DE102004054730A1

DE102004054730A1 - Serumstabile amphotere Liposomen

Info

Publication number: DE102004054730A1
Application number: DE102004054730A
Authority: DE
Original assignee: Novosom AG
Current assignee: Novosom AG
Priority date: 2004-03-28
Filing date: 2004-11-05
Publication date: 2006-05-11
Also published as: CA2561247C; AU2005229485A2; AU2005229485A1; US20080311181A1; WO2005094783A3; CA2561247A1; WO2005094783A2; JP2007530462A; EP1734928A2; US8236770B2

Abstract

Die Erfindung betrifft amphotere liposomale Formulierungen, die besondere Serumstabilität zeigen und sich zum intrazellulären Delivery von Oligonukleotiden eignen.

Description

Eine recht neue Klasse von potentiellen pharmazeutischen Wirkstoffen stellen die sogenannten kurzen interferierenden Ribonukleinsäuren (siRNA) dar, die als Doppelstrang eingesetzt werden, um einzelne Gene gezielt in ihrer Aktivität herunterzuregeln oder auszuschalten. Ihr großes Potential in Therapie und Diagnostik ist leider mit dem Nachteil der starken Instabilität gegenüber Körperflüssigkeiten verbunden. Insbesondere im Blut werden kleine Nukleinsäuren sehr rasch abgebaut. Durch chemische Modifizierung der Nukleinsäuren wird versucht die Empfindlichkeit dieser Moleküle herabzusetzen, was als Nachteil oft eine verringerte bis fehlende biologische Aktivität zur Folge haben kann.

Ein anderer Ansatz ist die Verwendung eines Trägers, der die siRNA vor Angriffen von Enzymen schützt und zum Wirkort transportieren kann. Liposomen werden schon seit einiger Zeit als pharmazeutischer Träger für Arzneistoffe eingesetzt.

Zahlreiche Publikationen beschäftigen sich mit der Anwendung von meist kationischen liposomalen Systemen zum intrazellulären Delivery von Oligonukleotiden in vivo (z.B. Molecular Membrane Biology, 16, 129–140, (1999); BBA 1464, 251–261, (2000); Reviews in Biology and Biotechnology, 1(2), 27–33, (2001). All diesen Systemen gemein ist jedoch die Tatsache, dass die verwendeten Lipid-Mischungen aus ungesättigten und kationischen Lipiden wie z.B. DOTAP und/oder DOPE aufgebaut sind und aus diesem Grund nicht serumstabil sind. Dadurch bedingt setzen diese Liposomen eingeschlossenen Wirkstoff sehr schnell nach einer parenteralen Applikation frei. Häufig werden für die oben genannten Anwendungen auch Komplexe aus vorgeformten Liposomen und Nukleinsäuren hergestellt (z.B. Lipoplexe). Die Komplexbildung bzw. die meist nicht im Serum stabilen liposomalen Formulierungen führen dazu, dass die Stabilität der Oligonukleotide über einen längeren Zeitraum, nicht gewährleistet ist.

Amphotere Liposomen sind eine neue Klasse von Liposomen, die vorteilhafte Eigenschaften gegenüber konventionellen Liposomen und rein kationischen Systemen für ein intrazelluläres Delivery bieten. Negativ geladene Wirkstoffe, wie die Nukleinsäuren lassen sich effektiv in das Innere dieser Liposomen verpacken, obwohl die Gesamtladung der Liposomen bei physiologischem pH negativ bleibt. Durch Änderung des Umgebungs-pH, wie er bei der endosomalen Aufnahme von Liposomen in Zellen vorkommt, von neutral nach leicht sauer, ändert sich auch die Ladung der amphoteren Liposomen von anionisch nach leicht kationisch und die Vorteile eines kationischen Transfektionsreagenzes werden ausgenutzt. In der WO 02/66012 A2 sind diese Liposomen erstmals beschrieben. Die WO 02/66490 und WO 02/66489 (WO 03 070220 & WO 03 070735) stellen pH-sensitive Lipide vor, die sich zum Aufbau von amphoteren Liposmen eignen.

Bei systemischer Applikation ist neben den üblichen Bedingungen für parenterale Applikation, wie Sterilität, Isoosmolarität, Reinheits- und Toxizitätsanforderungen, die Stabilität einer liposomalen Formulierung in humanem Serum eine Vorraussetzung für ein erfolgreiches Zulasssungsverfahren. So sehen auch die Richtlinien der US-amerikanischen Aufsichtsbehörde FDA für liposomale Formulierungen (http://www.fda.gov/cder/guigance/index.htm, Liposome Drug Products) besondere Prüfungen vor. Dabei wird verlangt, dass das Verhältnis verkapselter zu freiem Arzneistoff in vitro, sowie in vivo über den Zeitraum der Zirkulation zu bestimmen ist.

