KR100744237B1

KR100744237B1 - 리포솜-포획된 디엔에이 경구용 백신

Info

Publication number: KR100744237B1
Application number: KR1020027003922A
Authority: KR
Inventors: 그레고리 그레고리아디스
Original assignee: 리폭센 테크놀로지즈 리미티드
Priority date: 1999-10-01
Filing date: 2000-10-02
Publication date: 2007-07-30
Also published as: ES2256043T3; DE60024843T2; US7008791B1; DE60024843D1; EP1217989B1; WO2001024773B1; EP1217989A1; AU7540500A; ATE312599T1; CN1196474C; KR20030011763A; JP2003529550A; WO2001024773A1; CA2386024A1; CN1376056A

Abstract

경구용 백신은 리포솜 그리고 항원을 효과적으로 코드화하는 복합체화 된, 또는 바람직하기는 포획된 DNA로 이루어지고, 상기 리포솜은 양이온성 화합물과 양쪽성이온성 인지질을 포함하는 성분으로부터 형성된다. 리포솜 형성 화합물 내의 소수성기는 적어도 하나의 포화된 기를 포함하여야 한다. 이것은 전이온도를 상승시켜, 경구로 운반될 때 리포솜을 더욱 안정하게 만드는 것으로 믿어진다. 상기 조성물은 유효한 경구용 백신의 운반에 중요한 분비된 면역글로블린, IgA 내의 수준이 탐지될만큼 증가되었음이 확인되었다.

Description

리포솜-포획된 디엔에이 경구용 백신{LIPOSOME-ENTRAPPED DNA ORAL VACCINES}

본 발명은 양이온성 리포솜 및 상기 리포솜 내에 복합체화되거나 포획되고, 백신화(vaccination)가 요구되는 항원을 코드화하는 핵산인 유전자 백신으로 이루어진 경구용 백신에 관한 것이다.

WO-A-9810748에는 백신화가 요구되는 항원을 코드화하고, 리포솜안에 포획된 핵산을 함유하는 유전자 백신이 기재되어 있다. 상기 리포솜은 양이온성 지질을 함유하는 리포솜 형성 성분으로부터 형성된다. 상기 조성물은, 예를 들어 근육내로, 피하내로, 정맥내로, 또는 복막내로 투약되지만, 특히, 경구에 의하여 투약되는 것이 적합하다고 기재되어 있다.

경구투여에 따른 면역 반응을 일으키는 백신을 위해, 상기 조성물은 장내에서 임파계와 상호 작용을 해야 한다. 따라서, 백신은 GI관에서 안정하여야 하고, 담즙염에 의해 파괴되기 전에 시스템의 적절한 세포와 상호작용을 하기에 충분히 안정하여야 한다. 명백하게, 백신은 주사되어지는 것보다 경구로 투약되는 것이 바람직하다.

본 발명은 경구 투약에 적합한 조성물, 경구용 백신, 및 백신의 경구 투약에 의해 사람 또는 사람을 제외한 동물을 예방접종하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 첫번째 관점에 의하면, 하기 성분을 포함하는 리포솜 형성 성분으로부터 형성되는 리포솜들 내에 포획되고/포획되거나 이들과 복합체화된 항원을 효과적으로 코드화하는 핵산으로 이루어지는 새로운 백신이 제공된다.

a) 하기 화학식 1을 가지는 적어도 하나의 양이온성 화합물

화학식 1

R¹OCH₂CH(OR²)CH₂R⁵X¹R⁶ _n

여기서 R¹과 R²는 같거나 다르고, 식 CH₃(CH₂)_a(CH＝CH－CH ₂)_b(CH₂)_c(CO)_d￣의 기로부터 선택되고,

여기서 b는 0 내지 6이고, a와 c는 각각 0 ~ 23에서 선택되고, (a + c + 3b)는 12 ~ 23의 범위이고, 그리고 d는 0 또는 1 이고;

R⁵는 결합이거나 또는 C_1-8알칸디일(alkanediyl)기, C_1-4알콕시-C_1-4알킬기, 또는 C_1-8옥시-알킬렌(alkylene)기이고;

X¹은 N, P 또는 S이고;

n은 X¹이 N 또는 P인 경우 3이고, X¹이 S인 경우 2이고; 그리고,

R⁶기는 같거나 또는 다르고, 수소, C_1-8알킬, C_6-12아릴 또는 아랄킬(aralkyl)로부터 선택되거나, 또는 상기 R⁶기 중 둘 또는 셋은 X¹과 함께 5 내지 7의 고리 원자를 가지는 포화되거나 불포화된 헤테로사이클기를 형성할 수 있고;

b) 하기 화학식 2를 가지는 적어도 하나의 양쪽성이온성 인지질(zwitterionic phospholipid)

화학식 2

여기서 R³와 R⁴는 같거나 다르고, 식 CH₃(CH₂)_e(CH＝CH－CH ₂)_f(CH₂)_g－ 의 기로부터 선택되고,

여기서 f는 0 내지 6이고, e와 g는 각각 0 내지 23이고, 그리고 (e + g + 3f)는 12 ~ 23의 범위이고;

R⁷는 C_1-8알칸디일기이고;

Y는 －O－이거나 하나의 결합이고;

X²는 N, P 또는 S이고;

m은 X²가 N 또는 P일때 3이고, X²가 S일때 2이고; 그리고

R⁸기는 같거나 또는 다르고, 수소, C_1-8알킬, C_6-11아릴 또는 아랄킬로 이루어지는 군으로부터 선택되고, R⁸기 중 둘 또는 셋은 X²와 함께 5 내지 7의 고리 원자를 가지는 포화되거나 불포화된 헤테로사이클기를 형성할 수 있고;

경우에 따라서, R¹, R², R³, 및 R⁴기 중 적어도 하나 이상, b 또는 f가 0일 수 있다.

