CN1376056A - 脂质体包封的dna口服疫苗 - Google Patents
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Abstract
一种口服疫苗,包括脂质体和结合或优选包裹于脂质体中可有效编码抗原的DNA,其中脂质体由包括阳离子化合物和两性离子型磷脂的组分所制得。所述脂质体形成化合物中的疏水基必须包括至少一种饱和基团,这提高了化合物的相变温度,使脂质体在口服给药中更加稳定。研究表明,该组合物可提高分泌型免疫球蛋白IgA的水平,这对于实施有效的口服疫苗给药是关键的。
Description
本发明涉及包括阳离子脂质体和结合或包裹于脂质体中的核酸的口服疫苗,所述核酸是一种基因疫苗,它可有效地编码诱发期望免疫反应的抗原。
WO-A-9810748描述一种含有基因疫苗,它含有可有效地编码诱发期望免疫反应的抗原的核酸,所述核酸是包裹于脂质体中的。其中脂质体由包括阳离子类脂的组分所制得。该组合物据称适于经口服给药,但是在其实施例却采用了肌内、皮下、静脉内或腹膜内途径给药。
该组合物与肠道中的淋巴系统作用,才能使口服给予的疫苗产生免疫应答。因此,疫苗在胃肠道中必须稳定,并且必须在被胆盐破坏以前保持足够的稳定性以便与系统中的有关细胞作用。很明显,口服给予疫苗比注射可取。本发明涉及适于口服给予疫苗的组合物、和经口服给予疫苗而对人类或非人类动物进行预防接种的方法。
首先,本发明提供了一种新型疫苗,其中包括结合和/或包裹于脂质体中可有效地编码抗原的核酸,所述脂质体由包括以下物质的组分所制得:
a)至少一种式I阳离子化合物,
R1OCH2CH(OR2)CH2R5X1R6 n I
其中R1和R2相同或不同,选自式CH3(CH2)a(CH=CH-CH2)b(CH2)c(CO)d -
其中b为0-6,每一a和c选自0-23,(a+C+3b)为12-23,和d为0或1;
R5为化学键或C1-8亚烷基(alkanediyl)C1-4烷氧基-C1-4烷基基团,或C1-8氧-亚烷基基团;
X1为N、P或S;
X1为N或P时n为3,X1为S时n为2;和
基团R6相同或不同,选自氢、C1-8烷基、C6-12芳香基或芳烷基,或者2或3个基团R6与X1形成饱和或不饱和的5-7元杂环基团;
其中R3和R4相同或不同,选自式CH3(CH2)e(CH=CH-CH2)f(CH2)g -,
其中f为0-6,每一e和g为0-23,和(e+g+3f)为12-23;
R7为C1-8亚烷基基团;
Y为-O-或化学键;
X2为N、P或S;
X2为N或P时m为3,X2为S时m为2;和
基团R8相同或不同,选自氢、C1-8烷基、C6-11芳香基或芳烷基,或者2或3个基团R8与X2可形成饱和或不饱和的5-7元杂环基团;
其条件是R1、R2、R3和R4中的至少一种基团的b或f为0。
所述组合物优选为口服疫苗,本发明还涉及经口服给予疫苗的方法。该组合物可包括药用稀释剂,及可提高疫苗免疫原性能的组分例如常规佐剂。
在本发明中,条件是R1、R2、R3和R4中的至少一种基团具有饱和长烷基链,这可使组合物具有相对高的相变温度。这样,可使脂质体形成组分的混合物的相变温度至少为37℃,优选为38-50℃。
在另一个优选实施方案中,基团R1和R2可彼此相同,基团R3和R4也彼此相同。我们发现,R1、R2为不饱和基团而R3、R4是饱和基团时是可取的,反之亦然。阳离子化合物包括单一的式I化合物。
在一个特定实施方案中,本发明脂质体形成组分中采用了式II中不同结构的两种两性离子型磷脂。
在一个实施方案,采用了这样的化合物,其中第一种两性离子型磷脂的基团R3和R4相同,其中f为1,e+g为14-20、优选14-18。优选不饱和基团位于R3或R4的中间,即e≈9,优选e=g=7。烯键一般为顺式。
在另一实施方案,混合物中的第一种磷脂采用了磷脂混合物,其中基团R8相同且优选均为氢。在式II的第二种磷脂中,基团R8均为C1-4-烷基。在该实施方案中,两种磷脂的f一般为0。
通常,在上述采用第一与第二磷脂混合物的两个实施方案中,Y为0和X2为N。此外,R7优选为C2-3-亚烷基。
在式I的阳离子化合物中,疏水基R1和R2可通过醚键(d=0)或酯键(d=1)与分子其他部分连接。优选式I化合物中的R5为C1-4-亚烷基。优选所述阳离子化合物主要为阳离子,即在似于体内pH5-9的条件下基本上完全电离。优选每个基团R6不是氢而是C1-4-烷基,最优选每个基团R6为甲基。
