EP1628636A1 - Injizierbare liposomale depots zum wirkstoffdelivery - Google Patents

Injizierbare liposomale depots zum wirkstoffdelivery

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Publication number
EP1628636A1
EP1628636A1 EP04738511A EP04738511A EP1628636A1 EP 1628636 A1 EP1628636 A1 EP 1628636A1 EP 04738511 A EP04738511 A EP 04738511A EP 04738511 A EP04738511 A EP 04738511A EP 1628636 A1 EP1628636 A1 EP 1628636A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
active ingredient
depot
depot system
chol
liposomes
Prior art date
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Ceased
Application number
EP04738511A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Steffen Panzner
Silke Lutz
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Novosom AG
Original Assignee
Novosom AG
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Publication date
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Priority claimed from DE200410005783 external-priority patent/DE102004005783A1/de
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Publication of EP1628636A1 publication Critical patent/EP1628636A1/de
Ceased legal-status Critical Current

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    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0024—Solid, semi-solid or solidifying implants, which are implanted or injected in body tissue
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    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids

Definitions

  • the invention relates to a liposomal delivery system for delayed drug release and the use of this system in basic research and clinic.
  • Peptide and protein active ingredients are broken down or excreted very quickly in the body after application and must therefore be administered by repeated injections.
  • Liposomes are a possible form of such a carrier system. They are made up of one or more lipid bilayers and enclose an aqueous compartment inside, in which water-soluble substances can be enclosed. Lipophilic substances can be incorporated into the lipid bilayer.
  • depot systems use liposomes which are composed of neutral, anionic or PEG lipids, for example in WO 9920301 for a depot of ⁇ -interferon, in Diabetes 31 (1982), 506-511 for a depot of Insulin; still in Proc. Natl. Acad. Be. 88 (1991), 10440-10444 for vaccination.
  • liposomes are used for liposomal depot systems.
  • the liposomes must have a minimum size in order not to migrate into the lymph.
  • oligonucleotides In addition to peptides and proteins, enzymes also break down oligonucleotides in the body very quickly. These drugs are usually given in high doses by intravenous injection, but need to be repeated often. For an improved "patient compliance" and in order to be able to reduce the dose, a suitable delivery system is therefore required which protects the active substance in the body against degradation and releases it only slowly and with a delay.
  • Today delivery systems are mostly used which support the intracellular delivery of the active substances after administration. These include liposomal systems, polymer-based systems (e.g. PEI) and viral carriers. These intracellular delivery strategies can lead to a dose reduction of the active substances. However, the number of injections cannot be reduced.
  • oligonucleotides Another option for administering oligonucleotides is depot systems, which are applied locally and release the active substances evenly over a certain period of time. These delivery strategies do not necessarily support the intracellular delivery of the active ingredients, rather they lead to a steady-state level of the active ingredient over time in the blood or tissue. This allows the frequency of injections to be reduced and, furthermore, a dose reduction is possible by maintaining the active substance concentration.
  • Micro- or nanoparticles made of biocompatible polymers represent a possible form of such a depot system.
  • US Pat. No. 6,555,525 describes the delayed release of antisense oligonucleotides from PLGA microcapsules after subcutaneous injection in a mouse leukemia model. The delayed release of oligonucleotides from PLGA-based micro or. Nanocapsules are also described in numerous other publications (e.g. J. Drug Target. 5 (4), 291-302, (1998); Gene Ther. 9 (23), 1607-16, (2002); Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 9 (5), 451-8, (1999), J. Control. Release 37, 173-183, (1995)).
  • the hydrolysis of the PLGA capsules produces very low pH values inside the capsules, which can damage the integrity of the enclosed active substances. It is known, for example, that purine bases detach from the nucleic acid backbone by hydrolysis at low pH values.
  • Liposomes are also a possible form of a carrier system for oligonucleotides. Numerous publications deal with the use of mostly cationic liposomal systems for the delivery of oligonucleotides in vivo
  • lipid mixtures used from unsaturated lipids such as e.g. DOTAP or DOPE are built up and are therefore not serum stable.
  • these liposomes release the trapped active ingredient very quickly after the injection.
  • complexes of preformed liposomes and nucleic acids are also produced for the above-mentioned applications (e.g. lipoplexes).
  • the complex formation or the liposomal formulations which are usually not stable in the serum, mean that the stability of the oligonucleotides is not guaranteed over a longer period of time, as required for a depot.
  • the object of the invention was therefore to provide new stable liposomal depot formulations for protein and peptide active ingredients and for oligonucleotides which achieve long-term release of the active ingredient over at least one week and are well tolerated in the organism. Another task was to provide depot systems that do not "burst release" the active ingredient or, if therapeutically indicated, achieve an initial rapid partial release of the active substance, followed by a long-lasting release of the active substance.
  • a depot system in particular for the delayed release of active ingredient, wherein it contains liposomes (a) with saturated synthetic phosphatidylcholines, selected from the group DMPC, DPPC and / or DSPC, (b) cholesterol with a proportion of 35 to 50 mol%. , (c) cationic lipids selected from the group DC-Chol, DAC-Chol, DMTAP, DPTAP and / or DOTAP with a proportion of 5 to 20 mol% of the liposome membrane (d) and a protein and / or peptide active ingredient ,
  • such liposomes preferably also comprise cationic lipids.
  • positively charged liposomes aggregate well with components of the serum or interstitial fluid and remain in this state at the puncture site. A diffusion of the depot away from the puncture site is thus advantageously avoided.
  • the depots can be designed in such a way that they enable a burst release or do not enable this. Depots without burst release can be provided by detaching and separating active substance adhering to the outside of the liposomes. If a burst relase is advantageous, the active substance adhering to the outside of the liposomes is not detached and separated.
  • the liposomes according to the invention aggregate with serum components and components of the interstitial fluid, whereby the depot remains at the puncture site and thus e.g. migration into the lymph is prevented.
  • the lipid composition according to the invention contains saturated framework lipids, which ensures the integrity of the liposomes even in the aggregated state and thus for better protection of the active substance or for a longer depot duration.
  • the manufacturing process does not use organic, water-immiscible solvents, which can cause regulatory problems because they are difficult to remove completely or damage the active ingredient (proteins). There are no degradation products, like micro and nanoparticles made of polymers, that can damage the active ingredient (acidic reaction when PLGA capsules are broken down). Variable through with or without burst release character of the depot system, depending on the requirements of therapy and active ingredient.
  • liposomes which are composed of neutral and cationic lipids are used as a liposomal depot system for the delayed release of therapeutic peptides and proteins of various molecular weights.
  • J. Pharm. Sei., 89 (3), 297-310, 2000 the absolute bioavailability of peptides and proteins of different sizes after subcutaneous administration is described, with no significant reduction in bioavailability being observed with increasing molar mass. Since therapeutic peptides and proteins are broken down very quickly in the body, they have to be administered by repeated injections.
  • the peptides and proteins relevant to this embodiment of the invention, their analogs, associated peptides, fragments, inhibitors and anatagonists include:
  • TGF-alpha, TGF-beta Transforming growth factors (TGF-alpha, TGF-beta), interleukins (e.g. IL-1, IL-2, IL-3), interferons (IFN-alpha, IFN-beta, IFN-gamma), calcitonins, insulin-like growth factors (IGF-1, IGF-2), parathyroid hormone, granulocyte stimulating factor (GCSF), granulocyte macrophage stimulating factor (GMCSF), macrophage stimulating factor (MCSF), erythropoietin, insulin, amyline, glucagone, lipocortine, growth hormone, Somatostatin, angiostatin, endostatin, octreotide, gonadotropin releasing hormone (GNRH), luteinizing hormone releasing hormone (LHRH) and effective agonists such as leuprolide acetate, buserelin, goserelin, triptorelin; Platelet-derived growth factor; Blood coagulation
  • factor VIII factor VIII
  • factor IX thromboplastin activators
  • tissue plasminogen activators streptokinase, vasopressin, muramyl dipeptide (MDP), atrial naturetic factor (ANF), calcitonin gene-related peptide (CGRP), bombesin, enkephaline, enfuvirtide, vasoactive intestinal peptide (VIP), epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), growth hormone releasing hormone (GRH), bone morphogenetic proteins (BMP), antibodies and antibody fragments (e.g.
  • oligonucleotides are composed of 5-100, preferably 5-40 and particularly preferably 10-25 nucleotides or base pairs.
  • the oligonucleotides can be present as a single strand (e.g. antisense oligonucleotides), as a double strand (e.g. small-interfering RNA, decoy-oligonucleotides) or in complex folds (e.g. aptamers, Spiegelmers, ribozymes).
  • oligonucleotides relevant to this invention are made up of deoxyribonucleotides or ribonucleotides and their chemically modified derivatives (eg phosphorothioate DNA (PS), 2 "-O-ethyl RNA (OMe), 2'-0-methoxy-ethyl RNA (MOE ), Peptide nucleic acid (PNA), N3'-P5 'Phosphoroamidate (NP), 2' -fluoro-arabino nucleic acid (FANA), Locked nucleic acid (LNA), Morpholino phosphoroamidate (MF), Cyclohexene nucleic acid (CeNA) , Tricyclo-DNA (tcDNA)), copolymers and block copolymers of different nucleotides and so-called gapmers can be included in the liposomes.