Serumkomponenten können die liposomale Membran permeabilisieren und Wirkstoff freisetzen. Ob ein Wirkstoff schnell, langsam oder nicht freigesetzt wird, hängt auch von den molekularen Dimensionen des Wirkstoffes ab. So verbleibt ein Plasmid mit mehreren tausend Basenpaaren eher im Liposom als kleine Oligonucleotide. Für ein intrazelluläres Delivery ist es wesentlich, dass die Freisetzung möglichst gering ist.

Beschreibung der Erfindung

Überraschenderweise wurde gefunden, dass die in der WO 02/66012 A2 offenbarten amphoteren Liposomen sich stark in ihrer Serumstabilität bei Verwendung von kleinen Oligonukleotiden unterscheiden. Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, Formulierungen von amphoteren Liposomen bereitzustellen, die kleine Oligonukleotide, wie siRNA und/oder Antisense-Moleküle, in ihren Innenraum einschließen und unter Serumbedingung nicht, oder nur zu einem kleinen Teil freisetzen und sich somit zur parenteralen Gabe eignen.

Die für diese Ausführung der Erfindung relevanten Oligonukleotide sind aus 5–100, bevorzugt aus 5–40 und besonders bevorzugt aus 10–25 Nukleotiden oder Basenpaaren aufgebaut. Darüberhinaus können die Oligonukleotide als Einzelstrang (z.B. Antisense-Oligonukleotide), als Doppelstrang (z.B. small-interfering RNA, Decoy-Oligonukleotide) oder in komplexer Faltung (z.B. Aptamere, Spiegelmere, Ribozyme) vorliegen. Alle für diese Erfindung relevanten Oligonukleotide sind aus Desoxyribonukleotiden oder aus Ribonukleotiden sowie aus deren chemisch-modifizierten Derivaten aufgebaut, wie beispielsweise Phosphorothioate DNA (PS), 2'-O-methyl RNA (OMe), 2'-O-methoxy-ethyl RNA (MOE), Peptide nucleic acid (PNA), N3'-P5' Phosphoroamidate (NP), 2'-fluoro-arabino nucleic acid (FANA), Locked nucleic acid (LNA), Morpholino phosphoroamidate (MF), Cyclohexene nucleic acid (CeNA), Tricyclo-DNA (tcDNA)). Darüber können Copolymere und Block-Copolymere verschiedener Nukleotide und sogenannte Gapmere in die Liposomen eingeschlossen werden.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden Aptamere oder Spiegelmere in die Liposomen eingeschlossen.

Aptamere sind DNA- oder RNA-basierte Oligonukleotide mit komplexer dreidimensionaler Struktur. Aufgrund dieser Struktur können Aptamere sehr spezifisch und hochaffin an Proteintargets binden und wirken somit therapeutisch, meist extrazellulär. Ihre Funktionalität ist nahezu identisch zu monoklonalen Antikörpern.

Spiegelmere sind im Gegensatz zu D-Oligonukleotiden aus L-Ribose- und L-2'-Desoxyribose-Einheiten aufgebaut. Genau wie Aptamere binden diese spiegelbildlichen Nukleinsäuren spezifisch an Proteintargets. Aufgrund der chiralen Inversion besitzen Spiegelmere im Gegensatz zu herkömmlichen D-Oligonukleotiden eine erhöhte Stabilität gegenüber einem enzymatischen Abbau.

Das Grundgerüst der erfindungsgemäßen amphoteren Liposomen wird von neutralen Gerüstlipiden gebildet, die einen Anteil an der Membran von mindestens 15mol%, bevorzugt von mehr als 25mol% und weiter bevorzugt von mehr als 35 mol% und höchstens 65 mol% besitzen. Geeignete Lipide sind Phoshatidylcholine, wie DMPC, DPPC, DSPC, DOPC und POPC, die sowohl synthetischen als auch natürlichen oder halbsynthetischen Ursprungs sein können.

Es ist dem Fachmann bekannt, dass sich die Serumstabilität von Liposomen durch Zusatz von Cholesterol in der Membran erhöhen läßt. Dies wurde auch für amphotere Liposomen gefunden. Die erfindungsgemäßen Liposomen besitzen vorzugsweise einen Gehalt von 30 bis 50mol%, bevorzugt von 35–45 mol% Cholesterol in der Membran.

Viele Lipide, die als Ladungsträger für amphotere Liposomen verwendet werden können, leiten sich von der chemischen Grundstruktur des Cholesterol ab (beispielsweise die offenbarten Verindungen in WO 02/66490 und WO 02/6648).

Überraschenderweise wurde gefunden, dass diese Cholesteroldereivate im Allgemeinen, besonders MoChol, HisChol, Chems, HistChol nicht die stabilisierende Wirkung des nativen Cholesterols besitzen, daher ist es von Vorteil, wenn die Summe aller sterolbasierenden Lipide 55 mol% nicht übersteigt.

