CN118001254A - 靶向抗原呈递细胞的脂质组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，提供靶向抗原呈递细胞的脂质组合物及其应用。本发明提供的组合物具有良好的器官和细胞靶向性，能显著提高抗原在脾脏中的蛋白表达量，并且使脾脏中抗原呈递细胞（例如，B细胞、pDC细胞、cDC细胞、巨噬细胞）中表达抗原的细胞百分比显著增加，可以用于疾病的免疫治疗。

Description

靶向抗原呈递细胞的脂质组合物及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及靶向抗原呈递细胞的脂质组合物及其应用。

背景技术

通过编码mRNA在抗原呈递细胞(APC)中表达肿瘤抗原，以诱导针对肿瘤的T细胞应答，在肿瘤的免疫治疗中具有巨大的潜力。由于带负电荷的mRNA分子不能直接进入抗原呈递细胞，而现有的大部分递送技术通常不可避免的会将mRNA大量递送至肝脏和肺，对于免疫治疗来说，mRNA在肺或肝的免疫应答通常是有害的，因此，决定mRNA免疫治疗成功的关键问题是将编码特定抗原的mRNA高选择性的递送至抗原呈递细胞(APC)。

采用脂质组合物包裹mRNA制成脂质-RNA组合物的方式是mRNA免疫治疗中较为常用的将mRNA导入细胞中的方式之一。目前研究人员开发出的用于脂质-RNA组合物的脂质体系主要包括：

1、脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticle，LNP）由一个(单层)或多个(多层)磷脂双层组成的球形囊泡，LNP递送技术就是把mRNA包裹在由阳离子脂质（例如，DLin-MC3-DMA、C12-200）、中性脂质（例如，DSPC、DOPE）、结构性脂质（例如，胆固醇）和聚合物共轭脂质（例如，DMG-PEG2000）四种成分组成的纳米脂质体颗粒里面。其中，阳离子脂质包括永久阳离子脂质（包含季铵基团）和可电离阳离子脂质（包含伯胺基团、仲胺基团或叔胺基团）；由于采用永久性阳离子脂质导致制备得到的LNP对细胞的毒性增强，进而采用可电离阳离子脂质进行替代。

在传统四组分肝靶向脂质纳米颗粒中添加第5种脂质（选择性器官靶向SORT脂质）可以实现mRNA药物的器官靶向性。例如，CN112996519A中记载了包含治疗剂以及脂质纳米颗粒组合物的组合物，其中脂质纳米颗粒组合物包括①可电离的阳离子脂质、磷脂（即，中性脂质）、类固醇（即，结构性脂质，包括胆固醇）、聚乙二醇化的脂质（即，聚合物共轭脂质，包括二肉豆蔻酰基-sn-甘油）以及永久阳离子脂质（即，肝脏靶向的SORT脂质）；或者包括②可电离的阳离子脂质、磷脂（即，中性脂质）、类固醇（即，结构性脂质，包括胆固醇）、聚乙二醇化的脂质（即，聚合物共轭脂质，包括二肉豆蔻酰基-sn-甘油）以及永久阴离子脂质（即，脾脏靶向的SORT脂质）；进而改变所述包含的选择性的器官靶向化合物的脂质纳米颗粒组合物的表观pK_a，调控制备得到的组合物制剂对不同器官的靶向作用。

2、脂质多聚复合物(Lipopolyplex，LPP)是一种以聚合物包载mRNA为内核、磷脂包裹为外壳的双层结构，带负电荷的mRNA凝聚在带正电荷的聚合物内，它们一起形成直径为几纳米到几百纳米的紧密多聚复合物“核”结构。LPP的双层纳米结构和传统的LNP相比具有更好的包载、保护mRNA的效果，并能够随聚合物的降解逐步释放mRNA分子。并且，其优异的树突状细胞靶向性可以更好地通过抗原递呈激活T细胞的免疫反应，从而达到理想的免疫治疗效果。

例如，CN115845040A中记载了由囊封在1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱/1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺/1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000(永久阳离子脂质EDOPC/中性脂质DOPE/辅助脂质DSPE-PEG)脂质壳中的聚(β-氨基酯)聚合物mRNA核组成的脂质多聚复合物mRNA疫苗。在上述壳/核-mRNA疫苗中，由亲水性磷脂双层“壳”囊封该多聚复合物核，所述壳既增强树突状细胞的摄取，又保护内核内的mRNA分子不被细胞的核酸酶降解。并且，其中还记载了一条增强树突状细胞摄取疫苗粒子的有效途径：在mRNA疫苗在脂质壳的表面上缀合亲和成分(例如，糖部分例如甘露糖、结合蛋白或对一种或多种DC表达表位具有特异性的抗体)进行“官能化”，增强疫苗粒子与所述疫苗核/壳复合物靶向的抗原呈递细胞(例如树突状细胞、巨噬细胞和B细胞)之间的相互作用和/或增加它们之间的结合。

3、脂质体复合物（lipoplex，LPX）是BioNTech开发的由阳离子脂质和中性辅助脂质生成的复合物递送载体，mRNA分子嵌入于双层脂质之间。例如，CN 109331176 A公开了可由永久阳离子(带正电的)脂质体和阴离子(带负电的)核酸形成，还可以加入中性脂质作为辅助脂质。通过优化RNA-lipoplexes (RNA-LPX)中脂质和RNA的比例，将制剂组合物的净电荷调整为中性或负电荷，静脉注射后可以精准地靶向树突状细胞（Dendritic Cells，DC细胞），而不需要对纳米颗粒进行靶向性的改造。

在最简单的情况下，脂质体复合物通过某种混合方案使核酸与脂质体混合来自发形成，但是也可应用多种其他方案。带正电的脂质体与带负电的核酸之间的静电相互作用是形成脂质体复合物的驱动力。除了脂质组分以外，阳离子部分和阴离子部分之间的电荷比也对有效的缩合和转染起重要作用。一般来说，脂质体复合物的过量正电荷被认为是有效转染所必需的(Templeton，N .S .等，(1997)Nature Biotechnology15(7)：647-652；Zhdanov，R .I .等，(2002)Bioelectrochemistry58(1)：53-64；Templeton，N .S .(2003)Current Medicinal Chemistry10(14)：1279-1287)。大多数天然膜带负电，带正电的脂质体复合物与带负电的生物膜之间的静电相互吸引作用可能在细胞结合和脂质体复合物摄取方面起作用；反之，如果具有较低的过量正电荷，则转染效率大幅下降或几乎为零。但是，基于已报道的带正电的脂质体和脂质体复合物具有较高的细胞毒性，因此作为药品应用也存在问题。

已证实，上述脂质体复合物能够在多种器官中进行转染，其在具体器官的表达分布取决于制剂和施用参数(脂质组成、尺寸、施用途径)等多重参数。迄今为止，还不能充分实现在指定的靶器官或细胞部分中进行选择性表达同时避免在非靶器官中表达。已经报道了使用萤光素酶DNA或RNA作为报道基因(reporter)，在肺、肝、脾、肾和心脏等器官中进行的转染。但是，避免靶向肺和肝难度系数较大；因为，在许多情况下，靶向肺和肝占主导。肺具有非常大的表面，并且它是经静脉注射(i.v.)的化合物在施用后第一个通过的器官。肝是脂质体和具有亲脂性化合物(如存在于脂质体复合物中的脂质)制剂的典型靶器官。对于基于RNA的免疫治疗，由于存在对肺或肝的免疫应答的风险，所以靶向肺或肝可能是有害的。因此，对于这样的治疗，需要仅对DC(例如脾中的)具有高选择性的制剂。

某些配体被认为可以改进靶向选择性。例如，在脂质上进行缀合修饰（包括甘露糖等）可以显著增加对巨噬细胞的靶向性，但是脂质的缀合修饰需要考虑到血清的相互作用以及RNA在血清中的降解，这样的组分使制剂更加复杂，从而使得实际的药物开发更加困难。

此外，还发现将RNA与阳离子脂质体孵育过程中通常观察到大聚集物的形成，该聚集物的形成导致粒径显著增大，并且稳定性减弱，这对于开发用于静脉内施用或皮下施用可接受的组合物制剂来说是一个主要障碍。

Integrin-Targeted, Short Interfering RNA Nanocomplexes forNeuroblastoma Tumor-Specific Delivery Achieve MYCN Silencing with ImprovedSurvival，Adv. Funct. Mater. 2021, 31, 2104843中公开了一种多功能阳离子和阴离子的siRNA纳米颗粒制剂，被称为受体靶向纳米复合物（RTNs），它包括脂质组合物（包括永久阴离子脂质DOPG、永久阳离子脂质DOTMA和中性脂质DOPE，以及DPPE-PEG2000）以及能用于siRNA封装和受体介导细胞摄取的多肽，小鼠静脉注射RTNs后，主要在异种移植肿瘤中积累，而在肝脏、肺部或脾脏中几乎检测不到，表明RTN制剂可以实现特异性肿瘤靶向，并且肝脏清除率极低，因此可以实现siRNA靶向药物治疗肿瘤（参见摘要和第9页右栏）。

IL-1 and IL-1ra are key regulators of the Inflammatory response toRNA vaccines，Siri Tahtinen et al,NATURE IMMUNOLOGY , VOL 23 , AprIL 2022 ,532–542以编码TLR7/8激动剂的RNA-LPX疫苗（其中，RNA-LPX的脂质组合物包括DOTMA 和DOPE，(+):(-)电荷比例为1.3:2，参见543页左栏第3段）为例，研究了其诱导产生IL-1细胞因子的影响因素，例如单核细胞的个数、炎性小体、天冬酶活性等。

Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defencefor cancer immunotherapy，Lena M. Kranz et al, NATURE, volume 534, 396–401(2016)公开了一种RNA-LPX，包含由DOTMA和DOPE组成的阳离子脂质体，其中通过改变脂质和RNA的比例，研究了正、负电荷对体内抗原呈递细胞靶向性的影响。当RNA-LPX中带少量正电荷或者接近中性时（正、负电荷比为2.5:1-1.8:2），制备得到的RNA-LPX不稳定，会立即形成大的聚集体。Luc-RNA-LPX带正电荷时（正、负电荷比为5:1），其蛋白表达集中在小鼠肺部，脾脏表达较少；随着阳离子脂质含量的减少，蛋白表达从肺部转移到脾脏。近中性和负性颗粒（电荷比为1.7:2，或≤1.7:2）其蛋白表达转移至脾脏。并且，随着负电荷的增加，转染效率逐渐下降，文中记载可能是由于游离RNA增多所导致的（参见第396页右栏）。

由于上述现有技术中目前存在的问题以及大规模癌症基因组测序工作和在预测免疫原性肿瘤突变中的技术进步，不断鉴定出肿瘤相关的新抗原，为开发新的和改进的肿瘤治疗性疫苗提供了前所未有的机会。亟待提供一种新的mRNA高选择性递送至抗原呈递细胞的新途径，并且能保证满足用于施用于患者之产品标准的可注射RNA制剂。

发明内容

本发明提供了靶向抗原呈递细胞的脂质组合物及其应用。

本发明提供的组合物在全身性施用后导致RNA在脾中（尤其是抗原呈递细胞中）大量表达，而在其他器官（例如，肝、肺）中低表达，具有良好的靶向性。此外，该组合物施用后还可诱导针对抗原的强免疫应答。通常过量的正电荷被认为是成功摄取和表达的前提条件，但是具有本发明电荷比的组合物，在全身性施用后表达仍然高至足以提供脂质体复合物的治疗效力。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种脂质组合物，其包含：

（1）永久阴离子脂质；

（2）永久阳离子脂质；

（3）中性脂质；

其中，永久阴离子脂质、永久阳离子脂质和中性脂质在所述脂质组合物中的摩尔占比的比例为14-33:40-57:22-40。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述永久阴离子脂质中包含磷酸根基团。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述永久阳离子脂质中包含季铵基团。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述中性脂质中包含磷酸根基团和/或季铵基团。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述永久阴离子脂质选自以下任意一种或多种：

2-乙酰氨基乙基((R)-2,3-双(油酰氧基)丙基)磷酸酯、(Z)-(R)-3-(膦酰氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯和1,2-二油酰-SN-甘油基-3-磷酸-RAC-甘油，以及它们的盐。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述永久阳离子脂质选自以下任意一种或多种：

1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷、(2,3-二油氧基丙基)三甲基铵，以及它们的盐。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述中性脂质选自：

1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺，和/或，二硬脂酰磷脂酰胆碱，以及它们的盐。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述脂质组合物包含：

（1）25mol%的永久阴离子脂质；

（2）50mol%的永久阳离子脂质；以及

（3）25mol%的中性脂质；

或者，所述脂质组合物包含：

（1）20mol%的永久阴离子脂质；

（2）40mol%的永久阳离子脂质；以及

（3）40mol%的中性脂质；

或者，所述脂质组合物包含：

（1）14mol%的永久阴离子脂质；

（2）57mol%的永久阳离子脂质；以及

（3）29mol%的中性脂质；

或者，所述脂质组合物包含：

（1）33mol%的永久阴离子脂质；

（2）45mol%的永久阳离子脂质；以及

（3）22mol%的中性脂质。

本发明第二方面提供脂质组合物在提高对靶器官中的抗原呈递细胞的靶向性中的应用，该脂质组合物包含：

（1）永久阴离子脂质；

（2）永久阳离子脂质；

（3）中性脂质；

其中，永久阴离子脂质、永久阳离子脂质和中性脂质在所述脂质组合物中的摩尔占比的比例为14-33:40-57:22-40。

根据本发明，所述脂质组合物即为第一方面所述的脂质组合物，其特征如前所述，在此不再赘述。

本发明第三方面提供一种组合物，其包含：

(A) 治疗剂和/或预防剂，其包含核酸分子、小分子化合物、多肽或蛋白质中的一种或多种；

(B) 如第一方面所述的脂质组合物；

所述组合物用于将所述治疗剂和/或预防剂递送至靶器官中的抗原呈递细胞。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述治疗剂和/或预防剂为能够编码一种或多种抗原的核酸分子。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述抗原为疾病相关抗原，或者所述核酸分子或抗原能够引发针对疾病相关抗原或表达疾病相关抗原之细胞的免疫应答。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述靶器官选自以下中任意一种或多种：脾、肝和肺。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述靶器官为脾。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述抗原呈递细胞包括以下任意一种或多种：树突状细胞、巨噬细胞和B细胞。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述治疗剂和/或预防剂与脂质组合物的用量使得所述组合物中的净正电荷与负电荷的电荷比为1:2至1:5。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述脂质组合物包含：

