CN104884637A - 利用生物标志物通过bcl2表达的调节治疗癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及癌症的疗法和使用它们的方法。特别地，本发明提供了通过疾病鉴别、疾病进展、耐药性和/或治疗效果的标志物监控和改善癌症疗法施用的方法，其中所述癌症是由BCL2致癌基因介导的。

Description

利用生物标志物通过BCL2表达的调节治疗癌症的方法
发明的技术领域
本发明涉及癌症的疗法和使用它们的方法。特别地，本发明提供了通过疾病鉴别、疾病进展、耐药性和/或治疗效果的标志物监控和改善癌症疗法施用的方法，其中所述癌症是由BCL2致癌基因介导的。
优先权声明
本申请要求2012年11月05日提交的美国申请序列号61/722,764的优先权，上述申请的全文通过引用在此引入。
序列表
本申请通过引用引入2012年11月5日创建的和在2012年11月5日随本文一起提交的题为“Sequence_2012.txt”(698KB)的序列表的全部内容。
发明背景
致癌基因已成为了解癌症生物学的核心概念，且可以为治疗药物提供有价值的靶标。在许多类型的人类肿瘤(包括淋巴瘤和白血病)中，致癌基因是过表达的，且可以与致瘤性相关(Tsujimoto等，Science228:1440-1443(1985))。例如，已经在具有t(14；18)染色体易位的所有淋巴瘤(包括大多数滤泡性B细胞淋巴瘤和许多大细胞非何杰金氏淋巴瘤)中发现人BCL2基因的高水平表达。在不具有t(14；18)染色体翻译的某些白血病中也已经发现BCL2基因的高水平表达，其中包括慢性淋巴细胞性白血病急性的大多数病例、许多前B细胞类型的淋巴细胞性白血病、神经母细胞瘤、鼻咽癌及前列腺、乳腺和结肠的许多腺癌。(Reed等，Cancer Res.51:6529[1991]；Yunis等，New EnglandJ.Med.320:1047；Campos等，Blood 81:3091-3096[1993]；McDonnell等，Cancer Res.52:6940-6944[1992]；Lu等，Int.J Cancer 53:29-35[1993]；Bonner等，Lab Invest.68:43A[1993]；Klamper等,PNAS 93:14059-14064[1996]；Paz-Priel等，Mol Cancer Res 3:585-596[2005])。其它的重要致癌基因包括TGF-α、c-ki-ras、ras、HER-2和c-myc。
BCL2是经典的癌症靶标，因为它在癌症细胞而非正常细胞中上调。已知BCL2蛋白驱动血液系统癌症如滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLCL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。此外，在许多实体癌症类型中BCL2-上调驱动肿瘤细胞对细胞毒性损伤和程序性细胞死亡的抗性，从而使它们对现有的治疗有抗性。
细胞凋亡的失调是恶性细胞的限定特征和这是其中BCL2蛋白的过表达起着关键作用的过程。提高的BCL2/抗细胞凋亡表型可以造成广泛种类的肿瘤(包括弥漫性大B细胞淋巴瘤和许多实体肿瘤)的药物抗性。鉴于这种生物学重要性，BCL2是用于药物开发的首要靶标。现有的调节BCL2的途径包括RNA靶向的反义寡核苷酸、小分子蛋白质抑制剂以及其它等。
用BCL2靶向寡核苷酸进行的之前工作表明，直接与DNA的相互作用可以沉默该基因而杀死癌细胞，因而有治疗价值。低聚物PNT100靶向BCL2的启动子的非转录区，且因此不通过BCL2蛋白合成的翻译抑制起作用。PNT100，一种24个碱基的DNA寡核苷酸序列，表现为结合其启动子靶标，无论已知驱动某些淋巴瘤的t(14,18)易位事件是否已经牵涉BCL2基因。
本发明公开了可用于鉴别对BCL2基因的调节有反应的癌症的生物标志物，评估相关的生物标志物的表达和优化所述治疗在患者中的施用。
发明概述
本发明的方面包括利用生物标志物来定义对施用用于在患有癌症的受试者中治疗BCL2介导的癌症的受试化合物有反应的患癌症的患者的方法，包括：在施用所述受试化合物之前或施用之后从受试者获得生物样品；检测生物样品中一种或多种生物标志物的水平，其中所述生物标志物选自于，但不限于：Ki-67、BCL2、CD10、CD5、CD38、BCL6、MUM1、TP53、ZAP70，包括免疫组织化学组的免疫组织化学，流式细胞术分析，基因表达组，基因异常组，遗传缺失、易位、扩增和突变，BCL2的染色体重排的细胞遗传学—如t(14；18)、t(14；18)(q32；q21.3)和很少见地对于IG轻链(IGK，IGL)基因座如t(2；18)(P11；q21.3)或t(18；22)(q21.3；q11)或者在CMYC或参与驱动BCL2的转录和/或过表达的其它基因、蛋白质和/或因子中的染色体重排，包括FDG-PET摄取(标准摄取值，SUV)和CT成像的临床或成像参数，磷酸化BCL2、活性半胱天冬酶(capsase)-3、PARP、细胞色素C、LDH、B症状的缺乏、AKT信号传导通路标志物、BCL2家族成员如BAX、淋巴细胞计数、血小板计数、瘦素、IL-1ra、IL-17a、MCP-1、MIP-1β和IP10或它们的组合；将所述的一种或多种生物标志物的水平与各生物标志物的可测量阈值进行比较，其中各生物标志物的各可测量阈值是基于在获得施用后生物样品之前获得的在先生物样品中存在的该生物标志物的水平或者按照一些其它的临床标准；测定参考水平的剂量，其中当施用后生物样品中的水平与可测量的确定阈值不同时或患者得到临床益处(例如，肿瘤收缩、生活质量的改善、无进展的改善或整体生存率)时，BCL2被调节。
本发明的方面包括在施用用于在患有癌症的受试者中治疗BCL2介导的癌症的受试化合物之后测定BCL2表达的下调的方法，包括：施用受试化合物；在施用所述受试化合物之后，从所述受试者获得生物样品；检测生物样品中一种或多种生物标志物的水平，其中所述生物标志物选自于但不限于：Ki-67、BCL2、CD10、CD5、CD38、BCL6、MUM1、TP53、ZAP70，包括免疫组织化学组的免疫组织化学，流式细胞术分析，基因表达组，基因异常组，遗传缺失、易位、扩增和突变，BCL2的染色体重排的细胞遗传学—如t(14；18)、t(14；18)(q32；q21.3)和很少见地对于IG轻链(IGK，IGL)基因座如t(2；18)(P11；q21.3)或t(18；22)(q21.3；q11)或者在CMYC或参与驱动BCL2的转录和/或过表达的其它基因、蛋白质和/或因子中的染色体重排，包括FDG-PET摄取(标准摄取值，SUV)和CT成像的临床或成像参数，磷酸化BCL2、活性半胱天冬酶-3、PARP、细胞色素C、LDH、B症状的缺乏、AKT信号传导通路标志物、BCL2家族成员如BAX、淋巴细胞计数、血小板计数、瘦素、IL-1ra、IL-17a、MCP-1、MIP-1β和IP10或它们的组合；将所述的一种或多种生物标志物的水平与各生物标志物的可测量阈值进行比较，其中各生物标志物的各可测量阈值是基于获得施用后生物样品之前获得的在先生物样品中存在的该生物标志物的水平或者按照一些其它的临床标准；确定参考水平的剂量，其中当施用后生物样品中的水平与可测量的阈值不同时或患者得到临床益处(例如，肿瘤收缩、生活质量的改善、无进展的改善或整体生存率)时BCL2被调节。
在一些方面，BCL2可以变为转录活性的或它的过表达响应于化疗或靶向剂的治疗而触发，所述化疗或靶向剂涉及参与肿瘤抑制、发生、进展、生长、增殖、迁移、细胞周期、细胞信号传导、DNA损伤、基因组不稳定性、转移、侵入、转化、分化、耐受性、血管渗漏、上皮间质转化(EMT)、聚集、血管生成、粘附、抗性的发生、致癌基因和非癌基因(细胞因子、趋化因子、生长因子)的成瘾、免疫监视或免疫应答的改变、肿瘤基质/局部环境的改变、内皮细胞活化、细胞外基质重塑、缺氧和炎症、免疫激活或免疫抑制及存活和/或由于凋亡导致的细胞死亡的防止、坏死或自噬的阻断通路。
在一些方面，受试化合物可以是寡核苷酸化合物，其包含在生理条件下与选自于SEQ ID NO:1249或1254或其互补序列的寡核苷酸序列杂交的低聚物。
在一些方面，该低聚物可以包含选自于SEQ ID NO:1250、1251、1252、1253、1267-1477或其互补序列的低聚物。在一些方面，该低聚物可以包含选自于SEQ ID NO:1250、1251、1289-1358或其互补序列的低聚物。在一些方面，该低聚物包含SEQ ID NO:1250或1251。该低聚物可以包含SEQ ID NO：1251。
在一些方面，所述低聚物可以在脂质体制剂中施用。在一些方面，所述脂质体制剂可以是两性脂质体制剂。在一些方面，所述两性脂质体制剂可以包含一种或多种两性脂质。在一些方面，所述两性脂质体制剂可以由包含具有两性特征的脂质组分的混合物的脂质相形成。
在一些方面，脂质组分的混合物可以选自于(i)稳定的阳离子脂质和可带电荷的阴离子脂质，(ii)可带电荷的阳离子脂质和可带电荷的阴离子脂质和(iii)稳定的阴离子脂质和可带电荷的阳离子脂质。
在一些方面，所述脂质组分可以包含选自于DOGSucc、POGSucc、DMGSucc、DPGSucc、DGSucc、DMPS、DPPS、DOPS、POPS、DMPG、DPPG、DOPG、POPG、DMPA、DPPA、DOPA、POPA、CHEMS和Cet-P的一种或多种阴离子脂质。在一些方面，所述脂质组分可以包含选自于DMTAP、DPTAP、DOTAP、DC-Chol、MoChol、HisChol、DPIM、CHIM、DORIE、DDAB、DAC-Chol、TC-Chol、DOTMA、DOGS、(C18)2Gly+N,N-二-十八烷基酰胺-甘氨酸、CTAP、CPyC、DODAP和DOEPC的一种或多种阳离子脂质。
在一些方面，脂质相可进一步包含中性脂质。在一些方面，所述中性脂质可以选自甾醇及其衍生物、中性磷脂以及它们的组合。在一些方面，中性磷脂可以是磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷酸乙醇胺或它们的混合物。所述磷脂酰胆碱可以选自于POPC、OPPC、天然或氢化大豆磷脂酰胆碱、天然或氢化的蛋黄磷脂酰胆碱、DMPC、DPPC或DOPC和它们的衍生物，且磷脂酰乙醇胺选自于DOPE、DMPE、DPPE和它们的衍生物。
在一些方面，所述两性脂质体可以包含DOPE、POPC、CHEMS和MoChol。在一些方面，POPC/DOPE/MoChol/CHEMS的摩尔比可以为约6/24/47/23。
在一些方面，一种或多种生物标志物可以是蛋白质，和其中该检测步骤还包括使用质谱法或免疫测定法或两者的组合来分析生物样品中蛋白质的水平。
在一些方面，生物样品是血液或血浆。
在一些方面，之前的生物样品可以取自受试者。
本发明的其它方面可以包括在受试者中治疗BCL2介导的癌症的方法，包括：施用受试化合物；施用所述受试化合物之后，从受试者获得一个或多个额外的生物样品；检测生物样品中一种或多种生物标志物的水平，其中所述生物标志物选自于但不限于：Ki-67、BCL2、CD10、CD5、CD38、BCL6、MUM1、TP53、ZAP70，包括免疫组织化学组的免疫组织化学，流式细胞术分析，基因表达组，基因异常组，遗传缺失、易位、扩增和突变，BCL2的染色体重排的细胞遗传学—如t(14；18)、t(14；18)(q32；q21.3)和很少见地对于IG轻链(IGK，IGL)基因座如t(2；18)(P11；q21.3)或t(18；22)(q21.3；q11)或者在CMYC或参与驱动BCL2的转录和/或过表达的其它基因、蛋白质和/或因子中的染色体重排，包括FDG-PET摄取(标准摄取值，SUV)和CT成像的临床或成像参数，磷酸化BCL2、活性半胱天冬酶-3、PARP、细胞色素C、LDH、B症状的缺乏、AKT信号传导通路标志物、BCL2家族成员如BAX、淋巴细胞计数、血小板计数、瘦素、IL-1ra、IL-17a、MCP-1、MIP-1β和IP10或它们的组合；将所述的一种或多种生物标志物的水平与各生物标志物的可测量阈值进行比较，其中各生物标志物的各可测量阈值是基于获得施用后生物样品之前获得的在先生物样品中存在的该生物标志物的水平或者按照一些其它的临床标准；确定参考水平的剂量，其中当施用后生物样品中的水平与可测量的阈值不同时或患者得到临床益处(例如，肿瘤收缩、生活质量的改善、无进展的改善或整体生存期)时，BCL2被调节。
在一些方面，该方法可进一步包括在受试化合物施用的同时或之前从受试者收集在先生物样品。
在一些方面，瘦素的水平可在样品中检测，且其中从测定步骤确定瘦素不同于统计测定的阈值，则启动对癌症的治疗；和用新的或修改的癌症治疗来治疗受试者。
在进一步的方面中，Ki-67的水平可以在样品中检测，并且从所述测定步骤，Ki-67定义患者为响应于治疗。
而在进一步的方面中，可在样品中检测染色体重排的存在，并且其中从所述测定步骤，染色体重排定义患者为响应于治疗。
而在进一步的方面中，可以在PET图像中检测标准摄取值(SUV)，并且其中从所述测定步骤，SUV水平定义患为者响应于治疗。如本文中所用，通过FDG-PET测定的标准摄取值(SUV)指的是测量葡萄糖的代谢摄取或代谢活性肿瘤的目前公认的方法。SUV被常用在PET成像中用于简单的半定量分析，其通常用于癌症患者的[18F]氟代脱氧葡萄糖([18F]FDG)图像的分析中。SUV是用于在受试者中评估[18F]FDG PET图像以研究识别、监测治疗和/或治疗响应且也在受试者之间进行比较的方便的方法。
而在进一步的方面中，来自受试者的血液样品可以显示可在样品中检测的淋巴细胞或血小板计数和亚型，且其中从该测定步骤，淋巴细胞计数定义响应于治疗的患者。
而在进一步的方面中，可在肿瘤或血液样品中检测免疫组织化学或流式细胞术组，并且其中从所述测定步骤，蛋白质标志物定义响应于治疗的患者。
本发明的一些方面可以包括在需要的受试者中调节BCL2表达的方法，包括施用受试化合物；其中在受试者中调节BCL2表达调节了一种或多种下列(但不限于)标志物的表达：Ki-67、BCL2、CD10、CD5、CD38、BCL6、MUM1、TP53、ZAP70，包括免疫组织化学组的免疫组织化学，流式细胞术分析，基因表达组，基因异常组，遗传缺失、易位、扩增和突变，BCL2的染色体重排的细胞遗传学—如t(14；18)、t(14；18)(q32；q21.3)和很少见地对于IG轻链(IGK，IGL)基因座如t(2；18)(P11；q21.3)或t(18；22)(q21.3；q11)或者在CMYC或参与驱动BCL2的转录和/或过表达的其它基因、蛋白质和/或因子中的染色体重排，包括FDG-PET摄取(标准摄取值，SUV)和CT成像的临床或成像参数，磷酸化BCL2、活性半胱天冬酶-3、PARP、细胞色素C、LDH、B症状的缺乏、AKT信号传导通路标志物、BCL2家族成员如BAX、淋巴细胞计数、血小板计数、瘦素、IL-1ra、IL-17a、MCP-1、MIP-1β和IP10或它们的组合。本发明的一些实施方式可包括用于在患有癌症的受试者中施用用于治疗BCL2介导的癌症的受试化合物后，测定BCL2表达的下调的试剂盒，包含：用于检测生物样品中一种或多种生物标志物的水平的探针，其中所述生物标志物选自于但不限于：Ki-67、BCL2、CD10、CD5、CD38、BCL6、MUM1、TP53、ZAP70，包括免疫组织化学组的免疫组织化学，流式细胞术分析，基因表达组，基因异常组，遗传缺失、易位、扩增和突变，BCL2的染色体重排的细胞遗传学—如t(14；18)、t(14；18)(q32；q21.3)和很少见地对于IG轻链(IGK，IGL)基因座如t(2；18)(P11；q21.3)或t(18；22)(q21.3；q11)或者在CMYC或参与驱动BCL2的转录和/或过表达的其它基因、蛋白质和/或因子中的染色体重排，包括FDG-PET摄取(标准摄取值，SUV)和CT成像的临床或成像参数，磷酸化BCL2、活性半胱天冬酶-3、PARP、细胞色素C、LDH、B症状的缺乏、AKT信号传导通路标志物、BCL2家族成员如BAX、淋巴细胞计数、血小板计数、瘦素、IL-1ra、IL-17a、MCP-1、MIP-1β和IP10或它们的组合。
附图简要说明
图1描绘了其中对携带人类肿瘤的免疫抑制小鼠单独或组合施用PNT2258和化疗剂利妥昔单抗或多西他赛的研究的结果。
图2A-D描绘了病人的数据，其在人类癌症患者受试者中的给药和安全性试验中分组为初始给药群组和用于无对照概念验证研究的患者数据。也显示了按癌症类型分组的患者数据。
图3描绘了受试者保留在剂量和安全性研究中的时间长度(以研究日测量)，按给药群组分类。
图4A-D描绘了在剂量和安全性研究中给药前和给药后受试者PBMC细胞的BCL-2、活性BCL-2、PARP和半胱天冬酶(caspase)-3表达的改变和在可评估的无对照概念验证受试者PBMC细胞和肿瘤活检中给药前至给药后BCL-2的改变。
图5A-B描绘了施用PNT-2258后研究中患者的各种癌细胞类型的BCL2敲减的相对量。
图6A-C描绘了施用各种不同剂量的PNT2258后人类剂量和安全性研究的受试者中和施用120mg/m2的PNT2258后人类无对照概念验证受试者中淋巴细胞的数量。
图7A-B描绘了施用各种不同剂量的PNT2258后人类剂量和安全性受试者和施用120mg/m2的PNT2258后人类无对照概念验证受试者中的血小板计数。
图8描绘了来自用PNT2258、乱序对照和空脂质体对照处理的健康BALB/c小鼠的生物标志物表达数据。
图9描绘了4-6周龄的雌性C.B-17SCID小鼠中的生物标志物表达。向小鼠植入WSU-DLCL2异种移植物片段，并在肿瘤达到300-400mm3的体积时用PNT2258或乱序对照处理。红色＝PNT2258；蓝＝乱序对照。
图10描述了在人类患者中的生物标志物表达。
图11描绘了患者中的炎性细胞因子谱情况，将给药前与给药后进行比较。
图12描绘了施用后6天，体外Pfeiffer人淋巴瘤细胞系中PNT2258、PNT100和二甲双胍之间的药物相互作用。
图13描述了从施用PNT2258前到施用后，在人类无对照概念验证受试者中Ki-67表达的变化。
图14描绘了来自无对照概念验证研究的患者反应。
图15描绘了来自无对照概念验证研究的患者诊断和诊断或者筛选时的分子特征。
发明详述
一、定义
如本文所使用的，“患者”是指哺乳动物，包括人类。
如本文所使用的，术语“受试者”指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人类、非人灵长类、啮齿类等，其将是特定治疗的接受者。典型地，术语“受试者”和“患者”在本文对于人类受试者可互换地使用。
如本文所使用的，术语“非人类动物”指所有的非人类动物，包括，但不限于，脊椎动物如啮齿类、非人灵长类、羊科动物、牛科动物、反刍动物、兔形目动物、猪科动物、公山羊、马科动物、犬科动物、猫科动物、鸟类等，和非脊椎动物例如果蝇和秀丽隐杆线虫。
如本文所使用的“有效量”被定义为向所治疗的患者提供治疗效果所需要的量，并且通常基于患者的年龄、表面积、体重和状况而确定。用于动物和人类的剂量的相互关系(根据每平方米体表面积的毫克数)由Freireich等，Cancer Chemother.Rep.,50:219(1966)描述。体表面积可以从患者的身高和体重近似地确定。见，例如，ScientificTables,Geigy Pharmaceuticals,Ardsley,New York,537(1970)。
如本文所使用的术语“其中所述化疗剂以小于标准剂量的一半存在”是指低于用于对人类给药的标准剂量范围的最小值的一半(例如，小于50％、小于40％、小于10％或小于1％)的剂量。在一些实施方式中，所述标准剂量范围是由制造商推荐的剂量范围。在其它的实施方式中，所述标准剂量范围是由本领域的医生所使用的范围。而在其它的实施方式中，所述标准剂量范围是考虑该领域中的正常护理标准的范围。所述剂量范围内的具体剂量通过，例如，受试者的年龄、体重和健康以及被治疗的癌症类型而确定。
如本文所使用的，“反应特征”是可能对受试化合物做出反应的受试者。
如本文所用的，“生物相关的表达范围或水平”被用于定义在用受试化合物治疗之前患者中的蛋白质水平、表达、翻译。
如本文所使用的，术语“在使得所述基因的表达被抑制的条件下”是指在其中本发明的寡核苷酸与基因(例如，基因的调控区域)杂交并相对于不存在该寡核苷酸时的转录水平抑制该基因的转录至少10％、至少25％、至少50％或至少90％的条件。示例性的基因包括BCL2；可以与BCL2一起被抑制的另外的基因包括，但不限于c-ki-ras、c-Ha-ras、c-myc、her-2和TGF-α。
如本文所使用的，术语“调节”是指按照测量或比例的调节。调节还包括改变基因转录或者蛋白质翻译或表达的一种或多种特性的过程。
如本文所使用的，术语“在使得所述细胞的生长减少的条件下”指其中向细胞(例如，癌细胞)施用本发明的寡核苷酸时，相对于不存在该寡核苷酸时的细胞生长速率，其降低细胞生长速率至少10％、至少25％、至少50％或至少90％的条件。
如本文所使用的，术语Ki-67是与增殖相关且是增殖的细胞标志物的核蛋白。此外，它与核糖体RNA转录相关。减少抗原Ki-67指示基因转录的抑制。通常，Ki-67蛋白质存在于细胞周期的所有活性期(G1、S、G2和有丝分裂)，但是不存在于静息细胞(G0)。Ki-67是确定给定细胞群体的生长分数的优良标志物。Ki-67阳性肿瘤细胞的分数(Ki-67标记指数)常常与癌症的临床过程相关联。
如本文所使用的，术语免疫组织化学或流式细胞术组(panel)是指对于白血病、淋巴瘤或癌瘤测试的免疫组织化学组。
如本文所使用的，术语细胞遗传学是指测试以鉴别基因/染色体重排和染色体异常，包括与白血病、淋巴瘤和癌瘤的样品相关的缺失。淋巴细胞的主要功能是抗体的形成，血液癌中受到影响的一组常见基因涉及抗体的重链和轻链的形成。这些基因在以下染色体上被发现：重链：14号染色体，轻链κ：2号染色体，轻链λ：染色体。除了这些基因外，对于白血病、淋巴瘤和癌瘤的亚组特异性的关键基因是已知的。实例包括但不意图限制性地包括，(1)位于染色体8上的c-myc基因，且可以包括t(8；14)、t(2；8)、t(8；22)，(2)位于3号染色体上的bcl-6，且可以包括：t(3；14)、t(2；3)和t(3；22)，(3)位于19号染色体上的bcl-3，且可以包括t(14；19)，(4)位于11号染色体上的bcl-1(细胞周期蛋白D1)，且可以包括t(11；14)，(5)在慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中常见的染色体缺失和标志物，且可以包括17p、13p、ZAP70等。如本文所使用的，通过FDG-PET测定的标准摄取值(SUV)指的是目前公认的测量葡萄糖的代谢摄取或代谢活性肿瘤的方法。
如本文所用的，术语“核酸分子”是指任何含核酸的分子，包括但不限于，DNA或RNA。该术语涵盖的序列包括DNA和RNA的任何已知的碱基类似物。
术语“基因”是指包含产生多肽、前体或RNA(例如，rRNA、tRNA)所必需的编码序列的核酸(例如，DNA)序列。该多肽可以由全长编码序列或由编码序列的任何部分编码，只要保留了该全长或片段的所需活性或功能性质(例如，酶活性、配体结合、信号转导、免疫原性等)。该术语还包括结构基因的编码区和在5'和3'端上邻近于编码区任一端的距离约1kb或更多的序列，使得该基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区的5'或上游和存在于mRNA上的序列被称为5'非翻译序列。位于编码区的3'或下游和存在于mRNA的序列被称为3'非翻译序列。术语“基因”包括基因的cDNA和基因组形式。基因的基因组形式或克隆含有被称为“内含子”或“间插区域”或“间插序列”的非编码序列中断的编码区。内含子是被转录成核RNA(hnRNA)的基因片段；内含子可以含有调控元件，如增强子。内含子从核或初级转录本除去或“剪切掉”；因此内含子不存在于信使RNA(mRNA)转录本中。在翻译过程中mRNA起到指定新生多肽中氨基酸的序列或顺序的作用。
如本文所用的，基因的“调控区域”是调节基因表达的基因的任何部分，包括但不限于，转录和翻译的调节。该区域包括但不限于基因的5'和3'区域、调控因子的结合位点(包括但不限于转录因子结合位点)。该区域还包括翻译起始位点的上游或下游长达20,000或更多的碱基对的区域，只要该区域以任何方式参与该基因的表达的调节。该区域可以短至20个碱基对或长至数千碱基对。
如本文所用的术语，“异源基因”指不是在其天然环境中的基因。例如，异源基因包括从一个物种引入到另一物种的基因。异源基因还包括已经以某种方式(例如，突变、以多拷贝添加、连接非天然调控序列等)改变的生物体原有的基因。异源基因与内源基因的区别在于，异源基因序列通常与未被发现与染色体中的基因序列天然相关的DNA序列接合，或与未在自然界中发现的染色体部分相关(例如，在其中该基因通常不表达的基因座中表达基因)。
如本文所用的，术语“基因表达”是指通过基因的“转录”(即，经由RNA聚合酶的酶促作用)将基因中的编码遗传信息转化为RNA(例如，mRNA、微RNA(miRNA)、rRNA、tRNA或snRNA)的过程，和对于蛋白质编码基因，通过mRNA的“翻译”转化为蛋白质。基因表达可以在该过程中的许多阶段中进行调节。“上调”或“激活”是指增加基因表达产物(即，RNA或蛋白质)产生的调节，而“下调”或“抑制”是指降低产生的调节。参与上调或下调的分子(例如，转录因子)通常分别被称为“激活因子”和“阻遏剂”。
除了含有内含子，基因的基因组形式还可以包括位于存在于RNA转录本上的序列的5'和3'末端的序列。这些序列被称为“侧翼”序列或区域(这些侧翼序列位于mRNA转录本上存在的非翻译序列的5'或3'侧)。5'侧翼区域可含有调控序列如启动子和增强子，其调节或影响基因的转录。3'侧翼区域可以包含指导转录终止、转录后切割和多聚腺苷酸化的序列。
术语“野生型”是指从天然存在的来源分离的基因或基因产物。野生型基因是在群体中最常观察到的并因此任意设计基因的“正常”或“野生型”形式。与此相反，术语“修饰的”或“突变体”是指当与野生型基因或基因产物相比时，在序列和/或功能特性(即，改变的特征)中显示出修改的基因或基因产物。应该注意的是天然存在的突变体可以被分离；与野生型基因或基因产物相比，这些被它们具有改变的特征(包括改变的核酸序列)的事实鉴别。
如本文所使用的，术语“具有编码基因的核苷酸序列的寡核苷酸”和“具有编码基因的核苷酸序列的多核苷酸”是指包含基因的编码区的核酸序列或换句话说编码基因产物的核酸序列。编码区可以存在于cDNA、基因组DNA或RNA形式中。当存在于DNA的形式中时，寡核苷酸或多核苷酸可以是单链的(即有义链)或双链的。合适的控制元件，例如增强子/启动子、剪接点、多腺苷酸化信号等，可以在需要时靠近该基因的编码区设置以允许初级RNA转录物的适当转录起始和/或正确加工。可选地，在本发明的表达载体中使用的编码区可以包含内源增强子/启动子、剪接点、间隔序列、多腺苷酸化信号等，或内源性和外源性控制元件的组合。
如本文所使用的，术语“寡核苷酸”是指短长度的单链多核苷酸链。寡核苷酸通常少于200个残基长(例如，在8和100之间)，然而如本文所用的，该术语还旨在包含较长的多核苷酸链(例如，大到5000个残基)。寡核苷酸通常是按它们的长度指称。例如24残基的寡核苷酸被称作“24-mer”。寡核苷酸可以通过自身杂交或与其它多核苷酸杂交而形成二级和三级结构。这样的结构可以包括，但不限于，双链体、发夹、十字形、弯曲和三联体。
在一些实施方式中，寡核苷酸是“抗基因”。如本文所使用的，术语“抗基因”是指与基因的启动子区域杂交的寡核苷酸。在一些实施方式中，抗基因与启动子的杂交抑制该基因的表达。
如本文所用的术语“互补的”或“互补性”用于指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，对于序列“A-G-T”，其与序列“T-C-A”互补。互补性可以是“部分的”，其中仅一些核酸碱基根据碱基配对规则匹配。或者，在核酸之间可能存在“完全”或“总体”互补性。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有显著影响。这在扩增反应以及依赖于核酸之间结合的检测方法中特别重要。
如本文所用的，术语“完全互补的”例如当用于本发明的寡核苷酸时，是指其中所有的核苷酸互补于靶序列(例如，基因)的寡核苷酸。
如本文所使用的术语“部分互补的”例如当用于本发明的寡核苷酸时，是指其中至少一个核苷酸不互补于靶序列的寡核苷酸。示例性的部分互补的寡核苷酸是在生理条件下仍然能够杂交于靶序列的那些。术语“部分互补的”是指核苷酸内部或在任一端具有一个或多个非互补的寡核苷酸的区域的寡核苷酸。在末端具有错配的寡核苷酸仍可与靶序列杂交。
术语“同源性”是指互补性的程度。可以有部分同源或完全同源(即，同一性)。部分互补序列是至少部分地抑制完全互补的核酸分子与“基本同源”的靶核酸杂交的核酸分子。可利用杂交分析(Southern或Northern印记、溶液杂交等)在低严格性条件下检验完全互补序列与靶序列的杂交的抑制。基本同源的序列或探针会在低严格性条件下竞争和抑制完全同源的核酸分子与靶标的结合(即，杂交)。这并不是说，低严格性条件是使得允许非特异性结合；低严格条件需要两条序列彼此的结合是特异性的(即，选择性的)相互作用。可通过使用基本上非互补(例如，小于约30％同一性)的第二靶标对非特异性结合的不存在进行测试；在不存在非特异性结合的情况下，探针将不杂交于第二非互补靶标。
当对于双链核酸序列例如cDNA或基因组克隆使用时，术语“基本上同源的”是指如上所述在低严格性条件下任何探针可以与双链核酸序列的任一或两条链杂交。
当对于单链核酸序列使用时，术语“基本上同源”是指如上所述在低严格性条件下可以与单链核酸序列杂交(即，与其互补)的任何探针。
如本文所使用的，术语“杂交”被用于指互补核酸的配对。杂交和杂交的强度(即，核酸之间结合的强度)受如核酸之间的互补程度、所涉及的严格性条件、所形成的杂合体的Tm以及核酸内G：C比的因素影响。在其结构内含有互补核酸的配对的单一分子被称为是“自我杂交”。
如本文所用的，术语“Tm”用来指“解链温度”。解链温度是双链核酸分子群体一半解离成为单链的温度。用于计算核酸的Tm的公式是本领域公知的。如标准参考所指示的，Tm值的简单估算可以通过公式来计算：Tm＝81.5+0.41(％G+C)，当核酸在1M NaCl的水性溶液中时(参见例如，Anderson和Young，Quantitative Filter Hybridization,in Nucleic Acid Hybridization[1985])。其它的参考包括将结构以及序列特征考虑用于Tm的计算的更复杂的计算。
如本文所用的，术语“严格性”用于指在其中进行核酸杂交的温度、离子强度和其它化合物例如有机溶剂的存在的条件。在“低严格性条件”下，目的核酸序列将杂交于其精确互补物、具有单碱基错配的序列、密切相关的序列(例如，具有90％或更高同源性的序列)和仅具有部分同源性的序列(如具有50-90％同源性的序列)。在“中等严格性条件”下，目的核酸序列只与其精确互补物、具有单碱基错配的序列和密切相关的序列(例如，90％或更高同源性)杂交。在“高严格性条件”下，目的核酸序列将只与其精确互补物和(取决于条件如温度)具有单碱基错配的序列杂交。换句话说，在高严格性条件下，可以升高温度以便排除与具有单碱基错配的序列的杂交。