  • PS phosphorothioate DNA
  • OMe 2 "-O-ethyl RNA
  • MOE 2
  • aptamers or Spiegelmers are included in the liposomal depot.
  • Aptamers are DNA or RNA-based oligonucleotides with a complex three-dimensional structure. Due to this structure, aptamers can bind to protein targets in a very specific and highly affine manner and thus have a therapeutic, usually extracellular, effect. Their functionality is almost identical to that of monoclonal antibodies.
  • Spiegelmers are made up of L-ribose and L-2 'deoxyribose units. Just like aptamers, these mirror-image nucleic acids bind specifically to protein targets. Because of the chiral inversion In contrast to conventional D-oligonucleotides, Spiegelmers have increased stability against enzymatic degradation.
  • water-soluble active ingredients or water-soluble active ingredient derivatives of the following active ingredient classes are also relevant for this invention: antibiotics (e.g. rifamycin SV sodium salt, rifampicin, tetracycline hydrochloride, kanamycin, penicillin G, ampicillin, novobiocin), antifungal agents (e.g. amphotericin B, flucytosine), cytostatics (e.g. doxorubicin, daunorubicin, vincristine, cytarabine), glucocorticoids (dexamethasone, prednisolone, hydrocortisone, betamethasone).
  • antibiotics e.g. rifamycin SV sodium salt, rifampicin, tetracycline hydrochloride, kanamycin, penicillin G, ampicillin, novobiocin
  • antifungal agents e.g. amphotericin B, flucytosine
  • cytostatics e.g.
  • carbohydrates such as Heparin or hyaluronic acid be relevant drug molecules for this invention.
  • Membrane proteins that are difficult to introduce into the interior of liposomes are not preferred active substances in the sense of the invention.
  • Suitable liposome formers are membrane-forming and membrane-bound lipids, which can be of natural or synthetic origin. These include in particular cholesterol and derivatives, phosphatidylcholines, phosphatidylethanolamines as neutral lipids.
  • the fully saturated compounds of this class are particularly preferably used, such as, for example, the dimyristoyl, dipalmitoyl or distearoyl derivatives of the phosphatidylcholines (DMPC, DPPC, DSPC) and the phosphatidylethanolamines.
  • Cationic lipids for practicing the invention include, for example:
  • DOTAP 1-dioleoyloxypropyl
  • DOSPER 1-dioleoyloxy-2- (6-carboxy-spermyl) -propylamide
  • DOTMA 1-dioleyloxypropyl
  • N, N-trimethylammonium chloride Lipofectin®
  • DORIE (1, 2-dioleyloxypropyl) -3 dimethylhydroxyethyl ammonium bromi
  • DOSC (1, 2-dioleoyl-3-succinyl-sn-glycerol choline ester
  • DOGSDSO 1-dioleoyl-sn-glycero-3-succinyl-2hydroxyethyl disulfide ornithine
  • Preferred cationic lipids for practicing the invention include cholesteryl 3 ⁇ -N- (dimethylaminoethyl) carbamate (DC-chol), 3- ⁇ - [N- (N, N'-dimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol (DAC-chol), ( N- [1- (2, 3-Dimyristoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium salt (DMTAP), (N- [l- (2,3-dipal itoyloxy) propyl] -N, N, N -trimethylammonium salt
  • DPTAP (N- [1- (2,3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium salt (DOTAP).
  • saturated synthetic phosphatidyl cholines such as DMPC, DPPC or DSPC, cholesterol, the cationic lipids DC-Chol, DAC-Chol, DMTAP, DPTAP or DOTAP are used, very particularly preferably the proportion of cationic lipids is between 5 and 20 mol% and the proportion of cholesterol is between 35 and 50%.
  • pH-sensitive cationic lipids are used, as are exemplified in WO 02 066490 and US 5965434. Liposomes containing these lipids can be brought into a neutral charge state by changing the pH and enable simple removal from the active substance adhering to the outside during the production process.
  • pH-sensitive cationic compounds are: histaminyl-cholesterol hemisuccinate (His-Chol), morpholine-N-ethylamino-cholesterol hemisuccinate (Mo-Chol), 4- (2,3-bis-palmitoyloxypropyl) -1-methyl-1H -imidazole (DPIM), cholesterol- (3-imidazol-l-yl propyl) carbamate (CHIM).
  • the size of the liposomes according to the invention varies from 20-1000 nm, preferably from 50-800 nm and very particularly preferably from 50-300 nm.
  • liposomes For the production of the liposomes, established methods are used according to the state of the art, such as extrusion through polycarbonate membranes, ethanol injection or high pressure homogenization.
  • Passive inclusion is preferably used when large amounts of a readily soluble active ingredient are to be included.
  • liposomes with a lipid concentration of 30 to 150 mM, preferably with a lipid concentration of 50 to 120 mM and very particularly preferably with a lipid concentration of 80 to 110 mM, are prepared in the presence of the dissolved active ingredient.
  • a further method for the inclusion of water-soluble active substances is the so-called "advanced loading" method, which is described in WO 01/34115 A2, which is included in the disclosure content of the present invention.
  • This method enables a high level Inclusion efficiency. It is preferably used when the active ingredient is to be enclosed in the liposomes as cost-effectively as possible.
  • This method which is based on an interaction between the active ingredient and membrane-forming substances, works at low ionic strengths and at a pH at which the active ingredient is in an anionic charge state in order to enter into a reversible electrostatic interaction with the cationic liposome membrane.
  • the passive inclusion method is combined with the advanced loading process.
  • the advanced loading process is carried out with a lipid concentration of 30 to 150 mM, preferably with a lipid concentration of 50 to 120 mM and very particularly preferably with a lipid concentration of 80 to 110 M, in order to significantly increase the inclusion rates compared to the individual methods.
  • active substance adhering to the outside of the liposome membrane can be detached and removed from the surface of the liposomes.
  • This step is of central importance for the properties of the liposomal depot. If the active substance is detached from the liposome surface and removed from the liposome suspension, depot formulations are obtained which show practically no or only minimal "burst release".
  • This feature is of central importance in particular when active substances are to be administered, for which a short-term high concentrations of active substances, as is the case with the initial flooding, can lead to toxic reactions in the body, for example insulin, the overdosing of which leads to life-threatening hypoglycemic Conditions.
  • the existing interaction can be resolved, for example, by changing the pH or increasing the ionic strength.
  • the final separation can be carried out by processes known to the person skilled in the art, such as centrifugation, ultrafiltration, dialysis or other chromatic processes, so that at least 90% of the active substance is enclosed in the liposome and less than 10%, preferably less than 5%, of the active substance is outside the Liposomes.
  • the active substance adhering to the liposomal membrane is not detached from the membrane, i.e. the pH value or the ionic strength are not changed.
  • This embodiment is used in particular in the case of active substances in which an initial flooding of the active substance is toxicologically unobjectionable, for example in the case of leuprolide acetate or many antibodies.
  • the free active ingredient remains in whole or in part, but more than 5%, preferably more than 10%, in the liposome suspension and ensures that the active ingredient quickly floods into the blood.
  • Another advantage of this embodiment is that the suspension can be lyophilized, since release of the active substance enclosed inside is minimized during the lyophilization process, since the same active substance concentration is present both on the inside and on the outside of the membrane.
  • Leuprolide acetate ([D-Leu ⁇ Pro 9 Des-Gly 10 ] -LHRH ethyl amide) is a synthetically produced agonist of LHRH (luteneizing hormone releasing hormone) and is used clinically primarily for prostate cancer, endometriosis and premature puberty to reduce androgen levels in serum to lower.
  • LHRH leuprolide acetate
  • the continuous administration of leuprolide acetate initially leads to an increase in the testosterone level before it is then lowered to the castration level.
  • the initial increase of testosterone is due to stimulation of the LHRH receptors in the pituitary gland and the resulting release of LH, which in turn stimulates testosterone production in the testes.
  • leuprolide acetate is used as an active ingredient in a depot system according to the invention.
  • antigens or antigen fragments are used as active ingredients of a depot system according to the invention for vaccination.
  • therapeutically usable insulins are used as active ingredients for a delivery system according to the invention.
  • the liposomal formulations according to the invention can be used to produce a medicament.
  • the liposomal formulations are brought into a physiologically compatible medium.
  • the conditions of a physiologically compatible medium are known to the person skilled in the art and include, for example, a pH of 7.3 to 7.6, preferably 7.4 to 7.5, a salt content corresponding to approximately 150 mM NaCl, or an osmolarity of about 320 mos.
  • the liposomal formulations according to the invention can be injected subcutaneously or intramuscularly as a depot pharmaceutical form. Furthermore, they can also be applied locally or topically.
  • the invention also relates to a kit which comprises the depot system according to the invention, possibly with information for combining the contents of the kit.
