JPWO2020022499A1 - 老化の抑制、加齢性の疾患もしくは症状の予防、改善、もしくは治療、または寿命の延長のための組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)Rubicon遺伝子の転写産物に結合するRNAまたは該RNAをコードするDNA
(b)Rubiconタンパク質に結合するRNAまたはDNA
(c)Rubiconタンパク質に結合する抗体
[3]加齢性の疾患もしくは症状が、代謝性骨疾患もしくはその症状、ストレス耐性の向上、または臓器の線維化である、[1]または[2]に記載の組成物。
被検化合物とRubiconタンパク質とを接触させる工程、および
被検化合物とRubiconタンパク質との結合を検出する工程、
を含み、
被検化合物が、前記Rubiconタンパク質と結合する場合、老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性があると評価される方法。
Rubicon遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程、および
該細胞内におけるRubicon遺伝子の発現を検出する工程、
を含み、
被検化合物を接触させない場合と比較して、被検化合物がRubicon遺伝子の発現を減少させる場合、老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性があると評価される方法。
Rubicon遺伝子のプロモータ−領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞に、被検化合物を接触させる工程、および
該細胞内における前記レポーター遺伝子の発現を検出する工程、
を含み、
被検化合物を接触させない場合と比較して、被検化合物が前記レポーター遺伝子の発現を減少させる場合、老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性があると評価される方法。
被検試料におけるRubicon遺伝子の発現産物を検出する工程を含み、
Rubicon遺伝子の発現産物の量が対照と比較して高い場合に、老化の程度、加齢性の疾患もしくは症状の発症のリスク、または寿命の短縮のリスクが高いと評価される方法。
(a)Rubicon遺伝子の転写産物に結合するオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブ
(b)Rubiconタンパク質に結合する抗体
本発明は、Rubicon遺伝子の機能を抑制する分子を有効成分とする、対象における老化の抑制、加齢性の疾患もしくは症状の予防、改善、もしくは治療、または寿命の延長のための組成物を提供する。
−Rubiconタンパク質への結合を指標とする方法−
後述の実施例において示す通り、Rubicon遺伝子の機能を抑制することにより、代謝性骨疾患の原因となる骨量や骨密度・骨体積/骨組織体積比の低下および骨形態の変化の改善、神経変性疾患の原因となる凝集性タンパク質の減少、目の変性の減少、および運動機能の低下の改善、ストレス耐性の向上、臓器の線維化の軽減などの様々な加齢性の疾患もしくは症状が改善し、寿命が延長することが判明した。従って、老化の抑制、加齢性の疾患もしくは症状の予防、改善、もしくは治療、または寿命の延長のための組成物の開発のための一つのステップとして、Rubiconタンパク質に結合する化合物を同定することは有効である。すなわち、本発明は、被検化合物が、対象における老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、(a)被検化合物とRubiconタンパク質とを接触させる工程、および(b)被検化合物とRubiconタンパク質との結合を検出する工程、を含む方法を、本発明の評価方法の第一の態様として提供する。
後述の実施例において示す通り、Rubicon遺伝子の発現が年齢依存的にアップレギュレートされ、これが様々な加齢性の疾患や症状の発症の起因となることが示唆された。従って、老化の抑制、加齢性の疾患もしくは症状の予防、改善、もしくは治療、または寿命の延長のための組成物の開発のための一つのステップとして、Rubicon遺伝子の発現量を減少させる化合物を同定することが有効である。すなわち、本発明は、被検化合物が、対象における老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、(a)Rubicon遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程、および(b)該細胞内におけるRubicon遺伝子の発現を検出する工程、を含む方法を、本発明の評価グ方法の第二の態様として提供する。