当“高严格性条件”用于核酸杂交时，其包含等同于使用约500个核苷酸的长度的探针时，在42℃下在由5X SSPE(43.8g/l的NaCl，6.9g/l的NaH2PO4·H2O和1.85g/l的EDTA，用NaOH将pH值调节至7.4)，0.5％的SDS，5X Denhardt氏试剂和100μg/ml变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，随后在包含0.1X SSPE，1.0％SDS的溶液中在42℃下洗涤的条件。
当“中等严格性条件”用于核酸杂交时，其包含等同于使用约500个核苷酸的长度的探针时，在42℃下在由5X SSPE(43.8g/l的NaCl，6.9g/l的NaH2PO4·H2O和1.85g/l的EDTA，用NaOH将pH值调节至7.4)，0.5％的SDS，5X Denhardt氏试剂和100μg/ml变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，随后在含有0.1X SSPE，1.0％SDS的溶液中在42℃下洗涤的条件。
“低严格性条件”包含等同于使用约500个核苷酸的长度的探针时，在42℃下在由5X SSPE(43.8g/l的NaCl，6.9g/l的NaH2PO4·H2O和1.85g/l的EDTA，用NaOH将pH值调节至7.4)，0.1％SDS，5XDenhardt氏试剂[50X Denhardt氏试剂每500ml含有：5g Ficoll(Type400,Pharmacia)，5g BSA(Fraction V；Sigma)]和100μg/ml变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，随后在含有5×SSPE，0.1％SDS的溶液中在42℃下洗涤的条件。
本发明并不限定于约500个核苷酸长度的探针的杂交。本发明考虑使用长度约8个核苷酸至最多几千个(例如，至少5000)个核苷酸之间的探针。相关领域的技术人员理解，严格性条件可以对于其它大小的探针而改变(参见例如，Anderson和Young，Quantitative FilterHybridization,in Nucleic Acid Hybridization[1985]和Sambrook等，Molecular Cloning—A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001，及Current Protocols inMolecular Biology,M.Ausubel等编，(Current Protocols,a joint venturebetween Greene Publishing Associates,Inc和John Wiley&Sons,Inc.，并通过2006年增补。))
在本领域中公知，众多等同条件可以用于构成低严格性条件；考虑如探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)和靶标的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或固定的等)，以及盐和其它的组分的浓度(例如，存在或不存在甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇)的因素，且可以改变杂交溶液以产生不同于，但等同于，上面列出的条件的低严格性杂交条件。此外，本领域已知在高严格性条件下促进杂交的条件(例如，提高杂交和/或洗涤步骤的温度，在杂交溶液中使用甲酰胺等)(参见上述“严格性”的定义)。
如本文所用的，术语“生理条件”是指近似的或者属于动物(例如，人)体内的条件的特定严格性条件。用于体外用途的示例性生理条件包括，但不限于，37℃，95％空气，5％CO2，用于培养哺乳动物细胞的市售培养基(例如，DMEM培养基，购自Gibco，MD)，5-10％的血清(如牛血清或马血清)，附加的缓冲剂，和任选的激素(例如，胰岛素和表皮生长因子)。
如本文所用的，术语“分离的”，当用于核酸时，如在“分离的寡核苷酸”或“分离的多核苷酸”中，指已经鉴别的和与至少一种通常与其天然来源相关的组分或污染物分离的核酸序列。分离的核酸是以不同于其天然存在的形式的这样的形式或环境。与此相反，非分离的核酸是以它们在自然界中存在的状态发现的核酸，例如DNA和RNA。例如，给定DNA序列(例如，基因)在宿主细胞染色体上接近邻近基因存在；RNA序列，如编码特定蛋白质的特定mRNA序列，在细胞中作为与编码大量蛋白质的许多其它的mRNA的混合物存在。然而，编码给定蛋白质的分离的核酸包括，举例来说，在通常表达给定蛋白质的细胞中的这种核酸，其中所述核酸是在与天然细胞不同的染色体位置中，或者另外地是被与天然发现的所不同的核酸序列侧邻。分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸可以以单链或双链形式存在。当分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸被用于表达蛋白质时，该寡核苷酸或多核苷酸将包含至少有义或编码链(即寡核苷酸或多核苷酸可以是单链的)，但也可以同时包含有义和反义链(即，寡核苷酸或多核苷酸可以是双链的)。
如本文所用的术语“可测量的”是指从动物(例如，人)获得并测量样品或评估参数，例如，但不限于CT扫描、PET、MRI、X射线的图像，预后评分/指数(如R-IPI，修订的国际预后指数)或其组合，其可用于确认或预测疾病的结果。
如本文所使用的术语“纯化的”或“纯化”是指从样品中去除组分(例如，污染物)。例如，重组多肽在细菌宿主细胞中表达和该多肽通过去除宿主细胞蛋白质纯化；从而在样品中重组多肽的百分比提高。
如本文所使用的术语“表位”是指抗原的与特定抗体形成接触的该部分。
当蛋白质或蛋白质的片段被用于免疫宿主动物时，蛋白质的许多区域可诱导产生特异性结合到蛋白质上的给定区域或三维结构的抗体；这些区域或结构被称为“抗原决定簇”。抗原决定簇可以与完整的抗原(即，用于引发免疫应答的“免疫原”)竞争结合抗体。
如本文所用的，术语“蛋白质印迹”是指固定于载体如硝基纤维素或膜上的蛋白质(或多肽)的分析。将蛋白质在丙烯酰胺凝胶上运行以分离蛋白质，随后将蛋白质从凝胶转移到固体支持物，如硝基纤维素或尼龙膜。然后将固定的蛋白质暴露于具有针对目标抗原的反应性的抗体。可以通过各种方法检测所述抗体的结合，其中包括使用放射性标记的抗体。
如本文所使用的，术语“细胞培养”是指任何的体外细胞培养。包括在该术语内的有连续细胞系(例如，具有永生表型)、原代细胞培养、转化的细胞系、有限细胞系(例如，未转化的细胞)和体外保持的任何其它细胞群体。
所使用的术语“真核生物”是指可与“原核生物”相区分的生物体。该术语意图包含具有表现出真核生物的通常特性的细胞的所有生物，例如存在由核膜包裹的真细胞核(在其中放置染色体)、存在膜结合的细胞器以及在真核生物中通常观察到的其它特征。因此，该术语包括，但不限于如真菌、原生动物和动物(例如，人类)的此类生物体。
如本文所用的，术语“体外”是指人工环境和在人工环境中发生的过程或反应。体外环境可以包括，但不限于试管和细胞培养物。术语“体内”指的是天然环境(例如，动物或细胞)和在自然环境中发生的过程或反应。
术语“受试化合物”和“候选化合物”指作为用于治疗或预防疾病、不适、病症或身体功能的失调(例如，癌症)的候选物的任何化学实体、药剂、药物等。受试化合物包括已知的和潜在的治疗化合物。受试化合物可以通过使用本发明的筛选方法进行筛选而确定是治疗性的。在本发明的一些实施方式中，受试化合物包括反义化合物。
如本文所用的术语“化疗剂”是指在疾病(例如，癌症)的治疗中可用的化合物。有效对抗癌症的示例性化疗剂包括，但不限于，柔红霉素、更生霉素、阿霉素、博来霉素、丝裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷(CA)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MTX)、秋水仙素、长春新碱、长春碱、依托泊苷、替尼泊苷、顺铂和己烯雌酚(DES)、氟达拉滨、苯达莫司汀、烷基化剂(例如，氮芥、亚硝基脲、四嗪、氮丙啶、顺铂)、抗代谢物(例如，抗叶酸)、抗微管剂(例如，紫杉醇、长春花生物碱)、拓扑异构酶抑制剂(例如，依立替康、托泊替康)、细胞毒性抗生素(例如，阿霉素、柔红霉素)、PARP剂，其它靶向剂，如抗体或抗体样药剂。化疗剂的定义包括可用于增强一种或多种第一化疗剂或本发明的寡核苷酸的作用，或减轻一种或多种第一化疗剂或本发明的寡核苷酸的副作用的化合物。示例性的靶向剂也可以包括，例如，涉及细胞内和细胞外的细胞信号传导途径的激酶、细胞表面受体和蛋白/酶的抑制剂。
免疫疗法的定义包括诱导、增强或抑制免疫应答的免疫调节剂。
放射疗法的定义包括使用X射线的放射性干预、超声波、无线电波、热或磁场，其可用于增强一种或多种第一化疗剂或本发明的寡核苷酸的作用，或者减轻一种或多种第一化疗剂或本发明的寡核苷酸的副作用。
手术疗法的定义包括外科的或侵入性的干预(例如，肿瘤切除术、中央导管放置)，其可用于增强一种或多种第一化疗剂或本发明的寡核苷酸的效果，或减轻一种或多种第一化疗剂或本发明的寡核苷酸的副作用。
如本文所使用的，术语“样品”用于其最广泛的含义。在某种意义上，它是指包括从任何来源获得的样本或培养物，以及生物和环境样品。生物样品可从动物(包括人类)获得并且包括流体、固体、组织和气体。生物样品包括血液制品，如血浆、血清等。环境样品包括环境材料，如表面物质、土壤、水、晶体和工业样品。然而这些实例并不应当被理解为限制适用于本发明的样品类型。
对于本发明来说，根据化学元素周期表，CAS版，Handbook ofChemistry and Physics，第75版来确定化学元素。另外，有机化学的一般原理被描述于“Organic Chemistry”，Thomas Sorrell,UniversityScience Books,Sausalito:1999，和“March’s Advanced OrganicChemistry”，第5版，编辑：Smith、M.B.和March，J.，John Wiley&Sons,New York:2001中。
如本文所用的，术语“脂族的”包括术语烷基、烯基、炔基，其各自任选如下所述被取代。
如本文所使用的，“烷基”基团指含有1-8(例如，1-6或1-4)个碳原子的饱和脂族烃基。烷基可以是直链或支链的。烷基的实例包括，但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正庚基或2-乙基己基。烷基基团可以被一个或多个取代基取代(即，任选取代)，如卤素、环脂族基、杂环脂族基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳酰基、杂芳酰基、(环脂族基)羰基、(杂环脂族基)羰基、硝基、氰基、氨基、酰氨基、酰基、磺酰基、亚磺酰基、硫烷基、硫氧基、脲、硫脲、氨磺酰基、磺酰胺、氧代、羧基、氨基甲酰基、环脂族氧基(cycloaliphaticoxy)、杂环脂族氧基、芳氧基、杂芳氧基、芳烷氧基、杂芳烷氧基或羟基。取代的烷基的一些实例包括但不限于，羧基烷基(如HOOC-烷基、烷氧基羰基烷基和烷基羰氧基烷基)、氰基烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、酰基烷基、羟基烷基、芳烷基、(烷氧基芳基)烷基、(磺酰基氨基)烷基(如(烷基磺酰基氨基)烷基)、氨基烷基、酰氨基烷基、(环脂族基)烷基、氰基烷基或卤代烷基。
如本文所使用的，“烯基”基团是指含有2-8(例如，2-6或2-4)个碳原子和至少一个双键的脂肪族烃基团。与烷基基团一样，烯基基团可以是直链或支链的。烯基基团的实例包括但不限于，烯丙基、异戊二烯基、2-丁烯基和2-己烯基。烯基可任选地被一个或多个取代基所取代，如卤素、环脂族基、杂环脂族基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳酰基、杂芳酰基、(环脂族基)羰基、(杂环脂族基)羰基、硝基、氰基、氨基、酰氨基、酰基、磺酰基、亚磺酰基、硫烷基、硫氧基、脲、硫脲、氨磺酰基、磺酰胺、氧代、羧基、氨基甲酰基、(环脂族基)氧基、(杂环脂族基)氧基、芳氧基、杂芳氧基、芳烷氧基、(杂芳基)烷氧基或羟基。
如本文所使用的，“炔基”基团是指含有2-8(例如，2-6或2-4)个碳原子和至少具有一个三键的脂肪族烃基团。炔基基团可以是直链或支链的。炔基基团的实例包括但不限于，丙炔基和丁炔基。炔基基团可以任选地被一个或多个取代基所取代，如卤素、环脂族基、杂环脂族基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳酰基、杂芳酰基、(环脂族基)羰基、(杂环脂族基)羰基、硝基、氰基、氨基、酰氨基、酰基、磺酰基、亚磺酰基、硫烷基、硫氧基、脲、硫脲、氨磺酰基、磺酰胺、氧代、羧基、氨基甲酰基、(环脂族基)氧基、(杂环脂肪族)氧基、芳氧基、杂芳氧基、芳烷氧基、(杂芳基)烷氧基或羟基。
如本文所使用的，“酰胺基”包含“氨基羰基”和“羰基氨基”。当这些术语单独使用或与另一基团结合使用时是指酰胺基团，如当末端使用时是指N(RX)2-C(O)-或RYC(O)-N(RX)2-和当中间使用时是指-C(O)-N(RX)-或-N(RX)-C(O)-，其中RX和RY定义如下。酰胺基的实例包括烷基酰氨基如烷基羰基氨基和烷基羰基氨基、(杂环脂族基)酰氨基、(杂芳烷基)酰氨基、(杂芳基)酰氨基、(杂环烷基)烷基酰氨基、芳基酰氨基、芳烷基酰氨基、(环烷基)烷基酰氨基和环烷基酰氨基。
如本文所使用的，“氨基”基团指-NRXRY，其中RX和RY各自独立地为氢、烷基、环脂族基、(环脂族基)脂族基、芳基、芳脂族基、杂环脂族基、(杂环脂族基)脂族基、杂芳基、羧基、硫烷基、亚磺酰基、磺酰基、(脂族基)羰基、(环脂族基)羰基、((环脂族基)脂族基)羰基、芳基羰基、(脂族基)羰基、(杂环脂族基)羰基、((杂环脂族基)脂族基)羰基、(杂芳基)羰基或(杂芳脂族基)羰基，其各自在此被定义和任选被取代。氨基的实例包括烷基氨基、二烷基氨基和芳基氨基。
当术语“氨基”不是末端基团(例如，烷基羰基氨基)时，它是由-NRX-表示。RX具有如上所定义的相同的含义。
如本文所用的，单独使用的或作为较大基团(如“芳烷基”、“芳烷氧基”或“芳氧基烷基”)的部分的“芳基”基团是指单环的(如，苯基)；双环的(例如，茚基、萘基、四氢萘基、四氢茚基)；和三环的(例如，芴基、四氢芴基或四氢蒽基、蒽基)。所述二环和三环基团包括苯并稠合的2-3元碳环。例如，苯并稠合基团包括与两个或更多个C4-8碳环部分稠合的苯基。芳基任选被一个或多个取代基所取代，包括脂族基[例如，烷基、烯基或炔基]；环脂族基；(环脂族基)脂族基；杂环脂族基；(杂环脂族基)脂族基；芳基；杂芳基；烷氧基；(环脂族基)氧基；(杂环脂族基)氧基；芳氧基；杂芳氧基；(脂族基)氧基；(杂芳脂族基)氧基；芳酰基；杂芳酰基；氨基；氧代(在苯并稠合双环或三环芳基的非芳族碳环上)；硝基；羧基；酰氨基；酰基[例如，脂族羰基；(环脂族基)羰基；((环脂族基)脂族基)羰基；(芳脂族基)羰基；(杂环脂族基)羰基；((杂环脂族基)脂族基)羰基；和(杂芳脂族基)羰基]；磺酰基[例如，脂族基硫酰基和氨基磺酰基]；亚磺酰基[例如，脂族基亚磺酰基]；硫烷基[例如，脂族基硫烷基]；硝基；氰基；卤素；羟基；巯基；硫氧基；脲；硫脲；氨磺酰基；磺酰胺；和氨基甲酰基。可选地，芳基可以是未取代的。
取代的芳基的非限制性实例包括卤代芳基[例如，单-、二(诸如对、间-二卤代芳基)和(三-卤代)芳基]；(羧基)芳基[例如，(烷氧基羰基)芳基、((芳烷基)羰氧基)芳基和(烷氧基羰基)芳基]；(酰氨基)芳基[例如，(氨基羰基)芳基、(((烷基氨基)烷基)氨基羰基)芳基、(烷基羰基)氨基芳基、(芳基氨基羰基)芳基和(((杂芳基)氨基)羰基)芳基]；氨基芳基[例如，((烷基磺酰基)氨基)芳基和((二烷基)氨基)芳基]；(氰基烷基)芳基；(烷氧基)芳基；(氨磺酰基)芳基[例如，(氨基磺酰基)芳基]；(烷基磺酰基)芳基；(氰基)芳基；(羟烷基)芳基；((烷氧基)烷基)芳基；(羟基)芳基、((羧基)烷基)芳基；(((二烷基)氨基)烷基)芳基；(硝基烷基)芳基；(((烷基磺酰基)氨基)烷基)芳基；((杂环脂族基)羰基)芳基；((烷基磺酰基)烷基)芳基；(氰基烷基)芳基；(羟烷基)芳基；(烷基羰基)芳基；烷基芳基；(三卤代烷基)芳基；对-氨基-间-烷氧基羰基芳基；对-氨基-间-氰基芳基；对-卤代-间-氨基芳基；和(间-(杂环脂族基)-邻-(烷基))芳基。
如本文所使用的，“芳脂族基”如“芳烷基”基团是指被芳基取代的脂族基团(例如，C1-4烷基)。“脂族基”、“烷基”和“芳基”在本文中定义。芳脂族基例如芳烷基的实例是苄基。
如本文所使用的，“双环系统”包括8-12(例如，9、10或11)元结构，其形成两个环，其中两个环具有至少一个共有原子(例如，2个共有原子)。双环系统包括双环脂族基(例如，双环烷基或双环烯基)、双环杂脂族基、双环芳基和双环杂芳基。
如本文所使用的，“环脂族”基团包括“环烷基”基团和“环烯基”基团，其各自如下所述任选被取代。
如本文所使用的，“环烷基”基团是指3-10(例如，5-10)个碳原子的饱和碳环单-或双环(稠合或桥接)环。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、金刚烷基、冰片基、cubyl、八氢茚基、十氢萘基、双环[3.2.1]辛基、双环[2.2.2]辛基、双环[3.3.1]壬基、双环[3.3.2]癸基、双环[2.2.2]辛基、金刚烷基、氮杂环烷基或((氨基羰基)环烷基)环烷基。如本文所用的“环烯基”基团是指具有一个或多个双键的3-10(例如，4-8)个碳原子的非芳族碳环。环烯基的实例包括环戊烯基、1,4-环己二烯基、环庚烯基、环辛烯基、六氢茚基、八氢萘基、环己烯基、环戊烯基、双环[2.2.2]辛烯基和双环[3.3.1]壬烯基。
环烷基或环烯基可任选被一个或多个取代基所取代，如脂族基[例如，烷基、烯基或炔基]、环脂族基、(环脂族基)脂肪族、杂环脂族基、(杂环脂族基)脂族基、芳基、杂芳基、烷氧基、(环脂族基)氧基、(杂环脂族基)氧基、芳氧基、杂芳氧基、(芳脂族基)氧基、(杂芳脂肪族)氧基、芳酰基、杂芳酰基、氨基、酰氨基[例如，(脂族基)羰基氨基、(环脂族基)羰基氨基、((环脂族基)脂族基)羰基氨基、(芳基)羰基氨基、(芳脂族基)羰基氨基、(杂环脂族基)羰基氨基、((杂环脂族基)脂族基)羰基氨基、(杂芳基)羰基氨基和(杂芳脂族基)羰基氨基]、硝基、羧基[例如，HOOC-、烷氧基羰基和烷基羰基氧基]、酰基[例如，(环脂族基)羰基、((环脂族基)脂族基)羰基、(芳脂族基)羰基、(杂环脂族基)羰基、((杂环脂族基)脂族基)羰基和(杂芳脂族基)羰基]、硝基、氰基、卤基、羟基、巯基、磺酰基[例如，烷基磺酰基和芳基磺酰基]、亚磺酰基[例如，烷基亚磺酰基]、硫烷基[例如，烷基硫烷基]、sulfoxy、脲、硫脲、氨磺酰基、磺酰胺、氧代或氨基甲酰基。
如本文所使用的“环状部分”包括环脂族基、杂环脂族基、芳基或杂芳基，其各自如前面所定义。
如本文所使用的术语“杂环脂族基”包括杂环烷基基团和杂环烯基基团，其各自任选地如下所述被取代。
如本文所使用的“杂环烷基”基团指3-10元单环或双环(稠合或桥连)(例如，5-至10-元单环或双环)饱和环结构，其中一个或多个环原子是杂环原子(例如，N、O、S或其组合)。杂环烷基基团的实例包括哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基、四氢呋喃基、1,4-二氧戊环基、1,4-二噻烷基、1,3-二氧戊环基、oxazolidyl、isoxazolidyl、吗啉基、硫代吗啉基(thiomorpholyl)、八氢苯并呋喃基、八氢色烯基、八氢thiochromenyl、八氢吲哚基、八氢-吡啶基、十氢喹啉基、八氢-苯并[b]噻吩基、2-氧杂-双环[2.2.2]辛基、1-氮杂-双环[2.2.2]辛基、3-氮杂双环[3.2.1]辛基和2,6-二氧杂-三环[3.3.1.03,7]壬基。单环杂环烷基可以与苯基部分如四氢异喹啉稠合。如本文所用的“杂环烯基”基团是指单-或双环(例如，5-至10-元单环或双环)非芳族环结构，其具有一个或多个双键，和其中一个或多个环原子是杂原子(例如，N、O或S)。单环和双环杂脂族根据标准化学命名法编号。
杂环烷基或杂环烯基基团可任选被一个或多个取代基所取代，如脂族基[例如，烷基、烯基或炔基]、环脂族基、(环脂族基)脂族基、杂环脂族基、(杂环脂族基)脂族基、芳基、杂芳基、烷氧基、(环脂族基)氧基、(杂环脂族基)氧基、芳氧基、杂芳氧基、(芳脂族基)氧基、(杂芳脂族基)氧基、芳酰基、杂芳酰基、氨基、酰氨基[例如，(脂族基)羰基氨基、(环脂族基)羰基氨基、((环脂族基)脂族基)羰基氨基、(芳基)羰基氨基、(芳脂族基)羰基氨基、(杂环脂族基)羰基氨基、((杂环脂族基)脂族基)羰基氨基、(杂芳基)羰基氨基和(杂芳脂族基)羰基氨基]、硝基、羧基[例如，HOOC-、烷氧基羰基和烷基羰基氧基]、酰基[例如，(环脂族基)羰基、((环脂族基)脂族基)羰基、(芳脂族基)羰基、(杂环脂族基)羰基、((杂环脂族基)脂族基)羰基和(杂芳脂族基)羰基]、硝基、氰基、卤基、羟基、巯基、磺酰基[例如，烷基磺酰基和芳基磺酰基]、亚磺酰基[例如，烷基亚磺酰基]、硫烷基[例如，烷基硫烷基]、sulfoxy、脲、硫脲、氨磺酰基、磺酰胺、氧代或氨基甲酰基。
如本文使用的，“杂芳基”基团是指单环、双环或三环的环结构，其具有4至15个环原子，其中一个或多个环原子是杂原子(如N、O、S或它们的组合)，并且其中所述二环或三环环结构中的一个或多个环是芳族的。杂芳基包括具有2至3个环的苯并稠合环系统。例如，苯并稠合基团包括与一个或两个4至8元杂脂环族基团(例如，indolizyl、吲哚基、异吲哚基、3H-吲哚基、二氢吲哚基、苯并[b]呋喃基、苯并[b]噻吩基、喹啉基或异喹啉基)稠合的苯并。杂芳基的一些实例是氮杂环丁烷基、吡啶基、1H-吲唑基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、噁唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、异喹啉基、苯并噻唑基、呫吨、噻吨、吩噻嗪、二氢吲哚、苯并[1,3]二氧杂环戊烯、苯并并[b]呋喃基、苯并[b]噻吩基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、puryl、噌啉基、喹啉基、喹唑啉基、噌啉基、phthalazyl、喹唑啉基、喹喔啉基、异喹啉基、4H-quinolizyl、苯并-1,2,5-噻二唑基或1,8-萘啶基。
单环杂芳基包括而不限于呋喃基、噻吩基、2H-吡咯基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、1,3,4-噻二唑基、2H-吡喃基、4-H-pranyl、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡唑基、pyrazyl或1,3,5-triazyl。单环杂芳基按照标准化学命名法编号。
双环杂芳基包括而不限于indolizyl、吲哚基、异吲哚基、3H-吲哚基、二氢吲哚基、苯并[b]呋喃基、苯并[b]噻吩基、喹啉基、异喹啉基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、嘌呤基、4H-quinolizyl、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、phthalazyl、喹唑啉基、喹喔啉基、1,8-萘啶基或蝶啶基。双环杂芳基按照标准化学命名法编号。
杂芳基任选被一个或多个取代基所取代，如脂族基[例如，烷基、烯基或炔基]；环脂族基；(环脂族基)脂族基；杂环脂族基；(杂环脂族基)脂族基；芳基；杂芳基；烷氧基；(环脂族基)氧基；(杂环脂族基)氧基；芳氧基；杂芳氧基；(芳脂族基)氧基；(杂芳脂族基)氧基；芳酰基；杂芳酰基；氨基；氧代(在双环或三环杂芳基的非芳族碳环或杂环的环上)；硝基；羧基；酰氨基；酰基[例如，脂族基羰基；(环脂族基)羰基；((环脂族基)脂族基)羰基；(芳脂族基)羰基；(杂环脂族基)羰基；((杂环脂族基)脂族基)羰基和(杂芳脂族基)羰基]；磺酰基[例如，脂族基磺酰基和氨基磺酰基]；亚磺酰基[例如，脂族基亚硫酰基]；硫烷基[例如，脂族基硫烷基]；硝基；氰基；卤基；羟基；巯基；sulfoxy；脲；硫脲；氨磺酰基；磺酰胺或氨基甲酰。可选地，杂芳基可以是未取代的。
取代的杂芳基的非限制性实例包括(卤代)杂芳基[例如，单-和二-(卤代)杂芳基]；(羧基)杂芳基[例如，(烷氧基羰基)杂芳基]；氰基杂芳基；氨基杂芳基[例如，((烷基磺酰基)氨基)杂芳基和((二烷基)氨基)杂芳基]；(酰氨基)杂芳基[例如，氨基羰基杂芳基，((烷基羰基)氨基)杂芳基，((((烷基)氨基)烷基)氨基羰基)杂芳基，(((杂芳基)氨基)羰基)杂芳基，((杂环脂族基)羰基)杂芳基和((烷基羰基)氨基)杂芳基]；(氰基烷基)杂芳基；(烷氧基)杂芳基；(氨磺酰基)杂芳基[例如，(氨基磺酰基)杂芳基]；(磺酰基)杂芳基[例如，(烷基磺酰基)杂芳基]；(羟烷基)杂芳基；(烷氧基烷基)杂芳基；(羟基)杂芳基；((羧基)烷基)杂芳基；[((二烷基)氨基)烷基]杂芳基；(杂环脂族基)杂芳基；(环脂族基)杂芳基；(硝基烷基)杂芳基；(((烷基磺酰基)氨基)烷基)杂芳基；((烷基磺酰基)烷基)杂芳基；(氰基烷基)杂芳基；(酰基)杂芳基[例如，(烷基羰基)杂芳基]；(烷基)杂芳基和(卤代烷基)杂芳基[例如，三卤代烷基杂芳基]。
如本文所用的，“杂芳脂族基”(如杂芳烷基基团)是指被杂芳基基团取代的脂族基团(例如，C1-4烷基基团)。“脂族基”、“烷基”和“杂芳基”已在上文定义。
如本文所使用的，“酰基”基团指的是甲酰基基团或RX-C(O)-(如-烷基-C(O)-，也称作“烷基羰基”)，其中RX和“烷基”前面已经定义。乙酰基和新戊酰基为酰基基团的实例。
如本文所使用的，“烷氧基”基团指其中“烷基”先前定义的烷基-O-基团。
如本文所使用的，“氨基甲酰基”基团是指具有结构-O-CO-NRXRY或-NRX-CO-O-RZ的基团，其中RX和RY已如上定义和RZ可以是脂族基、芳基、芳脂族基、杂环脂族基、杂芳基或杂芳脂族基。
如本文所使用的，“羧基”基团当作为端基团使用时是指-COOH，-COORX，-OC(O)H，-OC(O)RX，或当作为内部基团使用时是-OC(O)-或-C(O)O-。
如本文所使用的，“卤代脂族基”基团指被1-3个卤素取代的脂族基团。例如，术语卤代烷基包括基团-CF3。
如本文所使用的，“巯基”基团指-SH。
如本文所使用的“磺基”当用于末端指-SO3H或-SO3RX或用于内部时指-S(O)3-。
如本文所使用的“磺酰胺”基团当用于末端指结构-NRX-S(O)2-NRYRZ和用于内部时指-NRX-S(O)2-NRY-，其中RX、RY和RZ已经如上所定义。
如本文所使用的“氨磺酰”基团当用于末端时指结构-S(O)2-NRXRY或-NRX-S(O)2-RZ或用于内部时指-S(O)2-NRX-或-NRXS(O)2-，其中RX、RY和RZ的定义如上。
如本文所使用的，“硫烷基”基团当用于末端指-S-RX和用于内部时指-S-，其中RX已如上定义。硫烷基的实例包括烷基硫烷基。
如本文所使用的，“亚磺酰基”基团当用于末端指-S(O)-RX和用于内部时指-S(O)-，其中RX上述已有定义。
如本文所使用的“磺酰基”基团当用于末端指-S(O)2-RX和用于内部时指-S(O)2-，其中RX上述已有定义。
如本文所使用的“sulfoxy”基团当用于末端指-O-SO-RX或-SO-O-RX，和用于内部时指-O-S(O)-或-S(O)-O-，其中RX上述已有定义。
如本文所使用的，“卤素”或“卤代”基团指氟、氯、溴或碘。
如本文所使用的，“烷氧基羰基”(其由术语羧基所包含)单独使用或与另一基团结合使用是指一种基团，如烷基-O-C(O)-。
如本文所使用的“烷氧基烷基”是指烷基基团，如烷基-O-烷基-，其中烷基在上文定义。
如本文所使用的“羰基”是指-C(O)-。
如本文所使用的“氧代”是指＝O。
如本文所使用的“氨基烷基”指结构(RX)2N-烷基-。
如本文所使用的“氰基烷基”指结构(NC)-烷基-。
如本文所使用的“脲”基团是指-NRX-CO-NRYRZ和“硫脲”基团当用于末端指结构时指结构-NRX-CS-NRYRZ和当用于内部时指-NRX-CO-NRY-或-NRX-CS-NRY-，其中RX，RY和RZ已经如上所定义。
如本文所使用的“胍基”基团指结构-N＝C(N(RXRY))N(RXRY)，其中RX和RY已经如上所定义。
如本文所用的术语“脒基”基团指结构-C＝(NRX)N(RXRY)，其中RX和RY已经如上所定义。
术语“末端”和“内部”是指取代基中基团的位置。当基团存在于取代基的末端而进一步键合到化学结构的其余部分时，该基团是末端的。羧基烷基，即，RXO(O)C-烷基为末端使用的羧基的实例。当该基团存在于取代基的中间或结合到化学结构其余部分上的取代基的末端时，该基团是内部的。烷基羧基(例如，烷基-C(O)O-或烷基-OC(O)-)和烷基羧基芳基(例如，烷基-C(O)O-芳基-或烷基-O(CO)-芳基-)是内部使用的羧基基团的实例。
短语“任选取代的”可与短语“取代或未取代的”互换使用。如本文所描述，本发明的化合物可以任选被一个或多个取代基所取代，如上面所阐述的，或者如本发明的特定类别、亚类和种类所例示的。如本文所述，本文包含的变量涵盖特定基团，如烷基和芳基。除非另有说明，用于本文所包含的变量的每一个具体基团可任选被本文所描述的一个或多个取代基所取代。特定基团的各取代基进一步任选被卤素、氰基、氧代烷氧基、羟基、氨基、硝基、芳基、卤代烷基和烷基中的一至三个所取代。例如，烷基可被烷基硫烷基取代且烷基硫烷基可任选被卤素、氰基、氧代烷氧基、羟基、氨基、硝基、芳基、卤代烷基和烷基中的一至三个所取代。作为附加的实例，(环烷基)羰基氨基的环烷基部分可以任选地被卤素、氰基、烷氧基、羟基、硝基、卤代烷基和烷基中的一至三个所取代。当两个烷氧基基团与相同原子或毗邻原子结合时，该两个烷氧基基团可与它们所结合的原子一起形成环。
通常，术语“取代的”无论其前面有无术语“任选的”，都表示用特定取代基的基团取代给定结构中的氢基团。具体的取代基在如上所述的定义中和在下面的化合物和其实例的描述中说明。除非另有指示，任选取代的基团可以在基团的各个可取代的位置具有取代基，并且当在任何给定结构中的一个以上位置可以被选自于指定组中的一个以上的取代基所取代时，该取代基在每个位置可以是相同或不同的。环取代基，诸如杂环烷基，可结合至另一个环，诸如环烷基，以形成螺-双环环系统，例如，两个环共有一个原子。如本领域的普通技术人员能够了解的，本发明所预想的取代基的组合是那些导致形成稳定或化学上可行的化合物的组合。