상기 조성물은 바람직하기는 경구용 백신이고, 본 발명은 또한 경구에 의한 백신의 투약 방법을 포함한다. 조성물은 약학적으로 수용가능한 희석제를 함유할 수 있고, 통상적인 보조약 같은, 백신의 면역원적 특성을 높이는 성분을 포함할 수 있다.

본 발명에서 R¹, R², R³ 및 R⁴기 중 적어도 하나가 포화된 긴 사슬의 알킬기를 가져야 하는 단서는 상대적으로 높은 전이 온도를 가지는 조성물을 제공하게 된다. 그러므로 혼합물에서, 리포솜 형성 성분은 적어도 37℃ 이상, 바람직하기는 38내지 50℃ 범위의 전이온도를 가져야 한다.

R¹과 R²기는 서로 같고, R³과 R⁴기는 서로 같은 것이 바람직하다. 본 발명자들은 일반적으로 R¹과 R²는 불포화되고, R³와 R⁴는 포화되는 것이, 또는 반대로 되는 것이 바람직하다는 것을 발견하였다. 바람직하기는 양이온성 화합물은 상기 화학식 1의 단일 화합물로 이루어진다.

본 발명의 특정 구현예에서는 화학식 2에서 각각 다른 식을 가지는 두 양쪽성이온성 인지질이 리포솜 형성 성분으로 사용된다.

하나의 구현예에서, 제 1 양쪽성이온성 인지질에서의 R³과 R⁴기는 같고, 그리고 각각은 f는 1이고, e + g 는 14 내지 20의 범위, 바람직하기는 14 내지 18의 범위를 가지는 기를 나타내는 혼합물이 사용된다. 바람직하기는 불포화기는 e ≒ g, 바람직하기는 e = g = 7인 R³ 또는 R⁴사이의 중간 정도이다. 통상적으로 에틸렌 결합은 시스(cis) 형태이다.

두 번째 구현예에서, 혼합물의 제 1인지질 내에서 R⁸기는 바람직하기는 모두 같고, 수소인 인지질의 혼합물이 사용된다. 화학식 2의 제 2인지질에서, R⁸기는 모두 같고 C_1-4-알킬이다. 상기 구현예에서 흔히, 양쪽 인지질의 f는 0이다.

일반적으로, 제 1 및 제 2인지질 모두에서 인지질의 혼합물을 사용하는 양쪽 구현예에서, Y는 O이고, X²는 N이다. 또한 R⁷은 C_2-3-알칸디일인 것이 바람직하다.

화학식 1의 양이온성 화합물에서, 소수성기 R¹과 R²은 에테르 결합(d가 0인) 또는 에스테르 결합(d가 1인) 중 하나를 통해 분자의 나머지 부분과 결합될 수 있다. 화학식 1의 화합물에서 바람직하기는, R⁵는 C_1-4-알칸디일이다. 바람직하기는 양이온성 화합물은 생체 내에서 부딪히게 될 모든 pH에서, 즉 5 내지 9의 범위에서, 실질적으로 충분히 이온화된 불변성의 양이온이다. 바람직하기는 R⁶기의 각각은 수소와 다른, 따라서, 특히 C_1-4-알킬이고, 가장 바람직하기는 R⁶기가 각각 메틸인 것이다.

R⁵는 결합 또는 메틸렌기인 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물 중 특히 바람직한 구현예는 R¹과 R²기 각각이 올레오일(oleoyl)기이고, R⁵기가 결합이고, X¹이 N이고, R⁶기의 각각이 메틸(1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트리메틸암모니오)프로판(DOTAP))인 화학식 1의 양이온성 화합물을 이용한다. 대체 가능한 양이온성 화합물은 소수성 올레오일기가 올레일기에 의해 대체된, 즉, 에스테르 결합 대신 에테르 결합을 통해 연결된 유사한 화합물이다. 소수성기가 포화된 적합한 양이온성 화합물은 1,2-비스(헥사데실옥시)-3-트리메틸아미노 프로판(BisHOP)이다.

적합한 양쪽성이온성 인지질은 디올레오일옥시 포스파티딜 에탄올아민 (DOPE), 디올레오일옥시 포스파티딜콜린 (DOPC), 디스테아로일 포스파티딜 에탄올아민 (DSPE), 디스테아로일옥시 포스파티딜콜린 (DSPC), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민 (DPPE), 디팔미토일 포스파티딜콜린 (DPPC), 및 혼합물을 포함한다. 특히 바림직한 양성이온 인지질 혼합물은 디스테아로일 포스파티딜콜린 및 디올레오일 포스파티딜 에탄올아민을 함유한다.

일반적으로 두 양쪽성이온성 인지질의 혼합물은 두 화합물의 중량비 10:1 에서 1:10의 범위를, 더욱 바람직하기는 5:1 에서 1:5의 범위, 가장 바람직하기는 2:1 에서 1:2의 범위를 갖는다. 혼합물 내에 포화된 R³과 R⁴기의 비율은 바람직하기는 적어도 50%이상인 것이다.