Das amphotere Ladungsverhalten kann auf zwei Weisen gebildet werden: durch Verwendung von amphoteren Lipiden oder durch geignete Mischungen von pH-sensitiven kationischen und anionischen Lipiden, wie sie in der WO 02 066012 offenbart werden. Werden amphotere Lipide verwendet, so beträgt der Membranteil zwischen 5 und 30 mol%, weiter bevorzugt zwischen 10 und 25%, bei Mischungen beträgt der Gesamtladungsträgeranteil bevorzugt nicht mehr als 50mol%, weiter bevorzugt zwischen 20 und 40mol%.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden amphotere Formulierungen wie folgt zusammengesetzt:

– Grundlipid ausgewählt aus der Gruppe DMPC, DPPC, DSPC mit 25 bis 65 mol%
– Cholesterol, mit 35–45 mol%
– amphoteres Lipid, ausgewählt aus der Gruppe: HistChol, HistDG, isoHistSuccDG, Acylcarnosin, HCChol.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Formulierungen wie folgt zusammengesetzt:

– Grundlipid ausgewählt aus der Gruppe DMPC, DPPC, DSPC mit 25 bis 65 mol%
– Cholesterol, mit 35–45 mol%
– Mischung kationischer und anionischer Lipide, davon mindestens eines pH-sensitiv, ausgewählt aus den Gruppen: a) kationisch: DMTAP, DPTAP, DOTAP, DC-Chol, MoChol, HisChol, DPIM, CHIM, DORIE, DDAB, DAC-Chol, TC-Chol, DOTMA, DOGS, C(18)2Gly+N,N-dioctadecylamidoglycin, CTAP, CpyC, DODAP, und DOEPC. b) anionisch: DGSucc, DMPS, DPPS, DOPS, POPS, DMPG, DPPG, DOPG, POPG, DMPA, DPPA, DOPA, POPA, Chems und CetylP mit Anteil an der liposomalen Membran von höchstens 40 mol%.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Formulierung und ihre Zusammensetzung ausgewählt aus folgender Tabelle:

Für eine Verwendung der erfindungsgemäßen Formulierungen als Arzneimittelträger kann es zweckmäßig sein, Substanzen, die die Haltbarkeit erhöhen, die zur Regulierung des osmotischen Drucks dienen, zuzusetzen.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Liposomen kann durch Verfahren nach dem Stand der Technik erfolgen, wie beispielsweise Extrusion durch Membranen definierter Porengröße, Ethanolinjektion oder Hochdruckhomogenisation. Beispielhafte Ausführungen sind in den Beispielen gegeben.

Nicht eingeschlossener Wirkstoff wird abgetrennt. Dazu werden geeignete Trennverfahren verwendet, so dass der Wirkstoff zu mindestens 90% im Liposom eingeschlossen ist und weniger als 10% des Wirkstoffes sich ausserhalb des Liposoms befinden. Hierfür können chromatographische Verfahren, Zentrifugation, Dialyse oder Ultrafiltration verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen liposomalen Formulierungen können zur therapeutischen Behandlung eines Säugetieresverwendet werden. Auch zur therapeutischen Behandlung von Menschen können sie verwendet werden.

Insbesondere zur parenteralen Applikation, bevorzugt zur intravenösen Applikation sind die erfindungsgemäßen liposomalen Formulierungen geeignet.

Anschließend wird die Erfindung an Beispielen weiter erläutert, ohne auf diese Ausführungen begrenzt zu sein.
Abkürzungen:

DMPC

Dimyristoylphosphatidylcholin

DPPC

Dipalmitoylphosphatidylcholin

DSPC

Distearoylphosphatidylcholin

POPC

Palmitoyl-oleoylphosphatidylcholin

DOPC

Dioleoylphosphatidylcholin

DOPG

Dioleoylphosphatidylglycerol

POPG

Palmitoyl-oleoylphosphatidylglycerol

DMPG

Dimyristoylphosphatidylglycerol

DPPG

Dipalmitoylphosphatidylglycerol

DMPS

Dimyristoylphosphatidylserin

DPPS

Dipalmitoylphosphatidylserin

DOPS

Dioleoylphosphatidylserin

POPS

Palmitoyl-oleoylphosphatidylserin

DMPA

Dimyristoylphosphatidic acid

DPPA

Dipalmitoylphosphatidic acid

DOPA

Dioleoylphosphatidic acid

POPA

Palmitoyl-oleoylphosphatidic acid

Chems

Cholesterolhemisuccinat

DC-Chol

3-β-[N-(N',N'-dimethylethane) carbamoyl]cholesterol

CetylP

Cetylphosphat

DODAP

(1,2)-dioleoyloxypropyl)-N,N-dimethylammonium chloride

DOEPC

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin

DAC-Chol

3-β-[N-(N,N'-dimethylethane) carbamoyl]cholesterol

TC-Chol

3-β-[N-(N',N',N'-trimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol

DOTMA

(1,2-dioleyloxypropyl)-N,N,N-trimethylammoniumchlorid) (Lipofectin^®)

