온으로 가온하도록 두고, 밤새 교반하였다. 혼합물을 농축하였다. 수득한 잔류물을 DMF(10 ml) 및 NaHCO₃(0.42 g, 5.0 mmol)에서 용해시키고 벤질 브로마이드(0.242 ml, 2.0 mmol)를 혼합물에 첨가했다. 혼합물을 밤새 21℃에서 교반한 다음 에틸 아세테이트(3 x 30 ml)로 추출하였다. 조합된 유기상을 물 및 염수로 세정하고 무수 MgSO₄ 상에서 건조하였다. 7/1 헥산/에틸 아세테이트로 용출하는 실리카 겔상 플래시 칼럼 크로마토그래피로 혼합된 디에스테르 1-벤질 5-옥틸 (S)-2-하이드록시펜탄디오에이트를 무색 오일로 얻었다. 디클로로메탄(10.0 ml)에 용해된 이러한 오일에 NaHCO₃(0.42 g, 5.0 mmol) 및 데스-마틴 퍼요오디난(0.509 g, 1.2 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반한 다음 에틸 아세테이트(3 x 30 ml)로 추출하였다. 조합된 유기상을 물 및 염수로 세정하고 무수 MgSO₄ 상에서 건조하였다. 5/1 헥산/에틸 아세테이트로 용출하는 실리카 겔상 플래시 칼럼 크로마토그래피로 원하는 1-벤질 5-옥틸 2-옥소펜탄디오에이트(0.22 g, 66%)를 백색 고체로 얻었다. ¹H NMR(500 MHz, CDCl₃): 7.38(m, 5H), 5.27(s, 2H), 4.05(t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.14(t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.64(t, J = 6.5 Hz, 2H), 1.59(m, 2H), 1.28(m, 10H), 0.87(t, J = 7.0 Hz, 3H). ¹³C NMR(125 MHz, CDCl₃): 192.2, 171.9, 160.1, 134.3, 128.7, 128.6, 128.5, 67.9, 65.0, 34.2, 31.7, 29.07, 29.05, 28.4, 27.5, 25.7, 22.5, 14.0.

5-옥틸 α-KG (5-(옥틸옥시)-2,5-디옥소펜탄산): 에틸 아세테이트(15 ml) 중 1-벤질 5-옥틸 2-옥소펜탄디오에이트(0.12 g, 0.344 mmol)의 용액에 5% Pd/C(80 mg)를 첨가하였다. 혼합물에 걸쳐 아르곤 스트림을 통과시킨 다음 아르곤을 수소 가스로 대체하고 혼합물을 15 분 동안 격렬하게 교반하였다. 혼합물을 두꺼운 셀라이트 패드를 통해 여과하여 원하는 생성물 5-옥틸 α-KG(0.088 g, 99%)를 백색 고체로 얻었다. ¹H NMR(500 MHz, CDCl₃): 8.16(br s, 1H), 4.06(t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.18(t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.69(t, J = 6.0 Hz, 2H), 1.59(m, 2H), 1.26(m, 10H), 0.85(t, J = 7.0 Hz, 3H). ¹³C NMR(125 MHz, CDCl₃): 193.8, 172.7, 160.5, 65.5, 33.0, 31.7, 29.08, 29.06, 28.4, 27.8, 25.8, 22.5, 14.0.

1- 옥틸 ( S ) 2- 하이드록시펜탄디오에이트 ( 옥틸 ( S )-2-HG)의 합성

벤질 알코올

L-글루탐산

(S)-2-아미노-5-(벤질옥시)-5-옥소펜탄산: L-글루탐산(2.0 g, 13.6 mmol) 및 무수 황산나트륨(2.0 g)을 벤질 알코올(25 ml)에서 용해시킨 다음 테트라플루오로붕산 디에틸 에테르 복합체(3.7 ml, 27.2 mmol)를 첨가했다. 현탁된 혼합물을 21℃에서 밤새 교반하였다. 무수 THF(75 ml)를 혼합물에 첨가하고 이를 두꺼운 활성탄 패드를 통해 여과하였다. 무수 트리에틸아민(4.1 ml)을 맑은 여액에 첨가하여 유백색 슬러리를 수득하였다. 에틸 아세테이트(100 ml)를 이용한 분쇄 시, 모노에스테르 모노산이 침전되었다. 이를 수집하고, 추가 에틸 아세테이트(2 x 10 ml)로 세정하고, 진공에서 건조하여 원하는 생성물 (S)-2-아미노-5-(벤질옥시)-5-옥소펜탄산(3.07 g, 95%)을 백색 고체로 얻었다. ^lH NMR(500 MHz, 아세트산-d₄): δ 7.41 - 7.25(m, 5H), 5.14(s, 2H), 4.12(m, 1H), 2.75 - 2.60(m, 2H), 2.27(m, 2H). ¹³C NMR(125 MHz, 아세트산-d₄): δ 174.6, 174.4, 136.9, 129.5, 129.2, 129.1, 67.7, 55.0, 30.9, 26.3.

1-요오도옥탄/DMF

(S)-5-벤질 1-옥틸 2-하이드록시펜탄디오에이트: 0℃로 냉각된 H₂O(25 ml) 및 아세트산(10 ml) 중 (S)-2-아미노-5-(벤질옥시)-5-옥소펜탄산(1.187 g, 5.0 mmol)의 용액에 수성 아질산나트륨(1.07 g, 15 ml H₂O 중) 용액을 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물이 서서히 실온으로 가온되도록 두고 밤새 교반하였다. 혼합물을 농축하였다. 수득한 잔류물을 DMF(15 ml) 및 NaHCO₃(1.26 g, 15 mmol)에서 용해시키고 1-요오도옥탄(1.84 ml, 10 mmol)을 혼합물에 첨가했다. 혼합물을 21℃에서 밤새 교반한 다음 에틸 아세테이트(3 x 50 ml)로 추출하였다. 조합된 유기상을 물 및 염수로 세정하고 무수 MgSO₄ 상에서 건조하였다. 7/1 헥산/에틸 아세테이트로 용출하는 실리카 겔상 플래시 칼럼 크로마토그래피로 원하는 혼합된 디에스테르 (S)-5-벤질 1-옥틸 2-하이드록시펜탄디오에이트(0.785 g, 45%)를 무색 오일로 얻었다. ¹H NMR(500 MHz, CDCl₃): δ 7.37 - 7.28(m, 5H), 5.12(s, 2H), 4.26 - 4.19(m, 1H), 4.16(t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.11(d, J = 4.1 Hz, 1H), 2.61 - 2.46(m, 2H), 2.26 - 2.14(m, 1H), 1.95(dtd, J = 14.2, 8.3, 6.1 Hz, 1H), 1.71 - 1.57(m, 2H), 1.39 - 1.20(m, 10H), 0.88(t, J = 6.9 Hz, 3H). ¹³C NMR(125 MHz, CDCl₃): δ 174.6, 172.8, 135.8, 128.4, 128.1, 128.0, 69.3, 66.2, 65.8, 31.6, 29.6, 29.2, 29.0(2C's), 28.4, 25.6, 22.5, 13.9.

옥틸 (S)-2-HG

1-옥틸 (S) 2-하이드록시펜탄디오에이트(옥틸 (S)-2-하이드록시글루타레이트; 옥틸 (S)-2-HG): MeOH(50 ml) 중 (S)-5-벤질 1-옥틸 2-하이드록시펜탄디오에이트(0.71 g, 2.0 mmol)의 용액에 5% Pd/C(80 mg)를 첨가하였다. 혼합물에 걸쳐 아르곤 조건을 통과시킨 다음 아르곤을 수소로 대체하고 혼합물을 1 시간 동안 격렬하게 교반하였다. 혼합물을 두꺼운 셀라이트 패드를 통해 여과하고 유기상을 증발시켰다. 잔류물을 25/1 CH₂Cl₂/MeOH로 용출하는 실리카 겔상 플래시 칼럼 크로마토그래피를 통해 정제하여 옥틸 (S)-2-HG(0.495 g, 48%)를 백색 고체로 얻었다. ^lH NMR(500 MHz, CDCl₃): δ 4.23(dd, J = 8.0, 4.2 Hz, 1H), 4.16(t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.60 - 2.42(m, 2H), 2.15(m, 1H), 1.92(dtd, J = 14.2, 8.2, 6.1 Hz, 1H), 1.69 - 1.59(m, 2H), 1.38 - 1.16(m, 10H), 0.86(t, J = 7.0 Hz, 3H). ¹³C NMR(125 MHz, CDCl₃): δ 178.8, 174.8, 69.3, 66.1, 31.7, 29.4, 29.1(2C's), 28.9, 28.4, 25.7, 22.5, 14.0.

1- 옥틸 ( R ) 2- 하이드록시펜탄디오에이트 ( 옥틸 ( R )-2-HG)의 합성

반대 거울상이성질체, 즉 옥틸 (R)-2-HG의 합성을 D-글루탐산으로 시작하여 정확히 동일한 절차에 의해 수행하였다. 분광 데이타는 거울상이성질체 화합물에서와 동일하였다.

C. 엘레간스 에서의 RNAi

C. 엘레간스에서의 RNAi를 pL4440 벡터로부터 표적-유전자 이중-가닥 RNA(dsRNA)를 발현하는 HT115(DE3) 박테리아를 벌레에 섭취시켜 달성하였다. [Timmons & Fire, Nature 395, 854(1998)]을 참고하라. dsRNA 생산을 1 mM IPTG를 함유하는 플레이트 상에서 밤새 유도하였다. 모든 RNAi 섭취 클론을 다르게 언급되지 않으면 C. 엘레간스 ORF-RNAi 라이브러리(Thermo Scientific/Open Biosystems)로부터 수득하였다. C. 엘레간스 TOR(CeTOR) RNAi 클론(Long 등, Curr Biol 12, 1448-1461(2002))을 Joseph Avruch(MGH/Harvard)에서 수득하였다. 효율적인 녹다운을 상응하는 단백질의 웨스턴 블롯팅에 의해 또는 mRNA의 qRT-PCR에 의해 확인하였다. qRT-PCR을 위해 사용된 프라이머 서열은 하기와 같다:

atp-2 정방향: TGACAACATTTTCCGTTTCACC(서열식별번호: 1)

atp-2 역방향: AAATAGCCTGGACGGATGTGAT(서열식별번호: 2)

let-363/ CeTOR 정방향: GATCCGAGACAAGATGAACGTG(서열식별번호: 3)

let-363/ CeTOR 역방향: ACAATTTGGAACCCAACCAATC(서열식별번호: 4)

ogdh -1 정방향: TGATTTGGACCGAGAATTCCTT(서열식별번호: 5)

ogdh -1 역방향: GGATCAGACGTTTGAACAGCAC(서열식별번호: 6)

ogdh -1 및 atp-2 둘 다의 RNAi 녹다운을 정량적 RT-PCR에 의해 검증하고 atp-2 녹다운을 또한 웨스턴 블롯팅에 의해 검증하였다. ogdh -1의 전사체는 85% 감소되었고, atp-2의 전사체 및 단백질 수준은 상응하는 dsRNA를 발현하는 박테리아 상에 배양된 유충에서 각각 52% 및 83% 감소되었다. 또한, atp-2의 RNAi는 지연된 후-배아 발생 및 유충 정지와 관련된 것으로 나타났으며, 이는 atp-2(ua2) 동물의 표현형과 일치한다. qRT-PCR에 의한 분석은 RNAi를 거치는 유충에서 CeTOR 전사체의 26%만큼 보통의, 그러나 유의미한 감소를 시사하였다; 게다가, 자가포식에 대한 분자 마커가 이들 동물에서 유도되었고, 성체의 수명이 연장되었으며, 이는 키나제의 부분 불활성화와 일치한다.

수명 실험에서, RNAi를 외인성 α-KG의 존재 또는 부재 하에 성숙한 동물에서 atp-2, ogdh -1, 및 CeTOR를 불활성화하기 위해 사용하였다. 이들 실험에서 사용된 α-KG의 농도(8 mM)가 야생형 동물을 위해 가장 유익한 것으로 실험적으로 결정되었다(도 1, 패널 c). 이러한 접근법은 α-KG의 보충에 의해 부여되는 장수에 대해 필수적인 단백질 및 경로의 기여를 평가할 수 있도록 하였다. 특히, 배아 및 유충 발생을 끝낸 성체 동물에서 atp-2의 완전하지는 않지만 상당한 불활성화가 가능하였다. 본원에 기재된 바와 같이, 8 mM α-KG를 이용한 보충은 atp-2( RNAi ) 동물의 수명을 추가 연장시키지 않았고(사실 상, 한 경우에서는 심지어 감소시켰고)(도 13), 그렇게 함으로써 atp-2가 관여됨을 시사하였다. 다른 한편으로, atp-2의 완전 불활성화는 치명적일 것이며, 이에 따라 α-KG에 의한 ATP 합성효소 저해의 이점을 차단할 것이다.