일반적으로 양쪽성이온성 인지질(총합)에 대한 양이온성 화합물의 비율은 10:1 에서 1:20의 범위, 더욱 바람직하기는 5:1 에서 1:10의 범위, 가장 바람직하기는 1:1 에서 1:5의 범위이다.

본 발명의 다른 관점에 의하면, 적어도 하나의 글리세롤지질(glycerolipid), 적어도 하나의 양이온성 화합물 및 적어도 하나의 양쪽성이온성 인지질을 포함하는 리포솜 형성 성분으로부터 형성된 리포솜과 복합체화 된 그리고/또는 이에 포획된 항원을 코드화하는 핵산으로 이루어지는 경구용 백신을 제공하는 데, 이때 상기 글리세롤 지질은 O,O'-디알카노일 또는 O,O'-디알킬 인지질인 것을 특징으로 한다. 바람직하기는 상기 글리세롤지질은 R³과 R⁴ 모두에서 f가 0인, 상기의 화학식 2의 화합물이다.

본 발명의 모든 관점에서 리포솜 형성 성분은 적어도 37℃이상의 전이 온도를 갖는 것이 바람직하다. 전이 온도는 시차 주사 열량법에 의해 결정된다.

본 발명의 이러한 관점에서 양쪽성이온성 인지질은 바람직하기는 지질의 혼합물, 예를 들어 포화된 그리고 불포화된 지질 혼합물, 및/또는 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민의 혼합물을 함유한다.

양이온성 화합물은 바람직하기는, 예를 들어 상기 화학식 1을 가지는, 2,3-디(아실옥시(acyloxy) 또는 알콕시) 치환된 프로필아민 유도체이다. 선택적으로, 상기 화합물은 모노- 또는 디-스테아릴아민 또는 다른 긴 사슬 알킬아민, 또는 디메틸디옥타데실 암모늄 할라이드과 같은 N-저급 알킬(C_1-4알킬) 치환기를 각각 하나, 두개 또는 세개 가지는 이차, 삼차 또는 사차 유도체와 같은 간단한 양이온성의 양성친화적인 화합물로 형성된다. 리포솜으로 혼합되기에 적합한 양성친화적인 양이온성 화합물의 다른 범주는 디(패티 아실)글리세라이드 또는 N,N-디(C_12-24)알킬아실아미드 화합물과 컨쥬게이트된 스페르민 또는 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에틸)카바메이트] 콜레스테롤(DC chol)이다. 적합한 양이온성의 양성친화적인 화합물의 범위는 Bioconjugate Chem. (1995), 6 (1), 7-20 에서 Kabanov A.V.등에 의해 기술되었다.

본 발명의 다른 관점에 의하면, 리포솜 형성 성분이 각각 40℃를 넘는 전이 온도를 가지는 성분을 25 몰%이상, 바람직하기는 50 몰%이상 포함하는 것을 특징으로 하는, 적어도 하나의 양이온성 화합물 및 적어도 하나의 양쪽성이온성 인지질을 포함하는 리포솜 형성 성분들로부터 형성된 리포솜과 복합체화 된 그리고/또는 이에 포획된 항원을 코드화하는 핵산으로 이루어지는 경구용 백신을 제공한다.

본 발명의 이러한 관점에 의하면, 높은 전이 온도의 지질 성분을 비교적 높은 수준으로 사용하는 효과는 사용된 성분에 의한 리포솜 혼합물의 전이 온도가 37℃를 넘을 것이라는 것이다. 혼합물의 전이 온도는 각각 성분의 평균 전이 온도에 근접하려는 경향이 있다. 그러나 이 중 많은 값들이 알려져 있으므로, 일반적으로 성분들의 전이 온도를 결정하는 것은 쉽다. 바람직한 높은 전이 온도의 양쪽성이온성 인지질은 DPPC(T_c41.4℃), DSPC(T_c55.1℃),DPPE(T_c64℃) 및 DSPE(T_c74.2℃)이다.

본 발명의 모든 관점에서 콜레스테롤과 같은 다른 성분은 50 중량% 이하의 양으로 리포솜 형성 혼합물에 포함될 수 있다. 바람직하기는 리포솜 형성 성분은 콜레스테롤이 없는 것이다.

바람직하기는 양이온성 화합물의 양은 리포솜 형성 성분의 전체 몰 중 5 내지 50%의 범위이며, 더 바람직하기는 10 내지 25 몰%인 것이다.

일반적으로 리포솜 조성물은 예를 들어, 생리학적인 완충액과 같은 수용성 현탁액의 형태이다. 선택적으로, 그것은 재수화(rehydration)를 위해 건조된 조성물일 수도 있다.

리포솜은 일반적으로 사용되는 리포솜 형성 기술 중 어느 것으로도 만들어질 수 있다. 리포솜 생성물은 다중의 엷은 막의 또는 단일 엷은 막의 액포일 수 있고, 상대적으로 크거나(300㎚에서 2000㎚의 범위의, 바람직하기는 500㎚에서 1000㎚의 범위의 평균 직경을 가지는 액포 직경), 또는 작을 수 있다(100㎚에서 400㎚ 범위의, 바람직하기는 200㎚에서 300㎚의 범위의 평균 직경을 가지는 액포 직경). 바람직하기는 리포솜의 평균 직경이 1000㎚이하이면, 바람직하기는 실질적으로 모두 2000㎚미만의 직경을 가진다. 평균 직경은 200-750㎚인 것이 가장 바람직하다.