被検化合物がRubicon遺伝子の発現レベルを減少させるか否かの評価は、レポーター遺伝子を用いた系で行うこともできる。すなわち、本発明は、被検化合物が、対象における老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、(a)Rubicon遺伝子のプロモータ−領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞に、被検化合物を接触させる工程、および(b)該細胞内における前記レポーター遺伝子の発現を検出する工程、を含む方法を、本発明の評価方法の第三の態様として提供する。
後述の実施例において示す通り、Rubicon遺伝子の発現が年齢依存的にアップレギュレートされ、これが様々な加齢性の疾患や症状の発症や寿命の短縮の起因となることが示唆された。従って、Rubicon遺伝子の発現量を指標に、老化の程度、加齢性の疾患や症状の発症のリスク、または寿命の短縮のリスクを検査することが可能である。すなわち、本発明は、対象における老化の程度、加齢性の疾患もしくは症状の発症のリスク、または寿命の短縮のリスクを検査する方法であって、被検試料におけるRubicon遺伝子の発現産物を検出する工程を含み、Rubicon遺伝子の発現産物の量が対照と比較して高い場合に、老化の程度、加齢性の疾患もしくは症状の発症のリスク、または寿命の短縮のリスクが高いと評価される方法を提供する。本発明の検査方法は、医師や獣医師などによる診断のための情報を提供する方法、あるいは医師や獣医師などによる診断を補助する方法と表現することもできる。
(a)Rubicon遺伝子の転写産物に結合するオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブ
(b)Rubiconタンパク質に結合する抗体
上記オリゴヌクレオチドプライマー(以下、単に「プライマー」と称する)は、RubiconをコードするcDNAの塩基配列情報(例えば、配列番号:1)に基づき、Rubicon遺伝子の転写産物以外の転写産物が極力増幅されないように設計すればよい。このようなプライマー設計は、当業者であれば、常法により行うことができる。プライマーの長さは、通常15〜50塩基長、好ましくは15〜30塩基長であるが、手法および目的によってはこれより長くてもよい。
(1)C.elegansの飼育条件と株
線虫は、特記しない限り、大腸菌株OP50を有する線虫飼育培地(NGM)寒天プレート上において、標準的な技術を用いて20℃で培養した。本実施例では、以下のワーム株を使用した。
(2)プラスミド構築およびトランスジェネシス
CeRubicon:EGFP翻訳融合構築物については、CeRubicon 4kb内在性プロモーターに加えてコーディング配列を、EGFPタグを含むpDC4ベクターにクローニングした。構築物のマイクロインジェクションを、共注入マーカーmyo−2p::mCherryとともに実施し、CeRubicon::EGFPを生成させた。
CAG−CreマウスおよびNestin−Creマウスは、ジャクソン研究所および宮崎純一博士の研究所(大阪大学)からそれぞれ入手した。CAG−CreマウスをRubiconfloxマウス(Tanaka, S. et al., Hepatology 64, 1994−2014 (2016))と交配させて、全体Rubicon欠失マウスを作製した。作製したRubicon−アレルを有するマウスをC57BL/6J野生型株に5回戻し交配した後、Rubicon+/−マウスとの間でインタークロスさせてRubicon−/−マウスおよび野生型対照を作製した。Nestin−CreマウスをRubiconfloxマウスと交配させて、脳内で特異的にRubiconのホモ接合欠損を有するマウスを作製した。本実施例で使用した全てのマウスは、カロリー制限マウスを除いて、C57BL/6Jバックグラウンドで維持した。これらの実験では、Turturroら(Turturro, A. et al., J Gerontol a−Biol 54, B492−B501 (1999))によって開発された成人発症の40%カロリー制限プロトコルを用いた。雌のBDF1マウスをケージ内で個別に飼育した。CRプロトコルは、9ヶ月齢まで継続した。水は自由に与えた。
