JP2022101553A - 反復関連非ａｔｇ（ｒａｎ）翻訳を調節するためのｅｉｆ３の操作 - Google Patents

Abstract

【課題】反復非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳を調節するための方法および組成物を提供する。【解決手段】いくつかの局面において、本開示は、ＲＡＮタンパク質翻訳と関連する疾患を有する対象にｅＩＦ３またはｅＩＦ３サブユニットのモジュレーター、またはＲＡＮタンパク質に結合する抗体を投与することによって前記対象を処置するための方法に関する。【選択図】図２

Description

関連出願
本出願は、「反復関連非ＡＴＧ（ＲＡＮ）翻訳を調節するためのＥＩＦ３の操作」とタイトル付けされた２０１６年４月４日付け米国仮出願番号第６２／３１８，２００号の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． １１９（ｅ）に基づく利益を主張し、その全体の内容を出典明示により本願明細書に包含させる。

連邦支援研究
本願発明は、ＮＩＨによって授与されたＲ３７ＮＳ０４０３８９に基づく政府の支援によってなされた。政府は本願発明に一定の権利を有する。

背景
反復関連非ＡＴＧ（ＲＡＮ）翻訳の最初の発見以来、疾患関連反復の数が増えて、ＲＡＮ翻訳を受けることが見いだされている。ＲＡＮタンパク質毒性がトランスフェクト細胞およびモデル系において示されており、ＲＡＮ翻訳の疾患病因への関連性を示唆しているが、ＲＡＮ翻訳の最初の発見以来、ＲＡＮ翻訳のメカニズムの理解は改善されていない。非ヘアピン形成ＣＡＡ拡張ではなく、ヘアピン形成ＣＡＧが、トランスフェクト細胞においてＲＡＮ翻訳を受けることが観察されている。さらに、ＲＡＮ翻訳を受けることが報告されている他のすべての反復拡張は、鎖内ヘアピンおよびＧ－四重鎖のような複雑なＲＮＡ構造を形成することもできることが観察されている。これらのデータは、ＲＡＮ翻訳がＲＮＡ構造依存的に起こることを示唆している。さらに、より大きな反復拡張は、一般的に、トランスフェクト細胞におけるＲＡＮタンパク質蓄積のより高いレベルと関連し、反復の数の増加がＲＡＮ翻訳に都合が良いことを示唆する。ＲＡＮ翻訳に関与するさらなるｃｉｓ－およびｔｒａｎｓ－因子は、まだ解明されていない。

発明の概要
いくつかの態様において、本開示の局面は、反復関連非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）を発現する細胞を有効量の真核生物開始因子３（ｅＩＦ３）調節剤と接触させることによって、反復関連非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳を調節する方法を提供する。

いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質は、ポリ－アラニン、ポリ－ロイシン、ポリ－セリン、ポリ－システイン、ｐｏｌｙ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｃｙｓ（配列番号：６）（例えば、ＤＭ２と関連する）、ｐｏｌｙ－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ（配列番号：５）（例えば、ＤＭ２と関連する）、ｐｏｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、ｐｏｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ、ｐｏｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｌａ（例えば、センス Ｃ９ｏｒｆ７２ ＡＬＳ／ＦＴＤ）、またはｐｏｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｌａ、ｐｏｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ、ｐｏｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（例えば、アンチセンス Ｃ９ｏｒｆ７２ ＡＬＳ／ＦＴＤ）である。いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質はポリ－グルタミンではない。いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質は、約１０から約１００個のポリ－アミノ酸反復を含む。いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質は、約２０から約７５個のポリ－アミノ酸反復を含む。いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質は、約３０から約２００個のポリ－アミノ酸反復を含む。いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質は、少なくとも３５個のポリ－アミノ酸反復を含む。いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質は、少なくとも１００個のポリ－アミノ酸反復を含む。いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質は、少なくとも２００個のポリ－アミノ酸反復（例えば、少なくとも５００、１０００、２０００、２５００、５０００、１００００個などのポリ－アミノ酸反復）を含む。

いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質は、ハンチントン病（ＨＤ、ＨＤＬ２）、脆弱性Ｘ症候群（ＦＲＡＸＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、脊髄小脳失調症１（ＳＣＡ１）、脊髄小脳失調症２（ＳＣＡ２）、脊髄小脳失調症３（ＳＣＡ３）、脊髄小脳失調症６（ＳＣＡ６）、脊髄小脳失調症７（ＳＣＡ７）、脊髄小脳失調症８（ＳＣＡ８）、脊髄小脳失調症１２（ＳＣＡ１２）、または脊髄小脳失調症１７（ＳＣＡ１７）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調症３６型（ＳＣＡ３６）、脊髄小脳失調症２９型（ＳＣＡ２９）、脊髄小脳失調症１０型（ＳＣＡ１０）、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）、筋強直性ジストロフィー２型（ＤＭ２）、またはフックス角膜ジストロフィー（例えば、ＣＴＧ１８１）と関連する遺伝子によってコードされる。

いくつかの態様において、ｅＩＦ３調節剤は、タンパク質、例えば抗体、核酸、または小分子である。いくつかの態様において、ｅＩＦ３調節剤は阻害性核酸である。いくつかの態様において、阻害性核酸は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉ－ＲＮＡ、および人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉ－ＲＮＡ）からなる群から選択される干渉ＲＮＡである。いくつかの態様において、阻害性核酸は、アンチセンス核酸、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、または核酸アプタマー、例えばＲＮＡアプタマーである。いくつかの態様において、干渉ＲＮＡはｓｉＲＮＡである。いくつかの態様において、干渉ＲＮＡは、ｅＩＦ３をコードする核酸（例えば、ｅＩＦ３サブユニットをコードする核酸）に特異的に結合する（例えば、ハイブリダイズする）。

ｅＩＦ３調節剤が、ｅＩＦ３サブユニット（例えば、ｅＩＦ３Ｆ核酸）をコードする核酸の発現またはｅＩＦ３タンパク質（例えば、ｅＩＦ３ｆサブユニット）の発現を低下させることができると理解されるべきである。いくつかの態様において、ｅＩＦ３調節剤は、ｅＩＦ３ａ、ｅＩＦ３ｂ、ｅＩＦ３ｃ、ｅＩＦ３ｄ、ｅＩＦ３ｅ、ｅＩＦ３ｆ、ｅＩＦ３ｇ、ｅＩＦ３ｈ、ｅＩＦ３ｉ、ｅＩＦ３ｊ、ｅＩＦ３ｋ、ｅＩＦ３ｌ、およびｅＩＦ３ｍからなる群から選択されるｅＩＦ３サブユニットの発現を低下させる。いくつかの態様において、ｅＩＦ３インヒビターは、ｅＩＦ３ｆまたはｅＩＦ３ｍの発現を低下させる。いくつかの態様において、ｅＩＦ３調節剤は、ｅＩＦ３Ａ、ｅＩＦ３Ｂ、ｅＩＦ３Ｃ、ｅＩＦ３Ｄ、ｅＩＦ３Ｅ、ｅＩＦ３Ｆ、ｅＩＦ３Ｇ、ｅＩＦ３Ｈ、ｅＩＦ３Ｉ、ｅＩＦ３Ｊ、ｅＩＦ３Ｋ、ｅＩＦ３Ｌ、およびｅＩＦ３Ｍからなる群から選択されるｅＩＦ３サブユニットをコードする核酸の発現を低下させる。いくつかの態様において、ｅＩＦ３インヒビターは、ｅＩＦ３ｆまたはｅＩＦ３ｍの発現を低下させる。いくつかの態様において、ｅＩＦ３インヒビターは、ｅＩＦ３ＦまたはｅＩＦ３Ｍの発現を低下させる。

いくつかの態様において、ｅＩＦ３調節剤は、ｅＩＦ３ａ、ｅＩＦ３ｂ、ｅＩＦ３ｃ、ｅＩＦ３ｄ、ｅＩＦ３ｅ、ｅＩＦ３ｆ、ｅＩＦ３ｇ、ｅＩＦ３ｈ、ｅＩＦ３ｉ、ｅＩＦ３ｊ、ｅＩＦ３ｋ、ｅＩＦ３ｌ、およびｅＩＦ３ｍからなる群から選択されるｅＩＦ３サブユニットの発現を増加させる。いくつかの態様において、ｅＩＦ３インヒビターは、ｅＩＦ３ｈの発現を増加させる。いくつかの態様において、ｅＩＦ３調節剤は、ｅＩＦ３Ａ、ｅＩＦ３Ｂ、ｅＩＦ３Ｃ、ｅＩＦ３Ｄ、ｅＩＦ３Ｅ、ｅＩＦ３Ｆ、ｅＩＦ３Ｇ、ｅＩＦ３Ｈ、ｅＩＦ３Ｉ、ｅＩＦ３Ｊ、ｅＩＦ３Ｋ、ｅＩＦ３Ｌ、およびｅＩＦ３Ｍからなる群から選択されるｅＩＦ３サブユニットをコードする核酸の発現を増加させる。いくつかの態様において、ｅＩＦ３インヒビターは、ｅＩＦ３ｆまたはｅＩＦ３ｍの発現を増加させる。いくつかの態様において、ｅＩＦ３インヒビターは、ｅＩＦ３ＦまたはｅＩＦ３Ｍの発現を増加させる。

いくつかの態様において、細胞は対象に位置する。いくつかの態様において、細胞は、対象の脳、所望により脳の白質に位置する。いくつかの態様において、対象は動物である。いくつかの態様において、対象は哺乳動物である。いくつかの態様において、対象はヒトである。

いくつかの態様において、本開示の局面は、反復関連非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）を発現する対象に有効量の真核生物開始因子３（ｅＩＦ３）調節剤を投与することによって、反復関連非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳と関連する疾患を処置する方法を提供する。

いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質はポリ－グルタミンではない。いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質は、ポリ－アラニン、ポリ－ロイシン、ポリ－セリン、ポリ－システイン、ポリ－グルタミン、ｐｏｌｙ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｃｙｓ（配列番号：６）（例えば、ＤＭ２と関連する）、ｐｏｌｙ－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ（配列番号：５）（例えば、ＤＭ２と関連する）、ｐｏｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、ｐｏｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ、ｐｏｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｌａ（例えば、センス Ｃ９ｏｒｆ７２ ＡＬＳ／ＦＴＤ）、またはｐｏｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｌａ、ｐｏｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ、ｐｏｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（例えば、アンチセンス Ｃ９ｏｒｆ７２ ＡＬＳ／ＦＴＤ）である。いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質は、少なくとも３５個のポリ－アミノ酸反復を含む。いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質は、約１０から約１００個のポリ－アミノ酸反復を含む。いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質は、約２０から約７５個のポリ－アミノ酸反復を含む。いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質は、約３０から約２００個のポリ－アミノ酸反復を含む。いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質は、少なくとも１００個のポリ－アミノ酸反復を含む。いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質は、少なくとも２００個のポリ－アミノ酸反復（例えば、少なくとも５００、１０００、２０００、２５００、５０００、１００００個などのポリ－アミノ酸反復）を含む。

いくつかの態様において、反復非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳と関連する疾患は、ハンチントン病（ＨＤ、ＨＤＬ２）、脆弱性Ｘ症候群（ＦＲＡＸＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、脊髄小脳失調症１（ＳＣＡ１）、脊髄小脳失調症２（ＳＣＡ２）、脊髄小脳失調症３（ＳＣＡ３）、脊髄小脳失調症６（ＳＣＡ６）、脊髄小脳失調症７（ＳＣＡ７）、脊髄小脳失調症８（ＳＣＡ８）、脊髄小脳失調症１２（ＳＣＡ１２）、または脊髄小脳失調症１７（ＳＣＡ１７）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調症３６型（ＳＣＡ３６）、脊髄小脳失調症２９型（ＳＣＡ２９）、脊髄小脳失調症１０型（ＳＣＡ１０）、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）、筋強直性ジストロフィー２型（ＤＭ２）、またはフックス角膜ジストロフィー（例えば、ＣＴＧ１８１）である。

いくつかの態様において、ｅＩＦ３調節剤は、タンパク質、例えば抗体、核酸、または小分子である。いくつかの態様において、ｅＩＦ３調節剤は阻害性核酸である。いくつかの態様において、阻害性核酸は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉ－ＲＮＡ、およびａｍｉ－ＲＮＡからなる群から選択される干渉ＲＮＡである。いくつかの態様において、阻害性核酸は、アンチセンス核酸、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、または核酸アプタマー、例えばＲＮＡアプタマーである。いくつかの態様において、干渉ＲＮＡはｓｉＲＮＡである。

いくつかの態様において、ｅＩＦ３調節剤はｅＩＦ３ｆの発現を低下させる。いくつかの態様において、ｅＩＦ３調節剤はｅＩＦ３ｍの発現を低下させる。いくつかの態様において、ｅＩＦ３調節剤はｅＩＦ３Ｆの発現を低下させる。いくつかの態様において、ｅＩＦ３調節剤はｅＩＦ３Ｍの発現を低下させる。いくつかの態様において、ｅＩＦ３ｆの発現を低下させるｅＩＦ３調節剤およびｅＩＦ３ｍの発現を低下させるｅＩＦ３調節剤の両方が、対象に投与される。