상기의 새로운 조성물에서, 핵산은 리포솜의 외부에 위치하는 리포솜과 복합체화 되어도 좋다. 그러나, 바람직하기는 핵산은 적어도 부분적으로 포획된다.

바람직하기는 리포솜은 액포가 형성되어, 포획될 핵산과 혼합되고, 그 다음 바람직하기는 동결 건조에 의해 건조되고, 이어서 탈수화-재수화 액포(DRV's)를 만들기 위한 수용성 조성물에 재수화되고, 임의로 DRV's는 그 평균 크기를 감소시키기 위해 연속적으로 극소유체화될 수 있다. 그러나, 바람직하기는 DRV's는 극소유체화되지 않거나, 또는 극소유체화 중 하나 또는 두 주기만이 되는 것이다. 바람직하기는 비-포획된 물질은 필수적이지는 않으나, 재수화 및/또는 극소유체화 단계 후, 원심 분리법 또는 분자채 크로마토그래피법에 의해 리포솜으로부터 분리된다.

본 발명의 다른 관점에 의하면, 다음과 같은 단계를 포함하는 리포솜으로 폴리뉴클레오티드를 포획하는 방법을 제공한다:

ⅰ) 사람 또는 동물 개체에서 원하는 면역 반응을 유발시키는 데에 유용한 면역원성 폴리펩티드를 효과적으로 코드화하는 순수한 폴리뉴클레오티드 및 상기 새로운 조성물에 특이적인 리포솜 형성 성분으로 형성된 예비성형 리포솜를 함유하는 수용성 현탁액을 형성하는 단계,

ⅱ) 현탁액을 동결 건조 또는 분무 건조하는 단계, 및

ⅲ) 탈수화/재수화 액포을 형성하기 위하여 ⅱ)단계의 생성물을 재수화하는 단계.

다음과 같은 추가적인 단계가 실시될 수 있으나, 필수적인 것은 아니다:

ⅳ) ⅲ)단계로부터 얻은 탈수화 재수화 액포를 수용성 현탁시켜, 크기를 조절하기 위하여 극소유체화하는 단계; 및/또는

ⅴ)임의로 리포솜으로부터 포획되지 않은 폴리뉴클레오티드을 분리하는 단계.

ⅳ)단계는 탈수화 재수화 액포이므로 일반적으로 불필요하다고 판명된다.

마지막 단계는 외부 핵산이 양이온적으로 대전된 리포솜과 복합체화 되는 것에 의한 환경으로부터 부분적으로 보호받을 수 있으므로 일반적으로 불필요하다고 판단된다.

탈수화-재수화 단계는 Kirby와 Gregoriadis, (1984) Biotechnology, 2, 979-984 에 충분히 기재되어 있다. 그러므로, ⅰ)단계의 리포솜은 바람직하기는 작은 단일의 얇은 막(SUV's)(비록 그것들이 예를 들어 2㎛ 크기를 가지는 MLV's일 수 있더라도)이고, ⅲ)단계에서 만들어진 리포솜은 바람직하기는 다중의 얇은 막 리포솜(MLV's)이다. ⅲ)단계에서의 리포솜 생성물은 일반적으로 탈수화-재수화 액포(DRV's)라 명명된다.

DRV's의 극소유체화는 WO-A-92/04009, 및 Gregoriadis et al, (1990), Int. J. Pharm. 65, 235-242에 기재된 바에 따라 실시된다. 상기한 바와 같이, 극소유체화가 수행된다면, 수행되는 2 주기중 하나만 실행되는 것이 바람직하다.

본 발명은 전이 온도를 올리기 위하여 리포솜 형성 성분을 중합하는 단계를 포함하지는 않는다. 이것은 활동체의 운반 속도를 감소시킬 수 있고, 공정 중 바람직하지 않은 과잉의 단계이다.

DRV 기술을 사용함에 의해, 발명자는 건조 단계에 도입되는 수용성 현탁액에 존재하는 폴리뉴클레오티드의 90%이하 또는 그 이상이 리포솜에 포획될 수 있고 그리고/또는 복합체화 될 수 있다는 것을 알았다. 리포솜 조성물에 포획된 그리고/또는 복합체화된 폴리뉴클레오티드의 양은 바람직하기는 0.05 내지 100㎍/μmole 지질의 범위, 바람직하기는 1 내지 50㎍/μmole 지질의 범위, 가장 바람직하기는 5내지 50㎍/μmole 지질의 범위이다.

본 발명의 리포솜 조성물은 담즙염에 저항력이 있는 것으로 밝혀졌고, 이것은 GI관에서의 안정성과 상호 관계가 있는 것으로 믿어진다.

핵산 활동체는, 예를 들어 항원의 합성에서 직접적으로 전사될 수 있고 해독될 수 있는, 또는 복제를 위한 DNA를 형성하기 위해 먼저 역전사 되어야 하는 RNA일 수 있다. 바람직하기는 핵산은 선택된 항원을 형성하기 위해 전사되고 해독된, 그리고 바람직하기는 복제된 DNA이다. DNA는 바람직하기는 이중나선(ds)의 플라스미드 DNA이다.

본 발명은 또한 치료 또는 예방의 방법에 사용하기 위한 조성물의 제조에서의 본 발명의 방법에 따라 만들어진 리포솜의 조성물의 용도를 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 전염성의 미생물에 의한 감염에 대항하여 사람 또는 동물 개체를 보호하기 위한 사람 또는 동물 개체의 면역화(백신화, 백신접종)일 수 있다. 선택적으로 면역 반응은, 예를 들어 감염을 포함한, 암 또는 다른 질병을 치료하기 위한 면역 요법에 유용한 유전자 생성물에 의해 생성될 수 있다.