수명 분석

표준 프로토콜을 이용해서 고체 선충 성장 배지(NGM) 상에 20℃에서 수명 검정을 수행하였고, 적어도 2 회 독립 실험에서 반복하였다. 적시 산란(Sutphin & Kaeberlein, J Vis Exp(2009)) 또는 수정란 제조(70 ㎕ M9 버퍼, 25 ㎕ 표백제(10% 나트륨 차아염소산염 용액), 및 5 ㎕ 10 N NaOH 중 약 100 개 임신 벌레를 용해시킴(Brenner Genetics 77, 71-94(1974))를 수행하여 C. 엘레간스를 동기화하였다. 어린 성체 동물을 1.5% 디메틸 설폭사이드(DMSO; Sigma, D8418), 49.5 μM 5-플루오로-2'-데옥시우리딘(Sutphin & Kaeberlein, J Vis Exp(2009))(FUDR; Sigma, F0503), D-2-HG(Sigma, H8378), 또는 L-2-HG(Sigma, 90790), 및 α-KG(Sigma, K1128) 또는 비히클 대조군(H₂O)을 함유하는 NGM 검정 플레이트 상에서 픽킹하였다. FUDR을 포함시켜 자손 생산을 예방하였다. α-KG를 함유하는 배지를 NaOH의 첨가에 의해 pH 6.0(대조군 플레이트와 동일한 pH)로 조정하였다. 모든 화합물을 오토클레이브 후 배지 고화 전에 NGM 배지 내로 혼합하였다. 검정 플레이트에 OP50(또는 지정된 RNAi 섭취 클론, 아래 참고)을 첨가하였다. 벌레를 4 일 마다 신규 검정 플레이트로 이동시켰다(충분한 식품이 항상 존재하도록 하고 곰팡이 오염 위험을 감소시키기 위해). 벌레의 생존을 평가하기 위해, 동물을 2-3 일마다 백금 와이어로 자극하고, 반응하지 못하는 것들을 죽은 것으로 스코어링하였다. 돌연변이체 균주에 관한 분석을 위해, 상응하는 친계 균주를 동일한 실험에서 대조군으로서 사용하였다.

RNAi가 관여되는 수명 실험을 위해, 플레이트는 또한 1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG; Acros, CAS 367-93-1) 및 50 ㎍/ml 암피실린(Fisher, BP 1760-25)을 함유하였다. pL4440로부터 표적-유전자 dsRNA를 발현하는 HT115(DE3) 박테리아를 N2 벌레에 섭취시켜 RNAi를 달성하였다(Timmons & Fire, Nature 395, 854(1998)); GFP dsRNA 또는 빈 벡터(동일한 수명 결과를 제공함)를 발현하는 HT115(DE3) 박테리아를 N2 벌레에 섭취시켜 모든 실험에 대한 대조군 RNAi를 병렬 수행하였다.

올리고마이신(Cell Signaling Technology, 9996)을 이용한 수명 실험을 α-KG에 대해 기재된 바에 따라 수행하였다(1.5% DMSO 및 49.5 μM FUDR 함유 NGM 플레이트; N2 벌레; OP50 박테리아).

smg -1( cc546ts ); pha -4( zu225 ) 및 smg -1( cc546ts )에 관한 수명 실험을 위해(Timmons & Fire, Nature 395, 854(1998); 및 Gaudet & Mango, Science 295, 821-825(2002)), 균주를 24℃에서 수정란에서부터 L4 단계로 성장시켰고, 이는 smg-1 온도-민감성 대립유전자를 불활성화하여 pha -4( zu225 ) mRNA의 미성숙 정지 코돈을 함유하는 mRNA 감시-매개된 분해를 예방함으로써 끝이 잘렸지만 완전히 기능적인 PHA-4 전사 인자를 생성한다(Gaudet & Mango, Science 295, 821-825(2002)). 이어서 L4 단계에 온도를 20℃로 옮기고, 이는 smg -1 기능을 회복시킴으로써 pha -4( zu225 ) mRNA의 분해를 일으킨다. α-KG를 이용한 처리를 L4 단계에 시작하였다.

샘플 크기를 포함하는 수명 데이타를 도 13에 제공한다. 샘플 크기를 공개 문서 분야에서 수행된 표준에 근거하여 선택하였다. 샘플 크기를 미리 결정하기 위해 통계적인 방법은 사용하지 않았다. 동물을 실험 그룹으로 무작위로 배정하였다. 파열하거나 부풀거나(예를 들면, 내부 자손 부화를 나타냄), 또는 기어나온 벌레는 검열하였다. 수명 데이타를 GraphPad Prism을 이용해서 분석하였다; P-값을 로그-순위(Mantel-Cox) 시험을 이용해서 계산하였다.

식품 선호 검정

Abada 등(Mol Cells 28, 209-213(2009))에서 채택된 프로토콜을 하기와 같이 수행하였다. 10 cm NGM 플레이트에 도 5, 패널 e에 나타낸 바와 같이 2 개 스팟의 OP50을 접종하였다. OP50 잔디를 2 일에 걸쳐 실온에서 건조하도록 둔 후, 비히클(H₂O) 또는 α-KG(8 mM)을 잔디 상부에 첨가하고 2 일에 걸쳐 실온에서 건조하도록 두었다. 약 50-100 개의 동기화된 성체 1 일령 벌레를 플레이트의 중심 상에 놓고, 박테리아 잔디 중 어느 하나에 대한 이들의 선호를 실온에서 3 시간 후 기록하였다.

약물 친화도 반응성 표적 안정성(DARTS)을 이용한 표적 확인

DARTS를 이용한 표적 확인을 당해분야에 공지된 방법에 따라 수행하였다. 예를 들면 [Lomenick 등, PNAS USA 106, 21984-21989(2009)]을 참고하라. 비편향 표적 ID에 있어서(도 2, 패널 a), 인간 Jurkat 세포를 프로테아제 저해제(Roche, 11836153001) 및 포스파타제 저해제(Lomenick 등, Curr Protoc Chem Biol 3, 163-180(2011))의 첨가로 M-PER(Thermo Scientific, 78501)을 사용해서 용해시켰다. TNC 버퍼(50 mM 트리스-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl, 10 mM CaCl₂)를 용해물에 첨가한 뒤 단백질 농도를 BCA 단백질 검정 키트(Pierce, 23227)를 이용해서 결정하였다. 세포 용해물을 비히클(H₂O) 또는 α-KG와 함께 얼음 상에서 1 시간 동안, 그 다음 추가 20 분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 소화를 프로나제(Roche, 10165921001)를 이용해서 실온에서 30 분 동안 수행하고 과잉 프로테아제 저해제를 이용해서 중단한 후 얼음으로 즉각 옮겼다. 수득한 소화물을 SDS-PAGE에 의해 분리하고 SYPRO Ruby 단백질 겔 염색(Invitrogen, S12000)을 이용해서 가시화하였다. α-KG 레인에서 증가된 염색을 갖는 밴드(α-KG의 결합에 의해 단백질분해로부터 보호되는 잠재적인 단백질 표적에 상응함) 및 대조군 레인에서 매치되는 영역을 절제하고, 겔-내 트립신 소화시키고, 기재된 바와 같이 LC-MS/MS 분석을 거쳤다(Lomenick 등, PNAS USA 106, 21984-21989(2009); 및 Lomenick 등, ACS Chem Biol 6, 34-46(2011)). 질량 분광분석법 결과를 Mascot 버전 2.3.0을 이용해서 인간 Swissprot 데이타베이스(출시 57.15)에 대해 검색하였고, 모든 펩타이드는 0.05의 유의성 역치에 부합하였다.

DARTS-웨스턴 블롯팅에 의한 표적 검증을 위해(도 2, 패널 b), HeLa 세포를 프로테아제 저해제(Roche, 11836153001) 및 포스파타제 저해제(50 mM NaF, 10 mM β-글리세로포스페이트, 5 mM 나트륨 파이로포스페이트, 2 mM Na₃VO₄)가 첨가된 M-PER 버퍼(Thermo Scientific, 78501) 중에 용해시켰다. 냉각된 TNC 버퍼(50 mM 트리스-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl, 10 mM Cal₂)를 단백질 용해물에 첨가하고, 용해물의 단백질 농도를 BCA 단백질 검정 키트(Pierce, 23227)에 의해 측정하였다. 이어서 단백질 용해물을 Eppendorf Thermomixer에서 600 rpm에서 진탕하면서 실온에서 3 시간 동안 비히클 대조군(H₂O) 또는 가변 농도의 α-KG와 함께 인큐베이션하였다. 프로나제(Roche, 10165921001) 소화를 20 분 동안 실온에서 수행하고, SDS 로딩 버퍼를 첨가하고 즉시 70℃에서 10 분 동안 가열하여 중단시켰다. 샘플을 4-12% 비스-트리스 구배 겔(Invitrogen, NP0322BOX) 상에서 SDS-PAGE를 거치고 ATP 합성효소 서브유닛 ATP5B(Sigma, AV48185), ATP5O(Abeam, ab91400), 및 ATP5A(Abeam, ab110273)에 대해 웨스턴 블롯팅하였다. α-KG가 공동-기질(Stubbs 등, J Med Chem 52, 2799-2805(2009))인 PHD-2/Egln1(D31E11) 토끼 mAb(Cell Signaling Technology, 4835) 및 α-KG 간 결합을 DARTS에 의해 확인하였다. GAPDH(Ambion, AM4300)를 음성 대조군으로 사용하였다.

C. 엘레간스를 이용한 DARTS를 위해(도 6, 패널 a), 다양한 연령의 야생형 동물을 NGM/OP50 플레이트 상에 성장시키고, M9 버퍼로 4 회 세정하고, 즉시 -80℃ 냉동고에 넣었다. 동물을 4℃ 방에서 용해 매트릭스 C 튜브(MP Biomedicals, 6912-100) 및 FastPrep-24(MP Biomedicals) 고속 벤치탑 균질기를 이용해서 HEPES 버퍼(40 mM HEPES pH 8.0, 120 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.5% 트리톤 X-100, 10 mM β-글리세로포스페이트, 50 mM NaF, 0.2 mM Na₃VO₄, 프로테아제 저해제(Roche, 11836153001)) 중에 용해시켰다(6.5 m/s로 20 초 동안 벌레를 손상시키고, 1 분 동안 얼음 상에 휴지시키고; 2 회 반복함). 용해된 동물을 4℃에서 10 분 동안 14,000 rpm에서 원심분리하여 벌레 잔해를 펠렛화하고, DARTS를 위해 상청액을 수집하였다. 단백질 농도를 BCA 단백질 검정 키트(Pierce, 23223)를 이용해서 결정하였다. 1.13 ㎍/㎕의 벌레 용해물 농도를 DARTS 실험을 위해 사용하였다. 모든 단계를 얼음 상에서 또는 4℃에서 수행하여 미성숙 단백질 분해의 예방을 도왔다. TNC 버퍼(50 mM 트리스-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl, 10 mM CaCl₂)를 벌레 용해물에 첨가하였다. 벌레 용해물을 얼음 상에서 1 시간 동안, 그 다음 실온에서 50 분 동안 비히클 대조군(H₂O) 또는 α-KG와 인큐베이션하였다. 프로나제(Roche, 10165921001) 소화를 실온에서 30 분 동안 수행하고, SDS 로딩 버퍼 첨가 및 70℃에서 10 분 동안 가열에 의해 중단시켰다. 이어서 샘플을 NuPAGE Novex 4-12% 비스-트리스 구배 겔(Invitrogen, NP0322BOX) 상에서 SDS-PAGE를 거치고, 웨스턴 블롯팅을 ATP-2를 또한 인식하는 ATP5B(Sigma, AV48185)에 대한 항체로 수행하였다.