いくつかの態様において、方法は、反復非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳と関連する疾患に対するさらなる治療剤を投与することをさらに含む。いくつかの態様において、さらなる治療剤は、抗体（例えば、ＲＡＮ反復拡張に特異的に結合する抗体または反復拡張のＣ－末端であるＲＡＮタンパク質のユニークな(unique)領域に特異的に結合する抗体）またはさらなる阻害性核酸である。いくつかの態様において、抗体はｐｏｌｙ－Ｓｅｒ ＲＡＮ反復拡張に特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体はｐｏｌｙ－Ｓｅｒ ＲＡＮ反復拡張を含むタンパク質のＣ－末端領域に結合する。

いくつかの態様において、ｅＩＦ３調節剤はｅＩＦ３ｈの発現を増加させる。

いくつかの態様において、対象は動物である。いくつかの態様において、対象は哺乳動物である。いくつかの態様において、対象はヒトである。

いくつかの態様において、組成物は、ｅＩＦ３の（例えばｅＩＦ３の１つ以上のサブユニットの）発現および／または活性を調節する１つ以上の（例えば、２、３、４、５、またはそれ以上の）薬剤を含む。

いくつかの局面において、本開示は、反復非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）を発現する対象に有効量のＲＡＮ反復拡張に特異的に結合する抗体、または反復拡張のＣ－末端であるＲＡＮタンパク質のユニークな領域に特異的に結合する抗体を投与することを含む、反復非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳と関連する疾患を処置するための方法を提供する。

いくつかの態様において、抗体はポリ－セリン（ｐｏｌｙ－Ｓｅｒ）反復拡張に結合する。いくつかの態様において、抗体は反復拡張のＣ－末端であるＲＡＮタンパク質のユニークな領域に結合する。いくつかの態様において、反復拡張のＣ－末端であるＲＡＮタンパク質のユニークな領域は、配列番号：９に示されている配列であるか、またはそれを含む。

いくつかの態様において、本開示によって記載される抗体（例えば、ＲＡＮ反復拡張に特異的に結合する抗体、または反復拡張のＣ－末端であるＲＡＮタンパク質のユニークな領域に特異的に結合する抗体）は、対象においてＲＡＮタンパク質凝集体を標的とする（例えば、に免疫特異的に結合する）。いくつかの態様において、抗ＲＡＮタンパク質抗体は細胞内ＲＡＮタンパク質に結合する（例えば、細胞の細胞質または核においてＲＡＮタンパク質に結合する）。いくつかの態様において、抗ＲＡＮタンパク質抗体は細胞外ＲＡＮタンパク質に結合する（例えば、細胞の細胞外膜の外側のＲＡＮタンパク質に結合する）。

本願のこれらおよび他の局面は、本願明細書により詳細に記載されており、以下の非限定的な図面によって説明されている。

図１Ａ－１Ｃは、ｅＩＦ３ＦノックダウンがｐｏｌｙＡｌａ ＲＡＮの減少を引き起こすことを示す。図１Ａは、使用されたプラスミドを示す概略図を示す。ｐｏｌｙＧｌｎフレームでのＡＴＧ。配列は配列番号：１８に対応する。図１Ｂ－１Ｃは、ｅＩＦ３Ｆノックダウン（ＫＤ）の存在下でｐｏｌｙＧｌｕではなくｐｏｌｙＡｌａの減少を示すウェスタンブロットを示す。

図２Ａ－２Ｄは、ｅＩＦ３ＨノックダウンではなくｅＩＦ３ＦおよびｅＩＦ３ＭノックダウンがｐｏｌｙＡｌａフレームにおいてＲＡＮを減少させることを示す。図２Ａは、ｅＩＦ３複合体組織の概略図を示す。図２ＢはＲＡＮ発現構築物を示す。ＡＴＧはｐｏｌｙＡｌａフレームに存在する。配列は配列番号：１８に対応する。図２Ｃ－２Ｄは、ｐｏｌｙＡｌａレベルがｅＩＦ３Ｍ ｓｉＲＮＡ処理で低下するが、ｅＩＦ３Ｈ ｓｉＲＮＡ処理によって増加することを示す。

図３Ａ－３Ｃは、ｅＩＦ３ＦがＣＡＧ拡張にわたって全３つのフレームにおいてＲＡＮ翻訳を制御することを示す。図３Ａは、近いコグネイト開始部位を有さないＲＡＮ発現構築物を示す。配列は配列番号：１９に対応する。図３Ｂは、ＲＡＮが３つのフレームを減少させることを証明するウェスタンブロットを示す。ｐｏｌｙＳｅｒは、可溶性（上部）および不溶性（下部）画分の両方を示す。図３Ｃは、ｅＩＦ３Ｆタンパク質の効率的なノックダウンを示すウェスタンブロットを示す。

図４Ａ－４Ｂは、ＡＴＸＮ８の状況においてｅＩＦ３Ｆノックダウンの効果を示す。図４Ａは、ＡＴＸＮ８遺伝子およびＣＡＧ反復にわたって発現されるタンパク質を示す。アミノ酸および核酸配列（上から下）は、配列番号：１１－１３によって表される。図４Ｂは、ｐｏｌｙＧｌｎおよびｐｏｌｙＡｌａフレームにおいてＡＵＧおよび近いコグネイトのために、ＡＴＸＮ８におけるｐｏｌｙＳｅｒフレームの発現がｅＩＦ３Ｆ－ノックダウン感受性であることを示す。

図５Ａ－５Ｂは、Ｃ９ｏｒｆ７２（ＡＬＳ）およびＤＭ２状況におけるｅＩＦ３Ｆの効果を示す。図５Ａは、Ｃ９ｏｒｆ７２ミニ遺伝子（上）およびｅＩＦ３Ｆ ｓｉＲＮＡがＧＰ ＲＡＮタンパク質を低下させることを示すタンパク質ブロット（下）を示す。図５Ｂは、ＤＭ２ミニ遺伝子（上）およびｅＩＦ３Ｆ ｓｉＲＮＡがＱＡＧＲ ＲＡＮタンパク質を低下させることを示すタンパク質ブロット（下）を示す。

図６Ａ－６Ｅは、ｐｏｌｙＳｅｒタンパク質が脳の白質領域に蓄積することを示す。図６Ａは、ユニークなＣ－末端を有するｐｏｌｙＳｅｒ ＲＡＮタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：１４）を示す。ウサギポリクローナル抗体を生成するために使用されるペプチド配列は、下線が引かれている（ＳＳＳＫＡＲＦＳＮＭＫＤＰＧ、配列番号：１５）およびＲＶＮＬＳＶＥＡＧＳＱＫＲＱＳＥ、配列番号：１６）である。図６Ｂは、ＡＴＧ開始Ｎ末端Ｆｌａｇエピトープタグ化ｐｏｌｙＳｅｒ拡張タンパク質、次に内因性Ｃ－末端配列を発現するＦｌａｇ－Ｓｅｒ－ＣＴ構築物の概略図を示す。配列は配列番号：２０に対応する。免疫前血清ではなくＦｌａｇ－Ｓｅｒ－ＣＴでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるα－Ｆｌａｇおよびα－ＳｅｒＣＴ１を用いた免疫蛍光（ＩＦ）染色の共局在化。図６Ｃは、ｐｃＤＮＡ３．１ではなくＦｌａｇ－Ｓｅｒ－ＣＴでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるα－Ｆｌａｇおよびα－ＳｅｒＣＴ２を用いた免疫蛍光（ＩＦ）染色の共局在化を示す。図６Ｄは、ｐｃＤＮＡ３．１（第１レーン）ではなくＦｌａｇ－Ｓｅｒ－ＣＴ（第２レーン）でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物におけるα－Ｆｌａｇ（左）およびα－ＳｅｒＣＴ２（右）を用いた組換えｐｏｌｙＳｅｒタンパク質の検出を示す免疫ブロットを示す。図６Ｅは、ＳＣＡ８ ＢＡＣマウス小脳の免疫組織化学（ＩＨＣ）を示し、ｐｏｌｙＳｅｒではなくｐｏｌｙＧｌｎがＰｕｒｋｉｎｊｅ細胞に蓄積することを示す。対照的に、ｐｏｌｙＳｅｒが分子層および小脳白質において見られる。（挿入：分子層および白質のより高い倍率。

図７は、ｐｏｌｙＳｅｒ蓄積が年齢および疾患の重症度とともに増加することを示す。α－ＳｅｒＣＴで染色された２月（左パネル）、６月（真ん中のパネル）、および最終段階でのＳＣＡ８ ＢＡＣマウス（ｎ＝３）の前庭神経核、楔状束核、および運動皮質層ＩＩ／ＩＩＩの典型的なイメージを示す。典型的な凝集体は矢印で示される。

図８Ａ－８Ｄは、ＳＣＡ８ ＢＡＣマウスが、ｐｏｌｙＳｅｒ蓄積部位に白質異常を示すことを示す。図８Ａは、ＮＴマウスではなく小脳および脳幹ＳＣＡ８ ＢＡＣマウスにおいて示されるとき、Ｈ＆Ｅによって示される空胞化、ルクソールファストブルー染色（ＬＦＢ）によって示される関連脱髄、および、α－ＳＭＩ－３２によって示される軸索変性 深層小脳白質におけるＳｅｒＣＴによって示されるｐｏｌｙＳｅｒ蓄積で観察される部位を示す。図８Ｂは、ＳＣＡ８ヒト剖検組織において、ＬＦＢによって示される脱髄、およびα－ＳＭＩ－３２によって示される軸索変性、ＳｅｒＣＴ抗体により検出されるときｐｏｌｙＳｅｒ蓄積を有する観察される部位を示す。図８Ｃは、ＣＣ１（α－ＡＰＣ）抗体を用いた免疫組織化学（ＩＨＣ）が、ＮＴマウスと比較して、ＳＣＡ８ ＢＡＣマウスにおいて成熟乏突起膠細胞の有意に低下した数を示す（ＮＴ ｎ＝５、ＳＣＡ８ ＢＡＣ ｎ＝５；＊＊＊＊ ｐ＜０．０００１；平均±ＳＥＭ；対応がないｔ検定）。図８Ｄは、α－ＧＦＡＰ抗体を用いた免疫蛍光が、ＮＴマウスと比較して、ＳＣＡ８ ＢＡＣマウスにおいてアストログリオーシスの有意な増加を示すことを示す（ＮＴ ｎ＝３、ＳＣＡ８ ＢＡＣ ｎ＝３、＊＊ ｐ＜０．０１；平均±ＳＥＭ；対応がないｔ検定）。

図９Ａ－９Ｆは、哺乳動物翻訳因子ｅＩＦ３Ｆが対症的ＳＣＡ８ ＢＡＣマウスにおいてアップレギュレートされ、ＲＡＮ翻訳を制御することができることを示す。図９Ａは、同腹子と比較して、ＳＣＡ８ ＢＡＣマウスにおいて相対的Ｅｉｆ３ｆ発現レベルを示す棒グラフを示す。ｐ＜０．０００１；平均±ＳＥＭ；対応がないｔ検定）。図９Ｂは、ｅｉＦ３Ｆノックダウン実験のために使用される構築物を示す概略図を示す。すべての構築物は、３つのリーディングフレームのそれぞれにタグを有する。Ｍはメチオニン開始リーディングフレームを示す。配列はすべて配列番号１８に対応する。図９Ｃは、細胞がｅＩＦ３Ｆ ｓｉＲＮＡと共トランスフェクトされるとき、ＡＴＧ ｐｏｌｙＳｅｒではなくＲＡＮ ｐｏｌｙ－Ｓｅｒにおける減少を示すα－ＦＬＡＧ抗体を使用したｐｏｌｙＳｅｒ発現のドットブロット検出を示す。図９ＤはｐｏｌｙＳｅｒ検出の定量を示す。＊ｐ＜０．０５；ｎ．ｓ．有意でない；平均±ＳＥＭ；対応がないｔ検定。図９Ｅは、細胞がｅＩＦ３Ｆ ｓｉＲＮＡと共トランスフェクトされるとき、ＡＴＧ ｐｏｌｙＡｌａではなくＲＡＮ ｐｏｌｙ－Ａｌａにおける減少を示すα－ＨＡ抗体を使用したｐｏｌｙＡｌａ発現の検出を示す。図９ＦはｐｏｌｙＡｌａ検出の定量を示す。＊ｐ＜０．０５；ｎ．ｓ．有意でない；平均±ＳＥＭ；対応がないｔ検定。