ハエは、標準的なコーンミール−寒天−酵母ベースの培地において、25℃で飼育した。UAS−MJDtr−Q27(#8149)、UAS−MJDtr−Q78s(#8150、眼変性用)、UAS−MJDtr−Q78w(#8141)、UAS−GFP−IR(#9330)、UAS−dRubicon(CG12772)−IR(#43276)、UAS−GFP−mCherry−Atg8a(#37749)、da−GAL4(#55849)およびelav−GAL4c155(#458)を有するハエを、Bloomington Stock Centerから得た。gmr−GAL4を有するトランスジェニックハエ系統がこれまでに報告されている(Yamaguchi, M. et al., Oncogene 18, 6767−6775 (1999))。
ワームについては、RNAiプレート上で4〜6時間の産卵から同期した卵を得た。1日目の成体から、寿命試験をプレート当たり15〜20匹の密度でセットアップし、20℃で行った。ワームは一日おきに新しいプレートに移した。生存率も1日おきにカウントした。全てのRNAi寿命は、卵から実施した。死亡は、プラチナワイヤーで刺激した後、一切の動きがないものとして記録した。内部からの孵化や外陰部の破裂、またはプレートから這い上がったワームは除外した。TOR RNAi実験では、成体よりノックダウンを行った。Mantel−Coxログランク法を用いて、Excel(Microsoft)で統計的解析を行った。実験用ハエを標準培地で飼育し、誕生後48時間交配させた後、CO2麻酔を用いて選別した。麻酔することなく、2〜3日ごとにバイアルを新鮮な食べ物に交換し、すべてのハエが死ぬまで死亡を記録した。
RNA干渉(RNAi)は、標的遺伝子に対してdsRNAを産生するベクターL4440により形質転換されたHT115(DE3)細菌を供給することによって実施した。同調した卵を、IPTGおよびアンピシリンを含む指定のRNAiプレート上に置いた。RNAiクローンは、Ahringer氏またはVidal氏のRNAiライブラリーから得た。let−363/TOR RNAiクローンは、Hansen博士(Sanford−Burnham Medical Research Institute)より供与された。二重ノックダウン実験では、各RNAiに対して同量の細菌を混合し、プレートに播種する。空ベクター(L4440)およびルシフェラーゼ(L4440::Luc)RNAiを非標的対照として用いた。
TRIzol(Invitrogen社)またはQIAZOL(Qiagen社)中で、ワーム、ハエ、およびマウスの組織サンプルを採取した。RNeasyキット(QIAGEN社)を用いて全RNAを抽出した。iScript(Bio−Rad社)またはPrimeScript RT試薬キット(タカラ社)を用いてcDNAを生成した。qRT−PCRは、ViiA7 Real−Time PCR System(Applied Biosystems社)上でPower SYBR Green(Applied Biosystems社)を用いて、またはCFX96 Real−Time PCR Detection System(Bio−Rad社)上でKAPA SYBR Fast qPCRキット(KAPA Biosystems社)を用いて行った。各反応につき、4回のテクニカルレプリケートを行った。ama−1(ワーム)、Rpl32(ハエ)、18s rRNA(マウス)およびGAPDH(ヒト)を内部対照として用いた。
13cm×10cmの寒天充填プレートを、等しい面積を有する4つの領域に分割した。動物が領域間を移動するのを防ぐために、各領域を、C.elegansの嫌悪刺激であるグリセロールで囲んだ。ある実験群からのワームを4つの領域のうちの1つに配置し、多数の実験群を同時に試験した。マルチワームトラッカーの適合バージョン(Swierczek, N. A. et al, Nat Methods 8, 592−598 (2011))を用いて、C.elegansの寒天プレート上の運動を記録した。運動を10分間記録し、Choreography(マルチワームトラッカーソフトウェアの一部)とカスタム作成スクリプトを使用して記録を分析した後、データを整理し、要約した。動物のトラックは、記録中、最後の2分間における各フレームの重心位置の時系列として収集した。トラッカーによる動物の認識を安定させるために、最初の8分間は無視した。Choreographyフィルター(シャドーレスおよび−t10)を用いて画像のアーティファクトを回避した。個体の速度は、一連の重心間の距離の合計をトラックの継続時間で割ったものとして算出した。実験群は、動物のトラックの長さで重み付けした標本平均およびその標準誤差を用いて要約した。