2-HG 실험을 위해, DARTS를 상기에서 기재된 바와 같이 수행하였다. 간단히, U87 세포를 프로테아제(Roche, 11836153001) 및 포스파타제(50 mM NaF, 2 mM Na₃VO₄) 저해제의 첨가로 M-PER 버퍼(Thermo Scientific, 78501) 중에 용해시켰다. 냉각된 TNC 버퍼(50 mM 트리스-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl, 10 mM CaCl₂)를 용해물에 첨가하고, 용액의 단백질 농도를 BCA 단백질 검정 키트(Pierce, 23227)에 의해 분취량 상에서 측정하였다. 이어서 잔여 용해물을 0.5 시간 동안 실온에서 비히클 대조군(H₂O) 또는 가변 농도의 2-HG 또는 α-KG와 함께 인큐베이션하였다. 이어서 샘플을 프로나제 소화를 거치고(Roche, 10165921001, 실온에서 5 분), SDS 로딩 버퍼의 첨가 및 즉각적인 가열(95℃, 5 분)에 의해 중단시켰다. 샘플을 4-12% 비스-트리스 구배 겔(Invitrogen, NP0322BOX) 상에서 SDS-PAGE를 거치고 웨스턴 블롯팅을 ATP5B(Sigma, AV48185) 또는 GAPDH(Santa Cruz, SC25778)에 대한 항체로 수행하였다.

복합체 V 활성 검정

복합체 V 활성을 MitoTox OXPHOS 복합체 V 활성 키트(Abeam, ab109907)를 이용해서 분석하였다. 비히클(H₂O) 또는 α-KG를 인지질 첨가 전에 효소와 혼합하였다. 옥틸 α-KG를 사용하는 실험에서, 비히클(1% DMSO) 또는 옥틸 α-KG에 인지질을 첨가하였다. 상대 복합체 V 활성을 비히클과 비교하였다. 올리고마이신(Sigma, O4876)을 검정을 위한 양성 대조군으로 사용하였다.

마우스 간으로부터 미토콘드리아의 단리

동물 연구을 승인된 UCLA 동물 연구 프로토콜 하에 수행하였다. 3-월령 C57BL/6 마우스로부터의 미토콘드리아를 기재된 바와 같이 단리하였다(Rogers 등, PLoS One 6, e21746(2011)). 간단히, 간을 추출하고, MSHE+BSA 중 4℃에서 다지고(70 mM 수크로스, 210 mM 만니톨, 5 mM HEPES, 1 mM EGTA, 및 0.5% 지방산 비함유 BSA, pH 7.2), 몇 번 헹궈서 혈액을 제거하였다. 모든 후속 단계를 얼음 상에서 또는 4℃에서 수행하였다. 조직을 유리 Dounce 균질기(5-6 회 스트로크)로 10 용적의 MSHE+BSA로 파괴하고, 균질물을 800 x g에서 10 분 동안 원심분리하여 조직 잔해 및 핵을 제거하였다. 상청액을 세포 분주기를 통해 경사분리하고 8,000 x g에서 10 분 동안 원심분리하였다. 진한 미토콘드리아 펠렛을 MSHE+BSA에서 재현탁시키고 8,000 x g에서 10 분 동안 재-원심분리하였다. 최종 미토콘드리아 펠렛을 아래에서 기재된 바와 같이 다양한 검정을 위해 사용하였다.

서브-미토콘드리아 입자( SMP ) ATPase 검정

ATP 합성효소에 의한 ATP 가수분해를 서브-미토콘드리아 입자를 이용해서 측정하였다([Alberts, B. Molecular Biology of the Cell. 3rd edn, (Garland Pub., 1994)] 및 내부의 참조문헌 참고). 미토콘드리아를 상기에서 기재된 바와 같이 마우스 간으로부터 단리하였다. 최종 미토콘드리아 펠렛을 10 ㎍/㎕로 버퍼 A(250 mM 수크로스, 10 mM 트리스-HCl, 1 mM ATP, 5 mM MgCl₂, 및 0.1 mM EGTA, pH 7.4)에서 재현탁시키고, 얼음 상에서 초음파처리(Fisher Scientific Model 550 Sonic Dismembrator; 중간 파워, 총 60 초의 초음파처리 동안 10 초 간격의 초음파처리 및 얼음 상 휴지를 교대함)한 다음 4℃에서 10 분 동안 18,000 x g로 원심분리하였다. 상청액을 수집하고 4℃에서 45 분 동안 100,000 x g로 원심분리하였다. 최종 펠렛(서브-미토콘드리아 입자)을 버퍼 B(250 mM 수크로스, 10 mM 트리스-HCl, 및 0.02 mM EGTA, pH 7.4)에서 재현탁시켰다.

SMP ATPase 활성을 상기와 같이 복합체 V 활성 버퍼를 사용하여 분석하였다. ADP 생산은 피루베이트 키나제 및 락테이트 탈수소효소를 통해 NADH의 NAD⁺로의 산화와 커플링된다. α-KG의 첨가(최대 10 mM)는 외부 ADP를 첨가했을 때 피루베이트 키나제 또는 락테이트 탈수소효소의 활성에 영향을 미치지 않았다. 340 nm에서 NADH의 흡광도 감소는 ATPase 활성에 관련된다. SMP(2.18 ng/㎕)를 활성 버퍼의 첨가 전에 실온에서 90 분 동안 비히클 또는 α-KG와 인큐베이션한 다음 340 nm에서 NADH의 흡광도 감소를 1 시간 동안 1 분 마다 측정하였다. 올리고마이신(Cell Signaling Technology, 9996)을 검정을 위한 양성 대조군으로 사용하였다.

ATP 수준에 대한 검정

정상 인간 2 배체 섬유아세포 WI-38(ATCC, CCL-75) 세포를 2 x 10⁴ 세포/웰로 96-웰 플레이트에 접종하였다. 세포를 2 시간 동안 가변 농도에서 DMSO(비히클 대조군) 또는 옥틸 α-KG로 3 개씩 처리하였다. ATP 수준을 CellTiter-Glo 발광성 ATP 검정(Promega, G7572)을 이용하여 측정하고; 발광을 Analyst HT(Molecular Devices)를 이용해서 판독하였다. 동시에, 동일하게 처리된 세포를 M-PER(Thermo Scientific, 78501) 중에 용해시켜 BCA 단백질 검정 키트(Pierce, 23223)에 의해 단백질 농도를 수득하였다. ATP 수준을 단백질 함량에 대해 정규화하였다. 통계 분석을 GraphPad Prism(페어링되지 않은 t-테스트)을 이용해서 수행하였다.

C. 엘레간스에서 ATP 수준에 대한 검정. 동기화된 1 일령 성체 야생형 C. 엘레간스를 비히클 또는 8 mM α-KG를 함유하는 NGM 플레이트 상에 배치하였다. 성체기 2 및 8 일에, 약 100 개 벌레의 9 개 복제물 및 4 개 복제물을 각각 α-KG 또는 비히클 대조군 플레이트로부터 수집하고, M9 버퍼 중에 4 회 세정하고, -80℃에서 냉동하였다. 동물을 용해 매트릭스 C 튜브(MP Biomedicals, 6912-100) 및 FastPrep-24(MP Biomedicals) 고속 벤치톱 균질기를 이용해서 용해시켰다(6.5 m/s로 20 초 동안 벌레를 파괴하고, 1 분 동안 얼음 상에 휴지시키고; 2 회 반복함). 용해된 동물을 4℃에서 10 분 동안 14,000 rpm에서 원심분리하여 벌레 잔해를 펠렛화하고, 상청액을 제조자의 설명서에 따라 Kinase-Glo 발광 키나제 검정 플랫폼(Promega, V6713)을 이용해서 ATP 정량을 위해 보관하였다. 검정을 백색 불투명 96 웰 조직 배양 플레이트(Falcon, 353296)에서 수행하고, 발광을 Analyst HT(Molecular Devices)를 이용해서 측정하였다. ATP 수준을 벌레의 수에 대해 정규화하였다. 통계 분석을 Microsoft Excel(t-테스트, 2-테일화, 2 개-샘플 비균등 분산)을 이용해서 수행하였다.

2-HG 실험을 위해, U87 세포를 2 x 10⁴ 세포/웰로 96-웰 플레이트에 접종하고 2 시간 동안 표시된 화합물로 3 개씩 처리하였다. ATP 수준을 CellTiter-Glo 발광 ATP 검정(Promega, G7572)을 이용하여 측정하고; 발광을 Analyst HT(Molecular Devices)를 이용하여 판독하였다. 세포 수가 처리 간에 일치함을 확인하기 위해, 세포 용해물을 QuantiFluor dsDNA 시스템(Promega)을 이용해서 dsDNA 염색을 추가로 거쳤다. 통계 분석을 GraphPad Prism(페어링되지 않은 t-테스트)을 이용해서 수행하였다.

산소 소비율(OCR) 및 세포외 산성화율(ECAR)의 측정

OCR 측정을 Seahorse XF-24 분석기(Seahorse Bioscience)를 이용해서 수행하였다(Wu 등, Am J Physiol Cell Physiol 292, C125-136(2007)). 세포를 10% FBS 및 10 mM 글루코스가 보충된 DMEM 배지 중 50,000 세포/웰로 Seahorse XF-24 세포 배양 마이크로플레이트에 접종하고, 밤새 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 1 시간 동안 옥틸 α-KG 또는 DMSO(비히클 대조군)로 처리하였다. 세포를 측정 직전에 비완충 DMEM 배지(pH 7.4, 10 mM 글루코스) 중에 세정하고, 표시된 농도의 옥틸 α-KG로 이러한 버퍼 중에 유지하였다. 산소 소비율을 기저 조건 하에 3 회 측정하고, 단백질 농도/웰에 대해 정규화하였다. 통계 분석을 GraphPad Prism을 이용해서 수행하였다.

생존 C. 엘레간스에서 산소 소비율(OCR)의 측정을 Yamamoto 등(Cell 147, 827-839(2011)) 및 Pathare 등(PLoS Genet 8, e1002645(2012))에서 채택된 프로토콜을 이용해서 수행하였다. 야생형 1 일령 성체 N2 벌레를 OP50 또는 HT115 E. 콜리가 접종된 8 mM α-KG 또는 H₂O(비히클 대조군) 함유 NGM 플레이트 상에 배치하였다. OCR을 성체기 2 일령에 평가하였다. 성체기 2 일령에, 벌레를 수집하고 M9로 4 회 세정하여 박테리아 샘플을 제거한 다음(본 발명자들은 α-KG가 박테리아의 산소 소비에 영향을 미치지 않음을 추가로 확인하였다-따라서 세정 후 임의의 잔존 박테리아가 존재한 경우, 관측된 OCR에서의 변화는 여전히 벌레-특이적일 것이다), 동물을 약 200 마리 벌레/웰로 200 ㎕ M9 중에 Seahorse XF-24 세포 배양 마이크로플레이트(Seahorse Bioscience, V7-PS)에 4 개씩 접종하였다. 산소 소비율을 기저 조건 하에 7 회 측정하고 웰 당 카운트된 벌레의 수에 대해 정규화하였다. 실험을 2 회 반복하였다. 통계 분석을 Microsoft Excel(t-테스트, 2-테일화, 2 개-샘플 비균등 분산)을 이용해서 수행하였다.

2-HG 실험을 위해, OCR 및 ECAR 측정을 Seahorse XF-24 분석기(Seahorse Bioscience)를 이용해서 수행하였다(Wu 등, Am J Physiol Cell Physiol 292, C125-136(2007)). U87 세포를 10% FBS 및 10 mM 글루코스 또는 10 mM 갈락토스가 보충된 DMEM 중 50,000 세포/웰로 Seahorse XF-24 세포 배양 마이크로플레이트에 접종하고 5% CO₂ 중 37℃에서 O/N 인큐베이션하였다. 옥틸 α-KG, 옥틸 (R)-2-HG, 옥틸 (S)-2-HG, 또는 DMSO(비히클 대조군)를 이용해서 1 시간 동안 처리하였다. 세포를 측정 직전에 비완충 DMEM(pH 7.4, 10 mM 글루코스) 중에 세정하고, 표시된 농도의 화합물을 함유하는 이러한 버퍼 중에 유지하였다. OCR 또는 ECAR을 기저 조건 하에 3 회 측정하고 웰 당 단백질 농도에 대해 정규화하였다. 통계 분석을 GraphPad Prism(페어링되지 않은 t-테스트, 2-테일화, 2 개-샘플 비균등 분산)을 이용해서 수행하였다.

미토콘드리아 호흡 조절비( RCR )의 측정

미토콘드리아 RCR을 단리된 마우스 간 미토콘드리아를 이용해서 분석하였다([Brand 등, Biochem J 435, 297-312(2011)] 및 내부의 참조문헌 참고). 미토콘드리아를 상기에서 기재된 바와 같이 마우스 간으로부터 단리하였다. 최종 미토콘드리아 펠렛을 30 ㎕의 MAS 버퍼(70 mM 수크로스, 220 mM 만니톨, 10 mM KH₂PO₄, 5 mM MgCl₂, 2 mM HEPES, 1 mM EGTA, 및 0.2% 지방산 비함유 BSA, pH 7.2)에서 재현탁시켰다.