  • the kit can be used in basic research and medicine.
  • the information can, for example, also refer to a Internet address at which further information can be obtained.
  • the information can be a treatment regimen for a disease or, for example, instructions for using the kit in research.
  • Liposomal depot system with leuprolide acetate from example 7 of the present invention in an animal model (serum level leuprolide acetate) examples
  • Lipid mixtures of the following composition are Lipid mixtures of the following composition
  • Formulation Composition 1-1 DPPC / DC-Chol / Chol
  • the liposomes are extruded several times through a membrane with a pore size of 200nm or 400nm (Avestin LiposoFast, polycarbonate membrane with a pore size of 200 or 400nm).
  • the suspension obtained is buffered by adding a stock solution of glycine-HCl, pH 3.5 and NaCl.
  • the insulin which had not been trapped was separated by sedimentation three times in the ultracentrifuge at 60,000 ⁇ g, 45 minutes.
  • a physiological pH is adjusted again by adding a HEPES stock solution, pH 7.5.
  • the amount of insulin included is determined after extraction with CHC1 3 and CH 3 OH using RP-HPLC. Inclusion rates of 80-100% insulin result.
  • the liposomes are extruded several times through a membrane with a pore size of 200nm or 400nm (Avestin LiposoFast, polycarbonate membrane with a pore size of 200 or 400nm). After the extrusion, the ionic strength of the suspension obtained is increased by adding a stock solution of NaCl.
  • the non-trapped AP is separated by sedimentation three times in the ultracentrifuge at 60,000 x g for 45 min.
  • the amount of AP included will be organic Precipitation with CHC1 3 and CH 3 OH was determined using a protein assay (BCA Protein Assay Reagent Kit, Perbio). In addition, the activity of the included AP is determined using an enzyme assay (p-nitrophenyl phosphate test). Inclusion rates of 40-50% AP result.
  • the liposomes are extruded several times through a membrane with a pore size of 200 nm (Avestin LiposoFast, polycarbonate membrane with a pore size of 200 nm).
  • the 3- H-inulin which is not trapped is removed by gel filtration (G75 column, Pharmacia).
  • the amount of 3 H-inulin included is determined after separation in the scintillation counter. Inclusion rates of 10-25% 3 H inulin result.
  • the various liposomes according to Example 3 were injected subcutaneously into healthy rats (3 animals per group) in a concentration of 20 mM lipid in a volume of 0.5 mL.
  • a control sample with empty liposomes and unencapsulated 3 H inulin was also administered subcutaneously in a volume of 0.5 mL.
  • the pharmacokinetic data were obtained by taking blood at different times.
  • the entire trial duration of the animal study was 6 weeks.
  • the general condition of all animals was good over the test period. Only one animal from group P20 showed strong breathing noises on test day 10 for approximately 1 hour.
  • the inulin content was determined by burning the blood samples (Oxidizer Ox 500, Zinser) and subsequent scintillation measurements.
  • Lipid mixtures of the following composition are Lipid mixtures of the following composition:
  • the liposomes are extruded several times through a membrane with a pore size of 400 nm
  • the various liposomes according to Example 5 were injected subcutaneously into healthy male rats (3 animals per group) in a concentration of 25-30 mM lipid in a volume of 0.5 mL.
  • a control sample with empty liposomes and unencapsulated leuprolide acetate was also administered subcutaneously in a volume of 0.5 mL.
  • the pharmacokinetic data were obtained by taking blood samples from various subjects
  • the testosterone concentration was influenced in rats
  • the liposomes according to Example 5 were injected subcutaneously into healthy male rats (3 animals per group) in a volume of 0.5 ml without removal of the active substance present on the outside.
  • the dose of leuprolide acetate per animal was 2.5 mg.
  • the pharmacokinetic data were obtained by taking blood at various times, collecting serum and determining the serum leuprolide acetate concentration using an ELISA (Peninsula).
  • the entire trial duration of the animal study was 6 weeks. The general condition of all animals was good over the test period.
  • the wording shows the following table:
  • the liposomes are extruded several times through a membrane with a pore size of 200nm or 400nm (Avestin LiposoFast, polycarbonate membrane with a pore size of 200 or 400nm). After the extrusion, the ionic strength of the suspension obtained is increased by adding a NaCl stock solution.
  • Antisense oligonucleotide is removed by separating the active ingredient by sedimentation three times in the
  • the inclusion efficiency of the oligonucleotide is 47%.

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Abstract

Die Erfindung betrifft liposomale Formulierungen zur Herstellung eines injizierbaren Depots von Peptid-, Protein und Oligonukleotidwirkstoffen zur langanhaltenden Freisetzung und Wirkung in einem Säugerkörper.

Description

Injizierbare liposomale Depots zum Wirkstoffdelivery
Die Erfindung betrifft ein liposomales Abgabesystem zur verzögerten Wirkstofffreisetzung und die Verwendung dieses Systems in Grundlagenforschung und Klinik.
Peptid- und Proteinwirkstoffe werden im Körper nach Applikation sehr schnell abgebaut oder ausgeschieden und müssen daher durch wiederholte Injektionen verabreicht werden.
Um die „patient •compliance" zu erhöhen wird ein geeignetes
Deliverysystem benötigt, das den Wirkstoff im Körper vor Abbau schützt und ihn nur langsam in die Blutbahn freigibt. Dazu werden Depotsysteme eingesetzt, die subkutan oder intramuskulär injiziert oder implantiert werden. Liposomen sind eine mögliche Form eines solchen Trägersystems. Sie sind aufgebaut aus einer oder mehreren Lipid-Doppelschichten und umschliessen in ihrem Innern ein wässriges Kompartiment, in welches wasserlösliche Substanzen eingeschlossen werden können. In die Lipid-Doppelschicht können lipophile Substanzen eingebaut werden.
In J.Controll. Rel . 64 (2000) 155-166, in der US 5766627 und anderen Schriften der Autoren werden multivesikuläre Aggregate aus Liposomen als in izierbares Depotsystem für Insulin, Leuprolide und Enkephalin vorgestellt, die durch einen Doppelemulsionsprozess gewonnen werden. Wegen des Zusatzes unpolarer Triglyceride sind diese multizentrischen Aggregate nicht als Liposomen im engeren Sinne aufzufassen, da die Triglyceride keine Bilayermembranen bilden und nicht in solche eingebaut werden. Nachteilig ist weiterhin die Nutzung einer mit Wasser nicht mischbaren Ölphase zur Herstellung der Strukturen. Insbesondere beim Einschluss grösserer Proteine führt das zur Denaturierung an der Grenzfläche. Ebenso stellen Reste organischer Lösungsmittel ein nicht zu unterschätzendes regulatorisches Problem dar.
Für Depotsysteme finden nach dem Stand der Technik Liposomen Verwendung, die aus neutralen, anionischen oder PEG-Lipiden zusammengesetzt sind, etwa in der WO 9920301 für ein Depot von γ-Interferon, in Diabetes 31 (1982) , 506-511 für ein Depot von Insulin; weiterhin in Proc. Natl. Acad. Sei. 88 (1991), 10440- 10444 zur Vakzinierung.
In BBA 1328 (1997), 261-272 werden verschiedene liposo ale Systeme (unilamellar und ultilamellar) aus Ei-PC, Ei-PG, DPPC, DPPG, PS und Cholesterol auf deren Aufnahme ins Lymphsystem und der Bioverteilung nach subkutaner Gabe hin untersucht. Der Review-Artikel Advanced Drug Delivery Reviews 50 (2001), 143-156 schliesst an diese Untersuchungen an. Hier wird gezeigt, dass kleinere Liposomen (<150nm) aus einem subkutanen Depot in die Lymphe auswandern.
Nach dem Stand der Technik werden neutrale und negativ geladene Liposomen für liposomale Depotsysteme verwendet. Die Liposomen müssen eine Mindestgrösse aufweisen, um nicht in die Lymphe abzuwandern.
Die Herstellung grosser Liposomen von deutlich mehr als 150nm ist aber mit technischen und regulatorischen Schwierigkeiten verbunden. Insbesondere ist dann die wünschenswerte Sterilfiltration der Partikel nach deren Herstellung nicht mehr möglich.
Neben Peptiden und Proteinen werden auch Oligonukleotide im Körper durch Enzyme sehr schnell abgebaut. Diese Wirkstoffe werden normalerweise in hohen Dosen durch intravenöse Inkjektionen verabreicht, die jedoch häufig wiederholt werden müssen. Für eine verbesserte „patient compliance" und um die Dosis verringern zu können, wird daher ein geeignetes Deliverysystem benötigt, das den Wirkstoff im Körper vor Abbau schützt und ihn nur langsam und verzögert freisetzt. Meist werden heute Delivery-Systeme verwendet, welche nach Verabreichung das intrazelluläre Delivery der Wirkstoffe unterstützen. Dazu zählen liposomale Systeme, polymerbasierte Systeme (z.B. PEI) und virale Carrier. Diese intrazellulären Delivery-Strategien können zu einer Dosisverringerung der Wirkstoffe führen. Eine Reduktion der Injektionen kann allerdings nicht erreicht werden.