図１０Ａ－１０Ｃは、哺乳動物翻訳因子ｅＩＦ３ＦがＧＧＧＧＣＣ、ＣＡＧＧおよびＣＣＴＧ反復にわたって制御することができることを示す。図１０Ａは、ＧＧＧＧＣＣまたはＣＡＧＧ構築物とｅＩＦ３Ｆ ｓｉＲＮＡで共トランスフェクトされた細胞におけるＲＡＮタンパク質蓄積の減少ならびにＣＣＴＧおよびｅＩＦ３Ｆ ｓｉＲＮＡで共トランスフェクトされた細胞におけるＲＡＮタンパク質蓄積の増加を示すα－ＦＬＡＧ抗体で検出されたＲＡＮタンパク質発現のタンパク質ブロッティングを示す。図１０Ｂは、タンパク質ブロットの定量を示す。＊ｐ＜０．０５；ｎ．ｓ．有意でない；平均±ＳＥＭ；対応がないｔ検定。図１０Ｃは、ｅＩＦ３Ｆノックダウンが、ＡＴＧ開始コドンを欠く構築物から発現されたＧＰおよびＱＡＧＲ ＲＡＮタンパク質のレベルを減少させ、ＣＣＵＧ拡張ＲＮＡにわたって発現されたＬＰＡＣテトラペプチドタンパク質のレベルを増加させることを示す。

図１１Ａ－１１Ｅは、ｐｏｌｙ－Ｓｅｒ反復に結合する抗－Ｓｅｒ抗体の開発を示す。図１１Ａは、ＣＡＧ反復から生じるセンスおよびアンチセンス転写産物から翻訳された推定タンパク質の概略図を示す。図１１Ｂは、抗－Ｓｅｒ抗体を生成するために使用されたペプチド配列（配列番号：１７）（上）およびＣ－末端ＦＬＡＧタグを有するｐｏｌｙ－Ｓｅｒ発現構築物（下）を示す。図１１Ｃは、抗－Ｓｅｒ抗体を用いた免疫ブロット法によって細胞において検出されたｐｏｌｙ－Ｓｅｒを示す。図１１Ｄは、抗－ＦＬＡＧおよび抗－Ｓｅｒ抗体によるＣ－末端ＦＬＡＧ－ｔａｇを有するｐｏｌｙ－Ｓｅｒの免疫蛍光検出を示す。図１１Ｅは、抗－Ｓｅｒ抗体を用いたヒトＳＣＡ８およびコントロール剖検組織の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を示す。

真核生物において、リボソーム、開始因子（ｅＩＦ）および翻訳開始および伸長の特定の工程を含むタンパク質翻訳機構がよく保存されている。しかしながら、リボソームタンパク質、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｅＩＦ３サブユニットを含む翻訳機構の成分が細胞型および発生段階間で変化することが報告されている。本開示の局面によると、これらの因子の１つ以上（例えば、１つ以上のｅＩＦ３サブユニット）の細胞または組織特異的不均一性は、いくつかの態様において、脳においてＲＡＮタンパク質蓄積の可変性を構成する。

真核生物開始因子３（ｅＩＦ３）は、真核タンパク質翻訳の開始段階に関与する多タンパク質複合体である。一般的に、ヒトにおいて、ｅＩＦ３は、１３個の同一でないサブユニット（例えば、ｅＩＦ３ａ－ｍ）を含む。最大の最も複雑な開始因子である哺乳動物ｅＩＦ３は、最大１３個の同一でないサブユニットを含む。一般的に、ｅＩＦ３ｆは、三重複合体の安定化、４０ＳサブユニットへのｍＲＮＡの結合を媒介すること、および４０Ｓおよび６０Ｓリボソームサブユニットの解離を促進することを含む翻訳開始の多くの工程に関与する。いくつかの態様において、他の非保存哺乳動物ｅＩＦ３サブユニットは、ｅＩＦ３機能において調節的役割を果たすことができ、ＲＡＮ翻訳に影響する（例えば、ｅＩＦ３ｍ）。いくつかの態様において、ｅＩＦ３複合体は、ＲＮＡ構造依存性様式においてウイルス性および細胞性ＩＲＥＳと相互作用することが観察されており、これが非標準的翻訳事象における役割であることを示している。いくつかの態様において、ｅＩＦ３ｆは、ＲＡＮ翻訳において重要な役割を果たし、ｅＩＦ３Ｆ／ｅＩＦ３ｆまたは他のｅＩＦ３サブユニット（例えば、ｅＩＦ３Ｍ／ｅＩＦ３ｍ）の操作は、ＲＡＮタンパク質発現を調節するのに有用であることができる。

ＲＡＮタンパク質翻訳
本開示の局面は、１つ以上のｅＩＦ３サブユニットが反復関連非ＡＴＧ（ＲＡＮ）タンパク質翻訳のレギュレーターであるということを見いだしたことに関する。「ＲＡＮタンパク質（反復関連非ＡＴＧ翻訳タンパク質）」は、ＡＵＧ開始コドンの非存在下でヌクレオチド拡張を有する、双方向に転写されたセンスまたはアンチセンスＲＮＡ配列から翻訳されたポリペプチドである。一般的に、ＲＡＮタンパク質は、ポリアミノ酸反復と呼ばれるアミノ酸の拡張反復を含む。例えば、「ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ」（ポリ－アラニン）（配列番号１）、「ＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬ」（ポリ－ロイシン）（配列番号２）、「ＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳ」（ポリ－セリン）（配列番号３）、または「ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ」（ポリ－システイン）（配列番号４）は、それぞれ２０個のアミノ酸残基の長さであるポリアミノ酸反復である。ＲＡＮタンパク質は、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、または少なくとも２００個のアミノ酸残基の長さであるポリアミノ酸反復を有することができる。いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質は、２００個以上のアミノ酸残基の長さのポリアミノ酸反復を有する。

一般的に、ＲＡＮタンパク質は、ＤＮＡの異常な反復拡張（例えば、ＣＡＧ反復）から翻訳される。いかなる特定の理論によっても束縛されることを望まずに、（例えば、細胞の核または細胞質における）ＲＡＮタンパク質蓄積は、細胞機能を破壊し、細胞毒性を誘導する。したがって、いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質の翻訳および蓄積は、疾患または障害、例えば神経変性疾患または障害と関連する。ＲＡＮタンパク質翻訳および蓄積と関連する障害および疾患の例は、限定はしないが、脊髄小脳失調症８型（ＳＣＡ８）、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）、脆弱Ｘ振戦失調症候群（ＦＸＴＡＳ）およびＣ９ＯＲＦ７２筋萎縮性側索硬化症／前頭側頭型認知症（ＡＬＳ／ＦＴＤ）を含む。

ＲＡＮタンパク質翻訳または蓄積と関連する疾患および障害を処置する方法
いくつかの態様において、本開示により記載される組成物および方法は、細胞または対象（例えば、ＲＡＮ翻訳と関連する障害または疾患を有する対象）におけるＲＡＮタンパク質翻訳または蓄積を低減または阻害するために有用である。いくつかの態様において、細胞はインビトロである。いくつかの態様において、対象は哺乳動物対象である。いくつかの態様において、対象はヒト対象である。

いくつかの局面において、本開示は、反復非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）を発現する対象に有効量の真核生物開始因子３（ｅＩＦ３）調節剤を投与することによって、反復非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳と関連する疾患を処置する方法を提供する。

いくつかの局面において、本開示は、反復非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）を発現する対象に抗体（例えば、ＲＡＮ反復拡張に特異的に結合する抗体または反復拡張のＣ－末端であるＲＡＮタンパク質のユニークな領域に特異的に結合する抗体）を投与することによって、反復非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳と関連する疾患を処置する方法を提供する。いくつかの態様において、抗体は、ｐｏｌｙ－Ｓｅｒ ＲＡＮ反復拡張に特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体は、ｐｏｌｙ－Ｓｅｒ ＲＡＮ反復拡張を含むタンパク質のＣ－末端領域に結合する。

いくつかの態様において、反復非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳と関連する疾患は、ハンチントン病（ＨＤ、ＨＤＬ２）、脆弱性Ｘ症候群（ＦＲＡＸＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、脊髄小脳失調症１（ＳＣＡ１）、脊髄小脳失調症２（ＳＣＡ２）、脊髄小脳失調症３（ＳＣＡ３）、脊髄小脳失調症６（ＳＣＡ６）、脊髄小脳失調症７（ＳＣＡ７）、脊髄小脳失調症８（ＳＣＡ８）、脊髄小脳失調症１２（ＳＣＡ１２）または脊髄小脳失調症１７（ＳＣＡ１７）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調症３６型（ＳＣＡ３６）、脊髄小脳失調症２９型（ＳＣＡ２９）、脊髄小脳失調症１０型（ＳＣＡ１０）、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）、筋強直性ジストロフィー２型（ＤＭ２）、またはフックス角膜ジストロフィー（例えば、ＣＴＧ１８１）である。

本願明細書において使用される「有効量」は、ＲＡＮタンパク質翻訳または蓄積と関連する疾患または障害（例えば、神経変性疾患）によって引き起こされる１つ以上の徴候または症状の処置または改善のような医学的に望ましい結果を提供するのに十分な治療剤の用量である。有効量は、処置される対象の年齢および健康状態、対象における疾患または障害の重症度（例えば、ＲＡＮタンパク質蓄積量、またはかかる蓄積によって引き起こされる細胞毒性）、処置期間、任意の併用療法の性質、特定の投与経路、および医療従事者（ｈｅａｌｔｈ ｐｒａｃｔｉｔｉｏｎｅｒ）の知識および専門知識の中の同様の因子などにより変わる。

いくつかの態様において、本開示により記載される反復非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳と関連する疾患を処置するための方法は、１つ以上のさらなる治療剤を対象に投与することをさらに含む。適切なさらなる治療剤の同定および選択は、当業者の能力の範囲内であり、対象が罹患している疾患に応じて変わる。例えば、いくつかの態様において、ハンチントン病（例えば、テトラベナジン、アマンタジン、クロルプロマジンなど）、脆弱性Ｘ症候群（例えば、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、カルバマゼピン、メチルフェニデート、トラゾドンなど）、脊髄小脳失調症（例えば、バクロフェン、リルゾール、アマンタジン、バレニクリンなど）、または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（例えば、リルゾールなど）、筋強直性ジストロフィー１型（タイドグロブス、メキシレチンなど）のための１つ以上の治療剤が対象に投与される。

処置の投与は、当該分野で既知の任意の方法（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｉｎｃ．参照）により達成されてもよい。投与は局所的または全身的であってもよい。投与は、非経口（例えば、静脈内、皮下、または皮内）または経口であってもよい。異なる投与経路のための組成物は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ参照）。用量は、対象および投与経路に依存する。用量は、当業者により決定されることができる。

投与経路は、限定はしないが、経口、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、皮下、眼、膣および直腸を含む。全身経路は、経口および非経口を含む。吸入による投与のために、いくつかのタイプの装置が定期的に使用される。これらのタイプの装置は、定量吸入器（ＭＤＩ）、呼吸作動（ｂｒｅａｔｈ－ａｃｔｕａｔｅｄ）ＭＤＩ、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、ＭＤＩと組み合わせたスペーサー／保持チャンバー、およびネブライザーを含む。

いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質発現と関連する疾患の処置は、それを必要とする対象の中枢神経系（ＣＮＳ）に投与される。本願明細書において使用される「中枢神経系（ＣＮＳ）」は、限定はしないが、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、脳脊髄液などを含む、対象の脳および脊髄の全ての細胞および組織を意味する。対象のＣＮＳへの治療剤の投与様式は、脳への直接注射（例えば、脳内注射、脳室内注射、脳実質内注射など）、対象の脊髄への直接注射（例えば、髄腔内注射、腰椎注射など）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

いくつかの態様において、本開示により記載される処置は、例えば静脈内注射により、対象に全身的に投与される。いくつかの態様において、対象のＣＮＳへの分子の送達を改善するために、全身投与される治療分子（例えば、ｅＩＦ３調節剤または抗ＲＡＮタンパク質抗体）を修飾することができる。治療分子のＣＮＳ送達を改善する修飾の例は、限定はしないが、血液脳関門標的化剤（例えば、Ｇｅｏｒｇｉｖａら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ６（４）：５５７－５８３（２０１４）に開示されているように、トランスフェリン、メラノトランスフェリン、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、血管平滑筋腫、ＲＶＧペプチドなど）との共投与またはコンジュゲーション、ＢＢＢ破壊剤（例えばブラジキニン）との共投与、および投与前のＢＢＢの物理的破壊（例えば、ＭＲＩガイド下集束超音波（ＭＲＩ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｆｏｃｕｓｅｄ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ））などを含む。

ｅＩＦ３調節剤、または抗ＲＡＮタンパク質抗体（例えば、ＲＡＮタンパク質に結合する抗体）は、当該分野で既知の任意の適切な様式により送達されてもよい。いくつかの態様において、ｅＩＦ３調節剤（例えば、ｅｉＦ３干渉ＲＮＡ、またはＲＡＮタンパク質に結合する抗体）は、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶベクター）、レンチウイルスベクターなど）またはプラスミドベースのベクターのようなベクターにより対象に送達される。

本開示の局面は、ＳＣＡ８マウスおよびＳＣＡ８ヒト剖検組織における深層小脳白質内で、強固なＳＣＡ８ ｐｏｌｙＳｅｒ ＲＡＮ蓄積が検出されたという驚くべきことを見いだしたことに関する。したがって、本開示により記載される方法のいくつかの態様において、有効量のｅＩＦ３モジュレーターが対象の脳の白質に送達される。

