WO2017038945A1 - 細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬、バイオマーカー、診断薬、並びに、スクリーニング方法 - Google Patents

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erdj8
disease
cells
accumulation
substance
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洋平 山本
永田　和宏
信行 貫名
晴子 宮▲崎▼
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学校法人京都産業大学
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent, a biomarker, a diagnostic agent and a screening method for diseases associated with abnormal substance accumulation in cells.
  • Autophagy is roughly classified into three types: “macro autophagy”, “microautophagy”, and “chaperone-mediated autophagy”.
  • macro autophagy a membrane called an isolating membrane extends at the endoplasmic reticulum membrane, wraps up defective proteins and organelles, and forms a double membrane autophagosome. When this autophagosome is fused with lysosome, it becomes autolysosome and degrades protein.
  • autophagy indicates macro autophagy.
  • Microautophagy degrades by incorporating defective proteins directly into lysosomes.
  • chaperone-mediated autophagy is degraded by incorporating defective proteins into lysosomes by molecular chaperones.
  • the degradation process by autophagy can be broadly divided into three: “isolation membrane formation”, “isolation membrane extension and autophagosome formation”, and “autophagosome-lysosome fusion”. These are controlled by various autophagy-related factors (Atg factors) related to autophagy.
  • autophagy can be classified into “guided autophagy” and “basic autophagy”. Induced autophagy occurs when starvation is induced and is used to provide a temporary nutrient supply.
  • basal-type autophagy is an autophagy that is always generated in order to perform steady clearance of abnormal proteins and organelles in cells.
  • basal type autophagy is particularly important for long-lived neurons.
  • Basal type autophagy is particularly important for long-lived neurons.
  • accumulation of structurally abnormal proteins occurred in neurons, and as a result, neuronal cell death was observed (Non-patent Document 1). From this, it is expected that neuronal cell death caused by their accumulation is prevented by degrading and removing defective proteins and abnormal intracellular organelles by basal autophagy in neurons. .
  • Non-patent Document 1 Intracellular protein aggregates that cause neurodegenerative diseases accumulate due to degradation delay due to autophagy. That is, autophagy activity in nerve cells decreases, proteolysis is delayed, and intracellular protein aggregates accumulate. Therefore, if autophagy activity in nerve cells can be controlled (enhanced), intracellular protein aggregates can be reduced and accumulation of intracellular protein aggregates can be prevented. It is expected to lead to the development of therapeutic methods. For example, it is conceivable to increase autophagy activity by specifying a factor that regulates autophagy activity and controlling the factor.
  • Non-patent document 2 Crohn's disease
  • Non-patent document 3 atrophic age-related macular degeneration
  • myotonic dystrophy amyotrophic lateral sclerosis
  • Non-patent document 4 type 1 and type 2 diabetes
  • Non-patent document 5 hepatitis
  • Non-patent Document 6 a membrane component necessary for autophagy degradation is generated from a contact site (MAM) between the endoplasmic reticulum and mitochondria.
  • the object of the present invention is to newly specify a control factor of autophagy and provide a series of techniques using the factor.
  • One aspect of the present invention provided on the basis of the above findings is a therapeutic agent for diseases associated with abnormal substance accumulation in cells, containing as an active ingredient a substance that suppresses the expression of ERdj8.
  • Another aspect of the present invention is a therapeutic agent for diseases associated with abnormal substance accumulation in cells, containing as an active ingredient a substance that suppresses the autophagy activity inhibiting function of ERdj8.
  • the autophagy is a basic autophagy.
  • the disease accompanied by accumulation of abnormal substances in cells is a neurodegenerative disease.
  • the neurodegenerative disease is Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Lewy body dementia, frontotemporal lobar degeneration, spinocerebellar degeneration, or Huntington's chorea.
  • the disease accompanied by abnormal substance accumulation in cells is type 1 diabetes, type 2 diabetes, age-related macular degeneration, myotonic dystrophy, amyotrophic lateral sclerosis, or Crohn's disease.
  • the substance that suppresses the expression of ERdj8 or the substance that suppresses the autophagy activity suppressing function of ERdj8 is a nucleic acid.
  • the nucleic acid is siRNA, shRNA, nucleic acid aptamer, or antisense nucleic acid.
  • Another aspect of the present invention is a biomarker for detecting a disease accompanied by abnormal substance accumulation in a cell, comprising ERdj8.
  • the disease accompanied by accumulation of abnormal substances in cells is a neurodegenerative disease.
  • the neurodegenerative disease is Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Lewy body dementia, frontotemporal lobar degeneration, spinocerebellar degeneration, or Huntington's chorea.
  • the disease accompanied by abnormal substance accumulation in cells is type 1 diabetes, type 2 diabetes, age-related macular degeneration, myotonic dystrophy, amyotrophic lateral sclerosis, or Crohn's disease.
  • Another aspect of the present invention is a diagnostic agent for use in the detection of diseases associated with abnormal substance accumulation in cells, including substances that specifically bind to ERdj8.
  • the substance that specifically binds to ERdj8 is an anti-ERdj8 antibody.
  • the disease accompanied by accumulation of abnormal substances in cells is a neurodegenerative disease.
  • the neurodegenerative disease is Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Lewy body dementia, frontotemporal lobar degeneration, spinocerebellar degeneration, or Huntington's chorea.
  • the disease accompanied by abnormal substance accumulation in cells is type 1 diabetes, type 2 diabetes, age-related macular degeneration, myotonic dystrophy, amyotrophic lateral sclerosis, or Crohn's disease.
  • Another aspect of the present invention has a test substance, (A) the activity of suppressing the autophagy activity suppressing function of ERdj8, or (B) the activity of suppressing the expression level of ERdj8,
  • the screening method is characterized by screening a candidate substance for a therapeutic drug for a disease associated with abnormal substance accumulation in a cell using as an index.
  • the disease accompanied by accumulation of abnormal substances in cells is a neurodegenerative disease.
  • the neurodegenerative disease is Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Lewy body dementia, frontotemporal lobar degeneration, spinocerebellar degeneration, or Huntington's chorea.
  • the disease accompanied by abnormal substance accumulation in cells is type 1 diabetes, type 2 diabetes, age-related macular degeneration, myotonic dystrophy, amyotrophic lateral sclerosis, or Crohn's disease.
  • the present invention is useful for the treatment and diagnosis of diseases involving abnormal substance accumulation in cells and diseases involving autophagy abnormalities. Moreover, according to the present invention, candidate substances for therapeutic agents for diseases associated with intracellular abnormal substance accumulation can be efficiently screened.
  • ERdj8 is the same protein as DNAJC16 (DnaJ homolog subfamily member 16), which is an endoplasmic reticulum membrane-localized DnaJ protein.
  • the nucleotide sequence of DNA containing the gene (cDNA) encoding ERdj8 is shown in SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 the region from No. 165 to 2510 is a portion encoding ERdj8.
  • the nucleotide sequence of the region and the corresponding amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 2, and only the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 3.
  • ERdj8 is a membrane protein consisting of 782 amino acids and has a DnaJ domain, a thioredoxin-like domain, and a transmembrane domain.
  • the present invention includes a therapeutic agent for diseases associated with accumulation of abnormal substances in cells, containing a substance that suppresses the expression of ERdj8 as an active ingredient.
  • the present invention includes a therapeutic agent for diseases associated with abnormal substance accumulation in cells, which contains, as an active ingredient, a substance that suppresses the autophagy activity suppressing function of ERdj8.
  • ERdj8 expression includes both transcription level expression (mRNA amount) and translation level expression (protein amount). That is, both the amount of the transcript of the ERdj8 gene and the amount of the translation product can be the expression level of ERdj8.
  • the “substance that suppresses the expression of ERdj8” or the “substance that suppresses the autophagy activity suppression function of ERdj8” is a nucleic acid. That is, the therapeutic agent of the present invention can be a nucleic acid drug.
  • Examples of the substance that suppresses the expression of ERdj8 and the substance that suppresses the autophagy activity suppressing function include ERdj8-specific siRNA and shRNA.
  • siRNA containing the sequence shown in SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 as an ERdj8-specific sequence used in Examples described later can be mentioned.
  • the length (number of bases) of the sense strand and the antisense strand of the siRNA may be the same or different.
  • the number of bases is usually 30 bases or less, preferably 19 to 25 bases, more preferably 19 to 23 bases, and even more preferably 21 bases.
  • the end shape of the sense strand and the antisense strand of the siRNA may be a blunt end or a protruding end with an overhang on the 3 'side.
  • the number of bases of the protruding portion is usually 1 to 10 bases, preferably 1 to 4 bases, more preferably 1 to 2 bases.
  • the lengths of the protruding portions of the sense strand and the antisense strand may be the same or different.
  • the nucleotide of the protruding portion may be converted to DNA.
  • the nucleotide in the protruding portion preferably has a base complementary to the mRNA of the target gene, but may have a non-complementary base as long as RNA interference can be induced.
  • the ERdj8-specific sequence of the siRNA is preferably the same as the target sequence, but may not be completely identical as long as RNA interference can be induced.
  • a mismatch of about several bases is allowed. That is, the siRNA includes those in which 1 to several (eg, about 2 to 4) bases are substituted, added, or deleted with respect to the target sequence and can induce RNA interference.
  • the siRNA includes those having sequence identity of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 98% or more, and can induce RNA interference with the target sequence. .
  • the siRNA may be of a type in which RNA and DNA are mixed as long as RNA interference can be induced.
  • a hybrid siRNA in which one of the sense strand and the antisense strand is an RNA strand and the other is a DNA strand may be used.
  • a chimeric siRNA in which a part of the nucleotides of the sense strand and / or antisense strand is converted to DNA may be used.
  • the hybrid siRNA is preferably one in which the sense strand is DNA and the antisense strand is RNA.
  • Examples of the chimeric siRNA include those in which some nucleotides on the downstream side (3 ′ end side of the sense strand, 5 ′ end side of the antisense strand) are converted to DNA. Specific examples include those in which nucleotides on both the 3 'end side of the sense strand and the 5' end side of the antisense strand are converted to DNA. In addition, one in which either one of the nucleotide on the 3 'end side of the sense strand and the 5' end side of the antisense strand is converted to DNA is exemplified. In addition, it is preferable that the length of the nucleotide converted into DNA is not more than the number of nucleotides corresponding to 1/2 of the RNA molecule.
  • the region to be converted into DNA can be selected, for example, from the range of 1 to 13 nucleotides, preferably 1 to 10 nucleotides from the end.
  • the nucleotide length of each strand is 19 to 21, and a part or all of about 1 to 10 nucleotides excluding the overhang portion from the 3 ′ end side of the sense strand are continuously DNA And a part or all of about 1 to 10 nucleotides from the 5 ′ end of the antisense strand are continuously converted to DNA.
  • the region to be converted into DNA is usually about 1 to 10, preferably 1 to 8, more preferably 1 to 6, from the end on the 3 ′ end side of the sense strand. is there.