단리된 미토콘드리아 호흡을 기재된 바와 같이 커플링 및 전자 흐름 검정의 수행에 의해 측정하였다(Rogers 등, PLoS One 6, e21746(2011)). 커플링 검정을 위해, 완전 MAS 버퍼(10 mM 석시네이트 및 2 μM 로테논이 보충된 MAS 버퍼) 중 20 ㎍의 미토콘드리아를 4℃에서 20 분 동안 2,000 x g에서 원심분리에 의해 XF24 Seahorse 플레이트 내로 접종하였다. 검정 직전에, 미토콘드리아에 총 500 ㎕에 대해 완전 MAS 버퍼를 보충하고(1% DMSO, 옥탄올, 옥틸 α-KG, 또는 옥틸 2-HG 함유), 산소 소비율 측정을 시작하기 전 30 분 동안 37℃에서 가온하였다. 미토콘드리아 호흡은 커플링된 상태 2에서 시작된다; 상태 3은 2 mM ADP에 의해 개시된다; 상태 4o(올리고마이신-비민감성, 즉 복합체 V-독립적)는 2.5 μM 올리고마이신에 의해 유도되며, 상태 3u(FCCP 미커플링 최대 호흡능)는 4 μM FCCP에 의해 유도된다. 마지막으로, 1.5 ㎍/ml 안티마이신 A를 검정 말기에 주사하였다. 상태 3/상태 4o 비는 호흡 조절비(RCR)를 제공한다.

전자 흐름 검정을 위해, MAS 버퍼에 10 mM 나트륨 피루베이트(복합체 I 기질), 2 mM 말레이트(복합체 II 저해제), 및 4 μM FCCP를 보충하고, 미토콘드리아를 커플링 검정을 위해 기재된 것과 동일한 방식으로 접종한다. 기저 판독 후, 순차적인 주사는 하기와 같았다: 2 μM 로테논(복합체 I 저해제), 10 mM 석시네이트(복합체 II 기질), 4 μM 안티마이신 A(복합체 III 저해제), 및 10 mM/100 μM 아스코르베이트/테트라메틸페닐렌디아민(복합체 IV 기질).

ATP 합성효소 효소 저해 속도론

ATP 합성 효소 저해 속도론 분석을 단리된 미토콘드리아를 이용해서 수행하였다. 미토콘드리아를 상기에서 기재된 바와 같이 마우스 간으로부터 단리하였다. 최종 미토콘드리아 펠렛을 5 mM 나트륨 아스코르베이트(Sigma, A7631) 및 5 mM TMPD(Sigma, T7394)가 보충된 MAS 버퍼에서 재현탁시켰다.

반응을 5 mM 나트륨 아스코르베이트, 5 mM TMPD, 루시퍼라아제 시약(Roche, 11699695001), 옥탄올 또는 옥틸 α-KG, 가변량의 ADP(Sigma, A2754), 및 3.75 ng/㎕ 미토콘드리아를 함유하는 MAS 버퍼에서 수행하였다. ATP 합성을 발광분석기(Analyst HT, Molecular Devices)에 의해 경시적으로 발광 증가에 의해 모니터링하였다. 올리고마이신-비민감성 발광으로부터 유도된 ATP 합성효소-독립적 ATP 형성을 배경으로 공제하였다. ATP 합성의 초기 속도를 속도가 감소하기 시작하기 전에 반응의 최초 3 분 동안의 기울기로부터 계산하였다. 효소 저해 속도론을 GraphPad Prism을 이용해서 비선형 회귀 최소 자승 피팅에 의해 분석하였다.

포유동물 TOR( mTOR ) 경로 활성에 대한 검정

옥틸 α-KG, 2-HG, 또는 올리고마이신으로 처리된 세포에서의 mTOR 경로 활성을 S6K(T389), 4E-BP1(S65), AKT(S473), 및 ULK1(S757)을 포함하는 공지된 mTOR 기질의 인산화 수준에 의해 결정하였다(Pullen & Thomas, FEBS Lett 410, 78-82(1997); Burnett 등, PNAS USA 95, 1432-1437(1998); Gingras 등, Genes Dev 15, 2852-2864(2001); Sarbassov 등, Science 307, 1098-1101(2005); 및 Kim 등, Nat Cell Biol 13, 132-141(2011)). 사용된 특이적 항체: P-S6K T389(Cell Signaling Technology, 9234), S6K(Cell Signaling Technology, 9202S), P-4E-BP1 S65(Cell Signaling Technology, 9451S), 4E-BP1(Cell Signaling Technology, 9452S), P-AKT S473(Cell Signaling Technology, 4060S), AKT(Cell Signaling Technology, 4691S), P-ULK1 S757(Cell Signaling Technology, 6888), ULK1(Cell Signaling Technology, 4773S), 및 GAPDH(Santa Cruz Biotechnology, 25778).

자가포식에 대한 검정

통합된 GFP:LGG-1 번역 융합 유전자를 수반하는 DA2123 동물(Kang 등, Genes Dev 21, 2161-2171(2007); Hansen 등, PLoS Genet 4, e24(2008); 및 Alberti 등, Autophagy 6, 622-633(2010))을 사용하여 자가포식 수준을 정량하였다. 동기화된 DA2123 집단을 수득하기 위해, 임신 성체의 수정란 제조물을 제조하고(약 100 마리의 임신 벌레를 70 ㎕ M9 버퍼, 25 ㎕ 표백제 및 5 ㎕ 10 N NaOH 중에 용해시킴), 수정란이 M9 중에 밤새 부화하도록 두어 기아 유도된 L1 휴면기를 유도하였다. L1 유충을 비히클, 8 mM α-KG, 또는 40 μM 올리고마이신을 함유하는 NGM 처리 플레이트 상에 놓고 E. 콜리 OP50, 빈 벡터를 포함하는 HT113(DE3), 또는 나타낸 바와 같이 atp-2, CeTOR /let-363, 또는 ogdh -1을 표적으로 하는 dsRNA를 발현하는 HT115(DE3)를 접종하였다. 주어진 샘플 중 대다수의 동물이 중간 L3단계에 최초 도달하면, 개별 L3 유충을 현미경 슬라이드 상에 실장하고 1.6 mM 레바미솔(Sigma, 31742)로 마취하였다. 선충을 LSM5 파스칼 레이저를 갖춘 Axiovert 200M Zeiss 공초점 현미경을 이용하여 관측하고, 이미지를 LSM 이미지 조사기(Zeiss)를 이용해서 포착하였다. 각각의 시료에 있어서, 측면 연결 세포 및 Hyp7을 포함하는 표피 내의 GFP:LGG-1 반점(자가포식소체)을 ImageJ(Schneider 등, Nat Methods 9, 671-675(2012))에서 입자 분석을 이용하여 140.97 ㎛²의 3 개의 별도 영역에서 카운팅하였다. 측정은 유전자형 및 보충에 대해 모두 맹검 방식으로 수행하였다. 통계 분석을 Microsoft Excel(t-테스트, 2-테일화, 2 개-샘플 비균등 분산)을 이용해서 수행하였다.

포유동물 세포에서 자가포식에 대한 검정. HEK-293 세포를 10% FBS 및 10 mM 글루코스가 보충된 DMEM 배지 중 2.5 x 10⁵ 세포/웰로 6-웰 플레이트에 접종하고, 72 시간 동안 옥탄올(비히클 대조군) 또는 옥틸 α-KG의 처리 전에 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 프로테아제 및 포스파타제 저해제를 함유하는 M-PER 버퍼 중에 용해시켰다. 용해물을 MES 수행 버퍼로 4-12% 비스-트리스 구배 겔 상에서 SDS-PAGE를 거치고, LC3(Novus, NB100-2220)에 대해 웨스턴 블롯팅하였다. LC3은 벌레 LGG-1의 포유동물 동족체이며, 가용성 LC3-I에서 지질화된 LC3-II로의 전환은 자가포식에서, 예를 들면 기아 시 활성화된다(Kabeya 등, EMBO J 19, 5720-5728(2000)).

8 mM α-KG로 처리된 C. 엘레간스 의 인두 펌핑률

조건 당 20 마리의 야생형 N2 벌레의 인두 펌핑률을 평가하였다. 인두 수축을 12-배 광학 줌으로 부착된 Sony NDR-XR500V 카메라 및 Zeiss M2BioDiscovery 현미경을 이용해서 1 분 동안 녹화하였다. 수득한 비디오를 MPlayerX를 이용해서 0.3x 속도로 뒤로 플레이하고 인두 펌핑을 카운트하였다. 통계 분석을 Microsoft Excel(t-테스트, 2-테일화, 2 개-샘플 비균등 분산)을 이용해서 수행하였다.

C. 엘레간스 에서 α-KG 수준의 검정

동기화된 성체 벌레를 비히클(H₂O) 또는 8 mM α-KG를 함유하는 플레이트로부터 수집하고, M9 버퍼로 3 회 세정하고, 급속 냉동하였다. 벌레를 4℃ 방에서 용해 매트릭스 C 튜브(MP Biomedicals, 6912-100) 및 FastPrep-24(MP Biomedicals) 고속 벤치탑 균질기를 이용해서 M9 중에 용해시켰다(6.5 m/s로 20 초 동안 벌레를 파괴하고, 1 분 동안 얼음 상에 휴지시킴; 3 회 반복함). 용해된 동물을 4℃에서 10 분 동안 14,000 rpm에서 원심분리하여 벌레 잔해를 펠렛화하고, 상청액을 보관하였다. 상청액의 단백질 농도를 BCA 단백질 검정 키트(Pierce, 23223)를 이용해서 결정하였다; α-KG 처리된 동물 및 비히클 처리된 동물에서 벌레 당 단백질 수준에는 차이가 없었다(데이타는 나타내지 않음). α-KG 함량을 이전에 기재된 바와 같이, 개질을 포함하여 평가하였다(MacKenzie 등, Mol Cell Biol 27, 3282-3289(2007)). 벌레 용해물을 37℃에서 10 분 동안 100 mM KH₂PO₄(pH 7.2), 10 mM NH₄Cl, 5 mM MgCl₂, 및 0.3 mM NADH 중에 인큐베이션하였다. 이어서 글루타메이트 탈수소효소(Sigma, G2501)를 1.83 units/ml의 최종 농도에 도달하도록 첨가하였다. 이들 조건 하에, 글루타메이트 탈수소효소는 α-KG 및 NADH를 사용하여 글루타메이트를 제조한다. 흡광도 감소를 340 nm에서 모니터링하였다. α-KG의 세포내 수준을 NADH의 흡광도 감소로부터 결정하였다. 동물 내부에 존재하는 α-KG의 근사 몰농도를 평균 단백질 함량(약 245 ng/벌레, BCA 검정으로부터) 및 용적(길이 1.1 mm 및 직경 60 ㎛인 성체 벌레에 대해 약 3 nL(WorldWideWeb.wormatlasDOTORG/hermaphrodite/introduction/Introframeet.HyperTextMarkupLanguage, 여기서 "WorldWideWeb"은 "www"이며, "DOTORG"는 ".org"이고, "HyperTextMarkupLanguage"는 "html"임))을 이용하여 산정하였다.

UHPLC-ESI/MS/MS을 이용하여 벌레에서의 α-KG의 정량 분석을 위해, 동기화된 1 일령 성체 벌레를 24 시간 동안 박테리아 함유 또는 비함유 비히클 플레이트 상에 배치한 다음 상술된 바와 동일한 방식으로 수집하고 용해시켰다. LC/MS/MS에 의한 α-KG 분석을 Agilent Jet Stream 기술로 전기분무 이온화(ESI) 공급원을 이용하여 Agilent 1290 Infinity UHPLC 시스템 및 6460 삼중 사중극자 질량 분광분석기(Agilent Technologies) 상에서 수행하였다. 데이타를 Agilent MassHunter 데이타 획득 소프트웨어 버전 B.06.00으로 획득하고, MassHunter Qualitative 분석 소프트웨어 버전 B.06.00을 이용하여 전구체 및 생성물 이온 선택에 대해 그리고 QQQ 소프트웨어 버전 B.06.00에 대한 MassHunter Quantitative Analysis을 이용한 보정 및 정량을 위해 가공하였다.