Eine weitere Möglichkeit Oligonukleotide zu verabreichen stellen Depotsysteme dar, die lokal appliziert werden und die Wirkstoffe gleichmäßig über einen bestimmten Zeitraum freisetzen. Diese Delivery-Strategien unterstützen das intrazelluläre Delivery der Wirkstoffe nicht zwingend, vielmehr führen sie zu einem steady-state Spiegel des Wirkstoffes über die Zeit im Blut oder Gewebe. Dadurch kann die Injektionshäufigkeit verringert werden und darüber hinaus ist durch das Aufrechterhalten der Wirkstoffkonzentration eine Dosisreduktion möglich.
Mikro- oder Nanopartikel aus biokompatiblen Polymeren stellen eine mögliche Form eines solchen Depotsystems dar. In US 6,555,525 wird die verzögerte Freisetzung von Antisense- Oligonukleotiden aus PLGA-Mikrokapseln nach subkutaner Injektion in einem Maus-Leukämie-Modell beschrieben. Die verzögerte Freisetzung von Oligonukleotiden aus PLGA-basierten Mikro-bzw. Nanokapseln wird in zahlreichen anderen Publikationen ebenfalls beschrieben (z.B. J. Drug Target. 5(4), 291-302, (1998); Gene Ther. 9 (23), 1607-16, (2002); Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 9(5), 451-8, (1999), J. Control. Release 37, 173-183, (1995)).
In weiteren Druckschriften werden andere Polymer-basierte Systeme zum Delivery von Nukleinsäuren beschrieben. In Methods : A companion to Methods in Enymology 18, 286-295, (1999) weisen die Autoren z.B. auf die mögliche Anwendung der beschriebenen Polyhexylcyanoacrylate-Nanopartikel als Depotsystem für Oligonukleotide hin. Nachteilig der Mikro- oder Nanopartikel aus Polymeren ist deren Herstellungsprozess . Hier müssen in den meisten Fällen Emulsionsprozesse zur Anwendung kommen, unter Verwendung organischer, nicht mit Wasser mischbarer Lösungsmittel. Diese Lösungsmittel müssen nach Prozessende wieder vollständig entfernt werden. Dadurch stellen sie ein nicht zu unterschätzendes regulatorisches Problem dar. Darüber hinaus entstehen bei der Hydrolyse der PLGA-Kapseln sehr niedrige pH- Werte im Innern der Kapseln, wodurch die Integrität der eingeschlossenen Wirkstoffe Schaden nehmen kann. So ist es bekannt, dass Purinbasen bei niedrigen pH-Werten sich durch Hydrolyse vom Nukleinsäurerückgrat ablösen.
Liposomen sind ebenfalls eine mögliche Form eines Trägersystems für Oligonukleotide. Zahlreiche Publikationen beschäftigen sich mit der Anwendung von meist kationischen liposomalen Systemen zum Delivery von Oligonukleotiden in vivo
(z.B. Molecular Membrane Biology, 16, 129-140, (1999); BBA
1464, 251-261, (2000) ; Reviews in Biology and Biotechnology, 1(2), 27-33, (2001). All diesen Systemen gemein ist jedoch die Tatsache, dass die verwendeten Lipid-Mischungen aus ungesättigten Lipiden wie z.B. DOTAP oder DOPE aufgebaut sind und aus diesem Grund nicht serumstabil sind. Dadurch bedingt setzen diese Liposomen eingeschlossenen Wirkstoff sehr schnell nach der Injektion frei. Häufig werden für die oben genannten Anwendungen auch Komplexe aus vorgeformten Liposomen und Nukleinsäuren hergestellt (z.B. Lipoplexe) . Die Komplexbildung bzw. die meist nicht im Serum stabilen liposomalen Formulierungen führen dazu, dass die Stabilität der Oligonukleotide über einen längeren Zeitraum, wie für ein Depot erforderlich, nicht gewährleistet ist.
Aufgabe der Erfindung war es daher, neue stabile liposomale Depotformulierungen für Protein- und Peptidwirkstoffe, sowie für Oligonukleotide bereitzustellen, die eine langfristige Freisetzung des Wirkstoffes über mindestens eine Woche erreichen und eine gute Verträglichkeit im Organismus aufweisen. Eine weitere Aufgabe war es, DepotSysteme bereitzustellen, die keinen „burst release" des Wirkstoffes aufweisen, oder die, wenn es therapeutisch angezeigt ist, eine initiale schnelle Teilfreisetzung des Wirkstoffes erzielen, gefolgt von einer lang anhaltenden Freisetzung des Wirkstoffes.
Diese technische Aufgabe wird gelöst durch ein Depotsystem, insbesondere zur verzögerten Wirkstofffreisetzung, wobei es Liposomen (a) mit gesättigten synthetischen Phosphatidylcholinen, ausgewählt aus der Gruppe DMPC, DPPC und/oder DSPC, (b) Cholesterol mit einem Anteil von 35 bis 50 mol%, (c) kationische Lipide, ausgewählt aus der Gruppe DC- Chol, DAC-Chol, DMTAP, DPTAP und/oder DOTAP mit einem Anteil von 5 bis 20 mol% an der Liposomenmembran (d) und einen Protein- und/oder Peptidwirkstoff umfasst, wobei die Formulierung der Wirkstoffe in Liposomen bei der Anwendung als Depot in Form von Aggregaten vorliegen. Solche Liposomen umfassen bevorzugt neben neutralen Lipiden auch kationische Lipide .
Positiv geladene Liposomen aggregieren z.B. gut mit Komponenten des Serums oder der Interstitialflüssigkeit und verbleiben in diesem Zustand an der Einstichstelle. Ein Wegdiffundieren des Depots von der Einstichstelle wird damit vorteilhafterweise vermieden.
Die Depots können so beschaffen sein, dass sie einen burst release ermöglichen oder diesen nicht ermöglichen. Depots ohne burst release können dadurch bereitgestellt, dass aussen an den Liposomen anhaftender Wirkstoff abgelöst und abgetrennt wird. Wenn ein burst relase vorteilhaft ist, wird der aussen an den Liposomen anhaftende Wirkstoff nicht abgelöst und abgetrennt.
Verschiedene Verfahren zum Einschluss des insbesondere wasserlöslichen Wirkstoffs in Liposomen des Depotsystems sind dem Fachmann bekannt. Für den Einschluss des gewünschten Wirkstoffes in die Liposomen wird dieser beispielsweise in einer Pufferlösung gelöst, mit welcher dann die Liposomen hergestellt werden. Bei dem sogenannten passiven Einschluss zählt das relative Volumen, das von den gebildeten Liposomen umschlossen wird. Die Einschlussef izienz wird beim passiven Einschluss mit zunehmender Lipidkonzentration gesteigert, da das von der Lipiddoppelschicht umschlossene Flüssigkeitsvolumen zunimmt.
Die anmeldungsgemäße Lehre weist eine Reihe von Vorteilen auf. Bekannt sind bisher neutrale/negativ geladene Liposomen, bzw. Mikro- und Nanopartikel aus Polymeren für die oben genannten Aufgaben verwendet worden.
Die erfindungsgemäßen Liposomen aggregieren mit Serumkomponenten und Komponenten der Interstitialflüssigkeit, wodurch das Depot an der Einstichstelle verbleibt und somit z.B. ein Abwandern in die Lymphe verhindert wird. Die erfindungsgemäße Lipidzusammensetzung enthält gesättigte Gerüstlipide, was für eine Integrität der Liposomen auch im aggregierten Zustand sorgt und so für einen besseren Schutz des Wirkstoffes, bzw. für eine längere Depotdauer. Der Herstellungsprozess kommt ohne organische, nicht mit Wasser mischbare Lösungsmittel aus, die für regulatorische Probleme sorgen können, da schwierig vollständig zu entfernen oder den Wirkstoff (Proteine) schädigen. Es gibt keine Abbauprodukte, wie bei Mikro- und Nanopartikel aus Polymeren, welche dem Wirkstoff schaden können (saure Reaktion bei Abbau von PLGA- Kapseln) . Variabel durch mit/oder ohne burst release Charakter des Depotsystems, je nach Anforderungen von Therapie und Wirkstoff.