  • the number is usually about 1 to 10, preferably 1 to 8, and more preferably 1 to 6 from the end.
  • the number of DNAs in the sense strand (excluding the overhang portion) and the antisense strand is preferably the same.
  • This siRNA is considered to be particularly preferable in terms of RNA interference effect, stability of RNA molecules, safety to living bodies, and the like.
  • the nucleotide constituting the siRNA may be a nucleotide analog in which the sugar part or base part of the nucleotide or the binding part between nucleotides is chemically modified.
  • Base modified nucleotide analogues include 5-propynyluridine, 5-propynylcytidine, 5-methylcytidine, 5-methyluridine, 5- (2-amino) propyluridine, 5-halocytidine, 5-halouridine, 5 5-position-modified uridine or cytidine such as methyloxyuridine; 8-position-modified adenosine or guanosine such as 8-bromognosin; deazanucleotide such as 7-deaza-adenosine; O- and N-alkylated nucleotides such as N6-methyladenosine , Etc.
  • the 2′-OH of the ribonucleotide is H, OR, R, a halogen atom, SH, SR, NH 2 , NHR, NR 2 , or CN (where R is carbon 2′-position sugar-modified products substituted with a 1-6 alkyl group, alkenyl group or alkynyl group), and 5′-terminal phosphorylated modified products in which the 5 ′ end is monophosphorylated.
  • Nucleotide analogs in which the internucleotide linkage moiety is modified include those in which the phosphoester group between adjacent ribonucleotides is replaced with a phosphothioate group.
  • the nucleic acid in the present invention may be a double-stranded RNA formed by a single strand having a stem-loop structure, that is, shRNA.
  • the nucleic acid may be shRNA in which a loop composed of 2 to 4 nucleotides is formed at the 5 ′ end of the sense strand and the 3 ′ end of the antisense strand.
  • the nucleic acid may be shRNA in which a loop composed of 2 to 4 nucleotides is formed at the 3 ′ end of the sense strand and the 5 ′ end of the antisense strand.
  • the nucleic acid has loops of 2 to 4 nucleotides formed on both the 5 ′ end of the sense strand and the 3 ′ end of the antisense strand, and both the 3 ′ end of the sense strand and the 5 ′ end of the antisense strand.
  • ShRNA may also be used.
  • shRNA a hybrid type or chimeric type configuration can be adopted.
  • the nucleotide constituting the shRNA may be a nucleotide analogue in which the sugar moiety, base moiety, or internucleotide linkage moiety is chemically modified.
  • nucleic acids other than siRNA / shRNA examples include antisense nucleic acids. That is, an antisense nucleic acid having a sequence complementary to the mRNA of ERdj8 can be designed and used as a nucleic acid drug that suppresses the expression of ERdj8.
  • nucleic acid aptamers examples include nucleic acid aptamers.
  • a nucleic acid aptamer that specifically binds to and acts on ERdj8 can be designed and used as a nucleic acid drug that suppresses the autophagy activity suppression function of ERdj8.
  • the method of using the therapeutic agent of the present invention is appropriately selected depending on the type of active ingredient, dosage form, and the like.
  • the therapeutic agent of the present invention can be used by either systemic administration or local administration.
  • abnormal substance accumulation in cells occurs locally, it can be administered directly to the site by injection or the like (local administration).
  • systemic administration by intravenous injection or the like is preferably employed when the accumulation of abnormal substances in cells extends over a plurality of locations or when the location cannot be specified.
  • parenteral administration examples include administration methods such as intravenous, subcutaneous, muscle, topical, intraperitoneal, transdermal, nasal, transpulmonary, intrathecal, and intraventricular.
  • the dosage of the therapeutic agent of the present invention can be appropriately set according to the type of active ingredient, administration route, disease progression and severity, age and weight of the administration subject, and the like.
  • the therapeutic agent of the present invention comprises an active ingredient “substance that suppresses the expression of ERdj8” or “substance that suppresses the autophagy activity suppression function of ERdj8” and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier include excipients, binders, disintegrants, stabilizers, lubricants, suspending agents, dispersing agents, diluents, and the like.
  • the therapeutic agent of the present invention may be in a liquid, semi-solid, or solid dosage form.
  • the therapeutic agent of the present invention is a nucleic acid drug
  • it can be administered in the form of a non-viral vector or a viral vector.
  • a method of introducing a nucleic acid molecule using a liposome such as liposome method, HVJ-liposome method, cationic liposome method, lipofection method, lipofectamine method, etc .
  • microinjection Method A method of transferring a nucleic acid molecule into a cell together with a carrier with a gene gun can be used.
  • a viral vector such as a recombinant adenovirus or a retrovirus
  • a viral vector such as a recombinant adenovirus or a retrovirus
  • siRNA or shRNA is expressed in DNA virus or RNA virus such as detoxified retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, pox virus, poliovirus, Sindbis virus, Sendai virus, SV40 Introduce DNA. Cells or tissues are then infected with this recombinant virus. Thereby, a transgene is expressed in a cell or a tissue, and siRNA / shRNA can act.
  • the “substance that suppresses the autophagy activity suppressing function of ERdj8” is a low molecular compound, a peptide, or an antibody.
  • Examples of the peptide include a peptide that can bind to ERdj8, a peptide that is a partial peptide and / or analog peptide of ERdj8 and has a function of suppressing autophagy activity lower than that of ERdj8 (a peptide having a dominant negative action of ERdj8). .
  • the antibody examples include an antibody against ERdj8.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • an antibody fragment that can specifically bind to an antigen for example, Fab, F (ab ′) 2 , Fab ′, Fv, scFv, etc.
  • an antigen for example, Fab, F (ab ′) 2 , Fab ′, Fv, scFv, etc.
  • the antibody is preferably a human chimeric antibody or a humanized antibody.
  • peptides and antibodies can be produced by known methods.
  • a parenteral route of administration for example, intravenous, intramuscular, intradermal , Intraperitoneal, intrathecal, intraventricular, subcutaneous or topical.
  • the present invention includes a biomarker for detecting a disease accompanied by abnormal substance accumulation in a cell, comprising ERdj8.
  • a disease associated with abnormal substance accumulation in cells can be detected using a biomarker composed of ERdj8 as an index.
  • the expression level of the biomarker is large in a local area of the living body, autophagy is suppressed, and it can be determined that abnormal substance accumulation in the cell is occurring.
  • the present invention includes a diagnostic agent for use in detection of a disease associated with abnormal substance accumulation in a cell, including a substance that specifically binds to ERdj8.
  • a substance that specifically binds to ERdj8 is an anti-ERdj8 antibody.
  • the expression level of ERdj8 in tissues or body fluids can be measured using an anti-ERdj8 antibody, and the presence or absence of abnormal substance accumulation in cells due to abnormal autophagy can be detected.
  • the present invention relates to the accumulation of abnormal substances in cells using as an index the (a) the activity of suppressing the autophagy activity suppression function of ERdj8, or the (b) the activity of suppressing the expression level of ERdj8.
  • One aspect of the screening method of the present invention uses “the activity of suppressing the expression level of ERdj8” possessed by the test substance as an index. That is, a substance having the activity is expected to have an action of promoting autophagy or an action of recovering (releasing the suppression) of suppressed autophagy, and a therapeutic agent for diseases accompanied by abnormal substance accumulation in cells. Can be a candidate substance.
  • the “expression level of ERdj8” includes both the expression level at the transcription level (mRNA amount) and the expression level at the translation level (protein amount). That is, both the amount of transcription product and the amount of translation product of ERdj8 gene or its alternative gene (reporter gene etc.) can be the expression level of ERdj8.
  • the method for measuring the amount of mRNA is not particularly limited as long as it is a method capable of measuring the amount of mRNA of the corresponding gene.
  • the RT-PCR method, quantitative PCR method, Northern blot method, DNA microarray method, etc. are used. be able to.
  • the method for measuring the amount of protein is not particularly limited as long as it can specifically measure the protein encoded by the corresponding gene.
  • an immunoassay method such as ELISA, a Western blot method, or the like can be used. it can.
  • a reporter gene When using the expression level of ERdj8 as an indicator, a reporter gene can be used. That is, the expression level of ERdj8 can be grasped from the expression level of the reporter gene operably linked downstream of the promoter of the ERdj8 gene.
  • the ERdj8 gene promoter is a region on DNA that regulates the expression of the ERdj8 gene in the cell, and refers to a region in which the expression of the ERdj8 gene is induced by binding of a transcription factor.
  • “Functionally linked” refers to a linkage mode in which a gene linked downstream of a promoter can be expressed under the control of the promoter. That is, the reporter gene operably linked downstream of the promoter of the ERdj8 gene is transcribed under the control of the promoter and then translated.
  • reporter gene those commonly used in the field of biotechnology can be employed.
  • a gene encoding luciferase, green fluorescent protein (GFP), ⁇ -glucuronidase (GUS), chloramphenicol acetyltransferase (CAT) can be employed.
  • Preferred embodiments include the following (i) and (ii): (I) contacting a test substance with a cell having a reporter gene operably linked downstream of the promoter of the ERdj8 gene or an extract of the cell; (Ii) measuring the expression level of the reporter gene in the cell contacted with the test substance in step (i) or the extract of the cell, And the above screening method.
  • a reporter gene is functionally linked downstream of the promoter of the ERdj8 gene, and this is incorporated into an appropriate vector and further introduced into an appropriate cell. Then, a test substance is brought into contact with these cells (recombinant cells). Examples of the method of bringing a test substance into contact with cells include culturing the cells in a medium containing the test substance. Other examples include adding a test substance to a cell suspension or cell extract.
  • the expression level of the reporter gene is measured.
  • the reporter gene is a luciferase gene
  • the activity of the expression product luciferase can be detected with fluorescence.
  • the reporter gene is a GFP gene
  • the expression product GFP can be detected with fluorescence.
  • the reporter gene is a GUS gene
  • the activity of the expression product GUS can be detected with color development such as glucuron.
  • the reporter gene is a CAT gene
  • the activity of the expression product CAT can be detected by acetylation of chloramphenicol.
  • step (i) a control is set so that the test substance is not brought into contact with the cells, and the expression level in that case is set as a reference value. And the measured value when a test substance is made to contact a cell etc. is compared with the said reference value.
  • the gene linked downstream of the promoter of ERdj8 may be a fusion gene of a part or full length of ERdj8 gene and a reporter gene.
  • the ERdj8 gene it is also possible to use the ERdj8 gene as it is without using the reporter gene. That is, the expression level of ERdj8 can be grasped by measuring the amount of the transcription product (mRNA amount) or translation product (ERdj8 protein) of the ERdj8 gene linked downstream of the promoter.
  • the ERdj8 gene in this case may be a gene encoding a functional fragment of ERdj8 in addition to the gene encoding the full length of ERdj8. The functional fragment of ERdj8 will be described later.
  • Another aspect of the screening method of the present invention uses “suppressing the autophagy activity suppression function of ERdj8” as an index of the test substance.