如本文所用的短语“稳定的或化学上可行的”是指当经受允许其产生、检测和优选其回收、纯化和用于本文所公开的一种或多种目的的条件时，基本上不改变的化合物。
除非另有说明，本文所描绘的结构也意指包括该结构的所有异构(例如，对映体，非对映体和几何(或构象))形式；例如，对于各不对称中心的R和S构象，(Z)和(E)双键异构体，和(Z)和(E)构象异构体。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映体、非对映体，几何(或构象)混合物在本发明的范围之内。除非另有说明，本发明化合物的所有互变异构形式都在本发明的范围之内。另外，除非另有规定，本文所描绘的结构也意在包括区别仅在于存在一种或多种同位素富集的原子的化合物。例如，除了氢被氘或氚取代，或者碳被13C-或14C-富集的碳所取代外，具有本结构的化合物在本发明的范围之内。这种化合物可用作，例如，生物试验中的分析工具或探针。
如本文所用的，共同疗法包括可单独使用的或与其它癌症疗法组合使用来治疗癌症的任何寡核苷酸化合物。
如本文所用，构成Revised International Prognostic Index(R-IPI)的因素包括：年龄>60，性能状态>2，乳酸脱氢酶升高，>1的结外病灶，3/4期疾病。
II、癌症
本发明的化合物和方法可用于治疗几种类型的癌症。在一些实施方式中可用本发明的化合物和方法治疗的癌症的实例包括实体瘤癌症，包括但不限于黑色素瘤、转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、转移性激素难治性前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、胰腺癌、头颈癌和血液系统癌症，其包括但不限于，所有白血病和淋巴瘤。
本发明的化合物和方法可用于治疗几种类型的淋巴瘤亚型，其选自于霍奇金淋巴瘤、经典霍奇金淋巴瘤，富淋巴细胞型/混合细胞型/淋巴细胞削减型、富淋巴细胞型、混合细胞型、淋巴细胞削减型、结节性硬化症、经典霍奇金淋巴瘤NOS、结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤B细胞、前体非霍奇金淋巴瘤B细胞、成熟非霍奇金淋巴瘤B细胞、慢性/小/幼淋巴细胞性/套B细胞NHL、慢性/小淋巴细胞性白血病/淋巴、幼淋巴细胞性白血病B-细胞、套细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤/瓦尔登斯特、淋巴浆细胞性淋巴瘤、waldenstrom巨球蛋白血症、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、DLBCL NOS、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、纵隔大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤/白血病、边缘区淋巴瘤(MZL)、脾MZL、结外MZL MALT型、淋巴结MZL、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、浆细胞肿瘤、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞白血病、重链病、非霍奇金淋巴瘤B细胞NOS、非霍奇金淋巴瘤T细胞、前体非霍奇金淋巴瘤T细胞、成熟的非霍奇金淋巴瘤T细胞、蕈样霉菌病/塞扎里综合征、蕈样霉菌病、塞扎里综合征、外周T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤NOS、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤T-或祼细胞、肝脾T细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤NOS、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、NK/T细胞淋巴、鼻型/侵袭性NK白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞性白血病、幼淋巴细胞性白血病T细胞、非霍奇金淋巴瘤NOS T细胞、非霍奇金淋巴瘤-未知谱系、前体淋巴细胞性白血病/淋巴-未知谱系、幼淋巴细胞性白血病-未知谱系、非霍奇金淋巴瘤NOS-未知谱系、复合霍奇金淋巴瘤和NHL、淋巴样肿瘤NOS和未分类亚型。
黑色素瘤或皮肤的癌症是癌症的非常普遍的形式，并且如果早期诊断和治疗的话一般可以被控制。然而，如果未经治疗，黑色素瘤可以导致转移性黑色素瘤并且难以治疗。III或IV期黑色素瘤的发展是严重的医学病症，并且可以通常在诊断时间起的8至18个月内导致死亡。
达卡巴嗪是由FDA批准用于治疗转移性黑色素瘤的唯一的化疗剂，并且和7-12％的反应率和治疗开始后5.6-7.8个月的平均存活相关。与其它的化疗剂的组合没有显示出改善的反应率。最近，其它的试剂，包括易普利姆玛，一种阻止细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的单克隆抗体，与达卡巴嗪联合已经显示出比单独的达卡巴嗪有更好的存活率。最近，维罗菲尼(PLX4032)，突变的BRAF激酶抑制剂的强效抑制剂，当与达卡巴嗪相比时在具有BRAF V600E突变的转移性黑色素瘤患者中显示出改善的存活。
约40-60％的皮肤黑色素瘤在BRAF激酶抑制子中携带突变，这导致通过MAPK途径的下游信号传导的组成型活化。尽管大多数(约90％)的突变是由密码子600处谷氨酸取代缬氨酸(BRAF V600E)组成，但其它的激活突变是已知的，如BRAF V600K和BRAF V600R。靶向BRAF V600E突变已经导致维罗菲尼的发现和开发，并导致针对BRAF V600E突变选择的患者中整体和无进展生存的改善。
然而，没有BRAF V600E突变的患者表现为没有达卡巴嗪(FDA批准的治疗转移性黑色素瘤的唯一化疗剂)以外的其它的替代治疗。对于任一治疗选择，对于任何转移性黑色素瘤患者的整体存活率通常少于两年。
在其它实施方式中，本发明的组合物或低聚物可用于治疗炎症性疾病，如类风湿关节炎、狼疮(lupis)和炎性肠疾病，有或没有另外的治疗剂，包括TNF-α抑制剂，如依那西普、非类固醇抗炎药(NSAID)如布洛芬、皮质类固醇、缓解疾病的抗风湿药物(DMARD)如甲氨蝶呤和免疫抑制剂如硫唑嘌呤和CD-20抑制剂。
III、癌症疗法
本发明的癌症疗法包括寡核苷酸化合物、化疗剂、放射疗法、外科手术或它们的组合。
A.寡核苷酸化合物的基因靶标
1.BCL2
在包括淋巴瘤和白血病的许多类型的人类肿瘤中，人BCL2基因过表达，并且可以与致瘤性相关(Tsujimoto等Science 228:1440-1443[1985])。已经在许多形式的血液系统和实体肿瘤中发现了BCL2。这些包括所有实体肿瘤癌症，包括但不限于黑色素瘤、转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、急性骨髓性白血病(AML)、转移性激素难治性前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、胰腺癌、头颈癌以及血液系统癌症，包括但不限于，所有白血病和淋巴瘤。
在具有t(14；18)染色体易位的所有淋巴瘤(包括大多数滤泡性B细胞淋巴瘤和许多大细胞非何杰金氏淋巴瘤)中已发现人类BCL2基因的高水平表达。在没有t(14；18)染色体翻译的某些白血病中也已经发现了BCL2基因的高水平的表达，包括慢性淋巴细胞性白血病急性的大多数情况、许多前B细胞类型的淋巴细胞性白血病、神经母细胞瘤、鼻咽癌及前列腺、乳腺和结肠的许多腺癌。(Reed等，Cancer Res51：6529[1991]；Yunis等，New England J.Med.320:1047；Campos等，Blood 81:3091-3096[1993]；McDonnell等，Cancer Res.52:6940-6944[1992)；Lu等，Int.J Cancer 53:29-35[1993]；Bonner等，Lab Invest.68:43A[1993])。
目前的模型提出BCL2蛋白在抑制性相互作用的分层网络中发挥作用来调节细胞凋亡。BCL2家族蛋白是细胞凋亡的必要调节者，其造成癌细胞中存活途径的失调。该家族的促存活成员，如BCL2、BCL-XL和MCL-1，具有4个BCL2同源性(BH)结构域。促凋亡BCL2蛋白被分为两个亚族。蛋白质如BAX或BAK含有BH1-BH3结构域但缺乏N-末端BH4域。蛋白质如BAD、BID、BIM或PUMA缺乏除了BH3之外的所有结构域，并称为“仅-BH3”蛋白质。在健康细胞中，BAX和BAK的促凋亡作用是通过促生存蛋白质BCL2、BCL-XL和MCL-1抑制的。
然而，响应于促凋亡的应激，所述的仅-BH3蛋白质的成员被表达或激活。仅-BH3蛋白质抑制BCL2、BCL-XL和MCL-1的促存活作用，从而释放BAX和BAK的促凋亡作用而导致细胞死亡。
细胞凋亡的失调是恶性细胞的限定特征，且这是其中BCL2蛋白的过表达起着关键作用的一个过程。提高的BCL2/抗凋亡表型造成包括弥漫性大B细胞淋巴瘤和许多实体肿瘤的各种各样肿瘤的化疗抗性。鉴于这种生物学重要性，BCL2是用于药物开发的首要靶标。调节BCL2的先前途径包括RNA靶向的反义寡核苷酸、小分子蛋白抑制剂及其它。
2.其它的致癌基因靶标
本发明可以包括共同施用设计用于其它的致癌基因靶标的寡核苷酸，如c-erb-2(her-2)、c-myc、TGF-α、c-Ha-ras和c-ki-Ras。其它的示例性致癌基因包括，但不限于，BCR/ABL、ABL1/BCR、ABL、BCL1、BCL-2、BRAF、CD24、CDK4、EGFR/ERBB-1、HSTF1、INT1/WNT1、INT2、MDM2、MET、MYB、MYC、MYCN、MYCL1、RAF1、NRAS、REL、AKT2、APC、BCL2-α、BCL2-β、BCL3、BCR、BRCA1、BRCA2、CBL、CCND1、CDKN1A、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CRK、CRK-II、CSF1R/FMS、DBL、DDOST、DCC、DPC4/SMAD4、E-CAD、E2F1/RBAP、ELK1、ELK3、EPH、EPHA1、E2F1、EPHA3、ERG、ETS1、ETS2、FER、FGR、FLI1/ERGB2、FOS、FPS/FES、FRA1、FRA2、FYN、HCK、HEK、HER3/ERBB-2、ERBB-3、HER4/ERBB-4、HST2、INK4A、INK4B、JUN、JUNB、JUND、KIP2、KIT、KRAS2A、KRAS2B、LCK、LYN、MAS、MAX、MCC、MLH1、MOS、MSH2、MYBA、MYBB、NF1、NF2、P53、PDGFB、PIM1、PTC、RB1、RET、ROS1、SKI、SRC1、TAL1、TGFBR2、THRA1、THRB、TIAM1、TRK、VAV、VHL、WAF1、WNT2、WT1、YES1、ALK/NPM1、AMI1、AXL、FMS、GIP、GLI、GSP、HOX11、HST、IL3、INT2、KS3、K-SAM、LBC、LMO-1、LMO-2、L-MYC、LYL1、LYT-10、MDM-2、MLH1、MLL、MLM、N-MYC、OST、PAX-5、PMS-1、PMS-2、PRAD-1、RAF、RHOM-1、RHOM-2、SIS、TAL2、TAN1、TIAM1、TSC2、TRK、TSC1、STK11、PTCH、MEN1、MEN2、P57/KIP2、PTEN、HPC1、ATM、XPA/XPG、BCL6、DEK、AKAP13、CDH1、BLM、EWSR1/FLI1、FES、FGF3、FGF4、FGF6、FANCA、FLI1/ERGB2、FOSL1、FOSL2、GLI、HRAS1、HRX/MLLT1、HRX/MLLT2、KRAS2、MADH4、MAS1、MCF2、MLLT1/MLL、MLLT2/HRX、MTG8/RUNX1、MYCLK1、MYH11/CBFB、NFKB2、NOTCH1、NPM1/ALK、NRG/REL、NTRK1、PBX1/TCF3、PML/RARA、PRCA1、RUNX1、RUNX1/CBFA2T1、SET、TCF3/PBX1、TGFB1、TLX1、P53、WNT1、WNT2、WT1、αv-β3、PKCα、TNFα、丛生蛋白、生存素、TGFβ、c-fos、c-SRC和INT-1。
3.非致癌基因靶标
本发明并不限定于共同施用有效对抗其它致癌基因的寡核苷酸。例如，在一些实施方式中，被靶向的基因包括，但不限于，免疫球蛋白或抗体基因、凝血因子基因、蛋白酶、垂体激素、蛋白酶抑制剂、生长因子、生长调节素(somatomedian)、促性腺激素，趋化素、趋化因子、血浆蛋白、血浆蛋白酶抑制剂、白细胞介素、干扰素、细胞因子、转录因子或病原体靶标(例如，病毒基因、细菌基因、微生物基因、真菌基因)。
特定基因的实例包括，但不限于，ADAMTS4、ADAMTS5、APOA1、APOE、APP、B2M、COX2、CRP、DDX25、DMC1、FKBP8、GH1、GHR、IAPP、IFNA1、IFNG、IL1、Il10、IL12、IL13、IL2、IL4、IL7、IL8、IPW、MAPK14、Mei1、MMP13、MYD88、NDN、PACE4、PRNP、PSEN1、PSEN2、RAD51、RAD51C、SAP、SNRPN、TLR4、TLR9、TTR、UBE3A、VLA-4和PTP-1B、c-RAF、m-TOR、LDL、VLDL、ApoB-100、VEGF、rhPDGF-BB、NADs、ICAM-1、MUC1、2-dG、CTL、PSGL-1、E2F、NF-kB、HIF和GCPRs。
在其它实施方式中，靶向来自病原体的基因。示例性的病原体包括，但不限于，人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、涉及严重急性呼吸综合征的病原体、西尼罗河病毒和食源性病原体(例如，大肠杆菌)。
B.寡核苷酸设计
在一些实施方式中，本发明提供了用于调节致癌基因如BCL2的表达的抗基因寡核苷酸。如下描述了对于抗基因的示例性设计和产生策略。下面的描述并不意在限制适用于本发明中的抗基因化合物的范围且其它的抗基因在本发明的范围之内。
a.癌基因的调控区域
BCL2基因具有两个启动子，称为P1和P2。大多数BCL2mRNA从P1转录，其位于翻译起始位点上游约1.4kb，和P2是在P1下游的1.3kb。(见Seto,M.等EMBO J.7,123-131(1988))。P1富含GC，缺乏TATA盒，有许多转录起始位点和包括用于SP1转录因子的七个共有结合位点。P2包括CCAAT盒和TATA盒，和有两个不同的转录起始位点。P2内有多个NF-κB识别位点和SV40增强子样八聚体基序。(参见Heckman,C.A.等Oncogene 21,3898-3908(2002))(见SEQID NO：1254)。大多数人类滤泡性淋巴瘤包含3'-BCL2基因区域断点所造成的t(14；18)染色体易位。(见Tsujimoto,Y.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 84,1329-1331(1987))。这些易位将BCL2表达放置在免疫球蛋白重链(IgH)基因座增强子的控制下，导致BCL2表达的上调。可选地，存在着在某些DLCL淋巴瘤患者分离物中发现由与IgH基因座或两个不同的免疫球蛋白轻链(IgL)基因座融合而导致的5'-BCL2断点区域。(见Yonetani,N.等Jpn.J.Cancer Res.92,933-940(2001))。在单独的异质患者中已经将这些5'-BCL2断点映射于跨越翻译起始位点上游378至2312bp的区域。(见SEQ ID NO：1255-1266。)bcl-2周围的调控区域的重要性已由他人确认。例如，研究人员已经证明，BCL-2的P1和P2启动子之间的一系列的20个碱基缺失降低转录(Young和Korsmeyer Mol.Cell Biol 13:p3686-3697(1993)和Chen HM,Boxer LM.Mol Cell Biol.15:p.3840-3847(11995))；Miyashita等报道了BCL-2基因上游的p53依赖性区域作为负调节元件起作用(Cancer Res.54:p.3131-3135(1994))；和Duan等表明通过IgH 3'区域中的增强子对BCL-2转录的长范围调控作用(Oncogene 27:p.6720–6728(2008))。断点周围的区域可以是可用于BCL2寡核苷酸设计的序列。
b.寡核苷酸设计
寡核苷酸可以包括与BCL2基因的上游区域(定义为SEQ IDNO:1249和1254)杂交的任何低聚物。
在一些实施方式中，寡核苷酸是根据优选的设标准而设计的。随后可以使用本文公开的方法对这样的寡核苷酸的功效进行测试。例如，在一些实施方式中，寡核苷酸在至少一个、两种或所有CpG岛上被甲基化。在其它的实施方式中，寡核苷酸不包含甲基化。本发明并不限于特定的机制。事实上，对于机制的理解对于实施本发明不是必需的。尽管如此，可以设想，在一些实施方式中寡核苷酸是具有至少50％的GC含量和至少两个GC二核苷酸的那些。而且，在一些实施方式中，寡核苷酸不自身杂交。在进一步的实施方式中，寡核苷酸被设计成具有至少1个A或T以最小化自身杂交。而在进一步的实施方式中，可商购的计算机程序被用来调查寡核苷酸的自身杂交能力。而在其它的实施方式中，寡核苷酸是至少10个或15个核苷酸并且不超过100个核苷酸长度。在进一步的实施方式中，寡核苷酸是18-26个核苷酸长度。在另外的实施方式中，寡核苷酸包含通用蛋白结合序列CGCCC和CGCG或其互补序列。
在一些实施方式中，寡核苷酸与启动子的TATA盒上游的基因启动子区域杂交。在进一步的实施方式中，寡核苷酸被设计为与已知被蛋白质(例如，转录因子)结合的致癌基因启动子区域的区域杂交。在一些实施方式中，寡核苷酸化合物不是完全与人类基因组的其它区域同源。本发明的寡核苷酸化合物与基因组的其它区域的同源性可以使用可用的检索工具(例如，BLAST，可在NCBI的互联网网站获得)来测定。
本发明不限于本文所述的寡核苷酸。其它合适的寡核苷酸可被识别(例如，使用以上所述的标准或其它标准)。使用任何合适的方法可以测试候选寡核苷酸的功效。例如，候选寡核苷酸可评价其在各种浓度下防止细胞增殖的能力。在一些实施方式中，寡核苷酸在低浓度下抑制基因表达或细胞增殖(例如，体外分析中小于20μM或10μM)。
c.寡核苷酸区带
在一些实施方式中，致癌基因启动子区域内的区域被进一步定义为用于寡核苷酸杂交的区域。在一些实施方式中，这些区域被称为“热区”。
在一些实施方式中，热区基于被证明是有效的寡核苷酸化合物(见上面关于寡核苷酸的章节)和基于上述寡核苷酸标准被认为是有效的那些来定义。在一些实施方式中，热区包含被包括在各个热区内的每个化合物的上游和下游的10bp，和在各化合物的上游或下游进一步的40bp的增量内具有至少一个CG或更多。在进一步的实施方式中，热区涵盖被包括在热区中的每个寡核苷酸化合物的上游和下游的最多100bp。在另外的实施方式中，热区在各个启动子的开始区域定义。这些热区基于有效序列或设想序列定义且具有200bp的优选最大长度。根据上述标准，设计示例性热区。用于BCL2的热区位于SEQID NO:1249的碱基679-720、930-1050、1070-1280和1420-1760处。
d.描述
在一个方面，寡核苷酸可以是在生理条件下与以下序列杂交的任何低聚物：SEQ ID NO:1249或SEQ ID NO:1254。在另一个方面，该低聚物可以是与SEQ ID NO:1249的核苷酸500-2026、核苷酸500-1525、核苷酸800-1225、核苷酸900-1125、核苷酸950-1075或核苷酸970-1045或其互补序列杂交的任何低聚物。在另一个方面，所述寡核苷酸可以是在生理条件下与SEQ ID NO:1249中的示例性热区杂交的任何低聚物。低聚物的实例包括，但不限于SEQ ID NO:1250-1253和1267-1477中列出的那些低聚物和其互补序列。在另一个方面，所述寡核苷酸是SEQ ID NO:2-22、283-301、463-503、937-958、1082-1109、1250-1254和1270-1477或其互补序列。在这些方面的实施方式中，寡核苷酸的长度在15-35个碱基对。
在一个实施方式中，该低聚物可以是SEQ ID NO:1250、1251、1252、1253、1267-1477或其互补序列。在另一个实施方式中，该低聚物可以是SEQ ID NO:1250、1251、1267、1268、1276、1277、1285、1286或其互补序列。在再另一个实施方式中，该低聚物可以是SEQ IDNO:1250、1251、1289-1358或其互补序列。在再另一实施方式中，低聚物可以是SEQ ID NO：1250或1251。
在这些方面的进一步的实施方式中，该低聚物具有BCL2序列的正链的序列，并因此结合该序列的负链。
在其它方面，该低聚物可包括抗BCL2寡核苷酸的混合物。例如，该低聚物可以包括多个寡核苷酸，其各自与SEQ ID NO:1249和1254的不同部分杂交。低聚物可以与这些序列上的重叠区域杂交或低聚物区域可以与非重叠区域杂交。在其它的实施方式中，低聚物可以是SEQ ID NO:1250、1251、1252、1253、1267-1477或其互补序列，其中抗BCL2低聚物的混合物包含至少2种不同序列的低聚物。
在其它实施方式中，该低聚物可包括低聚物的混合物，其各自与不同基因的调控节区域杂交。例如，该低聚物可包括杂交于SEQ IDNO：1249或1254的第一低聚物和杂交于第二基因的调控区域的第二低聚物。在一些实施方式中，该低聚物包括SEQ ID NO:1250-1254和1267-1477或其互补序列的低聚物。在其它实施方式中，该低聚物包括SEQ ID NO：1250或1251或其互补序列和杂交于另一致癌基因如c-erb-2(her-2)、c-myc、TGF-α、c-Ha-ras和c-ki-Ras的启动子区域的低聚物。这类低聚物的实例可以被发现于，例如，7,524,827、7,807,647和7,498,315号美国专利。
在一些实施方式中，本发明提供了在特定位点被甲基化的寡核苷酸治疗剂。本发明并不限于特定的机制。事实上，对于机制的理解对于实施本发明不是必需的。尽管如此，可以设想，用于调节基因活性的一种机制是DNA中胞嘧啶残基的甲基化。5-甲基胞嘧啶(5-MeC)是在DNA中检测到的唯一天然存在的修饰碱基(Ehrlick等，Science212：1350-1357(1981))。虽然不是所有的基因都通过甲基化调节，在许多基因的特定位点或特定区域中的低甲基化与活跃的转录相关(Doerfler,Annu.Rev.Biochem.52:93-124[1984]；Christman,Curr.Top.Microbiol.Immunol.108:49-78[1988]；Cedar,Cell 34:5503-5513[1988])。体外DNA甲基化可以防止在无细胞系统中基因的有效转录或转染基因的瞬时表达。在一些特定的顺式调控区域中C残基的甲基化还可以阻断或增强转录因子或阻遏剂的结合(Doerfler，同上；Christman，同上；Cedar,Cell 34:5503-5513(1988)；Tate等,Curr.Opin.Genet.Dev.3:225-231[1993]；Christman等,Virus Strategies,eds.Doerfler,W.&Bohm,P.(VCH,Weinheim,N.Y.)pp.319-333[1993])。
破坏DNA甲基化的正常模式已与癌症的发生相关联(Christman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7347-7351[1995])。来自肿瘤的DNA和肿瘤衍生细胞系的DNA的5-MeC含量通常比正常组织低(Jones等，Adv.Cancer Res 40:1-30[1983])。在多种人类和动物肿瘤中已经检测到特定致癌基因如c-myc、c-ki-ras和c-Ha-ras的低甲基化(Nambu等，Jpn.J.Cancer(Gann)78:696-704[1987]；Feinberg等,Biochem.Biophys.Res.Commun.111:47-54[1983]；Cheah等,JNCI73:1057-1063[1984]；Bhave等,Carcinogenesis(Lond)9:343-348[1988]。在人类肿瘤进展的一种最充分研究的实例中，已经证明DNA的低甲基化是在结肠癌发生中的早期事件(Goetz等，Science 228：187-290[1985])。体内甲基化的干扰可导致肿瘤的形成。已经报道，喂饲甲基化抑制剂例如L-甲硫氨酸或5-氮杂胞苷或者通过喂饲缺乏lipotropes的饮食导致的5-腺苷甲硫氨酸严重缺乏诱导大鼠中肝脏肿瘤的形成(Wainfan等，Cancer Res 52：2071s-2077s(1992))。研究表明，极端lipotrope不足的饮食可引起在基因如c-myc、ras和c-fos的特定位点中甲基基团的损失(Dizik等，Carcinogenesis 12:1307-1312[1991])。发生低甲基化，尽管存在升高水平的DNA MT酶活性(Wainfan等，Cancer Res 49：4094-4097[1989])。，持续活跃增殖所需要的基因在分化期间由于甲基化变得失活，而组织特异性基因变得低甲基化和活跃。然后低甲基化可以将平衡在两种状态之间转换。在一些实施方式中，本发明因此利用了这种自然发生现象以提供用于特定基因启动子的位点特异性甲基化的组合物和方法，由此阻止某些基因的转录且因此阻止其翻译。在其它的实施方式中，本发明提供的方法和组合物用于通过改变基因的甲基化模式上调目标基因(例如，肿瘤抑制基因)的表达。
出现了哺乳动物细胞启动子区域由CpG岛所包围和这些非甲基化区域有助于基因调控的理解(Blackledge NP,Klose RJ(2011)Epigenetics 6:p.147-152和Deaton AM,Bird A(2011)Genes Dev.25:p.1010-1022)。这些启动子周围的基因组区域是DNA酶I-超敏感性的，也使得能够发现作为调节基因表达的转录因子、增强子、沉默子、阻遏剂或控制区域的顺式调控元件(Thurman RE,Rynes E,Humbert R,Vierstra H,Maurano MT(2012)Nature 489:75-82；Maston等.Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.2006.7:29–59；Sabo PJ,Kuehn MS,Thurman R,Johnson,BE,Johnson,BE等(2006)Nat Methods 3:p.511-8)。此外，致癌基因启动子区域周围的高阶二级结构(四链体形，十字形或I-基序)也可以用作顺式调控结构域来调节转录(BrazdaV,Laister RC,Jagelska EB,Arrowsmith,C(2011)BMC Mol Biol 12:p.33-48and Kendrick,S.和L.H.Hurley,Pure Appl Chem,2010.82(8):p.1609-1621)。在其它的实施方式中，本发明提供的方法和组合物可杂交或结合于低甲基化或未甲基化的富含CG的区域(CpG岛)。
本发明并不局限于使用甲基化的寡核苷酸。事实上，使用非甲基化的寡核苷酸用于基因表达的调节是本发明所特别考虑的。本发明的开发过程中进行的实验证明，靶向BCL2的未甲基化的寡核苷酸将淋巴瘤细胞的生长抑制在类似于甲基化的寡核苷酸的水平。
SEQ ID NO:1250和1251都被包括在如下使用的术语PNT-100的范围内。PNT100是24个碱基的DNA寡核苷酸序列，其被设计为靶向已知驱动特定淋巴瘤的t(14,18)易位中发现的区域。随后的实例使用未甲基化形式，但术语PNT-100包含甲基化形式在内。
C.寡核苷酸的制备和制剂
寡核苷酸合成的任何已知方法可以用于制备本发明的修饰的寡核苷酸。在一些利用甲基化寡核苷酸的实施方式中，核苷酸dC在适宜情况下被5-甲基-dC所替换，如本发明所教导的。本发明的修饰的或未修饰的寡核苷酸最方便地通过使用任何可商购的自动核酸合成仪来制备。它们也可以从按照客户的要求合成定制的寡核苷酸的商业来源获得。
尽管寡核苷酸是化合物的一种形式，本发明包含其它寡聚的寡核苷酸化合物，包括但不限于如下所述的寡核苷酸模拟物。根据本发明的寡核苷酸化合物通常包含从约18至约30个核碱基(即，从约18至约30个连接的碱基)，尽管使用本发明可以发现更长和更短的序列。
关于本发明中有用的化合物的具体实例包括含有修饰的骨架或非天然核苷间键的寡核苷酸。如在本说明书中定义的，具有修饰的骨架的寡核苷酸包括在骨架中保留了磷原子的和那些在骨架中不具有磷原子的那些。为了本说明书的目的，在核苷间骨架中不具有磷原子的修饰的寡核苷酸也可被认为是寡核苷。
修饰的寡核苷酸骨架包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它的烷基膦酸酯包括3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、亚膦酸酯、氨基磷酸酯包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸脂，硫羰基烷基磷酸三酯和boranophosphate，其具有正常的3'-5'的连接，它们的2'-5'连接的类似物，以及具有反向极性的那些，其中相邻对的核苷单元连接3-'5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'。各种盐、混合盐和游离酸形式也包括在内。
在一些实施方式中，寡核苷酸具有硫代磷酸酯主链，其具有以下的一般结构。
其中不包括磷原子的修饰的寡核苷酸骨架具有通过短链烷基或环烷基核苷间连接、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间连接或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间连接形成的骨架。它们包括那些具有吗啉代连接(部分地由核苷的糖部分形成)的骨架；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；formacetyl和thioformacetyl骨架；亚甲基formacetyl和thioformacetyl骨架；含烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚胺和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架以及其它具有混合的N、O、S和CH2构成部分的骨架。