（1）14 mol%-33 mol%的永久阴离子脂质；

（2）40 mol%-57 mol%的永久阳离子脂质；

（3）22 mol%-40 mol%的中性脂质；

所述永久阴离子脂质为2-乙酰氨基乙基((R)-2,3-双(油酰氧基)丙基)磷酸酯和/或其盐，永久阳离子脂质为1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷和/或其盐，中性脂质为1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺和/或其盐；

所述组合物中的净正电荷与负电荷的电荷比为1:2至1:5。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述组合物中的净正电荷与负电荷的电荷比为1:2；

或者，所述组合物中的净正电荷与负电荷的电荷比为2:5；

或者，所述组合物中的净正电荷与负电荷的电荷比为1:3；

或者，所述组合物中的净正电荷与负电荷的电荷比为1:5。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述核酸分子是编码一种或多种抗原的RNA。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述组合物还包含至少一种辅助成分或佐剂。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述组合物还包含一种或多种可药用载剂、稀释剂或赋形剂。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述组合物还包含一种或多种疏水性小分子、渗透性增强分子、碳水化合物、聚合物、表面改变剂、官能化脂质或细胞因子。

本发明第四方面提供一种制备用于将治疗剂和/或预防剂递送至靶器官中的抗原呈递细胞的组合物的方法，其特征在于，该方法包括：

(a) 将永久阴离子脂质、永久阳离子脂质和中性脂质溶解在有机溶剂中形成脂质溶液，所述永久阴离子脂质、永久阳离子脂质和中性脂质的摩尔比为14-33:40-57:22-40；

(b) 将步骤(a)获得的脂质溶液与水混合得到脂质混合液；

(c) 将步骤(b)获得的脂质混合液与治疗剂和/或预防剂混合形成所述组合物，所述治疗剂和/或预防剂包括通过将核酸分子溶解于pH值为6.8-7.6的缓冲液中获得的核酸缓冲溶液。

根据本发明的优选实施方式，其中，步骤（a）中，所述有机溶剂为醇溶剂。

根据本发明的优选实施方式，其中，步骤（b）中，所述脂质混合液能够通过孔径100-400nm的聚碳酸酯膜。

根据本发明的优选实施方式，其中，步骤（c）中，所述缓冲液包括水性HEPES缓冲液。

根据本发明的优选实施方式，其中，步骤（c）中，所述核酸分子为能够编码一种或多种抗原的核酸分子。

根据本发明的优选实施方式，其中，步骤（a）中，所述有机溶剂包括碳原子数1-4的醇。

根据本发明的优选实施方式，其中，步骤（c）中，所述缓冲液包括水性HEPES缓冲液和EDTA。

根据本发明的优选实施方式，其中，步骤（c）中，所述抗原为疾病相关抗原，或者所述核酸分子或抗原能够引发针对疾病相关抗原或表达疾病相关抗原之细胞的免疫应答。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述永久阴离子脂质中包含磷酸根基团。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述永久阳离子脂质中包含季铵基团。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述中性脂质中包含磷酸根基团和/或季铵基团。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述永久阴离子脂质选自以下任意一种或多种：

2-乙酰氨基乙基((R)-2,3-双(油酰氧基)丙基)磷酸酯、(Z)-(R)-3-(膦酰氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯和1,2-二油酰-SN-甘油基-3-磷酸-RAC-甘油，以及它们的盐。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述永久阳离子脂质选自以下任意一种或多种：

1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷、(2,3-二油氧基丙基)三甲基铵，以及它们的盐。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述中性脂质选自：

1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺，和/或，二硬脂酰磷脂酰胆碱，以及它们的盐。

根据本发明的优选实施方式，其中，步骤（c）中，脂质混合液与治疗剂和/或预防剂的用量使得得到的组合物中的净正电荷与负电荷的电荷比为1:2至1:5。

本发明第五方面提供第一方面所述的脂质组合物、第三方面所述的组合物，或者，根据第四方面所述的方法制备得到的组合物在制备能够诱发细胞的免疫应答的药物中的用途。

本发明第六方面提供第二方面所述的脂质组合物、第三方面所述的组合物，或者，根据第四方面所述的方法制备得到的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、诊断、治疗或改善哺乳动物受试者中疾病、病症、异常病况或功能障碍。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述疾病、病症、异常病况或功能障碍选自以下中的任意一种或多种：感染性疾病、癌症、增生性疾病、遗传性疾病、自体免疫性疾病、神经退化性疾病、心血管和肾血管疾病、代谢性疾病。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述哺乳动物受试者选自人类、非人灵长类动物、伴侣动物、外来物种、家畜动物和供食用动物中的一种或多种。

根据本发明的一些优选实施方式，可形成具有合适的粒径分布特征的组合物，其能满足对患者进行静脉内施用的要求，并且通过自组装/自装配将脂质组合物与RNA孵育来形成。因此，本发明的组合物在粒径分布特征和稳定性方面满足药物制剂施用于患者的重要要求。

本发明通过添加永久阴离子脂质制备得到的组合物至少具有以下优点：①粒径大小良好，颗粒分布均匀；②能显著提高抗原在脾脏中的蛋白表达量；以及③使脾脏中抗原呈递细胞（例如，B细胞、pDC细胞、cDC细胞、巨噬细胞）表达抗原的细胞百分比显著增加；具体来说：

I、通过添加含有磷酸根基团的永久阴离子脂质，能制备得到粒径大小良好（粒径控制在240-500nm），颗粒分布均匀（PDI＜0.5）的组合物。

1. 通过添加永久阴离子脂质，特别是含有磷酸根基团的永久阴离子脂质包括ADOPE、18PA、DOPG、十四烷基膦酸、法尼焦磷酸、γ,γ-二甲基烯丙基焦磷酸和pA(2′-OMe)mpG，制备的组合物均有较好的粒径和PDI。其中最好为ADOPE，粒径为303.1nm，PDI低至0.2455，颗粒均匀度良好。

2. 相反，采用不含有磷酸根基团的其他类阴离子脂质，如油酸、二（月桂醇聚醚-7）柠檬酸酯钠、月桂基磺酸钠的组合物粒径较大，超过1000nm，并有固体析出，不合适作为mRNA递送载体。

II、本发明设计的含永久阴离子脂质、永久阳离子脂质和中性脂质的组合物，特别是通过控制其摩尔百分比在(14 mol%-33 mol%)：(40 mol%-57 mol%)：(22 mol%-40mol%)，和/或电荷比为1:2-1:5，能显著提高抗原在脾脏中的蛋白表达量（对应总辐射强度）：

1．小鼠活体成像实验表明本发明设计的含永久阴离子脂质的组合物其递送的抗原在脾脏中的蛋白表达量显著高于其他脏器（例如：肝、肺），制备的组合物递送的Fluc-mRNA在脾脏中表达蛋白的总辐射强度高达1.20×10⁷-7.38×10⁷p/s。

2.与不添加阴离子脂质制备的组合物相比，本发明设计的组合物其递送的抗原在脾脏中的蛋白表达量显著高于不添加阴离子脂质制备的组合物。

例如，本发明设计的mRNA组合物递送的Fluc-mRNA在脾脏中表达蛋白的总辐射强度高达不添加阴离子脂质的组合物的12.1倍。

3.本发明设计的脂质组合物递送的抗原在脾脏中的蛋白表达量显著高于现有技术LNP。

例如，本发明设计的组合物在脾脏中表达蛋白的总辐射强度高达现有技术LNP：YK-009-mRNA-LNP的9.46倍、YK-407-mRNA-LNP的7.1倍。

III、本发明设计的组合物使脾脏中抗原呈递细胞（例如，B细胞、pDC细胞、cDC细胞、巨噬细胞）表达抗原的细胞百分比显著增加：

1. 小鼠脾脏细胞流式实验表明本发明设计的含永久阴离子脂质的组合物使脾脏中抗原呈递细胞（例如，B细胞、pDC细胞、cDC细胞、巨噬细胞）表达抗原的细胞百分比显著增加。

例如：抗原呈递细胞中B细胞百分比约0.1-0.4%，pDC细胞百分比约2-6%，cDC细胞百分比约2-9%，巨噬细胞百分比约2.4-7.5%。

2. 与不添加阴离子脂质的组合物相比，本发明设计的组合物使脾脏中抗原呈递细胞表达抗原的细胞百分比显著提高。

例如，施用本发明提供的组合物后，表达eGFP的B细胞、pDC细胞、cDC细胞、巨噬细胞的细胞百分比分别是施用不添加阴离子脂质的组合物的19倍、2.8倍、8.1倍和11.8倍。

3. 本发明设计的特定组合的组合物使脾脏中抗原呈递细胞表达抗原的百分比显著高于其他组合的组合物。

例如，施用本发明特定组合的组合物（永久阴离子脂质ADOPE、永久阳离子脂质DOTMA、中性脂质DOPE）后，表达eGFP的B细胞、pDC细胞、cDC细胞、巨噬细胞的细胞百分比分别是施用pA(2′-OMe)mpG的eGFP RNA组合物（永久阴离子脂质pA(2′-OMe)mpG、永久阳离子脂质DOTMA、中性脂质DOPE）的4.8倍、5.6倍、12.1倍和11.6倍。

IV、本发明设计的特定组合的组合物与不含阴离子脂质的LPX-RNA组合物相比，激发IFN-α细胞因子的能力显著增强，证明本发明的组合物可以启动强I型IFN驱动的免疫刺激程序。

例如，分别注射后6小时和24小时，施用本发明含永久阴离子脂质组合物的血清中的IFN-α细胞因子含量是施用不含阴离子脂质的LPX-RNA组合物的1.7-4倍和1.5-5倍左右。

V、本发明设计的特定组合的组合物与不含阴离子脂质的LPX-RNA组合物相比，激发的抗原特异性细胞毒性T细胞的能力显著增强，证明本发明的组合物可以产生非常强的T细胞效应。

例如，在注射第13天，施用本发明的含永久阴离子脂质的特定组合物的血清中的OVA抗原特异性CD8⁺的T细胞在总CD8⁺T细胞中的百分比是施用不含阴离子脂质的LPX-RNA组合物的1.3-1.9倍。

VI、本发明设计的特定组合的组合物与不含阴离子脂质的LPX-RNA组合物相比，在动物实验中表现出明显的控制肿瘤生长、延长荷瘤实验动物生存时间的效果。

例如，小鼠皮下接种B16F10-OVA黑色素瘤细胞后，相对于空白脂质对照组和施用不含阴离子脂质的LPX-RNA组合物的对照组，通过注射施用本发明的含永久阴离子脂质的特定组合物，能够有效延迟肿瘤生长速度，肿瘤大小明显减小；注射施用本发明的含永久阴离子脂质的特定组合物的荷瘤小鼠生存率显著增加。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对本发明的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本发明的一些特定实施方式，而非对本发明的限制。

图1显示表8序号6、7、8、17对应包含Fluc-mRNA的组合物的小鼠和小鼠脏器（肝、脾、肺）荧光图。

图2显示不包含阴离子脂质的小粒径LPX（表10序号13）、不包含阴离子脂质的大粒径LPX（表12序号2）和表12序号1对应包含eGFP-mRNA的组合物的小鼠脾脏流式实验图。

图3为表13中序号1-4组不同的组合物，其在不同时间，激发的IFN-α细胞因子含量对比图。

图4为表15中序号1-4组不同的组合物，在注射药物组合物后第13天，刺激产生的抗原特异性细胞毒性T细胞情况对比图。

图5为表16中序号1-4组不同的组合物，注射接种至荷瘤小鼠后，小鼠肿瘤体积变化对比图。

图6为表16中序号1-4组不同的组合物，注射接种至荷瘤小鼠后，小鼠存活情况对比图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的附图，对本发明的技术方案进行更加清楚、完整地描述。显然，所描述的具体实施方式仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于所描述的本发明的实施方式，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施方式，都属于本发明保护的范围。

本发明可在不偏离本发明基本属性的情况下以其它具体形式来实施。应该理解的是，在不冲突的前提下，本发明的任一和所有实施方式都可与任一其它实施方式或多个其它实施方式中的技术特征进行组合以得到另外的实施方式。本发明包括这样的组合得到的另外的实施方式。

本发明中提及的所有出版物和专利在此通过引用以它们的全部内容纳入本发明。如果通过引用纳入的任何出版物和专利中使用的用途或术语与本发明中使用的用途或术语冲突，那么以本发明的用途和术语为准。

本发明所用的章节标题仅用于组织文章的目的，而不应被解释为对所述主题的限制。

除非另有规定，本发明使用的所有技术术语和科学术语具有要求保护主题所属领域的通常含义。倘若对于某术语存在多个定义，则以本发明的定义为准。

除了在实施例中或另外指出之外，在说明书和权利要求中陈述的定量性质例如剂量的所有数字应理解为在所有情况中被术语“约”修饰。还应理解的是，本发明列举的任何数字范围意在包括该范围内的所有的子范围和该范围或子范围的各个端点的任何组合。

本发明中使用的“包括”、“含有”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的要素涵盖出现在该词后面列举的要素及其等同，而不排除未记载的要素。本发明所用的术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…组成”、或“由…组成”。

术语“药学上可接受的”在本发明中是指：化合物或组合物在化学上和/或在毒理学上与构成制剂的其它成分和/或与用其预防或治疗疾病或病症的人类或哺乳动物相容。

术语“受试者”或“患者”在本发明中包括哺乳动物受试者。例如，所述哺乳动物受试者可以选自人类、非人灵长类动物、伴侣动物、外来物种、家畜动物和供食用动物中的一种或多种。

本发明所用的术语“治疗”是指给患有疾病或者具有所述疾病的症状的患者或受试者施用一种或多种药物物质，用以治愈、缓解、减轻、改善或影响所述疾病或者所述疾病的症状。在本发明的上下文中，除非作出相反的具体说明，术语“治疗”也可包括预防。

本发明中，术语“抗原”包括含有至少一个能引发免疫应答的表位和/或免疫应答所针对的表位的任何分子，优选肽或蛋白质。优选地，本发明上下文中的抗原是这样的分子，其任选在加工后诱导优选特异性针对该抗原或表达该抗原的细胞的免疫应答。特别地，“抗原”涉及这样的分子，其任选在加工后被MHC分子呈递，并特异地与T淋巴细胞(T细胞)反应。