  • a substance having the activity is expected to have an action of restoring suppressed autophagy (releasing the suppression), and can be a candidate substance for a therapeutic drug for a disease accompanied by intracellular abnormal substance accumulation.
  • the screening method of the present invention can be performed by measuring the activity of the ERdj8 when the test substance is contacted with the isolated ERdj8.
  • Activity of ERdj8 is, for example, an autophagy activity suppression function.
  • the autophagy activity suppression function there is a possibility of inhibiting the dissociation of the autophagosome from the endoplasmic reticulum membrane.
  • the isolated ERdj8 can be prepared using, for example, the ERdj8 gene shown in SEQ ID NO: 2.
  • the isolated ERdj8 contains a functional fragment of ERdj8 in addition to the full length of ERdj8.
  • the “functional fragment of ERdj8” refers to a polypeptide having a partial sequence of ERdj8, which retains activity as ERdj8 (for example, autophagy activity suppression function).
  • the isolated ERdj8 includes mutants and modifications of ERdj8 that can be regarded as substantially equivalent to natural ERdj8.
  • it is encoded by DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a nucleotide sequence complementary to DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 (cDNA of human ERdj8) and has activity as ERdj8
  • the isolated protein is included in the isolated ERdj8 in this embodiment.
  • the stringent conditions are the conditions of “0.1 ⁇ SSC solution (composition of 1 ⁇ concentration SSC solution is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate), 1% SDS, 65 ° C., 24 hours”.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 human ERdj8
  • a protein consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted or added, and having activity as ERdj8, Included in the isolated ERdj8 in this embodiment.
  • a protein having an activity as ERdj8 is also included in the isolated ERdj8 in this embodiment.
  • diseases associated with abnormal substance accumulation in cells include neurodegenerative diseases. Specific examples include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Lewy body dementia, frontotemporal lobar degeneration, spinocerebellar degeneration, Huntington's chorea. Other examples of diseases with abnormal substance accumulation in cells include type 1 diabetes and type 2 diabetes. Other examples include age-related macular degeneration, myotonic dystrophy, amyotrophic lateral sclerosis, Crohn's disease, and the like.
  • the present invention includes an autophagy activity promoter containing, as an active ingredient, a substance that suppresses the autophagy activity suppression function of ERdj8.
  • the present autophagy activity promoter can be used to promote autophagy activity in eukaryotic organisms and cells derived therefrom.
  • this autophagy activity promoter can also be used for purposes other than human treatment.
  • the present autophagy activity promoter can also have the same embodiment as the therapeutic agent of the present invention described above.
  • the active ingredient of the present autophagy activity promoter may be a low molecular compound, a peptide or an antibody.
  • the present invention includes an autophagy activity inhibitor containing ERdj8 or a nucleic acid encoding ERdj8 as an active ingredient.
  • the autophagy activity inhibitor containing the nucleic acid as an active ingredient can be, for example, a vector in which the nucleic acid is incorporated.
  • the present invention includes a method for treating a disease associated with accumulation of abnormal substances in cells, which comprises administering a substance that suppresses the expression of ERdj8.
  • the present invention also includes a method for treating a disease associated with abnormal substance accumulation in cells, which comprises administering a substance that suppresses the autophagy activity suppressing function of ERdj8.
  • the present invention also includes a substance that suppresses the expression of ERdj8, which is used for treatment of a disease associated with abnormal substance accumulation in cells. Moreover, this invention includes the substance which suppresses the autophagy activity suppression function which ERdj8 has used for the treatment of the disease which accompanies abnormal substance accumulation
  • the present invention also includes the use of a substance that suppresses the expression of ERdj8 for the manufacture of a therapeutic agent for a disease associated with abnormal substance accumulation in cells.
  • the present invention also includes the use of a substance that suppresses the autophagy activity-suppressing function of ERdj8 for the manufacture of a therapeutic drug for diseases associated with intracellular abnormal substance accumulation.
  • siRNA # 2 siRNA employing SEQ ID NO: 4
  • siRNA employing SEQ ID NO: 5 siRNA employing SEQ ID NO: 5
  • TfLC3 is a fusion protein (mCherry-GFP-LC3) in which mCherry and GFP are linked to LC3 in tandem. tfLC3 emits red and green fluorescence in autophagosomes that are not fused with lysosomes, whereas it emits only red fluorescence in autolysosomes after being fused with lysosomes.
  • the sample was subjected to SDS-PAGE, then transferred to a PVDF membrane, and Western blotting was performed.
  • an anti-DNAJC16 antibody (Cosmo Bio) was used.
  • an anti-LC3 antibody (MBL) was used.
  • an anti-tubulin antibody (using Millipore) was used.
  • Detection was performed with LAS4000 (Fuji Film) using ECL (GE Healthcare) as a detection reagent for dot plots and Western blots.
  • ECL GE Healthcare
  • the sample was subjected to SDS-PAGE, then transferred to a PVDF membrane, and Western blotting was performed.
  • an anti-DNAJC16 antibody (Cosmo Bio) was used.
  • an anti-tubulin antibody (using Millipore) was used.
  • Detection was performed with LAS4000 (Fuji Film) using ECL (GE Healthcare) as a detection reagent for dot plots and Western blots.
  • a similar experiment was performed using a plasmid expressing only RFP.
  • FIGS. 9 The results are shown in FIGS. That is, accumulation of PolyQ aggregates was observed in cells into which a plasmid expressing ERdj8-RFP was introduced (FIG. 9). The number of PolyQ protein aggregates per cell was about 0.29 in the control, and about 41.4 in the human ERdj8 overexpressing cells (FIG. 10). These results strongly suggested that ERdj8 overexpression inhibits basal level autophagy activity.
  • the cells were solidified using a mounting agent.
  • an LSM700 confocal laser microscope (Carl Zeiss) was used.
  • ZEISS microscope software ZEN (Carl Zeiss) was used for analysis of the acquired image.
  • a similar experiment was performed using a plasmid expressing only RFP.
  • LGG1 dots were markedly accumulated in the nematode individuals that knocked down dnj-8 (FIG. 14).
  • the number of LGG1 dots per nematode was about 15 for the control nematode, but about 30 for the nematode knocked down with dnj-8 (FIG. 15).
  • LGG1 as an autophagy marker was markedly accumulated by knocking down ERdj8 in the same manner as in cultured cells, strongly suggesting that autophagy was promoted.
  • Results are shown in FIG. That is, the number of PolyQ protein aggregates was significantly reduced in the nematode individuals in which dnj8 was knocked down. Specifically, the number of PolyQ protein aggregates per cell was about 42 in the control nematode but about 31 in the nematode knocked down with dnj8. This strongly suggested that autophagy was promoted by knockdown of ERdj8 in nematode individuals.
  • GFP :: poly79Q is a nematode (neurodegenerative disease model nematode) that stably expresses muscular E. coli expressing dnj8-specific siRNA. It was given as food and knocked down dnj8.
  • Recovery of the movement of GFP :: poly79Q-expressing nematodes at the time of adults was observed with a fluorescence microscope SZX16 (Olympus), and analysis of changes in movement was performed with MetaMorph (Molecular Devices).
  • ERdj8 knockdown of Huntington's chorea model mouse ERdj8-specific siRNA was directly introduced into the cerebral ventricle of 5-week-old R6 / 2 mouse (Huntington's chorea model mouse) to knock down ERdj8. It was.
  • SMARTpool Accell Dnajc16 siRNA (Darmacon) was used as the ERdj8-specific siRNA. As a negative control, Accell Non-targeting Control Pool (Darmacon) was used.
  • Darmacon Accell Non-targeting Control Pool
  • each siRNA was dissolved in the attached 5 ⁇ buffer, and 4 times the amount of Accell siRNA delivery Media was added (1 ⁇ g / ⁇ L). These siRNA solutions were mixed by shaking for 30 minutes at room temperature. 2 ⁇ L of the siRNA solution after mixing was injected into the mouse ventricle.
  • mice were sacrificed at 6 weeks of age. Accumulation of huntingtin protein and ubiquitin, the causative proteins of Huntington's chorea, in the basal ganglia striatum, anti-Htt (EM48) (Chemicon MAB5374, mouse) and anti-Ubiquitin (DAKO Z0458, rabbit) Were evaluated by a tissue immune antibody staining method.
  • Anti-Ub is an anti-Ubiquitin antibody
  • Anti-Htt is an anti-Htt antibody
  • 8w WT is an 8-week-old wild type mouse
  • 6w R6 / 2 is a 6-week-old.
  • R6 / 2 mice “siControl” represents negative control
  • siERdj8 represents ERdj8-specific siRNA.
  • accumulation of huntingtin protein and ubiquitin in the striatum was significantly reduced in R6 / 2 mice in which ERdj8-specific siRNA was injected into the brain.
  • ERdj8 knockdown significantly reduced the accumulation of huntingtin protein and ubiquitin, which are proteins causing Huntington's chorea. From the above, it was shown that reducing the expression level of ERdj8 is effective in the treatment of neurodegenerative diseases such as Huntington's chorea. It was also shown that ERdj8-specific siRNA (a substance that suppresses ERdj8 expression) is effective in the treatment of neurodegenerative diseases such as Huntington's chorea.