在其它的寡核苷酸模拟物中，核苷酸单元的糖和核苷间连接(即骨架)被替换为新的基团。碱基部分保持用于与适当的核酸靶标化合物杂交。一种此类寡聚化合物被称为肽核酸(PNA)，它是已经显示具有极好的杂交特性的寡核苷酸模拟物。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖-骨架由含酰胺的骨架(具体而言是氨基乙基甘氨酸骨架)替换。核碱基被保留并直接或间接与骨架酰胺部分的氮杂氮原子结合。教导了PNA化合物制备的代表性专利包括但不限于美国专利5,539,082；5,714,331和5,719,262号，每项专利在文中引用作为参考。可在Nielsen等人，Science 254:1497(1991)和Neilsen,Methods inEnzymology,313,156-164(1999)中找到PNA化合物的进一步教导。PNA化合物可以商购获得，例如，购自Applied Biosystems(Foster City,CA,USA)。
在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸是具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸和具有杂原子骨架的寡核苷，且特别是-CH2、-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-[称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨架]、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2和上面提到的5,489,677号美国专利中的-O-N(CH3)-CH2-CH2-[其中天然的磷酸二酯骨架被表示为-O-P-O-CH2-]，以及上述引用的5,602,240号美国专利的酰胺骨架。具有上面参考的5,034,506号美国专利的吗啉代骨架结构的寡核苷酸也是示例性的。
寡核苷酸也可以具有核糖和脱氧核糖以外的糖，包括阿拉伯呋喃糖(描述于国际公开号WO 99/67378中，其在此通过引用并入)、木糖阿拉伯呋喃糖(xyloarabinofuranose)(描述于6,316,612和6,489465号美国专利中，在此通过引用并入)、α-苏式呋喃糖(threofuranose)(等.(2000)Science,290,1347-51，其在此引入作为参考)和L-呋喃核糖。糖模拟物可以取代核苷酸中的糖。它们包括环己烯(Wang等(2000)J.Am.Chem.Soc.122,8595-8602；Vebeure等Nucl.Acids Res.(2001)29,4941-4947，其通过引用并入本文)、三环基团(Steffens等J.Am.Chem.Soc.(1997)119,11548-11549，其在此通过引用并入)、环丁基、己糖醇基(Maurinsh，等(1997)J.Org.Chem,62,2861-71；J.Am.Chem.Soc.(1998)120,5381-94，其通过引用并入本文)、阿卓糖醇基(Allart等，Tetrahedron(1999)6527-46，其在此通过引用并入)、吡咯烷基(Scharer等J.Am.Chem.Soc.,117,6623-24，其在此通过引用并入)、通过用亚甲基基团替代呋喃糖环的氧而得到的碳环基团(Froehler和Ricca J.Am.Chem.Soc.114,8230-32，其在此引入作为参考)或用S替代以获得4'-硫代呋喃糖(Hancock等，Nucl.Acids Res.21,3485-91，其在此引入作为参考)，和/或吗啉代基团(Heasman，(2002)Dev.Biol.,243,209-214，其在此通过引用并入)代替呋喃戊糖基糖。吗啉代寡核苷酸购自Gene Tools,LLC(CorvallisOregon,USA)。
寡核苷酸还可以包括“锁核酸”或LNA。所述的LNA可以是双环、三环或多环的。LNA包括多种不同的单体，其中一个在式I中描述。
其中
B代表核碱基；
Z*选自于核苷间连接和末端基团；
Z选自于与在前核苷酸/核苷和末端基团的核苷间连接的键，条件是仅Z和Z*中的一个可以是末端基团；
X和Y独立地选自-O-、-S-、-N(H)-、-N(R)-、-CH2-或-C(H)＝、CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-N(H)-、-CH2-N(R)-、-CH2-CH2-或-CH2-C(H)＝、-CH＝CH-；条件是X和Y不同时是O。
除了在式I(a[2,2,1]双环核苷)中所描述的LNA[2'-Y，4'-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖基]单体，LNA核苷酸还可以包括具有其它呋喃糖或其它5或6元环和/或具有不同的单体配方的“锁核酸”，(包括2'-Y，3'连接的和3'-Y，4'连接的，1'-Y，3连接的，1'-Y，4'连接的，3'-Y，5'连接的，2'-Y，5连接的，1'-Y，2'连接的双环核苷等。所有上述的LNA可以用不同的手性中心获得，导致例如LNA[3'-Y-4'-C-亚甲基(或亚乙基)-β(或α)-阿拉伯糖-，木糖-或L-核糖-呋喃糖基]单体。LNA寡核苷酸和LNA核苷酸一般地被描述于国际公开号WO99/14226和随后的申请；国际公开号WO 00/56746、WO 00/56748、WO 00/66604、WO 01/25248、WO 02/28875、WO 02/094250、WO03/006475；美国专利6,043,060、6268490、6770748、6639051号和美国公开号2002/0125241、2003/0105309、2003/0125241、2002/0147332、2004/0244840和2005/0203042中，其全部在此通过引用引入。LNA寡核苷酸和LNA类似物寡核苷酸可购自，例如，ProligoLLC，6200Lookout Road,Boulder,CO 80301USA。
寡核苷酸还可以含有一个或多个取代的糖部分。寡核苷酸可以在2'糖位置包含以下之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基、O-[(CH2)nO]mCH3，O(CH2)nOCH3，O-(CH2)nNH2，O(CH2)nCH3，O(CH2)nONH2，和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m是从1到约10。然而，其它的寡核苷酸在2'位置包含以下之一：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、嵌入剂、用于改进寡核苷酸的药代动力学特性的基团或改进寡核苷酸药效学性质的基团及其它具有类似性质的取代基。一种修饰包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O-CH2CH2OCH3，也被称为2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin等，Helv.Chim.Acta 78:486[1995])，即，烷氧烷氧基。进一步的修饰包括2'-二甲基氨基氧基乙氧基(即，O(CH2)2ON(CH3)2基团)，也被称为2'-DMAOE，及2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(本领域还称为2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，即2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2。
其它的修饰包括2'-甲氧基(2'-O-CH3)、2'-氨基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)和2'-氟代(2'-F)。类似的修饰也可以在寡核苷酸的其它位置上进行，特别是3'末端核苷酸上或在2'-5'连接的寡核苷酸中糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置。寡核苷酸也可以具有糖模拟物，如环丁基部分取代呋喃戊糖基糖。
寡核苷酸还可包括核碱基(本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用的“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其它合成的和天然的核碱基，例如5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-丙炔-6-氟尿嘧啶、5-甲基噻唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷，二氨基嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、7-脱氮杂腺嘌呤、3-脱氮杂鸟嘌呤、3-脱氮杂腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、7-丙炔基-7-脱氮杂腺嘌呤、7-丙炔基-7-脱氮杂鸟嘌呤、2-氯-6-氨基嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、吖丙啶基胞嘧啶、5-(羧基羟基-甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶，5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤及腺嘌呤和鸟嘌呤的其它烷基衍生物、2-丙基腺嘌呤及腺嘌呤和鸟嘌呤的其它烷基衍生物、2-氨基腺嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-三氟甲基尿嘧啶和胞嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、Q核苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-硫胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。进一步的核碱基包括那些在3,687,808号美国专利中所公开的。这些核碱基中的某些特别可用于提高本发明的寡聚化合物的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶及N-2,N-6和O-6取代的嘌呤、其中包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已显示出增加核酸双链体的稳定性-0.6-1.2℃。当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时这些是特别有效的。
本发明的寡核苷酸的另一种修饰涉及与寡核苷酸化学连接的一个或多个部分或偶联物，其增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞对寡核苷酸的摄取。此类部分包括但不限于脂质部分如胆固醇部分、胆酸、硫醚，(例如，己基-S-三苯甲基硫醇)、巯基胆固醇、脂族链，(例如，十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂，(例如，二-十六烷基-消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-消旋-甘油基-3-H-膦酸酯)，聚胺或聚乙二醇链或金刚烷乙酸、棕榈基部分或十八胺或己胺基-羰基-羟胆固醇部分。
相关领域的技术人员熟知如何产生含有上述修饰的寡核苷酸。本发明不限于上述的寡核苷酸。任何合适的修饰或取代都可以使用。
没有必要在给定化合物中的所有位置被一致地修饰，而事实上多于一种前述的修饰可以被引入单个化合物或甚至寡核苷酸内的单一核苷中。本发明还包括其中包括如下所述的本发明的低聚化合物的药物组合物和制剂。
D.寡核苷酸混合物
在一些实施方式中，本发明提供了包含两种或更多种针对基因(例如，致癌基因)的调控区域的寡核苷酸的混合物。在一些实施方式中，该两种或更多种寡核苷酸杂交于相同基因的调控区域的不同区域。在其它的实施方式中，该两种或更多种寡核苷酸杂交于两个不同基因的调控区域。本发明并不限于特定的机制。事实上，对于机制的理解对于实施本发明不是必需的。尽管如此，可以设想，本发明的两种或更多种化合物的组合提供了癌细胞生长的抑制，其大于各化合物单独施用的抑制的累加。
E.SEQID的索引
SEQ ID NO：1249  BCL2上游区域
SEQ ID NO：1250  PNT-100寡核苷酸，甲基化的
SEQ ID NO：1251  PNT-100寡核苷酸，未甲化基的
SEQ ID NO：1252  抗BCL2寡核苷酸，甲基化的
SEQ ID NO：1253  抗BCL2寡核苷酸，未甲化基的
SEQ ID NO：1254  BCL2次级启动子序列
SEQ ID NO：1255-1266    BCL2序列
SEQ ID NO：1250-1254    抗BCL2寡核苷酸
和1267-1477
和1289-1358
SEQ ID NO：1448-1461    BCL2对照寡核苷酸
G.其它的癌症疗法
本发明可以用来测试受试化合物作为化疗剂下调患有BCL2介导的癌症的受试者中BCL2水平的有效性。
术语“受试化合物”和“候选化合物”指任何化学实体、药剂、药物等，其作为用于治疗或预防身体功能的疾病、不适、病症或紊乱(例如，癌症)的候选物。受试化合物包括已知的和潜在的治疗化合物。通过使用本发明的筛选方法进行筛选，受试化合物可以被确定为是治疗性的。在本发明的一些实施方式中，受试化合物包括反义化合物。
a.化疗药剂
本发明的化疗剂可以包括任何合适的化疗药物或化疗药物的组合(例如，混合物)。示例性的化疗剂包括，但不限于，烷基化剂、铂类、抗代谢物、蒽环类、紫杉烷类、喜树碱类、亚硝基脲类、EGFR抑制剂、抗生素类、HER2/neu抑制剂、BRAF抑制剂、NRAS或RAS抑制剂、血管生成抑制剂、激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、免疫疗法、激素疗法、光动力疗法、癌症疫苗、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、鞘脂调节剂、低聚物、其它未分类的化疗药物和它们的组合。
化疗剂可包括上述两种或更多种化疗药物的混合物。在一些实施方式中，化疗剂是包括两种或更多种烷基化剂、铂类、抗代谢物、蒽环类、紫杉烷类、喜树碱类、亚硝基脲类、EGFR抑制剂、抗生素类、HER2/neu抑制剂、血管生成抑制剂、激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、免疫疗法、激素疗法、光动力疗法、癌症疫苗、鞘脂调节剂、低聚物或它们的组合的混合物。
1.烷基化剂
烷基化剂是被认为攻击DNA上的带负电荷的位点(例如，氧、氮、磷和硫原子)和结合DNA从而改变复制、转录和甚至碱基配对的化疗剂。也据信DNA的烷基化也导致DNA链断裂和DNA链交联。通过以这种方式改变DNA，细胞活动被有效地停止，且癌细胞会死亡。普通烷基化试剂包括，但不限于，甲苄肼、异环磷酰胺、环磷酰胺、苯达莫司汀、美法仑、苯丁酸氮芥、达卡巴嗪、白消安、噻替派等。注射达卡巴嗪指示治疗转移性恶性黑色素瘤。此外，达卡巴嗪的注射还指示在与其它有效的药剂组合使用时作为二线治疗用于霍奇金病。烷基化剂，例如上述的那些，可以与一种或多种其它的烷基化剂和/或与一种或多种不同种类的化疗剂结合使用。
2.铂类
铂化疗剂被认为通过交联的DNA亚单位抑制DNA合成、转录和功能。(交联可以发生在两条链之间或DNA的一条链内。)普通的铂化疗剂包括，但不限于，顺铂、卡铂、奥沙利铂、乐沙定TM等。铂化疗剂，例如上述的那些，可以与一种或多种其它铂类和/或与一种或多种不同种类的化疗剂结合使用。
3.抗代谢物
抗代谢物化疗剂被认为干扰正常的代谢途径，包括形成新的DNA需要的那些代谢途径。常见的抗代谢物包括但不限于，甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶(例如，卡培他滨)、吉西他滨(2′-脱氧-2′,2′-二氟胞苷单盐酸盐(β-异构体),Eli Lilly)、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、氟达拉滨、克拉屈滨、阿糖胞苷、替加氟、雷替曲塞、胞嘧啶阿拉伯糖苷等。硝酸镓是另一种抑制核糖核苷酸还原酶的抗代谢物。抗代谢物，如上述的那些，可以与一种或多种其它抗代谢物和/或与一种或多种不同种类的化疗剂结合使用。
4.蒽环类
蒽环类被认为促进游离氧自由基的形成。这些自由基导致DNA链断裂和DNA合成和功能的后续抑制。蒽环类也被认为通过与酶和DNA形成复合体而抑制拓扑异构酶。常见蒽环类包括但不限于，柔红霉素、阿霉素、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌、亚德利亚霉素、博莱霉素、丝裂霉素-C、更生霉素、光神霉素等。蒽环类，例如上述的那些，可以与一种或多种其它蒽环类和/或与一种或多种不同种类的化疗剂结合使用。
5.紫杉烷类
紫杉烷类被认为在细胞周期的M期中以高亲和力与微管结合并抑制其正常功能。常见的紫杉烷包括但不限于，紫杉醇、多西紫杉醇(TaxotereTM)、TaxolTM、taxasm、7-表紫杉醇、t-乙酰基紫杉醇、10-脱乙酰基-紫杉醇、10-脱乙酰基-7-表紫杉醇、7-木糖基紫杉醇、10-去乙酰基-7-表紫杉醇、7-N-N-二甲基甘氨酰紫杉醇、7-L-丙氨酰紫杉醇等。紫杉烷类，如上述的那些，可以与一种或多种其它的紫杉烷类和/或与一种或多种不同种类的化疗剂结合使用。
例如，泰索帝(TaxotereTM)指示用于治疗之前化疗失败后的噪患局部晚期或转移性乳腺癌的患者；其与阿霉素和环磷酰胺组合指示用于患有可手术的淋巴结阳性乳腺癌患者的辅助治疗；作为单一药剂，指示用于在之前基于铂的化疗失败后治疗患有局部晚期或转移性非小细胞肺癌(NSCLC)的患者；与顺铂组合指示用于治疗以前没有接受过对于NSCLC的化疗的患有不可切除的、局部晚期或者转移性NSCLC的患者；与强的松结合指示用于治疗患有雄激素非依赖性(激素难治的)转移性前列腺癌的患者；与顺铂和氟尿嘧啶结合指示用于治疗患有晚期胃癌(包括胃食管交界处的腺癌)的未曾接受过晚期疾病化疗的患者；和与顺铂和氟尿嘧啶结合指示用于患有局部晚期头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)的患者的诱导治疗。
6.喜树碱类
喜树碱被认为与拓扑异构酶和DNA复合从而导致这种酶功能的抑制。进一步认为拓扑异构酶的存在是持续的DNA合成需要的。常见的喜树碱类包括但不限于伊立替康、托泊替康、依托泊苷、长春花生物碱(例如，长春新碱、长春碱或长春瑞滨)、安吖啶、替尼泊苷等。喜树碱类，如上所述的那些，可以与一种或多种其它喜树碱类和/或与一种或多种不同种类的化疗剂结合使用。
7.亚硝基脲类
亚硝基脲类被认为抑制DNA修复所必需的变化。常见的亚硝基脲类包括但不限于，卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀等。亚硝基脲类，如上所述的那些，可以与一种或多种其它的亚硝基脲类和/或与一种或多种不同种类的化疗剂结合使用。
8.EGFR抑制剂
EGFR(即，表皮生长因子受体)抑制剂被认为抑制EGFR和干扰包括细胞增殖和分化的细胞反应。EGFR抑制剂包括抑制一种或多种EGFR的功能或产生的分子。它们包括EGFR的小分子抑制剂、EGFR的抗体、反义低聚物、RNAi抑制剂和降低EGFR表达的其它低聚物。常见的EGFR抑制剂包括，但不限于，吉非替尼、埃罗替尼()、西妥昔单抗(ErbituxTM)、帕尼单抗(，Amgen)、拉帕替尼(GlaxoSmithKline)、CI1033或PD183805或canternib(6-丙烯酰胺-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺，Pfizer)等。其它抑制剂包括PKI-166(4-[(1R)-1-苯基乙基氨基]-6-(4-羟基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶，Novartis)、CL-387785(N-[4-(3-溴苯胺基)喹唑啉-6-基]丁-2-炔酰胺)、EKB-569(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-3-氰基-6-(4-二甲基氨基丁2(E)-烯酰胺基)-7-乙氧基喹啉，Wyeth)、拉帕替尼(GW2016，GlaxoSmithKline)、EKB509(Wyeth)、帕尼单抗(ABX-EGF，Abgenix)，马妥珠单抗(EMD 72000，Merck)和单克隆抗体RH3(New York Medical)。EGFR抑制剂,如上所述的那些,可以与一种或多种其它的EGFR抑制剂和/或与一种或多种不同种类的化疗剂结合使用。
9.抗生素
抗生素被认为促进了游离氧自由基的形成，其引起导致癌细胞死亡的DNA断裂。常见的抗生素包括但不限于，博莱霉素和雷帕霉素等。大环内酯杀真菌剂雷帕霉素(也称为RAP、雷帕鸣和西罗莫司)在细胞内结合于免疫亲和素FK506结合蛋白12(FKBP12)，且所得复合物抑制雷帕霉素哺乳动物靶标(mTOR)的丝氨酸蛋白激酶活性。雷帕霉素大环内酯包括雷帕霉素的天然存在形式以及靶向和抑制mTOR的雷帕霉素类似物和衍生物。其它雷帕霉素大环内酯类包括，但不限于，坦西莫司(CCI-779，Wyeth)、依维莫司和ABT-578。抗生素，如上所述的那些，可以与一种或多种其它的抗生素和/或与一种或多种不同种类的化疗剂结合使用。
10.HER2/neu抑制剂
HER2/neu抑制剂被认为阻断HER2受体和防止肿瘤存活所需要的反应级联。Her2抑制剂包括抑制Her2的功能或产生的分子。它们包括Her2的小分子抑制剂、Her2的抗体、反义低聚物、RNAi抑制剂和降低酪氨酸激酶表达的其它低聚物。常见的HER2/neu抑制剂包括，但不限于曲妥珠单抗(，Genentech)等。其它的Her2/neu抑制剂包括双特异性抗体MDX-210(FCγR1-Her2/neu)和MDX-447(Medarex)、培妥珠单抗(rhuMAb 2C4，Genentech)，HER2/neu抑制剂，如以上所述的那些，可以与一种或多种其它的HER2/neu抑制剂和/或与一种或多种不同种类的化疗剂结合使用。
11.血管生成抑制剂
血管生成抑制剂被认为抑制血管内皮细胞生长因子，即VEGF，从而抑制肿瘤存活所必需的新血管的形成。VEGF抑制剂包括抑制一种或多种VEGF的功能或产生的分子。它们包括VEGF的小分子抑制剂、VEGF的抗体、反义低聚物、RNAi抑制剂和降低酪氨酸激酶表达的其它低聚物。常见的血管生成抑制剂包括但不限于贝伐单抗(，Genentech)。其它血管生成抑制剂包括，但不限于，ZD6474(AstraZeneca)、BAY-43-9006、索拉非尼(、Bayer)、司马沙尼(SU5416，Pharmacia)、SU6668(Pharmacia)、ZD4190(N-(4-溴-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[2-(1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基]喹唑啉-4-胺，Astra Zeneca)、ZactimaTM(ZD6474，N-(4-溴2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[2-(1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基]喹唑啉-4-胺，Astra Zeneca)、伐他拉尼(PTK787，Novartis)、单克隆抗体IMC-1C11(Imclone)等。血管生成抑制剂，如以上所述的那些，可以与一种或多种其它的血管生成抑制剂和/或与一种或多种不同种类的化疗剂结合使用。
12.BRAF抑制剂
B-Raf(BRAF)变体，BRAF V600E，是已知的最常见的致癌蛋白激酶突变。激活BRAF V600E的有效的和选择性的抑制剂的选择已经导致了显示出BRAF激酶特异性和针对携带BRAF V600E突变的细胞的细胞毒性作用的多种药剂。特别是，Plexxikon试剂，PLX4720，报告为在BRAF V600E中而非在BRAF野生型肿瘤细胞中显示特定ERK磷酸化。在黑色素瘤模型中，PLX4720诱导细胞周期阻滞和B-RafV600E阳性细胞的凋亡。Plexxikon试剂，维罗非尼(PLX4032)，另一B-Raf V600E特异性药剂，在患有具有BRAF V600E的转移性黑色素瘤的人类中进行了测试。观察到对于提高整体生存率和无进展生存的显著的治疗效果。
如上所述，尽管大多数(约90％)的突变是由在密码子600处谷氨酸置换缬氨酸(BRAF V600E)组成的，其它的活化突变是已知的，如BRAF V600K和BRAF V600R。
BRAF V600E和“野生型”BRAF与许多癌症关联，包括例如，非霍奇金淋巴瘤、白血病、恶性黑色素瘤、甲状腺癌、结肠直肠癌和腺癌及NSCLC。
可以在本发明的实施方式中使用的其它BRAF抑制剂可以包括但不限于，GDC-0879、BAY 7304506(瑞格非尼)、RAF265(CHIR-265)、SB590885、索拉非尼。
13.其它激酶抑制剂
除了EGFR、HER2、BRAF和VEGF抑制剂外，其它激酶抑制剂也用作化疗剂。极光(Aurora)激酶抑制剂包括，但不限于，化合物如4-(4-N-苯甲酰基氨基)苯胺)-6-甲氧基(methyxy)-7-(3-(1-吗啉代)丙氧基)喹唑啉(ZM447439，Ditchfield等，J.Cell.Biol.,161:267-80(2003))和hesperadin(Haaf等，J.Cell Biol.,161:281-94(2003))。适合用作极光激酶抑制剂的其它化合物在被描述于Vankayalapati H等，Mol.Cancer Ther.2:283-9(2003)k。SRC/Abl激酶抑制剂包括但不限于，AZD0530(4-(6-氯-2,3-亚甲基二氧苯胺基)-7-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]-5-四氢呋喃(tetrahycropyran)-4-基氧基喹唑啉)。酪氨酸激酶抑制剂包括抑制一种或多种酪氨酸激酶的功能或产生的分子。它们包括酪氨酸激酶的小分子抑制剂、酪氨酸激酶的抗体和反义低聚物、RNAi抑制剂和降低酪氨酸激酶表达的其它低聚物。CEP-701和CEP-751(瑟法隆)作为酪氨酸激酶抑制剂起作用。伊马替尼甲磺酸酯是一种酪氨酸激酶抑制剂，其通过结合bcr-abl的ATP结合位点和竞争性地抑制蛋白质的酶活性来抑制bcr-abl。虽然伊马替尼对于bcr-abl是高选择性的，但是它也抑制其它靶标，如c-kit和PDGF-R。FLT-3抑制剂包括，但不限于，坦度替尼(tandutinib)(MLN518，Millenium)、索坦(SU11248，5-[5-氟-2-氧代-1,2-二氢吲哚-(3Z)-亚基甲基(ylidenemethyl)]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-二乙基氨基乙基]酰胺，Pfizer)、米哚妥林(4'-N-苯甲酰基星孢菌素，Novartis)，来氟米特(lefunomide)(SU101)等。MEK抑制剂包括，但不限于，2-(2-氯-4-碘-苯基氨基)-N-环丙基甲氧基-3,4-二氟-苯甲酰胺(PD184352/CI-1044，Pfizer)、PD198306(Pfizer)、PD98059(2'-氨基-3'-甲氧基黄酮)、UO126(Promega)、来自发酵的微生物提取物的Ro092-210(Roche)、二羟基苯甲酸内酯、L783277(也分离自微生物提取物)(Merck)等。酪氨酸激酶抑制剂，如以上所述的那些，可以与一种或多种其它的酪氨酸激酶抑制剂和/或与一种或多种不同种类的化疗剂(包括，但不限于磷脂酰肌醇-3激酶抑制剂、Bruton酪氨酸激酶抑制剂和脾酪氨酸激酶(也称为中Syk蛋白(由SYK基因编码))抑制剂)结合使用。
14.蛋白酶体(proteosome)抑制剂
蛋白酶体抑制剂被认为抑制已被标记用于破坏的这些蛋白质中一些的降解。这导致细胞的生长停滞或死亡。常见的蛋白酶体抑制剂包括，但不限于，硼替佐米、ortezomib、卡非佐米等。蛋白酶体抑制剂，如以上所述的那些，可以与一种或多种其它的蛋白酶体抑制剂和/或与一种或多种不同种类的化疗剂结合使用。
15.免疫疗法
免疫疗法被认为结合并阻断特定靶标，从而破坏肿瘤细胞增殖所需要的事件链。常见的免疫疗法包括，但不限于，利妥昔单抗和抗CD19、CD20、CD38的其它抗体，Campath-1HTM和抗CD-50的其它抗体，依帕珠单抗和抗CD-22的其它抗体，加利昔单抗和抗CD-80的其它抗体，阿泊珠单抗HU1D10和抗HLA-DR的其它抗体，等等。放射性同位素可以与抗体偶联，从而导致放射免疫治疗。两种这样的抗CD20产品是托西莫单抗(BexxarTM)和替伊莫单抗(ZevalinTM)。免疫疗法，如以上所述的那些，可以与一种或多种其它的免疫疗法和/或与一种或多种不同种类的化疗剂结合使用。结合或阻断CD38、CD19和CD20的抗体或组合物及刺激T细胞介导的杀伤的抗体如PD-1。
利妥昔单抗(RituxanTM)，在其它的适应症中，特别指示用于治疗患有先前未治疗的滤泡性CD20阳性、B细胞非霍奇金淋巴瘤的患者；及与氟达拉滨和环磷酰胺(FC)结合用于治疗先前未治疗的和先前治疗的CD20阳性的慢性淋巴细胞白血病。
YervoyTM(易普利姆玛)是阻断被称为细胞毒性T淋巴细胞抗原或CTLA-4的分子的单克隆抗体。CTLA-4可以在减缓或关闭身体的免疫系统中起作用，从而影响其对抗癌性细胞的能力。Yervoy可以通过使身体的免疫系统识别、靶向和攻击黑色素瘤中的细胞而发挥作用。该药物静脉内施用。Yervoy指示用于治疗不能手术切除的或转移性的黑色素瘤。每3周静脉内施用Yervoy(3mg/kg)超过90分钟，共四个剂量。已经用Yervoy进行了两个关键的临床试验。得到FDA批准的第一个临床试验在676名黑色素瘤患者的单一国际研究中基于Yervoy的安全性和有效性。在研究中的所有患者均停止对于黑色素瘤的其它FDA批准的或常用的治疗方法的反应。此外，有疾病的参与者已经扩散或无法手术切除。
可以在本发明的实施方式中使用的其它的CTLA-4抗体包括但不限于替西木单抗(tremelimumab)。
16.激素疗法