In einer bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung werden Liposomen, die aus neutralen und kationischen Lipiden aufgebaut sind, als liposomales Depotsystem für die verzögerte Freisetzung von therapeutischen Peptiden und Proteinen verschiedenster Molmassen eingesetzt. In J. Pharm. Sei., 89 (3), 297-310, 2000 wird die absolute Bioverfügbarkeiten verschieden großer Peptide und Proteine nach subkutaner Applikation beschrieben, wobei mit zunehmender Molmasse keine siknifikante Verringerung der Bioverfügbarkeit beobachtet wird. Da therapeutische Peptide und Proteine im Körper sehr schnell abgebaut werden, müssen diese durch wiederholte Injektionen verabreicht werden. Die für diese Ausführung der Erfindung relevanten Peptide und Proteine, deren Analoga, zugehörige Peptide, Fragmente, Inhibitoren und Anatagonisten, umfassen:
Transforming growth factors (TGF-alpha, TGF-beta) , Interleukine (z.B. IL-1, IL-2, IL-3) , Interferone (IFN-alpha, IFN-beta, IFN-gamma) , Calcitonine, Insulin-like growth factors (IGF-1, IGF-2), Parathyroid hormone, Granulozyten- stimulierender Faktor (GCSF) , Granulozyten-Makrophagen stimulierender Faktor (GMCSF) , Makrophagen stimulierender Faktor (MCSF) , Erythropoetin, Insuline, Amyline, Glucagone, Lipocortine, Wachstumshormone, Somatostatin, Angiostatin, Endostatin, Octreotid, Gonadotropin releasing hormone (GNRH) , Luteinizing hormone releasing hormone (LHRH) und wirksame Agonisten wie Leuprolidacetat, Buserelin, Goserelin, Triptorelin; Platelet-derived growth factor; Blutgerinnungsfaktoren (z.B. Faktor VIII, Faktor IX), Thromboplastin-Aktivatoren, Gewebe Plasminogen Aktivatoren, Streptokinase, Vasopressin, Muramyldipeptide (MDP) , Atrial naturetic factor (ANF) , Calcitonin gene-related Peptid (CGRP) , Bombesin, Enkephaline, Enfuvirtide, Vasoaktives intestinales Peptid (VIP) , Epidermal growth factor (EGF) , Fibroblast growth factor (FGF) , Growth hormone releasing hormone (GRH) , Bone morphpogenetic proteins (BMP) , Antikörper und Antikörperfragmente (z.B. scFv-Fragmente, Fab-Fragmente) , Peptid T und Peptid T Amide, Herpes Virus Inhibitor, Virus Replikations Inhibitions Faktor, Antigene und Antigenfragmente, lösliches CD4, ACTH und Fragmente, Angiotensine, und ACE Inhibitoren, Bradykinin (BK) , Hypercalcemia malignancy factor (PTH like adenylate cyclase- stimulating protein) , beta-casomorphins, chemotactic peptides and inhibitors, corticotropin releasing factor (CRF) , caerulein, cholecystokinins + Fragmente und Analoga, Galanin, gastric inhibitory polypeptide (GIP) , gastrins, gastrin releasing peptide (GRP) , otilin, PHI peptides, PHM peptides, peptide YY, secretins, melanocyte stimulating hormone (MSH) , neuropeptide Y (NPY) , neuromedins, neuropeptide K, neurotensins, phosphate acceptor peptide (c-AMP protein kinase Substrates), Oxytocine, substance P, TRH - sowie Fragmente, Analoga und Derivate dieser Stoffe.
Eine weitere bevorzugte Wirkstoffklasse für erfindungsgemäße liposomale Depots sind Oligonukleotide. Die für diese Ausführung der Erfindung relevanten Oligonukleotide sind aus 5-100, bevorzugt aus 5-40 und besonders bevorzugt aus 10-25 Nukleotiden oder Basenpaaren aufgebaut. Darüberhinaus können die Oligonukleotide als Einzelstrang (z.B. Antisense- Oligonukleotide) , als Doppelstrang (z.B. small-interfering RNA, Decoy-Oligonukleotide) oder in komplexer Faltung (z.B. Aptamere, Spiegelmere, Ribozyme) vorliegen. Alle für diese Erfindung relevanten Oligonukleotide sind aus Desoxyribonukleotiden oder aus Ribonukleotiden sowie aus deren chemisch-modifizierten Derivaten aufgebaut (z.B. Phosphorothioate DNA (PS), 2" -O- ethyl RNA (OMe) , 2'-0- methoxy-ethyl RNA (MOE), Peptide nucleic acid (PNA) , N3'-P5' Phosphoroamidate (NP) , 2 ' -fluoro-arabino nucleic acid (FANA) , Locked nucleic acid (LNA) , Morpholino phosphoroamidate (MF) , Cyclohexene nucleic acid (CeNA) , Tricyclo-DNA (tcDNA) ) . Darüber können Copolymere und Block-Copolymere verschiedener Nukleotide und sogenannte Gapmere in die Liposomen eingeschlossen werden.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden Aptamere oder Spiegelmere in das liposomale Depot eingeschlossen. Aptamere sind DNA- oder RNA-basierte Oligonukleotide mit komplexer dreidimensionaler Struktur. Aufgrund dieser Struktur können Aptamere sehr spezifisch und hochaffin an Proteintargets binden und wirken somit therapeutisch, meist extrazellulär. Ihre Funktionalität ist nahezu identisch zu monoklonalen Antikörpern.
Spiegelmere sind im Gegensatz zu D-Oligonukleotiden aus L- Ribose- und L-2' -Desoxyribose-Einheiten aufgebaut. Genau wie Aptamere binden diese spiegelbildlichen Nukleinsäuren spezifisch an Proteintargets. Aufgrund der chiralen Inversion besitzen Spiegelmere im Gegensatz zu herkömmlichen D- Oligonukleotiden eine erhöhte Stabilität gegenüber einem enzymatischen Abbau.
Desweiteren sind für diese Erfindung auch wasserlösliche Wirkstoffe oder wasserlösliche Wirkstoff-Derivate folgender Wirkstoffklassen relevant: Antibiotika (z.B. Rifamycin SV Na- Salz, Rifampicin, Tetracyclinhydrochlorid, Kanamycin, Penicillin G, Ampicillin, Novobiocin) , Antimykotika (z.B. Amphotericin B, Flucytosin) , Cytostatika (z.B. Doxorubicin, Daunorubicin, Vincristin, Cytarabin) , Glucocorticoide (Dexamethason, Prednisolon, Hydrocortison, Betamethason) .
Neben den genannten Wirkstoffklassen können auch Kohlenhydrate wie z.B. Heparin oder Hyaluronsäure für diese Erfindung relevante Wirkstoffmoleküle sein. Keine bevorzugten Wirkstoffe im Sinne der Erfindung sind Membranproteine, die sich schlecht in den Innenraum von Liposomen einbringen lassen.
Als Liposomenbildner kommen membranbildende und membranständige Lipide in Frage, wobei diese natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein können. Hierzu zählen insbesondere Cholesterol und Derivate, Phosphatidylcholine, Phosphatidylethanolamine als neutrale Lipide. Besonders bevorzugt werden die vollständig gesättigten Verbindungen dieser Klasse verwendet, wie beispielsweise die Dimyristoyl-, Dipalmitoyl- oder Distearoyl-derivate der Phosphatidylcholine (DMPC, DPPC, DSPC) und der Phosphatidylethanolamine.
Kationische Lipide zur Ausführung der Erfindung umfassen beispielsweise :
DAC-Chol 3-ß- [N- (N,N'-dimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol DC-Chol 3-ß- [N- (N' , N'-dimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol TC-Chol 3-ß-[N-(N',N', N'-trimethyla inoethane) carbamoyl'. cholesterol BGSC Bis-guanidinium-spermidine-cholesterol BGTC Bis-guanidinium-tren-cholesterol,
DOTAP (1, 2-dioleoyloxypropyl) -N,N,N-trimethylammonium Chlorid DOSPER (1, 3-dioleoyloxy-2- ( 6-Carboxy-spermyl) -propylamid)
DOTMA (1, 2-dioleyloxypropyl) -N,N,N-trimethylammonium Chlorid) (Lipofectin®)
DORIE (1, 2-dioleyloxypropyl) -3 dimethylhydroxyethyl ammoniumbromi ) DOSC (1, 2-dioleoyl-3-succinyl-sn-glycerl cholinester)
DOGSDSO (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-succinyl-2hydroxyethyl disulfide ornithin) ,
DDAB Dimethyldioctadecylammonium bromid DOGS ( (C18) 2GlySper3+) N,N-dioctadecylamido-glycyl-spermin (Transfectam®)
(C18) 2Gly+ N, N-dioctadecylamido-glycin
DOEPC 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin oder andere O-Alkyl-Phosphatidylcholin oder-ethanolamine, 1, 3-bis- (1, 2-bis tetradecyloxy-propyl-3 dimethylethoxy ammonium-bromid) propan- 2-ol (Neophectin®) , sowie von allen genannten Lipiden mit ungesättigten Fettsäure- und/oder Fettalkoholketten deren gesättigte Derivate mit Dimyristoyl-, Dipalmitoyl-, oder Distearoylketten.
Bevorzugte kationische Lipide zur Ausführung der Erfindung umfassen Cholesteryl 3ß-N- (Dimethyl-aminoethyl) carbamat (DC- Chol) , 3-ß- [N- (N, N'-dimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol (DAC-Chol) , (N- [1- (2, 3-Dimyristoyloxy) propyl] -N, N, N- trimethylam onium Salz (DMTAP) , (N-[l-(2,3- Dipal itoyloxy) propyl] -N,N,N-trimethylammonium Salz
(DPTAP) , (N- [1- (2, 3-Dioleoyloxy) propyl] -N,N,N-trimethylammonium Salz (DOTAP) .