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Abstract

ＥＲｄｊ８の発現を抑制する物質、或いは、ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する物質を有効成分として含有する、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬が提供される。ＥＲｄｊ８からなる、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患検出用のバイオマーカーが提供される。ＥＲｄｊ８に対して特異的に結合する物質を含む、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の検出に用いるための診断薬が提供される。被検物質が有する、（ａ）ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する活性、又は、（ｂ）ＥＲｄｊ８の発現量を抑制する活性、を指標として、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングする方法が提供される。

Description

細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬、バイオマーカー、診断薬、並びに、スクリーニング方法
　本発明は、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬、バイオマーカー、診断薬、並びに、スクリーニング方法に関する。
　オートファジーは、細胞が持つ細胞内の不良なタンパク質やオルガネラを分解するシステムである。この分解によって、細胞内の恒常性維持や飢餓時のアミノ酸供給が行われていると考えられている。
　オートファジーは、「マクロオートファジー」、「ミクロオートファジー」、「シャペロン介在性オートファジー」の３種類に大きく分類される。マクロオートファジーでは、隔離膜と呼ばれる膜が小胞体膜で伸張し、不良タンパク質やオルガネラを包み込み、２重膜構造のオートファゴソームを形成する。このオートファゴソームがリソソームと融合することでオートリソソームとなり、タンパク質を分解する。一般に、オートファジーと表記する場合は、マクロオートファジーを示す。一方、ミクロオートファジーは、不良タンパク質を直接リソソームに取り込むことで分解する。また、シャペロン介在性オートファジーは、分子シャペロンによって不良タンパク質をリソソームに取り込むことで分解する。
　オートファジーによる分解プロセスは、「隔離膜の形成」、「隔離膜の伸張とオートファゴソームの形成」、「オートファゴソームとリソソームの融合」の３つに大きく分けられる。そして、オートファジーに関わる様々なオートファジー関連因子（Ａｔｇ因子）によって、これらが制御されている。
　またオートファジーは、「誘導型オートファジー」と「基底型オートファジー」に分類することができる。誘導型オートファジーは、飢餓誘導時などに生じ、一過的な栄養供給を行なうためのものである。一方、基底型オートファジーは、細胞内の異常タンパク質やオルガネラの定常的なクリアランスを行なうために、常に生じているオートファジーである。
　このうち、基底型オートファジーは寿命の長い神経細胞などでは特に重要である。これまでの報告で、神経系においてオートファジーが抑制されたマウスでは、神経細胞内に構造異常タンパク質の蓄積が生じ、結果的に神経細胞死が観察されている（非特許文献１）。このことから、神経細胞において、基底型オートファジーによって不良タンパク質や異常な細胞内小器官などが分解除去されることで、それらの蓄積により生じる神経細胞死が防がれていることが予想される。
　ところで、アルツハイマー病等の認知症を伴う神経変性疾患は、根本的な治療法が確立しておらず、病気の進行を遅らせる対処療法しかないのが現状である。このような神経変性疾患の治療や予防を目的とした医薬品開発は急務である。
　上記のように、神経変性疾患の原因となる細胞内タンパク質凝集体は、オートファジーによる分解遅延によって蓄積することが明らかになっている（非特許文献１）。すなわち、神経細胞内におけるオートファジー活性が低下することにより、タンパク質分解が遅延し、細胞内タンパク質凝集体の蓄積が起こる。このことから、神経細胞内におけるオートファジー活性を制御する（高める）ことができれば、細胞内タンパク質凝集体を減少させ、また細胞内タンパク質凝集体の蓄積を防止することができ、神経変性疾患の根本的治療法の開発につながることが期待される。例えば、オートファジー活性を調節する因子を特定し、当該因子を制御することにより、オートファジー活性を上昇させることが考えられる。
　さらにオートファジー活性の低下が、クローン病（非特許文献２）、萎縮型加齢黄斑変性症、筋強直性ジストロフィー、筋委縮側索硬化症（非特許文献３）、１型および２型糖尿病（非特許文献４）、肝炎（非特許文献５）の発症または増悪に関与することが示唆されている。
　なお、細胞におけるオートファジーを誘発又は阻害する方法として、例えば、特許文献１，２に記載のものがある。
　また近年、オートファジー分解に必要な膜成分が小胞体とミトコンドリアのコンタクトサイト（ＭＡＭ）から生じることが報告されている（非特許文献６）。このように、ＭＡＭがオートファジーにおいて重要な役割を持つことが明らかになってきている。
国際公開第２０１１／０４１５８２号 国際公開第２０１１／０４１５８４号
Hara,T et al., Nature, 441, 885-889 2006 Adolph T et al., Nature, 503, 272-276, 2013 Fujiwara Y et al., Autophagy 9:3, 403-409, 2013 Zhang S et al., FASEB J (12):5083-96, 2014 Rautou P et al., Journal of Hepatology, 53, 6, 1123-1134, 2010 Hamasaki M et al., Nature, 495, 389-93, 2013
　本発明は、オートファジーの制御因子を新たに特定し、当該因子を利用した一連の技術を提供することを目的とする。
　本発明者らは、新規のオートファジーの制御因子を探索し、小胞体膜局在ＤｎａＪタンパク質であるＤＮＡＪＣ１６（DnaJ homolog subfamily C member 16）をクローニングした。そして、当該タンパク質が小胞体内腔にＪドメインを有することを確認したことから、新たにＥＲｄｊ８と命名した。そして、ＥＲｄｊ８について研究を進めた結果、ＥＲｄｊ８がオートファジー活性、特に基底型オートファジーを強力に負に制御する機能を有することを見出した。
　上記した知見に基づいて提供される本発明の１つの様相は、ＥＲｄｊ８の発現を抑制する物質を有効成分として含有する、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬である。
　本発明の他の様相は、ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する物質を有効成分として含有する、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬である。
　好ましくは、オートファジーが基底型オートファジーである。
　好ましくは、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患が、神経変性疾患である。
　好ましくは、神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、前頭側頭葉変性症、脊髄小脳変性症、又はハンチントン舞踏症である。
　好ましくは、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患が、１型糖尿病、２型糖尿病、加齢黄斑変性症、筋強直性ジストロフィー、筋委縮側索硬化症、又はクローン病である。
　好ましくは、ＥＲｄｊ８の発現を抑制する物質又はＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する物質が、核酸である。
　好ましくは、核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、核酸アプタマー、又はアンチセンス核酸である。
　本発明の他の様相は、ＥＲｄｊ８からなる、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患検出用のバイオマーカーである。
　好ましくは、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患が、神経変性疾患である。
　好ましくは、神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、前頭側頭葉変性症、脊髄小脳変性症、又はハンチントン舞踏症である。
　好ましくは、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患が、１型糖尿病、２型糖尿病、加齢黄斑変性症、筋強直性ジストロフィー、筋委縮側索硬化症、又はクローン病である。
　本発明の他の様相は、ＥＲｄｊ８に対して特異的に結合する物質を含む、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の検出に用いるための診断薬である。
　好ましくは、ＥＲｄｊ８に対して特異的に結合する物質が、抗ＥＲｄｊ８抗体である。
　好ましくは、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患が、神経変性疾患である。
　好ましくは、神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、前頭側頭葉変性症、脊髄小脳変性症、又はハンチントン舞踏症である。
　好ましくは、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患が、１型糖尿病、２型糖尿病、加齢黄斑変性症、筋強直性ジストロフィー、筋委縮側索硬化症、又はクローン病である。
　本発明の他の様相は、被検物質が有する、
（ａ）ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する活性、又は、
（ｂ）ＥＲｄｊ８の発現量を抑制する活性、
を指標として、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングすることを特徴とするスクリーニング方法である。
　好ましくは、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患が、神経変性疾患である。
　好ましくは、神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、前頭側頭葉変性症、脊髄小脳変性症、又はハンチントン舞踏症である。
　好ましくは、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患が、１型糖尿病、２型糖尿病、加齢黄斑変性症、筋強直性ジストロフィー、筋委縮側索硬化症、又はクローン病である。
　本発明は、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患やオートファジーの異常が関与する疾患の、治療や診断に有用である。また本発明によれば、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬の候補物質を効率的にスクリーニングすることができる。
ヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡが導入されたＨｅＬａ細胞における、ＬＣ３の発現を調べたウエスタンブロットの結果を表す写真である。 ヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡが導入されたＨｅＬａ細胞における、細胞内のＬＣ３の蓄積を表す写真である。 ヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡが導入されたｔｆＬＣ３安定発現ＨｅＬａ細胞における、細胞内のＬＣ３の蓄積を表す写真である。 図３で観察された全細胞のうち、オートリソソームを含む細胞が占める割合を表すグラフである。 ヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡを導入したＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞における、ＰｏｌｙＱタンパク質の蓄積量を調べたドットブロットとＬＣ３の蓄積量を調べたウエスタンブロットの結果を表す写真である。 ヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡを導入したＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞における、細胞内のＰｏｌｙＱタンパク質凝集体の蓄積を表す写真である。 図６で観察された細胞における、ＰｏｌｙＱタンパク質凝集体の数を表すグラフである。 ＥＲｄｊ８を過剰発現させたＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞における、ＰｏｌｙＱタンパク質の蓄積量を調べたドットブロットとＬＣ３の蓄積量を調べたウエスタンブロットの結果を表す写真である。 ＥＲｄｊ８を過剰発現させたＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞における、ＰｏｌｙＱタンパク質凝集体の蓄積を表す写真である。 図９で観察された細胞における、ＰｏｌｙＱタンパク質凝集体の数を表すグラフである。 ＥＲｄｊ８の過剰発現させたＳＫ－Ｎ－ＳＨ細胞における、内在性のユビキチンタンパク質の蓄積を表す写真である。 ＥＲｄｊ８の過剰発現させたＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞における、ＰｏｌｙＱタンパク質凝集体とリソソームの共局在を表す写真である。 図１２で観察された細胞における、リソソームと共局在しているＰｏｌｙＱタンパク質凝集体の割合を表すグラフである。 ｄｎｊ８をノックダウンした神経変性疾患モデル線虫における、ＧＦＰ：：ＬＧＧ１の蓄積を表す写真である。 図１４の線虫における、ＬＧＧ１のドットの数を表すグラフである。 ｄｎｊ８をノックダウンした神経変性疾患モデル線虫における、ＰｏｌｙＱタンパク質凝集体の数を表すグラフである。 ｄｎｊ８をノックダウンした神経変性疾患モデル線虫における、運動機能の回復を表すグラフである。 ハンチントン舞踏症モデルマウスにおける、ハンチンチンタンパク質及びユビキチンの蓄積を表す写真である。