DOGS

((C18)₂GlySper3⁺) N,N-dioctadecylamido-glycyl-spermin (Transfectam^®)

CTAB

Cetyl-trimethylammoniumbromid,

CPyC

Cetyl-pyridiniumchlorid

DOTAP

(1,2-dioleoyloxypropyl)-N,N,N-trimethylammonium Salz

DMTAP

(1,2-dimyristoyloxypropyl)-N,N,N-trimethylammonium Salz

DPTAP

(1,2-dipalmitoyloxypropyl)-N,N,N-trimethylammonium Salz

DOTMA

(1,2-dioleyloxypropyl)-N,N,N-trimethylammonium chlorid)

DORIE

(1,2-dioleyloxypropyl)-3 dimethylhydroxyethyl ammoniumbromid)

DDAB

Dimethyldioctadecylammonium bromid

DPIM CHIM

Histaminyl-Cholesterolcarbamat

MoChol

4-(2-Aminoethyl)-Morpholino-Cholesterolhemisuccinat

HisChol

Histaminyl-Cholesterolhemisuccinat.

HCChol

Nα-Histidinyl-Cholesterolcarbamat

HistChol

Nα-Histidinyl-Cholesterol-hemisuccinat.

AC

Acylcarnosin, Stearyl- & Palmitoylcarnosin

HistDG

1,2-Dipalmitoylglycerol-hemisuccinat-Nα-Histidinyl-hemisuccinat, & Distearoyl-, Dimyristoyl, Dioleoyl or palmitoyl-oleoylderivatives

IsoHistSuccDG

1,2-Dipalmitoylglycerol-Oα-Histidinyl-Nα-hemisuccinat, & Distearoyl-, Dimyristoyl, Dioleoyl or palmitoyl-oleoylderivatives

DGSucc

1,2-Dipalmitoyglycerol-3-hemisuccinat & Distearoyl-, dimyristoyl- Dioleoyl or palmitoyl-oleoylderivatives