激素疗法被认为阻断细胞受体、抑制体内激素的产生和/或消除或改变细胞上的激素受体，其全部具有减缓或停止肿瘤增殖的最终结果。常见的激素疗法包括，但不限于，抗雌激素(例如，他莫昔芬、托瑞米芬、氟维司群、雷洛昔芬、屈洛昔芬，碘昔芬等)、孕激素(如醋酸甲地孕酮等)、芳香酶抑制剂(例如，阿那曲唑、来曲唑、依西美坦、伏氯唑、依西美坦、法倔唑、氨鲁米特、依西美坦、1-甲基-1,4-雄二烯-3,17-二酮等)、抗雄激素(例如，比卡鲁胺(bicalutimide)、尼鲁米特、氟他胺、醋酸环丙孕酮等)、促黄体激素释放激素激动剂(LHRH激动剂)(例如，戈舍瑞林、亮丙瑞林、布舍瑞林等)；5-α还原酶抑制剂如非那雄胺等。
阿比特龙(ZytigaTM)是另一种有用的激素疗法，其在睾丸、前列腺和肾上腺癌组织中抑制酶17α羟化酶/C17,20裂解酶，从而阻断睾酮前体的合成。激素疗法，如以上所述的那些，可以与一种或多种其它的激素疗法和/或与一种或多种不同种类的化疗剂结合使用。
17.光动力疗法
光动力疗法将光敏药物暴露于特定波长的光来杀死癌细胞。常见的光动力学疗法包括例如卟吩姆钠(例如，)等。光动力疗法，如以上所述的那些，可以与一种或多种其它的光动力学疗法和/或与一种或多种不同种类的化疗剂结合使用。
18.癌症疫苗
癌症疫苗被认为利用整体的、灭活的肿瘤细胞、全蛋白、肽片段、病毒载体等以产生靶向癌细胞的免疫反应。常见的癌症疫苗包括但不限于，修饰的肿瘤细胞、肽疫苗、树突疫苗(dendritic vaccine)、病毒载体疫苗、热休克蛋白疫苗等。
19.组蛋白去乙酰化酶抑制剂
组蛋白去乙酰化酶抑制剂能够调节转录活性，且因此能阻断血管发生和细胞周期及促进细胞凋亡和分化。组蛋白去乙酰化酶抑制剂包括，但不限于，SAHA(辛二酰苯胺异羟肟酸)、缩酚酸肽(FK288)和类似物、PivanexTM(Titan)、CI994(Pfizer)、MS275PXD101(CuraGen，TopoTarget)MGCD0103(MethylGene)、LBH589、NVP-LAQ824(Novartis)等，并已用作化疗剂。组蛋白去乙酰化酶抑制剂，如以上所述的那些，可以与一种或多种其它的组蛋白去乙酰化酶抑制剂和/或与一种或多种不同种类的化疗剂结合使用。
20.鞘脂调节剂
鞘脂代谢调节剂已显示诱导细胞凋亡。综述参见N.S.Radin,Biochem J,371:243-56(2003)；D.E.Modrak等,Mol.Cancer Ther,5:200-208(2006),K.Desai等,Biochim Biophys Acta,1585:188-92(2002)和C.P.Reynolds等和Cancer Lett,206,169-80(2004)，所有这些都通过引用并入本文。参与鞘脂代谢的各种酶的调节剂和抑制剂可以用作化疗剂。
(a)已经显示神经酰胺诱导细胞凋亡，因此已经使用外源神经酰胺或短链神经酰胺类似物如N-乙酰神经鞘氨醇(C2-Cer)、C6-Cer或C8-Cer。其它的类似物包括但不限于，Cer 1-葡糖苷酸、聚(乙二醇)-衍生的神经酰胺和聚乙二醇化的神经酰胺。
(b)刺激神经酰胺合成的调节剂已用于提高神经酰胺的水平。刺激丝氨酸棕榈酰转移酶(参与神经酰胺合成的酶)的化合物包括但不限于，四氢大麻酚(THC)及合成的类似物和花生四烯酸乙醇胺(anandamide)，一种天然存在的哺乳动物大麻素。吉西他滨、视黄酸及衍生物、芬维A胺[N-(4-羟基苯基)视黄酰胺、(4-HPR)]、喜树碱、高喜树碱、依托泊苷、紫杉醇、柔红霉素和氟达拉滨也被证明提高神经酰胺的水平。此外，伐司朴达(PSC833，Novartis)(环孢菌素的非免疫抑制性非肾毒性(ephrotoxic)类似物和p-糖蛋白的抑制剂)增加神经酰胺的水平。
(c)鞘磷脂酶的调节剂可以增加神经酰胺水平。他们包括降低GSH水平的化合物，因为GSH抑制鞘磷脂酶。例如，betathine(β-丙氨酰半胱胺二硫化物)，氧化的谷胱甘肽，已经对患有骨髓瘤、黑色素瘤和乳腺癌的患者产生了良好的效果。COX-2抑制剂，如塞来考昔、酮康唑(一种抗真菌剂)、阿霉素、米托蒽醌、D609(三环癸-9-基-黄原酸酯)、地塞米松和Ara-C(1-β-D-阿糖呋喃基胞嘧啶)也刺激鞘磷脂酶。
(d)刺激葡糖神经酰胺的水解的分子也提高神经酰胺水平。酶(GlcCer葡糖苷酶)(其可供用于高歇氏病中，特别是以视黄醇或戊醇作为葡萄糖受体和/或酶的活化剂)可被用作治疗剂。鞘脂激活蛋白(saposin)C及其类似物以及抗精神病药氯丙嗪的类似物也可使用。
(e)葡糖神经酰胺合成抑制剂包括，但不限于，PDMP(N-[2-羟基-1-(4-吗啉基甲基)-2-苯乙基癸酰胺])、PMPP(D,L-苏式-(1-苯基-2-六癸酰基氨基-3-吗啉代-1-丙醇)、P4或PPPP(D-苏式-1-苯基-2-棕榈酰氨基-3-吡咯烷基-1-丙醇)、亚乙二氧-P4、2-癸酰基胺-3-吗啉代丙烯酮(morpholinoprophenone)、它莫西芬(tamixofen)、雷洛昔芬、米非司酮(RU486)、N-丁基脱氧野尻霉素和抗雄激素化疗(比卡鲁胺+醋酸亮丙瑞林))。，(1,5-(丁基亚氨基)-1,5-二脱氧-D-葡萄糖醇)(通常用于治疗高歇氏病)，是葡糖神经酰胺合成的另一抑制剂。
(f)神经酰胺酶抑制剂包括，但不限于，N-油酰乙醇胺(一种神经酰胺的截短形式)、D-MAPP(D-赤式-2-十四酰基氨基-1-苯基-1-丙醇)和相关的抑制剂B13(对硝基-D-MAPP)。
(g)神经鞘氨醇激酶抑制剂也导致神经酰胺水平提高。抑制剂包括，但不限于，沙芬戈(safingol)(L-苏式-二氢神经鞘氨醇)、N,N-二甲基神经鞘氨醇、三甲基神经鞘氨醇及神经鞘氨醇的类似物和衍生物如二氢神经鞘氨醇，和多球壳菌素。
(h)伏马菌素和伏马菌素类似物，虽然它们抑制神经酰胺合成酶，但由于抑制鞘脂的从头生物合成也增加神经鞘氨醇的水平，从而导致细胞凋亡。
(i)增加神经酰胺水平的其它分子包括，但不限于，米替福星(十六烷基磷酸胆碱)。鞘脂调节剂，如以上所述的那些，可以与一种或多种其它的鞘脂调节剂和/或与一种或多种不同种类的化疗剂结合使用。
21.其它的低聚物
除了上面介绍的寡核苷酸，其它的寡核苷酸已被用作癌症治疗剂。它们包括(oblimersen，G3139，来自Genta)(靶向BCL2的反义寡核苷酸)和G4460(LR3001，来自Genta)(靶向癌症途径，包括但不限于STAT-3、生存素、c-myb及其它，的另一反义寡核苷酸)。其它的低聚物包括，但不限于，siRNA、诱饵(decoys)、RNAi寡核苷酸等。寡核苷酸，如以上所述的那些，可以与一种或多种其它的寡核苷酸抑制剂和/或与一种或多种不同种类的化疗剂结合使用。
22.其它化疗药物
其它的未分类的化疗剂在下面表1中描述。
表1.其它的未分类的化疗药物
23.其它化疗剂
可被施用或与本发明的化合物共施用的其它药物包括二甲双胍、胰岛素、2-脱氧葡萄糖、磺酰脲类、一般抗糖尿病剂、线粒体氧化磷酸化解偶联剂、抗瘦素抗体、瘦素受体激动剂、可溶性受体或治疗剂、抗脂联蛋白抗体、脂联蛋白受体激动剂或拮抗剂、抗胰岛素抗体、可溶性胰岛素受体、胰岛素受体拮抗剂、瘦素突变蛋白(即，突变体形式)、mTOR抑制剂或影响癌症代谢的药剂。
24.药物混合物
化疗剂可包括上述两种或更多种化疗药物的混合物。在一些实施方式中，化疗剂是包括两种或更多种烷基化剂、铂类、抗代谢物、蒽环类、紫杉烷类、喜树碱类、亚硝基脲类、EGFR抑制剂、抗生素、HER2/neu抑制剂、血管生成抑制剂、激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、免疫疗法、激素疗法、光动力疗法、癌症疫苗、鞘脂调节剂、低聚物或它们的组合的混合物。
在一个实施方式中，化疗剂是包括免疫治疗、烷基化剂、蒽环类、喜树碱和强的松混合物。在其它实施方式中，化疗剂是包括利妥昔单抗、烷基化剂、蒽环类、喜树碱和强的松的混合物。在其它实施方式中，化疗剂是包括利妥昔单抗、环磷酰胺、蒽环类、喜树碱和强的松的混合物。而在其它的实施方式中，化疗剂是包括利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松(例如，R-CHOP)的混合物。
在另一个实施方式中，化疗剂是包括阿霉素、异环磷酰胺和美司钠的混合物。
在其它的实施方式中，化疗剂是包括抗代谢物和紫杉烷的混合物。例如，所述化疗剂包括吉西他滨和泰索帝。
在其它的实施方式中，化疗剂是包括达卡巴嗪、丝裂霉素、阿霉素和顺铂的混合物。
在其它的实施方式中，化疗剂是包括阿霉素和达卡巴嗪的混合物。
在可选择的实施方式中，化疗剂是包括烷基化剂、喜树碱类、蒽环类和达卡巴嗪的混合物。在其它的实例中，所述化疗剂包括环磷酰胺、长春新碱、阿霉素和达卡巴嗪。
而在其它实施方式中，化疗剂是包括烷基化剂、甲氨蝶呤、抗代谢物和一种或多种蒽环类的混合物。例如，所述的化疗剂包括5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、环磷酰胺、阿霉素和表柔比星。
而在其它的实施方式中，化疗剂是包括紫杉烷和强的松或雌莫司汀的混合物。例如，化疗剂可以包括与强的松或雌莫司汀联用的多西他赛。
而在又另一实施方式中，化疗剂包括蒽环类和强的松。例如，化疗剂可以包括米托蒽醌和强的松。
在其它的实施方式中，化疗剂包括雷帕霉素大环内酯类和激酶抑制剂。激酶抑制剂可以是EGFR、HER2/neu、VEGF、极光激酶、SRC/Abl激酶、酪氨酸激酶、MET和/或MEK抑制剂。
在另一个实施方式中，化疗剂包括两种或更多种鞘脂调节剂。
而在另一实施方式中，化疗剂包括低聚物，如和一种或多种烷基化剂、铂类、抗代谢物、蒽环类、紫杉烷类、喜树碱类、亚硝基脲类、EGFR抑制剂、抗生素、HER2/neu抑制剂、血管生成抑制剂、激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、免疫疗法、激素疗法、光动力疗法、癌症疫苗、鞘脂调节剂、PARP抑制剂或它们的组合。
此外，构成化疗剂的一种或多种化疗药物可在与其它药物的联合疗法中施用，或它们可相继或同时对患者施用。
b.放射疗法
在本发明的几种实施方式中，除了施用寡核苷酸化合物外，还施用放射疗法。放射疗法包括外部和内部放射疗法。
1.外部放射疗法
外部放射疗法包括将高能射线(例如，X射线、γ射线等)或粒子(α粒子、β粒子、质子、中子等)对准癌症和它周围的正常组织。该放射是在病人的身体外部在称为线性加速器的机器中产生的。外部放射疗法可以与化学疗法、外科手术或寡核苷酸化合物组合。
2.内部放射疗法
内部放射疗法包括将高能射线源放置在体内，尽可能接近癌细胞。内部放射疗法可以与外部放射疗法、化学疗法或手术相结合。
放射疗法可以与化学疗法一齐、同时地或单独地施用。此外放射疗法可与外科手术一齐、同时地或单独地施用。
c.手术
在本发明的可选实施方式中，手术被用于从患者去除癌性组织。可以使用任何适合的手术方法包括例如，腹腔镜、手术刀、激光、剪刀等从患者切除癌性组织。在几种实施方式中，手术与化疗相结合。在其它的实施方式中，手术与放射疗法相结合。而在其它的实施方式中，手术与化疗和放射疗法相结合。
IV.药物组合物
在本发明的一个方面，药物组合物包含一种或多种寡核苷酸化合物和化疗剂。例如，药物组合物包含具有SEQ ID NO:1250、1251、1252或1253的寡核苷酸化合物；和一种或多种烷基化剂、铂、抗代谢物、蒽环类、紫杉烷、喜树碱类、亚硝基脲、EGFR抑制剂、抗生素、HER2/neu抑制剂、血管生成抑制剂、蛋白酶体抑制剂、免疫疗法、激素疗法、光动力疗法、癌症疫苗、PARP抑制剂、细胞增殖抑制剂、其它化学治疗剂如在表1中示出的那些，或它们的组合。
在一个实施方式中，药物组合物包含寡核苷酸化合物和化疗剂，包括达卡巴嗪、B-RAF V600E抑制剂或结合于细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的抗体，或其组合。B-Raf抑制剂可以是维罗非尼。所述的CTLA-4抗体可以是易普利姆玛。
所述的药物组合物还可以包含免疫治疗、烷基化剂、蒽环类、喜树碱和强的松。例如，该药物组合物包含一种或多种寡核苷酸化合物，其包含SEQ ID NO:2-281、283-461、463-935、937-1080、1082-1248、1250-1254和1267-1477及其互补序列；和化疗剂，其包括免疫治疗、烷基化剂、蒽环类、喜树碱和强的松。在其它的实施方式中，药物组合物包含寡核苷酸化合物和化疗剂(其包括利妥昔单抗、环磷酰胺、蒽环类、喜树碱和强的松)。而在其它的实施方式中，所述药物组合物包含寡核苷酸和化疗剂，其包括利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松(例如，R-CHOP)。在一些实施方式中，药物组合物可包含，例如，寡核苷酸化合物和苯达莫司汀。在其它的实施方式中，药物组合物可以包含寡核苷酸化合物和氟达拉滨、环磷酰胺，和任选地利妥昔单抗(FCR)。
本发明的药物组合物可以任选地包括药物如麻醉药物、营养补充剂(例如，维生素、矿物质、蛋白质等)、发色团、它们的组合等等。
A.寡核苷酸递送
可使用任何合适的方法递送本发明的寡核苷酸化合物。在一些实施方式中，施用裸露的DNA。在其它的实施方式中，利用脂质转染将核酸递送给受试者。在更进一步的实施方式中，用磷硫酰(phosphothiolate)修饰寡核苷酸用于递送(参见例如，美国专利6,169,177，其通过引用并入本文)。
在一些实施方式中，寡核苷酸被隔离在脂质(例如，脂质体或胶束)中以帮助递送(参见例如，美国专利6,458,382、6,429,200；美国专利公开2003/0099697、2004/0120997、2004/0131666、2005/0164963和国际公开WO 06/048329，其中每一个通过引用并入本文)。
如本文所用的“脂质体”是指一种或多种形成复合体的脂质，该复合体通常被水溶液包围。脂质体通常是球形的结构，其包含脂质如磷脂、类固醇、脂肪酸，并且是脂质双层型结构，并且可以包括单层囊泡、多层结构和无定形的脂质囊泡。通常，脂质体是含有被包裹的水相体积的完全封闭的脂双层膜。脂质体可以是单层囊泡(具有单一双层膜)或多层(特征在于多个膜双层的洋葱状结构，各个膜双层由水层与下一层分隔)。本发明的脂质体还可以包括如下所定义的DNAi寡核苷酸，其或者结合于脂质体或者隔离于脂质体中或脂质体上。所述分子包括但不限于，DNAi寡核苷酸和/或用于治疗疾病(如癌症)的其它试剂。
如本文所用的，“隔离的”、“隔离”或“使…隔离”指的是用脂质体的脂质包封、掺入或结合药物、分子、化合物(包括DNAi寡核苷酸)。该分子可与脂质双层结合或存在于脂质体的水性内部中或这两者。“隔离的”包括包封在脂质体的水性核心中。它也包括其中部分或全部分子位于脂质体的水性核心中且部分位于脂质体外的脂质体混悬液的水相中的情况，其中部分所述分子位于脂质体的水性核心中，且部分在脂质体的脂质部分中，或者部分伸出脂质体的外部，其中分子部分或完全嵌入在脂质体的脂质部分中，并包括与脂质体结合的分子，其中所有的或部分的分子与脂质体的外部相关联。
特别地，在全身性应用后，所述寡核苷酸和/或其它试剂必须稳定地隔离在脂质体中直到最终摄取到靶组织或细胞中。因此，对于脂质体药物，FDA的脂质体制剂准则规范要求特定临床前试验(http://www.fda.gov/cder/guidance/2191dft.pdf)。脂质体注射进入血流后，血清组分与脂质体相互作用，这可导致脂质体的渗透化。然而，被包封在脂质体中的药物或分子的释放依赖于药物或分子的分子尺寸。因此，释放数千碱基对的质粒比较小的寡核苷酸或其它的小分子慢得多。对于药物或分子的脂质体递送，理想的是，血流中脂质体的循环过程中药物的释放尽可能的低。
1.两性脂质体
在一些实施方式中，用于递送的脂质体可以是两性脂质体，如那些在US 2009/0220584中描述的，其通过引用并入本文。两性脂质体是一类在约pH 7.5下具有阴离子或中性电荷和在pH 4下具有阳离子电荷的脂质体。两性脂质体的脂质组分本身可以是两性的和/或可以由阴离子、阳离子和在某些情况下，中性物质的混合物组成，使得该脂质体是两性的。
如本文所使用的“两性脂质体”是如下所定义的具有两性特征的脂质体。
如本文所用的隔离的、隔离或使之隔离指的是用脂质体的脂质包封、掺入或结合药物、分子、化合物(包括DNAi寡核苷酸)。该分子可与脂质双层结合或存在于脂质体的水性内部中或两者。“隔离的”包括包封在脂质体的水性核心中。它也包括其中部分或全部分子位于脂质体的水性核心中和部分位于脂质体外的脂质体混悬液的水相中的情况，其中部分分子位于脂质体的水性核心中和部分在脂质体的脂质部分中，或者部分伸出脂质体的外部，其中分子部分或完全嵌入在脂质体的脂质部分中，并包括与脂质体结合的分子，其中所有的或部分的分子与脂质体的外部相关联。
如本文所用，“多分散指数”是脂质体的粒子分散的异质性(混合物中脂质体直径的异质性)的量度。多分散性指数范围对于脂质体制剂的粒度分布可以从0.0(均相的)到1.0(异相的)。
两性脂质体包括一种或多种两性脂质或可选地具有两性特性的脂质组分的混合物。合适的两性类脂在PCT国际公开号WO02/066489以及在PCT国际公开号WO03/070735中公开，这两者的内容通过引用并入本文。可选地，可使用pH-反应性阴离子和/或阳离子组分配制脂质相，如公开于PCT国际公开号WO02/066012中，其内容通过引用并入本文。对pH敏感的阳离子脂质被公开在PCT国际公开号WO02/066489和WO03/070220，Budker等1996,Nat.Biotechnol.,14(6):760-4，和在6,258,792号美国专利中，其内容通过引用并入本文，并且可以在与组成型带电的阴离子脂质或与对pH敏感的阴离子脂质组合使用。相反，阳离子电荷也可以与pH敏感的阴离子脂质组合从本领域的技术人员已知的组成型带电的脂质引入。(也参见PCT国际公开号WO05/094783、WO03/070735、WO04/00928、WO06/48329、WO06/053646、WO06/002991和美国专利公开2003/0099697、2005/0164963、2004/0120997、2006/159737、2006/0216343，其中的每一个也将其全部引入作为参考。)
本发明的两性脂质体包括：1)两性脂质或具有两性特性的脂质组分的混合物，(2)中性脂质，(3)一种或多种DNAi寡核苷酸，(4)冷冻保护剂和/或冻干保护剂，和(5)喷雾干燥的冷冻保护剂。另外，该DNAi脂质体具有限定的尺寸分布和多分散指数。
如本文所用，“两性”或“两性的”特征是指作为单一物质(例如，化合物)或物质的混合物(例如，两种或更多种化合物的混合物)或超分子复合物(例如，脂质体)包含阴离子和阳离子特征的带电基团的结构，其中
(i)至少一种带电基团具有4至8的pK，
(ii)该阳离子电荷在pH 4下占优势和
(iii)该阴离子电荷在pH 8下占优势，
从而导致pH 4和pH 8之间中性净电荷的等电点。该定义的两性特征与两性离子特征不同，因为两性离子没有上述范围内的pK。因此，两性离子在pH值范围内基本上是电中性的。磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺是具有两性离子特征的中性脂质。
如本文所用的“两性I脂质对”是指包含稳定的阳离子和带电荷的阴离子的脂质对。实例包括但不限于DDAB/CHEMS、DOTAP/CHEMS和DOTAP/DOPS。在一些方面，阳离子脂质与阴离子脂质的百分比的比率低于1。
如本文所用的“两性II脂质对”是指包含带电荷的阳离子和带电荷的阴离子的脂质对。实例包括但不限于Mo-Chol/CHEMS、DPIM/CHEMS或DPIM/DG-Succ。在一些方面，阳离子脂质与阴离子脂质的百分比的比例为约5至0.2。
如本文所用的“两性III脂质对”是指包含带电荷的阳离子和稳定的阴离子的脂质对。实例包括但不限于Mo-Chol/DOPG或Mo-Chol/Chol-SO4。在一个实施方式中，阳离子脂质与阴离子脂质的百分比的比率大于1。
脂质的缩写主要是指文献中使用的标准且包括在这里作为有用的参考：
DMPC  二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱
DPPC   二棕榈酰磷脂酰胆碱
DSPC   二硬脂酰磷脂酰胆碱
POPC   棕榈酰-油酰磷脂酰胆碱
OPPC   1-油酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱
DOPC   二油酰磷脂酰胆碱
DOPE   二油酰磷脂酰乙醇胺
DMPE  二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺
DPPE   二棕榈酰磷脂酰乙醇胺
DOPG  二油酰基磷脂酰甘油
POPG   棕榈酰-油酰磷脂酰甘油
DMPG  二肉豆蔻酰磷脂酰甘油
DPPG   二棕榈酰磷脂酰甘油
DLPG   二月桂基磷脂酰甘油
DSPG   二硬脂酰磷脂酰甘油
DMPS  二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸
DPPS   二棕榈酰磷脂酰丝氨酸
DOPS   二油酰磷脂酰丝氨酸
POPS   棕榈酰-油酰磷脂酰丝氨酸
DMPA  二肉豆蔻酰磷脂酸
DPPA   二棕榈酰磷脂酸
DSPA   二硬脂酰磷脂酸
DLPA   二月桂基磷脂酸
DOPA  二油酰磷脂酸
POPA   棕榈酰-油酰磷脂酸
CHEMS  胆固醇半琥珀酸酯
DC-Chol  3-β-[N-(N′,N′-二甲基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇
Cet-P   鲸蜡磷酸酯
DODAP  (1,2)-二油酰氧基丙基)-N,N-二甲基氯化铵
DOEPC  1,2-二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱
DAC-Chol 3-β-[N-(N,N′-二甲基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇
TC-Chol  3-β-[N-(N′,N′,N′-三甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇
DOTMA  (1,2-二油酰氧基丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵)()
DOGS  ((C18)2GlySper3+)N,N-二-十八烷基酰胺基-甘氨酰基-精胺()
CTAB   鲸蜡基-三甲基溴化铵
CPyC   鲸蜡基-吡啶盐酸盐
DOTAP  (1,2-二油酰氧基丙基)-N,N,N-三甲基铵盐
DMTAP  (1,2-二肉蔻酰氧基丙基)-N,N,N-三甲基铵盐
DPTAP  (1,2-二棕榈酰氧基丙基)-N,N,N-三甲基铵盐
DOTMA  (1,2-二油酰氧基丙基)-N,N,N-三甲基铵盐
DORIE  (1,2-二油酰氧基丙基)-3-二甲基羟乙基溴化铵
DDAB  二甲基二-十八烷基溴化铵
DPIM   4-(2,3-双-棕榈酰氧基-丙基)-1-甲基-1H-咪唑
CHIM   组胺基-胆固醇氨基甲酸酯
MoChol  4-(2-氨基乙基)-吗啉代-胆固醇半琥珀酸酯
HisChol  组胺基-胆固醇半琥珀酸酯
HCChol  Nα-组氨酰基-胆固醇氨基甲酸酯
HistChol  Nα-组氨酰基-胆固醇-半琥珀酸酯
AC    酰基肌肽(Acylcarnosine),硬脂酰基-&棕榈酰基肌肽
HistDG  1,2-二棕榈酰基甘油-半琥珀酸-N_-组氨酰基-半琥珀酸酯；和二硬脂酰基-、二肉蔻酰基-、二油酰基-或棕榈酰-油酰基衍生物
IsoHistSuccDG 1,2-二棕榈酰基甘油-O_-组氨酰基-Nα-半琥珀酸酯和二硬脂酰基-、二肉蔻酰基、二油酰基或棕榈酰-油酰基衍生物
DGSucc  1,2-二棕榈酰基-3-半琥珀酸酯&二硬脂酰基-、二肉蔻酰基-二油酰基或棕榈酰-油酰基衍生物
EDTA-Chol  乙二胺四乙酸的胆固醇酯
Hist-PS  Nα-组氨酰基-磷酯酰丝氨酸
BGSC   双胍-亚精胺-胆固醇
BGTC   双胍-三氨乙基胺-胆固醇
DOSPER  (1,3-二油酰氧基-2-(6-羧基-精胺酰(spermyl))-丙胺(propylarnide)
DOSC   (1,2-二油酰基-3-琥珀酰基-sn-甘油基胆碱酯)
DOGSDO  (1,2-二油酰基-sn-甘油-3-琥珀酰基-2-羟乙基二硫化物鸟氨酸)
DOGSucc  1,2-二油酰基甘油-3-半琥珀酸酯
POGSucc  棕榈酰基-油酰基甘油-油酰基-3-半琥珀酸酯
DMGSucc 1,2-二肉蔻酰基甘油-3-半琥珀酸酯
DPGSucc  1,2-二棕榈酰基甘油-3-半琥珀酸酯
下面的结构提供了适合用于根据本发明的组合物中的脂质的非限制性实例。示例性地显示脂质的膜锚且仅用于说明本发明的脂质而不打算限制本发明。
MoChol
两性脂质在PCT国际公开号WO02/066489和WO03/070735中公开，两者的内容在此引入作为参考。通过“两性物质”分子部分中阳离子和阴离子基团的同时存在，总体分子呈现其pH依赖性的电荷特征。更具体地，两性物质的特征在于以下事实：其电荷成分的总和在特定的pH值下将恰好是零。这一点被称为等电点(IP)。在IP以上，化合物具有负电荷，而低于IP，化合物被认为是正的阳离子，两性脂质的IP根据本发明在4.5和8.5的范围内。
分子在介质的特定pH值中的总电荷可以计算如下：
z＝Σni×((qi-1)+(10(pK-pH)/(1+10(pK-pH)))
qi：离子基团在其pK之下的绝对电荷(如，羧基＝0，单氮碱基＝1，二酯化磷酸基团＝-1)
ni：分子中这样的基团的数目。
例如，化合物通过将组氨酸的氨基与胆固醇半琥珀酸酯偶联而形成。在7的中性pH值下，该产物具有负电荷，因为其中存在的羧基功能团处于其完全解离形式，而咪唑功能团只具有低的电荷。在约4的酸性pH值下，情况正好相反：现在羧基功能团主要是不带电的，而咪唑基基本上是完全质子化的，且因此分子的总电荷为正。
在一个实施方式中，两性脂质选自于HistChol、HistDG、isoHistSuccDG、酰基肌肽和HCChol。在另一个实施方式中，两性脂质是HistChol。
两性脂质可以包括，但不限于包括阴离子取代基的阳离子脂质的衍生物。两性脂质包括，但不限于，具有下式结构的化合物：
Z-X-W1-Y-W2-HET
其中：
Z是甾醇或脂族的；
甾醇选自胆甾醇、谷甾醇、菜油甾醇、链甾醇、岩藻固醇、22-酮甾醇(ketosterol)、20-羟基甾醇、豆甾醇、22-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇、羊毛甾醇、7-脱氢胆固醇(dehydrocholesteril)、二氢胆固醇、19-羟基胆固醇、5α-胆甾-7-烯-3β-醇、7-羟基胆固醇、epocholesterol、麦角甾醇、去氢麦角甾醇及其衍生物；
W1各自独立地是未取代的脂族基团；
W2各自独立地是任选用HO(O)C-脂族基-氨基或羧基取代的脂族基团；
X和Y各自独立地为不存在、–(C＝O)–O–、–(C＝O)–NH–、–(C＝O)–S–、–O–、–NH–、–S–、–CH＝N–、–O–(O＝C)–、–S–(O＝C)–、–NH–(O＝C)–、–N＝CH–，和
HET是氨基、任选取代的杂环脂族基或任选取代的杂芳基。
在一些方面，所述HET为包括至少一个氮环原子的任选取代的杂环脂族基，或包括至少一个氮环原子的任选取代的杂芳基。在其它方面中，HET是吗啉基、哌啶基、哌嗪基、嘧啶基或吡啶基。在另一个方面，阳离子脂质具有结构：甾醇-X-间隔物1-Y-间隔物2-吗啉基或甾醇-X-间隔物1-Y-间隔物2-咪唑基。在更进一步的方面中，甾醇是胆固醇。
在其它实施方式中，两性脂质包括，但不限于，具有下式结构的化合物：
Z-X-W1-Y-W2-HET
其中：
Z是根据以下通式的结构
其中R1和R2独立地为C8-C30烷基或酰基链，其具有0、1或2个烯属不饱和键，和M选自于-O-(C＝O)、-NH-(C＝O)-、-S-(C＝O)-、-O-、-NH-、-S-、-N＝CH-、-(O＝C)-O-、-S-(O＝C)-、-NH-(O＝C)-、-N＝CH-、-S-S-；和
甾醇选自于胆甾醇、谷甾醇、菜油甾醇、链甾醇、岩藻固醇、22-酮甾醇、20-羟基甾醇、豆甾醇、22-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇、羊毛甾醇、7-脱氢胆固醇、二氢胆固醇、19-羟基胆固醇、5α-胆甾-7-烯-3β-醇、7-羟基胆固醇、epocholesterol、麦角甾醇、去氢麦角甾醇及其衍生物；
W1各自独立地是具有最多8个碳原子的未取代的脂族基；
W2各自独立地是脂族基、具有高达8个碳原子和0、1或2个烯属不饱和键的羧酸；
X为不存在，和Y是-(C＝O)-O-、-(C＝O)-NH-、-NH-(C＝O)-O-、-O-、-NH-、-CH＝N-、-O-(O＝C)-、-S-、-(O＝C)-、-NH-(O＝C)-、-O-(O＝C)-NH-、-N＝CH-和/或-S-S-；和
HET是氨基、任选取代的杂环脂族基或任选取代的杂芳基。
在一些方面，所述HET为包括至少一个氮环原子的任选取代的杂环脂族基，或包括至少一个氮环原子的任选取代的杂芳基。在其它方面中，HET是吗啉基、哌啶基、哌嗪基、嘧啶基或吡啶基。在另一个方面，阳离子脂质具有结构：甾醇-X-间隔物1-Y-间隔物2-吗啉基或甾醇-X-间隔物1-Y-间隔物2-咪唑基。在更进一步的方面中，甾醇是胆固醇。
可选地，可使用pH-反应性阴离子和/或阳离子组分配制脂质相，如公开于PCT国际公开号WO02/066012中，其内容通过引用并入本文。对pH敏感的阳离子脂质被公开在PCT国际公开号WO02/066489和WO03/070220、Budker等1996,Nat.Biotechnol.,14(6):760-4及在6,258,792号美国专利中，其内容全部通过引用并入本文。可选地，阳离子电荷可以与pH敏感性阴离子组合从那些本领域的技术人员已知的组成型带电的脂质引入。组成型(例如，在特定的pH范围内，例如在约4和9的pH值下稳定电荷)带电的阴离子和阳离子脂质的组合，如DOTAP和DPPG不是优选的。因此，在本发明的一些实施方式中，脂质组分的混合物可以包含(i)稳定的阳离子脂质和可带电的阴离子脂质，(ii)可带电的阳离子脂质和可带电的阴离子脂质或(ⅲ)稳定的阴离子脂质和可带电的阳离子脂质。
带电荷的基团可分为以下4组。
(1)强(例如，组成型带电的)阳离子，pKa>9，净正电荷：根据其化学性质，这些是，例如，铵、脒、胍或吡啶基团或适时地，仲或叔氨基官能团。
(2)弱阳离子，pKa<9，净正电荷：根据其化学性质，这些是特别地氮碱如哌嗪类、咪唑类和吗啉类、嘌呤类或嘧啶类。在生物系统中出现的这样的分子片段是例如，4-咪唑类(组胺)，2-、6-或9-嘌呤类(腺嘌呤类、鸟嘌呤类、腺苷类或鸟苷类)，1-、2-或4-嘧啶类(尿嘧啶类、胸腺嘧啶类、胞嘧啶类、尿苷类、胸苷类、胞苷类)或另外吡啶-3-羧酸类(烟酸酯或酰胺)。具有优选的pKa值的氮碱也通过用低分子量烯烃羟基，例如羟甲基或羟乙基基团，取代氮原子一次或多次而形成。例如，氨基二羟基丙烷、三乙醇胺、三(羟甲基)甲胺、双(羟甲基)甲胺、三(羟乙基)甲胺、双-(羟乙基)甲胺或相应的取代乙胺。