도 1은 실시예 1에 따라 개체에 첫번째 투약 후 14, 21, 32, 40, 48, 62, 84, 96 및 119일째에 수집된 배설물로부터 IgA 면역 반응을 측정하기 위한 ELISA 실시 결과로서, a - i의 결과는 쥐의 각각 그룹에서 측정된 두 번의 흡광도의 평균을 나타낸다.

도 2는 실시예 2에 따라 개체에 첫번째 투약 후 42, 55, 65 및 95일째에 수집된 배설물로부터 IgA 면역 반응을 측정하기 위한 ELISA 실시 결과로서, a - d의 결과는 쥐의 각각 그룹에서 측정된 두 번의 흡광도의 평균을 나타낸다.

도 3는 실시예 3에 따라 개체에 첫번째 투약 후 60일 및 70일째에 수집된 배설물로부터 IgA 면역 반응을 측정하기 위한 ELISA 실시 결과로 쥐의 각각 그룹에서 측정된 두 번의 흡광도의 평균을 나타낸다.

도 4는 리포솜-포획된 플라스미드 DNA가 투약된 쥐(도 4a), 순수한 DNA가 투약된 쥐(도 4b), 및 대조군(도 4c)의 리포터 유전자 발현 정도를 알아보기 위해, 장간막 림프절을 수집하여 얻은 사진이다.

본 발명은 다음의 실시예에서 더 잘 설명된다.

실시예 1

방법론: 경구 면역화 실험 1

리포솜 제조

다음의 조성물로 이루어진 리포솜이 탈수화-재수화 방법(DRV)에 의해 제조되었다;

1) 32 μmole 의 에그(egg) 포스파티딜콜린(PC), (약간의 포화기를 포함한, 디 패티 아실 포스파티딜콜린의 혼합물)

16 μmole 의 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE),

8 μmole 의 디올레오일 트리메틸암모늄 프로판(DOTAP).

2) 32 μmole 의 디스테아로일 포스파티딜콜린(DSPC),

16 μmole 의 DOPE,

8 μmole 의 DOTAP.

3) 32 μmole 의 DSPC,

16 μmole 의 콜레스테롤(CHOL)

8 μmole 의 DOTAP.

헤파티티스 B 표면 항원(HBsAg;특수형 ayw)의 S(small)영역을 코드화하는 600㎍의 pRc/CMV HBS 플라스미드 DNA는 다음의 기술을 사용하여 상기 리포솜 제제로 포획되었다.

탈수화-재수화 처리(Kirby and Gregoriadis, (1984) 상기 저서)는 리포솜으로 pRc/CMV HBS 플라스미드 DNA를 병합시키기 위해 사용되었다. 요컨대, 2㎖의 작은 단일의 얇은 막의 액포(SUV)는 -20℃에서 동결되고 하룻밤동안 동결-건조된 플라스미드 DNA와 혼합된 특정한 리포솜 형성 성분으로부터 제조되었다. 그리고 나서 리포솜은 다중 얇은 막의(Gregoriadis et al. (1993) Biochim. Biophys. Acta 1147, 185-193) 탈수화-재수화 액포(DRV)를 생성하기 위하여 조절된 재수화를 받았다. 생성물은 포획되지 않는 DNA를 제거하기 위한 단계를 거치지 않았고, 리포솜에 복합체화 된 외부 DNA를 포함할 것이다. 극소유체화는 실시되지 않았다.

상기 조성물 각각의 포획 복합체화 효율은 ³⁵S-dATP로부터 생성된 ³⁵S-표지된 DNA를 이용하여 결정하면, 85 - 95%이다. DRV's는 550 내지 750㎚ 범위의 평균 직경을 가진다.

면역화

이 방법은 Roy, K. et al (1999) Nature Medicine 5(4) 387-391를 토대로 하였다.

4마리의 Balb/c 암컷 쥐(마우스)(20-24g) 그룹들이 1㎖의 주사기에 결합된 동물용 급식 주사바늘을 이용하여 "순수한"(그룹 4) 또는 리포솜-포획된(그룹 1-3) DNA 중 하나로 경구로 면역화되었다. 쥐 각각에 0, 28 및 38일째 인산염 완충용액화 염수(PBS) 500㎕ 중 DNA 100㎍을 섭취시켰다.

면역화 그룹:

1) PC:DOPE:DOTAP (100㎍ DNA) (발명)

2) DSPC:DOPE:DOTAP (100㎍ DNA) (발명)

3) DSPC:CHOL:DOTAP (100㎍ DNA) (발명)

4) "순수한" DNA (100㎍ DNA) (참고)

5) 대조군 (no DNA)

배설물 펠렛으로부터의 IgA 추출물

배설물 펠렛은 0, 14, 21, 32, 40, 48, 62, 84, 96 및 119일째에 쥐의 우리로부터 수집되었다. 상기 펠렛은 100㎎/㎖의 농도로 PBS에 부유되었고, 원심분리되어 상청액(IgA를 포함하는)이 분석되었다.