Abbildungen
1: Chemische Formeln von Lipiden
2: Belegung einer 96-well Mikrotiterplatte für den Serumsstabilitätstest, gemessen wird die Freisetzung des Floureszenzmarkers CF
3: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme neben einer Phasenkontrastaufnahme zur Zelllokalisierung.
Beispiel 1
Herstellung von amphoteren Liposomen
Ein Gemisch aus den in Tabelle 1 benannten Lipiden wird in den angegebenen molaren Verhältnissen in Chloroform gelöst und anschließend im Rotationsverdampfer im Vakuum vollständig getrocknet.
Der Lipidfilm wird mit 10mM Hepes, 150mM NaCl, pH 7.5 versetzt, dass eine 100mM Suspension entsteht. Anschließend wird diese Suspension für 45 Minuten im Wasserbad bei 50°C unter Rotieren hydratisiert und für weitere 5 Minuten im Ultraschallbad behandelt. Danach wird die Lösung eingefroren. Nach dem Auftauen werden die Liposomen mehrfach durch eine Membran mit einer Porenweite von 400nm extrudiert.
CF – (Carboxyfluorescein) – gefüllte Liposomen
Die Herstellung erfolgt analog dem Voranstehenden, nur wird zur Hydratation des Lipidfilms eine Lösung des Farbstoffes verwendet, nach: 500 mg CF werden in 130 μl 5 M NaCl, 12,5 ml 10 mM Hepes pH 7,5 und 630 μl 5 N NaOH gelöst. Der pH-Wert wird kontrolliert und gegebenenfalls nachgestellt (auf pH 7,5).
Die Abtrennung des nicht eingeschlossenen CF erfolgt über Gelfiltration.
Beispiel 2:
Einschluss von Cy5.5 anti CD40 ODN (floereszenzmarkiertes Antisense-Oligonukleotid) in amphotere Liposomen
Eine Lipidmischung folgender Zusammensetzung DMPC/MoChol/DG-Succ/Chol 40:10:10:40 (mol%) wird bei 50°C in Chloroform gelöst und anschließend im Rotationsverdampfer im Vakuum vollständig getrocknet.
Der Lipidfilm wird mit soviel Cy5.5-anti-CD40-ODN (Antisense-Oligonukleotid) (150 μg/ml in 10 mM NaAcetat, 300 mM Sucrose, pH 4,5) versetzt, dass eine 15 mM Suspension entsteht. Anschließend wird diese Suspension für 45 Minuten im Wasserbad bei 50°C unter Schwenken hydratisiert und für weitere 5 Minuten im Ultraschallbad behandelt. Danach wird die Suspension eingefroren. Es folgen 3 Einfrier- und Auftauprozesse, wobei nach dem Auftauen jeweils eine 5-minütige Behandlung im Ultraschallbad erfolgt.
Nach dem letzten Auftauen werden die Liposomen mehrfach durch eine Membran mit einer Porenweite von 200nm oder 400nm extrudiert (Avestin LiposoFast, Polycarbonat-Membran mit einer Porenweite von 200 oder 400nm). Nach der Extrusion wird durch Zugabe einer 1mol/L HEPES-Stammlösung ein pH von 7,5 eingestellt.
Der Anteil des eingeschlossenen Cy5.5-anti-CD40-ODN (Antisense-Oligonukleotid) wird nach Abtrennung des frei vorliegenden Wirkstoffes durch dreimalige Sedimentation in der Ultrazentrifuge bei 60000 × g über 45 min fluoreszenzspektroskopisch ermittelt.
Die Einschlusseffizienz des Oligonukleotids wird durch Bestimmung des Lipidgehaltes und der fluorimetrischen Cy5.5-Bestimmung im Verhältnis zu zum Materialeinsatz von Lipid und ODN gesehen und beträgt für die Formulierung 53%.
Beispiel 3
Bestimmung der Serumstabilität
Als Modellwirkstoff wird Carboxyflourescein (CF) eingesetzt, der wie Oligonukleotide bei physiologischem pH negativ geladen ist. Die Serumstabilität der CF-gefüllten Liposomen wird über den Zeitraum von insgesamt 24 h bei 37°C beobachtet. Es wird dabei die Freisetzung des CF aus den Liposomen über die Zeit per Fluoreszenzmessung beobachtet. Es können 3 verschiedene Liposomenformulierungen pro 96-well-Platte getestet werden. Zur Bestimmung der prozentual freigesetzten Menge an CF wird die in Puffer inkubierte Probe sowohl direkt vermessen (Basiswert) als auch nach Öffnung der Liposomen durch Zugabe von Triton (Tritonwert oder 100%-Wert). In einem Gesamtvolumen von 500 μl werden sterilfiltriertes Serum und 1 mM Liposomen zusammengegeben. Derselbe Ansatz wird als Kontrolle mit Puffer anstelle des Serums vorbereitet.
Eine 96-well-Platte wird folgendermaßen vor den jeweiligen Probennahmen vorbereitet: in die Wells einer Zeile, Spalten 1, 3, 5, 7, 9 und 11 werden jeweils 5 μl Puffer (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7,5) vorgelegt. In die Spalten 2, 4, 6, 8, 10 und 12 jeweils 5 μl 10 % Triton X-100.
Die 96-well-Platte wird wie in 2 dargestellt belegt. In die Spalten 1–6 werden je 5 μl der in Puffer inkubierten Liposomen gegeben, in die Spalten 7–12 die in Serum inkubierten. Zu den 5 μl Probe plus 5 μl Puffer bzw. Triton werden 290 μl Puffer gegeben. Es wird jeweils wieder ein Basis- und ein Triton-Wert genommen. Auf diese Weise kann man drei Formulierungen über 8 Zeitpunkte pro Platte testen. Die Zeitpunkte sind die folgenden: null, null, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 5 h, 24 h.
Für die Messungen der Fluoreszenz wird ein Plattenreader mit 485/530 nm Filtern verwendet. Aus den gemessenen Floureszenzdaten werden die reltiven Freisetzungswerte errechnet, indem der Tritonwert 100 Freisetzung entspricht. Tabelle 1 zeigt eine Reihe von getesteten Formulierungen. Es zeigt sich, dass nur erfindungsgemäße Zusammensetzungen eine hohe Serumstabilität besitzen.
Beispiel 4
Einschluß von FITC-ODN (fluoreszenzmarkierte Antisense-DNA)
Das verwendete Antisense-Oligonukleotid (ODN) ist ein 18-mer Phosphorothioat mit einer FITC-Markierung am 5'-Ende (Fluoresceinisothiocyanat). Liposomen mit FITC-ODN wurden hergestellt: 0,5 ml einer 1 mM Lipidlösung mit 9 μg ODN. Zwei Ansätze mit unterschiedlichem Verhältnis der kationischen Lipiden zu anionischer ODN: 3:1 und 4,5:1

– Jeweils DPPC/DOTAP/DG-Succ/Chol 20/10/30/40
– Hydratisierungs- bzw. ODN-Lösung: 10 mM NaAc pH 4,5, 300 mM Sucrose
– Zur Abtrennung nicht eingeschlossenen ODNs wurden die Liposomen in einem diskontinuierlichen Sucrosegradienten mit 0, 0,8 und 1,2 M Sucrose in Hep¹⁰, NaCl¹⁵⁰ flotiert.