ｅＩＦ３モジュレーター
いくつかの態様において、ｅＩＦ３の１つ以上のサブユニットがＲＡＮ翻訳を制御する。いくつかの態様において、細胞または対象（例えば、ＲＡＮ翻訳と関連する疾患または状態を有する対象）におけるＲＡＮ翻訳を調節するために、ｅＩＦ３サブユニット（例えば、ｅＩＦ３ｆ、ｅＩＦ３ｍ、ｅＩＦ３ｈ、または他のｅＩＦ３サブユニット）の発現を調節する（例えば、発現を増加させる、または発現を減少させる）１つ以上の薬剤を使用することができる。いくつかの局面において、本開示は、いくつかの態様において、ｅＩＦ３複合体（ｅＩＦ３ｆ）のＦサブユニットのアイソフォームが、脳の特定の領域、例えばヒト脳の白質領域におけるＲＡＮ翻訳を制御するということを見いだしたことに基づいている。

局面において、本開示は、１つ以上のタンパク質における反復関連非ＡＴＧ（ＲＡＮ）翻訳を制御するために、ｅＩＦ３の１つ以上のモジュレーター（例えば、１つ以上のアクチベーター、または１つ以上のインヒビター）の対象（例えば、対象の細胞）への投与が使用されることができるということを見いだしたことに関する。本願明細書において使用される「ｅＩＦ３のモジュレーター」は、ｅＩＦ３タンパク質複合体またはｅＩＦ３複合体サブユニット（例えば、ｅＩＦ３ｆ、ｅＩＦ３ｍなど）の発現レベルまたは活性に直接的または間接的に影響する薬剤を意味する。モジュレーターは、ｅＩＦ３またはｅＩＦ３サブユニットのアクチベーター（例えば、ｅＩＦ３またはｅＩＦ３サブユニットの発現または活性を増加させる）またはｅＩＦ３またはｅＩＦ３サブユニットのインヒビター（例えば、ｅＩＦ３またはｅＩＦ３サブユニットの発現または活性を減少させる）であることができる。

一般的に、直接的モジュレーターは、ｅＩＦ３（またはｅＩＦ３サブユニット）、またはｅＩＦ３タンパク質複合体、またはｅＩＦ３サブユニットをコードする遺伝子と相互作用する（例えば、相互作用または結合する）ことにより機能する。一般的に、間接的モジュレーターは、ｅＩＦ３またはｅＩＦ３サブユニットの発現または活性を制御する（例えば、ｅＩＦ３またはｅｉＦ３サブユニットをコードする遺伝子またはタンパク質と直接相互作用しない）遺伝子またはタンパク質と相互作用することにより機能する。いくつかの態様において、ｅＩＦ３のモジュレーターは選択的モジュレーターである。「選択的モジュレーター」は、一方のタイプのｅＩＦ３サブユニットと比較して、もう一方のタイプのｅＩＦ３サブユニットの活性または発現を優先的に調節するｅＩＦ３のモジュレーターを意味する。いくつかの態様において、ｅＩＦ３のモジュレーターは、ｅＩＦ３ｆの選択的モジュレーターである。

ｅＩＦ３インヒビターは、タンパク質（例えば、抗体）、核酸、または小分子であることができる。ｅｉＦ３（例えば、ｅＩＦ３サブユニット）を阻害するタンパク質の例は、限定はしないが、ポリクローナル抗ｅＩＦ３抗体、モノクローナル抗ｅＩＦ３抗体、麻疹ウイルスＮタンパク質、ウイルスストレス誘導性タンパク質ｐ５６などを含む。ｅｉＦ３（例えば、ｅＩＦ３サブユニット）を阻害する核酸分子の例は、限定はしないが、ｅＩＦ３サブユニットをコードする遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどを含む。ｅＩＦ３の小分子インヒビターの例は、限定はしないが、ｍＴＯＲインヒビター（例えば、ラパマイシン、ＰＰ２４２）、Ｓ６キナーゼ（Ｓ６Ｋ）インヒビターなどを含む。

いくつかの態様において、ｅＩＦ３調節剤は阻害性核酸である。いくつかの態様において、阻害性核酸は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉ－ＲＮＡ、およびａｍｉ－ＲＮＡからなる群から選択される干渉ＲＮＡである。いくつかの態様において、阻害性核酸は、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ））または核酸アプタマー（例えば、ＲＮＡアプタマー）である。一般的に、阻害性ＲＮＡ分子は修飾されていなくても修飾されていてもよい。いくつかの態様において、阻害ＲＮＡ分子は、１つ以上の修飾オリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエート、２’－Ｏ－メチルなどの修飾オリゴヌクレオチドを含み、かかる修飾は当該技術分野においてインビボでのオリゴヌクレオチドの安定性を改善するとして認識されてきた。

いくつかの態様において、干渉ＲＮＡは、ｅＩＦ３サブユニットをコードする核酸配列（ＲＮＡ配列のような）の５～５０個の連続ヌクレオチド（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、約３０、約３５、約４０、または約５０個の連続ヌクレオチド））と相補的な配列を含む。ｅＩＦ３サブユニットをコードする核酸配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３７５０．２（ｅＩＦ３ａ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３７５１．３（ｅＩＦ３ｂ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３７５２．４（ｅＩＦ３ｃ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３７５３．３（ｅＩＦ３ｄ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１５６８．２（ｅＩＦ３ｅ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３７５４．２（ｅＩＦ３ｆ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３７５５．４（ｅＩＦ３ｇ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３７５６．２（ｅＩＦ３ｈ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３７５７．３（ｅＩＦ３ｉ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３７５８．３（ｅＩＦ３ｊ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１３２３４．３（ｅＩＦ３ｋ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６０９１．３（ｅＩＦ３ｌ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６３６０．５（ｅｉＦ３ｍ）などを含む。いくつかの態様において、干渉ＲＮＡはｓｉＲＮＡである。いくつかの態様において、ｅＩＦ３ｆ ｓｉＲＮＡが投与される（例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｃａｔ ＃Ｊ－０１９５３５－０８）。いくつかの態様において、ｅＩＦ３ｍ ｓｉＲＮＡが投与される（例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｃａｔ ＃Ｊ－０１６２１９－１２）。いくつかの態様において、ｅＩＦ３ｈ ｓｉＲＮＡが投与される（例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｃａｔ ＃Ｊ－００３８８３－０７）。

いくつかの態様において、ｅＩＦ３ｆはＲＡＮ翻訳のネガティブレギュレーターであり、ヒトｅＩＦ３ｆのレベルの低下は細胞におけるＲＡＮタンパク質の蓄積の減少と関連する。いくつかの態様において、（例えば、ＲＡＮタンパク質を発現する細胞における）ＲＡＮ翻訳は、近いコグネイト（ｃｌｏｓｅ ｃｏｇｎａｔｅ）からの翻訳またはＡＵＧ翻訳とは異なり、ｅＩＦ３ｆノックダウンに感受性である。いくつかの態様において、ＲＡＮ翻訳に使用される翻訳機構は、細胞におけるＡＵＧおよび近傍ＡＵＧ翻訳機構とは異なる。

いくつかの態様において、（例えば、ｅＩＦ３ｆの異所的発現を介した）ｅＩＦ３ｆレベルまたは活性の増加は、ＲＡＮ翻訳を増加させることができる。いくつかの態様において、これは、ＲＡＮ翻訳効率を増加させるために、または細胞においてＲＡＮ翻訳を誘導するために（例えば、ＲＡＮ翻訳の細胞モデルまたは動物モデルを作るために）有用であることができる。いくつかの態様において、ｅＩＦ３ｆをインビトロ無細胞翻訳系に加えてＲＡＮ翻訳を支持または促進することができる。

いくつかの態様において、ｅＩＦ３の１つ以上のサブユニットの１つ以上のモジュレーター（例えば、１つ以上のアクチベーターまたは１つ以上のインヒビター）を、対象に投与して、核酸反復の拡張と関連する（例えば、反復関連非ＡＴＧ翻訳と関連する）疾患を処置する。例えば、いくつかの態様において、対象に、ｅＩＦ３の１つ以上のサブユニットの２、３、４、５、６、７、８、９または１０のモジュレーターを投与する。

Ｃ９－ＡＬＳ／ＦＴＤのような特定のマイクロサテライト拡張障害において、ＧＧＧＧＣＣ反復拡張からのＲＡＮタンパク質は灰白質領域に蓄積することが示されている。３つのアンチセンスリーディングフレームのうちの２つは、インフレームＡＵＧ開始コドンを有する。本開示の局面によると、インフレームＡＵＧおよび近傍ＡＵＧコドンは、この疾患（例えば、Ｃ９－ＡＬＳ／ＦＴＤ）における白質領域より広範囲のＲＡＮタンパク質蓄積を説明することができる。いくつかの態様において、ＲＡＮ翻訳は上流のＡＵＧ開始コドンの存在下で起こり、ｅＩＦ３ｆ／Ｆの調節はそれらのリーディングフレームにおけるタンパク質蓄積（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２ ＡＬＳ／ＦＴＤのアンチセンスＧＧＣＣＣＣ拡張転写産物から作られたＰＲおよびＧＰ）に影響する。

いくつかの態様において、ｅＩＦ３ｆは、いずれの近傍コグネイト開始コドンも用いずにリーディングフレームに関するＲＡＮ翻訳を制御する。いくつかの態様において、いずれの近傍コグネイト開始コドンも用いずにリーディングフレームに関するＲＡＮ翻訳は、これらのフレームからのＲＡＮタンパク質の白質特異的な蓄積に寄与する。したがって、いくつかの態様において、対象の白質におけるＲＡＮタンパク質の蓄積は、本願明細書に記載のようにｅＩＦ３を調節することにより調節することができる。いくつかの態様において、ｅＩＦ３ｆ調節は、他の非白質組織におけるＲＡＮタンパク質蓄積を調節してもよい。

いくつかの態様において、白質領域におけるｅＩＦ３ｆは、非病理学的条件下で、反復含有転写産物（ヒトゲノムの６０％超が反復要素からなる）由来のペプチドを誘導してもよい。興味深いことに、最も豊富な白質特異的タンパク質の１つ、ミエリン塩基性タンパク質をコードするヒトＭＢＰ遺伝子は、第１のエキソン内で高度に多型であるが非病原性（ＴＧＧＡ）ｎ反復を含有する（Ｂｏｙｌａｎら、１９９０）。いくつかの態様において、反復拡張を含有するＭＰＢおよび／または他の白質特異的遺伝子は、ＲＡＮ翻訳を介して翻訳され、ヒト白質中のペプチドを生じさせることができる。本開示の局面によれば、かかるペプチドの翻訳は、本願明細書に記載のようにｅＩＦ３を介して制御することができる。

抗ＲＡＮタンパク質抗体
いくつかの局面において、本開示は、ＲＡＮ反復拡張に特異的に結合する抗体、または反復拡張のＣ－末端であるＲＡＮタンパク質のユニークな領域に特異的に結合する抗体に関する。いくつかの態様において、抗体は、ｐｏｌｙ－Ｓｅｒ ＲＡＮ反復拡張に特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体は、ｐｏｌｙ－Ｓｅｒ ＲＡＮ反復拡張を含むタンパク質のＣ末端領域に結合する。いくつかの態様において、抗ＲＡＮ抗体は、細胞内ＲＡＮタンパク質に結合する。いくつかの態様において、抗ＲＡＮ抗体は、細胞外ＲＡＮタンパク質に結合する。

抗ＲＡＮ抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であることができる。典型的には、ポリクローナル抗体は、マウス、ウサギまたはヤギのような適切な哺乳動物の接種により生産される。回収できる血清の量が多いため、より大きな哺乳動物がしばしば好ましい。典型的には、抗原（例えば、ｐｏｌｙ－Ｓｅｒ反復領域を含む抗原）が哺乳動物に注入される。これは、Ｂリンパ球が抗原に特異的なＩｇＧ免疫グロブリンを生産するように誘導する。このポリクローナルＩｇＧは、哺乳動物の血清から精製される。モノクローナル抗体は、一般に単一細胞株（例えば、ハイブリドーマ細胞株）により生産される。いくつかの態様において、抗ＲＡＮ抗体が精製される（例えば、血清から単離される）。

多くの方法が抗ＲＡＮ抗体を得るために用いてよい。例えば、抗体は、組換えＤＮＡ法を用いて生産することができる。モノクローナル抗体はまた、既知の方法に従って、ハイブリドーマ（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５－４９９を参照）の生成により生産してもよい。次いで、この方法で形成されたハイブリドーマを、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および表面プラズモン共鳴（例えば、ＯＣＴＥＴまたはＢＩＡＣＯＲＥ）分析などの標準的な方法を用いてスクリーニングし、特定の抗原に特異的に結合する抗体を生産する１つ以上のハイブリドーマを同定する。特定の抗原（例えば、ＲＡＮタンパク質）の任意の形態を、例えば組換え抗原、天然に存在する形態、その任意の変異体または断片を、免疫原として使用してもよい。抗体を作る１つの典型的な方法は、抗体またはその断片（例えばｓｃＦｖ）を発現するタンパク質発現ライブラリー、例えばファージまたはリボソームディスプレイライブラリーをスクリーニングすることを含む。ファージディスプレイは、例えば、Ｌａｄｎｅｒら 米国特許第５，２２３，４０９号； Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５－１３１７； Ｃｌａｃｋｓｏｎら （１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４－６２８； Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１－５９７、ＷＯ ９２／１８６１９；ＷＯ ９１／１７２７１；ＷＯ ９２／２０７９１；ＷＯ ９２／１５６７９；ＷＯ ９３／０１２８８；ＷＯ ９２／０１０４７；ＷＯ ９２／０９６９０；およびＷＯ ９０／０２８０９号中に記載されている。