UHPLC를 위해, 3 ㎕ 보정 표준 및 샘플을 빌트-인 진공 가스제거기 및 온도조절된 G4226A 고성능 자동시료주입기를 갖춘 G4220A 2 원 펌프를 포함하는 UHPLC 시스템 상에 주사하였다. Waters Corporation의 ACQUITY UPLC BEH 아마이드 분석 칼럼(2.1 x 50 mm, 1.7 ㎛) 및 VanGuard BEH 아마이드 사전-칼럼(2.1 x 5 mm, 1.7 ㎛)을 이용하여 0.6 ml/분의 유속으로 10 mM 암모늄 아세테이트를 함유하는 50/50/0.04 아세토니트릴/물/수산화암모늄을 이동상 A로 및 10 mM 암모늄 아세테이트를 함유하는 95/5/0.04 아세토니트릴/물/수산화암모늄을 이동상 B로 사용하였다. 칼럼을 실온에서 유지하였다. 하기 구배를 적용하였다: 0-0.41 분: 100% B 등용매; 0.41-5.30 분: 100-30% B; 5.3-5.35 분: 30-0% B; 5.35-7.35 분: 0% B 등용매; 7.35-7.55 분: 0-100% B; 7.55-9.55 분: 100% B 등용매.

MS 검출을 위해, ESI 질량 스펙트럼 데이타를 MRM에 의한 음성 이온화 방식 상에 기록하였다. α-KG의 MRM 전이 및 그것의 ISTD ¹³C₄-α-KG(Cambridge Isotope Laboratories)를 0.6 ml/분의 유속으로 칼럼을 통해 1-분 37% B 등용매 UHPLC 방법을 이용해서 결정하였다. 최고 신호 대 노이즈비를 갖는 [M-H]^-의 전구체 이온 및 [M-CO₂-H]^-의 생성물 이온을 관측하였다. 전구체 및 생성물 이온은 AKG에 대해 각각 145.0 및 100.9이고 ISTD ¹³C₄-α-KG에 대해 149.0 및 104.9이다. 질소를 건조, 차단, 및 충돌 가스로 사용하였다. 모든 공급원 및 분석기 파라미터를 각각 Agilent MassHunter Source 및 iFunnel Optimizer 및 Optimizer 소프트웨어를 이용해서 최적화하였다. 공급원 파라미터는 하기와 같다: 건조 가스 온도 120℃, 건조 가스 흐름 13 L/분, 분무기 압력 55 psi, 차단 가스 온도 400℃, 차단 가스 흐름 12 L/분, 모세관 전압 2000 V, 및 노즐 전압 0 V. 분석기 파라미터는 하기와 같다: 단편화기 전압 55 V, 충돌 에너지 2 V, 및 세포 가속화제 전압 1 V. 1 분 전 및 5.3 분 후 UHPLC 용출물을 폐기물로 전환하였다.

α-KG의 막 투과성 에스테르

α-KG의 막-투과성 에스테르, 옥틸 α-KG(MacKenzie 등, Mol Cell Biol 27, 3282-3289(2007); Zhao 등, Science 324, 261-265(2009); Xu 등, Cancer Cell 19, 17-30(2011); 및 Jin 등, Cancer Res 73, 496-501(2013))을 사용하여 세포 및 미토콘드리아를 사용하는 실험에서 지질 막을 거쳐 α-KG를 전달하였다. 세포성 에스테라제에 의한 가수분해 시, 옥틸 α-KG는 α-KG 및 부산물 옥탄올을 산출한다. 옥탄올 대조군은 효과를 갖지 않는 반면(도 6, 패널 e-f 및 도 10, 패널 a), α-KG만 ATP 합성효소에 결합하여 이를 저해하고(도 2, 패널 a-b, 도 6, 패널 a-b, 데이타는 나타내지 않음), ATP 및 OCR을 감소시키고(도 2, 패널 e, 및 도 2, 패널 g), 자가포식을 유도하고(도 4, 패널 b), C. 엘레간 스 수명을 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다(도 1, 도 3, 도 5, 도 9, 및 도 13). 미토콘드리아 및 세포 배양 실험에서 에스테라제의 존재 및 활성을 가수분해 시 형광을 내는 에스테라제 기질 칼세인 AM(C1430, Molecular Probes)을 사용해서, 또한 질량 분광분석법에 의해(데이타는 나타내지 않음) 확인하였다. 에스테라제에 의한 가수분해는 α-KG의 구별되는 에스테르, 예컨대 1-옥틸 α-KG, 5-옥틸 α-KG, 및 디메틸 α-KG가 α-KG와 유사한 효과를 갖는 이유를 설명한다(도 6, 패널 g-h, 및 도 13).

세포 성장 및 생존력 검정

세포를 12-웰 플레이트에 접종하고, 밤새 인큐베이션 후 표시된 농도의 각각의 화합물로 처리하였다. 수확 후, 세포를 아크리딘 오렌지(AO) 및 DAPI로 염색하였다. 세포 수 및 생존력을 제조자의 설명서를 따라 NC3000(Chemometec)에 의해 측정된 AO 및 DAPI 형광에 기반하여 측정하였다.

대사 프로파일 분석

세포를 24 시간 동안 배양하고, PBS로 헹구고, [1,2-¹³C]글루코스(1 g/L) 함유 배지를 첨가했다. 24 시간 배양 후, 세포를 빙랭 150 mM NH₄AcO(pH 7.3)로 헹군 뒤 400 ml의 차가운 메탄올 및 400 ml 냉수를 첨가하였다. 세포를 긁어 내고, 에펜도르프 튜브로 옮기고, 10 nmol 노르발린 뿐만 아니라 400 ml 클로로포름을 각 시료에 첨가하였다. 대사물 추출을 위해, 샘플을 5 분 동안 얼음 상에서 볼텍싱하고, 회전 침강시키고, 수성 층을 유리 바이알 내로 옮기고, 건조하였다. 대사물을 70% ACN에서 재현탁시키고, 5 ml 샘플을 Phenomenex Luna 3u NH2 100 A(150 x 2.0 mm) 칼럼 상에 로딩하였다. 크로마토그래피 분리를 이동상 A(5 mM NH₄AcO, pH 9.9) 및 B(ACN)로 300 ml/분의 유속으로 UltiMate 300RSLC(Thermo Scientific) 상에서 수행하였다. 구배를 18 분에 걸쳐 15% A 내지 95% A로, 95% A에서 9 분 등용매로, 그리고 7 분 동안 재-평형을 수행하였다. 대사물 검출을 극성 스위칭 방식(+3.0 kV/-2.25 kV)으로 수행되는 Thermo Scientific Q Exactive 질량 분광분석기로 달성하였다. TraceFinder 3.1(Thermo Scientific)을 이용해서 체류 시간 및 정확한 질량 측정(≤ 3 ppm)을 이용한 곡선하 면적으로서 대사물을 정량하였다. 대사물의 상대량을 주어진 대사물의 모든 이성질체의 합산에 의해 계산하였다.

ADP 내수송에 대한 검정

새롭게 제조된 마우스 간 미토콘드리아를 220 mM 만니톨, 70 mM 수크로스, 2 mM HEPES, 2.74 μM 안티마이신 A, 5 μM 로테논, 1 mM EGTA, 및 10 mM 칼륨 인산염 버퍼, pH 7.4로 구성된 배지 중에 1 ㎍/㎕로 현탁시켰다. 미토콘드리아 현탁액을 37℃에서 30 분 동안 지정된 약물과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 현탁액을 10 분 동안 인큐베이션을 위해 얼음으로 옮겼다. 나중에, 100 μM [³H]ADP(비방사활성, 185 kBq/pmol)를 첨가하고, 혼합물을 즉시 볼텍싱하여 20 초 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 반응을 10 μM 카복시아트락틸로사이드의 첨가로 종료시키고, 혼합물을 4℃에서 10 분 동안 10,000 g에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 상청액을 판독을 위해 수집하고 펠렛을 10 μM 카복시아트락틸로사이드가 보충된 동일한 배지로 2 회 세정하였다. 세정 후, 펠렛을 0.2 mL의 1% SDS 첨가로 용해시켰다. 용해물 및 상청액의 방사활성을 TRI-CARB 2300 TR 액체 섬광 분석기에 의해 결정하였다. ADP-ATP 전위율을 펠렛 대 펠렛 및 상청액의 합계 판독의 비에 의해 결정하였다.

통계 분석

모든 실험을 적어도 2 회 반복하여 동일하거나 유사한 결과를 얻었다. 데이타는 생물학적 반복을 나타낸다. 적절한 통계 테스트를 모든 도면에 대해 사용하였다. 데이타는 각각의 도면에 대해 기재된 통계 테스트의 가정에 부합한다. 다르게 언급되지 않으면, 모든 도에서 평균 ± s.d.를 도시한다.

결과

도 1에 나타낸 바와 같이, α-KG는 C. 엘레간스의 성체 수명을 연장시킨다. 패널 a는 α-KG가 대사물 장수 스크리닝에서 성체 벌레의 수명을 연장시킴을 나타낸다. 모든 대사물에 대해 8 mM을 사용하였다. 패널 b는 α-KG의 구조를 나타낸다. 패널 c는 장수에서의 α-KG의 용량 반응을 나타낸다. 패널 d-e는 α-KG가 암피실린-정지된(패널 d) 또는 γ-조사-사멸된(패널 e) 박테리아 섭취 벌레의 수명을 연장시킴을 나타낸다(P < 0.0001). 패널 f는 α-KG가 ogdh -1( RNAi ) 벌레의 수명을 추가 연장시키지 않음을 나타낸다(P = 0.65).

도 2에 나타낸 바와 같이, α-KG는 ATP 합성효소에 결합하고 이를 저해한다. 패널 a는 DARTS를 이용하여 α-KG-결합 단백질로서 ATP5B를 확인시켜주는 Sypro Ruby-염색된 겔이다. 화살표 = 보호된 밴드. 패널 b는 DARTS 및 웨스턴 블롯팅을 이용하여 ATP5B에 특이적으로 결합하는 α-KG를 확인시켜 주는 겔이다. 패널 c는 α-KG에 의한(옥틸 α-KG로부터 방출됨) ATP 합성효소의 저해를 나타내는 그래프이다. 이러한 저해는 가역적이었다(나타내지 않음). 패널 d-g는 (패널 d) 옥틸 α-KG 처리된 정상 인간 섬유아세포(^** P = 0.0016, ^**** P < 0.0001) 및 (패널 e) α-KG 처리된 벌레(2 일령, P = 0.969; 8 일령, ^* P = 0.012)에서 감소된 ATP 수준을 나타낸다. 감소된 산소 소비율을 옥틸 α-KG 처리된 세포에 대해 패널 f에서(^*** P = 0.0004, ^**** P < 0.0001) 그리고 α-KG 처리된 벌레에 대해 패널 g에서(P < 0.0001) 나타낸다. RLU, 상대 발광 단위. 패널 h는 옥틸 α-KG로부터 방출된 α-KG(800 μM)가 마우스 간으로부터 단리된 미토콘드리아에서의 호흡을 상태 3으로 감소시키지만, 상태 4o 또는 3u로는 감소시키지 않음을 나타낸다(P = 0.997). 호흡 조절비는 옥틸 α-KG(3.1 ± 0.6) 대 비히클(5.2 ± 1.0)에서 감소된다(^* P = 0.015). 패널 i는 α-KG(옥틸 α-KG의 원위치 가수분해에 의해 생산됨)에 의한 ATP 합성효소의 정상상태 저해 속도론의 Eadie-Hofstee 그래프이다. [S]는 기질(ADP) 농도이며, V는 200 μM 옥탄올(비히클 대조군) 또는 옥틸 α-KG의 존재 하에 ATP 합성의 초기 속도이다. α-KG(옥틸 α-KG로부터 생산됨)는 비선형 회귀 최소 자승 피팅에 의해 겉보기 V _max(53.9에서 26.7로) 및 K _m(25.9에서 15.4로)을 감소시킨다. 패널 c-i, 독립 실험의 수: 2. 평균 ± s.d.를 도시한다. t-테스트, 2-테일화, 2 개-샘플 비균등 분산 이용. 패널 e에 있어서, 각각의 세트에서의 첫 번째 막대는 비히클이다.

도 3에 나타낸 바와 같이, α-KG 장수는 ATP 합성효소 및 DR/TOR 축을 통해 매개된다. 수명에 대한 α-KG의 효과를 하기에 대해 나타낸다: atp-2(RNAi)(패널 a), daf -2(e1370)(패널 b), eat-2( ad1116 )(패널 c), CeTOR ( RNAi )(패널 d), daf -16( mu86 )(패널 e), pha -4( zu225 )(패널 f), 또는 hif -1(ia4)(패널 g) 벌레. 독립 실험의 수: RNAi 대조군(6), atp-2(2), CeTOR(3), N2(5), daf -2(2), eat-2(2), pha -4(2), daf -16(2), hif -1(5).