因此，抗原或其片段应能够被T细胞受体识别。优选地，如果被T细胞受体识别，抗原或片段能够在合适的共刺激信号存在下诱导携带特异性识别该抗原或片段之T细胞受体的T细胞进行克隆扩增。在本发明实施方式的上下文中，抗原或片段在MHC分子的环境下优选由细胞呈递，优选由抗原呈递细胞和/或病变细胞呈递，其导致针对该抗原或表达该抗原的细胞的免疫应答。

根据本发明，设想了作为用于免疫应答的候选物的任何合适的抗原，其中所述免疫应答优选为细胞免疫应答。

抗原优选为对应于或来自于天然存在的抗原的产物。该天然存在的抗原可包括或可来自过敏原、病毒、细菌、真菌、寄生虫和其他感染原和病原体，或者抗原也可以是肿瘤抗原。根据本发明，抗原可以对应天然存在的产物，例如，病毒蛋白或其一部分。

术语“病原体”涉及病原微生物，并且包括病毒、细菌、真菌、单细胞生物和寄生虫。病原病毒的实例包括但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒(HSV)、甲肝病毒(HAV)、HBV、HCV、乳头瘤病毒和人嗜T细胞病毒(human T-lymphotrophic virus，HTLV)。单细胞生物包括但不限于疟原虫、锥体虫、阿米巴虫等。

术语“疾病相关抗原”是指所有具有病原显著性的抗原，并且包括“肿瘤抗原”。根据本发明，期望诱导针对疾病相关抗原或表达疾病相关抗原并且优选在MHC分子的环境下呈递疾病相关抗原之细胞的免疫应答。优选地，疾病相关抗原是天然存在的抗原。在一个实施方式中，疾病相关抗原在病变细胞中表达，并且优选由细胞的MHC分子呈递。

由包含在本发明所述（脂质组合物）纳米颗粒中的RNA（即所述治疗剂和/或预防剂）编码的抗原应诱导针对待靶向的疾病相关抗原或表达待靶向之疾病相关抗原的细胞的免疫应答。因此，由包含在本发明所述纳米颗粒中的RNA编码的抗原可对应于或者可包含疾病相关抗原或其一个或更多个免疫原性片段，例如疾病相关抗原的一个或更多个MHC结合肽。因此，由包含在本发明所述纳米颗粒中的RNA编码的抗原可为重组抗原。

本发明提供的一种组合物的平均尺寸为240nm-500nm，多分散系数≤0.5，优选≤0.2，更优选≤0.1。

永久阴离子脂质

在一些方面，本发明提供了具有一种或多种疏水组分和永久阴离子基团的一种或多种脂质。可以用在永久阴离子脂质中的一种阴离子基团是磷酸根基团。所述磷酸根基团可以是去质子化且在低于8、9、10、11、12、13或14的pH具有负电荷的化合物。所述疏水组分可以是一个或多个C₆-C₂₄烷基或烯基。所述化合物可以具有一个疏水基团、两个疏水基团或三个疏水基团。

在一些实施方式中，所述永久阴离子脂质以脂质组合物总量的约14-33mol%的量存在（也即，以脂质组合物的总量为基准，其中永久阴离子脂质的含量可以为14-33mol%）。所述组合物可以含有约14mol%、20mol%、25mol%或33mol%，或其中可导出的任意范围的永久阴离子脂质。

根据本发明的一些优选实施方式，所述永久阴离子脂质选自以下任意一种或多种：

2-乙酰氨基乙基((R)-2,3-双(油酰氧基)丙基)磷酸酯、(Z)-(R)-3-(膦酰氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯和1,2-二油酰-SN-甘油基-3-磷酸-RAC-甘油，以及它们的盐（例如钠盐、氯盐等）。

永久阳离子脂质

在一些方面，本发明内容提供了具有一种或多种疏水组分和永久阳离子基团的一种或多种脂质。永久阳离子脂质可以含有具有正电荷(不论pH)的基团。可用于永久阳离子脂质中的一种永久阳离子基团是季铵基团。

在一些实施方式中，所述永久阳离子脂质以脂质组合物总量的约40-57mol%的量存在。所述组合物可以含有约40mol%、45mol%、50mol%或57mol%，或其中可导出的任意范围的永久阳离子脂质。

根据本发明的一些优选实施方式，其中，所述永久阳离子脂质选自以下任意一种或多种：

1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷、(2,3-二油氧基丙基)三甲基铵，以及它们的盐（例如钠盐、氯盐等）。

中性脂质

中性脂质在本发明中是指在选定的pH值不带电荷或者以两性离子形式存在的起辅助作用的脂质。该中性脂质可能通过促进脂质相变来调节纳米颗粒流动性成脂质双层结构并提高效率，同时还可能影响靶器官/靶细胞的特异性。

例如，中性脂质可包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、神经酰胺、甾醇及其衍生物中的一种或多种。

包含阳离子脂质的组合物的载体组分可以包括一种或多种中性脂质-磷脂，如一种或多种(多)不饱和脂质。磷脂可以组装成一个或多个脂质双层。一般来说，磷脂可以包括磷脂部分和一个或多个脂肪酸部分。

中性脂质部分可以选自由以下组成的非限制性组：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2-溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂。脂肪酸部分可以选自由以下组成的非限制性组：月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻烯酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、芥酸、植烷酸、花生酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、山萮酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。还涵盖包括带有修饰和取代的天然物种的非天然物种，所述修饰和取代包括分支、氧化、环化和炔烃。例如，磷脂可以用一种或多种炔烃(例如一个或多个双键被三键置换的烯基)官能化或与该一种或多种炔烃交联。在适当反应条件下，炔基在暴露于叠氮化物时可能经历铜催化的环加成反应。这些反应可用于使组合物的脂质双层官能化以促进膜渗透或细胞识别，或将组合物与有用组分如靶向或成像部分(例如染料)偶联。

可用于这些组合物中的中性脂质可以选自由以下组成的非限制性组：1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0 Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0 PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-硬脂酰乙醇胺(SOPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱(SOPC)、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)以及其混合物。

在一些实施方式中，中性脂质包括DSPC。在一些实施方式中，中性脂质包括DOPE。在一些实施方式中，中性脂质（同时）包括DSPC和DOPE。

在一些实施方式中，所述中性脂质以脂质组合物总量的约22-40mol%的量存在。所述组合物可以含有22mol%、25mol%、29mol%或40mol%，或其中可导出的任意范围的中性脂质。

治疗剂和/或预防剂

本发明的组合物可以包括一种或多种治疗剂和/或预防剂。本发明的脂质组合物可用于递送活性成分例如治疗剂和/或预防剂。活性成分可包封在脂质组合物内或者与脂质组合物结合。在一种实施方式中，脂质组合物中的净正电荷与活性成分（如治疗剂和/或预防剂）中的负电荷的电荷比为1:2至1:5（也即，本发明提供的组合物中的净正电荷与负电荷的电荷比为1:2至1:5）。在一些实施方式中电荷比优选为1:2、2:5、1:3或1:5。

所述治疗剂和/或预防剂包括但不限于核酸分子、小分子化合物、多肽或蛋白质中的一种或多种。优选为核酸分子。

例如，所述治疗剂和/或预防剂是能够引起免疫响应的疫苗或化合物。因此，在一些优选实施方式中，所述治疗剂和/或预防剂可以为能够编码一种或多种抗原的核酸分子。

本发明的脂质组合物可以（作为载体）将治疗剂和/或预防剂递送至哺乳动物中的靶细胞和/或靶器官，因此本发明还提供治疗有需要哺乳动物的疾病或病症的方法，这些方法包括向哺乳动物施用包括治疗剂和/或预防剂的组合物和/或使哺乳动物细胞与该组合物接触。

治疗剂和/或预防剂包括生物活性物质并且替代地可称为“活性剂”、“活性成分”等。治疗剂和/或预防剂可以是在递送至细胞或器官后在该细胞或器官中或者其它身体组织或系统中引起所希望的变化的物质。此类物种可用于治疗一种或多种疾病、病症或病况。在一些实施方式中，治疗剂和/或预防剂是可用于治疗特定疾病、病症或病况的小分子药物。可用于组合物的药物的实例包括但不限于抗赘生剂(例如长春新碱(vincristine)、多柔比星(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、喜树碱(camptothecin)、顺铂(cisplatin)、博莱霉素(bleomycin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、甲氨蝶呤和链脲佐菌素(streptozotocin))、抗肿瘤剂(例如放线菌素D(actinomycin D)、长春新碱、长春碱(vinblastine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、蒽环霉素(anthracycline)、烷化剂、铂类化合物、抗代谢物以及核苷类似物，如甲氨蝶呤以及嘌呤和嘧啶类似物)、抗感染剂、局部麻醉剂(例如地布卡因(dibucaine)和氯丙嗪(chlorpromazine))、β-肾上腺素能阻断剂(例如普萘洛尔(propranolol)、第莫洛(timolol)和拉贝洛尔(labetalol))、抗高血压剂(例如可乐定(clonidine)和肼酞嗪(hydralazine))、抗抑郁剂(例如丙咪嗪(imipramine)、阿米替林(amitriptyline)和多虑平(doxepin))、抗痉挛剂(例如苯妥英(phenytoin))、抗组胺(例如苯海拉明(diphenhydramine)、氯苯那敏(chlorpheniramine)和异丙嗪(promethazine))、抗生素/抗细菌剂(例如庆大霉素(gentamycin)、环丙沙星(ciprofloxacin)和头孢西丁(cefoxitin))、抗真菌剂(例如咪康唑(miconazole)、特康唑(terconazole)、益康唑(econazole)、异康唑(isoconazole)、布康唑(butaconazole)、克霉唑(clotrimazole)、伊曲康唑(itraconazole)、制霉菌素(nystatin)、奈替芬(naftifine)和两性霉素B(amphotericin B))、抗寄生虫剂、激素、激素拮抗剂、免疫调节剂、神经递质拮抗剂、抗青光眼药、维生素、镇静剂以及成像剂。

在一些实施方式中，治疗剂和/或预防剂是细胞毒素、放射性离子、化学治疗剂、疫苗、引起免疫响应的化合物和/或另一治疗剂和/或预防剂。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何试剂。实例包括但不限于紫杉酚(taxol)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱(colchicine)、多柔比星、柔红霉素(daunorubicin)、二羟基蒽二酮(dihydroxy anthracindione)、米托蒽醌、光辉霉素(mithramycin)、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔、嘌呤霉素、类美登素(maytansinoid)如美登醇(maytansinol)、拉奇霉素(rachelmycin)(CC-1065)，以及其类似物或同系物。放射性离子包括但不限于碘(例如碘125或碘131)、锶89、磷、钯、铯、铱、磷酸根、钴、钇90、钐153和镨。疫苗包括能够提供针对与感染性疾病如流感、麻疹、人乳头瘤病毒(HPV)、狂犬病、脑膜炎、百日咳、破伤风、瘟疫、肝炎和肺结核相关的一种或多种病况的免疫性的化合物和制剂并且可以包括编码感染性疾病源性抗原和/或表位的核酸分子（例如mRNA）。疫苗还可以包括引导针对癌细胞的免疫响应的化合物和制剂并且可以包括编码肿瘤细胞源性抗原、表位和/或新表位的核酸分子（例如mRNA）。引起免疫响应的化合物可以包括疫苗、皮质类固醇(例如地塞米松)和其它物种。其它治疗剂和/或预防剂包括但不限于抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷和5-氟尿嘧啶达卡巴嗪(dacarbazine))、烷化剂(例如氮芥(mechlorethamine)、噻替哌(thiotepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、拉奇霉素(CC-1065)、美法兰(melphalan)、卡莫司汀(carmustine，BSNU)、罗莫司丁(lomustine，CCNU)、环磷酰胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二氯二胺络铂(II)(DDP)、顺铂)、蒽环霉素(例如柔红霉素(以前称为道诺霉素(daunomycin))和多柔比星)、抗生素(例如更生霉素(dactinomycin)(以前称为放线菌素)、博莱霉素、光辉霉素(mithramycin)和安曲霉素(anthramycin，AMC))以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱、长春碱、紫杉酚和类美登素)。

在其它实施方式中，治疗剂和/或预防剂是蛋白质。可用于本发明中的纳米粒子中的治疗性蛋白质包括但不限于庆大霉素、阿米卡星(amikacin)、胰岛素、促红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、因子VIR、黄体激素释放激素(LHRH)类似物、干扰素、肝素、乙型肝炎表面抗原、伤寒疫苗和霍乱疫苗。

在一些实施方式中，治疗剂和/或预防剂可以是多核苷酸或核酸(例如核糖核酸或脱氧核糖核酸)。术语“多核苷酸”的最广泛含义包括呈寡核苷酸链或可以并入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。根据本发明使用的示例性多核苷酸包括但不限于以下一种或多种：脱氧核糖核酸(DNA)；核糖核酸(RNA)，包括信使mRNA(mRNA)、其杂交体；RNAi诱导因子；RNAi因子；siRNA；shRNA；miRNA；反义RNA；核糖酶；催化性DNA；诱导三股螺旋形成的RNA；适体等。在一些优选实施方式中，治疗剂和/或预防剂是RNA。可用于本发明所描述的组合物和方法中的RNA可以选自但不限于由以下组成的组：shortmer、antagomir、反义RNA、核糖酶、小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、转运RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)及其混合物。在某些实施方式中，RNA是mRNA。

在某些实施方式中，治疗剂和/或预防剂是mRNA。mRNA可以编码任何所关注多肽，包括任何天然或非天然存在或以其它方式修饰的多肽。由mRNA编码的多肽可以具有任意大小并且可以具有任意二级结构或活性。在一些实施方式中，由mRNA编码的多肽当在细胞中表达时可以具有治疗作用。

在其它实施方式中，治疗剂和/或预防剂是siRNA。siRNA能够选择性降低所关注基因的表达或下调该基因的表达。例如，siRNA的选择可以使得在将包括该siRNA的组合物施用给有需要受试者后使与特定疾病、病症或病况有关的基因沉默。siRNA可以包含与编码所关注基因或蛋白质的mRNA序列互补的序列。在一些实施方式中，siRNA可以是免疫调节性siRNA。

在某些实施方式中，治疗剂和/或预防剂是sgRNA和/或cas9 mRNA。sgRNA和/或cas9 mRNA可以用作基因编辑工具。例如，sgRNA-cas9复合物可以影响细胞基因的mRNA翻译。