Bestimmung des Einbaus an FITC-ODN aus der Summe der gemessenen FITC-ODN – Fluoreszenzen (100 %) bzw. des Input und daraus abgeleitet dem Verhältnis von freier zu eingebauter Fluoreszenz:
Beispiel 4
Einschluß von siRNA (anti GFP) in amphotere Liposomen
Als Ladungsverhältnis von kationischem Lipid zu anionischer siRNA wird 5:1 bis 10:1 gewählt. Die siRNA (in 10 mM Hepes, 10 mM NaCl pH 7, 2) wird mit dem Hydratisierungspuffer (10 mM NaAcetat, 10 mM NaCl, 280 mM Sucrose, pH 4,5) vermischt und auf den Lipidfilm gegeben, sodass eine 5–10 mM Lipidsuspension entsteht. Die Lipide werden durch Ultraschallbehandlung von der Kolbenwand gelöst (max. 10 min). Hydratisiert wird für 15 min bei Raumtemperatur (POPC als Trägerlipid, bzw. bei 50 °C bei DMPC, DPPC als Trägerlipid). Es folgt ein mindestens dreimaliges Einfrieren bei –70 °C (10 min für 1 ml Volumen, 30 min für Volumina bis 15 ml) und wieder Auftauen im Wasserbad (Temperatur wie beim Hydratisieren).
Der Kolben wird aufgetaut und bei größeren Volumina werden 3 ml der Lösung entnommen (in 8 ml Glasröhrchen). Der restliche Ansatz wird wieder bei –70 °C eingefroren. Die Extrusion erfolgt durch 100 nm-Filter. Anschließend wird der pH Wert mit 1/10 Volumen 1 M Hepes auf pH 8,0 eingestellt.
Flotation der Liposomen:
Die Liposomen Fraktionen werden mit dem selben Volumen 2,4 M Sucrose in H₂O versetzt (d.h. es entsteht eine 1,2 M Lösung). Den Gradienten schichtet man mit Puffer (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7,5), darunter 0,8 M Sucrose in Puffer und zuunterst die Liposomen in 1,2 M Sucrose in H₂O. Das Volumen des Gradienten beträgt maximal 4,5 ml. Die Flotation erfolgt bei Raumtemperatur für 45 min bei 50.000 rpm in einer Ultrazentrifuge. Die Liposomen, welche sich zwischen der 0,8 M Sucrose- und der Pufferschicht befinden, werden abgenommen.
RNA-Mengenbestimmung mit Ribo Green RNA Quantitation Reagenz
Der Assay wird im Endvolumen von 200 μl durchgeführt. Zuerst fertigt man eine Eichreihe der siRNA zwischen 1 ng und 10 ng an (10–100 μl 100 ng/ml siRNA).
Das Ribo Green verdünnt man 1:2000 in TE-Puffer. Zu jedem Ansatz werden 100 μl Ribo Green zugegeben, dann inkubiert man 5 min bei Raumtemperatur und misst die Fluoreszenz bei 485/520 nm. Die Ansätze werden mit je 4 μl 10 Triton (Endkonzentration 0,2 mM) versetzt. Diese Eichkurve dient später für die Bestimmung der in Liposomen eingeschlossenen Menge an siRNA. Nach ca. 15 min misst man noch einmal die Fluoreszenz. Die Ergebnisse werden graphisch in ein Diagramm eingetragen (je eine Kurve mit und ohne Triton) und Eichgeraden mit den dazu gehörigen Gleichungen aus den Werten generiert.
Die Liposomen verdünnt man in zwei verschiedenen Konzentrationen (z.B. 1:50 und 1:100) und misst 2–3 verschiedene Volumina der Verdünnungen (z.B. 5, 10 und 15 μl der Verdünnungen ad 100 μl TE plus 100 μl Ribo Green Reagenz) ohne und mit Triton. Die errechnete Konzentration der siRNA einer Formulierung muss bei den verschiedenen Messungen in etwa übereinstimmen. Ist dies nicht der Fall, lag man mit der siRNA-Menge außerhalb der Eichkurven und sollte diese Werte nicht in die Berechnung der Konzentration > einfließen lassen. Die Effizienz, mit siRNA in verschieden Formulierung eingeschlossen werden konnte zeigt die Tabelle X.
Tabelle 2: Einschluss siRNA antiGFP in amphotere Liposomen
Test von siRNA-haltigen Liposomen im Serum
Unmodifizierte siRNA wird im Serum sehr schnell abgebaut. Um den schützenden Effekt der Liposomen auf die siRNA zu untersuchen, wird wie im folgenden dargestellt vorgegangen.
Die Konzentration der eingeschlossenen siRNA wird vor dem Serumtest bestimmt. Für jeden zu testenden Zeitpunkt werden Liposomen mit je 4 μg siRNA pro Zeitpunkt eingesetzt. Getestete Zeitenpunkte: Null, 1 h, 2 h und 4 h.
Die Liposomen mit 4 μg siRNR im Innern werden auf 60 μl Volumen verdünnt mit dem Puffer, in welchem sich die Liposomen befinden (üblicherweise 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7, 5). Zu den Ansätzen werden 60 μl Serum zugegeben und bis zu den entsprechenden Zeitpunkte bei 37 °C inkubiert. Der Nullzeitpunkt wird separat bestimmt.
Eine Phenol/Chloroform-Extraktion wird mit PLG-Eppis (Phase-Lock-Gel-Eppendorfröhrchen) durchgeführt für eine gute Trennung der Serumbestandteile und der Lipide von der siRNA. Die PLG-Eppis werden für 1 min bei 13 000 rpm zentrifugiert und auf Eis gestellt (im folgenden wird bei max. 4 °C gearbeitet). In die PLG-Eppis gibt man 280 μl Puffer (wie oben) und 45 μl 5 M NaCl.