ディスプレイライブラリーの使用に加えて、特定の抗原（例えば、ｐｏｌｙ－Ｓｅｒのような１つ以上のＲＡＮタンパク質）を使用して、非ヒト動物、例えば齧歯類、例えば、マウス、ハムスター、またはラットを免疫化させることができる。１つの態様において、非ヒト動物はマウスである。

他の態様において、非ヒト動物からモノクローナル抗体を得て、次いで当該分野で既知の組換えＤＮＡ技術を用いて修飾、例えばキメラ化する。キメラ抗体を作るための種々のアプローチが記載されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６８５１，１９８５；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２，１９８５、Ｃａｂｉｌｌｙら、 米国特許第４，８１６，５６７号；Ｂｏｓｓら、米国特許Ｎｏ．４，８１６，３９７号；Ｔａｎａｇｕｃｈｉら、欧州特許公開ＥＰ１７１４９６；欧州特許公開第０１７３４９４号、英国特許第２１７７０９６Ｂ号を参照のこと。

抗体はまた、当該分野で既知の方法によりヒト化することができる。例えば、所望の結合特異性を有するモノクローナル抗体を商業的にヒト化することができる（Ｓｃｏｔｇｅｎｅ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ；およびＯｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ）。トランスジェニック動物において発現されるような完全ヒト化抗体は、本発明の範囲内である（例えば、Ｇｒｅｅｎら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７，１３；および米国特許第５，５４５，８０６号および第５，５６９，８２５号参照）。

追加の抗体生産技術については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版を参照のこと。Ｅｄｗａｒｄ Ａ． Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ編、Ｄａｎａ－Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、（Ｃ）２０１４年。本願開示は、必ずしも抗体の特定の供給源、製造方法、または他の特別な特性に限定されない。

本出願のこれらおよび他の局面は、以下の非限定的な実施例により例示される。

実施例１
４０以上の疾患がマイクロサテライト拡張突然変異によって引き起こされる。反復拡張突然変異がタンパク質を作るメカニズムは様々である。拡張突然変異は、ＡＴＧ開始オープンリーディングフレームの一環として発現されるとき、拡張タンパク質にしがちな凝集体をコードすることができる。拡張は、近いコグネイトＡＵＧ様開始コドン（一般的にＡＵＧから１つのヌクレオチドに変化しているもの）の存在下で、タンパク質をもたらすことができる。これらの場合、標準的タンパク質翻訳機構が典型的に使用される。さらに、ヘアピン形成拡張突然変異はまた、ＡＵＧ開始コドンなしで、全３つのリーディングフレームにおいて拡張タンパク質を発現することもできる。このプロセスは、反復関連非ＡＴＧ（ＲＡＮ）翻訳と称され、脊髄小脳失調症８型、筋強直性ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症および前頭側頭型認知症を含む神経学的疾患の数の増大が報告されている。

この実施例は、（例えば、ＲＮＡｉ分子のような阻害剤を介する）ｅＩＦ３複合体の調節がＲＡＮ翻訳に影響を及ぼすことを記載する。この実施例は、ｅＩＦ３複合体のｅＩＦ３ｆおよびｅＩＦ３ｍタンパク質サブユニットをコードするｅＩＦ３ＦおよびｅＩＦ３Ｍ ＲＮＡのｓｉＲＮＡノックダウンが、ＣＡＧ、ＣＡＧＧ、ＣＣＵＧおよびＧ４Ｃ２拡張突然変異にわたって発現されるＲＡＮタンパク質の定常状態レベルを低下させることを記載する。逆に、ｅＩＦ３ｆおよびｅＩＦ３ｍの過剰発現は、いくつかの態様において、ＲＡＮ翻訳を増加させる。この見いだしたことは、マイクロサテライト拡張突然変異によって引き起こされる広範なカテゴリーの疾患に対する潜在的な治療的関連性を有する。

ｅＩＦ３Ｆのレベルの減少は、ＡＵＧまたは近いコグネイトＡＵＧ様開始コドンの非存在下でＲＡＮ翻訳の下方調節をもたらす
ＲＡＮ翻訳におけるｅＩＦ３Ｆの役割を調べるために、ｓｉＲＮＡを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｅＩＦ３Ｆ発現をノックダウンした。共トランスフェクション実験を、反復を含むプラスミド、ＡＴＧ－（ＣＡＧ）ｅｘｐおよび対照ｓｉＲＮＡ、ｅＩＦ３Ｆ ｓｉＲＮＡ、またはネガティブコントロールとして、ＭＲＩ１ ｓｉＲＮＡ（ｅＩＦ２Ｂサブユニット様タンパク質）を用いて行った。プラスミドＡＴＧ－（ＣＡＧ）ｎは、ｐｏｌｙＧｌｎフレームにおいてＡＴＧ開始コドンを含む。この構築物から発現されたｐｏｌｙ－Ｓｅｒ拡張タンパク質は溶解性の問題を有するため、ｐｏｌｙＡｌａをＲＡＮ翻訳のための読み出しとして使用した。コントロールおよびＭＲＩ１特異的ｓｉＲＮＡトランスフェクションの両方と比較して、ｅＩＦ３Ｆ特異的ｓｉＲＮＡと共にＡＴＧ－（ＣＡＧ）ｎプラスミドでトランスフェクトされた細胞においてｐｏｌｙＡｌａ発現の劇的な減少が観察された。対照的に、ＡＴＧ開始ｐｏｌｙＧｌｎ発現はｅＩＦ３Ｆノックダウンによって影響されないようであり、標準的翻訳はｅＩＦ３Ｆレベルに対してＲＡＮ翻訳ほど感受性ではないことを示す（図１Ａ－１Ｃ）。

ｅＩＦ３Ｆと直接相互作用する２つの他のｅＩＦ３サブユニットであるｅＩＦ３ｍおよびｅＩＦ３ｈの効果を調べた。ｅＩＦ３－ｍ、－ａ、－ｃ、－ｅ、－ｌ、－ｋサブユニットは、それらの重合ドメインの相互作用を介して集合されていることが示されている。－ｆと－ｈサブユニットは、互いに結合し、－ｆと－ｍ間の相互作用を介して残りの複合体に結合される。ｅＩＦ３ｍの下方調節は、ｐｏｌｙＡｌａ ＲＡＮタンパク質のレベルにおいて同様の減少を示す。このことは、ｅＩＦ３ｆがｅＩＦ３ｍを介して残りの複合体に負荷されるため、ｅＩＦ３ｆ減少で見られる減少と一致する。

第２の結合パートナーｅＩＦ３ｈは、ｅＩＦ３Ｈ ｓｉＲＮＡのノックダウンで、ｐｏｌｙＡｌａ ＲＡＮタンパク質のレベルを増加する逆効果を示し、ｅＩＦ３ｈサブユニットがＲＡＮ翻訳を通常妨げることを示す（図２Ａ－Ｄ）。ｅＩＦ３ｈサブユニットは、ＡＵＧまたは近いコグネイト開始コドンでの上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）から翻訳を媒介することが報告されており、この因子がＡＵＧまたは近いコグネイトコドンＡＵＧ様コドンでの開始に有利であり、ＲＡＮ翻訳を負に制御することができることを示す。したがって、ｅｉＦ３複合体の変異体は、いくつかの態様において、標準的およびＲＡＮ翻訳の効率に影響を与える。具体的には、ｅＩＦ３ｈがコア複合体に存在しないとき、ｅＩＦ３ｆは依然としてコアｅＩＦ３複合体に結合し、ＲＡＮ翻訳に有利であり、標準的翻訳を下方調節することができる。

ｅＩＦ３ｆの調節効果がｐｏｌｙＡｌａ特異的であるか否かを調べるために、反復の５’隣接配列上流に修飾ＨＤＬ２を有する伸長ＣＡＧ反復を含む第２のプラスミド（ＨＤＬ２－ｍｕｔ）を調べた。この構築物は、リーディングフレームのいずれかにおいて終止コドンと反復領域との間にＡＵＧまたは近いＡＵＧ開始コドンを含まない。ｅＩＦ３ｆ下方調節は、全３つのフレームにおいて減少したＲＡＮタンパク質蓄積をもたらす（図３Ａ－３Ｂ）。ｐｏｌｙＳｅｒ ＲＡＮタンパク質がポリアクリルアミドゲルにてうまく流れないため、不溶性および可溶性画分の両方で示される。ｅＩＦ３ｆのタンパク質レベルの効率的なノックダウンもまた示される（図３Ｃ）。

ＡＴＸＮ８の状況内でＲＡＮ翻訳に対するｅＩＦ３ｆノックダウンの効果を調べた（図４Ａ－４Ｂ）。ＡＴＸＮ８遺伝子座からの５’隣接領域を有する構築物（ＫＭＱ－３Ｔ）を使用した。ｐｏｌｙＧｌｎを有するフレームにおいてＡＴＧ開始コドンが存在する。このＫＭＱ－３ＴプラスミドおよびｅＩＦ３ｆ標的ｓｉＲＮＡでの二重トランスフェクション実験は、ｐｏｌｙＳｅｒフレームからのタンパク質翻訳のみがｅＩＦ３ｆレベルに感受性であるが、ｐｏｌｙＧｌｎおよびｐｏｌｙＡｌａはｅＩＦ３ｆのノックダウンの影響を受けなかったことを明らかにした。ｐｏｌｙＧｌｎ翻訳に関するこの結果は、フレーム内のＡＵＧ開始コドンが標準的翻訳を介してｐｏｌｙＧｌｎの発現を駆動することを示している。さらに、ｐｏｌｙＡｌａを有するフレーム内において近いコグネイトＡＵＡが存在する。ＡＵＡコドンは、ウサギ網状赤血球において標準的翻訳を開始するために約６０％の効率で使用されることが示されており、この状況においてもｐｏｌｙＡｌａフレームにおいて標準的翻訳を駆動することができる。したがって、ｅＩＦ３ｆの調節効果は、報告された近いコグネイト開始部位のいずれも含まないｐｏｌｙＳｅｒフレームについてのみ存在する。

ＡＬＳおよびＤＭ２状況内でＲＡＮ翻訳に対するｅＩＦ３ｆノックダウンの効果を調べた。図５Ａ－５Ｂは、Ｃ９ｏｒｆ７２（ＡＬＳ）およびＤＭ２状況におけるｅＩＦ３Ｆの効果を示す。図５Ａは、Ｃ９ｏｒｆ７２ミニ遺伝子（上）およびｅＩＦ３Ｆ ｓｉＲＮＡがＧＰ ＲＡＮタンパク質を低下させることを示すタンパク質ブロット（下）を示す。図５Ｂは、ＤＭ２ミニ遺伝子（上）およびｅＩＦ３Ｆ ｓｉＲＮＡがＱＡＧＲ ＲＡＮタンパク質を低下させることを示すタンパク質ブロット（下）を示す。

総合すれば、トランスフェクト細胞におけるこれらの実験は、近いコグネイトコドン使用頻度およびｍｅｔ－ｔＲＮＡ関連なしに開始するＲＡＮ翻訳が、ｅＩＦ３ｆおよびｅＩＦ３ｍサブユニットと関連する特定の翻訳機構を使用することを示す。

実施例２
ＰｏｌｙＳｅｒタンパク質は脳の白質領域に蓄積する
ＰｏｌｙＳｅｒ ＲＡＮタンパク質がＳＣＡ８に蓄積するか否かを試験するために、予測されたＳＣＡ８ ＰｏｌｙＳｅｒタンパク質のユニークなＣ末端領域内の２つの非重複ペプチド配列に指向されたウサギポリクローナル抗体を生成した（図６Ａ）。予測されたＣ－末端領域を有するエピトープタグ付きＰｏｌｙＳｅｒタンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトされた細胞を用いて、これらの抗体の特異性を証明した（図６Ｂ－６Ｄ）。免疫組織化学（ＩＨＣ）を行い、ＳＣＡ８ ＰｏｌｙＳｅｒ ＲＡＮタンパク質をインビボで検出した。ＰｏｌｙＳｅｒ ＲＡＮのＩＨＣ分布を、ＳＣＡ８マウスにおけるＳＣＡ８ ｐｏｌｙＧｌｎ拡張タンパク質のものと比較した。両方のタンパク質はＡＴＸＮ８センス転写産物から発現されるが、これらの分布パターンは著しく異なる。連続した小脳切片上で行われたＩＨＣは、ｐｏｌｙＧｌｎを示すが、ｐｏｌｙＳｅｒ凝集体はＰｕｒｋｉｎｊｅ細胞に蓄積しない。対照的に、ｐｏｌｙＧｌｎ凝集体ではなくｐｏｌｙＳｅｒは、分子層および深層小脳白質に見られる（図６Ｅ）。これらの領域におけるＰｏｌｙＧｌｎ染色は主に核である。対照的に、ｐｏｌｙＳｅｒ凝集体は、これらの領域において核周囲局在または神経網内での局在を示す。マウスと同様に、ＳＣＡ８ ｐｏｌｙＳｅｒおよびｐｏｌｙＧｌｎタンパク質は、ヒト剖検組織の別個の領域に蓄積し、主にｐｏｌｙＳｅｒが深層小脳白質において見られ、ｐｏｌｙＧｌｎがＰｕｒｋｉｎｊｅ細胞核に見られる。