　まず、ＥＲｄｊ８について説明する。ＥＲｄｊ８は、小胞体膜局在ＤｎａＪタンパク質であるＤＮＡＪＣ１６（DnaJ homolog subfamily C member 16）と同一のタンパク質である。ＥＲｄｊ８をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）を含むＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１に示す。配列番号１で示されるヌクレオチド配列のうち、１６５～２５１０番の領域がＥＲｄｊ８をコードしている部分である。当該領域のヌクレオチド配列とそれ対応するアミノ酸配列を配列番号２に、アミノ酸配列のみを配列番号３に示す。
　ＥＲｄｊ８は７８２アミノ酸からなる膜タンパク質であり、ＤｎａＪドメイン、チオレドキシン様ドメイン、及び膜貫通ドメインを有する。
　本発明は、ＥＲｄｊ８の発現を抑制する物質を有効成分として含有する、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬を包含する。また本発明は、ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する物質を有効成分として含有する、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬を包含する。
　「ＥＲｄｊ８の発現」には、転写レベルの発現（ｍＲＮＡ量）と翻訳レベルの発現（タンパク量）の両方が含まれる。すなわち、ＥＲｄｊ８遺伝子の転写産物の量と翻訳産物の量の両方が、ＥＲｄｊ８の発現量となり得る。
　１つの実施形態では、「ＥＲｄｊ８の発現を抑制する物質」又は「ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する物質」が核酸である。すなわち、本発明の治療薬は核酸医薬であり得る。
　ＥＲｄｊ８の発現を抑える物質、オートファジー活性抑制機能を抑制する物質の例として、ＥＲｄｊ８特異的なｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡが挙げられる。具体例としては、後述の実施例で使用した、配列番号４又は配列番号５で示す配列をＥＲｄｊ８特異的配列として含むｓｉＲＮＡが挙げられる。
　上記ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ（塩基数）は、同じでもよいし、異なってもよい。当該塩基数は、通常は３０塩基以下、好ましくは１９～２５塩基、より好ましくは１９～２３塩基、さらに好ましくは２１塩基である。
　また、上記ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の末端形状は、平滑末端でもよいし、３’側がオーバーハングした突出末端であってもよい。突出末端の場合、突出部分の塩基数は、通常は１～１０塩基、好ましくは１～４塩基、より好ましくは１～２塩基である。なお、センス鎖とアンチセンス鎖の突出部分の長さは、同じでもよいし、異なってもよい。また、突出部分のヌクレオチドは、ＤＮＡに変換されていてもよい。さらに、突出部分のヌクレオチドは、標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的な塩基を有することが好ましいが、ＲＮＡ干渉を誘導できる限り、相補的でない塩基を有するものであってもよい。
　上記ｓｉＲＮＡが有するＥＲｄｊ８特異的配列は、標的配列と同じであることが好ましいが、ＲＮＡ干渉を誘導できる限り、完全同一でなくてもよい。例えば、ｓｉＲＮＡのＥＲｄｊ８特異的配列（アンチセンス配列）と標的配列とがハイブリダイズ可能であれば、数個程度の塩基のミスマッチは許容される。すなわち上記ｓｉＲＮＡには、標的配列に対して１～数個（例えば２～４個程度）の塩基が置換、付加、若しくは欠失したものであって、かつＲＮＡ干渉を誘導できるものが含まれる。さらに上記ｓｉＲＮＡには、標的配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有し、かつＲＮＡ干渉を誘導できるものが含まれる。
　さらに上記ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉を誘導できる限り、ＲＮＡとＤＮＡとが混合したタイプであってもよい。例えば、センス鎖とアンチセンス鎖のいずれか一方がＲＮＡ鎖、他方がＤＮＡ鎖であるハイブリッド型ｓｉＲＮＡであってもよい。また、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の一部のヌクレオチドがＤＮＡに変換されたキメラ型ｓｉＲＮＡであってもよい。
　上記ハイブリッド型ｓｉＲＮＡは、センス鎖がＤＮＡ、アンチセンス鎖がＲＮＡであるものが好ましい。
　上記キメラ型ｓｉＲＮＡとしては、下流側（センス鎖の３’末端側、アンチセンス鎖の５’末端側）の一部のヌクレオチドがＤＮＡに変換されたものが挙げられる。具体例としては、センス鎖の３’末端側とアンチセンス鎖の５’末端側の両方のヌクレオチドがＤＮＡに変換されたものが挙げられる。また、センス鎖の３’末端側とアンチセンス鎖の５’末端側のいずれか一方のヌクレオチドがＤＮＡに変換されたものが挙げられる。なお、ＤＮＡに変換されるヌクレオチドの長さは、ＲＮＡ分子の１／２に相当するヌクレオチド数以下であることが好ましい。ＤＮＡに変換する領域は、例えば、末端から１～１３ヌクレオチド、好ましくは１～１０ヌクレオチドの範囲から選択することができる。
　キメラ型ｓｉＲＮＡの一例として、各鎖のヌクレオチド長が１９～２１であり、センス鎖の３’末端側からオーバーハング部分を除いた１～１０個程度のヌクレオチドの一部または全部が連続してＤＮＡに変換され、かつ、アンチセンス鎖の５’末端側から１～１０個程度のヌクレオチドの一部または全部が連続してＤＮＡに変換されたものが挙げられる。この例においてＤＮＡへの変換の対象となる領域は、センス鎖の３’末端側では、通常は末端から１～１０個程度であり、好ましくは１～８個、より好ましくは１～６個である。アンチセンス鎖の５’末端側では、通常は末端から１～１０個程度であり、好ましくは１～８個、より好ましくは１～６個である。この例において、センス鎖（オーバーハング部分を除く）とアンチセンス鎖におけるＤＮＡの数は、同じであることが好ましい。このｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉効果、ＲＮＡ分子の安定性、生体への安全性、などの点で特に好ましいと考えられる。
　また、ＲＮＡ干渉を誘導できる限り、上記ｓｉＲＮＡを構成するヌクレオチドは、ヌクレオチドの糖部分や塩基部分、あるいはヌクレオチド間の結合部分が化学修飾されたヌクレオチド類似体であってもよい。
　塩基が修飾されたヌクレオチド類似体としては、５－プロピニルウリジン、５－プロピニルシチジン、５－メチルシチジン、５－メチルウリジン、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ハロシチジン、５－ハロウリジン、５－メチルオキシウリジン等の５位修飾ウリジン又はシチジン；８－ブロモグノシン等の８位修飾アデノシン又はグアノシン；７－デアザ－アデノシン等のデアザヌクレオチド；Ｎ６－メチルアデノシン等のＯ－及びＮ－アルキル化ヌクレオチド、などが挙げられる。
　糖が修飾されたヌクレオチド類似体としては、リボヌクレオチドの２’－ＯＨが、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロゲン原子、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ2、ＮＨＲ、ＮＲ2、又はＣＮ（ここで、Ｒは炭素数１－６のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基を示す）等によって置換された２’位糖修飾体や、５’末端がモノリン酸化された５’末端リン酸化修飾体が挙げられる。
　ヌクレオチド間の結合部分が修飾されたヌクレオチド類似体としては、隣接するリボヌクレオチド間のホスホエステル基がホスホチオエート基で置換されたものが挙げられる。
　上記ｓｉＲＮＡに類似して、本発明における核酸は、一本の鎖がステムループ構造をとることにより形成された二本鎖ＲＮＡ、すなわちｓｈＲＮＡであってもよい。例えば、当該核酸は、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の３’末端に２～４ヌクレオチドからなるループが形成されたｓｈＲＮＡであってもよい。また当該核酸は、センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端に２～４ヌクレオチドからなるループが形成されたｓｈＲＮＡであってもよい。さらに当該核酸は、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の３’末端、並びに、センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端の両方に、２～４ヌクレオチドからなるループが形成されたｓｈＲＮＡであってもよい。
　ｓｈＲＮＡについても、ハイブリッド型やキメラ型の構成を採用することができる。さらに、ｓｈＲＮＡを構成するヌクレオチドは、その糖部分や塩基部分、あるいはヌクレオチド間の結合部分が化学修飾されたヌクレオチド類似体であってもよい。
　ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ以外の核酸としては、アンチセンス核酸が挙げられる。すなわち、ＥＲｄｊ８のｍＲＮＡに相補的な配列を有するアンチセンス核酸を設計し、ＥＲｄｊ８の発現を抑える核酸医薬として用いることができる。
　その他の例としては、核酸アプタマーが挙げられる。例えば、ＥＲｄｊ８に特異的に結合および作用する核酸アプタマーを設計し、ＥＲｄｊ８のオートファジー活性抑制機能を抑える核酸医薬として用いることができる。
　本発明の治療薬の使用方法については、有効成分の種類や剤形等によって適宜選択される。
　本発明の治療薬は、全身投与と局所投与のいずれによっても使用され得る。細胞内の異常物質蓄積が局所的に起こっている場合は、注射等により当該箇所に直接投与することができる（局所投与）。一方、細胞内の異常物質蓄積が複数箇所にわたる場合や場所を特定できない場合には、静脈注射等による全身投与が好ましく採用される。
　本発明の治療薬の投与経路としては、経口投与と非経口投与の両方が適用できる。非経口投与の例としては、静脈内、皮下、筋肉、局所、腹腔内、経皮、経鼻、経肺、髄腔内、脳室内、等の各投与方法が挙げられる。
　本発明の治療薬の投与量については、有効成分の種類、投与経路、疾患の進行度や重篤度、投与対象者の年齢や体重、等により適宜設定することができる。
　本発明の治療薬は、有効成分である「ＥＲｄｊ８の発現を抑制する物質」又は「ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する物質」と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であり得る。当該担体としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、安定化剤、滑剤、懸濁剤、分散剤、希釈剤、等が挙げられる。これらの担体は、公知のものがそのまま適用できる。また本発明の治療薬は、液体、半固体、固体のいずれの剤形でもよい。
　本発明の治療薬が核酸医薬である場合、非ウイルスベクター又はウイルスベクターの形態で投与することができる。
　非ウイルスベクターの形態で投与する場合には、例えば、リポソーム法、ＨＶＪ－リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法、リポフェクトアミン法等の、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法；マイクロインジェクション法；遺伝子銃でキャリアとともに核酸分子を細胞に移入する方法、などを用いることができる。
　ウイルスベクターを用いてｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡを投与する場合には、例えば、組換えアデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターを利用することができる。例えば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスに、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡを導入する。そして、細胞又は組織にこの組換えウイルスを感染させる。これにより、細胞又は組織内で導入遺伝子が発現し、ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡを作用させることができる。
　１つの実施形態では、「ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する物質」は、低分子化合物、ペプチド又は抗体である。
　当該ペプチドとしては、ＥＲｄｊ８と結合可能なペプチドや、ＥＲｄｊ８の部分ペプチド及び／又はアナログペプチドであってオートファジー活性抑制機能がＥＲｄｊ８よりも低いペプチド（ＥＲｄｊ８のドミナントネガティブ作用を持つペプチド）、が挙げられる。
　当該抗体としては、ＥＲｄｊ８に対する抗体が挙げられる。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。また、完全な抗体分子の他、抗原に特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等）でもよい。さらに当該抗体は、ヒト型キメラ抗体又はヒト化抗体であることが好ましい。
　上記ペプチド及び抗体は、いずれも公知の方法により製造することができる。本発明の医薬組成物の有効成分がペプチドまたは抗体である場合、薬学的に許容される担体とともに製剤化された注射剤又は輸液として、非経口投与経路、例えば、静脈内、筋肉内、皮膚内、腹腔内、髄腔内、脳室内、皮下又は局所に投与することができる。