도 4에 나타낸 바와 같이, α-KG에 의한 ATP 합성효소의 저해는 TOR 경로 활성에서 보존된 감소를 유도한다. 패널 a는 옥틸 α-KG 또는 올리고마이신으로 처리된 U87 세포에서 mTOR 기질의 감소된 인산화를 나타낸다. 유사한 결과가 HEK-293, 정상 인간 섬유아세포, 및 MEF에서 수득되었다(나타내지 않음). 패널 b는 atp-2 또는 CeTOR에 대해 α-KG 또는 RNAi로 처리된 동물에서 증가된 자가포식을 나타낸다. 패널 c는 ImageJ를 이용해서 정량화된 GFP::LGG-1 반점을 나타낸다. 2-3 회 독립 실험. 막대는 평균을 나타낸다. ^**** P < 0.0001; NS, 유의미하지 않음. 패널 d는 α-KG 수준이 굶긴 벌레에서 증가함을 나타낸다(^** P < 0.01). 평균 ± s.d.를 도시한다. 패널 c-d에서 t-테스트, 2-테일화, 2 개-샘플 비균등 분산 이용. 패널 e는 α-KG-매개된 장수의 도식적 모델이다. α-KG 수준이 굶긴 C. 엘레간스에서 상승되므로(패널 d), α-KG는 기아/DR 경로와 유사한 기전에 의해 수명 연장을 매개할 수 있다(패널 e).

도 5에 나타낸 바와 같이, α-KG의 보충은 C. 엘레간스 성체 수명을 연장시키지만 박테리아의 성장률, 또는 벌레의 식품 섭취, 인두 펌핑률 또는 번식 크기를 변화시키지 않는다. 패널 a는 α-KG에 의해 성체 C. 엘레간스에서 강력한 수명 연장을 나타낸다. 8 mM α-KG는 3 회 독립 실험에서 N2의 평균 수명을 평균 47.3% 증가시켰다(모든 실험에 대해 P < 0.0001, 로그-순위 시험). 실험. #1, m _veh = 18.9(n = 87), m _α _-KG = 25.8(n = 96); 실험. #2, m _veh = 17.5(n = 119), m_α-KG = 25.4(n = 97); 실험. #3, m _veh = 16.3(n = 100), m _α _-KG = 26.1(n = 104). m, 평균 수명(성체기 일수); n, 시험된 동물의 수. 패널 b는 8 mM α-KG가 보충된 벌레 및 α-KGDH(ogdh-1에 의해 인코딩됨)의 RNAi 녹다운을 갖는 벌레가 증가된 α-KG 수준을 가짐을 나타낸다. 어린 성체 벌레를 대조군 HT115 E. 콜리 또는 ogdh -1 dsRNA를 발현하는 HT115를 접종한 처리 플레이트 상에 배치하고, α-KG 함량을 24 시간 후 분석하였다. 패널 c는 수정란 단계에 시작하는 및 성체기에 시작하는 α-KG 처리가 동일한 수명 증가를 생성하였음을 나타낸다. 비히클, 비히클, 유충 및 성체 단계를 통한 비히클 대조군 처리(m = 15.6, n = 95); 비히클, α-KG, 유충 단계 동안 비히클 및 성체기에 8 mM α-KG 처리(m = 26.3, n = 102), P < 0.0001(로그-순위 시험); α-KG, α-KG, 유충 및 성체 단계를 통해 8 mM α-KG 처리(m = 26.3, n = 102), P < 0.0001(로그-순위 시험), m, 평균 수명(성체기의 일수); n, 시험된 동물의 수. 패널 d는 α-KG가 선충을 위한 표준 실험실 식품 공급원인 OP50 E. 콜리의 성장률을 변경하지 않음을 나타낸다. α-KG(8 mM) 또는 비히클(H₂O)을 표준 LB 배지에 첨가하고 NaOH의 첨가에 의해 pH를 6.6으로 조정하였다. 동일한 밤샘 OP50 배양으로부터의 박테리아 세포를 LB ± α-KG 혼합물에 1:40 희석으로 첨가한 다음 300 rpm으로 37℃ 인큐베이터 진탕기에 배치하였다. 595 nm에서의 흡광도를 1 시간 간격으로 판독하여 성장 곡선을 생성하였다. 패널 e는 식품 선호 검정의 도식적 묘사이다. 패널 f는 N2 벌레가 비히클 또는 α-KG로 처리된 OP50 E. 콜리 식품 간에 선호를 나타내지도 않고(P = 0.85, t-테스트, 2-테일화, 2 개-샘플 비균등 분산 이용) 동일하게 처리된 OP50 E. 콜리 간 선호를 나타내지도 않음을 보여주는 그래프이다. 패널 g는 8 mM α-KG 상 C. 엘레간스의 인두 펌핑률이 유의미하게 변경되지 않음을 나타낸다(t-테스트, 2-테일화, 2 개-샘플 비균등 분산 이용). 패널 h는 8 mM α-KG로 처리된 C. 엘레간스의 번식 크기를 나타낸다. 번식 크기 분석을 20℃에서 수행하였다. 10 마리의 L4 야생형 벌레를 각각 단독으로 비히클 또는 8 mM α-KG 함유 NGM 플레이트 상에 배치하였다. 벌레를 매일 신규 플레이트 상에 플레이트 당 한 마리씩 이동시키고, 산란한 수정란은 이전 플레이트에서 부화하여 발생하도록 두었다. 부화 유생을 플레이트로부터 제거하기 위해 진공을 사용하며 이들을 카운팅하였다. 8 mM α-KG 상의 동물은 비히클 플레이트 상 동물에 비해 번식 크기에서 유의미한 차이를 나타내지 않았다(P = 0.223, t-테스트, 2-테일화, 2 개-샘플 비균등 분산 이용). 모든 경우 평균 ± s.d.를 도시한다.

도 6에 나타낸 바와 같이, α-KG는 ATP 합성효소의 베타 서브유닛에 결합하며, 다른 ETC 복합체가 아닌 복합체 V의 활성을 저해한다. 패널 a는 DARTS 검정에서 α-KG 결합 시 프로나제 소화로부터 ATP-2 단백질의 보호를 나타내는 웨스턴 블롯이다. 인간 ATP5B(Sigma, AV48185)로부터의 보호는 C. 엘레간스 ATP-2와 90% 동일성을 갖는 에피토프 ₁₄₄IMNVIGEPIDERGPIKTKQFAPIHAEAPEFMEMSVEQEILVTGIKVVDLL₁₉₃(서열식별번호: 7)를 인식한다. 20 kDa 근처의 더 낮은 분자량 밴드는 α-KG에 의해 직접 결합된 도메인에 상응하는 전장 단백질의 단백분해 단편이다. 패널 b는 α-KG가 복합체 IV 활성에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 복합체 IV 활성을 MitoTox OXPHOS 복합체 IV 활성 키트(Abeam, ab109906)를 이용해서 분석하였다. 상대 복합체 IV 활성을 비히클(H₂O) 대조군과 비교하였다. 칼륨 시아나이드(Sigma, 60178)를 검정을 위한 양성 대조군으로 사용하였다. 복합체 V 활성을 MitoTox 복합체 V OXPHOS 활성 마이크로플레이트 검정(Abeam, ab109907)을 이용해서 분석하였다. 패널 c는 전체 시간 시리즈(2 회 독립 실험)에 대해 atp-2( RNAi ) 벌레가 대조군(RNAi 벡터 내 gfp)에 비해 더 낮은 산소 소비를 가짐을 나타내며, P < 0.0001(t-테스트, 2-테일화, 2 개-샘플 비균등 분산); 도 2, 패널 g에 나타낸 α-KG 처리된 벌레와 유사하다. 패널 d는 α-KG가 전자 전달 사슬의 전자 통과에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 기저에서(FCCP의 존재 하에, 각각 복합체 I 기질 및 복합체 II 저해제로서 피루베이트 및 말레이트) 그리고 로테논(Rote; 복합체 I 저해제), 석시네이트(Succ; 복합체 II 기질), 안티마이신 A(AA; 복합체 III 저해제), 아스코르베이트/테트라메틸페닐렌디아민(Asc/TMPD; 사이토크롬 c(복합체 IV) 기질)의 순차적 주사에 반응하여 단리된 마우스 간 미토콘드리아로부터의 OCR. 800 μM 옥틸 α-KG의 30 분 처리 후 복합체 I(C I), 복합체 II(C II), 또는 복합체 IV(C IV) 호흡에서는 차이가 관측되지 않은 반면, 복합체 V는 동일한 처리에 의해(2 회 독립 실험) 저해되었다(도 2, 패널 h 참고). 패널 e-f는 옥탄올 또는 DMSO 비히클 대조군으로 커플링(패널 e) 또는 전자 흐름(패널 f)에서 유의미한 차이가 관측되지 않음을 나타낸다. 패널 g-h는 1-옥틸 α-KG 또는 5-옥틸 α-KG의 처리가 커플링(패널 g) 또는 전자 흐름(패널 h) 검정에서 동일한 결과를 제공하였음을 나타낸다. 모든 경우에 평균 ± s.d.를 도시한다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 올리고마이신 처리는 let-363 의존적 방식으로 C. 엘레간스 수명을 연장하고 자가포식을 증강시킨다. 패널 a는 올리고마이신이 농도 의존적 방식으로 성체 C. 엘레간스의 수명을 연장시킴을 나타낸다. 올리고마이신 처리는 어린 성체 단계에 시작되었다. 40 μM 올리고마이신은 N2 벌레의 평균 수명을 32.3% 증가시켰다(P < 0.0001, 로그-순위 시험); 세부사항에 대해서는 도 13을 참고하라. 패널 b는 ImageJ를 이용해서 정량된 반점 함유 GFP:LGG-1의 수, 및 비히클, 올리고마이신(40 μM), 또는 α-KG(8 mM)을 이용한 C. 엘레간스의 L3 표피에서 GFP:LGG-1 반점의 공초점 이미지를 나타낸다. 막대는 평균을 나타낸다. 올리고마이신 또는 α-KG로 처리한 C. 엘레간스에서의 자가포식은 비히클-처리 대조군 동물보다 유의미하게 더 높다(t-테스트, 2-테일화, 2 개-샘플 비균등 분산). 패널 c는 도 4, 패널 b-c에서의 독립 실험과 일치하게, 올리고마이신으로 처리된 대조군 벌레 및 비히클로 처리된 CeTOR ( RNAi ) 벌레 간, 또는 비히클 및 α-KG 처리된 CeTOR ( RNAi ) 벌레 간에 유의미한 차이가 없음(n.s.)을 나타낸다; 또한, 올리고마이신은 CeTOR ( RNAi ) 벌레에서 자가포식을 강화하지 않는다(그렇더라도, 작은 감소가 있을 수 있음*); t-테스트, 2-테일화, 2 개-샘플 비균등 분산 이용. 막대는 평균을 나타낸다.

도 8은 α-KG 또는 atp-2 RNAi로 처리된 벌레에서의 산화적 스트레스 분석을 나타낸다. 패널 a는 atp-1( RNAi ) 벌레가 gfp 대조군 벌레에 비해 더 높은 DCF 형광 수준을 가짐을 나타낸다(P < 0.0001, t-테스트, 2-테일화, 2 개-샘플 비균등 분산 이용). α-KG의 보충은 또한 HT115(RNAi에 대해) 및 OP50 섭취 벌레에서 모두 더 높은 DCF 형광으로 이어진다(각각 P = 0.0007, 및 P = 0.0012). ROS 수준을 2',7'-디클로로디하이드로플루오레신 디아세테이트(H₂DCF-DA)를 사용하여 측정하였다. 전체 벌레 용해물을 사용하였으므로, 여기서는 총 세포성 산화적 스트레스를 측정하였다. H₂DCF-DA(Molecular Probes, D399)를 에탄올 중 모액 농도 1.5 mg/ml로 용해시켰다. 신선한 스톡을 매번 사용 전에 제조하였다. 벌레 용해물에서 ROS를 측정하기 위해, 검은 색 96-웰 플레이트(Greiner Bio-One)에서 전체 벌레 용해물과 혼합하기 전에 30 ng/ml의 H₂DCF-DA의 작업 농도를 실온에서 30 분 동안 0.1 M NaOH에 의해 가수분해하여 2',7'-디클로로디하이드로플루오레신(DCFH)을 생성하였다. ROS에 의한 DCFH의 산화는 고형광성 2',7'-디클로로플루오레신(DCF)을 산출한다. SpectraMax MS(Molecular Devices)를 이용해서 여기/방출 485/530 nm에서 DCF 형광을 판독하였다. H₂O₂를 양성 대조군으로 사용하였다(나타내지 않음). 벌레 용해물을 제조하기 위해, 동기화된 어린 성체 동물을 1 일 동안 비히클 또는 8 mM α-KG 및 OP50 또는 HT115 E. 콜리 함유 플레이트 상에 배양한 다음 본원에 기재된 바와 같이 수집하고 용해시켰다. 평균 ± s.d.를 도시한다. 패널 b는 α-KG 처리 또는 atp-2( RNAi ) 시 단백질 산화에 유의미한 변화가 없었음을 나타낸다. 산화된 단백질 수준을 OxyBlot에 의해 결정하였다. 동기화된 어린 성체 N2 동물을 비히클 또는 8 mM α-KG 함유 플레이트 상에 배치하고, 대조군 또는 atp-2 dsRNA를 발현하는 OP50 또는 HT115 박테리아를 접종하였다. 성체 2 일령 및 3 일령 벌레를 수집하고, M9 버퍼로 4 회 세정한 다음 적어도 24 시간 동안 -80℃에서 보관하였다. Laemmli 버퍼(Biorad, 161-0737)를 모든 샘플에 첨가하고, 동물을 교대 비등/냉동 사이클에 의해 용해시켰다. 용해된 동물을 4℃에서 10 분 동안 14,000 rpm에서 원심분리하여 벌레 잔해를 펠렛화하고, 상청액을 oxyblot 분석을 위해 수집하였다. 샘플의 단백질 농도를 660 nm 단백질 검정(Thermo Scientific, 1861426)에 의해 결정하고 모든 샘플에 대해 정규화하였다. 각각의 샘플에서 단백질 카보닐화를 OxyBlot 단백질 산화 검출 키트(Millipore, S7150)를 이용해서 검출하였다.