(3)弱阴离子，pKa>4，净负电荷：根据其化学性质，这些特别是羧酸。它们包括脂肪族的、直链或支链的单、二或三羧酸，其具有最多12个碳原子和0、1或2个烯属不饱和键。具有合适性能的羧酸还发现为芳香系统的取代基。其它的弱阴离子基团是羟基类或硫醇类，其可以解离和出现于抗坏血酸、N-取代四氧嘧啶、N-取代巴比妥酸、佛罗那、苯酚或作为硫醇基。
(4)强(例如，组成型带电的)阴离子，pKa<4，净负电荷：根据其化学性质，这些是如磺酸酯或磷酸酯的官能团。
两性脂质体含有可变量的这种膜形成的或膜基的两性材料，以使它们具有两性特征。这意味着脂质体可以完全改变电荷的符号。脂质体的电荷载体量(存在于介质的给定pH下)可以使用下列公式计算：
z＝Σni((qi–1)+10(pK–pH)/(1+10(pK–pH))
其中
qi是单个离子基团在其PK之下的绝对电荷(如，羧基＝0，单氮碱基＝1，第二解离步骤的磷酸基团＝-1等)
ni是脂质体中这些基团的数目。
在等电点时，脂质体的净电荷是0。可通过混合阴离子和阳离子部分产生具有基本上可选择等电点的结构。
在一个实施方式中，阳离子组分包括DPIM、CHIM、DORIE、DDAB、DAC-Chol、TC-Chol、DOTMA、DOGS、(C18)2Gly+N,N-二-十八烷基酰胺-甘氨酸、CTAB、CPyC、DODAP DMTAP、DPTAP、DOTAP、DC-Chol、MoChol、HisChol和DOEPC。在另一个实施方式中，阳离子脂质包括DMTAP、DPTAP、DOTAP、DC-Chol、MoChol和HisChol。
该阳离子脂质可以是具有下式结构的化合物
L-X-间隔物1-Y-间隔物2-HET
其中：
L是甾醇或[脂族(C(O)O)-]2-烷基-；
甾醇选自胆甾醇、谷甾醇、菜油甾醇、链甾醇、岩藻固醇、22-酮甾醇、20-羟基甾醇、豆甾醇、22-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇、羊毛甾醇、7-脱氢甾醇、二氢胆固醇、19-羟基胆固醇、5α-胆甾-7-烯-3β-醇、7-羟基胆固醇、epocholesterol、麦角甾醇、去氢麦角甾醇及其衍生物；
间隔物1和间隔物2各自独立地是未取代的脂族基；
X和Y各自独立地是不存在、–(C＝O)–O–、–(C＝O)–NH–、–(C＝O)–S–、–O–、–NH–、–S–、–CH＝N–、–O–(O＝C)–、–S–(O＝C)–、–NH–(O＝C)–、–N＝CH–，和
HET是氨基、任选取代的杂环脂族基或任选取代的杂芳基。
在一些方面，所述HET为包括至少一个氮环原子的任选取代的杂环脂族基，或包括至少一个氮环原子的任选取代的杂芳基。在其它方面中，HET是吗啉基、哌啶基、哌嗪基、嘧啶基或吡啶基。在另一个方面，所述阳离子脂质具有结构：甾醇-X-间隔物1-Y-间隔物2-吗啉基或甾醇-X-间隔物1-Y-间隔物2-咪唑基。在更进一步的方面中，甾醇是胆固醇。
在另一个实施方式中，pH敏感性阳离子脂质可以是具有下式结构的化合物
L-X-间隔物1-Y-间隔物2-HET
其中：
L是根据以下通式的结构
其中R1和R2独立地为C8-C30烷基或酰基链，其具有0、1或2个烯属不饱和键，和M为不存在、-O-(C＝O)、-NH-(C＝O)-、-S-(C＝O)-、-O-、-NH-、-S-、-N＝CH-、-(O＝C)-O-、-S-(O＝C)-、-NH-(O＝C)-、-N＝CH-、-S-S-；和
甾醇选自于胆甾醇、谷甾醇、菜油甾醇、链甾醇、岩藻固醇、22-酮甾醇、20-羟基甾醇、豆甾醇、22-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇、羊毛甾醇、7-脱氨胆甾醇、二氢胆固醇、19-羟基胆固醇、5α-胆甾-7-烯-3β-醇、7-羟基胆固醇、epocholesterol、麦角甾醇、去氢麦角甾醇及其衍生物；
间隔物1和间隔物2各自独立地是具有1-8个碳原子的未取代脂族基；
X为不存在，且Y为不存在、-(C＝O)-O-、-(C＝O)-NH-、-NH-(C＝O)-O-、-O-、-NH-、-CH＝N-、-O-(O＝C)-、-S-、-(O＝C)-、-NH-(O＝C)-、-O-(O＝C)-NH-、-N＝CH-和/或-S-S-；和
HET是氨基、任选取代的杂环脂族基或任选取代的杂芳基。
在一些方面，HET为包括至少一个氮环原子的任选取代的杂环脂族基，或包括至少一个氮环原子的任选取代的杂芳基。在其它方面中，HET是吗啉基、哌啶基、哌嗪基、嘧啶基或吡啶基。在另一个方面，阳离子脂质具有结构：甾醇-X-间隔物1-Y-间隔物2-吗啉基或甾醇-X-间隔物1-Y-间隔物2-咪唑基。在更进一步的方面中，甾醇是胆固醇。
可以使用1个或多个步骤的合成来合成上述化合物，并且可以由本领域技术人员来制备。
两性混合物进一步包含阴离子脂质，其或者为组成型或响应于pH值有条件地带电的，并且这样的脂质也是本领域技术人员所知的。在一个实施方式中，用于本发明的脂质包括DOGSucc、POGSucc、DMGSucc、DPGSucc、DMPS、DPPS、DOPS、POPS、DMPG、DPPG、DOPG、POPG、DMPA、DPPA、DOPA、POPA、CHEMS和CetylP。在另一个实施方式中，阴离子脂质包括DOGSucc、DMGSucc、DMPG、DPPG、DOPG、POPG、DMPA、DPPA、DOPA、POPA、CHEMS和CetylP。
中性脂质包括在介于约4和9之间的pH值下保持电中性的任何脂质。中性脂质包括，但不限于，胆固醇、其它甾醇及其衍生物、磷脂和它们的组合。磷脂包括任何一种磷脂或能够形成脂质体的磷脂的组合。它们包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、卵磷脂及其部分、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、缩醛磷脂和鞘磷脂。磷脂酰胆碱包括但不限于获得自卵、大豆或其它植物来源的那些或部分或完全合成的或具有可变脂质链长和不饱和度的那些、POPC、OPPC、天然或氢化大豆PC、天然或氢化的蛋黄PC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC和它们的衍生物。在一个实施方式中，磷脂酰胆碱是POPC、非氢化大豆磷脂酰胆碱和非氢化的蛋黄磷脂酰胆碱。磷脂酰乙醇胺包括但不限于，DOPE、DMPE和DPPE及其衍生物。磷脂酰甘油类包括，但不限于，DMPG、DLPG、DPPG和DSPG。磷脂酸类包括，但不限于，DSPA、DMPA、DLPA和DPPA。
甾醇包括胆固醇衍生物如3-羟基5.6-胆甾烯和相关类似物如3-氨基-5.6-胆甾烯和5,6-胆甾烯、胆甾烷、胆甾烷醇和相关类似物如3-羟基-胆甾烷；和如胆甾醇基-β-丙氨酸和胆固醇半琥珀酸酯的带电的胆固醇衍生物。甾醇还包括MoChol和MoChol的类似物。
在一个实施方式中，中性脂质包括但不限于DOPE、POPC、大豆磷脂酰胆碱或蛋黄磷脂酰胆碱和胆固醇。
在一些方面，本发明提供了包含两性脂质体和DNAi寡核苷酸的混合物。在第一方面的实施方式中，两性脂质体具有4和8之间的等电点。在进一步的实施方式中，两性脂质体在pH 7.4下带负电荷或为中性，和在pH 4下带正电。
在一些实施方式中，两性脂质体包括两性脂质。在进一步的实施方式中，两性脂质可以是HistChol、HistDG、isoHistSucc DG、酰基肌肽、HCChol或其组合。在另一个实施方式中，两性脂质体包括一种或多种阳离子脂质和一种或多种阴离子脂质的混合物。在又另一个实施方式中，阳离子脂质可以是DMTAP、DPTAP、DOTAP、DC-Chol、MoChol或HisChol或其组合，和阴离子脂质可以是CHEMS、DGSucc、Cet-P、DMGSucc、DOGSucc、POGSucc、DPGSucc、DG Succ、DMPS、DPPS、DOPS、POPS、DMPG、DPPG、DOPG、POPG、DMPA、DPPA、DOPA、POPA或其组合。
在另一个实施方式中，脂质体还包括中性脂质。在进一步的实施方式中，中性脂质包括甾醇及其衍生物。在更进一步的实施方式中，甾醇包括胆固醇及其衍生物。中性脂质还可以包括中性磷脂。在一个实施方式中，所述磷脂包括磷脂酰胆碱或磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺。在另一个实施方式中，磷脂酰胆碱是POPC、OPPC、天然或氢化大豆磷脂酰胆碱、天然或氢化蛋黄磷脂酰胆碱、DMPC、DPPC或DOPC及其衍生物，和磷脂酰乙醇胺是DOPE、DMPE、DPPE或衍生物和它们的组合。在进一步的实施方式中，磷脂酰胆碱是POPC、OPPC、大豆磷脂酰胆碱或蛋黄磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺是DOPE。
在更进一步的实施方式中，两性脂质体的脂质包括DOPE、POPC、CHEMS和MoChol；POPC、Chol、CHEMS和DOTAP；POPC、Chol、Cet-P和MoChol；或者POPC、DOPE、MoChol和DMGSucc。
在另一个方面，本发明的混合物的两性脂质体可以从包含具有两性特性的脂质组分的混合物和DNAi寡核苷酸的脂质相形成，其中在脂质体中带电脂质的总量可以从5摩尔％到70摩尔％变化，中性脂质的总量可以从20摩尔％至70摩尔％变化。在第一方面的实施方式中，两性脂质体包括3至20摩尔％的POPC、10至60摩尔％的DOPE、10至60摩尔％的MoChol和10至50摩尔％的CHEMS。在进一步的实施方式中，脂质体包括POPC、DOPE、MoChol和CHEMS，其中POPC/DOPE/MoChol/CHEMS的摩尔比为约6/24/47/23或15/45/20/20。在又另一个实施方式中，脂质体包括3至20摩尔％的POPC、10至40摩尔％的DOPE、15至60摩尔％的MoChol和15至60摩尔％的DMGSucc。在进一步的实施方式中，脂质体包括POPC、DOPE、DMGSucc和MoChol，其中POPC/DOPE/DMGSucc/MoChol的摩尔比为约6/24/47/23或6/24/23/47。在又另一实施方式中，脂质体包括10至50摩尔％的POPC、20至60摩尔％的Chol、10至40摩尔％的CHEMS和5至20摩尔％的DOTAP。在进一步的实施方式中，脂质体包括POPC、Chol、CHEMS和DOTAP，其中POPC/Chol/CHEMS/DOTAP的摩尔比为约30/40/20/10。在又另一个实施方式中，脂质体包括10至40摩尔％的POPC、20至50％摩尔的Chol、5至30摩尔％的Cet-P和10至40摩尔％的MoChol。在进一步的实施方式中，POPC/Chol/Cet-P/MoChol的摩尔比为约35/35/10/20。
在第三方面中，包含在两性脂质体混合物中的DNAi寡核苷酸包含杂交于SEQ ID NO：1249或其部分的DNAi寡核苷酸。在另一个实施方式中，DNAi寡核苷酸可以是SEQ ID NO：1250、1251、1252、1253、1267-1447或其互补序列。在又另一个实施方式中，DNAi寡核苷酸可以是SEQ ID NO：1250或1251或其互补序列。
本发明的两性脂质体混合物可进一步包括额外的DNAi寡核苷酸，例如，包含SEQ ID NO:1250-1253和1270-1477之一，或选自于SEQ ID NO:2-281、283-461、463-935、937-1080、1082-1248和其互补序列。
在另一个方面，包含在脂质体混合物中的DNAi寡核苷酸的长度在15和35个碱基对之间。
在另一个方面，所述两性脂质体-DNAi寡核苷酸混合物包括DNAi寡核苷酸SEQ ID NO：1250或1251和两性脂质体(包含POPC、DOPE、MoChol和CHEMS，其中POPC/DOPE/MoChol/CHEMS的摩尔比为约6/24/47/23)。
在另一个方面，所述两性脂质体-DNAi寡核苷酸混合物包括DNAi寡核苷酸，PNT-100(SEQ ID NO：1250或1251)，和两性脂质体，其包含POPC、DOPE、MoChol和CHEMS，其中POPC/DOPE/MoChol/CHEMS的摩尔比为约15/45/20/20。
在另一个方面，该混合物的两性脂质体可以包括50至500ηm之间的尺寸。在一个实施方式中，尺寸为80至300ηm之间以及在另一个实施方式中，尺寸为90和200ηm之间。
在另一个方面，所述两性脂质体可具有介于4和8之间的等电点。在第六方面的实施方式中，两性脂质体在pH 7.4下可以带负电荷或是中性的，和在pH 4下带正电。
在另一个方面，所述两性脂质体在10至100mM或更小的脂质浓度下具有浓度至少约2mg/ml的DNAi寡核苷酸。
在另一个方面，本发明提供了制备包含DNAi寡核苷酸的两性脂质体的方法。在一个实施方式中，该方法包括使用主动加载过程，并在另一个实施方式中，包括使用被动加载过程。在进一步的实施方式中，该方法使用手工挤压、机器挤出、匀质化、微流体化或乙醇注射产生脂质体。在再另一个实施方式中，该方法具有至少35％的包封效率。
在另一个方面，本发明提供了向细胞或动物引入DNAi寡核苷酸-两性脂质体混合物的方法。在一个实施方式中，该方法包括向哺乳动物施用该混合物以治疗癌症。该施用的混合物可减少或阻止哺乳动物中肿瘤的生长。在另一个实施方式中，引入该混合物导致减少细胞增殖。在另一个实施方式中，该混合物被施用到癌细胞、非人动物或人。在进一步的实施方式中，以每kg体重0.01mg至100mg的剂量将该混合物引入到动物中。在又另一个实施方式中，每天一次或多次或连续地将混合物引入到动物中。在又另一实施方式中，该混合物经局部、肺或肠胃外施用或通过医疗装置引入到动物中。在更进一步的实施方式中，施用于动物或细胞的混合物进一步包括化疗剂和/或细胞靶向成分。
在一些实施方式中，两性脂质体的制剂可分别包含6/24/47/23的摩尔比的POPC/DOPE/MoChol/CHEMS。这样的脂质体是富含胆固醇的和带负电的。这在脂质递送系统中是独特的，并造成细胞摄取。在一些实施方式中，SEQ ID NO:1251的寡核苷酸(PNT-100)可被与该制剂一起被隔离在两性脂质体中(以下称为“PNT 2258”)。
PNT2258是一种创新的治疗剂，其预计在其中靶基因BCL2过表达的许多癌症中解决未满足的医疗需求。已知BCL2在淋巴瘤、白血病、前列腺癌、黑色素瘤、肉瘤、肺癌和乳腺癌中过表达。在癌症的小鼠模型中，PNT2258单独地以及与rituxamib或多西他赛组合显示出针对几乎所有这些适应症的抗肿瘤活性(图1)。在组合中，PNT2258在所有的模型中证实无瘤生存。然而，用PNT2258与达卡巴嗪、维罗非尼(PLX4032)或易普利姆玛的组合治疗这些和其它肿瘤先前未进行过测试。这些药剂的组合可能对患有癌症(包括但不限于转移性黑色素瘤)的人类中对于无肿瘤进展或整体存活率有统计学有益的效果。
PNT2258是富含胆固醇的和带负电的。这在脂质递送系统中是独特的，并造成细胞摄取。PNT2258已在动物模型中显示出长循环半衰期、稳定性和显著的抗肿瘤功效。也确定快速分离的来自血液循环/细胞内环境的细胞清除胆固醇和富含胆固醇的颗粒被吸引到细胞外基质。不被理论所限制，据推测，PNT2258很可能通过这些机制引导到细胞中。
2.其它的脂质体递送媒介
脂质体包括，但不限于，基于心磷脂的阳离子脂质体(例如，NeoPhectin，购自NeoPharm，Forest Lake，IL)和pH敏感性脂质体。
在本发明的一些实施方式中，NeoPhectin被用作脂质体递送媒介。在一些实施方式中，用寡核苷酸配制NeoPhectin以便减少游离NeoPhectin。在其它实施方式中，NeoPhectin以NeoPhectin-寡核苷酸加载比6:1或更小(例如，5：1和4：1)存在。
而在其它实施方式中，脂质(特别是构成一些脂质体的磷脂)与聚乙二醇或其衍生物偶联以增加静脉内注射后脂质体在血液中循环的时间。(见例如，Moghimi,S.M.和Szebeni,J,Prog.Lipid Res.,42:463-78,2003及Li,W.等,J.Gene Med.,7:67-79,2005，其通过引用并入本文。)这样的脂质体，被称为“隐形脂质体”能够避开网状内皮系统(RES)，导致在某些情况下24小时以上的半衰期。在一个实施方式中，在脂质体中的磷脂偶联于聚乙二醇-二原酸酯分子，如在Li,W.等,J.Gene Med.,7:67-79,2005中描述的。在其它的实施方式中，PEG-脂质体靶向于特定的细胞受体。例如，在阳离子脂质体中在PEG连接的磷脂的远端偶联的氟哌啶醇靶向在一些癌细胞中过表达的σ受体，如在Mukherjee等,J.Biol.Chem.,280,15619-27,2005中所描述的，其在此引入作为参考。在脂质体中与PEG-连接的磷脂偶联的茴香酰胺也靶向σ受体。(Banerjee等，Int.J.Cancer,112,693-700,2004，其在此引入作为参考)。
其它的脂质体递送媒介包括被设计为包封并递送小的寡核苷酸的脂质纳米颗粒。脂质纳米颗粒的实例包括，但不限于，例如，稳定的核酸-脂质颗粒(SNALPs；参见例如，Semple等，Nature Biotech.Lett.(Jan 17,2010doi:10.1038/nbt.1602)；和lipidoids(参见例如，Love等，P.N.A.S.(USA)107(5)1864-1869)。
3.聚合物囊泡
在进一步的实施方式中，寡核苷酸被隔离在聚合物囊泡中。聚合物囊泡可以从许多不同的材料制成，但一般由嵌段共聚物形成的，例如，聚苯乙烯40-聚(异氰基-L-丙氨酸-L-丙氨酸)m。(参见例如，Discher等，Science,297:967-73,2002；Torchilin,Cell.Mol.Life Sci,61:2549-59,2004；Taubert等,Curr Opin Chem Biol,8:598-603,2004；Lee等,Pharm.Res.,22:1-10,2005；和Gaucher等,J.Control.Rel,109:169-88,2005，其各自在此引入作为参考。)共聚物囊泡由许多分子形成，包括，但不限于，聚丙烯酸-聚苯乙烯、非离子型聚环氧乙烷-聚丁二烯、三嵌段(聚环氧乙烷)5-(聚[环氧丙烷])68-(聚环氧乙烷)5、聚环氧乙烷-聚(硫化丙烯)、聚环氧乙烷-聚交酯和聚乙二醇-聚赖氨酸。许多共聚物，尤其是那些两性或带相反电荷的共聚物，包括聚苯乙烯40-聚(异氰基-L-丙氨酸-L-丙氨酸)m，在水性条件下自组装成囊泡。
使用几种方法可以将寡核苷酸加载到聚合物囊泡中。首先，该嵌段共聚物可在水性溶剂中与寡核苷酸一起溶解。这种方法可以很好地对于适度疏水的共聚物发挥作用。第二，对于不容易溶解在水中的两性共聚物，并且在可得到溶解寡核苷酸和共聚物两者的溶剂的情况下，所述寡核苷酸和共聚物溶解在溶剂中且混合物对水透析。第三种方法包括在水/叔丁醇混合物中溶解寡核苷酸和共聚物两者，并随后冻干溶剂。当冻干的寡核苷酸-共聚物重新溶解在可注射介质中时，所述寡核苷酸-装载的囊泡自发形成。(Dufresne等，Gurny,(ed.),B.T.Gattefosse,vol.96,Gattefosse,Saint-Priest,p.87-102,2003中，其在此引入作为参考。)
通过共聚物用双官能间隔物分子的后修饰将配体栓系于囊泡的外壳或通过直接合成异双功能的嵌段共聚物，可以将聚合物囊泡靶向特定细胞。
在再另一个实施方式中，寡核苷酸可以被隔离在杂合脂质体共聚物囊泡中，如在Ruysschaert等，J.Am.Chem.Soc.,127,6242-47,2005，其在此引入作为参考。例如，两性三嵌段共聚物，包括聚(2-甲基噁唑啉)-嵌段-聚(二甲基硅氧烷)-嵌段-聚(2-甲基噁唑啉)，可以与脂类(包括磷脂)相互作用以形成杂合的脂质体共聚物囊泡。
4.寡核苷酸修饰
在一些实施方式中，使用于递送的核酸密实以帮助它们的摄取(参见例如，美国专利6,008,366、6,383,811，通过引用并入本文)。在一些实施方式中，经由靶细胞结合部分将密实的核酸靶向特定的细胞类型(例如，癌细胞)(参见例如，美国专利5,844,107、6,077,835，其每一个通过引用并入本文)。
在一些实施方式中，寡核苷酸偶联于其它化合物以帮助其递送。例如，在一些实施方式中，将核酸与聚乙二醇偶联以帮助其递送(参见例如，美国专利6,177,274、6,287,591、6,447,752、6,447,753和6,440,743，其各自通过引用并入本文)。而在其它的实施方式中，寡核苷酸偶联于保护的接枝共聚物，其是可带电荷的“药物纳米载体(PharmaIn)”，在美国专利号7.138,105，和美国公开号2006/093660和2006/0239924中描述，其在此通过引用引入。在更进一步的实施方式中，寡核苷酸转运到细胞中通过与维生素的偶联促进(Endocyte,Inc,West Lafayette,IN；参见例如，美国专利5,108,921、5,416,016、5,635,382、6,291,673和WO 02/085908；其各自在此引入作为参考)。在其它实施方式中，寡核苷酸偶联于纳米颗粒(例如，NanoMedPharmaceuticals；Kalamazoo,MI)。
而在其它实施方式中，寡核苷酸与枝状聚合物相关联。枝状聚合物是具有高度支化的分子结构的合成大分子。代表性的枝状结构是阳离子聚合物，例如星放射状聚酰胺胺(PAMAM)，其中之一()可购自Qiagen(Valencia,CA)。其它枝状聚合物包括聚酯树状聚合物(dentrimers)，由Gillies等，Mol.Pharm.,2:129-38,2005描述，其在此引入作为参考；苯乙炔枝状聚合物，描述在Janssen和Meijer,eds,Synthesis of Polymers,Materials science and technologyseries,Weinheim,Germany:Wiley-VCH Verlag GMBH,Chapter 12,1999中，其在此引入作为参考；聚(L-赖氨酸)枝状聚合物-嵌段-聚(乙二醇)-嵌段-聚(L-赖氨酸)枝状聚合物描述于Choi等，J.Am.Chem.Soc.122,474-80,2000，其在此引入作为参考；两性枝状聚合物，描述于Joester等，Angew Chem Int.Ed.Engl.,42:1486-90,2003，其在此引入作为参考；聚乙二醇星样偶联物，描述于Liu等，Polym Chem,37:3492-3503,1999，其在此引入作为参考；含阳离子磷的枝状聚合物，描述于Loup等，Chem Eur J,5:3644-50,1999，其在此引入作为参考；聚(L-赖氨酸)枝状聚合物，描述于Ohasaki等，Bioconjug Chem,13:510-17,2002，其在此引入作为参考；和两性不对称枝状聚合物，描述于Shah等，Int.J.Pharm,208:41-48,2000，其在此引入作为参考。聚丙烯亚胺枝状聚合物，描述于Tack等，J.Drug Target,14:69-86,2006，其在此引入作为参考；和上述的其它枝状聚合物，可以被化学修饰以降低毒性，例如，如在Tack等中描述的。
枝状聚合物与核酸复合，正如其它具有高电荷密度的阳离子聚合物一样。在一般情况下，枝状聚合物-核酸的相互作用是基于静电相互作用。枝状聚合物可以与其它分子偶联，如环糊精以提高枝状聚合物-核酸复合物全身递送的效率(参见Dufes等，Adv.Drug Del.Rev,57,2177-2202,2005及Svenson和Tomalia,Adv.Drug Del.Rev.,57,2106-29,2005，两者都引入本文作为参考)。有些枝状聚合物具有柔性的开放式结构(其可以在其内部捕获小分子)，且其它树状聚合物具有不可接近的内部。(见Svenson和Tomalia，Adv.Drug Del.Rev.,57,2106-29,2005)
在更进一步的实施方式中，寡核苷酸与另外的聚合物复合以帮助递送(参见例如，美国专利6,379,966、6,339,067、5,744,335；其各自通过引用并入本文。例如，N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺的聚合物在美国专利公开号2006/0014695中描述，其在此引入作为参考。类似的阳离子聚合物描述于国际专利公开号WO 03/066054和美国专利公开号2006/0051315中，二者均通过引用并入本文。其它聚合物由IntradigmCorp.,Rockville,MD描述)。
5.其它的递送方法
在更进一步的实施方式中，由Mirus(Madison,WI)开发的受控高压递送系统被用于递送寡核苷酸。该递送系统在6,379,966号美国专利中描述，其在此引入作为参考。
B.配制、施用和用途
本发明的组合物可以口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、经鼻、眼内、口腔、阴道或者经植入型储存剂施用。本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、intraleRuysschaersional和颅内注射或输注技术。优选的是，该组合物口服、腹膜内或静脉施用。本发明组合物的无菌注射形式可以是水性或油性悬浮液。可根据本领域中已知的技术使用适当的分散或湿润剂和悬浮剂来配制这些悬浮液。无菌注射制剂还可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的介质和溶剂包括水、林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和葡萄糖溶液。此外，无菌、不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。
为了这个目的，可以使用任何温和的非挥发性油，包括合成的单-或二-甘油酯。脂肪酸诸如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备注射剂，因为它们是天然的药学上可接受的油，如橄榄油或蓖麻油，尤其是它们聚氧乙烯化形式。这些油溶液或悬浮液也可以含有长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或类似的分散剂，它们常用配制药学上可接受的剂型，包括乳剂和混悬剂。其它常用的表面活性剂，如吐温、司盘和其它乳化剂或生物利用度增强剂(其通常用于制备药学上可接受的固体、液体或其它剂型)，也可以用于制剂的目的。
在其中低聚物制备成脂质体的实施方式中，低聚物/脂质体制剂可以冻干或喷雾干燥进行存储。合适的冷冻保护剂和喷雾干燥防护剂可以包括糖类，例如，但不限于，葡萄糖、蔗糖、海藻糖、异麦芽糖、麦芽三糖(somaltotriose)和乳糖。其它的冷冻保护剂可包括二甲亚砜、山梨糖醇和改变玻璃相熔化温度(Tm)的其它试剂。制剂可以包括抗粘剂如硬脂酸镁和亮氨酸，缓冲剂如Tris或磷酸盐缓冲液，和螯合剂如EDTA。
本发明的药学上可接受的组合物可以以任意口服可接受的剂型口服施用，包括但不限于胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。在用于口服使用的片剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还加入润滑剂，例如硬脂酸镁。对于以胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当需要水悬浮液用于口服使用时，活性成分与乳化剂和悬浮剂结合。如果需要的话，也可加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。
或者，本发明的药学上可接受的组合物可以以栓剂的形式施用用于直肠给药。它们可以通过将药剂混合于在室温下是固体但在直肠温度下是液体而因此将在直肠中融化以释放药物的合适的非刺激性赋形剂来制备。这样的材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
本发明的药学上可接受的组合物也可以局部施用，特别是当治疗的靶标包括通过局部施用易于接触的区域或器官，包括眼、皮肤或下肠道的疾病。容易制备合适的局部制剂用于这些部位或器官中的每一个。
局部应用于下肠道可以以直肠栓剂制剂(见上文)或合适的灌肠剂来实现。也可以使用局部透皮贴剂。
对于局部施用，药学上可接受的组合物可以在含有在一种或多种载体中悬浮或溶解的活性组分的合适软膏中配制。用于局部施用本发明化合物的载体包括，但不限于，矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。可选地，药学上可接受的组合物可以在含有在一种或多种药学上可接受的载体中悬浮或溶解的活性组分中的活性组分的合适洗剂或霜剂中配制。合适的载体包括，但不限于，矿物油、山梨聚糖单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
对于眼科应用，所述药学上可接受的组合物可以在等渗的、pH调节的无菌盐水中配制成微粉化悬浮剂，或优选在等渗的、pH调节的无菌盐水中的溶液，含有或不含防腐剂如苯扎氯铵。或者，对于眼科应用，药学上可接受的组合物可以配制在软膏例如凡士林中。
本发明的药学上可接受的组合物还可以通过鼻用气雾剂或吸入施用。这类组合物根据药物制剂领域中公知的技术进行配制，并且可以制备为盐水中的溶液，使用苄醇或其它合适的防腐剂、提高生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其它常规增溶剂或分散剂。
在一些实施方式中，本发明的药学上可接受的组合物配制用于口服施用。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的组合物的本发明化合物的量将根据所治疗的宿主、具体的施用方式而变化。
C.生物标志物
本发明的实施方式可以包括在施用本发明的寡核苷酸或药物组合物后，从生物样品检测一种或多种蛋白质生物标志物，以评估施用本发明的所述寡核苷酸或药物组合物后BCL2的表达是否受影响。
如在本申请中使用的，“生物样品”是指从受试者体内得到的任何材料或流体(血液、淋巴等)，其含有或可能包含基因组DNA(染色体和线粒体DNA)或其它寡核苷酸，如，例如，从源自基因组DNA的mRNA。术语“生物样品”的含义中还包括器官或组织提取物和其中孵育来自受试者的任何细胞或组织制剂的培养流体。获得生物样品的方法是本领域众所周知的。可以使用本领域中公知的方法从生物样品中提取蛋白质。在一些实施方式中，样品中蛋白质生物标志物的水平可以直接测定(即，没有提取步骤)。
在本发明的情况中“标志物”是指一种有机生物分子，特别是多肽，其在施用本发明的寡核苷酸或药物组合物后从受试者获得的样品中相比于在施用本发明的寡核苷酸或药物组合物之前从受试者获得的相当样品中是差异存在的。例如，标志物可以是多肽(具有特定表观分子量)，其与具有阴性诊断的患者的样品相比，在前列腺癌患者的样品中以升高或降低的水平存在。