In einer besonders bevorzugten Zusammensetzung werden gesättigte synthetische Phosphatidylcholine, wie DMPC, DPPC oder DSPC, Cholesterin, die kationischen Lipide DC-Chol, DAC- Chol, DMTAP, DPTAP oder DOTAP verwendet, wobei ganz besonders bevorzugt der Anteil der kationischen Lipide zwischen 5 und 20mol% beträgt und der Anteil von Cholesterol zwischen 35 und 50% beträgt.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden pH-sensitiv kationische Lipide eingesetzt, wie sie in WO 02 066490 und US 5965434 beispielhaft offenbart sind. Liposomen, die diese Lipide enthalten, können durch pH-Wechsel in einen neutralen Ladungszustand gebracht werden und ermöglichen eine einfache Abtrennung von aussen anhaftendem Wirkstoff, während des Herstellungspozesses . Beispiele für pH- sensitiv kationische Verbindungen sind: Histaminyl-Cholesterolhemisuccinat (His-Chol) , Morpholin-N-ethylamino-cholesterolhemisuccinat (Mo-Chol) , 4- (2, 3-bis-palmitoyloxy-propyl) -1-methyl-lH-imidazol (DPIM) , Cholesterol- (3-imidazol-l-yl propyl) carbamat (CHIM) .
Die Größe der erfindungsgemäßen Liposomen variiert von 20-1000 nm, bevorzugt von 50-800 nm und ganz besonders bevorzugt von 50-300 nm.
Für die Herstellung der Liposomen werden nach dem Stand der Technik etablierte Verfahren, wie Extrusion durch Polycarbonat-Membranen, Ethanolinjektion oder Hochdruckho ogenisation verwendet.
Der passive Einschluss wird bevorzugt dann verwendet, wenn große Mengen eines gut löslichen Wirkstoffes eingeschlossen werden sollen. Dafür werden Liposomen mit einer Lipidkonzentration von 30 bis 150 mM, bevorzugt mit einer Lipidkonzentration von 50 bis 120 mM und ganz besonders bevorzugt einer Lipidkonzentration von 80 bis 110 mM in Gegenwart des gelösten Wirkstoffes hergestellt.
Ein weiteres Verfahren zum Einschluß von wasserlöslichen Wirkstoffen ist das sogenannte „Advanced Loading"-Verfahren, welches in der in WO 01/34115 A2 beschrieben ist, die in den Offenbarungsgehalt der vorliegenden Erfindung mit aufgenommen wird. Dieses Verfahren ermöglicht eine hohe Einschlussef izienz. Es wird bevorzugt dann verwendet, wenn der Wirkstoff möglichst kostensparend in die Liposomen eingeschlossen werden soll. Bei diesem Verfahren, das auf einer Wechselwirkung zwischen Wirkstoff und membranbildenden Substanzen beruht, wird bei niedrigen Ionenstärken und bei einem pH-Wert gearbeitet, bei welchem der Wirkstoff in einem anionischen Ladungszustand vorliegt, um mit der kationischen Liposomenembran eine reversible elektrostatische Wechselwirkung einzugehen.
Für viele Proteine oder Peptide ist das unter physiologischen Bedingungen, d.h. bei einem pH-Wert zwischen 7 und 8 der Fall. Die Ladung der Wirkstoffe bei einem gegebenen pH kann aus Datenbanken entnommen werden, etwa der SWISS-PROT oder lässt sich nach bekannten Algorithmen berechnen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das passive Einschlussverfahren mit dem Advanced Loading Prozess kombiniert. Bei diesem Verfahren wird der Advanced Loading Prozess mit einer Lipidkonzentration von 30 bis 150 mM, bevorzugt mit einer Lipidkonzentration von 50 bis 120 mM und ganz besonders bevorzugt einer Lipidkonzentration von 80 bis 110 M durchgeführt, um die Einschlussraten gegenüber den einzelnen Verfahren signifikant zu erhöhen.
Nach der Liposomenpräparation kann aussen an der Liposomenroembran anhaftender Wirkstoff von der Oberfläche der Liposomen abgelöst und entfernt werden. Dieser Schritt ist von zentraler Bedeutung für die Eigenschaften des liposomalen Depots. Wird der Wirkstoff von der Liposomenoberflache abgelöst und aus der Liposomensuspension entfernt, so werden Depotformulierungen erhalten, die praktisch keinen oder einen nur minimalen „burst release" zeigen. Dieses Merkmal ist insbesondere von zentraler Bedeutung, wenn Wirkstoffe verabreicht werden sollen, bei denen schon eine kurzzeitige hohe Wirkstoffkonzentration, wie dies bei der initialen Anflutung der Fall ist, zu toxischen Reaktionen im Körper führen kann. Ein Beispiel hierfür ist Insulin, dessen Überdosierung zu lebendsbedrohlichen hypoglykämischen Zuständen führen kann. Die Auflösung der bestehenden Wechselwirkung kann beispielsweise durch Änderung des pH- Wertes oder Erhöhung der Ionenstärke bewirkt werden.
Die entgültige Abtrennung kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren, wie Zentrifugation, Ultrafiltration, Dialyse oder andere chromatische Verfahren erfolgen, so dass der Wirkstoff zu mindestens 90% im Liposom eingeschlossen ist und weniger als 10%, bevorzugt weniger als 5% des Wirkstoffes sich ausserhalb des Liposoms befinden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird der an der liposomalen Membran anhaftende Wirkstoff nicht von der Membran abgelöst, d.h. der pH-Wert oder die Ionenstärke werden nicht verändert. Diese Ausführungsform findet insbesondere Anwendung bei Wirkstoffen, bei denen ein initiales Anfluten des Wirkstoffes toxikologisch unbedenklich ist, wie beispielsweise bei Leuprolidacetat oder vielen Antikörpern.
Der freie Wirkstoff verbleibt ganz oder teilweise, aber zu mehr als 5%, bevorzugt mehr als 10% in der Liposomensuspension und sorgt für das schnelle initiale Anfluten des Wirkstoffes im Blut.
Ein weiterer Vorteil dieser Ausführung liegt in der Lyophilisierbarkeit der Suspension, da eine Freisetzung des innen eingeschlossenen Wirkstoffes während des Lyophilisationsvorganges minimiert wird, da sowohl auf der Innen- wie auf der Außenseite der Membran die gleich Wirkstoffkonzentration vorliegt.
Leuprolidacetat ( [D-LeuδPro9Des-Gly10] -LHRH Ethylamid) ist ein synthetisch hergestellter Agonist des LHRH (luteneizing hormone releasing hormone) und wird klinisch vor allem bei Protstatakrebs, Endometriose und vorzeitiger Pubertät eingesetzt, um den Androgenspiegel im Serum zu senken. Die kontinuierliche Gabe von Leuprolidacetat führt zunächst zu einer Erhöhung des Testosteronspiegels, bevor dieser dann bis auf das Kastrationsniveau gesenkt wird. Der initiale Anstieg des Testosterons ist zurückzuführen auf eine Stimulation der LHRH Rezeptoren in der Hypophyse und der dadurch ausgelösten Ausschüttung von LH, welches wiederum die Testosteronproduktion im Hoden stimuliert. Nach der anfänglichen Stimulation durch Leuprolidacetat kommt es schließlich zu einer Desensibilisierung der Rezeptoren in der Hypophyse, wodurch die Ausschüttung von LH inhibiert wird. Dies führt dann zu einer Absenkung des Testosteronspiegels. In einer besonders bevorzugten Ausführung der Erfindung wird Leuprolidacetat als Wirkstoff eines erfindungsgemäßen Depotsystems verwendet.
In weiteren bevorzugten Ausführungform der Erfindung werden Antigene oder Antigenfragmente als Wirkstoffe eines erfindungsgemäßen Depotsystems zur Vakzinierung verwendet. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden therapeutisch nutzbare Insuline als Wirkstoffe für ein erfindungsgemäßes Abgabesystem eingesetzt.
Die erfindungsgemäßen liposomalen Formulierungen können zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet werden. In einem vorbereitenden Schritt werden die liposomalen Formulierungen in ein physiologisch verträgliches Medium gebracht. Die Bedingungen eines physiologisch verträglichen Mediums sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise einen pH-Wert von 7,3 bis 7,6, bevorzugt 7,4 bis 7,5, einen Salzgehalt der ca. 150 mM NaCl entspricht, bzw. einer Osmolarität von etwa 320 mos .
Die erfindungsgemäßen liposomalen Formulierungen können als Depotarzneiform subkutan oder intramuskulär iniziert werden. Weiterhin können sie auch lokal oder topisch appliziert werden.
Die Erfindung betrifft auch einen Kit, der das erfindungsgemäße Depotsystem umfasst, ggf. mit einer Information zum Kombinieren der Inhalte des Kits. Der Kit kann in Grundlagenforschung und Medizin angewandt werden. Die Information kann z.B. auch ein Hinweis auf eine Internetadresse sein, unter der weitere Informationen erhalten werden können. Die Information kann ein Behandlungsschema für eine Krankheit sein oder beispielsweise eine Gebrauchsanleitung zum Handhaben des Kits in der Forschung.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert, ohne auf diese Ausführungen begrenzt zu sein.