　本発明は、ＥＲｄｊ８からなる、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患検出用のバイオマーカーを包含する。例えば、ＥＲｄｊ８からなるバイオマーカーを指標として、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患を検出することができる。例えば、生体の局所において当該バイオマーカーの発現量が多い場合には、オートファジーが抑制されており、細胞内の異常物質蓄積が起こっていると判定することができる。
　本発明は、ＥＲｄｊ８に対して特異的に結合する物質を含む、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の検出に用いるための診断薬を包含する。ＥＲｄｊ８に対して特異的に結合する物質の例としては、抗ＥＲｄｊ８抗体が挙げられる。例えば、抗ＥＲｄｊ８抗体を用いて組織中や体液中のＥＲｄｊ８の発現量を測定し、オートファジーの異常に起因する細胞内の異常物質蓄積の有無を検出することができる。
　本発明は、被検物質が有する、（ａ）ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する活性、又は、（ｂ）ＥＲｄｊ８の発現量を抑制する活性、を指標として、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングするスクリーニング方法を包含する。
　本発明のスクリーニング方法の１つの態様は、被験物質が有する「ＥＲｄｊ８の発現量を抑制する活性」を指標とするものである。すなわち当該活性を有する物質は、オートファジーを促進する作用、あるいは抑制されたオートファジーを回復させる（抑制を解除する）作用を有することが期待され、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬の候補物質となり得る。
　本態様においても、「ＥＲｄｊ８の発現量」には、転写レベルの発現量（ｍＲＮＡ量）と翻訳レベルの発現量（タンパク量）の両方が含まれる。すなわち、ＥＲｄｊ８遺伝子又はその代替遺伝子（レポーター遺伝子等）の転写産物の量と翻訳産物の量の両方が、ＥＲｄｊ８の発現量となり得る。
　ｍＲＮＡ量の測定方法としては、対応する遺伝子のｍＲＮＡ量を測定できる方法であれば特に制限はなく、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法、定量ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法、等を用いて行うことができる。
　タンパク量の測定方法としては、対応する遺伝子がコードするタンパク質を特異的に測定できる方法であれば特に制限はなく、例えば、ＥＬＩＳＡ等の免疫測定法、ウエスタンブロット法、等を用いて行うことができる。
　ＥＲｄｊ８の発現量を指標とする場合は、レポーター遺伝子を使用することができる。すなわち、ＥＲｄｊ８遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結されたレポーター遺伝子の発現量をもって、ＥＲｄｊ８の発現量を把握することができる。
　ＥＲｄｊ８遺伝子のプロモーターとは、細胞内においてＥＲｄｊ８遺伝子の発現を調節しているＤＮＡ上の領域であって、転写因子が結合することにより、ＥＲｄｊ８遺伝子の発現が誘導される領域をいう。
　「機能的に連結」とは、プロモーターの下流に連結された遺伝子が当該プロモーターの制御下で発現可能である連結様式をいう。すなわち、ＥＲｄｊ８遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結されたレポーター遺伝子は、当該プロモーターの制御下で転写され、その後、翻訳される。
　レポーター遺伝子としては、生命工学の分野で一般的に用いられているものを採用することができる。例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、をコードする遺伝子を採用することができる。
　好ましい実施形態として、下記（ｉ）及び（ｉｉ）：
（ｉ）ＥＲｄｊ８遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結されたレポーター遺伝子を有する細胞又は当該細胞の抽出液に、被験物質を接触させる工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）で被験物質を接触させた細胞又は当該細胞の抽出液における前記レポーター遺伝子の発現量を測定する工程、
を包含する上記スクリーニング方法が挙げられる。
　本実施形態における、工程（ｉ）の具体例としては、ＥＲｄｊ８遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子を機能的に連結し、これを適宜のベクターに組み込み、さらに適宜の細胞に導入する。そして、この細胞（組換え細胞）に被験物質を接触させる。細胞に被験物質を接触させる方法としては、被験物質を含有する培地で細胞を培養することが挙げられる。その他の例としては、細胞懸濁液や細胞抽出液に被験物質を添加することが挙げられる。
　工程（ｉｉ）では、レポーター遺伝子の発現量を測定する。例えばレポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子であれば、発現産物であるルシフェラーゼの活性を、蛍光をもって検出することができる。レポーター遺伝子がＧＦＰ遺伝子であれば、発現産物であるＧＦＰを、蛍光をもって検出することができる。レポーター遺伝子がＧＵＳ遺伝子であれば、発現産物であるＧＵＳの活性を、グルクロン等の発色をもって検出することができる。レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子であれば、発現産物であるＣＡＴの活性を、クロラムフェニコールのアセチル化をもって検出することができる。
　別途、工程（ｉ）で細胞等に被験物質を接触させないコントロールを設定し、その場合の発現量を基準値として設定する。そして、被験物質を細胞等に接触させた場合の測定値と、当該基準値とを比較する。
　ＥＲｄｊ８のプロモーターの下流に連結する遺伝子は、ＥＲｄｊ８遺伝子の一部又は全長とレポーター遺伝子との融合遺伝子であってもよい。
　レポーター遺伝子を使わずに、ＥＲｄｊ８遺伝子をそのまま使うことも可能である。すなわち、前記プロモーターの下流に連結されたＥＲｄｊ８遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ量）又は翻訳産物（ＥＲｄｊ８タンパク）の量を測定することにより、ＥＲｄｊ８の発現量を把握することができる。
　また、この場合のＥＲｄｊ８遺伝子は、ＥＲｄｊ８の全長をコードする遺伝子に加えて、ＥＲｄｊ８の機能的断片をコードする遺伝子であってもよい。ＥＲｄｊ８の機能的断片については後述する。
　本発明のスクリーニング方法の別の態様は、被験物質が有する「ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する」を指標とするものである。すなわち当該活性を有する物質は、抑制されたオートファジーを回復させる（抑制を解除する）作用を有することが期待され、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬の候補物質となり得る。
　例えば、単離されたＥＲｄｊ８に被験物質を接触させた際の、当該ＥＲｄｊ８の活性を測定することにより、本発明のスクリーニング方法を実施することができる。「ＥＲｄｊ８の活性」は、例えばオートファジー活性抑制機能である。当該オートファジー活性抑制機能を代替するものとしては、オートファゴソームの小胞体膜からの解離を阻害する活性が可能性として挙げられる。
　単離されたＥＲｄｊ８は、例えば、配列番号２に示すＥＲｄｊ８遺伝子を用いて調製することができる。
　単離されたＥＲｄｊ８には、ＥＲｄｊ８の全長に加えて、ＥＲｄｊ８の機能的断片が含まれる。ここで「ＥＲｄｊ８の機能的断片」とは、ＥＲｄｊ８の部分配列を有するポリペプチドであって、ＥＲｄｊ８としての活性（例えば、オートファジー活性抑制機能）を保持しているものを指す。
　また、単離されたＥＲｄｊ８には、天然のＥＲｄｊ８と実質的に同等とみなせるＥＲｄｊ８の変異体、改変体が含まれる。
　例えば、配列番号２で表されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ（ヒトＥＲｄｊ８のｃＤＮＡ）と相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、かつＥＲｄｊ８としての活性を有するタンパク質が、本実施形態における単離されたＥＲｄｊ８に含まれる。ここで、ストリンジェントな条件とは、「０．１×ＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）、１％ＳＤＳ、６５℃、２４時間」の条件をいう。
　別の例として、配列番号３で表されるアミノ酸配列（ヒトＥＲｄｊ８）において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＥＲｄｊ８としての活性を有するタンパク質も、本実施形態における単離されたＥＲｄｊ８に含まれる。
　さらに別の例として、配列番号３で表されるアミノ酸配列（ヒトＥＲｄｊ８）と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつＥＲｄｊ８としての活性を有するタンパク質も、本実施形態における単離されたＥＲｄｊ８に含まれる。
　細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の例としては、神経変性疾患が挙げられる。具体的には、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、前頭側頭葉変性症、脊髄小脳変性症、ハンチントン舞踏症などが挙げられる。細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の他の例としては、１型糖尿病、２型糖尿病が挙げられる。その他の例としては、加齢黄斑変性症、筋強直性ジストロフィー、筋委縮側索硬化症、クローン病などが挙げられる。
　本発明は、ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する物質を有効成分として含有するオートファジー活性促進剤を包含する。例えば、真核細胞生物及び、それ由来の細胞におけるオートファジー活性を促進するために、本オートファジー活性促進剤を用いることができる。また、本オートファジー活性促進剤はヒトの治療以外の目的で使うこともできる。本オートファジー活性促進剤についても、上記した本発明の治療剤と同様の実施形態をとることができる。例えば、本オートファジー活性促進剤の有効成分は、低分子化合物、ペプチド又は抗体であり得る。
　さらに本発明は、ＥＲｄｊ８又はＥＲｄｊ８をコードする核酸を有効成分として含有するオートファジー活性抑制剤を包含する。当該核酸を有効成分として含有するオートファジー活性抑制剤は、例えば、当該核酸が組み込まれたベクターであり得る。
　本発明は、ＥＲｄｊ８の発現を抑制する物質を投与する、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療方法、を包含する。また本発明は、ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する物質を投与する、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療方法、を包含する。
　また本発明は、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療に用いられる、ＥＲｄｊ８の発現を抑制する物質、を包含する。また本発明は、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療に用いられる、ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する物質、を包含する。
　また本発明は、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬製造のための、ＥＲｄｊ８の発現を抑制する物質の使用、を包含する。また本発明は、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬製造のための、ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する物質の使用、を包含する。
　以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（１）ヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡの作製
　Lifetechnologies社のStealth RNAiTM siRNAを利用して、２種のヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡを作製した。ヒトＥＲｄｊ８特異的な配列（センス）として、GAUUGGUGCUUUAGCUGCAUUCAUA（配列番号４）とGAUUGGGAGUGAGAGUGACAAAUUU（配列番号５）を採用した。以下、配列番号４を採用したｓｉＲＮＡを「ｓｉＲＮＡ＃２」、配列番号５を採用したｓｉＲＮＡを「ｓｉＲＮＡ＃３」と称する。
（２）ＨｅＬａ細胞におけるＥＲｄｊ８のノックダウン＜１＞
　LipofectamineRNAiMAX(Invitrogen社)を用いて、ＨｅＬａ細胞に、播種と同時に上記（１）で作製したヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ＃２又はｓｉＲＮＡ＃３）を導入した。７２時間培養した後に細胞を回収し、１％ＮＰ４０含有Lysis Bufferで可溶化した。４℃、１５０００ｒｐｍで遠心した後、可溶性画分にLaemmli Sample bufferを加えて可溶化し、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に供した。