在一些实施方式中，治疗剂和/或预防剂是shRNA或者其编码载体或质粒。shRNA可以在将适当构建体递送至核中后在目标细胞内部产生。与shRNA相关的构建体和机制是相关领域中众所周知的。

疾病或病症

本发明的组合物/载体可以向受试者或患者递送治疗剂和/或预防剂。所述治疗剂和/或预防剂包括但不限于核酸分子、小分子化合物、多肽或蛋白质中的一种或多种。因此，本发明的组合物可用于制备核酸药物、基因疫苗、小分子药物、多肽或蛋白质药物。由于上述治疗剂和/或预防剂的种类广泛，本发明的组合物可用于治疗或预防多种疾病或病症。

在一种实施方式中，所述疾病或病症以功能失常或异常的蛋白质或多肽活性为特征。

本发明描述的试剂、组合物和方法可用于治疗患病(例如，以出现表达抗原并呈递抗原肽的病变细胞为特征的疾病)的受试者。可治疗和/或预防的疾病的实例涵盖所有表达本发明所述抗原之一的疾病。特别优选的疾病是感染性疾病(例如病毒性疾病)和癌症疾病。本发明描述的试剂、组合物和方法还可用于免疫或疫苗接种，以预防本发明描述的疾病。

根据本发明，术语“疾病”是指任何病理状态，包括感染性疾病和癌症疾病，特别是本发明描述的感染性疾病和疾病的那些形式。

根据本发明的待治疗的疾病优选为涉及抗原的疾病。根据本发明，“涉及抗原的疾病”或类似的表述意为，抗原在病变组织或器官的细胞中表达。病变组织或器官的细胞中的表达可相比于健康组织或器官的状态升高。在一个实施方案中，表达仅在病变组织中发生，而在健康组织中表达受到抑制。根据本发明，涉及抗原的疾病包括感染性疾病和癌症疾病，其中疾病相关抗原优选分别为感染原的抗原和肿瘤抗原。优选地，涉及抗原的疾病优选是涉及表达抗原并在MHC分子(特别是I类MHC)的环境下呈递该抗原的细胞的疾病。

例如，所述疾病或病症选自由以下组成的组：感染性疾病、癌症和增生性疾病、遗传性疾病、自体免疫性疾病、糖尿病、神经退化性疾病、心血管和肾血管疾病以及代谢性疾病。

所述感染性疾病的实例包括：①病毒感染性疾病，例如AIDS(HIV)、甲肝、乙肝或丙肝、疱疹带状疱疹(水痘)、德国麻疹(风疹病毒)、黄热病、登革热等、黄病毒、冠状病毒、流感病毒、狂犬病毒、出血性感染性疾病(马尔堡病毒或埃博拉病毒)；②细菌感染性疾病，例如军团菌病(Legionnaire′s disease)(军团菌，Legionella)、胃溃疡(螺杆菌，Helicobacter)、霍乱(弧菌，Vibrio)、由大肠杆菌、葡萄球菌(Staphylococci)、沙门氏菌(Salmonella)或链球菌(Streptococci)(破伤风)引起的感染；③由原生动物病原体引起的感染，例如疾、昏睡病、利什曼病、弓形体病，即由疟原虫(Plasmod ium)、锥体虫(Trypanosoma)、利什曼虫(Leishmania)和弓形虫引起的感染；或④真菌感染，其由例如，新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)或白色念珠菌(Candida albicans)引起。

所述癌或癌症(医学术语为恶性肿瘤)是一类这样的疾病，其中一群细胞表现出不受控制的生长(分裂超出了正常限制)、侵入(入侵并破坏相邻的组织)，并且有时转移(通过淋巴或血液扩散至身体的其他部位)。癌的这三个危害属性使其与自我限制的并且不侵入或转移的良性肿瘤区分开。大多数癌形成肿瘤，即，通过细胞(称为赘生性细胞或肿瘤细胞)的异常生长而形成的肿胀或病变，但是一些(像白血病)不是这样。根据本发明，术语“癌”包括白血病、精原细胞瘤、黑色素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、肉瘤、胚细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、肾癌、肾上腺癌、肾细胞癌、甲状腺癌、血液癌症、皮肤癌、脑癌、宫颈癌、肠癌、肝癌、结肠癌、胃癌、肺癌、肠癌、头颈癌、胃肠道癌、多发性骨髓瘤、淋巴结癌、食管癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫内膜癌、胰腺癌、耳鼻喉(ENT)癌、乳腺癌、子宫癌、乳房癌、前列腺癌、卵巢癌，及其转移。

恶性黑色素瘤是严重的皮肤癌类型。其是由于被称为黑色素细胞的色素细胞不受控制的生长导致。

根据本发明，“上皮癌”是源自上皮细胞的恶性肿瘤。该组占据了最常见的癌，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌的常见形式。

淋巴瘤和白血病是源自造血(血液形成)细胞的恶性肿瘤。

肉瘤是发源于胚胎中胚层发育成的一些组织之一的转化细胞的癌。因此，肉瘤包括骨肿瘤、软骨肿瘤、脂肪肿瘤、肌肉肿瘤、血管肿瘤和造血组织肿瘤。

母细胞瘤(blastic tumor)或胚细胞瘤是与未成熟组织或胚胎组织类似的肿瘤(通常是恶性的)。这些肿瘤中的多数常见于儿童。

神经胶质瘤是始于脑或脊椎的肿瘤类型。因为其发源于胶质细胞，所以被称为神经胶质瘤。神经胶质瘤最常见的部位是大脑。

其它组分或佐剂

本发明的组合物可与补充的免疫增强物质(例如，一种或更多种佐剂)一起施用，并且可包含一种或更多种免疫增强物质以进一步提高其效力，优选实现免疫刺激的协同效果。术语“佐剂”涉及延长或增强或加速免疫应答的化合物。在这方面可有多种机制，根据多种佐剂的类型而不同。例如，使DC成熟的化合物(例如脂多糖或CD40配体)构成第一类合适的佐剂。一般地，影响“危险信号”类型之免疫系统的任何药剂(LPS、GP96、dsRNA等)或细胞因子(例如GM-CSF)可用作能够以受控的方式增强和/或影响免疫应答的佐剂。CpG寡脱氧核苷酸也可任选用于该环境中，尽管如上所解释的，在某些环境下它们被认为具有副作用。特别优选的佐剂为细胞因子，例如单核因子、淋巴因子、白细胞介素或趋化因子例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、INFα、INF-γ、GM-CSF、LT-α，或生长因子，例如hGH。此外，已知的佐剂还有氢氧化铝、弗氏佐剂或油。例如Montanide^®；优选为Montanide^®ISA51，脂肽(例如，Pam3Cys、Pam3CSK4)、吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)、CpG寡聚脱氧核糖核苷酸(例如A类或B类)、多聚(I:C)也适于用作本发明组合物中的佐剂。

组合物可以包括一种或多种除前述部分中所描述的那些外的组分。例如，组合物可以包括一个或多个疏水性小分子，如维生素(例如维生素A或维生素E)或固醇。

组合物还可以包括一个或多个渗透性增强分子、碳水化合物、聚合物、表面改变剂或其它组分。渗透性增强分子可以是例如美国专利申请公布第2005/0222064号所描述的分子。碳水化合物可以包括简单糖(例如葡萄糖)和多糖(例如糖原以及其衍生物和类似物)。

表面改变剂可以包括但不限于阴离子性蛋白质(例如牛血清白蛋白)、表面活性剂(例如阳离子性表面活性剂，如二甲基双十八烷基溴化铵)、糖或糖衍生物(例如环糊精)、核酸、聚合物(例如肝素、聚乙二醇和泊洛沙姆)、粘液溶解剂(例如乙酰半胱氨酸、艾蒿、菠萝蛋白酶(bromelain)、木瓜蛋白酶、大青(clerodendrum)、溴己新(bromhexine)、羧甲司坦(carbocisteine)、依普拉酮(eprazinone)、美司钠(mesna)、氨溴索(ambroxol)、索布瑞醇(sobrerol)、多米奥醇(domiodol)、来托司坦(letosteine)、司替罗宁(stepronin)、硫普罗宁(tiopronin)、凝溶胶蛋白(gelsolin)、胸腺肽(thymosin)β4、链球菌DNA酶α(dornasealfa)、奈替克新(neltenexine)和厄多司坦(erdosteine))和DNA酶(例如rhDNA酶)。表面改变剂可以被安置在组合物的纳米粒子内和/或表面上(例如通过涂布、吸附、共价连接或其它方法)。

组合物还可以包含一种或多种官能化脂质。例如，脂质可以用炔基官能化，该炔基当在适当反应条件下暴露于叠氮化物时可能经历环加成反应。确切地说，脂质双层可以通过这一方式，用一个或多个可有效地促进膜渗透、细胞识别或成像的基团官能化。组合物的表面还可以与一种或多种有用抗体偶联。可用于靶向细胞递送、成像和膜渗透的官能团和偶联物是本领域中众所周知的。

除这些组分外，组合物可以包括可用于药物组合物中的任何物质。例如，组合物可以包括一种或多种药学上可接受（即，可药用的）的赋形剂或辅助成分，如但不限于一种或多种溶剂、分散介质、稀释剂、分散助剂、悬浮助剂、造粒助剂、崩解剂、填充剂、助流剂、液体媒剂、粘合剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、缓冲剂、润滑剂、油、防腐剂、调味剂、着色剂等。

术语“可药用”是指材料的无毒性，其不影响药物组合物的活性组分的作用。不可药用的成分可用于制备可药用成分，并包括在本发明中。

用于本发明组合物的合适的缓冲剂包括乙酸的盐形式、柠檬酸的盐形式、硼酸的盐形式和磷酸的盐形式。

当用于本发明中时，术语“赋形剂”旨在表示可存在于本发明药物组合物中的所有物质，并且其不是活性成分，例如载剂、粘合剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲剂、矫味剂或着色剂。赋形剂例如淀粉、乳糖或糊精。药学上可接受的赋形剂是本领域中众所周知的(参见例如Remington’s The Science and Practice of Pharmacy, 第21版, A.R.Gennaro；Lippincott, Williams&Wilkins, Baltimore, MD, 2006)。

术语“载剂”是指天然性质(natural nature)或合成性质的有机或无机组分，其与活性组分联用从而促进、增强或得以施用。根据本发明，术语“载剂”还包括一种或更多种适于施用于患者的相容性固体或液体填料、稀释剂或包封物质。

可用于肠胃外施用的载剂物质例如无菌水、林格液、乳酸林格液、无菌氯化钠溶液、聚烷撑乙二醇(polyalkylene glycol)、氢化的萘类，以及特别是生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。

用于本发明组合物的合适的防腐剂包括苯扎氯铵、氯代丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。

稀释剂的实例可以包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、粉末状糖和/或其组合。

剂型和施用

本发明的组合物可以制成固体、半固体、液体或气体的形式的制剂，例如片剂、胶囊剂、软膏剂、酏剂、糖浆、溶液、乳液、悬浮液、注射剂、气溶胶。本发明的组合物可以通过制药领域熟知的方法来制备。例如，无菌注射溶液可通过将所需量的治疗剂或预防剂与所需的上述各种其它成分掺入适当的溶剂例如无菌蒸馏水中，然后过滤灭菌来制备。还可以加入表面活性剂以促进形成均匀的溶液或悬浮液。

例如，本发明的组合物可以经静脉内、肌肉内、皮内、皮下、鼻内或通过吸入施用。在一种实施方式中，所述组合物是经静脉内或皮下施用的。

治疗有效量

“治疗有效量”为当给予患者时能改善疾病或症状的治疗剂的量。“预防有效量”为当给予受试者时能预防疾病或症状的预防剂的量。构成“治疗有效量”的治疗剂的量或“预防有效量”的预防剂的量随着治疗剂和/或预防剂、疾病状态及其严重性、待治疗和/或预防的患者和/或受试者的年龄、体重等而变化。本领域普通技术人员可根据其知识以及本发明常规地确定治疗有效量和预防有效量。

本发明的组合物以治疗有效量给药，所述量不仅可以随所选择的特定试剂而变化，还可以随给药途径，所治疗疾病的性质以及患者的年龄和状况而变化，并且最终可以由主治医师或临床医生自行决定。例如，可将约0.0001mg/kg至约10mg/kg剂量的所述治疗剂或预防剂施用给哺乳动物(例如人)。

抗原呈递细胞

抗原呈递细胞(APC)是在其表面在主要组织相容性复合物(MHC)的环境中呈递(即，展示)抗原的细胞。这包括其中呈递抗原的仅一个片段或更多个片段的情况。T细胞可用它们的T细胞受体(TCR)识别该复合体。抗原呈递细胞加工抗原，并将它们呈递至T细胞。

专职性抗原呈递细胞在将抗体内化(通过吞噬作用或通过受体介导的内吞作用)，然后在它们的膜上展示与II类MHC分子结合的抗原片段方面非常有效。T细胞识别抗原呈递细胞膜上的抗原-II类MHC分子复合物，并与其相互作用。然后抗原呈递细胞产生额外的共刺激信号，导致T细胞活化。表达共刺激分子是专职性抗原呈递细胞的典型特征。

专职性抗原呈递细胞的主要类型是树突状细胞(其具有最广的抗原呈递范围，并且可能是最重要的抗原呈递细胞)、巨噬细胞、B细胞和某些活化的上皮细胞。

树突状细胞是白细胞类群，包括浆细胞样树突状细胞（pDC细胞）和经典树突状细胞（cDC细胞），其将在外周组织中捕获的抗原经II类和I类MHC两种抗原呈递途径呈递给T细胞。树突状细胞是免疫应答的强力诱导者，并且这些细胞的活化是诱导抗肿瘤免疫的关键步骤。

可通过用编码包含待呈递之肽的肽或蛋白质的核酸(例如，编码抗原的核酸(例如，RNA))转导抗原呈递细胞，从而使该细胞装载MHC呈递的肽。用mRNA转染树突状细胞是一种有前景的刺激强抗肿瘤免疫的抗原装载技术。

术语“免疫原性”涉及抗原诱导免疫反应的相对效率。

术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本发明中可互换使用，包括辅助T细胞(CD4+T细胞)和溶细胞性T细胞的细胞毒性T细胞(CTL，CD8+T细胞)。