Beschreibung der Abbildungen
Abbildung 1
Vergleich der liposomalen Depotsysteme aus Beispiel 4 der vorliegenden Erfindung mit der injizierten Kontrollprobe (K 3) im Tiermodell
Abbildung 2
Vergleich der liposomalen Depotsysteme mit Leuprolidacetat aus Beispiel 4 der vorliegenden Erfindung mit der injizierten Kontrollprobe (P29) im Tiermodell (Serumspiegel Leuprolidacetat)
Abbildung 3
Vergleich der liposomalen Depotsysteme mit Leuprolidacetat aus Beispiel 4 der vorliegenden Erfindung mit der injizierten Kontrollprobe (P29) im Tiermodell (Serumspiegel Testosteron)
Abbildung 4
Liposomales Depotsystem mit Leuprolidacetat aus Beispiel 7 der vorliegenden Erfindung im Tiermodell (Serumspiegel Leuprolidacetat) Beispiele
Beispiel 1
Einschluss von Insulin in Liposomen
Lipidmischungen folgender Zusammensetzung
Formulierung Zusammensetzung 1-1 DPPC/DC-Chol/Chol
60:10:30 (mol%) 1-2 DPPC/DOTAP/Chol
50:10:40 (mol%)
wurden bei 50 °C in Chloroform gelöst und anschließend im Rotationsverdampfer im Vakuum vollständig getrocknet. Der Lipidfil wird mit soviel Human-Insulin-Lösung (rekombinantes Insulin) (4mg/ml Insulin in lOmM HEPES, 300 mM Sucrose, pH 7,5) versetzt, dass eine 50mM Suspension entsteht. Anschließend wird diese Suspension durch Schwenken über 45 Minuten im Wasserbad bei 50°C hydratisiert und für weitere 5 Minuten im Ultraschallbad behandelt. Danach wird die Suspension eingefroren. Es folgen 3 Einfrier- und Auftauprozesse, wobei nach dem Auftauen jeweils eine 5- minütige Behandlung im Ultraschallbad erfolgt.
Nach dem letzten Auftauen werden die Liposomen mehrfach durch eine Membran mit einer Porenweite von 200nm oder 400nm extrudiert (Avestin LiposoFast, Polycarbonat-Membran mit einer Porenweite von 200 oder 400nm) . Nach der Extrusion wird die erhaltene Suspension durch Zugabe einer Stammlösung Glycin- HC1, pH 3,5 und NaCl umgepuffert. Nach einer Filtration der Liposomen durch 0,8 μm erfolgt die Abtrennung des nicht- eingeschlossenen Insulins durch dreimalige Sedimentation in der Ultrazentrifuge bei 60000x g, 45 min. Durch Zugabe einer HEPES- Stammlösung, pH 7,5 wird wieder ein physiologischer pH eingestellt. Die Menge des eingeschlossenen Insulins wird nach einer Extraktion mit CHC13 und CH3OH mittels RP-HPLC bestimmt. Es ergeben sich Einschlussraten von 80-100 % Insulin.
Beispiel 2
Einschluss von Alkalischer Phosphatase (AP) in Liposomen
Eine Lipidmischung der folgender Zusammensetzung:
Formulierung Zusammensetzung
AP-1 DPPC/DOTAP/Chol
50:10:40 (mol%)
wird bei 50 C in Chloroform gelöst und anschließend im Rotationsverdampfer im Vakuum vollständig getrocknet. Der Lipidfilm wird mit soviel AP-Lösung (from bovine intestinal mucosa) (5 mg/ml AP in lOmM HEPES, 300 mM Sucrose, pH 7,5) versetzt, dass eine 50mM Suspension entsteht. Anschließend wird diese Suspension für 45 Minuten im Wasserbad bei 50°C unter Schwenken hydratisiert und für weitere 5 Minuten im Ultraschallbad behandelt. Danach wird die Suspension eingefroren. Es folgen 3 Einfrier- und Auftauprozesse, wobei nach dem Auftauen jeweils eine 5-minütige Behandlung im Ultraschallbad erfolgt.
Nach dem letzten Auftauen werden die Liposomen mehrfach durch eine Membran mit einer Porenweite von 200nm oder 400nm extrudiert (Avestin LiposoFast, Polycarbonat-Membran mit einer Porenweite von 200 oder 400nm) . Nach der Extrusion wird die Ionenstärke der erhaltenen Suspension durch Zugabe einer Stammlösung NaCl erhöht.
Die Abtrennung der nicht-eingeschlossenen AP erfolgt durch dreimalige Sedimentation in der Ultrazentrifuge bei 60000 x g über 45 min.
Die Menge der eingeschlossenen AP wird nach einer organischen Fällung mit CHC13 und CH3OH mittels eines Protein-Assays (BCA Protein Assay Reagent Kit, Perbio) ermittelt. Darüberhinaus wird die Aktivität der eigeschlossenen AP mittels eines Enzymassays (p-Nitrophenylphosphat Test) bestimmt. Es ergeben sich Einschlussraten von 40-50 % AP.
Beispiel 3
Einschluss von Inulin in Liposomen
Lipidmischungen folgender •Zusammensetzung:
Formulierung Zusammensetzung P-20 DPPC/DC-Chol/Chol
60:10:30 (mol%) P-21 DPPC/DOTAP/Chol
50:10:40 (mol%) P-23 DPPC/DPPG
40:60 (mol%)
werden bei 50 °C in Chloroform gelöst und anschließend im Rotationsverdampfer im Vakuum vollständig getrocknet. Der Lipidfilm wird mit soviel 3H-Inulin-Lösung (18,5 MBq/ml 3H- Inulin in 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5) versetzt, dass eine lOOmM Suspension entsteht. Anschließend wird diese Suspension für 45 Minuten im Wasserbad bei 50°C unter Schwenken hydratisiert. Danach wird die Suspension eingefroren. Es folgen weitere 3 Einfrier- und Auftauprozesse . Nach dem dritten Auftauen werden die Liposomen mehrfach durch eine Membran mit einer Porenweite von 200 nm extrudiert (Avestin LiposoFast, Polycarbonat-Membran mit einer Porenweite 200 nm) . Die Abtrennung des nicht-eingeschlossenen 3H-Inulins erfolgt über eine Gelfiltration (G75-Säule, Pharmacia) . Die Menge des eingeschlossenen 3H-Inulins wird nach der Abtrennung im Scintillationszähler bestimmt. Es ergeben sich Einschlussraten von 10-25 % 3H-Inulin. Beispiel 4
Einsatz von liposomalen Depotsystemen im Tiermodell
Die verschiedenen Liposomen nach Beispiel 3 wurden in einer Konzentration von 20mM Lipid in einem Volumen von 0,5mL subkutan in gesunde Ratten (3 Tiere pro Gruppe) injiziert. Eine Kontrollprobe mit Leerliposomen und nicht verkapseltem 3H- Inulin wurde ebenfalls in einem Volumen von 0,5 mL subkutan verabreicht. Die pharmakokinetischen Daten wurden durch Blutabnahmen zu verschiedenen Zeitpunkten gewonnen. Die gesamte Versuchsdauer der Tierstudie betrug 6 Wochen. Das Allgemeinbefinden aller Tiere war über die Versuchsdauer gut. Nur ein Tier der Gruppe P20 zeigte am Versuchstag 10 für ca. lh starke Atemgeräusche.
Die Inulingehalte wurde Verbrennen der Blutproben (Oxidizer Ox 500, Zinser) und anschliessender Scintillationsmessungen bestimmt . Die Formulierungen und die relativen Bioverfügbarkeiten bis t=42 d sind in folgender Tabelle dargestellt:.
Formulierung Zusammensetzung Relative Bioverfügbarkeit bis t=42 Tage [%]
K-3 DPPC/DPPG/Chol 100
50:10:40 (200 nm) + 3H-Inulin aussen
P-20 DPPC/DC-Chol/Chol 136,5 60:10:30 (200 nm)
P-21 DPPC/DOTAP/Chol 120 50:10:40 (200 nm)
P-23 DPPC/DPPG 142 40:60 (200 nm) Beispiel 5
Einschluss von Leuprolidacetat in Liposomen
Lipidmischungen der folgenden Zusammensetzung:
Formulierung Zusammensetzung
P-26 DPPC/DC-Chol/Chol 60:10:30 (mol%)
P-27 DPPC/DOTAP/Chol 50:10:40 (mol%)
Ll DPPC/DC-Chol/Chol
60:10:30 (mol%) (ohne Abtrennung)
werden bei 50 °C in Chloroform gelöst und anschließend im Rotationsverdampfer im Vakuum vollständig getrocknet. Der Lipidfilm wird mit soviel Leuprolidacetat-Lösung (95 mg/ml in 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 6, Ll : 2,5 mg/ml) versetzt, dass eine 100 mM Suspension entsteht. Anschließend wird diese Suspension für 45 Minuten im Wasserbad bei 50°C unter Schwenken hydratisiert. Danach wird die Suspension eingefroren. Es folgen weitere 3 Einfrier- und Auftauprozesse.