クライミングアッセイは、公表されているプロトコル(Suzuki, M. et al., Human molecular genetics 24, 6675−6686 (2015))にわずかな改変を加えたものに従って行った。10〜20匹のハエを、麻酔なしの円錐形ガラス管(長さ15cm;直径2.5cm)に入れた。ハエを管の底まで落としてから10秒後、各鉛直領域のハエの数を数え、以下のように点数をつけた。点数0(0〜2cm)、1(2〜3.9cm)、2(4〜5.9cm)、3(6〜7.9cm)、4(8〜9.9cm)、5(10〜15cm)。3つの試験を20秒間隔で各群に対して行い、クライミングの点数を以下のようにして算出した。各スコアにハエの数を乗じたものをハエの総数で割り、3つの試験の平均点を算出した。結果は、3〜9回の独立した実験で得られた点数の標本平均±標準誤差として表した。
オートファジー活性をモニタするために、L4段階のGFP::LGG−1およびmCherry::GFP::LGG−1動物を0.1%アジ化ナトリウムで麻酔し、オリンパスFV1000共焦点顕微鏡を用いて画像を取得した。これらの画像を用いて、前腸領域または咽頭領域のGFPおよび/またはmCherry punctaを計数し、定量化した。CeRubicon::EGFPおよびQ35::YFPワームについては、氷冷した空のプレート上に整列したワーム全体の蛍光画像を、DP80 CCDカメラを備えた実体顕微鏡SZX16(オリンパス)で撮影し、ワーム当たりのpolyQ凝集物の数を勘定した。
CCDカメラ(DP22、オリンパス)を備えた立体顕微鏡モデルSZX16(オリンパス)を用いて、1日齢の成体雌ハエの光学顕微鏡画像を撮影した。1つの複眼に対する壊死した個眼の数を各遺伝子型についてカウントした。
摂食状態を一致させるために、da−GAL4ドライバーの下で、且つ、dRubicon−IRが存在するまたは存在しない状況下で、GFP−mCherry−Atg8aを発現する4日齢のハエを、0.75%寒天により15時間飢餓状態にし、4時間再摂取させた。脳を解剖し、PBS中の4%ホルマリン内に固定し、80%グリセロールで一晩インキュベートし、次いで、DAPI フルオロマウント−G(SouthernBiotech社)で封入した。共焦点顕微鏡(ライカ社TCS SP8)によりKC層の蛍光画像を撮影し、150〜200個の細胞を含む25×50μmの関心領域中のGFPおよび/またはmCherry punctaの数をカウントした。3つのオーバーラップしない画像を各KC層の定量化に使用した。
1日目の成体ワームを、酸化ストレス(空のプレート中4.4mMのH2O2)または熱ストレス(35℃)にそれぞれ3時間または7時間さらし、生存したワームをカウントした。各条件につき30匹のワームを使用し、実験を3回繰り返した。
ホモジナイザーを用いて、ワームまたはマウスの組織を溶解緩衝液(50mM Tris/HCl[pH7.4]、150mM NaCl、1mM EDTA、0.1%NP−40、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル[Roche社])中で溶解した。遠心分離した後、得られた上澄みを蛋白質定量化およびウエスタンブロッティングに供した。ワームおよびマウス組織の蛋白質溶解物をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離してPVDF膜に転写し、次いでこれをブロックして特異的な一次抗体と共にインキュベートした。マウス組織のウエスタンブロッティングに使用した一次抗体および希釈物は以下の通りである。