T细胞属于被称为淋巴细胞的白血球群组，并且在细胞介导的免疫中发挥核心作用。可通过在其细胞表面的称为T细胞受体(TCR)的特殊受体的存在来将它们与其他淋巴细胞类型(例如B细胞和自然杀伤细胞)区分开来。胸腺是负责T细胞成熟的主要器官。已经发现了若干种不同的T细胞亚群，每一种都具有不同的功能。

辅助T细胞在免疫过程中协助其他白血球，包括使B细胞成熟为浆细胞以及活化细胞毒性T细胞和巨噬细胞等功能。因为它们在其表面表达CD4蛋白，所以这些细胞也被称为CD4⁺T细胞。当在抗原呈递细胞(APC)表面表达的II类MHC分子将肽抗原呈递给辅助T细胞时，辅助T细胞被活化。在活化之后，它们迅速分裂，并分泌称为细胞因子的小蛋白质，这些蛋白质调节或协助主动免疫应答。

细胞毒性T细胞破坏病变细胞，例如，受感染的细胞(如受病毒感染的细胞)和癌细胞，并且也参与移植排斥。因为它们在其表面表达CD8糖蛋白，所以这些细胞也被称为CD8⁺T细胞。这些细胞通过结合与I类MHC有关的抗原来识别其靶标，所述I类MHC存在于身体的几乎每个细胞表面上。

大多数T细胞具有作为数种蛋白质的复合物存在的T细胞受体(TCR)。实际的T细胞受体由两条独立的肽链构成，其由独立的T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)基因产生，并被称为α-TCR链和β-TCR链。γδT细胞表示T细胞的一个小亚型，其表面上具有独特的T细胞受体(TCR)。然而，在γδT细胞中，TCR由一条γ链和一条δ链构成。该组T细胞较αβT细胞更为不常见(总T细胞的2％)。

所有T细胞都源自骨髓中的造血干细胞。源自造血干细胞的造血祖细胞存在于胸腺，并通过细胞分裂扩增以产生大量不成熟的胸腺细胞。早期胸腺细胞既不表达CD4也不表达CD8，因此归类为双阴性(CD4-CD8-)细胞。随着它们通过发育而发展，它们成为双阳性的胸腺细胞(CD4+CD8+)，并最终成熟为单阳性(CD4⁺CD8^-或CD4^-CD8⁺)胸腺细胞，然后从胸腺释放至外周组织。

T细胞活化的第一信号通过T细胞受体与由另一个细胞上的主要组织相容性复合物(MHC)呈递的短肽结合来提供。这确保了只有具有对该肽特异的TCR的T细胞被活化。伴侣细胞通常是专职性抗原呈递细胞(APC)，在初次应答的情况下通常为树突细胞，但B细胞和巨噬细胞也可为重要的APC。由I类MHC分子呈递至CD8⁺T细胞的肽的长度为8至10个氨基酸长；由II类MHC分子呈递至CD4⁺T细胞的肽更长，因为II类MHC分子的结合裂口(cleft)末端是开放的。

实施例

下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明具体实施例中，所使用的原料均可通过市售获得。除非另有说明，上下文中百分比为重量百分比，所有的温度以摄氏度给出。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

以下缩写字母分别代表如下试剂：

ADOPE：2-乙酰氨基乙基((R)-2,3-双(油酰氧基)丙基)磷酸酯钠盐；

DOTMA：1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷(氯盐)；

DOPE：1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺；

18PA：(Z)-(R)-3-(膦酰氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯单钠盐；

DOPG：1,2-二油酰-SN-甘油基-3-磷酸-RAC-甘油钠盐；

pA(2′-OMe)mpG：((2R,3S,4S,5R)-3-(((((2R,3R,4S,5R)-5-(2-氨基-6-氧代-1,6-二氢-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(羟基)磷酰基)氧基)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-甲氧基四氢呋喃-2-基)甲基磷酸二氢酯；

DSPC：二硬脂酰磷脂酰胆碱；

DOTAP：(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵；

HOBt：1-羟基苯并三唑；

EDCI：1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐。

实施例1：ADOPE的合成

2-乙酰氨基乙基((R)-2,3-双(油酰氧基)丙基)磷酸酯钠盐(ADOPE)的合成路线如下：

将二油酰基磷脂酰乙醇胺（1.0 g, 1.34 mmol）溶于二氯甲烷（3 mL），之后依次向上述溶液中加入HOBt（910 mg，6.71 mmol）和EDCI（1.28 g，6.71 mmol），室温下搅拌反应20分钟，之后向上述混合溶液加入乙酸（403 mg，6.71 mmol），室温下继续搅拌反应过夜。反应完毕后旋除溶剂，通过硅胶色谱法纯化（洗脱剂：二氯甲烷/20%甲醇（0.1%三氟乙酸）），将包含产品的馏分旋干，溶于乙酸乙酯，加入饱和NaHCO₃水溶液搅拌5min，分液，无水硫酸钠干燥，有机相旋干，得淡黄色油状化合物1.03g，产率95.1%。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 5.37-5.15 (m, 4H), 4.16-3.81 (m, 4H), δ3.51-3.10 (m, 4H), 2.52 (s, 2H), 2.29 (q, J=7.2 Hz, 4H), 2.08-1.91 (m, 10H),1.67-1.50 (m, 4H), 1.38-1.14 (m, 40H), 3.62-3.49 (m, 2H), 0.93-0.80 (m, 6H).C₄₃H₈₀NO₉P, MS(ES): m/z(M-Na^-)784.04.

实施例2：mRNA脂质组合物的制备方法

A）Fluc DNA、eGFP DNA模版的制备

1）将荧光素酶（Luciferase蛋白CDS）或绿色荧光蛋白(GFP)环状质粒经EcoRV酶切酶连构建于pVAX1载体（购自赛默飞世尔科技公司）上；

2）取步骤1）pVAX1载体上构建好的质粒与50 μL大肠杆菌感受态细胞Stbl2（购自赛默飞世尔科技公司）混匀后共同冰浴30 min，42℃热激90 s，马上放回冰上，冰浴2 min；

3）加400 μL LB培养基（购自赛默飞世尔科技公司），于30℃摇床慢摇振荡培养45-60 min；

4）取50-100 μL 菌液涂在含有卡那霉素抗生素（100 μg/mL，购自翌圣生物科技有限公司）的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜；

5）将得到的单克隆菌落平板进行测序验证其正确性，挑取测序正确的单克隆菌落于30℃摇床慢摇振荡培养过夜；

6）用无内毒素大提质粒试剂盒（购自翌圣生物科技有限公司）进行质粒抽提。

7）抽提得到的质粒采用限制性内切酶将其酶切成线性化质粒作为转录模板使用，具体酶切过程步骤参见步骤①-步骤③。

步骤① 取1 mg荧光素酶环状质粒，37℃，4 h酶切（BspQ Ⅰ 酶，购自翌圣生物科技有限公司）成线性化DNA转录模板（酶切体系见表1）；

表1 酶切反应体系

反应组分	终浓度/加入体积
		10×酶切缓冲液(mL)	2 mL
BspQ Ⅰ 酶	1 KU/mg
		荧光素酶环状质粒	50 μg/mL
注射用水	补充至20 mL体系

步骤② 反应完成后依次加入无水乙醇和醋酸钠，按照V_{酶切反应产物}：V_无水乙醇：V_3M醋酸钠=1:3:1的体积比加入无水乙醇和3M醋酸钠，放置-20℃沉淀1 h，之后于12000 rmp离心保留沉淀；

步骤③ 对步骤②沉淀以70%乙醇洗涤2遍，离心后的物质置于55℃烘干10 min，后加入1.7 mL注射用水溶解；

溶解液中线性化质粒的浓度为500 ng/µL，线性化比例为90%以上，纯化回收效率为85%。

B）Fluc mRNA、eGFP mRNA、HA mRNA和OVA mRNA的制备

1）共转录加帽反应：

以实施例1(A)制备的Fluc DNA、eGFP DNA或购自苏州金唯智生物科技有限公司的HA DNA、OVA DNA为模板，NTP溶液（NTPs）、Cap1帽类似物（货号：10678ES80，购于翌圣生物科技有限公司）为起始物料，通过T7 RNA聚合酶转录合成mRNA。具体反应体系见表2，将配制好的反应体系置于37℃恒温箱振荡培养反应3 h。上述Cap1帽类似物为Cap1-GAG，具有m7G(5') ppp (5') (2'-OMeA) pG结构，其分子式为C₃₂H₄₃N₁₅O₂₄P₄，其结构如下：

表2 共转录加帽反应体系

注：以上试剂均购于翌圣生物科技股份有限公司

2）消化模板DNA：

在上述步骤1）反应完成的共转录加帽反应体系中加入DNase Ⅰ（购自翌圣生物科技股份有限公司）使终浓度为1 U/μg线性化质粒，混匀后，离心，置于37℃ 消化1 h，得到共转录加帽产物。

3）氯化锂沉淀法纯化：

将上述步骤2）得到的共转录加帽产物用氯化锂沉淀法纯化，方法如下：

步骤① 加入氯化锂：向上述步骤2）的产物中加入氯化锂溶液（购自赛默飞世尔科技公司），终浓度为2.8 M，低温沉淀2 h；

步骤② 沉淀：12000 rmp高速离心15 min，保留沉淀；

步骤③ 洗涤：用75%乙醇洗涤2次，用注射用水溶解得到mRNA溶液。纯化后的mRNA溶液于-80℃保存。

C）利用脂质组合物制备mRNA组合物

1）脂质组合物溶液的制备

通用方法1：将脂质组合物的各成分（包括永久阴离子脂质、永久阳离子脂质和/或中性脂质，或其多种组合）按摩尔比溶于乙醇，制备乙醇脂质复合物溶液（脂质总浓度为100-600mM）。通过乙醇注入法将乙醇脂质复合物溶液快速加入去酶水中，搅拌30分钟后，将所得脂质组合物溶液通过孔径为100nm至400nm的聚碳酸酯膜过滤。

通用方法2：将永久阴离子脂质或者化合物溶于去酶水中，得到含永久阴离子脂质的去酶水；将永久阳离子脂质、中性脂质按照摩尔比溶于乙醇，制备乙醇脂质复合物溶液（脂质总浓度为100-600mM）。通过乙醇注入法将乙醇脂质复合物溶液快速加入含永久阴离子脂质的去酶水中，搅拌30分钟后，将所得脂质组合物溶液通过孔径为100nm至400nm的聚碳酸酯膜过滤。

2）mRNA组合物

将mRNA（实施例2制备）在HEPES和EDTA溶液中稀释得到mRNA水溶液（浓度0.5mg/ml，缓冲液为10mM HEPES和0.1mM EDTA，在水性HEPES中加入EDTA作为螯合剂）。用注射器取氯化钠(0.9％w/w在水中)溶液，注射至上述配置的mRNA水溶液中。用注射器取脂质复合物溶液，并注射至mRNA和氯化钠的溶液中，涡旋30秒，在室温下孵育10分钟，得到mRNA组合物（RNA终浓度为100μg/mL），并在4℃至8℃下储存。

3）粒径和PDI的测定

将mRNA组合物与氯化钠(0.9％w/w在水中)溶液以1:5的比例进行稀释，利用动态光散射，采用马尔文激光粒度仪测定粒径及多分散系数（PDI）。

实施例3：阴离子脂质的种类对mRNA组合物粒径、PDI的影响

表3 阴离子脂质结构

采用实施例2的方法制备以下mRNA组合物，其中，序号1-3对应的脂质复合物溶液采用方法1（即，阴离子脂质采用乙醇溶解）进行制备，序号4-7对应的脂质复合物溶液采用方法2（即，阴离子脂质采用水溶解）进行制备，序号8-10对应的脂质复合物溶液采用方法1进行制备，控制不同复合物中永久阴离子脂质，永久阳离子脂质DOTMA和中性脂质DOPE的摩尔比为1:2:1，并测定粒径和PDI。

实施例4-11中涉及含阴离子脂质复合物溶液均采用实施例2中的方法1制备，不再赘述。

表4 包含不同永久阴离子脂质的RNA组合物的粒径和PDI

实验结果显示，通过添加永久阴离子脂质，特别是包含磷酸根基团的永久阴离子脂质ADOPE、18PA、DOPG在乙醇的溶解度较好，而十四烷基膦酸、法尼焦磷酸、γ,γ-二甲基烯丙基焦磷酸和((2R,3S,4S,5R)-3-(((((2R,3R,4S,5R)-5-(2-氨基-6-氧代-1,6-二氢-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(羟基)磷酰基)氧基)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-甲氧基四氢呋喃-2-基)甲基磷酸二氢酯（pA(2′-OMe)mpG）在乙醇的溶解度较低，采用两种方式制备的组合物均有较好的粒径和PDI，其中最好为ADOPE，粒径为303.1nm，PDI低至0.2455，颗粒均匀度良好。

相反，采用不含有磷酸根基团的其他阴离子脂质，如油酸、二（月桂醇聚醚-7）柠檬酸酯钠、月桂基磺酸钠的组合物粒径显著升高，粒径超过1000nm，并有固体析出，不合适作为mRNA递送载体。

由上述对比可知，通过添加含有磷酸根基团的永久阴离子脂质，能制备得到粒径大小良好（粒径控制在240-500nm），颗粒分布均匀（PDI＜0.5）的组合物。

实施例4：脂质配比对RNA组合物粒径和PDI的影响

采用实施例2的方法制备以下包含永久阴离子脂质的mRNA组合物，其中，脂质复合物溶液采用方法1（即，永久阴离子脂质采用乙醇溶解）进行制备。

改变脂质复合物溶液中永久阴离子脂质ADOPE、永久阳离子脂质DOTMA、中性脂质DOPE三者的摩尔比例，以及脂质体溶液的用量，并测定粒径和PDI。

表5 不同配方的组合物的粒径和PDI

注：电荷比=（永久阳离子脂质所带正电荷的摩尔量-永久阴离子脂质所带负电荷的摩尔量）/[mRNA的重量（g）÷碱基的平均分子量330（g/mol）]。序号11和序号12在制备过程中析出大量固体，故粒径没有进行测量。

实验结果显示，控制永久阴离子脂质、永久阳离子脂质和中性脂质组合的摩尔百分比为(10 mol%-33 mol%)：(40 mol%-60 mol%)：(22 mol%-40 mol%)，尤其是永久阴离子脂质的比例在10-33mol %，制备的组合物粒径（粒径控制在240-500nm以内）、PDI都在较好水平（小于0.5）。当添加永久阴离子脂质用量过大，超过10-33mol %的范围时，例如40mol%时，制备过程中体系不稳定，产生大量颗粒固体。