R5优选为化学键或亚甲基。
在一个特别优选实施方案中,本发明组合物使用了式I所示的阳离子化合物(1,2-二(油酰氧基)-3-(三甲氨基)丙烷(DOTAP)),其中每个基团R1和R2为油酰基,基团R5为化学键,X1为N和每个基团R6为甲基。另一阳离子化合物为其相似化合物,其中以油基取代疏水性油酰基,即用醚键而非酯键连接。含有饱和疏水基的适宜阳离子化合物为1,2-二(十六烷基氧基)-3-三甲铵丙烷(BisHOP)。
适宜的两性离子型磷脂包括二油酰氧基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰氧基磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二硬脂酰氧基磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)及其混合物。两性离子型磷脂混合物特别优选包括二硬脂酰磷脂酰胆碱和二油酰磷脂酰乙醇胺。
两种两性离子型磷脂的混合物通常包括重量比为10∶1-1∶10、最优选为5∶1-1∶5、更优选2∶1-1∶2的两种化合物。优选混合物中饱和基团R3和R4的比例至少为50%。
通常, 阳离子化合物与两性离子型磷脂(总量)的比例为10∶1-1∶20、更优选为5∶1-1∶10、更优选为1∶1-1∶5。
本发明另一方面提供了一种口服疫苗,其中包括结合和/或包裹于脂质体中可编码抗原的核酸,所述脂质体形成组分包括至少一种甘油类脂(glycerolipid)、至少一种阳离子化合物和至少一种两性离子型磷脂,其特征在于所述甘油类脂为O,O’-二烷酰基或O,O’-二烷基磷脂。优选甘油类脂为上述式II化合物,其中R3和R4的f均为0。
在本发明所有方面中,联用的脂质体形成组分的相变温度优选至少为37℃。采用差示扫描量热法测定相变温度。
在这方面,本发明两性离子型磷脂优选包括类脂混合物,例如包括饱和与不饱和类脂的混合物,和/或磷脂酰胆碱与磷脂酰乙醇胺的混合物。
阳离子化合物优选为2,3-二(酰氧基或烷氧基)取代的丙胺衍生物,例如具有式I结构的化合物。另外,化合物可由简单的阳离子两亲化合物例如单-或-硬脂胺或其他长链烷基胺,或其分别具有1、2或3个N-低级烷基(C1-4-烷基)取代基的仲、叔或季铵衍生物制得,例如二甲基双十八卤化铵。另一类适于掺入脂质体中的两亲阳离子化合物,是与二(脂酰)甘油酯或N,N-二(C12-24)烷基酰基酰胺化合物结合的精胺共轭物、或者3β-[N-(N’,N’-二甲基氨基乙基)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-chol)。一些适宜的阳离子两亲化合物可参见KabanovA.V.等在BioconjugateChem.(1995),6(1),7-20中的描述,其公开内容在此引入作为参考。
本发明另一方面提供了一种口服疫苗,其中包括结合和/或包裹于脂质体中可编码抗原的核酸,所述脂质体形成组分包括至少一种阳离子化合物和至少一种两性离子型磷脂,其特征在于所述脂质体形成组分包括至少25摩尔%、优选至少50摩尔%的独立相变温度高于40℃的化合物。
在这方面,本发明中具有高相变温度的脂类化合物的含量相对较高,这样就使脂质体形成组分混合物的相变温度高于37℃。混合物的相变温度应接近于每种化合物相变温度的均值。一般很容易测定每种化合物的相变温度,并且许多化合物的相变温度是已知的。高相变温度的两性离子型磷脂优选为DPPC(Tc=41.4℃)、DSPC(Tc=55.1℃)、DPPE(Tc=64℃)和DSPE(Tc=74.2℃)。
在本发明脂质体形成组分的混合物中,还可含有其他组分例如高达50%重量的胆固醇。优选脂质体形成组分中不含胆固醇。
优选地,阳离化合物的用量占脂质体形成组分总量的5-50%、优选为10-25%摩尔。
通常,脂质体组合物为水性混悬液例如生理缓冲液的形式,也可以是需进一步再水合处理的干燥组合物形式。
可采用任何脂质体制备技术制备本发明脂质体。本发明脂质体可以是多层或单层囊泡,可以是较大(囊泡直径为300-2000nm,优选其平均粒径为500-1000nm)或者较小(囊泡直径为100-400nm,优选其平均粒径为200-300nm)。优选脂质体的平均粒径不超过1000nm,优选基本上所有的直径小于2000nm。最优选平均粒径为200-750nm。