ELISA 측정

분비성 IgA를 측정하기 위해 배설 추출물에 ELISA가 실행되었다. 플레이트는 헤파티티스 B 표면 항원(HBsAg;특수형 ayw) S(small) 영역으로 코팅되었고, 비-특이적 결합을 피하기 위해 1% BSA로 차단하고 나서 펠렛 추출물은 이중으로(희석되지 않은) 가하여졌다. 호스래디쉬 퍼옥시데이즈-연계된 고트 항-마우스 IgA가 가하여졌고, O-페닐렌디아민 기질이 가하여졌다. 도 1a-i의 결과는 쥐의 각 그룹에서 측정된 두 번의 흡광도의 평균을 나타낸다.

실시예 2

방법론: 경구 면역화 실험 2

리포솜 제조

다음의 조성물로 이루어진 리포솜은 탈수화-재수화 방법(DRV)을 사용하여 제조되었다:

1) 32 μmole 의 DSPC,

16 μmole 의 DOPE,

8 μmole 의 DOTAP.

2) 32 μmole 의 DSPC,

16 μmole 의 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민 (DSPE),

8 μmole 의 DOTAP.

3) 32 μmole 의 DSPC,

16μmole 의 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPE),

8 μmole 의 DOTAP.

4) 32 μmole 의 DSPC,

16 μmole 의 DOPE.

pRc/CMV HBS 플라스미드 DNA는 실시예 1에서와 같은 방법으로 상기 리포솜 제제에 포획되었다. DRV 조성물 1, 2 및 3은 사용된 DNA 총량의 85 - 95%를 포획하였다. 비-양이온성 DRV 리포솜(조성물 4)은 (사용된 DNA 총량의) 45 - 55%의 포획 효율을 가졌다. DRV 리포솜의 크기는 실시예 1에서의 범위와 같았다.

면역화

4 마리의 Balb/c 암컷 쥐(20 - 24g) 그룹들이 1㎖ 주사기에 결합된 동물 급식 주사바늘를 이용하여 "순수한"(그룹 6) 또는 리포솜-포획된(그룹 1-5) DNA 중 하나로 경구 면역화되었다. 각각의 쥐에게 0, 32일째에 PBS 500㎕ 중 50㎍(그룹 5) 또는 100㎍(그룹 1,2,3,4 및 6)의 DNA를 섭취시켰다.

면역화 그룹:

1) DSPC:DOPE:DOTAP (100㎍ DNA) (발명)

2) DSPC:DSPE:DOTAP (100㎍ DNA) (발명)

3) DSPC:DPPE:DOTAP (100㎍ DNA) (발명)

4) DSPC:DOPE (100㎍ DNA) (참조)

5) DSPC:DOPE:DOTAP(50㎍ DNA) (발명)

6) "순수한" DNA (100㎍ DNA)

7) 대조군 (no DNA)

배설물 펠렛으로부터의 IgA 추출물

배설물 펠렛은 0, 42, 55, 65, 및 92일째에 쥐의 우리로부터 수집되었다. 상 기 펠렛은 100㎎/㎖의 농도로 PBS에 부유되었고, 원심분리되어서 (IgA를 포함하는)상청액이 분석되었다.

ELISA 측정

첫번째 경구용 면역화 실시예에서처럼 분비성 IgA를 측정하기 위해 배설 추출물에 ELISA가 수행되었다. 첫번째 실시예에서처럼, 도 2a-d에서의 결과는 쥐의 그룹 각각에 대해 측정된 두 번의 흡광도의 평균을 나타낸다.

경구 면역화 실험 3

이 실험은 나아가 리포솜-매개된 경구 면역화에서 리포솜 조성물의 영향을 더 조사하는 것을 목적으로 한다. 두 가지 요인이 측정되었다:

1) 이중막에서 포스파티딜콜린과 콜레스테롤의 존재의 복합적 영향.

2) 양이온성 디올레오일 트리메틸암모늄 프로판을 콜레스테롤 3β-N-(디메틸 -아미노에틸)카바메이트(DC-Chol)로 대체시킨 효과

방법론:

리포솜 제조

다음의 조성물로 이루어진 리포솜은 상기 실시예 1에서 기재된 것처럼, 탈수화-재수화방법(DRV)을 사용하여 제조되었다.

1) 32 μmole의 포스파티딜콜린(PC),

16 μmole 의 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE),

8 μmole 의 디올레오일 트리메틸암모늄프로판(DOTAP).

2) 32 μmole 의 디스테아로일 포스파티딜콜린(DSPC),

16 μmole 의 DOPE,

8 μmole 의 DOTAP.

3) 32 μmole 의 PC,

16 μmole 의 콜레스테롤(CHOL),

8 μmole 의 DOTAP.

4) 32 μmole 의 DSPC

16 μmole 의 콜레스테롤(CHOL)

8 μmole 의 콜레스테롤 3β-N-(디메틸-아미노에틸)카바메이트(DC-CHOL).

헤파티티스 B 표면 항원(HBsAg; 특수형 ayw)의 S(small)영역을 코드하는 pRc/CMV HBS 플라스미드 DNA 600㎍이 상기 리포솜 제제로 포획되었다. 상기 조성물의 각각의 포획 효율은 85 - 95%이었다. DRV 직경은 실시예 1에서와 같은 범위였다.

면역화

4마리의 Blab/c 암컷 쥐(20 - 24g) 그룹들이 1㎖주사기에 결합된 동물 급식 주사 바늘을 사용하여 "순수한"(그룹 5) 또는 리포솜-포획된(그룹 1-4) DNA 중 하나로 경구 면역화되었다. 각각의 쥐에게 0, 28 및 38일째에 PBS 500㎕ 중의 DNA 100㎍를 섭취시켰다.