“有机生物分子”指的是生物来源的有机分子，例如，甾醇、氨基酸、核苷酸、糖、多肽、多核苷酸、复合碳水化合物或脂质。
短语“差异存在”指的是从患有前列腺癌的患者所取得的样品中存在的多肽的量(特定表观分子量)，相比于从没有前列腺癌症的患者(例如，具有良性前列腺增生)所取得的相当样品的差异。如果在一个样品中多肽的量显著不同于其它的样品中多肽的量，多肽在两个样品之间是差异存在的。
例如，如果它存在的量(例如，浓度、质量、摩尔量等)比它在其它样品中存在的量高至少约150％、至少约200％、至少约500％或至少约1000％，或者如果它在一个样品中是可检测的而在另一个中不可检测，则多肽在两个样品之间是差异存在的。
标志物的“测试量”是指存在于被测试的样品中的标志物的量。测试量可以是在绝对量(例如，ng/ml)或相对量(例如，信号的相对强度)。
标志物的“对照量”可以是与标志物的测试量进行比较的任何量或量的范围。例如，标志物的对照量可以是在本发明的寡核苷酸或药物组合物的施用前或施用期间受试者中标志物的量。对照量可以是绝对量(例如，ng/ml)或相对量(例如，信号的相对强度)。
“洗脱液”或“洗涤液”指的是可被用于介导标志物对吸附剂的吸附的试剂。洗脱液和洗涤液也被称为“选择性阈调节剂”。洗脱液和洗涤液可以被用来从探针基质表面洗涤和除去未结合的物质。
“解析”、“分辨”或“标志物的拆分”指的是检测样品中的至少一种标志物。解析包括通过分离和随后的差分检测来检测样品中的多种标志物。解析不要求标志物与混合物中的所有其它标志物完全分离。
相反，任何分离足以允许至少两种标志物之间的区别。
“检测”是指识别被检测目标的存在、不存在或量。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用来指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。多肽可被修饰，例如，通过加入糖残基，以形成糖蛋白。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”包括糖蛋白以及非糖蛋白。
“可检测部分”或“标记”是指通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段可检测的组成。例如，有用的标记包括32p、35S、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，在ELISA中通常使用的)、生物素-抗生物素蛋白链菌素、地高辛、半抗原和其抗血清或单克隆抗体可得的蛋白质，或具有与靶互补的序列的核酸分子。可检测部分通常产生可测量的信号，例如放射性、发色的或荧光信号，其可以被用于定量样品中结合的可检测部分的量。可检测部分可以共价地或通过离子、范德华力或氢键被结合或附着于引物或探针，例如，并入放射性核苷酸或被抗生物素蛋白链菌素识别的生物素化核苷酸。
可检测部分可以是直接或间接地检测的。间接检测可包括将第二可直接或间接检测部分与该可检测的部分的结合。例如，可检测部分可以是结合伴体的配体，如生物素，其为抗生物素蛋白链菌素的结合伴体，或者是核苷酸序列，其是对于它可以特异性杂交的互补序列的结合伴体。
结合伴体本身可以是直接检测的，例如，抗体可以本身用荧光分子标记。结合伴体也可以间接检测，例如，具有互补核苷酸序列的核酸可以是分支的DNA分子的一部分，其随之可通过与其它的标记核酸分子杂交来检测。(参见，例如，P.D.Fahrlander和A.Klausner,BiolTechnology 6:1165(1988)。信号的定量是通过，例如，闪烁计数、密度测定或流式细胞术实现。
“测量”在其所有语法形式中是指检测、定量或测定物理实体的量(包括摩尔量)、浓度或质量或化学组成，在定量的情况下的绝对值，或者相对于相当物理实体或化学组成的值。
“抗体”是指特异性结合和识别表位(例如，抗原)的基本上由一种或多种免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽配体。公认的免疫球蛋白基因包括κ和λ轻链恒定区基因，α、γ、δ、ε和μ重链恒定区基因，以及众多的免疫球蛋白可变区基因。抗体存在为，例如，完整的免疫球蛋白或为由各种肽酶消化产生的许多良好表征的片段。这包括，例如，Fab'和F(ab)'2片段。在这里使用的术语“抗体”也包括通过完整抗体的修饰而产生的抗体片段或用重组DNA方法从头合成的那些。它也包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或单链抗体。抗体的“Fc”部分是指免疫球蛋白重链的部分，其包含一个或多个重链恒定区结构域，CH1、CH2和CH3，但不包括重链可变区。
“免疫分析”是使用特异性结合抗原的抗体的分析法。免疫分析的特征在于使用特定抗体的特异性结合特性来分离、靶向和/或量化抗原。
短语“特异性(或选择性)结合”于抗体或“特异性(或选择性)与…免疫反应”，当涉及蛋白质或肽时，是指确定蛋白质和其它生物物质的异质群体中蛋白质的存在的结合反应。因此，在指定的免疫分析条件下，所指明的抗体与特定蛋白质结合至少两倍于背景，且基本上不以显著量结合于存在于样品中的其它蛋白质。在这种条件下与抗体的特异性结合可能需要针对其对特定蛋白的特异性选择的抗体。例如，针对来自特定物种例如大鼠、小鼠或人的精液碱性蛋白产生的多克隆抗体可以被选择以获得仅与精液碱性蛋白特异性免疫反应和不与其它蛋白质(除了精液碱性蛋白的多态性变体和等位基因)反应的那些多克隆抗体。这一选择可通过减去与来自其它物种的精液碱性蛋白分子交叉反应的抗体来实现。可以使用多种免疫分析形式来选择与特定的蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫分析被常规地用于选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(见，例如，Harlow&Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(1988)，用于描述可用于测定特异性免疫反应性的免疫形式和条件)。典型地，特异性或选择性反应将至少两倍于背景信号或噪音，和更通常超过10至100倍于背景。
A.标志物的样品来源
样品优选是生物流体样品。可用于本发明的生物流体样品的实例包括血液、血清、尿液、前列腺液、精液流体、精液、精浆和前列腺组织(如上皮组织，包括其提取物)。
B.标志物的检测
得到样品后，可以使用任何合适的方法检测来自测试的受试者的样品中的标志物。例如，气相离子质谱法或免疫分析法都可以使用。
1.质谱
在一个实施方式中，使用质谱法检测本发明的标志物，更优选使用气相离子质谱法和，还更优选地，使用表面增强激光解吸/电离质谱(“SELDI”)。SELDI是用于生物分子的气相离子质谱法的改进方法。在SELDI中，分析物被施加在其上的表面在分析物的捕获、解析(desorption)和/或解吸中起着积极作用。
用于生物分子的气相离子质谱法的一种通用方法是MALDI(基质辅助激光解吸/电离)质谱法。在MALDI中，分析物通常是与基质材料混合，基质材料在干燥后形成捕获所述分析物的晶体。基质材料从能量源吸收能量，否则其将分裂生物分子分析物。
a)样品的制备
(i)预分级
在一个实施方式中，可以在进行气相离子质谱法之前预分级样品。预分级具有提供较低复杂性的样品用于分析的优点。另一方面，在分析过程中引入了额外步骤，其可能在例如临床环境中没有吸引力。样品可通过本领域已知的任何方式预分级，包括但不限于，大小分级分离和色谱分级分离。
在一个实施方式中，样品可以在通过气相离子质谱法分析之前预分级。分级的优选方法包括通过凝胶排阻色谱的第一分级分离。排除其分子量大于30kDa的分子的尺寸柱是特别有用的。
然后可以直接检查各种尺寸的级分或进行基于阴离子交换层析的第二分级分离步骤。使用阴离子交换Q旋转柱，可以使用低强度缓冲液(例如，约10mM至50mM的Tris、HEPES或PBS)与低到中等浓度(例如，约0.1M至0.6M)的盐和低浓度非离子型洗涤剂(例如，约0.05至0.2％的TritonX 100)洗脱标志物。特别有用的缓冲液是20mM Tris，0.5M NaCl和0.1％的TritonX 100。在另一个实施方式中，使用pH梯度洗脱标志物。
(ii)滞留色谱(retentate chromatography)
在另一个实施方式中，在气相离子质谱法之前，样品在生物色谱芯片上通过滞留色谱分级。优选的芯片是蛋白质阵列，可购自Ciphergen Biosystems,Inc.(Palo Alto,CA)。如上所述，该芯片或探针适于在质谱仪中使用。该芯片包含连接到其表面的吸附剂。在某些应用中，如在原位色谱树脂中，该吸附剂可以起作用。在基本的操作中，样品被施加到洗脱液中的吸附剂。在洗涤条件下吸附剂具有亲和力的分子结合到吸附剂上。
通过洗涤除去没有结合到所述吸附剂的分子。可以在各种严格性水平下进一步洗涤吸附剂以便分析物被保留或洗脱到适当的水平而进行分析。然后，能量吸收分子可以被加入吸附剂位点以进一步促进解吸和电离。通过从吸附剂解吸离子化和直接由检测器检测来检测分析物。因此，滞留色谱不同于传统的色谱法，其在于通过亲和性材料保留的分析物被检测到，而在传统的色谱中，从亲和性材料洗脱的物质被检测。
对于标志物集的标志物的有用的吸附剂是金属螯合吸附剂和尤其是铜。该表面也被pH中性缓冲液如PBS有利地洗涤。优选的表面是来自Ciphergen Biosystems,Inc的IMAC3。IMAC3包含铜螯合吸附剂。
对于本发明的任何标志物的另一种有用的吸附剂是与标志物特异性结合的抗体。包含结合于一种或多种标志物的抗体的芯片特别可用于除去未与抗体结合和在检测过程中充当“噪音”的非标志物。
如本领域中的任何技术人员显而易见的，使用吸附剂和洗脱剂的不同组合可以更容易地解析不同标志物。(iii)样品与能量吸收基质混合
在MALDI应用中，在电离和质量分析前将待分析样品与能量吸收基质混合。然后将样品/基质混合物应用到惰性质谱仪探头的表面上。合适的基质材料是本领域的技术人员所公知的和包括3-羟基吡啶甲酸(3-羟基-2-吡啶羧酸)、烟酸、N-氧化物、2'-6'-二羟基苯乙酮、龙胆酸(2,5二羟基苯甲酸)、α-氰基-4-羟基肉桂酸、阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)和芥子酸(3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)。
MALDI的分辨能力受到所分析的样品的复杂性限制。因此在进行MALDI分析前预分级分离或以其它方式纯化样品是优选的。
(iii)分析之前标志物的修饰
在另一个实施方式中，检测之前修饰标志物以改变它们的分子量。这些方法可以降低检测的模糊度。例如，在分析前可将标志物进行蛋白水解消化。任何蛋白酶都可以使用。蛋白酶如胰蛋白酶是特别有用的，其可将标志物切割成离散数目的片段。消化所产生的片段起到标志物的指纹的作用，从而使它们能够间接检测。对于其中具有类似分子量的标志物可能被混淆为所讨论的标志物的情况，这是特别有用的。此外，由于较小的标志物更容易通过质谱法解析，蛋白水解片段化对于高分子量标志物是有用的。在另一个实施方式中，可以通过将特异性结合分子标志物的特定分子量的标签的连接来修饰标志物，从而进一步区分它们。b)激光解吸/电离质谱的性质。在通过质谱法(优选气相离子质谱法)检测标志物后，可测定标志物的测试量。例如，在目的标志物的分子量下显示信号。根据所显示的信号的大小或强度，可以测定被测试的样品中标志物的量。值得注意的是，样品中标志物的测试量不需要以绝对单位来测量，而可以是以相对的单位，只要它可以定性或定量地与标志物的对照量相比。例如，检测的标志物的量可以在背景噪声的基础上按照相对强度显示。优选地，标志物的测试量和对照量在相同的条件下进行测定。
如果需要，标志物的绝对量可以通过校准来测定。例如，可以增加量加入纯化的已知的志物至探头表面上吸附剂的不同点。然后，可以获得来自各点的峰，和对各点处已知标志物蛋白质浓度绘制曲线图。从峰值强度vs浓度曲线，可测定在被测试的任何样品中标志物的绝对量。
2.免疫分析检测
在检测方法的另一个实施方式中，免疫分析可用于定性或定量地检测和分析样品中的标志物。此方法包括：(a)提供一种特异性结合标志物的抗体；(b)将样品与该抗体接触；和(c)检测抗体与所述样品中的标志物结合的复合物的存在。
为了制备与标志物特异性结合的抗体，可以使用纯化的标志物或它们的核酸序列。标志物的核酸和氨基酸序列可以通过这些标志物的进一步表征而获得。例如，每种标志物可以用多种酶(如胰蛋白酶、V8蛋白酶等)进行肽作图。来自每种标志物的消化片段的分子量可以用于检索数据库，例如SwissProt数据库，以获得匹配由各种酶产生的消化片段的分子量的序列。使用该方法，其它的标志物的核酸和氨基酸序列可以被识别，如果这些标志物是数据库中已知的蛋白质。
可选地，可以使用蛋白质梯测序(ladder sequencing)对蛋白质进行测序。蛋白梯可以通过，例如，将分子片段化并对片段进行酶消化或依次从该片段的末端除去单一氨基酸的其它方法生成。制备蛋白梯的方法描述于，例如，国际公开WO 93/24834(Chait等)和美国专利5,792,664(Chait等)中。随后通过质谱法对该蛋白梯进行分析。梯形片段的质量的差异鉴别从该分子的末端除去的氨基酸。
如果标志物不是数据库中已知的蛋白质，核酸和氨基酸序列可以用甚至标志物的氨基酸序列的一部分的知识来确定。例如，可以基于标志物的N-末端氨基酸序列制备简并探针。然后这些探针可以用于筛选从样品产生的基因组或cDNA文库，其中标志物最初从该样品检测到。阳性克隆可以被识别、放大，且它们的重组DNA序列可以使用公知的技术进行亚克隆。见，例如，Current Protocols for MolecularBiology(Ausubel等,Green Publishing Assoc.和Wiley-Interscience1989)和Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.(Sambrook等,Cold Spring Harbor Laboratory,NY 1989)。
使用纯化的标志物或它们的核酸序列，与标志物特异性结合的抗体可以使用本领域已知的任何合适方法制备。见例如，Coligan,CurrentProtocols in Immunology(1991)；Harlow&Lane,Antibodies:ALaboratory Manual(1988)；Goding,Monoclonal Antibodies:Principlesand Practice(2d ed.1986)；和Kohler&Milstein,Nature 256:495-497(1975)。这样的技术包括，但不限于，通过从噬菌体或类似载体中的重组抗体文库选择抗体的抗体制备，以及通过免疫兔或小鼠制备多克隆和单克隆抗体(见，例如，Huse等,Science 246:1275-1281(1989)；Ward等,Nature 341:544-546(1989))。
提供抗体后，可以使用多种公认的免疫结合分析中的任一种检测和/或定量标志物(见，例如，美国专利4,366,241；4,376,110；4,517,288；和4,837,168)。有用的分析包括，例如，酶免疫测定法(EIA)，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、Western印迹分析或狭缝印迹分析。对于一般免疫分析的综述，也参见见，Methods in Cell Biology:Antibodies in Cell Biology,volume 37(Asai,ed.1993)；Basic and Clinical Immunology(Stites&Terr,eds.,7th ed.1991)。
通常，从受试者获得的样品可以接触与标志物特异性结合的抗体。任选地，在将抗体与样品接触之前，该抗体可被固定到固体支持物上以方便清洗和随后的复合物分离。固体支持物的实例包括，例如，微量滴定板、棒、珠或微珠形式的玻璃或塑料。抗体也可连接到上述的探针基质或阵列。(见例如，Xiao等，Cancer Research62：6029-6033(2001))。该样品优选是从受试者采集的生物流体样品。生物流体样品的实例包括血液、血清、尿液、前列腺液、精液流体、精液、精浆和前列腺组织(如上皮组织，包括其提取物)。在一个优选的实施方式中，生物流体包含精浆。样品与抗体接触之前，可以用合适的洗脱剂对样品进行稀释。
样品与抗体孵育后，洗涤混合物且可以检测所形成的抗体-标志物复合物。这可以通过用检测试剂孵育洗涤混合物来完成。此检测试剂可以是，例如，用可检测标记进行标记的第二抗体。示例性的可检测标记包括磁珠(例如，DYNABEADSTM)、荧光染料、放射性标记、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶以及其他在ELISA中常用的酶)，和比色标记如胶体金或有色玻璃或塑料珠。可选地，样品中的标记物可以使用间接测定法(其中，例如，第二标记抗体被用于检测结合的标志物-特异性抗体)和/或在竞争或抑制性测定法(其中，例如，结合至标记物的不同表位的单克隆抗体同时与该混合物孵育)检测。
在整个分析试验中，试剂的每一组合之后可能需要孵育和/或洗涤步骤。孵育步骤可以从约5秒变化到几个小时，优选从约5分钟至约24小时。然而，温育时间将取决于分析形式、标志物、溶液体积、浓度等。通常，测定法将在环境温度下进行，虽然它们可以在一定温度范围内进行，如10℃至40℃。
免疫分析技术是本领域中众所周知的，且适用技术的总体综述可以在Harlow&Lane，同上中找到。免疫分析可用于测定来自受试者的样品中标志物的测试量。首先，可以使用上述免疫分析方法检测样品中的标志物的测试量。如果标志物存在于样品中，它会与在上述合适的孵育条件下与标志物特异性结合的抗体形成抗体-标志物复合物。可以通过与标准品比较来测定抗体-标志物复合物的量。如上所述，标志物的测试量不必以绝对单位来测量，只要测量单位可以与对照量比较。
C.生物标志物
合适的生物标志物可以包括，例如下列蛋白中的一种或多种：phosphpLeptin、GM-CSF、IL-20、MIP-1a(CCL3)、MMP-7、SAA和sCD40L。
在一些方面，合适的生物标志物包括磷酸化的BCL2、活性半胱天冬酶-3、PARP、瘦素、IL-1RA、IL-17a、MCP-1、MIP-1β和IP10或它们的组合。
在一些方面，合适的生物标志物包括淋巴细胞计数和血小板计数。从血浆中获得和计数血小板和淋巴细胞的方法是本领域公知的。
在体内与BCL2的表达相关的其它生物标志物可在本发明中使用。合适的生物标志物可以是涉及促-或抗-细胞凋亡途径或者两者的混合的其他基因。
D.试剂盒
本发明的实施方式包括用于在施用受试化合物用于在患有癌症的受试者中治疗BCL2介导的癌症后测定BCL2表达的下调的试剂盒，其包含：用于检测生物样品中一种或多种生物标志物的水平的探针，其中所述生物标志物选自于：磷酸化的BCL2、活性半胱天冬酶-3、PARP、淋巴细胞计数、血小板计数、瘦素、IL-1ra、IL-17a、MCP-1、MIP-1β和IP10或它们的组合。
合适的探针可以包括本文引用的任何其它探针。
Christine F.Garcia和Steven H.Swerdlow(2009)Best Practices inContemporary Diagnostic Immunohistochemistry：Panel Approach toHematolymphoid Proliferations.Archives of Pathology&LaboratoryMedicine:May 2009,Vol.133,No.5,pp.756-765
https://www.labcorp.com/wps/wcm/connect/IntOncologyLib/integratedoncology/resources/pdfs/test+requisition+forms/test-requisition-form-hematology-oncology
IV.癌症治疗的实施例
提供下面的实施例以证明和进一步说明本发明的某些优选的实施方式和各方面，并且不应当被解释为限制其范围。
实施例1：按癌症类型的PNT-2258的疗效
在关于PNT-2258单独或与其它化疗剂组合的有效性的先前的动物模型研究中，PNT2258的功效似乎随特定的癌症中BCL2表达的增加而提高(参见图1；即Daudi-Burkitts淋巴瘤；前列腺(PC-3)；黑色素瘤(A375)；弥漫性大细胞淋巴瘤(WSU-DLCL2))。
实施例2：患有各种癌症的人类患者中剂量范围研究的实验设计
在患有晚期实体瘤的人类患者中PNT2258的开放标签、无对照、1期剂量递增研究，患者以2个小时静脉输注接受PNT2258，每天一次，在21天(3个星期)的周期中连续5天(第1-5天)。初始剂量水平为1mg/m2。剂量加倍直至完成64mg/m2的剂量水平(例如，群组1＝1mg/m2；群组2＝2mg/m2；群组3＝4mg/m2)。此后，剂量增加应当以30mg/m2增量的增加持续进行，下一个剂量水平在90mg/m2和在随后的剂量递增中继续至120mg/m2和150mg/m2。如果给药剂量≤64mg/m2的患者在周期1过程中经历≥2级的毒性(排除脱发、恶心或低于最大止吐处理的呕吐和小于最大止泻处理的腹泻)，则遵守DLTS(剂量限制性毒性)的指导使用3-6名患者的群组剂量以33％增量增加。
关于这项研究的DLT被定义为在周期1过程中经历的以下治疗相关事件：
-超过5天持续时间的4级嗜中性白细胞减少症，或任何持续时间的3级或更高的发热性嗜中性白细胞减少症。
-4级血小板减少症。
-任何3级或更高的非血液系统毒性(除脱发、恶心/用止吐剂良好控制的呕吐，以及认为是临床上不显著的或在基线处升高的实验室异常)。
-任何毒性导致超过2周的治疗延迟。
-需要从研究中退出的急性输液反应(即输注中断后不消退至基线或≤1级和以较低速度恢复)。
-对于具有基线1或2级异常的患者AST(SGOT)/ALT(SGPT)的2级增加。
基于周期1的第1天在给药之前获得的患者计算体表面积计算在每个周期的开始剂量，除非自基线有≥10％的变化。如果有≥10％的变化，目前的体重用来计算用于该周期的剂量。
如果患者出现在输注过程中对治疗的急性反应，输注速率可以根据研究者的判断降低或输注可能被中断直到反应消退至基线或≤1级；然而，包括中断的总输液时间可能不超过6小时。如果毒性没有消退至基线或≤1级，输注被终止且患者从研究中退出。出现临床显著输液反应的患者在后续剂量之前接受前驱用药。
大多数患者以2小时静脉滴注接受PNT22582，每天一次，21天周期(3周)的连续5天(第1-5天)。然而，几名患者在周期1或周期2中以三分之一(6小时)或一半(4小时)的给药速率接受PNT2258。此外，几名患者接受PNT2258连续4天而不是连续5天或几名患者作为28天的周期(4周)的一部分接受PNT2258。总体而言，1-150mg/m2的剂量范围是耐受性良好的。针对病人耐受性和返回到诊所进行给药的可行性调整给药速率和给药时间表，从而以不同的剂量方案提供对PNT2258的支持。
图2提供了患者信息并分配到剂量和安全性研究中，并且还通过研究示出具有特定癌症类型的患者的数目。
实施例3：研究期间的肿瘤反应。
受试患者在研究中保留的中位周期数是两个周期。患者在研究中保留的中位时间是6周。注意，用PNT2258治疗的几名患者在研究中保持6-8个周期(即，16-24周)，如示于图3中。有趣的是注意到，由于稳定病情而留在研究中最长的患者良好地对应于已知为BCL2依赖性的肿瘤类型且在网状内皮系统(RES)的组织中。
从血浆生物标志物结果显现的附加因素(见下文)是见于大多数患者的瘦素上调。不受理论的限制，许多的最佳响应的患者具有葡萄糖和胆固醇特征，其暗示代谢综合征或提高的炎性状态。公知的是，低级慢性炎症状态诱导增强细胞存活的许多通路的上调。这些炎症状态与许多类型的癌症有很强的相关性。BCL2是被上调的途径之一。瘦素信号传导是与癌症，特别是乳腺癌，相关的另一途径。
具有持久的低级炎症的患者已显示出对胰岛素和瘦素信号传导两者的抗性。因此，虽然观察到瘦素上调(其可以赋予对BCL2下调的抗性)，这些患者由于其降低的瘦素信号传导感受能力而没有表现出与具有稍低程度的全身炎症标志物输送的那些患者相同程度的对补偿标志物的响应。或者，由于增加的瘦素与增加的BCL2转录相关(见Lam，Q.L.K.等(2010)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA107:13812-13817)，瘦素产生的反馈回路可以创建其中阻断BCL2转录的PNT2258作用模式被增强的环境。PNT2258导致IL-RA(与抗炎效应相关的标志物)增加，进一步支持了可以与患有伴随炎症的患者(例如具有代谢综合征的那些)相关的有利的和抗炎的作用。
实施例4：PNT2258给药前和后受试者外周血单核细胞(PBMC)中BCL2表达的分析
外周血单核细胞(PBMC)被广泛地用作肿瘤组织/细胞的替代，如果感兴趣的蛋白质在肿瘤细胞和PBMC两者中表达。
在San Antonio，TX的START诊所收集来自患者的PBMC样品作为PNT2258的I期研究的部分。将样品在干冰上输送到测试点和在-70℃下冷冻贮存直到处理。在浓缩的10x裂解缓冲液(最终浓度0.1％的Triton X-100，20mM的EDTA，5mM的Tris，pH 8，1mM的原钒酸钠，2mM的PMSF和1％的各蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物)的存在下，将在临床位置作为在0.5mL PBS中的悬浮液冷冻的PBMC在冰上进行解冻，然后在水浴中超声处理10分钟，并于-70℃冷冻24小时。通过在4℃以7,000RCF离心15分钟将裂解物澄清，并将上清液移至新管中。取出二十μL等份使用微BCA分析(Thermo FisherScientific,Rockford,IL)用于蛋白质浓度的测定，且剩余的样品被冷冻在-70℃直到BCL2、磷酸化BCL2、GAPDH、活性半胱天冬酶-3和活性PARP的分析。
ELISA分析
采用下面的人-特异性定量ELISA试剂盒：铂ELISA法，用于BCL2(P.N.BMS244/3，eBioscience，Vienna，Austria)、Quantikine人活性半胱天冬酶-3ELISA(P.N.KM300,R&DSystems，Minneapolis,MN)、活性(裂解的)PARP(214/215)(P.N.KHO0741，Invitrogen，Camarillo，CA)和人甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH；P.N.KT-16442,Kamiya Biomedical Company,Seattle,WA)。蛋白酶抑制剂混合物(P.N.P8340)和广泛磷酸酶抑制剂混合物(分别P.Nos.P5726和P2850)和碳酸盐-重碳酸盐缓冲液胶囊(P.N.C3041-50CAP)自Sigma-Aldrich，St.Louis,MO获得。
对于磷酸-BCL2(Ser70)的ELISA的开发，使用兔IgG抗人磷酸-BCL2(Ser70)多克隆抗体(Pierce/Thermo Fisher Scientific Inc,Rockford,IL；P.N.PA1-14063)和抗人BCL2的兔多克隆抗体(PNab59348，Abcam，Cambridge,MA)。对应于人磷酸(ser70)BCL2的磷酸化位点周围的氨基酸序列的合成肽(RT-磷酸-S-P-L；进一步称为'五肽'；96.89％纯度)，也用作来制备抗磷酸-BCL2(Ser70)(PA1-14063)的抗体的免疫原，购自Biomatik，Cambridge，ON，Canada。
紫杉醇刺激的Jurkat细胞裂解物(EMD Millipore Corporation,St.Charles,MO；P.N.47-206)被用作阳性对照，和未刺激的Jurkat细胞裂解物(EMD Millipore Corporation,St.Charles,MO；P.N.47-206)被用作磷酸化BCL2(Ser70)ELISA开发中的阴性对照。Cliniplate EBV96孔(P.N.95019330)高亲和性蛋白结合板、QuantaBlu荧光过氧化物酶底物试剂盒(P.N.151569)、Restore Western Blot Stripping缓冲液(PN 21059)和SuperSignal West Pico Stable Peroxide and LuminalEnhancer溶液(P.Nos.1859674和1859675)购自Thermo FisherScientific(Waltham,MA)。
Western印迹
将五μL等份的PBMC裂解物加入15μL还原性SDS缓冲液中并在具有生物素化蛋白质梯(Cell Signaling Technology公司，Beverly,MA)和Kaleidoscope预染色蛋白质标准品(Bio-Rad实验室，Hercules,CA)的4-15％Criterion TGX SDS聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad实验室，Hercules,CA)中解析。将凝胶转印至Hybond-C硝基纤维素(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)且将膜在5％的ECL高级封闭溶液(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)中封闭。将膜在4℃下与下列初级兔抗人单克隆抗体一起孵育过夜：磷酸化BCL2(Ser70)(克隆5H2、P.N.2827，Cell Signaling，Danvers，MA)和总BCL2(P.N.ab59348,Abcam,Cambridge,MA)，都以1：1000稀释度。首先进行磷酸化BCL2探测。然后对于检测总BCL2，首先通过与剥离缓冲液一起温育15分钟而将膜剥离，如上所述洗涤并封闭。抗兔IgG HRP偶联物以1：2,000稀释度用作第二抗体(P.N.SA1-5910,Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)，并在室温下孵育1小时。用2.5％的ECL高级封闭溶液对所有抗体进行稀释。目标蛋白用ECL高级Western印迹检测试剂盒通过增强的化学发光可视化和捕获在Hyperfilm-ECL膜上(均购自Amersham Biosciences)。针对标准品验证靶蛋白的分子量。使用显像密度计获得图像，并用ImageQuant软件(Molecular Dynamics)定量。
通过ELISA的蛋白质免疫检测
根据供应商的说明用在这些试剂盒中包括的适当的标准对总BCL2、活性半胱天冬酶3、活性PARP和GAPDH进行ELISA。一式两份在七个连续稀释中对所有标准品进行测定；裂解缓冲液被用作阴性对照。尽管最初对于0.1mg/mL总蛋白的测试样品提出，因为在很多裂解物中低的总蛋白浓度，将样品一式三份测定而无需额外稀释。