要約すれば、ＡＴＸＮ８転写産物から共に発現されるＳＣＡ８ ｐｏｌｙＳｅｒおよびｐｏｌｙＧｌｎタンパク質は、顕著に異なる蓄積パターンを示す。ＳＣＡ８ ＲＡＮ ｐｏｌｙＳｅｒ凝集体は、主に、脳全体で白質および神経網領域に見られる。対照的に、ｐｏｌｙＧｌｎ凝集体は、小脳Ｐｕｒｋｉｎｊｅ細胞および脳全体で他のニューロンに見られる。これらのデータは、これらのタンパク質の細胞特異的発現、局在または代謝回転の違いがそれらの異なる細胞蓄積パターンをもたらすこと、およびｐｏｌｙＳｅｒ ＲＡＮタンパク質が白質領域に影響を及ぼすことによって疾患に寄与し得ることを示す。

ＳＣＡ８ｐｏｌｙＳｅｒ凝集体は、年齢および疾患進行とともに増加する
ｐｏｌｙＳｅｒ ＲＡＮタンパク質凝集体負荷が時間および疾患進行とともに変化するかを調べるために、異なる年齢でのＩＨＣを、２月齢（動物が明らかな異常を示さないとき）、６月齢（顕著な表現型が明らかであり、さらなるケアなしで致死的であろうとき）、および１０月齢（動物が進行した末期疾患を示すとき）で行った。２月齢で、ＩＨＣは、脳幹においてまれに見出された非常に小さく、ピン様(pin-like)のｐｏｌｙＳｅｒ凝集体を表したが（図７）、前頭皮質において検出できなかった。６月齢で、脳幹においてｐｏｌｙＳｅｒ ＲＡＮ凝集体のサイズおよび数が実質的に増加し、小さな凝集体が今や前頭皮質全体で明らかになった。約１０月齢（対症療法を伴う最終段階）で、ｐｏｌｙＳｅｒ凝集体はサイズが増加し、脳幹および前頭皮質の両方においてより豊富であった（図７）。

要約すれば、ｐｏｌｙＳｅｒ ＲＡＮタンパク質負荷は、ＳＣＡ８マウスにおいて年齢および疾患進行とともに増加する。脳幹の神経網内の初期のｐｏｌｙＳｅｒ ＲＡＮタンパク質蓄積は、２月の動物において見られる初期の運動異常と一致する。さらに、疾患の後期で前頭皮質全体でのｐｏｌｙＳｅｒ ＲＡＮ凝集体の検出は、ＳＣＡ８患者において皮質関与の複数の報告と一致する。

ＲＡＮ ｐｏｌｙＳｅｒ陽性白質領域は変性表現型を示す
強く障害されたＳＣＡ８マウスのＨ＆Ｅ染色は、歯状核を含む小脳における皮質下および深部白質の広範な空胞化を示す（図８Ａ）。空胞化はまた、大脳皮質の皮質下白質領域および脳幹全体で白質路において観察された（図８Ａ）。小脳および脳幹の連続切片を調べて、脱髄および軸索変性がｐｏｌｙＳｅｒ陽性領域に認められるか否かを観察した。ルクソールファストブルー（ＬＦＢ）染色は、コントロールと比較してＳＣＡ８マウスからの小脳および脳幹の両方で脱髄を示す。一貫して、ニューロフィラメントＨの脱リン酸化形態に対する抗体を用いるＩＨＣは、軸索変性の証拠を示した（図８Ａ）。同様の変化が、ｐｏｌｙＳｅｒ蓄積を有する部位で観察された脱髄および軸索変性を伴うヒト剖検組織で観察された（図８Ｂ）。

ｐｏｌｙＳｅｒ陽性白質領域における乏突起膠細胞異常をさらに特徴付けるために、成熟乏突起膠細胞（ＣＣ１）の細胞質マーカーを用いたＩＨＣをマウスで行った。脱髄データと一致して、これらのデータは、コントロールと比較して、ＳＣＡ８動物の深層小脳白質領域における成熟乏突起膠細胞の数の減少を示す（図８Ｃ）。さらに、深層小脳白質のＧＦＡＰ染色は、相対ＧＦＡＰ染色の５０％増加を有するＮＴ動物と比較して、ＳＣＡ８における反応性アストログリオーシスの証拠を示す（図８Ｄ）。

総合すれば、これらのデータは、ＳＣＡ８マウスにおけるｐｏｌｙＳｅｒ陽性白質領域が乏突起膠細胞喪失、アストログリオーシス、脱髄および軸索変性を示すことを示している。

増加した白質発現での翻訳因子であるｅＩＦ３Ｆによって調節されるＲＡＮ翻訳
白質領域におけるＳＣＡ８ ｐｏｌｙＳｅｒ ＲＡＮタンパク質の蓄積は、ＲＡＮ翻訳が特定の細胞型または脳領域においてより効率的であり得ることを示す。トランスクリプトミクスデータを分析し、真核生物翻訳因子であるｅＩＦ３Ｆが白質において上昇されることが観察された。ＲＮＡｓｅｑデータは、コントロールマウスと比較して、ＲＡＮタンパク質凝集の増加と相関する疾患の後期段階中のｅＩＦ３Ｆ ＲＮＡレベルの２．１３倍の増加を示した（図９Ａ）。これらのデータは、ｅＩＦ３Ｆが疾患の後期段階でＲＡＮ翻訳を増加させ得ることを示し、また白質においてＲＡＮ ｐｏｌｙＳｅｒ タンパク質の優先的蓄積を説明する。

ＡＴＧ開始コドンの有無にかかわらず構築物から発現された拡張タンパク質に対するｅＩＦ３Ｆノックダウンの効果を調べた一連の細胞培養実験を行った。ｐｏｌｙＳｅｒフレーム中のＡＴＧ開始コドンの有無にかかわらずミニ遺伝子を用いたｐｏｌｙＳｅｒ ＲＡＮタンパク質発現に対するｅＩＦ３Ｆノックダウンの効果を調べた（図９Ｂ）。ｅＩＦ３ＦのｓｉＲＮＡノックダウンは、コントロールｓｉＲＮＡと比較してＡＴＧ開始コドンを含まないＡ８およびＣＡＧ構築物を用いて発現されたｐｏｌｙＳｅｒタンパク質の定常状態レベルを４７％（ｐ＜０．０５）および３４％（ｐ＜０．０１）に低下させる（図９Ｃ）。対照的に、ｅＩＦ３Ｆノックダウンは、ｐｏｌｙＳｅｒフレーム中にＡＴＧ開始コドンを含むＤＭ１（Ｍ_ｓ）－３Ｔ構築物でトランスフェクトされた細胞におけるｐｏｌｙＳｅｒレベルに影響しなかった（図９Ｄ）。同様に、ｐｏｌｙＡｌａリーディングフレーム中のＡＴＧ開始コドンを含まない構築物（Ａ８およびＤＭ１）から発現されたｐｏｌｙＡｌａ ＲＡＮタンパク質の定常状態レベルは、ｅＩＦ３Ｆノックダウンによって、それぞれ５３％（ｐ＜０．０５）および２８％（ｐ＜０．０５）に減少される（図９Ｅおよび図９Ｆ）。ｐｏｌｙＳｅｒの結果と同様に、ＡＴＧ開始コドン（ＣＡＧ－３Ｔ）の存在下でのｅＩＦ３Ｆノックダウンは、ｐｏｌｙＡｌａの蓄積を減少させなかった。要約すると、これらのデータは、拡張されたＣＡＧリピートにわたってｐｏｌｙＡｌａタンパク質およびｐｏｌｙＳｅｒタンパク質のＲＡＮ翻訳が、ｅＩＦ３Ｆと関与する代替タンパク質翻訳機構を使用することを示す。対照的に、インフレームＡＴＧコドンの存在は、ｅＩＦ３Ｆレベルに感受性ではない標準的前開始複合体の補充を可能にする。

他の疾患（例えば、Ｃ９ＯＲＦ７２、ＡＬＳ／ＦＴＤおよびＤＭ２）が見出される反復拡張モチーフと関連するＧ４Ｃ２、ＣＡＧＧおよびＣＣＵＧ拡張ＲＮＡを発現する構築物もまた試験した（図１０Ａ）。タンパク質ブロッティングにより、ＧｌｙＰｒｏ（Ｇ４Ｃ２）、ＧｌｎＡｌａＧｌｙＡｒｇ（配列番号：５）（ＣＡＧＧ）、ＬｅｕＰｒｏＡｌａＣｙｓ（配列番号：６）（ＣＣＵＧ）のタンパク質レベルを測定した。ＣＡＧ拡張の結果と同様に、ｅＩＦ３Ｆノックダウンは、ＡＴＧ開始コドンを欠く構築物から発現されたＧＰ（０．５７ ｐ＜０．０５）およびＱＡＧＲ（０．１２ ｐ＜０．０５）ＲＡＮタンパク質のレベルを減少させた。対照的に、ｅＩＦ３Ｆノックダウンは、ＣＣＵＧ拡張ＲＮＡにわたって発現されたＬＰＡＣテトラペプチドタンパク質のレベルを増加させた（２．８、ｐ＜０．０５）（図１０Ｂ－１０Ｃ）。

総合すれば、これらのデータは、ＲＡＮ翻訳を、複数のリーディングフレームにおいて、およびＣＡＧ、Ｇ４Ｃ２およびＣＡＧＧ反復を含む複数の反復モチーフにわたって、低下させることができることを示す。

材料および方法
ＤＮＡ構築物およびｓｉＲＮＡ
Ｆｌａｇ－ｐｏｌｙＳｅｒ－ＣＴ構築物を、ＣＡＧ指向においてｐ３ＸＦｌａｇ－ｍｙｃ－ＣＭＶ－２４ベクター（Ｓｉｇｍａ、Ｅ ６１５１）に、１８８ｂｐの下流配列を有する８２反復のＣＡＧ拡張を含むＡＴＮＸ８ゲノム配列をサブクローニングすることによって作製した。このクローンを生成するために使用されたゲノムＤＮＡを、ＳＣＡ８ ＢＡＣ拡張マウス（２８７８）からのゲノムＤＮＡを使用する、および加えられたＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を含む５’プライマー（５’ＡＧＣＴＧＡＡＧＣＴＴＧＴＴＡＡＡＡＧＡＡＧＡＴＡＡＴＡＴＡＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＧＣＡＧ３’；配列番号：７）および加えられたＥｃｏＲＩ制限酵素部位を含む３’プライマー（５’ＡＧＴＣＴＧＡＡＴＴＣＣＣＴＡＧＴＴＣＴＴＧＧＣＴＣＣＡＧＡＣＴＡＡＣ３’；配列番号：８）を使用するＰＣＲにより増幅した。５’プライマーはまた、Ｎ－末端ｆｌａｇおよび反復領域との間のＡＧＣリーディングフレームにおける終始コドンの挿入を回避するためにＴ／Ｇ塩基置換を含む。ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、同じ酵素で切断したｐ３ＸＦｌａｇ－ｍｙｃ－ＣＭＶ－２４にクローニングした。ｐｏｌｙＳｅｒ（ＡＧＣ）フレーム中のＮ末端Ｆｌａｇエピトープタグ、８２ＣＡＧ反復およびｐｏｌｙＳｅｒフレーム内の最初の終始コドンにわたる３’隣接領域の存在を、サンガー配列決定によって確認した。ＡＴＧ（ＣＡＧ１０３）－３Ｔ、Ａ８（ＫＭＱ）－３Ｔ、ＤＭ１－Ｓｅｒ（Ｍ）、ＧＧＧＧＣＣ－３Ｔを以前に作製した。ヒトｅＩＦ３Ｆを標的とするｓｉＲＮＡおよびコントロール非標的ｓｉＲＮＡを商業的な供給源から注文した。

細胞培養およびトランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補ったＤＭＥＭ中で培養し、３７℃、５％ＣＯ_２を含む湿潤雰囲気下でインキュベートした。プラスミドおよびｓｉＲＮＡトランスフェクションをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で行った。後の分析のために、トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収した。ＫＤ実験のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて３０ｎＭのｓｉＲＮＡで切断した。トランスフェクションの２４時間後に、反復を含むプラスミドおよび３０ｎＭのｓｉＲＮＡを共トランスフェクトした。トランスフェクションの最初の２回目のラウンド(the first second round)の４８時間後に細胞を回収した。