其中，上述结果显示，不添加永久阴离子脂质时，例如序号13，其也能制备粒径和PDI合格的组合物。

实施例5：电荷比对RNA组合物粒径和PDI的影响

采用实施例2的方法制备以下Fluc-mRNA组合物，其中，脂质复合物溶液采用方法1（即，永久阴离子脂质采用乙醇溶解）进行制备。

控制脂质复合物溶液中永久阴离子脂质ADOPE、永久阳离子脂质DOTMA、中性脂质DOPE三者的摩尔比例相同，改变电荷比，并测定粒径和PDI。

表6 不同电荷比的组合物的粒径和PDI

注：序号5、6、11、12配置过程中大颗粒固体析出，未检测粒径；电荷比=（永久阳离子脂质所带正电荷的摩尔量-永久阴离子脂质所带负电荷的摩尔量）/（mRNA的重量（g）除以碱基的平均分子量330（g/mol））；序号13不添加阴离子脂质的小粒径LPX-RNA配制过程乙醇用量与序号1-12一致；序号14不添加阴离子脂质的大粒径LPX-RNA配制的乙醇用量为序号1-12的50%。

实验结果显示，当脂质组合物中电荷比控制在1:5-1:2范围内时，其制备得到的脂质组合物粒径大小良好（粒径控制在240-500nm），颗粒分布均匀（PDI＜0.5）的组合物。

例如：ADOPE、DOTMA、DOPE的脂质组合物摩尔百分比为25:50:25时，电荷比为1:5-1:2范围内时，粒径随着电荷比的增加而增加，当电荷比达到1:2时，粒径为462.7nm。继续增加电荷比，例如序号5和序号6中电荷比为2:3和3:4，制备过程中体系不稳定，配置过程产生大颗粒固体，均有大颗粒固体析出。

同样ADOPE、DOTMA、DOPE的脂质组合物摩尔百分比为20:40:40时，电荷比为1:5-1:2范围内时，制备得到的脂质组合物粒径大小良好（粒径控制在240-500nm），颗粒分布均匀（PDI＜0.5）的组合物。随着电荷比的增加，组合物的粒径和PDI随之增大，电荷比为1:2，粒径和PDI分别为456.2nm和0.4144；当电荷比超过1:5-1:2范围时，例如序号11和序号12中电荷比为2:3和3:4，均有大颗粒固体析出。

其中，上述结果显示，不添加阴离子脂质时，例如序号13和序号14，其也能制备粒径和PDI合格的组合物。在此基础上，进行后续的小鼠体内蛋白表达实验和小鼠脾脏细胞流式实验，进行后续探究。

实施例6：小鼠体内蛋白表达实验

对照LNP的制备方法：将阳离子脂质化合物YK-009（或YK-407）分别与DSPC(艾伟拓(上海)医药科技有限公司)、胆固醇(艾伟拓(上海)医药科技有限公司)和DMG-PEG2000按照49: 10: 39.5: 1.5的摩尔比溶于乙醇，制备乙醇脂质溶液。通过乙醇注入法将乙醇脂质溶液快速加入柠檬酸盐缓冲液(pH=4-5)，涡旋30s备用。将Fluc-mRNA在柠檬酸盐缓冲液(pH=4-5)中稀释得到Fluc-mRNA水溶液。将一定体积的脂质体溶液与Fluc-mRNA水溶液，以总脂质与Fluc-mRNA的重量比为10:1、制备脂质体。25℃超声15min(超声频率40kHz，超声功率800W)。所得脂质体用PBS稀释至10倍体积后，300KDa超滤管进行超滤除乙醇。再经PBS定容，得到使用阳离子脂质YK-009（或YK-407）/DSPC/胆固醇/DMG-PEG2000(摩尔百分比为49:10:39.5:1.5)包封Fluc-mRNA的LNP制剂。YK-009和YK-407的结构如下：

表7 阳离子脂质的化学结构和来源

将按实施例2制备的含有20 μg Fluc-mRNA的含永久阴离子脂质的组合物（或按上述方法制备的含有20 μg Fluc-mRNA的含YK-009（或YK-407）的LNP制剂）经尾静脉注射至4-6周龄、重量为17-19g的雌性BALB/c白化小鼠体内，并在给药后6h后对小鼠进行腹腔注射荧光成像底物，小鼠自由活动5 min，然后经IVIS Spectrum小动物活体成像仪检测RNA组合物所携带的mRNA在小鼠体内表达的蛋白质的总辐射强度(对应于荧光蛋白表达强度，即蛋白表达量)。采样完成后，断颈处死，对小鼠进行解剖，精确地分离出小鼠的内脏器官：肝、脾、肺。经IVIS Spectrum小动物活体成像仪检测Fluc-mRNA在小鼠各脏器表达的蛋白质的总辐射强度（对应于荧光蛋白表达强度，即蛋白表达量）。小鼠活体成像检测结果见表8和图1。

表8 小鼠活体成像实验数据

注：电荷比=（永久阳离子脂质所带正电荷的摩尔量-永久阴离子脂质所带负电荷的摩尔量）/（mRNA的重量（g）除以碱基的平均分子量330（g/mol））；序号17为不添加阴离子脂质的小粒径LPX-RNA。

结果分析：(1) 当永久阴离子脂质、永久阳离子脂质、中性脂质的摩尔百分比控制在(14mol%-33mol%)：(40mol%-57mol%)：(22mol%-40mol%)，电荷比为1:2至1:5时（序号3-14），能显著提高抗原在脾脏中的蛋白表达量，组合物对脾的靶向性良好。

例如：①ADOPE、DOTMA、DOPE的摩尔百分比为25:50:25时，随着电荷比的增加，小鼠的总辐射强度越来越高，电荷比为1:2时，小鼠总辐射强度达到2.32×10⁷p/s，脾的总辐射强度要显著高于肝和肺，电荷比为2:5时，脾的总辐射强度最高，为7.38×10⁷p/s，分别肝和肺的56.77倍和67.09倍，表明组合物递送Fluc-mRNA在脾脏中的蛋白表达量显著高于肝和肺。

②当ADOPE、DOTMA、DOPE的摩尔百分比为20:40:40时，随着电荷比的增加，小鼠的总辐射强度同样有增加趋势，电荷比为1:2时，小鼠总辐射强度达到1.91×10⁷p/s，脾的总辐射强度要显著高于肝和肺，电荷比为1:2时，脾的总辐射强度最高，为4.84×10⁷p/s，均为肝和肺的48.40倍，表明组合物递送Fluc-mRNA在脾脏中的蛋白表达量显著高于肝和肺。

③虽然实施例3和实施例4的实验结果显示，不添加阴离子脂质时，也能制备粒径和PDI合格的组合物。但是小鼠体内蛋白表达实验表明：序号17不添加阴离子脂质制备得到的组合物中，小鼠总辐射强度达到0.64×10⁷p/s，肝、脾和肺的辐射强度分别为：0.10×10⁷p/s、0.61×10⁷p/s、0.10×10⁷p/s。其辐射强度较本发明上述添加永久阴离子脂质的组合物显著降低，并且不同脏器的辐射强度差异不显著，表明不添加阴离子脂质制备的组合物递送Fluc-mRNA在脾中的蛋白表达量显著降低。

④当永久阴离子脂质、永久阳离子脂质、中性脂质的摩尔百分比超出(14mol%-33mol%)：(40mol%-57mol%)：(22mol%-40mol%)范围时，例如ADOPE、DOTMA、DOPE的摩尔百分比为10 mol%:60 mol%:30 mol%，即使电荷比为1:3或1:2（序号1和2），在脾的总辐射强度仅为0.52×10⁷p/s和0.59×10⁷p/s；与不含有阴离子脂质制备的组合物（序号17）在脾的总辐射强度相当；表明二者制备的组合物其递送Fluc-mRNA在肝、脾和肺中的蛋白表达量无显著差异，组合物对脾的靶向性与不含有阴离子脂质制备的组合物（序号17）相当，并无提升。

(2) 采用其他的永久阴离子脂质时（序号15和16），例如18PA和DOPG，在上述条件基础上，也能显著提高抗原在脾脏中的蛋白表达量，表现出良好且显著的脾靶向作用。

例如，永久阴离子脂质、DOTMA、DOPE的摩尔百分比为25:50:25，电荷比为1:2时，小鼠总辐射强度分别达到1.98×10⁷p/s和2.11×10⁷p/s，脾的总辐射强度为6.72×10⁷p/s和5.99×10⁷p/s，分别是肝的56倍和54.45倍，分别是肺的61.09倍和54.45倍。

（3）与不添加阴离子脂质的组合物相比，由本发明设计的包含永久阴离子脂质的组合物，在脾脏中的蛋白表达量显著增加。

例如ADOPE、DOTMA、DOPE的摩尔百分比为25:50:25、电荷比为2:5的组合物（序号7）在脾脏的总辐射强度为不添加阴离子脂质的组合物（序号17小粒径LPX-RNA）的12.10倍。

(4) 与现有技术中LNP（序号18和19）相比，本发明设计的包含永久阴离子脂质的组合物，在脾脏中的蛋白表达量显著增加，表现出良好的脾靶向性；但是在肝脏和肺部中的蛋白表达量减少（辐射强度约为0.1×10⁷p/s），或不会在肝内停留并表达目的蛋白。

例如，ADOPE、DOTMA、DOPE的摩尔百分比为25:50:25、电荷比为1:3的组合物（序号6）在肝脏的总辐射强度仅为YK-009-Fluc mRNA-LNP（序号18）的0.09倍，但是在脾脏的总辐射强度高达YK-009-Fluc mRNA-LNP的6.22倍。

ADOPE、DOTMA、DOPE的摩尔百分比为25:50:25、电荷比为2:5的组合物（序号7）在脾脏的总辐射强度高达YK-407-Fluc mRNA-LNP（序号19）为的7.1倍。

结论：

通过上述实验结果可知本发明通过添加永久阴离子脂质制备得到的组合物能显著提高抗原在脾脏中的蛋白表达量。

实施例7：小鼠脾脏细胞流式实验

1、将按实施例2制备的含有80 μg eGFP-mRNA的含ADOPE的组合物经尾静脉注射至4-6周龄、重量为17-19g的雌性C57BL/6小鼠体内，并在给药后24h后断颈处死，对小鼠进行解剖，精确地分离出小鼠的内脏器官：脾脏。

2、制备单细胞

2.1.脾脏组织研磨，将脾组织单细胞化，过细胞筛；

2.2.加入10倍体积（4mL）的红细胞裂解液，对组织中的红细胞进行裂解、去除；

2.3.细胞计数，取5×10⁶个细胞至流式管中（保证样本间细胞数一致）；

3、脾脏组织免疫细胞检测（8色表染）

3.1.单细胞悬液中加入表面抗体MIX各100μL，室温避光孵育15min（一份阴性对照）；

表9 小鼠脾脏细胞流式实验试剂和来源

3.2 加入2mL PBS，500g离心5min弃上清；

3.3 用200μL PBS重悬细胞，(200目尼龙网过滤后)，流式细胞仪Cytoflex S上机检测。分析各细胞中GFP含量百分比。各细胞系检测顺序如下：

T细胞GFP比例：CD45⁺→CD3⁺→GFP⁺

B细胞GFP比例：CD45⁺→CD3^-CD19⁺→GFP⁺

NK细胞GFP比例：CD45⁺→NK1.1⁺→GFP⁺

cDC细胞GFP比例：CD45⁺→F4/80^-CD11c⁺→GFP⁺

pDC细胞GFP比例：CD45⁺→F4/80^-CD11c^intCD317⁺→GFP⁺

巨噬细胞GFP比例：CD45⁺→F4/80⁺→GFP⁺

表10 小鼠脾脏细胞eGFP阳性细胞百分比

注：序号13为不加阴离子脂质制备的小粒径LPX-RNA。

结果分析：抗原提呈细胞是指可以给抗原提供淋巴细胞的免疫细胞，其中包括树突状细胞（DC细胞）、B淋巴细胞以及巨噬细胞，在人体当中起着至关重要的作用，主要可以起到免疫识别、免疫应答以及免疫调节的作用。

含有ADOPE组合物（序号1-9）其中，ADOPE、DOTMA、DOPE的摩尔百分比控制在(14mol%-33mol%)：(40mol%-57mol%)：(22mol%-40mol%)，电荷比为1:2至1:5；或者采用其他的永久阴离子脂质，包括但不限于18PA（序号11）或DOPG（序号12）组合物，均可以使脾脏中抗原呈递细胞（例如，B细胞、pDC细胞、cDC细胞、巨噬细胞）表达抗原的细胞百分比显著增加。例如：

1、与空白对照相比，序号2（ADOPE:DOTMA:DOPE=25 mol%:50 mol%:25 mol%，电荷比为1:3）的组合物使脾脏中抗原呈递细胞B细胞、pDC细胞、cDC细胞、巨噬细胞eGFP阳性细胞百分比分别增加0.12%、3.62%、4.86%、5.86%；序号3（ADOPE:DOTMA:DOPE=25 mol%:50mol%:25 mol%，电荷比为2:5）的组合物分别增加0.15%、3.38%、4.55%、6.25%；序号4（ADOPE:DOTMA:DOPE=25 mol%:50 mol%:25 mol%，电荷比为1:2）的组合物分别增加0.37%、5.90%、8.69%、7.44%；序号5（ADOPE:DOTMA:DOPE=20 mol%:40 mol%:40 mol%，电荷比为1:2）的组合物分别增加0.14%、3.76%、4.28%、4.81%；序号9（ADOPE:DOTMA:DOPE=33 mol%:45 mol%:55mol%，电荷比为1:2）的组合物分别增加0.20%、4.37%、4.63%、4.20%。

采用其他的永久阴离子脂质，与空白对照相比，18PA组合物（序号11）分别增加0.17%、2.95%、4.52%、4.67%；DOPG组合物（序号12）分别增加0.14%、4.47%、3.73%、4.11%。

2、与不添加阴离子脂质的小粒径的LPX-RNA（序号13）相比，ADOPE组合物（序号1-9）可以使脾脏中抗原呈递细胞（例如，B细胞、pDC细胞、cDC细胞、巨噬细胞）表达抗原的细胞百分比显著增加。