ハエについては、成体の雌の脳(羽化から3日後)を解剖し、PBS中の4%ホルマリン内に固定し、PBS/T(PBS中0.5%Triton X−100)中の50%ブロックエース(大日本住友製薬株式会社)でブロックし、抗HA抗体(3F10,1:500、Sigma社)と共にインキュベートした後、HAタグでMJDtrQ78蛋白質を染色した。免疫染色をAlexa488標識抗ラット抗体で視覚化し、核をDAPIで染色した。ケニオン細胞層(KC層)の画像を、共焦点顕微鏡(LSM780、Zeiss社)を使用して撮影した。HA染色のシグナル強度を、ImageJ 1.51sソフトウェアを用いて定量化した。5匹の動物からの両側KC層10枚を、各群について分析した。マウスでは、コラーゲンIの免疫組織化学染色をパラフィン包埋切片上で行った。0.01mmol/Lクエン酸塩緩衝液(pH6.0)中、120℃で10分間オートクレーブすることによる抗原回収の後、切片をPBS中の3%BSAで60分間ブロックした。ブロックした切片を、一次抗体である抗コラーゲンI(abcam社、ab34710,1:400)と共に4℃で一晩インキュベートし、室温で30分間インキュベートした後、HRP−ジアミノベンジジン化合物(株式会社ニチレイ)を用いて検出を行った。切片をヘマトキシリンで対比染色した。
フィブリルの注入およびその検出は、これまでに報告されている(Luk, K. C. et al., Science 338, 949−953 (2012)、Watanabe, Y. et al., Autophagy 13, 133−148 (2017))。
RPE−1細胞を、6ウェル当たり5.0×104個の密度で播種した。1日後、ルシフェラーゼおよびMondoA(Santa Cruz社)に対し、20nMのsiRNAで細胞を処理した。48時間に渡るsiRNA処理の後、RPE1細胞をサンプル緩衝液中で溶解し、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングに供した。Rubiconの蛋白質レベルをウエスタンブロッティングによって定量化した。siRNA処理の1日前に、RPE−1細胞を、6ウェル当たり5.0×104個の密度で播種した。
結果は、標本平均±標準誤差として示した。統計的検定は、GraphPad Prism(GraphPad Software社)またはExcel(Microsoft Office 2011)を用いたTukeyの検定またはt検定による一元または二元配置分散分析を通じて行った。
骨髄細胞を24ウェルプレートに培養し、M−CSFとRANKLを添加することで破骨細胞へ誘導した。4% paraformaldehydeで5分間固定し蒸留水でwash後、50mM酒石酸含有緩衝液(Ph5.0)と発色気質を加え37℃で45分間反応させた。TRAP活性による染色はBZ−X700(Keyence)で検鏡観察した。
オステオアッセイプレート(Corning #3988)に骨髄細胞を培養し、M−CSFとRANKLを添加することで破骨細胞へ誘導。破骨細胞が骨基質を溶解することで吸収窩(Pit)が形成され、BZ−X700(Keyence)で検鏡観察した。
初代培養系では12ウェルプレート、培養細胞系では96ウェルプレートにおいて骨分化培地で5日間細胞培養した。骨分化培地はαMEM supplemented with 10% FBS, 50μg/ml L−ascorbate phosphate(Shigma), 10mM β−glycerophosphate(Shigma)で作成した。4% paraformaldehyde(in 0.1M cacodylate buffer ; pH 7.3)で30分固定し、Bromo−Chloro−Indolyl phosphate/Nitro Blue Tetrazolium Chlorideを添加し37℃で20分間染色後、BZ−X700(Keyence)で検鏡観察した。
初代培養系では12ウェルプレート、培養細胞系では96ウェルプレートにおいて骨分化培地で4週間細胞培養した。骨分化培地はαMEM supplemented with 10% FBS, 50μg/ml L−ascorbate phosphate(Shigma), 10mM β−glycerophosphate(Shigma)で作成した。骨分化培地は2日毎に培地交換し、4% paraformaldehyde(in 0.1M cacodylate buffer ; pH 7.3)で30分固定した。0.1M cacodylate buffer(pH 7.3)でwashし、Alizarin Red S(pH 4.0)で5分間染色後、蒸留水で再度washした。ウェルを乾燥させ、BZ−X700(Keyencne)で検鏡観察した。