면역화 그룹:

1) PC:DOPE:DOTAP (100㎍ DNA)

2) DSPC:DOPE:DOTAP (100㎍ DNA)

3) PC:CHOL:DOTAP (100㎍ DNA)

4) DSPC:DOPE:DC-Chol (100㎍ DNA)

5) "순수한" DNA (100㎍ DNA)

배설물 펠렛으로부터 IgA 추출물

배설물 펠렛은 0, 30, 45, 60 및 70일째에 쥐의 우리로부터 수집되었다.

상기 펠렛들은 100㎍/㎖의 농도로 PBS에 부유되고, 원심분리되어 (IgA를 포함하는) 상청액이 분석되었다.

ELISA 측정

분비성 IgA를 측정하기 위해 분비 추출물에 ELISA가 실행되었다. 플레이트는 헤파티티스 B 표면 항원(HBsAg;특수형 ayw)의 S(small)영역으로 코팅되었고, 비-특이적인 결합을 피하기 위하여 1% BSA로 차단되고 나서 펠렛 추출물은 (희석되지 않은) 이중으로 가하여졌다. 호스래디쉬 퍼옥시데이즈-연계된 고트 항-마우스 IgA가 가하여졌고, 뒤따라 o-페닐렌디아민 기질이 가하여졌다. 450㎚에서 흡광도가 측정되었다. 결과는 쥐의 그룹 각각에서 측정된 두 번의 흡광도의 평균을 나타낸다.

결과

첫번째 투약 후 60일, 및 70일째에 측정된 IgA 면역 반응은 각각 도 3a과 3b에서 나타내었다. 결과는 DPSC:DOPE:DOTAP로 구성된 DRV가 양 쪽의 시간점에서 경구로 면역화된 쥐에서 가장 높은 반응을 강화했다는 것을 보여준다. 리포솜에 포획된 DNA 중에서 양이온성 지질 DOTAP를 DC-CHOL으로 대체하는 것은 더 낮은 항-HBsAg IgA 면역 반응을 나타낸다. 또한, PC:CHOL:DOTAP로 구성된 리포솜은 매개된 면역 반응에서 DSPC:DOPE:DOTAP로 구성된 것들보다 덜 효과적이었다.

결론

실시예 1내지 3으로부터 얻은 결론은 실험은 재현가능하다는 것이다. 또한, 포획된 DNA의 상대적으로 낮은 함량은 (실시예 2의 그룹 1과 그룹 5를 비교하면) 면역 반응에 대해 적절한 트랜스펙션 속도를 제공하는 것을 나타낸다. 포화된 지질은 더 나은 수행능력을 가지는 리포솜을 생산하는 것으로 보인다.

실시예 4

경구 투약 후 리포터 유전자 발현

목적

형광성의 녹색 단백질 리포터 유전자(pCMV.efgp)를 코드화하는 순수한 또는 리포솜-포획된 플라스미드 DNA 중 하나를 쥐에게 경구 투약 후 장간막의 림프절에서 유전자 발현의 수준을 비교하기 위한 것이다. 회복된 림프절에서 가시적인 녹색 단백질에 의해 나타나는 바와 같이, 리포터 유전자가 발현된다면, 이것은 DNA가 장간막 림프절에 도달하고 흡수되어 발현되는 것을 나타내는 것이다. 항원이 존재하는 세포는, 면역 반응을 일으키는 유전자 백신의 표적인 림프절에 위치한다.

방법론:

리포솜 제조

32 μmole의 DSPC, 16 μmoles의 DOPE, 8 μmoles 의 DOTAP로 구성된 리포솜은 실시예 1에 기재된 것과 같은 탈수화-재수화 방법(DRV)과 pCMV.efgp 플라스미드 DNA 600㎍ 을 이용하여 제조되었다.

투약과 유전자 발현의 측정

2 마리의 Balb/c 암컷 쥐 그룹에게 1㎖ 주사기에 결합된 동물 급식용 주사바늘을 이용하여 "순수한" 또는 리포솜-포획된 DNA 중 하나를 경구적으로 투약하였다. 각각의 쥐에게 PBS 500㎕ 중 100㎍의 DNA를 십취시켰다. 투약후 44시간에, 장간막의 림프절이 투약된 쥐 및 대조군(자연의) 쥐로부터 수집되었다. 새로이 수집된 림프절은 Tissue-Teck(Miles Inc, USA)를 사용한 크리요스태트 척스(Cryostat chucks)로 부착되었고, 그 다음 액체 질소에서 동결되었다. 절편은 슬리 크리요스태트(Slee Cryostat)에서 20㎛로 잘렸다. 이미지는 입사 형광과 코닥 엑타크롬(Kodak ektachrome) 4000 ASA를 사용하는, 니콘 극소 사진용 현미경(Nikon microphoto Microscope)으로 찍었다.

결과 및 결론

순수한 pCMV.efgp(도 4b) 것들과 자연의 쥐로부터 얻은 림프절 절편(그림 4c)에서 얻은 것과 같은 기준 등급과 비교할 때 더 높은 수준의 형광성의 녹색 단백질을 코드화하는 플라스미드를 리포솜-포획된 pCMV.efgp (그림 4a)이 투약된 쥐의 장관막의 림프절에서 볼 수 있다. 이것으로부터 경구로 투약된 DNA는 장관막 림프절로 제거되고, 장관막 림프절에서 리포터 유전자의 발현율은 포화된 지질을 포함하는 양이온성 리포솜내로의 캡슐화에 의해 증가된다고 결론지을 수 있다. 이것은 포화된 지질로부터 형성된 양이온성 리포솜에 포획됨으로서 면역 반응이 증가하는 것을 보여주는 결과와 일치한다.