ウサギポリクローナル抗体の生産
ｐｏｌｙＳｅｒ ＲＡＮタンパク質に対するポリクローナルウサギ抗体を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅによって作製した。ウサギ抗血清を、α－ｐｏｌｙＳｅｒ１およびα－ｐｏｌｙＳｅｒ２についてそれぞれ合成ペプチドＡｃ－ＣＳＳＳＫＡＲＦＳＮＭＫＤ－アミド（配列番号：９）およびＡｃ－ＣＲＶＮＬＳＶＥＡＧＳＱＫＲＱＳＥ－アミド（配列番号：１０）に対して作製した。

マウスサンプル
この実施例において、ＦＶＢバックグラウンド上のＳＣＡ８ ＢＡＣトランスジェニック系統（Ｂａｃ ｅｘｐ２，２８７８）を使用した。ＳＣＡ８ ＢＡＣ導入遺伝子を有する半数体マウスを、遺伝子型決定ＰＣＲによって確認した。ＳＣＡ８ ＢＡＣ拡張マウスが５月齢の後に出現する重度の運動機能障害のために、追加の食物（ＧｅｌＤｉｅｔ、Ｃｌｅａｒ Ｈ_２Ｏ）が＞５ヶ月間、動物のケージの底に提供された。組織学的分析のために、体重１ｋｇあたり１００ｍｇのケタミンおよび２０ｍｇのキシラジンを用いて動物を麻酔し、１５ｍｌの等張生理食塩水、続いて１０ｍｌの１０％緩衝ホルマリンで上行大動脈を介して灌流した。

組織学および免疫組織化学
ｐｏｌｙＳｅｒ ＲＡＮタンパク質の検出のために、脳を回収し、液体窒素で冷却した２－メチルブタン中で凍結させた。クライオスタットを用いて７マイクロメーターの矢状切片を切断し、１０％緩衝ホルマリン中で１５分間固定した。内因性ペルオキシダーゼブロックを３％Ｈ_２Ｏ_２メタノール中で５分間行った。非特異的結合をブロックするために、非血清ブロック（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ、ＢＳ９６６Ｍ）を１５分間適用した。一次抗血清を１：１０の非血清ブロックに４℃で一晩、以下の希釈で適用した。α－ｐｏｌｙＳｅｒ１（１：１００００）、α－ｐｏｌｙＳｅｒ２（１：５０００）または対応する免疫前血清を同じ希釈率。切片を１Ｘ ＰＢＳで３回洗浄し、ビオチン標識ウサギ二次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｓｉｇ－３２００２）を室温で３０分間適用した。セイヨウワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートされた連結試薬（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、９３０２８）を室温で３０分間適用し、ベクターノバレッド基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、ＳＫ４８００）への曝露によって検出を行った。対比染色のために、ヘマトキシリン溶液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｈ３４０４）を２０秒間適用した。スライドを勾配エタノールおよびキシレン溶液で脱水し、Ｃｙｔｏｓｅａｌ ６０（電Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８００６）を用いてマウントした。

固定された脳組織中のｐｏｌｙＳｅｒ ＲＡＮタンパク質の検出のために、動物を、１×ＰＢＳおよび１０％緩衝ホルマリンで経心的に灌流した。脳を回収し、１０％ホルマリン中で２４時間貯蔵し、その後７０％エタノールに取り除いた。組織学的処理およびパラフィン包埋後、７マイクロメーターの矢状切片をミクロトームを用いて切断した。切片をキシレン（１５分間）で脱パラフィンし、アルコール勾配（１０分間）で再水和させた。次に、切片を以下の抗原回復工程で処理した。第１に、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ＝７．６）中、３７℃で３０分間、１ｕｇ／ｍＬ プロテイナーゼＫ処理。第２に、熱源としてマイクロ波を使用して１５分間１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ＝６．５）中で加圧。第３に、５分間９５％ギ酸処理。内在性ペルオキシダーゼを３％ Ｈ_２Ｏ_２メタノール中で１０分間ブロックした。非特異的結合をブロックするために、非血清ブロック（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ、ＢＳ９６６Ｍ）を１５分間適用した。一次抗血清を、α－ｐｏｌｙＳｅｒ１（１：５０００）、α－ｐｏｌｙＳｅｒ２（１：１００００）または対応する免疫前血清を同じ濃度で、１：１０の非血清ブロックに４℃で一晩適用した。切片を１Ｘ ＰＢＳで３回洗浄し、ビオチン標識ウサギ二次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＳＩＧ３２００２）を室温で３０分間適用した。セイヨウワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートされた連結試薬を室温で３０分間適用し、Ｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ。、ＳＫ４８００）への曝露によって検出を行った。ヘマトキシリン溶液を２０秒間適用した（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｈ３４０４）。

穏やかな熱誘起抗原回復が、加圧器の代わりに蒸し器を使用して１０ｍＭ クエン酸バッファー（ｐＨ＝６．０）において行われたことを除いて、上記と同様の方法において、ＣＣ１（１：１０００、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ＳＭＩ－３２ （１：３０００、Ｃｏｖａｎｃｅ）およびα－Ｆｌａｇ（１：１０００、Ｓｉｇｍａ）抗体を使用する免疫染色実験を行った。ヘマトキシリンおよびエオシン染色のために、７ミクロンのマウスおよびヒトの脳切片をキシレンで脱パラフィンし、勾配エタノールで脱水した。次に、スライドをヘマトキシリン（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｈａｒｒｉｓ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に１分間浸し、１０分間蒸留水で洗浄した。次に、スライドをＥｏｓｉｎ Ｙ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、７１３１１）に３０秒間浸漬し、１０分間蒸留水で洗浄した。視覚化の前に、スライドを再水和し、カバースリップさせた。

ルクソールファストブルー（ＬＦＢ）染色のために、７ミクロンのマウスおよびヒト脳切片をキシレン中で脱パラフィンし、９５％エチルアルコールに水和させた。切片を５６℃で一晩ＬＦＢ溶液（９５％ エチルアルコール中０．１％ ルクソールファストブルー）中に放置した。次の日、スライドを９５％ エチルアルコールおよび蒸留水で濯いだ。次に、スライドを炭酸リチウム溶液および７０％ エチルアルコール（それぞれ３０秒）で区別し、蒸留水で洗浄した。スライドをクレシルバイオレット溶液（蒸留水中０．１％ クレシルバイオレット）で４０秒間対比染色し、蒸留水で濯いだ。視覚化の前に、スライドを再水和し、カバースリップさせた。画像はＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１光学顕微鏡で捕捉した。

統計分析
統計的有意性は、対応がないスチューデントｔ検定によって評価した。統計を、ソフトウェアパッケージ Ｐｒｉｓｍ ５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて行った。

ウェスタンブロッティング
細胞をプロテイナーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含むＲＩＰＡ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％デオキシコール酸ナトリウム、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）（ｐＨ＝７．５）緩衝液で４℃で３０分間振盪して溶解した。ゲノムＤＮＡを２１ゲージの針によって剪断し、溶解物を４℃、１５０００ｇで１５分間遠心分離する。上清を、可溶性画分として取り、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏｒａｄ）によって定量した。溶解物を４％－１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｂｉｏｒａｄ）に流し、ニトロセルロース膜に移した。膜を、Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）を含むリン酸緩衝生理食塩水中の１％ミルク中で、４℃で一晩振とうさせて、抗体：抗－ｍｙｃ（１：２０００、Ｓｉｇｍａ、Ｆ９２９１）、抗－Ｆｌａｇ－ＨＲＰ（１：３０００、Ｓｉｇｍａ、Ａ８５９２）、抗－ＨＡ（１：２０００、Ｓｉｇｍａ、Ｈ６５３３）、抗－ＧＡＰＤＨ（１：１００００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ３７４）α－ｐｏｌｙＳｅｒ１（１：１００００）で、ブロットした。膜を、ＰＢＳＴ中で５分間３回洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされた二次抗体溶液（１：２５００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＮＡ９３１Ｖ）に室温で４５分間インキュベートした。膜をＰＢＳＴ中で再び洗浄し、１分間増強化学発光（ＥＣＬ）のための基質の適用で展開した（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＮＥＬ１０４００）。

ペレットを２％ＳＤＳに再懸濁し、６５℃でインキュベートした。得られたＳＤＳ可溶性画分を、真空下でＢｉｏ－Ｄｏｔ ９６ウェル精密濾過システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてニトロセルロース膜上に固定化した。膜をＰＢＳＴで洗浄し、ウェスタンブロッティングと同じプロトコールを用いてブロットした。

実施例３
ポリ－セリン（ｐｏｌｙＳｅｒ）ＲＡＮタンパク質に結合する抗Ｓｅｒ抗体を産生した（図１１Ａ－１１Ｃ）。ｐｏｌｙ－Ｓｅｒは、センス指向においてＣＡＧ反復の第２のリーディングフレームの翻訳によって生産される（図１１Ａ）。１０個のセリン残基を含むペプチド配列（配列番号：１７）を使用して、ウサギにおいてポリクローナル抗体（抗－Ｓｅｒ）を生産した。Ｃ－末端ＦＬＡＧタグを有するｐｏｌｙ－Ｓｅｒタンパク質をコードする発現構築物もまた生産した。免疫ブロット分析は、ｐｏｌｙ－Ｓｅｒタンパクへの抗－Ｓｅｒの特異的結合を示す（図１１Ｃ）。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｐｏｌｙＳｅｒをコードする発現構築物でトランスフェクトし、免疫蛍光アッセイを行った。データは、ｐｏｌｙ－Ｓｅｒタンパク質が抗－ＦＬＡＧおよび抗－Ｓｅｒ抗体の両方によって検出されたことを示す（図１１Ｄ）。抗－Ｓｅｒ抗体はまた、ＳＣＡ８ヒト剖検組織においてｐｏｌｙ－Ｓｅｒタンパク質を染色したが、コントロールヒト剖検組織を染色しなかった（図１１Ｅ）。

ＲＡＮ ｐｏｌｙＳｅｒが主に白質領域に明確な蓄積パターンを示し、白質異常と共局在化することが観察された。早期白質の変化がＳＣＡ８において病原性の役割を果たすことが観察され、翻訳機構の調節がＲＡＮ翻訳を減少させるために実行可能な治療的選択肢であることが示された。ヒトＳＣＡ８脳におけるｐｏｌｙＳｅｒ ＲＡＮタンパク質の蓄積はまた、ｐｏｌｙＳｅｒ ＲＡＮタンパク質が免疫療法のための適切な標的であることを示す。

多くの神経変性疾患は、不溶性の細胞内または細胞外凝集体におけるミスフォールドタンパク質の異常な蓄積を伴う。いくつかの態様において、ミスフォールドタンパク質凝集体の毒性は、不溶性凝集体の存在である。いくつかの態様において、ミスフォールドタンパク質凝集体の毒性は、それらの可溶性オリゴマーの存在である。したがって、いくつかの態様において、抗－ＲＡＮタンパク質抗体（例えば、抗－Ｓｅｒ）は、対象においてＲＡＮタンパク質凝集体およびオリゴマーを標的とし（例えば、免疫特異的に結合し）、クリアにする。いくつかの態様において、抗ＲＡＮタンパク質抗体は、細胞内ＲＡＮタンパク質に結合する（例えば、細胞の細胞質または核においてＲＡＮタンパク質に結合する）。いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質（例えば、ｐｏｌｙＧＡ、ｐｏｌｙ－ＧＰ、ｐｏｌｙ－ＰＡなど）は、細胞間で伝達される。いくつかの態様において、抗ＲＡＮタンパク質抗体は、細胞外ＲＡＮタンパク質に結合する（例えば、細胞の細胞外膜の外側のＲＡＮタンパク質に結合する）。

いくつかの態様において、抗ＲＡＮタンパク質抗体は、病理学的タンパク質沈着物の抗体誘発食作用、凝集物の直接的抗体介在破壊、毒性可溶性タンパク質の中和、凝集タンパク質の中和、またはミスフォールドタンパク質の細胞間伝達の阻止を媒介する。

他の態様
本明細書に開示された特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わされてもよい。本明細書に開示された各特徴は、同じ、等価な、または類似の目的を果たす代替の特徴により置き換えられてもよい。したがって、特に他に述べられない限り、開示された各特徴は、等価なまたは類似の特徴の包括的なシリーズの１つの例に過ぎない。

上記の記載から、当業者は本開示の本質的な特性を容易に確認することができ、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、種々の用途および条件に本開示を適合させるために本開示の種々の変更および修飾を行うことができる。従って、他の態様も本開示の特許請求の範囲内にある。