建立磷酸化BCL2(Ser70)的ELISA
为了开发内部ELISA方案用于测量人磷酸BCL2(Ser70)的水平，基于ELISA开发3；4的方案的三组不同的条件使用以下A-H行，1-12列中的设置在96孔形式中检验：
A  五肽20,000ng/mL
B  五肽2000ng/mL
C  五肽200ng/mL
D  五肽20ng/mL
E五肽  2ng/mL
阳性对照F Jurkat T细胞紫杉醇刺激的5 ng/mL
阴性对照G Jurkat T细胞7.6.4  10ng/mL
空白H抗原稀释缓冲液 0
直接捕获ELISA(在PBS中)
将PBS中的牛血清白蛋白(10μg/mL)用作抗原稀释缓冲液。将5个系列稀释的五肽(A-E行)、紫杉醇刺激的Jurkat细胞裂解物(F行)、未刺激的Jurkat细胞裂解物(G行)和单独的抗原稀释缓冲液(H行)在50μL体积中接种96孔板的1-12列。将板密封并在4℃下储存过夜。用340μL的洗涤缓冲液(0.05％Tweeen-20在PBS中)伴随在水平摇动器上100rpm的振荡将孔洗涤4次(每次1分钟)，并在100μL的PBS中5％无脂干乳在室温下封闭2小时。将孔如上洗涤并在室温下用在抗体稀释缓冲液(PBS中1％无脂干乳)中制备的1：10,000抗体-磷酸BCL2(Ser70)(ab28819)孵育2小时。这是按照供应商的方案用于ELISA的推荐的抗体稀释度。如上所述4次洗涤之后，A-D行用在抗体稀释缓冲液中1：2000稀释的山羊-抗-兔HRP偶联物在室温下孵育1小时，而E-H行以1：5000稀释的相同抗体孵育。如上洗涤之后，向每个孔中加入100μL的QuantaBlu荧光过氧化物酶底物溶液，并在室温下孵育30分钟，然后将90μL等份转移到透明底白色荧光板的相应孔，并记录荧光(在355nm处激发，在460nm处发射)。
直接捕获ELISA(碳酸盐/重碳酸盐缓冲液pH9.6)
该方案是如上所述方案的副本，除了使用0.2M碳酸盐/重碳酸盐缓冲液pH 9.6来制备抗原用于接种以最大化蛋白质与板的结合。所述板的一半(1-6列)在PBS中5％的脱脂乳封闭和另一半(7-12列)在PBS中5％的BSA中封闭。在1％乳或BSA中制备后续抗体溶液以匹配封闭溶液的组成。此外，以1：2000(列1、4、7和10)、1：4000(列2、5、8和11)和1：8000(列3、6、9和12)的多个稀释度检验第一抗体。以1：1000(列1-3和7-9)和1：2000(列4-6和10-12)测试第二抗体。
夹心ELISA
用100μL在0.2M的碳酸盐/重碳酸盐缓冲液pH 9.6中以1：1000稀释的磷酸BCL2(Ser70)抗体(捕获抗体)溶液涂覆Cliniplate的所有96孔板，并且将板密封和在4℃孵育过夜。如上洗涤之后，将在0.2M碳酸盐/重碳酸盐缓冲液pH 9.6中制备的抗原溶液接种至A-H行，1-12列中，将板密封并在4℃孵育过夜。以下的步骤按照对于碳酸盐/重碳酸盐缓冲液pH 9.6中的直接捕获ELISA的概述进行，除了抗BCL2的兔多克隆抗体被用作第一抗体。
结果
从基线(给药前)和PNT2258给药第5天后在BCL2、活化(磷酸化)BCL2、半胱天冬酶-3和PARP裂解的百分变化示于图4(左)中。PNT2258给药后多数患者表现出BCL2的降低。提供了观察到的半胱天冬酶-3和PARP裂解增加中BCL2的减少的进一步证据。BCL2的减少启动导致半胱天冬酶激活和PARP裂解的事件级联，这是凋亡细胞死亡的标志。
用约100mg/m2的剂量饱和的PNT2258治疗后，注意到BCL2的剂量依赖性降低。(图4，右)。检查整个受试患者肿瘤类型的数据产生有趣的结果，其中胰腺癌、肺癌和肉瘤癌症的BCL2降低程度的差异表现出最大百分比。(图5)。值得注意的是，前列腺癌和结肠直肠癌似乎通过增加BCL2而响应于PNT2258，BCL2增加可能是响应于治疗。
在PBMC中BCL2敲减的程度可能是PNT2258调节BCL2水平的能力的低估。这是由于这样的事实：PBMC由NK细胞和T细胞(淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞)所组成，且这种测量是高度时间依赖性的。注意到PNT2258治疗后淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞减少。因此，被采样的PBMC群体可以是(1)静态的和非积极细胞周期的细胞或(2)新释放的细胞。在BCL2水平高度抑制时，这由于细胞可能清除的事实进一步复杂化。
实施例5：PNT2258给药患者的淋巴细胞和血小板数量/计数的分 析
淋巴细胞是BCL2的强烈表达者且其清除是BCL2依赖性的。BCL2隔绝Bim(属于短BH3结构域内类似其它BCL2家族成员的不同蛋白质亚组的促凋亡(apototic)蛋白)。Bim对造血系统细胞动态平衡是至关重要的。PNT2258在淋巴细胞中由于BCL2靶向引起短暂的、但明显的可测量的降低。(图6)。淋巴细胞在PNT2258施用过程中表现出降低，具有大约100X施用量的剂量饱和。
血小板减少症是化疗剂的常见的副作用。对于BCL2靶向剂，血小板减少可以代表剂量限制性毒性。这种毒性可以由调节BCL2家族成员从而引起血小板的增强凋亡清除的对靶效应引起。
用PNT2258观察到的血小板减少症可以是BCL2抑制的功能和脂质体载体对骨髓和脾(RES组织)而不是循环血小板的效应。在第5-9天出现剂量依赖性的血小板最低点，这表明主要是由于巨核细胞的效应和对靶bcl-2效应。该数据表明PNT2258给药后血小板计数的下降趋势，其在群组7开始，在第5天观察到效果和在第9天观察到最低点(图7)。本研究中观察到的下降和瞬时效应的时机与PNT2258影响巨核细胞而不是循环血小板的想法一致。血小板是无核的，且因此不应受PNT2258的影响。另一方面，巨核细胞在它们成熟后脱落血小板。巨核细胞主要是由骨髓和脾产生的并调整其细胞质和细胞膜以使血小板生物合成通过增和核内有丝分裂(一种扩增DNA多达64倍的过程)而成为可能。不被理论所限制，PNT2258被认为正是在这一点上起作用并因此可能影响血小板生成和造成在较高剂量下注意到的瞬态时延迟的血小板下降趋势。与此相反，用ABT-263观察到立即的血小板减少，这可能是由于其在循环细胞中BCL2、Bcl-xL和Mcl-1的靶向破坏，从而导致它们的清除。
实施例6：在小鼠模型中施用PNT2258后的血浆蛋白生物标志物
在两个小鼠模型中施用PNT-2258后进行多重免疫分析，用作上述研究中对入组的人类受试者进行的免疫分析(在下面的实施例中提供数据)的比较。
16-18周龄体重约25g的具免疫能力的雌性BALB/c小鼠购自Taconic Farms(Hudson,NY)。运送后至少72小时使动物适应实验室环境。以下制剂用于注射：PNT2258、PNTE(空脂质体)和包封在与PNT2258相同的脂质体组合物中的乱序寡核苷酸(乱序的)用无菌PBS稀释至2mg/mL的最终浓度。小鼠用120μL的制剂注射，其相当于10mg/Kg的剂量。注射后24小时将动物处死并立即放血用于血浆的制备。
植入了WSU-DLCL2异种移植片段的4-6周龄的雌性C.B-17SCID小鼠使用类似的方案。当肿瘤体积达到300-400mm3时用PNT2258或乱序对照处理这些小鼠。
在正常小鼠(具有适应性免疫和先天免疫功能)或具有WSU-DLCL2肿瘤异种移植的小鼠(只具有先天免疫)中施用PNT2258(包封在SMARTICLES中的PNT100)与包封在SMARTICLES中的PNT100的乱序序列。
用于Luminex多重免疫分析的方法
该分析遵循对于鼠分析物(Streeper R.T.,Diaz A.,Campos D.,Michalek J.,Louden C,Furmaga W.,Izbicka E.(2011)Syntra-5downregulates inflammatory signaling in obese type 2diabetes murinemodel in vivo.Curr.Topics Nutraceutical Res.9:1-12)和人类分析物(Izbicka E.,Streeper R.T.,Michalek J.,Louden C.,Diaz A.,Campos D.(2012)Plasma biomarkers distinguish non-small cell lung cancer fromasthma and differ in men and women.Cancer Genomics Proteomics9(1):27-35)所描述的标准方案。在例如US 7,888,051，和Izbicka,E.等.(2012)Cancer Genomics&Proteomics 9:27-36中进一步讨论了用于Luminex生物分析的方法。
使用购自Affymetrix(Fremont，CA，USA)的Procarta试剂盒在小鼠中分析下面的血浆蛋白质分析物。
小鼠37-重
根据试剂盒生产商的方案将所有标本一式两份进行分析。用Luminex 100IS系统(Luminex Corporation，Austin,TX)进行多重免疫分析。使用Bio-Plex Manager 4.1.1(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)从标准曲线计算分析物的浓度。
正常Balb/c小鼠：
结果表明，在正常小鼠中，包封在SMARTICLES中的两种寡核苷酸都表现出随着所观察到的IFNγ、IL-12p40、IL-6、MCP-1、MCP-3和RANTES升高的典型免疫应答。(图8)。数据显示，对于这两组之间这些标志物相对于载体对照没有显示出显著的生化或统计学差异。
PNT2258和乱序对照显示免疫标志物G-CSF、GM-CSF、IL-12p70、IL-10、IL-1b、IL-1a、一系列的其它的标志物和瘦素的减少；注意到IL-12p40和趋化因子MCP-1、MCP-3和RANTES的增加。
WSU-DLCL2异种移植的裸鼠：
在与评估抗肿瘤作用相同的模型中包封在SMARTICLES中的测试PNT2258和乱序对照代表测试免疫效应是否有助于抗肿瘤活性的更好系统。重要的是，异种移植物可能更近似可能是免疫抑制的患者。
结果显示出两种颗粒都引起类似于正常小鼠观察到的G-CSF、IFNγ、IL-12p40、IL-6、MCP-1、MCP-3和RANTES的升高，但这些标志物在异种移植中的增加幅度比正常小鼠中高得多和在某些情况下高达10倍。(图9)。在PNT2258和乱序之间无统计学显著的差异，但是趋势表明PNT2258导致升高量的减小。结果也显示瘦素、GM-CSF、IL-12p70、IL-10、IL-1β、IL-1α和一系列其它标志物的降低。
实施例7：人类患者中施用PNT2258后的血浆蛋白标志物
样本和化学品
在EDTA Vacutainer中从正常健康供体的全血获得人PBMC样本，和用购自SeraCare(Milford，MA)的Ficoll-Paque密度梯度离心分离。将冷冻制剂贮存在液氮中直至使用。Toll样受体(TLR)激动剂：TLR3；聚(I：C)LMW，TLR7；咪喹莫特和TLR9；ODN2006，购自InvivoGen(San Diego，CA)。使用包封在与PNT2258(乱序对照)相同的脂质体组合物中的PNT2258、PNTE(空脂质体)和乱序寡核苷酸。
细胞处理
将五个小瓶的PBMC(3百万/mL)在37℃下的水浴中解冻，用40mL预热的RPMI1460(无酚红，Gibco)与10％的FBS和0.1％的青霉素/链霉素(完全培养基)洗涤，用相同的培养基调整到5×105个细胞/mL，并以每孔5×105细胞接种于24孔板中。一小时后在37℃达到平衡，将PBMC用(a)PNT2258、乱序对照或空脂质体对照各以7.5、1.5和0.3μM的最终浓度处理。注：在完全培养基中制备相同稀释的空脂质体，并加入到PBMC中。包括未治疗的对照。制备组(a)的两个相同的重复并暴露于(b)聚(I：C)(10μg/mL)和咪喹莫特(0.25μg/mL)和(c)ODN2006(0.5μg/mL)的处理。选择TLR激动剂的浓度落入到按照InvivoGen规范的推荐范围内。在37℃的加湿培养箱中24孵育后，将细胞转移到标记的Eppendorf管中并通过离心沉淀。将条件化培养基转到新鲜管中和冷冻用于多重免疫分析。将剩余的细胞再悬浮于完全培养基中并使用MTS分析测试存活力。
54种分析物的多重免疫分析被用来鉴别在患者血浆中对PNT2258反应或抗性的生物标志物。这些分析物示于下表中。
人类54-重
药物治疗的整个连续过程中施用PNT2258之前和之后(8小时和24小时)选取时间点。标志物选择的结果示于下表中。
选择结果
在图10所示的蜘蛛曲线图(spider plot)表示PNT2258治疗后的患者反应。尽管许多标志物显示出统计学显著性(见上表)唯一的关键标志物受到两倍或更高的影响(注有星号)。PNT2258诱导下列标志物的统计学显著的剂量依赖性变化；瘦素和GM-CSF增加；IL-20、MIP-1α(CCL3)、MMP-7、SAA和sCD40L降低。此外，IL-RA(白介素受体激动剂起到阻断IL-1α和IL-1β的抗炎作用的功能)和IP-10(确认PNT2258对骨髓的影响；连接以减少集落形成)的增加提示抗炎和抗肿瘤活性。MIP-1β和MCP-1给出PNT2258作为纳米颗粒的识别，并提示先天免疫细胞的募集。
如图10和11所示的标志物可以与BCL2调节关联。科学文献中包含了增加的血浆瘦素水平与细胞BCL2水平的抑制相关联的大量论文。据我们所知，没有论文报道，BCL2的抑制与血浆瘦素增加相关联。不受到理论的限制，我们建议瘦素和BCL2以交叉的目的生物化学地发挥作用，即抑制BCL2导致瘦素的补偿性增加，指示治疗性地命中我们的靶标。增加剂量与增加瘦素水平有关。
类似地，GM-CSF随PNT2258治疗以剂量依赖性方式增加。GM-CSF起到白细胞生长因子的功能。GM-CSF刺激干细胞以产生粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核细胞，后者可以退出循环并迁移入组织中，成熟成为认为对于抗癌症是重要的巨噬细胞和树突细胞。在其它标志物IL-20、血小板(和sCD40L)、淋巴细胞的减少支持PNT2258的抗BCL2作用以促进细胞凋亡；SAA的降低支持缺乏随PNT2258的免疫应答；MIP-1a和MMP-7的减少表明对转移的影响，并且可以支持于几个患者中观察到的稳定疾病。
免疫标志物也包括在该组中。已知寡核苷酸治疗剂在其施用后诱导免疫标志物。通过toll受体(TLR-3、TLR-8和TLR-9)的免疫刺激或免疫细胞(树突、NK和T细胞)的活化由RES的富含巨噬细胞的组织对包封在纳米颗粒中的寡核苷酸的优先摄取引起。此外，临床前研究已经证明，包封的寡核苷酸也已知激活补体因子。寡核苷酸的这些免疫调节作用在患者中受到关注，因为它们可能会导致发烧、发冷或寒战的临床后遗症。
结果表明，已知与临床前模型中的TLR刺激和其它的寡核苷酸的治疗剂相关的免疫标志物在患者中不随重复的PNT2258治疗而改变。结果示于图11。
这些结果清楚地表明，进行的在I期研究中，PNT2258不诱导抗炎症反应且没有被Toll样受体(TLR)识别为“外来的”。已报道炎性细胞因子(IL-6和TNFα)的血清水平与血清瘦素水平成反比。瘦素水平在PNT2258后升高的观察现象支持PNT2258给药后看到的免疫刺激的缺乏。
生物标志物的结果总结如下：
实施例9.最近的体外结果进一步支持瘦素作为PNT2258的伴侣标志物
PNT2258的近期体外数据显示在暴露于PNT2258或PNT100后甚至更稳定的BCL2降低。
进行初步研究来评估共同施用代谢影响药物如瘦素阻滞剂二甲双胍是否会对Pfeiffer人淋巴瘤细胞系上BCL2的表达有影响。向培养中的Pfeiffer细胞施用PNT2258、PNT100、PNT2258+二甲双胍(MTF)、PNT100+MTF。通过Western印迹监测BCL2的表达水平和b-肌动蛋白水平以及在培养基中的GAPDH水平。B-肌动蛋白和GAPDH可作为细胞功能丧失的标志物(例如，BCL2下调引起的细胞凋亡开始后)。经过6天培养，PNT2258+二甲双胍或PNT100+二甲双胍导致对于BCL2和B-肌动蛋白的协同作用。随PNT2258+MTF治疗观察到GAPDH的协同降低。(参见图12)
这些降低支持胰岛素和瘦素信号传导的调节示意推翻癌细胞对PNT2258治疗的抗性途径的假设。BCL2蛋白敲减的程度和细胞的生存力可根据施加的体外条件调低。这些数据表明，在动态环境(即来自肿瘤异种移植物的样品或离体分析的患者PBMC)中测量的快照只表示活细胞，而不是可以在体外环境如在上面的Western印迹中进行分析的所有细胞。还要注意的是，虽然PNT100和PNT2258两者减少BCL2蛋白的表达，PNT2258比给出脂质体包封的低聚物有效递送到细胞和细胞核的裸PNT100核更好地促进核摄取(并因此有利于其作用)。还要注意的是BCL2敲减与二甲双胍(瘦素和MAPK的阻断剂)的明显协同作用和相应的细胞死亡(参见图12)，其突出了该特定途径响应于PNT100或PNT2258的BCL2特异性敲减而激活。向患者施用PNT2258后增加的瘦素浓度水平表明其作为PNT2258诱导的BCL2敲减的“生物标志物”的效用。
由于PNT2258设计为降低细胞BCL2水平，这些数据支持该药物实际上按设计到达并作用于目的基因靶标的意见。这些发现是非常令人兴奋的，且大力支持PNT2258起着抑制BCL2转录和产生的作用的论点。这些标志物的相关性：(1)突出PNT2258作用的特定机制，(2)作为PNT2258施用的生物标志物，(3)鉴别可能响应于PNT2258治疗的患者和(4)指导鉴定与PNT2258协同工作的潜在疗法。临床前和患者的生物标志物结果存在明显差异。在患者中观察到的瘦素和GM-CSF的增加不能由临床前结果来预测。
实施例10.患难治性或复发性非霍奇金淋巴瘤的人类患者中的无对照概念验证研究的实验设计
PNT2258在患有复发的或难治性非霍奇金淋巴瘤的人类患者中的开放标签，无对照，2期研究。患者(患者的人口统计学，图2；诊断和分子特征的测量，图15；对治疗的反应，图14；Ki-67调节，图13)经3小时接受120mg/m2的PNT2258静脉内输注，每天一次，持续21天(3周)周期的5个连续天(第1-5天)。治疗可以持续，除非有疾病进展或发生不能接受的毒性共6个治疗周期。
用于本研究的入组标准包括，但不限于：非霍奇金淋巴瘤的形态学确认诊断，可接受的东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态和血液、肝和肾功能，至少一个可测量的肿瘤块(长轴>1.5cm)，定义为“与正常解剖或生理学不相容的位置中背景以上的局灶性或弥漫性FDG摄取，没有特定的标准化摄取值截止”的FDG-PET阳性基线扫描，施用初级治疗后复发的疾病，已完全停止之前的抗癌疗法至少21天。施用初级治疗(如利妥昔单抗和CHOP、EPOCH、苯达莫司汀或类似的化疗或后续的救援方案)后复发的疾病定义为对治疗的完全反应后的进展或者部分缓解或稳定的疾病后活跃疾病的放射影像学证据。已接受三个或更少的全身性细胞毒性方案的完整过程。注意：利妥昔单抗(单独或与细胞毒性化疗组合)不被认为是细胞毒性方案。
在参与期间(称为诱导期)允许已完成研究治疗的最初6个周期的受试者的维持期延长。具有临床益处(病情稳定或更好)的持续证据的受试者在他们完成诱导期时可考虑参与治疗的维持期段。患者可以继续参加PNT2258-02的维持期直到他们发生疾病进展、不可耐受的毒性、要求主动退出或者调查医生认为患者不再受益于PNT2258暴露。患者将经2小时接受PNT2258的IV输注，每天一次，每28天(4周)周期的连续2天(第1-2天)。用于研究的维持阶段的PNT2258的剂量基于每个受试者的计算体表面积是100mg/m2，最大计算BSA不超过2.0m2。
图2提供了患者信息和到无对照概念验证研究的分配，并且也示出了按照研究的具有特定癌症类型的患者的数目。
V.其它实施方式
应当理解的是，虽然已结合了其详细描述对本发明进行了描述，前面的描述意在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求进行限定。其它方面、优点和修改在以下的权利要求的范围之内。
本文引用的所有参考文献都通过引用整体并入本文。

Claims (48)

1.一种在患有癌症的受试者中施用用于治疗BCL2介导的癌症的受试化合物后测定BCL2转录、翻译或表达的调节的方法，其中包括：
施用所述受试化合物；
施用所述受试化合物之后，从所述受试者获得生物样品或放射图像；
检测所述生物样品中可测量水平的一种或多种生物标志物，其中所述生物标志物选自于Ki-67、BCL2、CD10、CD5、CD38、BCL6、MUM1、TP53、ZAP70，包括免疫组织化学组的免疫组织化学，流式细胞术分析，基因表达组，基因异常组，遗传缺失、易位、扩增和突变，BCL2的染色体重排的细胞遗传学—如t(14；18)、t(14；18)(q32；q21.3)和很少见地对于IG轻链(IGK，IGL)基因座如t(2；18)(P11；q21.3)或t(18；22)(q21.3；q11)或者在CMYC或参与驱动BCL2的转录和/或过表达的其它基因、蛋白质和/或因子中的染色体重排，包括FDG-PET摄取(标准摄取值，SUV)和CT成像的临床或成像参数，磷酸化BCL2、活性半胱天冬酶-3、PARP、细胞色素C、LDH、B症状的缺乏、AKT信号传导通路标志物、BCL2家族成员如BAX、淋巴细胞计数、血小板计数、瘦素、IL-1ra、IL-17a、MCP-1、MIP-1β和IP10或它们的组合。
2.如权利要求1的方法，其中所述受试化合物是在生理条件下与选自于SEQ ID NO:1249或1254或其互补序列的寡核苷酸序列杂交的低聚物。
3.如权利要求2的方法，其中所述低聚物选自于SEQ ID NO:1250、1251、1252、1253、1267-1477或其互补序列。
4.如权利要求3的方法，其中所述低聚物选自于SEQ ID NO:1250、1251、1289-1358或其互补序列。
5.如权利要求4任一的方法，其中所述低聚物包含SEQ ID NO:1250或1251。
6.如权利要求6所述的方法，其中所述低聚物包含SEQ ID NO:1251。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述低聚物以脂质体制剂施用。
8.如权利要求7的方法，其中所述脂质体制剂是两性脂质体制剂。
9.如权利要求8的方法，其中所述两性脂质体制剂包含一种或多种两性脂质。
10.如权利要求9的方法，其中所述两性脂质体制剂由包含具有两性特性的脂质组分的混合物的脂质相形成。
11.如权利要求10的方法，其中所述脂质组分的混合物选自于(i)稳定的阳离子脂质和可带电荷的阴离子脂质，(ii)可带电荷的阳离子脂质和可带电荷的阴离子脂质及(iii)稳定的阴离子脂质和可带电荷的阳离子脂质。
12.如权利要求11的方法，其中所述脂质组分包含选自于DOGSucc、POGSucc、DMGSucc、DPGSucc、DGSucc、DMPS、DPPS、DOPS、POPS、DMPG、DPPG、DOPG、POPG、DMPA、DPPA、DOPA、POPA、CHEMS和Cet-P的一种或多种阴离子脂质。
13.如权利要求11的方法，其中所述脂质组分包含选自于DMTAP、DPTAP、DOTAP、DC-Chol、MoChol、HisChol、DPIM、CHIM、DORIE、DDAB、DAC-Chol、TC-Chol、DOTMA、DOGS、(C18)2Gly+N,N-二-十八烷基酰胺-甘氨酸、CTAP、CPyC、DODAP和DOEPC的一种或多种阳离子脂质。
14.如权利要求10-13中任一项的方法，其中所述脂质相还包含中性脂质。
15.如权利要求14的方法，其中所述中性脂质选自甾醇及其衍生物、中性磷脂以及它们的组合。
16.如权利要求15的方法，其中所述中性磷脂是磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷酸乙醇胺或它们的混合物。
17.如权利要求16的方法，其中所述磷脂酰胆碱选自于POPC、OPPC、天然或氢化大豆磷脂酰胆碱、天然或氢化蛋黄磷脂酰胆碱、DMPC、DPPC、DOPC或它们的衍生物；和磷脂酰乙醇胺选自于DOPE、DMPE、DPPE或它们的衍生物。
18.如权利要求17的方法，其中所述两性脂质体包含DOPE、POPC、CHEMS和MoChol。
19.如权利要求18的方法，其中POPC/DOPE/MoChol/CHEMS的摩尔比为约6/24/47/23。
20.如权利要求1-19中任一项的方法，其中一种或多种生物标志物是蛋白质，且其中所述检测还包括使用质谱法、免疫测定法或它们的组合来分析生物样品中所述可测量水平的蛋白质表达。
21.如权利要求1-20中任一项的方法，其中所述生物样品选自于血液、血浆、血清、正常组织、PBMC、肿瘤组织、尿液或口腔拭子。
22.如权利要求1-21中任一项的方法，其中第一生物样品是在施用受试化合物之前从所述受试者获取。
23.如权利要求22的方法，其中在施用所述受试化合物之后获得的生物样品与所述第一生物样品相比较。
24.一种治疗受试者中BCL2介导的癌症的方法，包括：
施用受试化合物；
在施用所述受试化合物之后从所述受试者获得一种或多种的生物样品或放射图像；
测定所述生物样品或所述图像中一种或多种生物标志物的存在，其中所述生物标志物选自于Ki-67、BCL2、CD10、CD5、CD38、BCL6、MUM1、TP53、ZAP70，包括免疫组织化学组的免疫组织化学，流式细胞术分析，基因表达组，基因异常组，遗传缺失、易位、扩增和突变，BCL2的染色体重排的细胞遗传学—如t(14；18)、t(14；18)(q32；q21.3)和很少见地对于IG轻链(IGK，IGL)基因座如t(2；18)(P11；q21.3)或t(18；22)(q21.3；q11)或者在CMYC或参与驱动BCL2的转录和/或过表达的其它基因、蛋白质和/或因子中的染色体重排，包括FDG-PET摄取(标准摄取值，SUV)和CT成像的临床或成像参数，磷酸化BCL2、活性半胱天冬酶-3、PARP、细胞色素C、LDH、B症状的缺乏、AKT信号传导通路标志物、BCL2家族成员如BAX、淋巴细胞计数、血小板计数、瘦素、IL-1ra、IL-17a、MCP-1、MIP-1β和IP10或它们的组合；
和比较所述生物标志物的存在与所述生物标志物的可测量水平或表达。
25.根据权利要求24的方法，还包括使用生物样品中生物标志物的存在与生物学相关水平或表达之间的比较改进BCL2介导的癌症的治疗。
26.如权利要求24的方法，进一步包括在施用受试化合物之前从所述受试者收集第一生物样品。
27.如权利要求26的方法，其中所述生物标志物是瘦素且所述第一生物样品中瘦素的存在启动BCL2介导的癌症的治疗或改进。
28.如权利要求24-27中任一项的方法，其中所述患者的整体生存率提高。
29.如权利要求24-28中任一项的方法，其中所述患者的无进展改善。
30.如权利要求24-29中任一项的方法，其中所述患者中肿瘤大小减小。
31.如权利要求24-30中任一项的方法，其中放射性标记的葡萄糖的肿瘤代谢降低。
32.如权利要求31的方法，其中通过FDG-PET测量所述肿瘤代谢。
33.如权利要求24-31中任一项的方法，其中患者的生活质量提高。
34.如权利要求24-33中任一项的方法，其中患者状态的ECOG性能改善。
35.如权利要求24-34中的任一项的方法，其中患者的Cheson标准改善。
36.一种在需要的受试者中抑制BCL2表达的方法，包括
施用受试化合物；
其中在受试者中BCL2表达的抑制调节以下生物标志物中一种或多种的表达：Ki-67、BCL2、CD10、CD5、CD38、BCL6、MUM1、TP53、ZAP70、包括免疫组织化学组的免疫组织化学，流式细胞术分析，基因表达组，基因异常组，遗传缺失、易位、扩增和突变，BCL2的染色体重排的细胞遗传学—如t(14；18)、t(14；18)(q32；q21.3)和很少见地对于IG轻链(IGK，IGL)基因座如t(2；18)(P11；q21.3)或t(18；22)(q21.3；q11)或者在CMYC或参与驱动BCL2的转录和/或过表达的其它基因、蛋白质和/或因子中的染色体重排，磷酸化BCL2、活性半胱天冬酶-3、PARP、细胞色素C、LDH、B症状的缺乏、AKT信号传导通路标志物、BCL2家族成员如BAX、淋巴细胞计数、血小板计数、瘦素、IL-1ra、IL-17a、MCP-1、MIP-1β和IP10或它们的组合。
37.一种用于测定在患有癌症的受试者中施用用于治疗BCL2介导的癌症的受试化合物后BCL2转录、翻译或表达的调节的试剂盒，包含：
用于检测生物样品中一种或多种生物标志物的水平的探针，其中所述生物标志物选自于：Ki-67、BCL2、CD10、CD5、CD38、BCL6、MUM1、TP53、ZAP70、包括免疫组织化学组免疫组织化学，流式细胞术分析，基因表达组，基因异常组，遗传缺失、易位、扩增和突变，BCL2的染色体重排的细胞遗传学—如t(14；18)、t(14；18)(q32；q21.3)和很少见地对于IG轻链(IGK，IGL)基因座如t(2；18)(P11；q21.3)或t(18；22)(q21.3；q11)或者在CMYC或参与BCL2的转录和/或过表达的其它基因、蛋白质和/或因子中的染色体重排，磷酸化BCL2、活性半胱天冬酶-3、PARP、细胞色素C、LDH、B症状的缺乏、AKT信号传导通路标志物、BCL2家族成员如BAX、淋巴细胞计数、血小板计数、瘦素、IL-1ra、IL-17a、MCP-1、MIP-1β和IP10或它们的组合。
38.一种使用选自以下的生物标志物鉴别患者对于用受试化合物的治疗的反应特征的方法：免疫组织化学分析；流式细胞分析；细胞遗传学或临床分析；BCL2、CD10、Ki-67、MYC、t(14；18)、TP53、CD38、ZAP70或LDH的水平；患者年龄、MYC异常、遗传缺失、易位、扩增、突变或者临床或影像参数，包括PET SUV水平、CT成像、R-IPI、FLIPI、Rai标准、性能状态、B症状的存在或缺乏或者受试者年龄。
39.如权利要求38的方法，其中所述PET SUV大于或等于5。
40.如权利要求38的方法，其中所述患者年龄大于或等于60。
41.如权利要求38的方法，其中Ki-67在患者中是阳性的。
42.如权利要求38的方法，其中BCL2在患者中是阳性的。
43.如权利要求38的方法，其中所述患者中所述易位是t(14,18)或BCL2易位。
44.如权利要求38的方法，其中所述MYC异常存在于所述患者中。
45.如权利要求38的方法，其中所述CD10在所述患者中是阳性的。
46.如权利要求38的方法，其中所述R-IPI大于或等于3。
47.如权利要求38的方法，其中所述TP53在所述患者中是阳性的。
48.如权利要求38的方法，其中所述CD38在所述患者中是阳性的。
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