Claims

전염성 미생물의 항원에 대하여 IgA 반응을 일으키도록, 인간 또는 동물 개체에 경구적으로 투여되어 인간 또는 동물 개체의 백신화에 사용하기 위한 백신 제조용 조성물로서,

상기 조성물은 5~50몰% 범위의 양이온성 화합물 및 하기 화학식 2로 나타나는 양쪽성 이온성 인지질을 포함하는 리포솜 형성 성분으로부터 형성된 리포솜 내에 포획되거나 상기 리포솜과 복합체화되고, 상기 전염성 미생물의 항원을 작동가능하게 암호화하는 핵산을 포함하고,

화학식 2

여기서 R³와 R⁴는 같거나 다르고, 식 CH₃(CH₂)_e(CH＝CH－CH₂)_f(CH₂)_g－ 의 기로부터 선택되고,

여기서 f는 0 내지 6이고, e와 g는 각각 0 내지 23이고, 그리고 (e + g + 3f)는 12 ~ 23의 범위이고;

R⁷는 C_1-8알칸디일기이고;

Y는 －O－이거나 하나의 결합이고;

X²는 N, P 또는 S이고;

m은 X²가 N 또는 P일 때 3이고, X²가 S일 때 2이고; 그리고

R⁸기는 같거나 또는 다르고, 수소, C_1-8알킬, C_6-11아릴 또는 아랄킬로 이루어지는 군으로부터 선택되고, R⁸기 중 둘 또는 셋은 X²와 함께 5 내지 7의 고리 원자를 가지는 포화되거나 불포화된 헤테로사이클기를 형성할 수 있고;

R¹, R², R³, 및 R⁴기 중 하나 이상, b 또는 f가 0일 수도 있음, 그리고

a) 하기 화합물로부터 선택되는 양이온성 화합물,

- 화학식 1

R¹OCH₂CH(OR²)CH₂R⁵X¹R⁶ _n

여기서 R¹ 및 R²는 같거나 다르고, 식 CH₃(CH₂)_a(CH＝CH－CH₂)_b(CH₂)_c(CO)_d－의 기로부터 선택되고 (여기서 b는 0 내지 6이고, a와 c는 각각 0 ~ 23에서 선택되고 (a + c + 3b)는 12 ~ 23의 범위이고, d는 0 또는 1임),

R⁵는 결합이거나 또는 C_1-8알칸디일기이고,

X¹은 N, P 또는 S이고,

n은 X¹이 N 또는 P인 경우 3이고, X¹이 S인 경우 2이고, 그리고

R⁶기는 같거나 다르고, 수소, C_1-8알킬, C_6-12아릴 또는 아랄킬로부터 선택되거나, 또는 상기 R⁶기 중 둘 또는 세 개는 X¹과 함께 5 내지 7의 고리 원자를 가지는 포화 또는 불포화 헤테로사이클기를 형성할 수 있음;

- 이차, 삼차, 또는 사차 유도체를 포함하는, 하나, 둘, 또는 세개의 N-C_1-4알킬 치환기를 갖는 모노- 또는 디- 긴 사슬 알킬아민;

- 디(패티 아실)글리세라이드 또는 N,N-디(C_12-24)알킬아실아미드 화합물과 컨쥬게이트된 스페르민; 및

- 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에틸)-카바메이트]콜레스테롤,

b) 상기 리포솜 형성 성분 중 50몰% 이상이 디스테아로일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜콜린 및 디팔미토일포스파티딜에탄올아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 양이온성 화합물은 하기 화학식 1로 나타나는 조성물:

화학식 1

R¹OCH₂CH(OR²)CH₂R⁵X¹R⁶ _n

여기서 R¹ 및 R²는 같거나 다르고, 식 CH₃(CH₂)_a(CH＝CH－CH₂)_b(CH₂)_c(CO)_d－의 기로부터 선택되고 (여기서 b는 0 내지 6이고, a와 c는 각각 0 ~ 23에서 선택되고 (a + c + 3b)는 12 ~ 23의 범위이고, 그리고, d는 0 또는 1 이다);

R⁵는 결합이거나 또는 C_1-8알칸디일기이고;

X¹은 N, P 또는 S이고;

n은 X¹이 N 또는 P인 경우 3이고, X¹이 S인 경우 2이고; 그리고

R⁶기는 같거나 다르고, 수소, C_1-8알킬, C_6-12아릴 또는 아랄킬로부터 선택되거나, 또는 상기 R⁶기 중 둘 또는 세 개는 X¹과 함께 5 내지 7의 고리 원자를 가지는 포화 또는 불포화 헤테로사이클기를 형성할 수 있음.
제 2항에 있어서, R¹=R²인 조성물.
제 3항에 있어서, R¹ 및 R²는 각각 올레일 또는 올레오일이고, R⁵는 결합이고, X¹은 N이고 그리고 각 R⁶는 메틸인 조성물.
제 1항에 있어서, 양이온성 화합물이 콜레스테롤-3β-N-(디메틸아미노에틸)카바메이트인 조성물.
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