例如，与不添加阴离子脂质的小粒径的LPX-RNA（序号13）相比，ADOPE组合物（序号2）使脾脏中抗原呈递细胞B细胞、pDC细胞、cDC细胞、巨噬细胞eGFP阳性细胞百分比分别为其6.5倍、1.7倍、4.5倍和9.3倍；ADOPE组合物（序号3）分别为其8倍、1.6倍、4.2倍和9.9倍；ADOPE组合物（序号4）分别为其19倍、2.8倍、8.1倍和11.8倍；ADOPE组合物（序号5）分别为其7.5倍、1.8倍、4倍和7.7倍；ADOPE组合物（序号9）分别为其10.5倍、2.1倍、4.3倍和6.7倍。

采用其他的永久阴离子脂质，与不添加阴离子脂质的小粒径的LPX-RNA（序号13）相比，18PA组合物（序号11）分别为其9倍、1.4倍、4.2倍、7.4倍；DOPG组合物（序号12）分别为其7.5倍、2.2倍、3.5倍、6.5倍。

3、与其他组合的pA(2′-OMe)mpG的eGFP RNA组合物（包括永久阴离子脂质pA(2′-OMe)mpG、永久阳离子脂质DOTMA、中性脂质DOPE）相比，ADOPE组合物（序号1-9）可以使抗原呈递细胞（例如，B细胞、pDC细胞、cDC细胞、巨噬细胞）表达抗原的细胞百分比显著增加。

例如：ADOPE组合物（序号2）使脾脏中抗原呈递细胞B细胞、pDC细胞、cDC细胞、巨噬细胞eGFP阳性细胞百分比分别提高1.6倍、3.4倍、6.8倍和9.2倍；ADOPE组合物（序号3）分别增加2倍、3.2倍、6.3倍和9.8倍；ADOPE组合物（序号4）分别增加4.8倍、5.6倍、12.1倍和11.6倍；ADOPE组合物（序号5）分别为其1.9倍、3.6倍、6倍、7.5倍；ADOPE组合物（序号9）分别为其2.6倍、4.1倍、6.4倍、6.6倍。

采用本发明其他的永久阴离子脂质，与其他组合的pA(2′-OMe)mpG的eGFP RNA组合物（包括永久阴离子脂质pA(2′-OMe)mpG、永久阳离子脂质DOTMA、中性脂质DOPE）相比，18PA组合物（序号11）分别为其2.3倍、2.8倍、6.3倍、7.3倍；DOPG组合物（序号12）分别为其1.9倍、4.2倍、5.2倍、6.4倍。

4、当ADOPE、DOTMA、DOPE的摩尔百分比和/或电荷比超出上述范围时，使脾脏中抗原呈递细胞（例如，B细胞、pDC细胞、cDC细胞、巨噬细胞）表达抗原的细胞百分比呈现一定程度升高，但是较上述效果显著降低。例如：

序号10（ADOPE:DOTMA:DOPE=10 mol%:60 mol%:30 mol%，电荷比为4:9）中的组合物，与空白对照相比，在脾脏中B细胞、pDC细胞、cDC细胞、巨噬细胞等抗原呈递细胞的eGFP阳性细胞百分比呈现增加趋势。但是，与不添加阴离子脂质的小粒径的LPX-RNA（序号13）相比，在脾脏中B细胞、pDC细胞、cDC细胞、巨噬细胞等抗原呈递细胞的eGFP阳性细胞百分比并无显著差异，表明添加少量的ADOPE在抗原呈递细胞靶向方面不能呈现显著的效果。

结论

通过上述实验结果可知，本发明通过添加永久阴离子脂质、永久阳离子脂质、中性脂质制备得到的组合物能使脾脏中抗原呈递细胞（例如，B细胞、pDC细胞、cDC细胞、巨噬细胞）表达抗原的细胞百分比显著增加。

实施例8：含ADOPE的RNA组合物与大粒径LPX-RNA的对比实验

根据LPX-RNA的相关发明专利（授权公告号：CN109331176B）可知，注射不同尺寸的萤光素酶-RNA脂质体组合物后，小鼠的脾中萤光素酶活性有差异，主要表现为较大的脂质体组合物具有较高的活性。按照CN109331176B的制备方法，将LPX-RNA配制的乙醇用量降低50%即可制备大粒径LPX-RNA组合物。本实施例对比了含ADOPE组合物和大粒径LPX-RNA组合物在小鼠活体成像和小鼠脾脏细胞eGFP阳性细胞百分比等方面的差异。

表11含永久阴离子脂质的组合物与不含阴离子脂质的大粒径LPX-RNA组合物的小鼠活体成像实验数据对比

注：序号2为不含阴离子脂质的大粒径LPX-RNA。

结果分析：如表11所示，相比不含阴离子脂质的大粒径LPX-RNA（序号2，粒径478.5nm）的组合物，添加永久阴离子脂质ADOPE的组合物（序号1，粒径379.9nm）的小鼠总辐射强度为序号2的2.4倍，脾的总辐射强度为序号2的3.8倍。表明两种组合物在小鼠活体成像方面的差异主要由ADOPE的添加引起，粒径影响并不明显。即，添加永久阴离子脂质制备得到的组合物能显著提高抗原在脾脏中的蛋白表达量，表现出良好且显著的脾靶向作用。

表12 含永久阴离子脂质的组合物与不含阴离子脂质的大粒径LPX-RNA组合物在小鼠脾脏细胞eGFP阳性细胞百分比对比

注：序号2为大粒径LPX-RNA。

结果分析：如表12和图2所示，在粒径相当的情况下，与不含阴离子脂质的LPX-RNA组合物（序号2，粒径418.8nm）相比，含永久阴离子脂质ADOPE的组合物（序号1，粒径365.8nm）在B细胞、pDC细胞、cDC细胞、巨噬细胞等抗原呈递细胞的eGFP阳性细胞百分比分别为其4.8倍、2.4倍、3.7倍和2.3倍。

实验结果表明，永久阴离子脂质（例如，ADOPE）的添加可以使抗原呈递细胞（例如，B细胞、pDC细胞、cDC细胞、巨噬细胞）表达抗原的细胞百分比显著增加。

总结：通过上述结果进一步证明本发明设计的含永久阴离子脂质的mRNA组合物能够在小鼠脾脏富集，递送的mRNA在小鼠脾脏的蛋白质表达量，与不添加阴离子脂质制备的组合物以及现有技术递送技术相比均显著提升，并且能使抗原呈递细胞（例如，B细胞、pDC细胞、cDC细胞、巨噬细胞）表达抗原的细胞百分比显著增加。

实施例9：含ADOPE的RNA组合物激发的IFN-α细胞因子情况

干扰素α（IFN-α）是一种重要的细胞因子，在机体的免疫系统中发挥着重要的作用。它具有抗病毒、抗肿瘤、抑制造血细胞增殖和免疫调节等多种功能，对多种疾病具有治疗作用。IFN-α通常是在RNA病毒感染的情况下，由APC细胞分别通过内体TLR3和TLR7来感应双链RNA（dsRNA）和单链RNA（ssRNA）产生的，对于有效的炎症和抗病毒环境至关重要。

C57BL/6J小鼠尾静脉注射按实施例2制备的LPX-HA mRNA（一种预防流感的mRNA疫苗）（40μg）或含ADOPE的HA mRNA（40μg）组合物后6小时和24小时取血，通过ELISA测血清中IFN-α的含量，平行每组3只小鼠，同时将注射等体积空白脂质溶液的小鼠设定为空白组。

动物：C57BL/6小鼠来自Jackson实验室。在整个实验中使用8至10周龄雌性匹配动物。

ELISA测定：根据制造商的说明书采用标准ELISA测定在小鼠血清中检测小鼠的IFN-a(PBL)。

表13 含永久阴离子脂质的RNA组合物与不含阴离子脂质的LPX-HA mRNA组合物激发的IFN-α细胞因子对比

注：序号4为大粒径LPX-RNA。

结果分析：如表13和图3所示，在粒径相当的情况下，与不含阴离子脂质的LPX-RNA组合物（序号4，粒径384.1nm）相比，含永久阴离子脂质ADOPE的组合物（序号2，粒径325.7nm）和（序号3，粒径352.5nm）在注射后6小时血清中的IFN-α细胞因子平均为不含阴离子脂质的LPX-RNA组合物的（序号4）的1.9倍和3.1倍，在注射后24小时血清中的IFN-α细胞因子平均是不含阴离子脂质的LPX-RNA组合物的（序号4）的1.8倍和3.8倍。

实验结果表明，通过检测含ADOPE组合物激发的IFN-α细胞因子情况，可以证明本发明的组合物可以启动一种强I型IFN驱动的免疫刺激程序，并且激发情况显著高于LPX-RNA。

实施例10：含ADOPE的RNA组合物刺激产生的抗原特异性细胞毒性T细胞情况

肿瘤mRNA-脂质体复合物生成的T细胞效应的强弱可以通过检测血清中抗原特异性CD8⁺细胞毒性T细胞（CD8⁺T细胞）来判断，这对于脂质复合物递送肿瘤mRNA的抗肿瘤效果至关重要。

C57BL/6J小鼠分别在第0天、第3天、第8天通过尾静脉注射的方式用按实施例2制备的LPX-卵清蛋白（OVA）mRNA或者含ADOPE的OVA mRNA（40μg）组合物接种疫苗（每次每只注射含有40μg治疗剂OVA-mRNA的疫苗），同时将稀释后同体积等量的空白脂质溶液的小鼠设定为对照组，平行每组3只小鼠。

第13天（三次免疫后第5天）取全血约200μL通过细胞流式法检测OVA抗原特异性CD8⁺的T细胞在总CD8⁺T细胞中的百分比。具体操作：

1、取100μL全血至流式管中。（需要准备空白对照）

2、加入表面抗体预混液100μL吹吸混匀，室温避光孵育15min。预混液组分如下，配制时按下表14依次加入：

表14 检测OVA抗原特异性CD8⁺的T细胞实验试剂和来源

3、加入2mL 1×RBC Lysis Buffer，避光10分钟，500g离心5min，弃上清。

4、加入2mL 1×RBC Lysis Buffer，500g离心5min，弃上清。

5、加入200μL PBS，转移到洁净的已标号的EP管中，上机检测。上机前用单色补偿微球调补偿。检测顺序如下：

CD3⁺→CD8⁺→APC anti-mouse H-2Kb bound to SIINFEKL

表15 含永久阴离子脂质的RNA组合物与不含阴离子脂质的LPX-RNA组合物激发的OVA抗原特异性T细胞含量占比

注：序号4为大粒径LPX-RNA。

结果分析：如表15和图4所示，在粒径相当的情况下，与不含阴离子脂质的LPX-RNA组合物（序号4，粒径373.4nm）相比，含永久阴离子脂质ADOPE的组合物（序号2，粒径333.1nm）和（序号3，粒径356.3nm）在注射第13天，血清中的OVA抗原特异性CD8⁺的T细胞在总CD8⁺T细胞中的百分比平均是不含阴离子脂质的LPX-RNA组合物（序号4，粒径373.4nm）的1.5倍和1.8倍左右。

实验结果表明，通过检测含ADOPE组合物激发的抗原特异性细胞毒性T细胞情况，可以证明本发明的组合物可以产生非常强的T细胞效应，并且激发情况显著高于LPX-RNA。

实施例11：含ADOPE组合物对荷瘤小鼠模型的治疗作用

1) B16F10-OVA黑色素瘤小鼠模型的建立：在研究之前，使6至8周龄之间的雌性C57BL/6J小鼠适应至少三天。小鼠自由获取食物及无菌水，且在22℃±2℃及55％±15％之相对湿度下以12小时光/暗循环圈养。B16F10-OVA细胞，在按说明书描述的完全培养基中5％CO₂、37℃培养。细胞使用0.25％胰蛋白酶-EDTA来收集，再悬浮于杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中，且以2×10⁵个细胞/100μl/小鼠皮下(SC)移植至雌性C57BL/6J小鼠之肋部，建立皮下B16F10-OVA肿瘤模型，待肿瘤体积达到100mm³左右开始接种疫苗。

2) 接种疫苗：对入组的C57BL/6J小鼠用按实施例3制备的LPX-OVA mRNA或者含ADOPE的OVA mRNA组合物（40μg）分别在注射细胞后第10、13、17天通过尾静脉注射的方式接种疫苗（每次每只注射含有40μg治疗剂mRNA-OVA的疫苗），同时将接种等体积空白脂质溶液的小鼠设定为对照组，平行每组8只小鼠。

表16 含永久阴离子脂质的组合物与不含阴离子脂质的大粒径LPX-RNA组合物的肿瘤治疗

注：序号4为大粒径LPX-RNA。

3) 肿瘤大小和小鼠存活率：从接种肿瘤后第7天开始，每周3次测量肿瘤直径。按下述公式计算C57BL/6J小鼠的肿瘤体积：V(mm³)=x×y²/2，单位为mm，其中V代表肿瘤体积，x表示肿瘤长径，y表示肿瘤短径。同时每周3次用电子天平记录C57BL/6J小鼠体重的变化，直到肿瘤体积超过2000mm³后将存活动物实施安乐死，并统计存活率。

结果分析：如图5和下表17所示，在第0天皮下接种B16F10-OVA黑色素瘤细胞，分别在接种肿瘤后第10天、第13天、第17天接种疫苗，接种肿瘤后第10天，各组小鼠均进入肿瘤快速生长期，第14天开始，与空白脂质对照组（序号1）相比，由含ADOPE的OVA mRNA组合物组（序号2、序号3）均显示出明显的肿瘤生长延迟，肿瘤大小均明显小于空白脂质对照组；第19天开始，与LPX-OVA mRNA（序号4）相比，由含ADOPE的OVA mRNA组合物（序号2、序号3）组的肿瘤体积也均显示出更强的肿瘤生长抑制。

表17 不同组合物的肿瘤治疗过程中小鼠体内肿瘤生长情况

如图6和表18所示，空白脂质对照组在从接种肿瘤后第15天开始死亡，第17天全部死亡；LPX-OVA mRNA对照组（序号4），从第19天开始死亡，第28天全部死亡；由含ADOPE的OVAmRNA组合物（序号2、序号3）均从第21天开始死亡，分别在第31天和第33天全部死亡。

表18 不同组合物的肿瘤治疗过程中小鼠存活率情况

由表17和18的结果可知，相对于空白脂质对照组和不含阴离子脂质的LPX-RNA组合物，本发明的含永久阴离子脂质的特定组合物可显著的增强抑制肿瘤生长、提高小鼠存活率。