在本发明新颖的组合物中,与脂质体结合的核酸可复合于脂质体的外部。但是,优选至少部分核酸处于被包裹状态。
优选采用可形成囊泡的方法制备脂质体,然后与待包裹的核酸混合,再脱水,优选采用冻干法脱水,最后于水性组合物中再水化而形成干燥-再水化(dehydration-rehydration)囊泡(DRV’s),所得的DRV’s可任选进行微流化处理以降低其平均粒径。但是,优选DRV’s不进行微流化处理,或仅进行1或2个微流化循环。尽管以下步骤不是必须的,但仍优选在再水合和/或微流化步骤后,采用离心或分子筛色谱法从脂质体中除去未包裹的物质。
另一发明,本发明提供了用脂质体包裹多核苷酸的方法,包括以下步骤:
i)制备含有裸露多核苷酸和预制脂质体的水性混悬液,其中多核苷酸可有效地编码免疫原性多肽,该多肽可用于诱发人或动物受试者产生期望的免疫应答,所述脂质体采用上述新颖的化合物制得;
ii)冻干或喷雾干燥混悬液;和
iii)再水化步骤ii)的产品,得到干燥/再水化囊泡。
其他并非必要的步骤包括:
iv)将步骤iii)的干燥/再水化囊泡水性混悬液进行微流化处理以控制其大小;和/或
v)任选将未包裹的多核苷酸从脂质体中分离出来。
通常,步骤iv)对于干燥/再水化囊泡是不必要的。
最后步骤也是不必要的,因为外部核酸结合于阳离子脂质体上,一定程度上可防止环境的破坏。
有关干燥-再水化法的步骤,大体上可参见Kirby和Gregoriadis在(1984)Biotechnology,2,979-984中的描述,其公开内容在此引入作为参考。因此,步骤i)中的脂质体优选为小单层(SUV’s)(尽管其中也含有如2μm大小的MLV’s),步骤iii)中所制得的脂质体优选为多层脂质体(MLV’s)。步骤iii)制得的脂质体产品通常称为“干燥-再水化囊泡”(DRV’s)。
对DRV’s进行微流化处理的方法,大体上可见WO-A-92/04009中的描述,其公开内容在此引入作为参考,和Gregoriadis等在(1990),Int.J.Pharm.65,235-242中的描述。如上所述,如果采用微流化处理,优选不超过1或2个流化循环。
本发明无需通过对形成脂质体成分进行聚合处理来提高其相变温度。聚合反应是制备中不必要的附加步骤,而且有可能使活性物质的传递效率下降。
采用上述DRV技术,在干燥步骤中可将水性混悬液中高达90%或甚至更高的多核苷酸包裹和/或结合于脂质体中。包裹和/或结合于脂质体组合物中的多核苷酸浓度优选为0.05-100、优选1-50、更优选为5-50μg/微摩尔类酯。
研究表明,本发明脂质体组合物具有抗胆盐作用,可使之在胃肠道中保持稳定。
核酸活性分子可以是RNA,例如在合成抗原时可直接转录和转译的RNA,或者是必须首先逆转录成供复制的DNA。核酸优选为复制DNA,并可转录和转译成特异抗原。所述DNA优选为双链质粒DNA。
本发明还包括所述脂质体组合物或按本发明方法制备的组合物在制备用于治疗或预防的组合物中的用途。例如,所述方法可以是对人类受治疗者进行免疫(接种疫苗)以抗微生物所致的感染。另外,用于免疫治疗例如治疗癌症或其他疾病包括感染的基因产品也可用来产生免疫应答。
下面实施例将对本发明作进一步说明:
实施例1
方法学:口服免疫实验1
制备脂质体
采用下述组合物,用干燥-再水化法(DRV)制备脂质体:
1)32微摩尔蛋黄磷脂酰胆碱(PC),(二脂肪酰基磷脂酰胆碱的混合物,包括某些饱和基团)
16微摩尔二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE),
8微摩尔二油酰三甲铵丙烷(DOTAP)。
2)32微摩尔二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC),
16微摩尔DOPE,
8微摩尔DOTAP。
3)32微摩尔DSPC,
16摩尔胆固醇(CHOL),
8微摩尔DOTAP。
采用以下技术,将600μg可编码乙型肝炎表面抗原S(小)区(HBsAg;ayw亚型)的pRc/CMV HBS质粒DNA包裹于上述脂质体制剂中。