C57BL/6 バックグラウンドの12週齢のオスマウスを解析に使用した。ただし、骨粗鬆症モデルにおいては9週齢のメスマウスから卵巣を摘出し、4週間後に骨形態を計測した。骨形態はマウスの大腿骨遠位端をCTスキャンした(小・中型実験動物用3DマイクロX線CT/CosmoScan AX;Rigaku)。その後、3DマイクロCTデータをTRI/3D−BONソフトウェア(RATOC Systems)で解析し骨形態解析を行なった。
(1)Rubiconによるオートファジーの調節を介した寿命の制御
C.elegansのRubicon相同体を探索し、Y56A3A.16が、ヒトRubicon(KIAA0226)、ヒトKIAA0226L(最近、Pacerと同定)(Cheng, X. et al., Mol Cell 65, 1029−1043 (2017))、およびショウジョウバエRubicon(dRubicon、CG12772)(Banreti, A. et al., Dev Cell 28, 56−69 (2014))との配列類似性を有することを見出した(図5A)。
Rubiconのノックダウンが他の年齢発症表現型に影響を与えるか否かを検討した。体壁筋中でポリグルタミン(polyQ)−YFPを発現するワームは、polyQ融合蛋白質の年齢発症凝集を示す(Morley, J. F. et al., P Natl Acad Sci USA 99, 10417−104229 (2002))。CeRubiconのノックダウンは凝集のレベルを低下させたが、bec−1/Beclin 1の同時ノックダウンは減少を戻した。これはCeRubiconのノックダウンが、オートファジー依存的にpolyQ融合蛋白質の凝集を減少させることを示している(図2A,図2B(i))。
どの組織のCeRubiconが、C.elegansの寿命制御を担っているかを検討した。CeRubiconのノックダウン用に、TU3401(ニューロン特異的、sid−1系を使用)(Calixto, A. et al., Nature Methods 7, 554−U102 (2010))、NR350(筋肉)、VP303(腸)、およびNR222(皮下組織)を含む組織特異的なRNAi感受性株を使用した(図3A(i)、図7A(i)〜(iii))(Qadota, H. et al., Gene 400, 166−173 (2007))。神経細胞におけるCeRubiconのノックダウンが寿命を最も効率的に延ばした(図3A(i))。一方、CeRubiconの皮下組織および腸ノックダウンがそれよりも低い程度ではあるが大きく寿命を延ばした(図7A(i)〜(iii))。神経細胞は、通常、RNAiノックダウンに耐性があるため、野生型ワームのCeRubiconのノックダウンによって付与される寿命延長は、皮下組織、腸、および他の未同定組織からの組み合わせ効果を反映している可能性がある(図1D(i),(ii)、図5C(i))。
Rubiconの発現が、複数の寿命延長条件によって変更されるか否かを検討した。ワームでは、複数の異なる長命経路および対応する長命変異体がよく特徴づけられている。これらには、インスリン/IGF−1シグナル伝達(daf−2)、生殖細胞系列の除去(glp−1)、カロリー制限(eat−2)およびミトコンドリア機能障害(isp−1)の減少が含まれる(Kenyon, C. J. Nature 464, 504−512 (2010))。CeRubicon発現は、野生型と比較して、これらの長命ワームの全てにおいて抑制された(図4A(i)、図8B(ii))。さらに、9カ月間のカロリー制限を受けたマウスは、肝臓および腎臓におけるRubicon発現の低下を示した(図4A(ii)、図8B(i))。また、CeRubiconのノックダウンは、daf−2、glp−1、eat−2およびisp−1の寿命をそれ以上延長しないことを見出した(図8A(i)〜(iv))。この結果は、Rubiconが多数の寿命パラダイムの下流で制御され、これらの動物の寿命がRubicon発現の減少によって部分的に付与されることを示している。