结论：

本发明内容提供了一种组合物，包括编码一种或多种抗原的RNA作为治疗剂以及脂质组合物，其中脂质组合物包含：永久阴离子脂质、永久阳离子脂质、中性脂质；通过添加永久阴离子脂质制备得到的组合物①粒径大小良好，颗粒分布均匀；②能显著提高抗原在脾脏中的蛋白表达量；并且③使脾脏中抗原呈递细胞（例如，B细胞、pDC细胞、cDC细胞、巨噬细胞）表达抗原的细胞百分比显著增加；具体来说：

I、通过添加含有磷酸根基团的永久阴离子脂质，能制备得到粒径大小良好（粒径控制在240-500nm），颗粒分布均匀（PDI＜0.5）的组合物。

1. 通过添加永久阴离子脂质，特别是包含磷酸根基团的永久阴离子脂质，包括ADOPE、18PA、DOPG、十四烷基膦酸、法尼焦磷酸、γ,γ-二甲基烯丙基焦磷酸和pA(2′-OMe)mpG，制备的组合物均有较好的粒径和PDI，其中最好为ADOPE，粒径为303.1nm，PDI低至0.2455，颗粒均匀度良好。

2. 相反，采用不含有磷酸根基团的其他阴离子脂质，如油酸、二（月桂醇聚醚-7）柠檬酸酯钠、月桂基磺酸钠的组合物粒径较大，超过1000nm，并有固体析出，不合适作为mRNA递送载体。

II、本发明设计的含永久阴离子脂质、永久阳离子脂质和中性脂质的组合物，特别是通过控制其中ADOPE、DOTMA、DOPE的摩尔百分比在(14mol%-33mol%)：(40mol%-57mol%)：(22mol%-40mol%)，或者电荷比为1:2-1:5，能显著提高抗原在脾脏中的蛋白表达量（对应总辐射强度）：

1．小鼠活体成像实验表明本发明设计的含永久阴离子脂质的组合物其递送的抗原在脾脏中的蛋白表达量显著高于其他脏器（例如：肝、肺），制备的组合物递送的Fluc-mRNA在脾脏中表达的蛋白的总辐射强度高达1.20×10⁷-7.38×10⁷p/s。

2. 与不添加阴离子脂质制备的组合物相比，本发明设计的组合物其递送的抗原在脾脏中的蛋白表达量显著提高。

例如，本发明设计的mRNA组合物递送的Fluc-mRNA在脾脏中表达的蛋白的总辐射强度高达不添加阴离子脂质制备的组合物的12.10倍。

3. 与现有技术LNP相比，本发明设计的组合物其递送的抗原在脾脏中的蛋白表达量显著高于现有技术LNP。

例如，本发明设计的组合物在脾脏中表达蛋白的总辐射强度高达现有技术LNP：YK-009-mRNA-LNP的9.46倍、YK-407-mRNA-LNP的7.10倍。

III、本发明设计的组合物使脾脏中抗原呈递细胞（例如，B细胞、pDC细胞、cDC细胞、巨噬细胞）表达抗原的细胞百分比显著增加：

1. 小鼠脾脏细胞流式实验表明本发明设计的含永久阴离子脂质的组合物使脾脏中抗原呈递细胞（例如，B细胞、pDC细胞、cDC细胞、巨噬细胞）表达抗原的细胞百分比显著增加。

例如：抗原呈递细胞中B细胞百分比约0.1-0.4%，pDC细胞百分比约2-6%，cDC细胞百分比约2-9%，巨噬细胞百分比约2.4-7.5%。

2. 与不添加阴离子脂质制备的组合物相比，本发明设计的组合物使脾脏中抗原呈递细胞表达抗原的细胞百分比显著提高。

例如，本发明表达eGFP的B细胞、pDC细胞、cDC细胞、巨噬细胞的细胞百分比分别是不添加阴离子脂质制备的组合物的19倍、2.8倍、8.1倍和11.8倍。

3. 本发明设计的特定组合的组合物使脾脏中抗原呈递细胞表达抗原的百分比显著高于其他组合的组合物。

例如，本发明特定组合的组合物（永久阴离子脂质ADOPE、永久阳离子脂质DOTMA、中性脂质DOPE）表达eGFP的B细胞、pDC细胞、cDC细胞、巨噬细胞的细胞百分比分别是pA(2′-OMe)mpG的eGFP RNA组合物（永久阴离子脂质pA(2′-OMe)mpG、永久阳离子脂质DOTMA、中性脂质DOPE）的4.8倍、5.6倍、12.1倍和11.6倍。

IV、本发明设计的特定组合的组合物与不含阴离子脂质的LPX-RNA组合物相比，激发IFN-α细胞因子的能力显著增强，证明本发明的组合物可以启动强I型IFN驱动的免疫刺激程序。

例如，分别注射后6小时和24小时，本发明含永久阴离子脂质组合物血清中的IFN-α细胞因子含量是不含阴离子脂质的LPX-RNA组合物的1.7-4倍和1.5-5倍左右。

V、本发明设计的特定组合的组合物与不含阴离子脂质的LPX-RNA组合物相比，激发的抗原特异性细胞毒性T细胞的能力显著增强，证明本发明的组合物可以产生非常强的T细胞效应。

例如，在注射本发明含永久阴离子脂质的特定组合物第13天，其血清中的OVA抗原特异性CD8⁺的T细胞在总CD8⁺T细胞中的百分比是注射不含阴离子脂质的LPX-RNA组合物的1.3-1.9倍。

VI、本发明设计的特定组合的组合物与不含阴离子脂质的LPX-RNA组合物相比，在动物实验中表现出明显的控制肿瘤生长、延长荷瘤实验动物生存时间的效果。

小鼠皮下接种B16F10-OVA黑色素瘤细胞后，相对于空白脂质对照组和施用不含阴离子脂质的LPX-RNA组合物的对照组，通过注射施用本发明的含永久阴离子脂质的特定组合物，能够有效延迟肿瘤生长速度，肿瘤大小明显减小；注射施用本发明的含永久阴离子脂质的特定组合物的荷瘤小鼠生存率显著增加。

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明所保护的范围内。

Claims (26)

1.一种脂质组合物，其包含：

（1）永久阴离子脂质；

（2）永久阳离子脂质；

（3）中性脂质；

其中，永久阴离子脂质、永久阳离子脂质和中性脂质在所述脂质组合物中的摩尔占比的比例为14-33:40-57:22-40。

2.根据权利要求1所述的脂质组合物，其中，所述永久阴离子脂质中包含磷酸根基团；

和/或，所述永久阳离子脂质中包含季铵基团；

和/或，所述中性脂质中包含磷酸根基团和/或季铵基团。

3.根据权利要求1所述的脂质组合物，其中，所述永久阴离子脂质选自以下任意一种或多种：

2-乙酰氨基乙基((R)-2,3-双(油酰氧基)丙基)磷酸酯、(Z)-(R)-3-(膦酰氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯和1,2-二油酰-SN-甘油基-3-磷酸-RAC-甘油，以及它们的盐；

和/或，所述永久阳离子脂质选自以下任意一种或多种：

1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷、(2,3-二油氧基丙基)三甲基铵，以及它们的盐；

和/或，所述中性脂质选自：

1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺，和/或，二硬脂酰磷脂酰胆碱，以及它们的盐。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的脂质组合物，其中，所述脂质组合物包含：

（1）25mol%的永久阴离子脂质；

（2）50mol%的永久阳离子脂质；以及

（3）25mol%的中性脂质；

或者，所述脂质组合物包含：

（1）20mol%的永久阴离子脂质；

（2）40mol%的永久阳离子脂质；以及

（3）40mol%的中性脂质；

或者，所述脂质组合物包含：

（1）14mol%的永久阴离子脂质；

（2）57mol%的永久阳离子脂质；以及

（3）29mol%的中性脂质；

或者，所述脂质组合物包含：

（1）33mol%的永久阴离子脂质；

（2）45mol%的永久阳离子脂质；以及

（3）22mol%的中性脂质。

5.脂质组合物在提高对靶器官中的抗原呈递细胞的靶向性中的应用，该脂质组合物包含：

（1）永久阴离子脂质；

（2）永久阳离子脂质；

（3）中性脂质；

其中，永久阴离子脂质、永久阳离子脂质和中性脂质在所述脂质组合物中的摩尔占比的比例为14-33:40-57:22-40。

6.一种组合物，其包含：

(A) 治疗剂和/或预防剂，其包含核酸分子、小分子化合物、多肽或蛋白质中的一种或多种；

(B) 如权利要求1-4中任意一项所述的脂质组合物；

所述组合物用于将所述治疗剂和/或预防剂递送至靶器官中的抗原呈递细胞。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中，所述治疗剂和/或预防剂为能够编码一种或多种抗原的核酸分子。

8.根据权利要求6或7所述的组合物，其中，所述抗原为疾病相关抗原，或者所述核酸分子或抗原能够引发针对疾病相关抗原或表达疾病相关抗原之细胞的免疫应答。

9.根据权利要求6所述的组合物，其中，所述靶器官选自以下中任意一种或多种：脾、肝和肺。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中，所述靶器官为脾。

11.根据权利要求6所述的组合物，其中，所述抗原呈递细胞包括以下任意一种或多种：树突状细胞、巨噬细胞和B细胞。

12.根据权利要求6所述的组合物，其中，所述治疗剂和/或预防剂与脂质组合物的用量使得所述组合物中的净正电荷与负电荷的电荷比为1:2至1:5。

13.根据权利要求6所述的组合物，其中，所述脂质组合物包含：

（1）14 mol%-33 mol%的永久阴离子脂质；

（2）40 mol%-57 mol%的永久阳离子脂质；

（3）22 mol%-40 mol%的中性脂质；

所述永久阴离子脂质为2-乙酰氨基乙基((R)-2,3-双(油酰氧基)丙基)磷酸酯和/或其盐，永久阳离子脂质为1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷和/或其盐，中性脂质为1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺和/或其盐；

所述组合物中的净正电荷与负电荷的电荷比为1:2至1:5。

14.根据权利要求12或13所述的组合物，其中，所述组合物中的净正电荷与负电荷的电荷比为1:2；

或者，所述组合物中的净正电荷与负电荷的电荷比为2:5；

或者，所述组合物中的净正电荷与负电荷的电荷比为1:3；

或者，所述组合物中的净正电荷与负电荷的电荷比为1:5。

15.根据权利要求6或7所述的组合物，其中，所述核酸分子是编码一种或多种抗原的RNA。

16.根据权利要求6所述的组合物，其中，所述组合物还包含至少一种辅助成分或佐剂；

和/或，所述组合物还包含一种或多种可药用载剂、稀释剂或赋形剂；

和/或，所述组合物还包含一种或多种疏水性小分子、渗透性增强分子、碳水化合物、聚合物、表面改变剂、官能化脂质或细胞因子。

17.一种制备用于将治疗剂和/或预防剂递送至靶器官中的抗原呈递细胞的组合物的方法，该方法包括：

(a) 将永久阴离子脂质、永久阳离子脂质和中性脂质溶解在有机溶剂中形成脂质溶液，所述永久阴离子脂质、永久阳离子脂质和中性脂质的摩尔比为14-33:40-57:22-40；

(b) 将步骤(a)获得的脂质溶液与水混合得到脂质混合液；

(c) 将步骤(b)获得的脂质混合液与治疗剂和/或预防剂混合形成所述组合物，所述治疗剂和/或预防剂包括通过将核酸分子溶解于pH值为6.8-7.6的缓冲液中获得的核酸缓冲溶液。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，步骤（a）中，所述有机溶剂为醇溶剂；

和/或，步骤（b）中，所述脂质混合液能够通过孔径100-400nm的聚碳酸酯膜；

和/或，步骤（c）中，所述缓冲液包括水性HEPES缓冲液；

和/或，步骤（c）中，所述核酸分子为能够编码一种或多种抗原的核酸分子。

19.根据权利要求17或18所述的方法，其中，步骤（a）中，所述有机溶剂包括碳原子数1-4的醇；

和/或，步骤（c）中，所述缓冲液包括水性HEPES缓冲液和EDTA；

和/或，步骤（c）中，所述抗原为疾病相关抗原，或者所述核酸分子或抗原能够引发针对疾病相关抗原或表达疾病相关抗原之细胞的免疫应答。

20.根据权利要求17所述的方法，其中，所述永久阴离子脂质中包含磷酸根基团；

和/或，所述永久阳离子脂质中包含季铵基团；

和/或，所述中性脂质中包含磷酸根基团和/或季铵基团。

21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述永久阴离子脂质选自以下任意一种或多种：

2-乙酰氨基乙基((R)-2,3-双(油酰氧基)丙基)磷酸酯、(Z)-(R)-3-(膦酰氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯和1,2-二油酰-SN-甘油基-3-磷酸-RAC-甘油，以及它们的盐；

和/或，所述永久阳离子脂质选自以下任意一种或多种：

1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷、(2,3-二油氧基丙基)三甲基铵，以及它们的盐；

和/或，所述中性脂质选自：

1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺，和/或，二硬脂酰磷脂酰胆碱，以及它们的盐。

22.根据权利要求17所述的方法，其中，步骤（c）中，脂质混合液与治疗剂和/或预防剂的用量使得得到的组合物中的净正电荷与负电荷的电荷比为1:2至1:5。

23.权利要求1-4中任意一项所述的脂质组合物、权利要求6-16中任意一项所述的组合物，或者，根据权利要求17-22中任意一项所述的方法制备得到的组合物在制备能够诱发细胞的免疫应答的药物中的用途。

24.权利要求1-4中任意一项所述的脂质组合物、权利要求6-16中任意一项所述的组合物，或者，根据权利要求17-22中任意一项所述的方法制备得到的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、诊断、治疗或改善哺乳动物受试者中疾病、病症、异常病况或功能障碍。

25.根据权利要求24所述的用途，其中，所述疾病、病症、异常病况或功能障碍选自以下中的任意一种或多种：感染性疾病、癌症、增生性疾病、遗传性疾病、自体免疫性疾病、神经退化性疾病、心血管和肾血管疾病、代谢性疾病。

26.根据权利要求24所述的用途，其中，所述哺乳动物受试者选自人类、非人灵长类动物、伴侣动物、外来物种、家畜动物和供食用动物中的一种或多种。