도 9는 aak -2, daf -16, hif -1, vhl -1 또는 egl -9의 부재 하에 α-KG의 수명을 나타낸다. 패널 a는 N2 벌레, m _veh = 17.5(n = 119), m _α _-KG = 25.4(n = 97), P < 0.0001; 또는 aak -2( ok524 ) 돌연변이체, m _veh = 13.7(n = 85), m _α _-KG = 17(n = 83), P < 0.0001을 나타낸다. 패널 b는 gfp RNAi 대조군 섭취 N2 벌레, m _veh = 18.5(n = 101), m _α _-KG = 23.1(n = 98), P < 0.0001; 또는 daf -16 RNAi 섭취 N2 벌레, m _veh = 14.3(n = 99), m _α _-KG = 17.6(n = 99), P < 0.0001을 나타낸다. 패널 c는 N2 벌레, m _veh = 21.5(n = 101), m _α _-KG = 24.6(n = 102), P < 0.0001; hif -1(ia7) 돌연변이체, m _veh = 19.6(n = 102), m _α _-KG = 23.6(n = 101), P < 0.0001; vhl-1(ok161) 돌연변이체, m _veh = 20.0(n = 98), m _α _-KG = 24.9(n = 100), P < 0.0001; 또는 egl -9( sa307 ) 돌연변이체, m _veh = 16.2(n = 97), m _α _-KG = 25.6(n = 96), P < 0.0001을 나타낸다. m, 평균 수명(성체기의 일수); n, 시험된 동물의 수. P-값은 로그-순위 시험에 의해 결정하였다. 독립 실험의 수: N2(8), hif -1(5), vhl -1(1), 및 egl -9(2); 세부사항에 대해서는 도 13을 참고하라. 2 개의 상이한 hif -1 돌연변이체 대립유전자(Zhang 등, PLoS One 4, e6348(2009))를 사용하였다: ia4(도 3, 패널 g에 나타냄)은 몇몇 인트론 및 엑손에 걸친 결실이며; ia7(상기 나타냄)은 조기 정지 코돈으로, 끝이 잘린 단백질을 유도한다. 두 대립유전자는 모두 수명에 있어서 동일한 효과를 갖는다. 두 대립유전자를 모두 α-KG 장수에 대해 시험하고 동일한 결과를 수득하였다.

도 10에 나타낸 바와 같이, α-KG는 TOR 경로 활성을 감소시키지만 TOR과 직접적으로 상호작용하지는 않는다. 패널 a는 S6K(T389)의 인산화가 옥틸 α-KG로 처리된 U87 세포에서 감소되었지만 옥탄올 대조군으로 처리된 세포에서는 감소되지 않았음을 나타낸다. 동일한 결과를 HEK-293 및 MEF 세포를 사용하여 수득하였다. 패널 b는 AMPK(T172)의 인산화가 α-KG 처리된 세포 및 동물에서 감소된 ATP 함량과 일치하게 α-KG에 의한 복합체 V 저해 시 WI-38 세포에서 상향조절됨을 나타낸다. 그러나, 올리고마이신 또는 더 높은 농도의 옥틸 α-KG가 P-AMPK를 증가시킨 반면에 세포성 ATP 함량(도 2, 패널 d) 또는 산소 소비(도 2, 패널 f)를 감소시키는 것과 필적하는 농도의 옥틸 α-KG가 또한 P-S6K를 감소시키기 충분하므로, AMPK의 이러한 활성화는 mTOR의 불활성화보다는 더 심한 복합체 V 저해가 관여되는 것으로 나타난다. 동일한 결과를 U87 세포를 사용하여 수득하였다. 웨스턴 블롯팅을 P-AMPK T172(Cell Signaling Technology, 2535S) 및 AMPK(Cell Signaling Technology, 2603S)에 대해 특이적 항체로 수행하였다. 패널 c는 α-KG가 여전히 aak -2( RNAi ) 벌레에서 자가포식을 유도함을 나타낸다; ^** P < 0.01(t-테스트, 2-테일화, 2 개-샘플 비균등 분산). 반점 함유 GFP::LGG-1의 수를 ImageJ를 이용하여 정량하였다. 막대는 평균을 나타낸다. 패널 d-e는 α-KG가 DARTS에 의해 결정되는 바와 같이 TOR에 직접적으로 결합하지 않음을 나타낸다. HEK-293(패널 d) 또는 HeLa(패널 e) 세포를 프로테아제 저해제(Roche, 11836153001) 및 포스파타제 저해제(50 mM NaF, 10 mM β-글리세로포스페이트, 5 mM 나트륨 파이로포스페이트, 2 mM Na₃VO₄)를 첨가하여 M-PER 버퍼(Thermo Scientific, 78501) 중에 용해시켰다. 용해물의 단백질 농도를 BCA 단백질 검정 키트(Pierce, 23227)에 의해 측정하였다. 냉각된 TNC 버퍼(50 mM 트리스-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl, 10 mM CaCl₂)를 단백질 용해물에 첨가한 뒤, 단백질 용해물을 실온에서 1 시간 동안(패널 d에 대해) 또는 3 시간 동안(패널 e에 대해) 비히클 대조군(DMSO) 또는 가변 농도의 α-KG와 인큐베이션하였다. 프로나제(Roche, 10165921001) 소화를 실온에서 20 분 동안 수행하고, SDS 로딩 버퍼의 첨가 및 95℃에서 5 분 동안(패널 d에 대해) 또는 70℃에서 10 분 동안(패널 e에 대해) 즉시 가열하여 중단시켰따. 샘플을 4-12% 비스-트리스 구배 겔(Invitrogen, NP0322BOX) 상에서 SDS-PAGE를 수행하고 ATP5B(Santa Cruz, sc58618), mTOR(Cell Signaling Technology, 2972), 또는 GAPDH(Ambion, AM4300)에 대한 특이적 항체로 웨스턴 블롯팅하였다. ImageJ를 이용하여 mTOR/GAPDH 및 ATP5B/GAPDH 비를 정량하였다. 프로나제 소화에 대한 mTOR 단백질의 감수성은 α-KG의 존재 하에 변함없는 반면, 예상대로 α-KG의 존재 하의 프로나제 내성이 ATP5B에 대해 증가된다. 패널 f는 옥틸 α-KG로 처리된 HEK-293 세포에서 증가된 자가포식이 자가포식 개시 키나제 ULK1의 감소된 인산화와 일치하게, MAP1 LC3(Novus, NB100-2220)의 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었음을 나타낸다(도 4, 패널 a).

도 11에 나타낸 바와 같이, 자가포식은 ogdh -1 RNAi로 처리된 C. 엘레간 스에서 증강된다. 패널 a는 중간 L3 단계, 대조군 또는 ogdh -1 녹다운, 비히클 또는 α-KG(8 mM)로 처리된 C. 엘레간스의 표피에서 GFP::LGG-1 반점의 공초점 이미지를 나타낸다. 패널 b는 ImageJ를 이용해서 정량된 GFP::LGG-1 반점의 수를 나타낸다. 막대는 평균을 나타낸다. ogdh -1( RNAi ) 벌레는 유의미하게 더 높은 자가포식 수준을 가지고, α-KG는 ogdh -1( RNAi ) 벌레에서 자가포식을 유의미하게 강화하지 않는다(t-테스트, 2-테일화, 2 개 샘플 비균등 분산).

도 14에 나타낸 바와 같이, 2-HG는 성체 C. 엘레간스의 수명을 연장시킨다. 패널 A는 2-하이드록시글루타르산 및 α-케토글루타르산의 화학적 구조를 나타낸다. 패널 B는 (R)-2-HG 보충된 벌레의 수명이 α-KG가 보충된 벌레와 유사함을 나타낸다. 비히클 처리의 평균 수명(성체기의 일수) m _veh = 14.0(시험된 동물 n = 112); m _α _-KG = 20.7(n = 114), P < 0.0001(로그-순위 시험); m ₍ _R _)-2-HG = 20.0(n = 110), P < 0.0001(로그-순위 시험); m _Met = 14.7(n = 116), P = 0.4305(로그-순위 시험); m _Leu = 13.2(n = 110), P = 0.3307(로그-순위 시험). 패널 C는 (S)-2-HG 보충된 벌레의 수명이 α-KG가 보충된 벌레와 유사함을 나타낸다. m _veh = 15.7(n = 85); m _Na2α _-KG = 21.5(n = 99), P < 0.0001(로그-순위 시험); m ₍ _S _)-2-HG = 20.7(n = 87), P < 0.0001(로그-순위 시험). 모든 대사물을 8 mM 농도로 제공하였다.

도 15에 나타낸 바와 같이, 2-HG는 ATP 합성효소에 결합하고 이를 저해한다. 패널 A는 DARTS 및 웨스턴 블롯팅에 의해 확인된 바와 같이 ATP5B가 2-HG 결합 단백질임을 나타내는 겔이다. 패널 B는 2-HG에 의한 ATP 합성효소의 저해를 나타낸다. 옥틸 2-HG로부터 방출된 2-HG(600 μM)는 마우스 간으로부터 단리된 미토콘드리아에서의 호흡을 상태 3(2 mM ADP에 의해 개시됨)으로 감소시키지만 상태 4o(올리고마이신 비민감성, 즉, 복합체 V 독립적) 또는 3u(FCCP-미커플링 최대 호흡능)는 감소시키지 않는다. 옥탄올이 비히클로 사용된다. Oligo, 올리고마이신; FCCP, 카보닐 시아나이드-4-(트리플루오로메톡시)페닐하이드라존; AA, 안티마이신 A. 패널 C는 옥틸 2-HG 또는 옥틸 α-KG로 처리된 U87 세포에서 감소된 ATP 함량을 나타낸다(^* P < 0.05, ^*** P < 0.001; 페어링되지 않은 t-테스트, 2-테일화, 2 개-샘플 비균등 분산). 옥탄올은 ATP 함량에 대한 효과를 갖지 않는다. 패널 D는 글루코스 배지 중 옥틸 2-HG 처리된 U87 세포에서 OCR로 표시된 바와 같이 감소된 호흡을 나타낸다(^** P < 0.01, 페어링되지 않은 t-테스트, 2-테일화, 2 개-샘플 비균등 분산). 옥탄올은 DMSO에 비해 OCR 상에 효과를 갖지 않는다. 평균 ± s.d.를 도시한다.

도 16은 IDH1(R132H) 세포에서 ATP 합성효소의 저해를 나타낸다. 패널 A는 U87 IDH1(R132H) 세포에서 감소된 ATP 수준을 보여준다(^** P = 0.0071). 페어링되지 않은 t-테스트, 2-테일화, 2 개 샘플 비균등 분산 이용. 모든 경우에 평균 ± s.d.를 도시한다. 패널 B) U87 IDH1(R132H) 세포에서 감소된 호흡(^** P = 0.0037). 패널 C는 U87/IDH1(R132H) 세포에서의 2-HG 축적을 나타낸다(^*** P = 0.0003). 패널 D는 옥틸 (R)-2-HG 처리된 U87 세포의 대사 프로파일을 나타낸다(^*** P < 0.001, ^* P = 0.0435). 패널 E는 ATP 합성효소 저해를 통한 α-KG 및 2-HG에 의한 대사물 신호전달의 도식적 모델이다.