Nach dem letzten Auftauen werden die Liposomen mehrfach durch eine Membran mit einer Porenweite von 400 nm extrudiert
(Avestin LiposoFast, Polycarbonat-Membran mit einer Porenweite
400 nm) . Die Abtrennung des nicht-eingeschlossenen Leuprolidacetats erfolgt durch dreimalige Sedimentation in der Ultrazentrifuge bei 60000 x g über 45 min (nicht für Ll) . Die Menge des eingeschlossenen Leuprolidacetats wird nach einer Extraktion mit CHC13 und CH30H mittels RP-HPLC bestimmt. Es ergeben sich Einschlussraten von ca. 15 % Leuprolidacetat. Bei spiel 6
Einsatz von liposomalen Depotsystemen im Tiermodell
Die verschiedenen Liposomen nach Beispiel 5 wurden in einer Konzentration von 25-30mM Lipid in einem Volumen von 0,5mL subkutan in gesunde männliche Ratten (3 Tiere pro Gruppe) injiziert. Eine Kontrollprobe mit Leerliposomen und nicht verkapseltem Leuprolidacetat wurde ebenfalls in einem Volumen von 0,5 mL subkutan verabreicht. Die pharmakokinetischen Daten wurden erhalten durch Blutabnahmen zu verschiedenen
Zeitpunkten, das Gewinnen von Serum und die Bestimmung der
Leuprolidacetatkonzentration im Serum mittels ELISA
(Peninsula) .
Da Leuprolidacetat den Testosteronspiegel der männlichen
Ratten beeinflusst, wurde die Testosteronkonzentration im
Serum ebenfalls über den gesamten Zeitraum mittels ELISA
(DRG) bestimmt . Die gesamte Versuchsdauer der Tierstudie betrug 6 Wochen. Das Allgemeinbefinden aller Tiere war über die Versuchsdauer gut. Die Formulierungen und die relativen Bioverfügbarkeiten bis t=42 d sind in folgender Tabelle dargestellt:
_™_
Formulierung Zusammensetzung Größe Relative
[nm] Bioverfügbarkeit bis t=42 Tage [%]
P-29 DPPC/DC- 290 100
Chol/Chol 60:10:30 + Leuprolid aussen
P-26 DPPC/DC- 305 117
Chol/Chol 60:10:30 Beispiel 7
Einsatz von liposomalen Leuprolidacetat im Tiermodell
Die Liposomen nach Beispiel 5 wurden ohne Abtrennung des aussen vorliegenden Wirkstoffes in einem Volumen von 0,5mL subkutan in gesunde männliche Ratten (3 Tiere pro Gruppe) injiziert. Die Leuprolidacetat-Dosis pro Tier betrug 2,5 mg. Die pharmakokinetischen Daten wurden erhalten durch Blutabnahmen zu verschiedenen Zeitpunkten, das Gewinnen von Serum und die Bestimmung der Leuprolidacetatkonzentration im Serum mittels ELISA (Peninsula) . Die gesamte Versuchsdauer der Tierstudie betrug 6 Wochen. Das Allgemeinbefinden aller Tiere war über die Versuchsdauer gut. Die Formulierung zeigt folgende Tabelle:
Formulierung Zusammensetzung Dosis [mg]
Ll DPPC/DC- 2,5
Chol/Chol
60:10:30 keine
Abtrennung
Beispiel 8
Einschluss von Cy5.5 anti CD40 ODN (Antisense-Oligonukleotid) in Liposomen
Ein Lipidmischung folgender Zusammensetzung:
Formulierung Zusammensetzung AS1 DPPC/DC-Chol/Chol
60:10:30 (mol%)
wird bei 50°C in Chloroform gelöst und anschließend im Rotationsverdampfer im Vakuum vollständig getrocknet. Der Lipidfilm wird mit soviel Cy5.5 anti CD40 ODN (Antisense- Oligonukleotid) (150 μg/ml in 10 mM HEPES, 300 mM Sucrose, pH 7,5) versetzt, dass eine 15 mM Suspension entsteht. Anschließend wird diese Suspension für 45 Minuten im Wasserbad bei 50°C unter Schwenken hydratisiert und für weitere 5 Minuten im Ultraschallbad behandelt. Danach wird die Suspension eingefroren. Es folgen 3 Einfrier- und Auftauprozesse, wobei nach dem Auftauen jeweils eine 5- minütige Behandlung im Ultraschallbad erfolgt. Nach dem letzten Auftauen werden die Liposomen mehrfach durch eine Membran mit einer Porenweite von 200nm oder 400nm extrudiert (Avestin LiposoFast, Polycarbonat-Membran mit einer Porenweite von 200 oder 400nm) . Nach der Extrusion wird die Ionenstärke der erhaltenen Suspension durch Zugabe einer NaCl- Stammlösung erhöht.
Der Anteil des eingeschlossenen Cy5.5 anti CD40 ODN
(Antisense-Oligonukleotid) wird nach Abtrennung des frei vorliegenden Wirkstoffes durch dreimalige Sedimentation in der
Ultrazentrifuge bei 60000 x g über 45 min fluoreszenzspektroskopisch ermittelt.
Die Einschlusseffizienz des Oligonukleotids liegt bei 47%.

Claims

Patentansprüche
' 1. Depotsystem, insbesondere zur verzögerten
Wirkstofffreisetzung, dadurch gekennzeichnet, dass es Liposomen mit gesättigten synthetischen Phosphatidylcholinen, ausgewählt aus der Gruppe DMPC, DPPC und/oder DSPC, - Cholesterol mit einem Anteil von 35 bis 50 mol%,
- kationische Lipide, ausgewählt aus der Gruppe DC-Chol, DAC-Chol, DMTAP, DPTAP und/oder DOTAP mit einem Anteil von 5 bis 20 mol% an der Liposomenmembran, und mindestens einen Protein- und/oder Peptidwirkstoff umfasst.
2. Depotsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die kationischen Lipide ph-sensitiv kationisch sind und ausgewählt aus der Gruppe His-Chol und/oder Mo-Chol .
3. Depotsystem nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff zu mindestens 90% im Liposom eingeschlossen ist und weniger als 10% sich außerhalb des Liposoms befindet.
1. Depotsyste nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff im Liposom eingeschlossen ist und mehr als 10% sich außerhalb des Liposoms befindet.
5. Depotsystem zur verzögerten Wirkstofffreisetzung nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Abgabe des Wirkstoffes mindestens 1 Woche anhält.
6. Depotsystem nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Größe der Liposomen variiert von 20-1000 nm, insbesondere von 50-800 nm, bevorzugt von 50- 300 nm.
7. Verwendung des Depotsystems nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur subkutanen oder intramuskulären Applikation.
8. Verwendung des Depotsystems nach einem der Ansprüche 1 bis 6 für ein Depot von LHRH-Agonisten und/oder GnRH-Analoga, wobei das Depotsystem insbesondere Leuprolidacetat, Buserelin, Goserelin und/oder Triptorelinals umfasst.
9. Verwendung eines Depotsystems nach Anspruch 1, 2 oder 3 für ein Depot für Insulin, wobei der Peptidwirkstoff ein therapeutisch nutzbares Insulin umfassen.
10. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche für ein Depot von Heparin, wobei der Wirkstoff Heparin umfasst.
11. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche für ein Depot von Antigenfragmenten zur Vakzinierung.
12. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche zur verzögerten Wirkstofffreisetzung über mindestens eine Woche, wobei das Depotsystem Oligonukleotide umfasst.
13. Verwendung nach dem vorangegangenen Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotide aus 5-100, bevorzugt aus 5-40 und besonders bevorzugt aus 10-25 Desoxyribonukleotiden, Ribonukleotiden oder deren chemisch-modifizierten Derivaten aufgebaut sind.
14. Verwendung nach dem vorangegangenen Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotide als Einzelstrang, insbesondere Antisense-Oligonukleotide, als Doppelstrang, insbesondere small-interfering RNA, Decoy-Oligonukleotiden und/oder in komplexer Faltung, insbesondere Aptamere und/oder Spiegelmere, vorliegen.
15. Verwendung des Depotsystems nach einem der Ansprüche 1-6 zur Herstellung eines Arzneimittels.
16. Verwendung des DepotSystems nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur topischen und lokalen Anwendung, insbesondere zur Unterstützung von Heilungsprozessen.
17. Verwendung des Depotsystems nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur verzögerten Freisetzung eins Wirkstoffes über mindestens eine Woche, wobei der Wirkstoff ein wasserlösliches Wirkstoff-Derivat ausgewählt aus den Wirkstoffklassen der Antibiotika, Antimykotika, Cytostatika oder der Glucocorticoide umfasst.
18. Kit umfassend mindestens ein Depotsystem nach einem der Ansprüche 1 - 6 gegebenenfalls zusammen mit einer
Information zum Kombinieren der Inhalte des Kits.
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