均等なもの
いくつかの発明の態様が本明細書において記載され説明されてきた一方で、当業者は、機能を実行し、および／または結果および／または本明細書において記載された利点の１つ以上を得るための様々な他の手段および／または構造を容易に想像するし、かかる変形および／または修飾の各々は、本明細書に記載された発明の態様の範囲内にあるとみなされる。より一般には、当業者は、本明細書に記載された全てのパラメーター、寸法、材料、および構成が例示的であることを意図され、実際のパラメーター、寸法、材料および／または構成は、本発明の教示が使用される特定の適用に依存するであろうことを容易に認識する。当業者は、本明細書に記載の特定の発明の態様に対する多くの均等なものを、認識するかまたは単なる日常の実験を用いて確認することができる。故に、前述の態様は単なる一例として提示され、添付の特許請求の範囲およびそれと均等なものの範囲内で、発明の態様は、具体的に記載され請求された態様以外のように実施されてもよいことが理解されるべきである。本開示の発明の態様は、本明細書に記載された個々の各特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法に向けられている。加えて、かかる特徴、システム、物品、キット、および／または方法が相互に矛盾しない場合、かかる特徴、システム、物品、キットおよび／または方法の２つ以上の任意の組み合わせが、本開示の発明の範囲内に含まれる。

本明細書において定義され使用されている全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれた文書における定義、および／または定義された用語の通常の意味にて制御すると理解されるべきである。

本明細書に開示された全ての文献、特許および特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して出典明示により組み込まれており、ある場合には、文書の全体を含んでもよい。

本明細書および特許請求の範囲において使用される不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、反対に明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。

本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、「および／または」なる語句は、そのように結合された要素、すなわち場合によっては結合的に存在し、場合によっては選言的に存在する要素の「一方または両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」を用いて列挙された複数の要素は、同じように、すなわちそのように結合された要素の「１つ以上」と解釈されるべきである。具体的に特定されたそれらの要素と関連してもしなくても、「および／または」句により具体的に特定される要素以外の他の要素が所望により存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのオープンエンデッド（ｏｐｅｎ－ｅｎｄｅｄ）な言語と併せて使用される場合、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、１つの態様において、Ａのみ（所望により、Ｂ以外の要素を含む）を；他の態様において、Ｂのみ（所望によりＡ以外の要素を含む）を；さらに別の実施形態において、ＡおよびＢの両方（所望により他の要素を含む）；等を意味することができる。

本明細書および特許請求の範囲において使用される「または」は、上記で定義した「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト中の項目を分離している場合、「または」または「および／または」は包括的である、すなわち、要素の数またはリストの１を超えたも含む少なくとも１つの包含物であり、および、所望により追加のリストにない項目を含むと解釈されるべきである。「１つだけ」または「正確に１つ」、または、特許請求の範囲において使用される「からなる」のような反対に明確に示された用語のみが、要素の数またはリストの正確に１つの要素の包含物を意味する。一般に、本明細書において使用される「または」なる語は、「いずれかの」、「１つの」、「ただ１つの」、または「正確に１つの」などの排他的な用語により先行される場合、排他的な選択（すなわち「一方またはもう片方だが両方ではない」）を示すとしてのみ理解される。特許請求の範囲において使用される「本質的にからなる」は、特許法の分野において使用されるその通常の意味を有する。

１つ以上の要素のリストを参照して、本明細書および特許請求の範囲において使用される「少なくとも１つの」なる語句は、要素のリストにおけるいずれか１つ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、必ずしも要素のリスト内に具体的にリストされた要素のそれぞれおよび全ての少なくとも１つを含むとは限らず、要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを除外しないと理解されるべきである。この定義はまた、要素が、具体的に特定されたそれらの要素に関連してもしなくても、「少なくとも１つの」なる語句が意味する要素のリスト内で具体的に特定された要素以外に所望により存在してもよいことを可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、等価に「ＡまたはＢの少なくとも１つ」または、等価に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、１つの態様において、Ｂが存在しない（および所望によりＢ以外の要素を含む）少なくとも１つの、所望により１つ以上のＡを意味することができ；別の態様において、Ａが存在しない（および所望によりＡ以外の要素を含む）少なくとも１つの、所望により１を超えたＢを意味することができ；さらに別の態様において、少なくとも１つ、所望により１を超えたＡおよび、少なくとも１つ、所望により１を超えたＢ（および所望により他の要素を含む）等を意味することができる。

反対に明確に示されない限り、複数のステップまたは動作を含む本明細書において請求されるいずれの方法においても、該方法のステップまたは動作の順序は、必ずしもステップまたは動作が列挙される順序に限定されないことが理解されるべきである。

本明細書および特許請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）」などの全ての移行句（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｐｈｒａｓｅｓ）は、オープンエンデッドである、すなわち限定されないが含むことを意味すると理解されるべきである。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」なる移行句のみが、米国特許庁特許審査基準第２１１１．０３項に記載されているように、それぞれクローズド（ｃｌｏｓｅｄ）またはセミクローズド（ｓｅｍｉ－ｃｌｏｓｅｄ）な移行句である。代替の態様において、オープンエンデッドな移行句（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」）を使用して本明細書に記載された態様もまた、該オープンエンデッドな移行句により記述される特徴「からなる」および「本質的にからなる」としても考慮されることが理解されるべきである。例えば、本開示が「ＡおよびＢを含む組成物」を記載する場合、本開示はまた、代替の態様「ＡおよびＢからなる組成物」および「本質的にＡおよびＢからなる組成物」を考慮する。

Claims (37)

1. 反復非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）を発現する細胞を有効量の真核生物開始因子３（ｅＩＦ３）調節剤と接触させることを含む、反復非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳を調節する方法。
2. ＲＡＮタンパク質が、ポリ－アラニン、ポリ－ロイシン、ポリ－セリン、ポリ－システイン、またはポリ－グルタミンである、請求項１に記載の方法。
3. ＲＡＮタンパク質がポリ－グルタミンではない、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. ＲＡＮタンパク質が、少なくとも３５個のポリ－アミノ酸反復を含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
5. ＲＡＮタンパク質が、ハンチントン病（ＨＤ、ＨＤＬ２）、脆弱性Ｘ症候群（ＦＲＡＸＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、脊髄小脳失調症１（ＳＣＡ１）、脊髄小脳失調症２（ＳＣＡ２）、脊髄小脳失調症３（ＳＣＡ３）、脊髄小脳失調症６（ＳＣＡ６）、脊髄小脳失調症７（ＳＣＡ７）、脊髄小脳失調症８（ＳＣＡ８）、脊髄小脳失調症１２（ＳＣＡ１２）、または脊髄小脳失調症１７（ＳＣＡ１７）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調症３６型（ＳＣＡ３６）、脊髄小脳失調症２９型（ＳＣＡ２９）、脊髄小脳失調症１０型（ＳＣＡ１０）、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）、筋強直性ジストロフィー２型（ＤＭ２）、またはフックス角膜ジストロフィー（例えば、ＣＴＧ１８１）と関連する遺伝子によってコードされる、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
6. ｅＩＦ３調節剤が、タンパク質、所望により抗体、核酸、または小分子である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
7. ｅＩＦ３調節剤が阻害性核酸である、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
8. 阻害性核酸が、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉ－ＲＮＡ、および人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉ－ＲＮＡ）からなる群から選択される干渉ＲＮＡである、請求項７に記載の方法。
9. 阻害性核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）または核酸アプタマー、所望によりＲＮＡアプタマーである、請求項７に記載の方法。
10. 干渉ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項８に記載の方法。
11. ｅＩＦ３調節剤が、ｅＩＦ３ａ、ｅＩＦ３ｂ、ｅＩＦ３ｃ、ｅＩＦ３ｄ、ｅＩＦ３ｅ、ｅＩＦ３ｆ、ｅＩＦ３ｇ、ｅＩＦ３ｈ、ｅＩＦ３ｉ、ｅＩＦ３ｊ、ｅＩＦ３ｋ、ｅＩＦ３ｌ、およびｅＩＦ３ｍからなる群から選択されるｅＩＦ３サブユニットの発現を低下させる、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
12. ｅＩＦ３インヒビターが、ｅＩＦ３ｆまたはｅＩＦ３ｍの発現を低下させる、請求項１１に記載の方法。
13. ｅＩＦ３調節剤が、ｅＩＦ３ａ、ｅＩＦ３ｂ、ｅＩＦ３ｃ、ｅＩＦ３ｄ、ｅＩＦ３ｅ、ｅＩＦ３ｆ、ｅＩＦ３ｇ、ｅＩＦ３ｈ、ｅＩＦ３ｉ、ｅＩＦ３ｊ、ｅＩＦ３ｋ、ｅＩＦ３ｌ、およびｅＩＦ３ｍからなる群から選択されるｅＩＦ３サブユニットの発現を増加させる、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
14. ｅＩＦ３インヒビターが、ｅＩＦ３ｈの発現を増加させる、請求項１３に記載の方法。
15. 細胞が対象に位置する、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
16. 細胞が、対象の脳、所望により脳の白質に位置する、請求項１５に記載の方法。
17. 反復非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）を発現する対象に有効量の真核生物開始因子３（ｅＩＦ３）調節剤を投与することを含む、反復非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳と関連する疾患を処置する方法。
18. ＲＡＮタンパク質が、ポリ－アラニン、ポリ－ロイシン、ポリ－セリン、ポリ－システイン、ポリ－グルタミン、ｐｏｌｙ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｃｙｓ（配列番号：６）、ｐｏｌｙ－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ（配列番号：５）、ｐｏｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、ｐｏｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ、ｐｏｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｌａ、またはｐｏｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｌａ、ｐｏｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ、ｐｏｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏである、請求項１７に記載の方法。
19. ＲＡＮタンパク質がポリ－グルタミンではない、請求項１７または請求項１８に記載の方法。
20. ＲＡＮタンパク質が、少なくとも３５個のポリ－アミノ酸反復を含む、請求項１７から１９のいずれかに記載の方法。
21. 反復非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳と関連する疾患が、ハンチントン病（ＨＤ、ＨＤＬ２）、脆弱性Ｘ症候群（ＦＲＡＸＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、脊髄小脳失調症１（ＳＣＡ１）、脊髄小脳失調症２（ＳＣＡ２）、脊髄小脳失調症３（ＳＣＡ３）、脊髄小脳失調症６（ＳＣＡ６）、脊髄小脳失調症７（ＳＣＡ７）、脊髄小脳失調症８（ＳＣＡ８）、脊髄小脳失調症１２（ＳＣＡ１２）、または脊髄小脳失調症１７（ＳＣＡ１７）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調症３６型（ＳＣＡ３６）、脊髄小脳失調症２９型（ＳＣＡ２９）、脊髄小脳失調症１０型（ＳＣＡ１０）、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）、筋強直性ジストロフィー２型（ＤＭ２）、またはフックス角膜ジストロフィー（例えば、ＣＴＧ１８１）である、請求項１７から２０のいずれかに記載の方法。
22. ｅＩＦ３調節剤が、タンパク質（例えば、抗体）、核酸、または小分子である、請求項１７から２１のいずれかに記載の方法。
23. ｅＩＦ３調節剤が阻害性核酸である、請求項１７から２２のいずれかに記載の方法。
24. 阻害性核酸が、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉ－ＲＮＡ、および人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉ－ＲＮＡ）からなる群から選択される干渉ＲＮＡである、請求項２３に記載の方法。
25. 阻害性核酸が、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ））または核酸アプタマー（例えば、ＲＮＡアプタマー）である、請求項２３に記載の方法。
26. 干渉ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項２４に記載の方法。
27. ｅＩＦ３調節剤が、ｅＩＦ３ｆの発現を低下させる、請求項１７から２６のいずれかに記載の方法。
28. ｅＩＦ３調節剤が、ｅＩＦ３ｍの発現を低下させる、請求項１７から２６のいずれかに記載の方法。
29. ｅＩＦ３ｆの発現を低下させるｅＩＦ３調節剤およびｅＩＦ３ｍの発現を低下させるｅＩＦ３調節剤の両方が、対象に投与される、請求項１７から２６のいずれかに記載の方法。
30. 反復非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳と関連する疾患に対するさらなる治療剤を投与することをさらに含む、請求項１７から２９のいずれかに記載の方法。
31. さらなる治療剤が、抗体、所望によりＲＡＮ反復拡張に特異的に結合する抗体または反復拡張のＣ－末端であるＲＡＮタンパク質のユニークな(unique)領域に特異的に結合する抗体、またはさらなる阻害性核酸である、請求項３０に記載の方法。
32. ｅＩＦ３調節剤が、ｅＩＦ３ｈの発現を増加させる、請求項１７から２６のいずれかに記載の方法。
33. 対象がヒト対象である、請求項１７から３３のいずれかに記載の方法。
34. 反復非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）を発現する対象に有効量のＲＡＮ反復拡張に特異的に結合する抗体、または反復拡張のＣ－末端であるＲＡＮタンパク質のユニークな領域に特異的に結合する抗体を投与することを含む、反復非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳と関連する疾患を処置する方法。
35. 抗体が、ポリ－セリン反復に特異的に結合する、請求項３４に記載の方法。
36. 抗体が、反復拡張のＣ－末端であるＲＡＮタンパク質のユニークな領域に特異的に結合する、請求項３４に記載の方法。
37. ユニークな領域が、配列番号：９に示されている配列を含む、請求項３６に記載の方法。

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