도 17A-I는 ATP5B 녹다운, 2-HG 축적, 또는 IDH 돌연변이를 갖는 세포에서의 대사 취약성을 나타낸다. 도 17A는 U87/IDH1(R132H) 세포가 글루코스 기아에 대해 증가된 민감성을 가짐을 나타낸다(^*** P < 0.001). 도 17B-D는 옥틸 α-KG 또는 옥틸 2-HG 처리된 U87 세포가 글루코스 기아 시 감소된 생존력을 나타냄을 보여준다(^****P < 0.0001, ^***P < 0.001, ^**P < 0.01, ^*P < 0.05). 옥탄올은 생존력에 대해 효과를 갖지 않는다. 도 17E) ATP5B 녹다운은 U87 세포 성장을 저해한다(^***P = 0.0004). 도 17F는 HCT116 IDH1(R132H/+) 세포가 (R)-3-하이드록시부티레이트가 보충된 글루코스-비함유 배지에 대해 증가된 취약성을 나타냄을 보여준다(^***P < 0.001). 페어링되지 않은 t-테스트, 2-테일화, 2 개-샘플 비균등 분산 이용. 모든 경우에 평균 ± s.d.를 도시한다. 도 17G-I는 ATP5B 녹다운, α-KG 또는 2-HG 처리의 막-투과성 에스테라제-가수분해성 유사체, 또는 IDH1(R132H)을 안정되게 발현하는 U87 세포가 글루코스-비함유, 갈락토스-함유 배지에서 감소된 mTOR 복합체 1 활성을 나타냄을 보여준다. S6K(T389) 및 4E-BP1(S65)은 mTOR 복합체 1의 기질이다. 옥탄올은 TOR 활성에 대한 효과를 나타내지 않는다.

도 18에 나타낸 바와 같이, 2-HG는 전자 전달 사슬을 통한 전자 흐름에 영향을 미치지 않고 ADP 내수송에 영향을 미치지 않는다. 패널 A는 기저에서(FCCP의 존재 하에 복합체 I 기질 및 복합체 II 저해제로서 각각 피루베이트 및 말레이트) 그리고 로테논(Rote; 복합체 I 저해제), 석시네이트(복합체 II 기질), 안티마이신 A(AA; 복합체 III 저해제), 테트라메틸페닐렌디아민(TMPD; 사이토크롬 c(복합체 IV) 기질)의 순차적인 주사에 반응하여 단리된 마우스 간 미토콘드리아로부터의 OCR을 나타낸다. 600 μM 옥틸 2-HG의 30 분 처리 후 복합체 I(C I), 복합체 II(C II), 또는 복합체 IV(C IV) 호흡 간에는 차이가 관측되지 않는 반면, 복합체 V는 동일한 처리(2 회 독립 실험)에 의해 저해된다(도 15, 패널 B). 옥탄올이 비히클로 사용된다. 패널 B는 ADP 내수송이 옥탄올(비히클 대조군) 또는 옥틸 2-HG(600 μM)의 존재 하에 측정되었음을 나타낸다. 옥틸 (R)-2-HG, P = 0.4237; 옥틸 (S)-2-HG, P = 0.1623). ADP 내수송에 대해 공지된 저해제인 CATR(카복시아트락틸로사이드)를 검정용 양성 대조군으로 사용하였다(^*** P = 0.0003). 페어링되지 않은 t-테스트, 2-테일화, 2 개-샘플 비균등 분산 이용. 모든 경우에 평균 ± s.d.를 도시한다.

도 19에 나타낸 바와 같이, 2-HG는 세포 호흡을 저해하고 ATP 수준을 감소시킨다. 패널 A는 ATP 합성효소의 공지된 저해제인 올리고마이신을 나타내며, 양성 대조군으로 사용된다(^* P < 0.05; 페어링되지 않은 t-테스트, 2-테일화, 2 개-샘플 비균등 분산). 패널 B-C는 옥틸 2-HG로 처리된 U87 세포가 ATP 합성효소 의존적(올리고마이신 민감성) 산소 소비율(OCR)을 감소시켰음을 나타낸다(^* P < 0.05, ^** P < 0.01, ^*** P < 0.001; 페어링되지 않은 t-테스트, 2-테일화, 2 개-샘플 비균등 분산). 모든 경우에 평균 ± s.d.를 도시한다.

도 20은 2-HG 축적된 세포의 세포 에너지 및 대사 프로파일을 나타낸다. 패널 A는 HCT116 IDH1(R132H/+) 세포가 감소된 호흡을 나타냄을 보여준다(^** P = 0.0015). 패널 B는 2-HG 수준이 친계 대조군 세포에 비해 HCT116/IDH1(R132H/+) 세포에서 약 100 배 더 높음을 나타낸다(^**** P < 0.0001). 패널 C는 옥틸 (S)-2-HG 처리된 U87 세포에서 TCA 사이클 중간체 및 관련된 아미노산의 대사 프로파일을 나타낸다(^* P < 0.05). 패널 D는 옥틸 α-KG 처리된 U87 세포에서 TCA 사이클 중간체 및 관련된 아미노산의 대사 프로파일을 나타낸다(^*** P < 0.001, ^** P < 0.01). 페어링되지 않은 t-테스트, 2-테일화, 2 개-샘플 비균등 분산. 모든 경우에 평균 ± s.d.를 도시한다.

도 21에 나타낸 바와 같이, HCT116 IDH1(R132H/+) 세포는 대사 취약성 및 성장 저해를 나타낸다. 패널 A는 HCT116 IDH1(R132H/+) 세포가 글루코스 기아에 대해 증가된 민감성을 가짐을 나타낸다. 패널 B는 HCT116 IDH1(R132H/+) 세포가 감소된 성장률을 나타냄을 보여준다. ^** P < 0.01; 페어링되지 않은 t-테스트, 2-테일화, 2 개-샘플 비균등 분산. 모든 경우에 평균 ± s.d.를 도시한다.

도 22는 ATP5B 녹다운, 옥틸 2-HG 또는 옥틸 α-KG 처리, 또는 IDH1(R132H) 돌연변이 시의 세포 성장 저해를 나타낸다. 패널 A는 글루코스 배지 중에서도, ATP5B 녹다운이 U87 세포의 성장률을 감소시킴을 나타낸다. 패널 B-D는 U87 세포가 글루코스-비함유 배지에서 옥틸 α-KG 또는 옥틸 2-HG 처리 시 감소된 성장률을 나타냄을 보여준다. 성장률은 비록 더 적은 정도기는 해도 글루코스 배지에서도 감소되었다(나타내지 않음). 패널 E는 IDH1(R132H)을 발현하는 U87 세포가 글루코스 배지에서도 감소된 증식률을 나타냄을 보여준다. ^**** P < 0.0001, ^*** P < 0.001, ^** P < 0.01, ^* P < 0.05; 페어링되지 않은 t-테스트, 2-테일화, 2 개-샘플 비균등 분산. 모든 경우에 평균 ± s.d.를 도시한다.

α-KG 및 2-HG 화합물에 대해 수행된 것과 유사한 실험에서, D-글루타메이트 및 L-글루타메이트 투여는 모두 대상체의 수명을 증가시킨다(데이타는 나타내지 않음).

본 발명의 개시를 이해하거나 완성하기 위해 필요한 정도까지, 본원에 언급된 모든 공보, 특허, 및 특허 출원은 각각이 개별적으로 편입된 것과 동일한 정도로 여기에 참고로 명확히 편입된다.

본 발명의 예시적인 구현예가 기재되었으며, 당해분야의 숙련가에게는 개시내용 내에서 단지 예시적인 것이며, 다양한 다른 대안, 채용, 및 개질이 본 발명의 범위 내에서 수행될 수 있음이 주지된다. 따라서, 본 발명은 본원에 예시된 바와 같은 특정 구현예에 제한되지 않으며, 단지 하기 청구범위에 의해서만 제한된다.

<110> The Regents of the University of California <120> Compositions and Methods for Treating Aging and Age-Related Diseases and Symptoms <130> 034044.100WO1 <150> 61/939,092 <151> 2014-02-14 <150> 61/955,463 <151> 2014-03-19 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Caenorhabditis elegans <400> 1 tgacaacatt ttccgtttca cc 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Caenorhabditis elegans <400> 2 aaatagcctg gacggatgtg at 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Caenorhabditis elegans <400> 3 gatccgagac aagatgaacg tg 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Caenorhabditis elegans <400> 4 acaatttgga acccaaccaa tc 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Caenorhabditis elegans <400> 5 tgatttggac cgagaattcc tt 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Caenorhabditis elegans <400> 6 ggatcagacg tttgaacagc ac 22 <210> 7 <211> 50 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ile Met Asn Val Ile Gly Glu Pro Ile Asp Glu Arg Gly Pro Ile Lys 1 5 10 15 Thr Lys Gln Phe Ala Pro Ile His Ala Glu Ala Pro Glu Phe Met Glu 20 25 30 Met Ser Val Glu Gln Glu Ile Leu Val Thr Gly Ile Lys Val Val Asp 35 40 45 Leu Leu 50

Claims

대상체의 노화 저해, 감소, 지연 또는 예방 방법으로서, 대상체에서 ATP 합성효소의 촉매 코어의 베타 서브유닛에 결합하는 하나 이상의 화합물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
대상체의 노화 저해, 감소, 지연 또는 예방 방법으로서, 대상체에서 ATP 합성효소의 활성을 저해하거나 감소시키는 하나 이상의 화합물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
대상체에서 연령 관련 질환의 치료, 저해, 감소, 또는 예방 방법으로서, 대상체에서 ATP 합성효소의 촉매 코어의 베타 서브유닛에 결합하고/하거나 대상체에서 ATP 합성효소의 활성을 저해하거나 감소시키는 하나 이상의 화합물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
대상체에서 수명 증가 방법으로서, 대상체에서 ATP 합성효소의 촉매 코어의 베타 서브유닛에 결합하고/하거나 대상체에서 ATP 합성효소의 활성을 저해하거나 감소시키는 하나 이상의 화합물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
대상체의 노화 저해, 감소, 지연 또는 예방 방법으로서, 하나 이상의 글루타레이트 화합물, 하나 이상의 글루타메이트 화합물, 또는 둘 모두를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
청구항 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 화합물이 글루타레이트 화합물 또는 글루타메이트 화합물인 방법.
청구항 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 글루타레이트 화합물 및 적어도 하나의 글루타메이트 화합물이 대상체에 투여되는 방법.
청구항 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 화합물이 α-KG 화합물인 방법.
청구항 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 화합물이 2-HG 화합물인 방법.
청구항 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 α-KG 화합물 및 적어도 하나의 2-HG 화합물이 대상체에 투여되는 방법.
청구항 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체에서의 α-케토글루타레이트 수준이 약 30-60%, 바람직하게는 약 45-55%, 더 바람직하게는 약 50% 증가되는 방법.
청구항 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체의 수명이 미처리 대상체에 비해 최대 약 60% 또는 최대 약 70% 연장되는 방법.
암에 대한 대상체의 치료 방법으로서, 하나 이상의 글루타레이트 화합물, 하나 이상의 글루타메이트 화합물, 또는 둘 모두를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
청구항 13에 있어서, 상기 암이 신경아교종이고 상기 대상체에 하나 이상의 α-KG 화합물이 투여되는 방법.
대상체에서 연령 관련 심장 병태의 치료, 저해, 감소, 또는 예방 방법으로서, 하나 이상의 글루타레이트 화합물, 하나 이상의 글루타메이트 화합물, 또는 둘 모두를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
청구항 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 화합물이 효과적인 양 또는 치료적으로 효과적인 양으로 투여되는 방법.
청구항 16에 있어서, 상기 양이 주어진 기간에 걸쳐 몇몇 용량으로, 예를 들면 1 주 또는 그 초과 동안 1 일 용량으로 투여되는 방법.
청구항 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 ATP 합성효소가 포유동물 ATP 합성효소, 인간 ATP 합성효소, 포유동물 미토콘드리아 ATP 합성효소, 또는 인간 미토콘드리아 ATP 합성효소인 방법.
청구항 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체가 포유동물, 바람직하게는 인간인 방법.
청구항 19에 있어서, 상기 대상체가 인간이고, 상기 화합물이 약 0.25-2, 바람직하게는 약 0.5-2, 더 바람직하게는 약 1-2, 가장 바람직하게는 약 2 그램/대상체 체중 킬로그램/1 일의 1 일 용량으로 투여되는 방법.