全身のRubicon欠損マウスの大腿骨をCTで撮影したところ、Rubicon欠損マウスでは大腿骨の骨密度(BMD)、骨体積/骨組織体積比(BV/TV)、骨塩量(BMC)が有意に上昇した(図9A)。そこで、破骨細胞と骨芽細胞の初代培養系を作成し、それぞれの分化能と機能を評価した。破骨細胞の分化はTRAP染色で評価し、Rubicon欠損破骨細胞では分化が亢進していた(図9B)。また、破骨細胞の骨吸収機能をピットフォーメーションアッセイで評価したところ、Rubicon欠損骨芽細胞では骨吸収機能が亢進していた(図9C)。次に、骨芽細胞の分化能とミネラル化機能を初代培養系及び培養細胞系で検討した。培養細胞系におけるRubicon欠損細胞は、Crisper−Cas9 systemで作成している。分化能をALP染色で評価したところ、Rubicon欠損骨芽細胞では分化能が優位に上昇していた(図9D)。また、ミネラル化機能をアリザリン染色で評価したところ、Rubicon欠損骨芽細胞ではミネラル化機能が亢進していた(図9E)。全身のRubicon KOマウスでは、破骨細胞と骨芽細胞はともに、分化能および機能が亢進しているが、Rubicon欠損マウスにおいては大腿骨の骨形態が増強していることから、骨芽細胞の機能がより重要であると推測された。また、Rubicon欠損骨芽細胞においてオートファジーが亢進しているかどうかをLC3fluxアッセイで確認した。その結果、Rubicon欠損骨芽細胞は、栄養条件下、飢餓条件下の両方においてLC3 fluxが亢進した(図10)。
負の制御因子であるmTORおよびRubiconが、互いに部分的に独立して寿命を制御するということを明らかにした。
[0010]
以上から、本発明者は、Rubiconが、オートファジー活性の抑制を介した老化の鍵となる分子であり、Rubiconを標的として、老化の抑制、加齢性の疾患もしくは症状の予防、改善、もしくは治療、または寿命の延長を行うことや、老化の程度、加齢性の疾患もしくは症状の発症のリスク、または寿命の短縮のリスクを検査することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
[0011]
本発明は、より詳しくは、以下を提供するものである。
[0012]
[1]Rubicon遺伝子の機能を抑制する分子を有効成分とする、対象における老化の抑制、加齢性の疾患もしくは症状の予防、改善、もしくは治療、または寿命の延長のための組成物。
[0013]
[2]Rubicon遺伝子の機能を抑制する分子が、下記(a)〜(c)のいずれか1に記載の分子である、[1]に記載の組成物
(a)Rubicon遺伝子の転写産物に結合するRNAまたは該RNAをコードするDNA
(b)Rubiconタンパク質に結合するRNAまたはDNA
(c)Rubiconタンパク質に結合する抗体
[3]加齢性の疾患もしくは症状が、代謝性骨疾患もしくはその症状、ストレス耐性の低下、または臓器の線維化である、[1]または[2]に記載の組成物。
[0014]
[4]対象が脊椎動物である、[1]から[3]のいずれかに記載の組成物。
[0015]
[5]被検化合物が、対象における老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
被検化合物とRubiconタンパク質とを接触させる工程、および
被検化合物とRubiconタンパク質との結合を検出する工程、
ク、または寿命の短縮のリスクを検査する方法であって、
被検試料におけるRubicon遺伝子の発現産物を検出する工程を含み、
Rubicon遺伝子の発現産物の量が対照と比較して高い場合に、老化の程度、加齢性の疾患もしくは症状の発症のリスク、または寿命の短縮のリスクが高いと評価される方法。
[0019]
[9]加齢性の疾患もしくは症状が、代謝性骨疾患もしくはその症状、ストレス耐性の低下、または臓器の線維化である、[5]から[8]のいずれかに記載の方法。
[0020]
[10]対象が脊椎動物である、[5]から[9]のいずれかに記載の方法。
[0021]
[11][8]から[10]のいずれかに記載の方法において、Rubicon遺伝子の発現産物を検出するための組成物であって、下記(a)または(b)を含む組成物。
(a)Rubicon遺伝子の転写産物に結合するオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブ
(b)Rubiconタンパク質に結合する抗体
発明の効果
[0022]