In diese Lösung kommt der Ansatz der Liposomen im Serum (120 μl). Sofort danach erfolgt die Zugabe von 300 μl Phenol/Chloroform-Gemisch. Für den Nullwert gibt man zum Puffer mit NaCl in das PLG-Eppi auch 60 μl Serum. Alles wird sofort gemischt.
Es folgt eine Zentrifugation für 10 min bei 13 000 rpm und 4 °C. die wässrige Phase enthält die freie siRNA. Auf den Gradienten werden weitere 300 μl Chloroform gegeben und kurz gemischt. Nach einer weiteren Zentrifugation wie oben ist die wässrige Phase klar und kann möglichst vollständig abgenommen werden. Die siRNA wird nun aus der wässrigen Phase gefällt. Zur siRNA-Lösung gibt man 1/10 Volumen 3 M NaOAc, pH 5,2 und 2,5 Volumenteile Ethanol. Die Lösung wird gut durchmischt und die siRNA 1 h bei –70 °C ausgefällt. Eine weitere Zentrifugation bei 4°C, 13 000 rpm für 10 min folgt. Dabei pelletiert die siRNA. Der Überstand wird vollständig abgenommen und das Pellet wird mit 200 μ 70 % Ethanol gewaschen und für ca. 10 min getrocknet. Die siRNA wird in 5 μl Wasser wieder gelöst.
Die Qualität der siRNA wird im denaturierenden und möglicherweise auch im nativen Acrylamidgel überprüft.
Nachweis der Doppelsträngigkeit von siRNA im nativen Acrylamidgel
Die Qualität von siRNA wird über die vollständige Länge der Einzelstränge und die Doppelsträngigkeit definiert. Mittels eines nativen Acrylamidgels kann man die Doppelsträngigkeit einer siRNA überprüfen, da sich doppelsträngige siRNA langsamer im nativen Gel bewegt, als die Einzelstränge.
Das Gel muss mit TBE-Puffer 30 min vorlaufen (80 V, 100 mA), um die erforderliche Temperatur zu bekommen.
Es werden höchstens 2 μg siRNA pro Slot aufzutragen, da sonst das Gel überladen wird. Die Proben werden in einem Gesamtvolumen von 9 μl aufgenommen. Darauf gibt man 1 μl Blue Juice-Ladepuffer. Die Proben werden auf das vorgelaufene Gel aufgetragen und für 1 h bei 100 mA aufgetrennt. Färben des Gels:
Das Gel wird nach der Elektrophorese aus der Apparatur entnommen. Auf das Gel werden ca. 200 ml Stains All Gebrauchslösung (20 ml Stammlösung, 180 ml Formamid, 200 ml Wasser gegeben. Das Gel wird im Dunklen für 30–60 min in der Stains All-Lösung gefärbt. Danach wird die Lösung vom Gel genommen und das Gel wird unter Lichtzutritt im Wasser entfärbt (ca. 30 min-2 h je nach Lichtintensität). Die siRNA bleibt gefärbt, wohingegen sich der Hintergrund wieder völlig entfärbt wird.
Beispiel 5
In vitro Aufnahme von amphoteren Liposomen mit Cy3-BCL2-Antisense in HepG2 Zellen
HepG2 Zellen werden 2 Tage vor der Transfektion in 96-Wellplatten ausgesät, so dass sie am Tag der Transfektion eine Zelldichte von 60–80% zeigen (0,02 – 0,2 × 10⁵ in 100 μl, i.d.R. 1 × 10⁴). Es werden 2 Platten (Zentrifugation u. Kontrollinkubation) vorbereitet, die ansonsten identisch behandelt werden.
Transfektion:
Vortemperierung der Zentrifuge (Biofuge Stratos, Heraeus), Rotor # 3048 für Mikrotiterplatten. Cy3-Bc12-Antisense-haltige Liposomen werden auf eine einheitliche Konzentration mit 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.5 (HBS) eingestellt (Cy-3 ist ein rot floureszierender Marker).
Herstellung der Liposomenverdünnungen (mit und ohne Cargo) sowie Transfektionsmix von kommerziellen Kontrolltransfektionsreagenzien (z.B. Lipofectamine 2000, Oligofecatmine, siPort Amine, siPort Lipid) auf 96-well Platte mit serumfreien Medium (ca. 160 ng Antisense/well). Die Liposomenverdünnung wird in einem Volumen von 25–50 μl zu den Zellen gegeben werden.
Die Zellen werden mit serumfreien Medium gewaschen (1x) und mit serumhaltigen oder serumfreien Medium versetzt, z.B. je Well 75 μl, wenn die Liposomenverdünnungen so hergestellt wurden, dass die entsprechende Menge antisense/Well in 25 μl enthalten ist.
Eine Multiwellplatte wird bei 1,500 rpm (342 g), 1h, 37°C zentrifugiert, die Kontrollplatte 1 h inkubiert (37°C, 5% CO₂). Anschließend werden beide Platten 3 h inkubiert (37°C, 5% CO₂).
Medium aller Wells komplett entfernen, 1 × mit PBS waschen, 2 × mit serumhaltigen Medium; Zusatz von serumhaltigen Medium zu allen Wells, mikroskopische Kontrolle auf Vitalität, anschließend beide Platten über Nacht inkubieren (37°C, 5% CO₂).
Am Tag nach der Transfektion wird die Aufnahme von Liposomen in die Zellen floureszenzmikroskopisch untersucht. In 3 wird Fluoreszenzaufnahme neben einer Phasenkontrastaufnahme zur Zelllokalisierung gezeigt.
Tabelle 1