　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後のゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、BlockingOne（ナカライテスク社）を用いて室温で１時間ブロッキングを行った後、ウエスタンブロッティングを行った。ＥＲｄｊ８の検出には、抗ＤＮＡＪＣ１６抗体（コスモバイオ社）を用いた。ＬＣ３タイプ１の検出には、抗ＬＣ３タイプ１抗体（ＭＢＬ社）を用いた。ＬＣ３タイプ２の検出には、抗ＬＣ３タイプ２抗体（ＭＢＬ社）を用いた。検出試薬としてＥＣＬ（ＧＥヘルスケア社）用い、ＬＡＳ４０００（富士フィルム社）により検出を行った。
　コントロールとして、Stealth RNAi siRNA negative control lo GC（ThermoFisher社）を導入したＨｅＬａ細胞を用いて同様の実験を行った。
　結果を図１に示す。すなわち、ヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡが導入されＥＲｄｊ８の発現量が抑えられたＨｅＬａ細胞では、オートファゴソームマーカーであるＬＣ３の顕著な蓄積が観察された。
　以上より、ＥＲｄｊ８の発現量を抑えることによりオートファジーが促進されることが強く示唆された。また、ＥＲｄｊ８がオートファジーを負に制御する因子であることが強く示唆された。
（３）ＨｅＬａ細胞におけるＥＲｄｊ８のノックダウン＜２＞
　上記（２）と同様にしてＨｅＬａ細胞にヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡを導入した。７２時間培養した後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した。５０μｇ／ｍＬジギトニンで膜透過処理を行い、BlockingOne（ナカライテスク社）を用いて室温で１時間ブロッキング後、抗ＬＣ３抗体（ＭＢＬ社）を用いて細胞内のＬＣ３の染色を行った。観察にはＬＳＭ７００共焦点レーザー顕微鏡（カールツァイス）を用いた。取得した画像の解析にはＺＥＩＳＳ顕微鏡ソフトウェアＺＥＮ（カールツァイス）を用いた。
　コントロールとして、Stealth RNAi siRNA negative control lo GC（ThermoFisher社）を導入したＨｅＬａ細胞を用いて同様の実験を行った。
　結果を図２に示す。すなわち、ヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡが導入されたＨｅＬａ細胞では、細胞内にＬＣ３の顕著な蓄積が観察された。
　以上より、ＥＲｄｊ８の発現量を抑えることによりオートファジーが促進されることが強く示唆された。また、ＥＲｄｊ８がオートファジーを負に制御する因子であることが強く示唆された。
（４）ｔｆＬＣ３安定発現ＨｅＬａ細胞におけるＥＲｄｊ８のノックダウン
　LipofectamineRNAiMAX（Invitrogen社）を用いて、ｔｆＬＣ３安定発現ＨｅＬａ細胞に、播種と同時に上記（１）で作製したヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡ＃２を導入した。７２時間培養した後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定後、マウント剤を用いて細胞を固化した。観察はDeltaVision蛍光顕微鏡（ＧＥヘルスケア社）を用いた。取得した画像解析にはImage Jを用いた。
　コントロールとして、ｓｉＲＮＡを導入しないｔｆＬＣ３安定発現ＨｅＬａ細胞を用いて同様の実験を行った。
　なお、ｔｆＬＣ３はｍＣｈｅｒｒｙとＧＦＰとをタンデムにＬＣ３に結合した融合タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ－ＧＦＰ－ＬＣ３）である。ｔｆＬＣ３は、リソソームと融合していないオートファゴソーム内では赤色と緑色の蛍光を発し、一方、リソソームと融合した後のオートリソソーム内では赤色のみの蛍光を発する。
　結果を図３、図４に示す。すなわち、ｓｉＲＮＡを導入したｔｆＬＣ３安定発現ＨｅＬａ細胞では、赤色のみの蛍光が多く観察された（図３の右側の写真）。これは、ＬＣ３がリソソーム内に多く集積していることを示しており、オートファジーが顕著に促進していると考えられた。
　そして、観察された全細胞のうちオートリソソームを含む細胞が占める割合は、ｓｉＲＮＡを導入しないコントロールでは２４％であったが、ｓｉＲＮＡを導入した場合では８９％に達した（図４）。
　以上より、ＥＲｄｊ８がオートファジーを負に制御していることが強く示唆された。
（５）ＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞におけるＥＲｄｊ８のノックダウン＜１＞
　LipofectamineRNAiMAX（Invitrogen社）を用いて、ＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞に、播種と同時に上記（１）で作製したヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡ＃３を導入した。７２時間培養した後に細胞を回収し、Laemmli Sample bufferを直接加えサンプル化を行った。ＰＶＤＦ膜にドットブロットを行い、ＰｏｌｙＱタンパク質の蓄積を抗ＧＦＰ抗体（ＭＢＬ社）により定量した。
　また、サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後にＰＶＤＦ膜に転写し、ウエスタンブロッティングを行った。ＥＲｄｊ８の検出には、抗ＤＮＡＪＣ１６抗体（コスモバイオ社）を用いた。ＬＣ３の検出には、抗ＬＣ３抗体（ＭＢＬ社）を用いた。tubulinの検出には、抗tubulin抗体（ミリポア社を用いた）。
　ドットプロットとウエスタンブロットの検出試薬としてＥＣＬ（ＧＥヘルスケア社)）用い、ＬＡＳ４０００（富士フィルム社）により検出を行った。
　コントロールとして、ｓｉＲＮＡを導入しないＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞を用いて同様の実験を行った。
　結果を図５に示す。すなわち、ヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡを導入した細胞では、オートファジーの基質として知られるＰｏｌｙＱタンパク質が著しく減少していた。以上のことから、ＥＲｄｊ８のノックダウンによりオートファジーが亢進している可能性が強く示唆された。
（６）ＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞におけるＥＲｄｊ８のノックダウン＜２＞
　上記（５）と同様にして、ＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞にヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡ＃３を導入した。７２時間培養した後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定後、マウント剤を用いて細胞を固化した。観察にはＬＳＭ７００共焦点レーザー顕微鏡（カールツァイス）を用いた。取得した画像の解析にはＺＥＩＳＳ顕微鏡ソフトウェアＺＥＮ（カールツァイス）を用いた。
　コントロールとして、コントロールとして、Stealth RNAi siRNA negative control lo GC（ThermoFisher社）を導入し、ＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞を用いて同様の実験を行った。
　結果を図６、図７に示す。すなわち、ヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡを導入した細胞では、オートファジーの基質として知られるＰｏｌｙＱタンパク質（白い点）が著しく減少していた（図６）。細胞あたりのＰｏｌｙＱタンパク質凝集体の数は、コントロールでは０．１７個程度であったのに対し、ヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡを導入した細胞では０．０５個程度であった（図７）。以上のことから、ＥＲｄｊ８のノックダウンによりオートファジーが亢進している可能性が強く示唆された。
（７）ＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞におけるＥＲｄｊ８の過剰発現＜１＞
　Lipofectamine2000（Invitrogen社）を用いて、ＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞に、播種と同時に、ヒトＥＲｄｊ８とＲＦＰとの融合タンパク質（ＥＲｄｊ８－ＲＦＰ）を発現するためのプラスミド（origene社）を導入した。
　２４時間培養した後に細胞を回収し、Laemmli Sample bufferを直接加えサンプル化を行った。酢酸セルロース膜にドットブロットを行い、ＰｏｌｙＱタンパク質の蓄積を抗ＧＦＰ抗体（ＭＢＬ社）により定量した。
　また、サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後にＰＶＤＦ膜に転写し、ウエスタンブロッティングを行った。ＥＲｄｊ８の検出には、抗ＤＮＡＪＣ１６抗体（コスモバイオ社）を用いた。tubulinの検出には、抗tubulin抗体（ミリポア社を用いた）。
　ドットプロットとウエスタンブロットの検出試薬としてＥＣＬ（ＧＥヘルスケア社)）用い、ＬＡＳ４０００（富士フィルム社）により検出を行った。
　コントロールとして、ＲＦＰのみを発現するプラスミドを用いて同様の実験を行った。
　結果を図８に示す。すなわち、ＥＲｄｊ８－ＲＦＰを発現するプラスミドを導入した細胞では、ＰｏｌｙＱタンパク質が著しく増加していた。
　以上のことから、ＥＲｄｊ８の過剰発現により基底レベルのオートファジー活性が阻害されることが強く示唆された。
（８）ＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞におけるＥＲｄｊ８の過剰発現＜２＞
　上記（７）と同様にして、ＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞に、ＥＲｄｊ８－ＲＦＰを発現するためのプラスミドを導入した。
　２４時間培養した後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、ＥＲｄｊ８とＰｏｌｙＱの蛍光を観察した。観察にはＬＳＭ７００共焦点レーザー顕微鏡（カールツァイス）を用いた。取得した画像の解析にはＺＥＩＳＳ顕微鏡ソフトウェアＺＥＮ（カールツァイス）を用いた。
　コントロールとして、ＲＦＰのみを発現するプラスミドを用いて同様の実験を行った。
　結果を図９、図１０に示す。すなわち、ＥＲｄｊ８－ＲＦＰを発現するプラスミドを導入した細胞では、ＰｏｌｙＱ凝集体の蓄積が観察された（図９）。細胞あたりのＰｏｌｙＱタンパク質凝集体の数は、コントロールでは０．２９個程度であったのに対し、ヒトＥＲｄｊ８過剰発現細胞では４１．４個程度であった（図１０）。
　以上のことから、ＥＲｄｊ８の過剰発現により基底レベルのオートファジー活性が阻害されることが強く示唆された。
（９）神経細胞腫ＳＫ－Ｎ－ＳＨ細胞におけるＥＲｄｊ８の過剰発現
　Lipofectamine2000（Invitrogen社）を用いて、ＳＫ－Ｎ－ＳＨ細胞に、播種と同時に、ヒトＥＲｄｊ８とＦｌａｇとの融合タンパク質（ＥＲｄｊ８－Ｆｌａｇ）を発現するためのプラスミド（かずさＤＮＡ研究所社）を導入した。
　４８時間培養した後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定後、マウント剤を用いて細胞を固化した。観察にはＬＳＭ７００共焦点レーザー顕微鏡（カールツァイス）を用いた。取得した画像の解析にはＺＥＩＳＳ顕微鏡ソフトウェアＺＥＮ（カールツァイス）を用いた。
　コントロールとして、挿入遺伝子を持たないプラスミドを導入したＳＫ－Ｎ－ＳＨ細胞を用いて同様の実験を行った。
　結果を図１１に示す。すなわち、ＥＲｄｊ８－Ｆｌａｇの発現プラスミドが導入されたＳＫ－Ｎ－ＳＨ細胞において、内在性のユビキチンタンパク質の蓄積が観察された。この結果は、細胞内で定常的に分解されているユビキチン化タンパク質がＥＲｄｊ８の過剰発現により顕著に蓄積したことを示しており、ＥＲｄｊ８が定常的にオートファジーを負に制御していることが強く示唆された。また、神経細胞では誘導型オートファジーは起こらないとされていることから、ＥＲｄｊ８は定常型オートファジーを負に制御することができると考えられた。
（１０）ＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞用いたＥＲｄｊ８の過剰発現時におけるリソソームとＰｏｌｙＱの局在
　Lipofectamine2000（Invitrogen社）を用いて、ＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞に、播種と同時に、ヒトＥＲｄｊ８とＲＦＰとの融合タンパク質（ＥＲｄｊ８－ＲＦＰ）を発現するためのプラスミド（origene社）を導入した。
　２４時間培養後、リソソーム内の分解酵素の阻害剤であるＥ６４ｄ及びPepstatinAでさらに２４時間処理した後、Lysotraker（Molecular probes社）を用いてリソソームを染色した。細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定後、マウント剤を用いて細胞を固化した。観察にはＬＳＭ７００共焦点レーザー顕微鏡（カールツァイス）を用いた。取得した画像の解析にはＺＥＩＳＳ顕微鏡ソフトウェアＺＥＮ（カールツァイス）を用いた。
　コントロールとして、ＲＦＰのみを発現するプラスミドを用いて同様の実験を行った。
　結果を図１２、図１３に示す。すなわち、リソソーム内の分解酵素活性を阻害することにより生じたＰｏｌｙＱタンパク質凝集体が、ＥＲｄｊ８過剰発現細胞ではリソソームと共局在しなくなった（図１２）。リソソームと共局在しているＰｏｌｙＱタンパク質凝集体の割合は、コントロールでは８５％程度であったが、ＥＲｄｊ８過剰発現細胞では１８％程度であった（図１３）。
　以上より、ＥＲｄｊ８はオートファゴソームとリソソームとの融合を阻害していることが強く示唆された。
（１１）ＧＦＰ：：ＬＧＧ１を安定発現する線虫個体に対するｄｎｊ８のノックダウン＜１＞