本発明によれば、Rubicon遺伝子の機能を抑制することにより、オートファジーの活性化を介して、老化の抑制、加齢性の疾患や症状の予防、改善、もしくは治療、または寿命の延長が可能となる。特に、単一の遺伝子の機能を抑制するだけで、代謝性骨疾患の原因となる骨密度や骨体積/骨組織体積比の低下および骨形態の変化の改善、神経変性疾患の原因となる凝集性タンパク質の減少、目の変性の減少、および運動機能の低下の改善、ストレス耐性の向上、臓器の線維化の軽減、寿命の延長などの多様な効果をもたらすことができたことは、極めて驚くべきことである。また、本発明によれば、Rubicon遺伝子の発現産物を検出することにより、老化の程度、上記疾患や症状の発症のリスク、または寿命の短縮のリスクを検査することも
Claims (11)
- Rubicon遺伝子の機能を抑制する分子を有効成分とする、対象における老化の抑制、加齢性の疾患もしくは症状の予防、改善、もしくは治療、または寿命の延長のための組成物。
- Rubicon遺伝子の機能を抑制する分子が、下記(a)〜(c)のいずれか1に記載の分子である、請求項1に記載の組成物
(a)Rubicon遺伝子の転写産物に結合するRNAまたは該RNAをコードするDNA
(b)Rubiconタンパク質に結合するRNAまたはDNA
(c)Rubiconタンパク質に結合する抗体 - 加齢性の疾患もしくは症状が、代謝性骨疾患もしくはその症状、ストレス耐性の向上、または臓器の線維化である、請求項1または2に記載の組成物。
- 対象が脊椎動物である、請求項1から3のいずれかに記載の組成物。
- 被検化合物が、対象における老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
被検化合物とRubiconタンパク質とを接触させる工程、および
被検化合物とRubiconタンパク質との結合を検出する工程、
を含み、
被検化合物がRubiconタンパク質と結合する場合、老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性があると評価される方法。 - 被検化合物が、対象における老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
Rubicon遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程、および
該細胞内におけるRubicon遺伝子の発現を検出する工程、
を含み、
被検化合物を接触させない場合と比較して、被検化合物がRubicon遺伝子の発現を減少させる場合、老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性があると評価される方法。 - 被検化合物が、対象における老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
Rubicon遺伝子のプロモータ−領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞に、被検化合物を接触させる工程、および
該細胞内における前記レポーター遺伝子の発現を検出する工程、
を含み、
被検化合物を接触させない場合と比較して、被検化合物が前記レポーター遺伝子の発現を減少させる場合、老化を抑制する活性、加齢性の疾患もしくは症状を予防、改善、もしくは治療する活性、または寿命を延長する活性を有する蓋然性があると評価される方法。 - 対象における老化の程度、加齢性の疾患もしくは症状の発症のリスク、または寿命の短縮のリスクを検査する方法であって、
被検試料におけるRubicon遺伝子の発現産物を検出する工程を含み、
Rubicon遺伝子の発現産物の量が対照と比較して高い場合に、老化の程度、加齢性の疾患もしくは症状の発症のリスク、または寿命の短縮のリスクが高いと評価される方法。 - 加齢性の疾患もしくは症状が、代謝性骨疾患もしくはその症状、ストレス耐性の向上、または臓器の線維化である、請求項5か8のいずれかに記載の方法。
- 対象が脊椎動物である、請求項5から9のいずれかに記載の方法。
- 請求項8から10のいずれかに記載の方法において、Rubicon遺伝子の発現産物を検出するための組成物であって、下記(a)または(b)を含む組成物。
(a)Rubicon遺伝子の転写産物に結合するオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブ
(b)Rubiconタンパク質に結合する抗体
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