Claims

Serumstabile amphotere liposomale Formulierungen mit mindestens einem Wirkstoff im wässrigen Innenraum, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen – neutrale Lipide mit einem Membrananteil von 20–65 mol% umfassen, – Cholesterol mit einem Anteil von 35–45 mol%, als ladungstragende Lipide entweder – amphotere Lipide mit einem Anteil von 5–20 mol% oder – Mischungen von kationischen und anionischen Lipiden mit einem Anteil von 15–45 mol% umfassen, und der Wirkstoff ein Oligonukleotid umfasst.
Liposomalen Formulierung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotide aus 5–100, bevorzugt aus 5–40 und besonders bevorzugt aus 10–25 Desoxyribonukleotiden, Ribonukleotiden oder deren chemisch-modifizierten Derivaten aufgebaut sind.
Liposomalen Formulierung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotide als Einzelstrang (z.B. Antisense-Oligonukleotide), als Doppelstrang (z.B. small-interfering RNA, Decoy-Oligonukleotiden) oder in komplexer Faltung (z.B. Aptamere, Spiegelmere) vorliegen.
Liposomale Formulierung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid ein Aptameres ist.
Liposomale Formulierung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid ein Spiegelmeres ist.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/MoChol/DMPS/Chol 40:10:10:40 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/AC/Chol 50:10:40 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/HisChol/DPPS/Chol 35:10:15:40 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/IsohistsuccDG/Chol 50:10:40 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/MoChol/DGSucc/Chol 35:10:15:40 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/MoChol/DGSucc/Chol 40:10:10:40 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/MoChol/DGSucc/Chol 35:10:15:40 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/Hist-DG/Chol 50:10:40 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/MoChol/DPPS/Chol 40:10:10:40 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/DOTAP/DG-Succ/Chol 20:10:30:40 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/HistChol/Chol 50:10:40 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/HistDG/Chol 40:20:40 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/MoChol/DG-Succ/Chol 20:10:30:40 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/HcChol/Chol 50:15:35 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/HcChol/Chol 50:15:35 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/HistPS/Chol 50:15:35 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/HistPS/Chol 50:15:35 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/AC/Chol 50:15:35 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/AC/Chol 50:15:35 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/HistChol/Chol 50:15:35 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/HistChol/Chol 50:15:35 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/HistSuccDG 60:40 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/HistSuccDG/Chol 50:15:35 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/IsoHistSuccDG/Chol 50:15:35 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/HistSucc/Chol 50:15:35 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/IsoHistSuccDG/Chol 50:15:35 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DPPC/HistSucc/Chol 50:15:35 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/MoChol/Chems/Chol 40:10:10:40 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/DOTAP/Chems/Chol 30:10:20:40 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/DOTAP/Chems/Chol 30:10:20:40 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/HisChol/DGSucc/Chol 40:10:10:40 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/HisChol/Chems/Chol 40:10:10:40 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung DMPC/MoChol/Chems/Chol 40:10:10:40 hat.
Liposomale Formulierung nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die liposomale Membran die molare Zusammensetzung POPC/MoChol/DGSucc/Chol 30:20:10:40 hat.
Verwendung einer liposomalen Formulierung nach Anspruch 1–31 zur therapeutischen Behandlung eines Säugetieres.
Verwendung einer liposomalen Formulierung nach Anspruch 1–31 zur therapeutischen Behandlung eines Menschen.
Verwendung einer liposomalen Formulierung nach einem oder mehrerer der Ansprüche 1–31 zur parenteralen Applikation, bevorzugt zur intravenösen Applikation.
Liposomale Formulierung nach Anspruch 1–31, dadurch gekennzeichnet, dass sie keinen Wirkstoff enthält.