　ＧＦＰ：：ＬＧＧ１（哺乳動物細胞におけるＬＣ３のホモログ）を生殖腺で安定発現する線虫に、ｄｎｊ８（ＥＲｄｊ８のホモログ）特異的ｓｉＲＮＡを発現する大腸菌を餌として与え、ｄｎｊ８のノックダウンを行った。その次世代における生殖腺内でのＧＦＰ：：ＬＧＧ１の変化を共焦点レーザー顕微鏡ＬＳＭ７００で観察した。
　コントロールとして、ｓｉＲＮＡを発現しない大腸菌を餌として与えた線虫を用いて同様の実験を行った。
　結果を図１４、図１５に示す。すなわち、ｄｎｊ－８をノックダウンした線虫の個体内においてＬＧＧ１のドットが顕著に蓄積していた（図１４）。また、線虫１個体あたりのＬＧＧ１のドットの数は、コントロールの線虫では１５個程度であったが、ｄｎｊ－８をノックダウンした線虫では３０個程度であった（図１５）。
　このように、動物個体内においても、培養細胞と同様にＥＲｄｊ８のノックダウンにより、オートファジーマーカーであるＬＧＧ１が顕著に蓄積したことから、オートファジーが促進していることが強く示唆された。
（１２）ＧＦＰ：：ｐｏｌｙ４０Ｑを安定発現する線虫個体に対するｄｎｊ８のノックダウン＜２＞
　ＧＦＰ：：ｐｏｌｙ４０Ｑを筋肉において安定発現する線虫（神経変性疾患モデル線虫）に、ｄｎｊ８特異的ｓｉＲＮＡを発現する大腸菌を餌として与え、ｄｎｊ８のノックダウンを行った。その次世代における筋肉でのＧＦＰ：：ＬＧＧ１の変化を共焦点レーザー顕微鏡ＬＳＭ７００で観察した。
　コントロールとして、ｓｉＲＮＡを発現しない大腸菌を餌として与えた線虫を用いて同様の実験を行った。
　結果を図１６に示す。すなわち、ｄｎｊ８をノックダウンした線虫の個体内においてＰｏｌｙＱタンパク質凝集体の数が有意に減少した。詳細には、細胞あたりのＰｏｌｙＱタンパク質凝集体の数について、コントロールの線虫では４２個程度であったが、ｄｎｊ８をノックダウンした線虫では３１個程度であった。このことから、線虫個体において、ＥＲｄｊ８のノックダウンによりオートファジーが促進されることが強く示唆された。
（１３）ＧＦＰ：：ｐｏｌｙ７９Ｑを安定発現する線虫個体に対するｄｎｊ８のノックダウン
　ＧＦＰ：：ｐｏｌｙ７９Ｑを筋肉において安定発現する線虫（神経変性疾患モデル線虫）に、ｄｎｊ８特異的ｓｉＲＮＡを発現する大腸菌を餌として与え、ｄｎｊ８のノックダウンを行った。成虫時におけるＧＦＰ：：ｐｏｌｙ７９Ｑ発現線虫の動きの回復を蛍光顕微鏡ＳＺＸ１６（オリンパス社）で観察し、動きの変化の解析をMetaMorph（モレキュラーディバイス社）により解析した。具体的には、ｓｉＲＮＡを線虫に与えてから２４時間、４８時間、７２時間経過時における各線虫の６０秒間の移動距離を測定した。
　コントロールとして、ｓｉＲＮＡを発現しない大腸菌を餌として与えた線虫を用いて同様の実験を行った。
　結果を図１７に示す。すなわち、コントロールの線虫では運動機能を喪失したままであったのに対して、ｄｎｊ８をノックダウンした線虫では運動機能が回復していた。運動機能の回復は、ｓｉＲＮＡを線虫に与えてから後７２時間経過時において特に顕著であった。
　これは、ｄｎｊ８のノックダウンによりオートファジーが促進した結果、ＰｏｌｙＱタンパク質のオートファジーによる分解が促進され、線虫の運動機能が回復したものと考えられた。この結果は、ＰｏｌｙＱ発現線虫において発症している神経変性疾患の回復を意味する。
（１４）ハンチントン舞踏症モデルマウスに対するＥＲｄｊ８のノックダウン
　５週齢のＲ６／２マウス（ハンチントン舞踏症モデルマウス）の脳室に（ＩＣＶ）、ＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡを直接導入し、ＥＲｄｊ８をノックダウンさせた。ＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡとして、SMARTpool: Accell Dnajc16 siRNA（Darmacon社）を用いた。陰性コントロールとしてAccell Non-targeting Control Pool（Darmacon社）を用いた。
　脳室内へのｓｉＲＮＡの導入には、Darmacon社のAccell siRNA delivery Media（# B-005000-500）を用いた。具体的には、各々のｓｉＲＮＡを添付の５ｘバッファーで溶解し、４倍量のAccell siRNA delivery Mediaを加えた（１μｇ／μＬ）。これらのｓｉＲＮＡ溶液を室温で３０分間振とうして混合した。混合後のｓｉＲＮＡ溶液２μＬをマウスの脳室にインジェクトした。
　６週齢でマウスをサクリファイスした。大脳基底核線条体内における、ハンチントン舞踏症の原因タンパク質であるハンチンチンタンパク質及びユビキチンの蓄積を、anti-Htt (EM48) (Chemicon MAB5374, mouse)、anti-Ubiquitin (DAKO Z0458, rabbit)の２種類の抗体を用いて組織免疫抗体染色法により評価した。
　結果を図１８に示す。図１８中、「Anti-Ub」はanti-Ubiquitin抗体、「Anti-Htt」はanti-Htt抗体、「8w WT」は８週齢の野生型マウス、「6w R6/2」は６週齢のＲ６／２マウス、「siControl」は陰性コントロール、「siERdj8」はＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡ、をそれぞれ表す。図１８に示されるように、ＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡを脳内にインジェクトしたＲ６／２マウスでは、ハンチンチンタンパク質及びユビキチンの線条体への蓄積が有意に減少した。すなわち、ＥＲｄｊ８のノックダウンによって、ハンチントン舞踏症の原因タンパク質であるハンチンチンタンパク質及びユビキチンの蓄積が有意に減少した。
　以上より、ＥＲｄｊ８の発現量を減少させることが、ハンチントン舞踏症をはじめとする神経変性疾患の治療に有効であることが示された。また、ＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡ（ＥＲｄｊ８の発現を抑制する物質）が、ハンチントン舞踏症をはじめとする神経変性疾患の治療に有効であることが示された。

Claims (21)

  1. 　ＥＲｄｊ８の発現を抑制する物質を有効成分として含有する、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬。
  2. 　ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する物質を有効成分として含有する、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬。
  3. 　オートファジーが基底型オートファジーであることを特徴とする請求項２に記載の治療薬。
  4. 　細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患が、神経変性疾患であることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の治療薬。
  5. 　神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、前頭側頭葉変性症、脊髄小脳変性症、又はハンチントン舞踏症であることを特徴とする請求項４に記載の治療薬。
  6. 　細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患が、１型糖尿病、２型糖尿病、加齢黄斑変性症、筋強直性ジストロフィー、筋委縮型側索硬化症、又はクローン病であることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の治療薬。
  7. 　ＥＲｄｊ８の発現を抑制する物質又はＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する物質が、核酸であることを特徴とする請求項１～６のいずれかに記載の治療薬。
  8. 　核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、核酸アプタマー、又はアンチセンス核酸であることを特徴とする請求項７に記載の治療薬。
  9. 　ＥＲｄｊ８からなる、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患検出用のバイオマーカー。
  10. 　細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患が、神経変性疾患であることを特徴とする請求項９に記載のバイオマーカー。
  11. 　神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、前頭側頭葉変性症、脊髄小脳変性症、又はハンチントン舞踏症であることを特徴とする請求項１０に記載のバイオマーカー。
  12. 　細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患が、１型糖尿病、２型糖尿病、加齢黄斑変性症、筋強直性ジストロフィー、筋委縮側索硬化症、又はクローン病であることを特徴とする請求項９に記載のバイオマーカー。
  13. 　ＥＲｄｊ８に対して特異的に結合する物質を含む、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の検出に用いるための診断薬。
  14. 　ＥＲｄｊ８に対して特異的に結合する物質が、抗ＥＲｄｊ８抗体であることを特徴とする請求項１３に記載の診断薬。
  15. 　細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患が、神経変性疾患であることを特徴とする請求項１３又は１４に記載の診断薬。
  16. 　神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、前頭側頭葉変性症、脊髄小脳変性症、又はハンチントン舞踏症であることを特徴とする請求項１５に記載の診断薬。
  17. 　細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患が、１型糖尿病、２型糖尿病、加齢黄斑変性症、筋強直性ジストロフィー、筋委縮型側索硬化症、又はクローン病であることを特徴とする請求項１３又は１４に記載の診断薬。
  18. 　被検物質が有する、
    （ａ）ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する活性、又は、
    （ｂ）ＥＲｄｊ８の発現量を抑制する活性、
    を指標として、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングすることを特徴とするスクリーニング方法。
  19. 　細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患が、神経変性疾患であることを特徴とする請求項１８に記載のスクリーニング方法。
  20. 　神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、前頭側頭葉変性症、脊髄小脳変性症、又はハンチントン舞踏症であることを特徴とする請求項１９に記載のスクリーニング方法。
  21. 　細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患が、１型糖尿病、２型糖尿病、加齢黄斑変性症、筋強直性ジストロフィー、筋委縮型側索硬化症、又はクローン病であることを特徴とする請求項１８に記載のスクリーニング方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014152741A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Syros Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for evaluating genes

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEE, I. H. ET AL.: "Regulation of Autophagy by the p300 Acetyltransferase", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 284, no. 10, 2009, pages 6322 - 6328, XP055367905, ISSN: 0021-9258 *
MCCAUGHAN, J. ET AL.: "Genetics of New-Onset Diabetes after Transplantation", J AM SOC NEPHROL, vol. 25, 2014, pages 1037 - 1049, XP055367904, ISSN: 1046-6673 *
NOBUYUKI NUKINA ET AL.: "Examination of the change of gene expression of mice brain model with Huntington's disease", SHINKEI HENSEI SHIKKAN NI KANSURU CHOSA KENKYUHAN, 2002 NENDO KENKYU HOKOKUSHO, 2003, pages 77 - 79 *
SONG, L. ET AL.: "Genome-Wide Identification of Hsp40 Genes in Channel Catfish and Their Regulated Expression after Bacterial Infection", PLOS ONE, vol. 9, no. 12, 2014, pages 1 - 20, XP055367910, ISSN: 1932-6203 *
YAMAMOTO, Y. ET AL.: "A novel ER membrane protein, ERdj8, localizing at ER- mitochondria contact site as a negative regulator for macro- autophagy", PHARMA MEDICA, vol. 34, no. 4, April 2016 (2016-04-01), pages 122, ISSN: 0289-5803 *

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