采用干燥-再水化法(Kirby和Gregoriadis,(1984)op.Cit.),将pRc/CMV HBS质粒DNA掺入脂质体中。简言之,是将特定的脂质体形成组分与质粒DNA混合,于-20℃冷冻并冻干过夜,制得2ml小单层囊泡(SUV)。然后对脂质体进行控制再水合而形成多层干燥-再水化囊泡(DRV)(Gregoriadis等,(1993)Biochim.Biophys.Acta1147,185-193)。产品无需除掉未包封DNA的步骤,产品中可能含有结合于脂质体外部的DNA。无需进行微流化处理。
经35S-dATP制得的35S-标记DNA测得,每种组合物的包裹率/结合率为85-95%,DRV’s的平均直径为550-750nm。
免疫
采用以Roy,K.等(1999)NatureMedicine5(4)387-391为基础的方法。
每组为4只雌性Balb/c小鼠(20-24g),用连有1ml注射器的动物进料针,经口服给予“裸露(即未经包裹的)”DNA(第4组)或脂质体包裹的DNA(1-3组)进行免疫。于第0、28和38天,给予每只小鼠500μl含有100μgDNA的磷酸缓冲盐(PBS)。
免疫组:
1)PC:DOPE:DOTAP(100μgDNA)(本发明)
2)DSPC:DOPE:DOTAP(100μgDNA)(本发明)
3)DSPC:CHOL:DOTAP(100μgDNA)(本发明)
4)“裸露”DNA(100μgDNA)(参考)
5)对照品(不含DNA)
从粪便沉淀物中提取IgA
于第0、14、21、32、40、48、62、84、96和119天,从鼠笼中收集粪便(foecal)沉淀物。
将沉淀物混悬于PBS中,浓度为100mg/ml,离心后取上清液(含有IgA)用于分析。
ELISA测量
对粪便提取物进行ELISA分析,测定分泌的IgA。平皿用乙型肝炎表面抗原S(小)区(HBsAg;ayw亚型)包被,用1%BSA封闭以避免非特异性结合,然后将加入双份沉淀物提取物(未稀释)。加入辣根过氧化物酶偶联的山羊抗-鼠IgA,然后加入邻苯二胺底物。于450nm处测定吸光度。结果见图1a-i,为每组小鼠两次测定的均值。
实施例2
方法学:口服免疫实验2
制备脂质体
采用下述组合物,用干燥-再水化(DRV)法制备脂质体:
1)32微摩尔DSPC,
16微摩尔DOPE,
8微摩尔DOTAP。
2)32微摩尔DSPC,
16微摩尔二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE),
8微摩尔DOTAP。
3)32微摩尔DSPC,
16摩尔二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE),
8微摩尔DOTAP。
4)32微摩尔DSPC,
16微摩尔DOPE。
按实施例1方法,将pRc/CMV HBS质粒DNA包裹于上述脂质体制剂中。DRV组合物1、2和3包裹了85-95%所用的DNA。非阳离子DRV脂质体(组合物4)的包裹率为45-55%(所用的DNA总量)。该DRV脂质体的粒径同实施例1。
免疫
每组为4只雌性Balb/c小鼠(20-24g),用连有1ml注射器的动物进料针,经口服给予“裸露”DNA(第6组)或脂质体包裹的DNA(1-5组)进行免疫。于第0和32天,给予每只小鼠500μl含有50μg(第5组)或100μg(1-4和6组)DNA的PBS。
免疫组:
1)DSPC:DOPE:DOTAP(100μgDNA)(本发明)
2)DSPC:DSPE:DOTAP(100μgDNA)(本发明)
3)DSPC:DPPE:DOTAP(100μgDNA)(本发明)
4)DSPC:DOPE(100μgDNA)(参考)
5)DSPC:DOPE:DOTAP(50μgDNA)(本发明)
6)“裸露”DNA(100μgDNA)
7)对照品(不含DNA)
从粪便沉淀物中提取IgA
于第0、42、55、65和92天,从鼠笼中收集粪便沉淀物。将沉淀物混悬于PBS中,浓度为100mg/ml,离心后取上清液(含有IgA)用于分析。
ELISA测量
对粪便提取物进行ELISA分析,测定第一次口服免疫实验的分泌型IgA。结果见图2a-d,为每组小鼠两次测量的均值。
口服免疫实验3
该实验研究了脂质体组合物对脂质体介导口服免疫的影响。对以下两种因素进行了测量:
1)磷脂酰胆碱和胆固醇组合处于双层膜中的影响;
2)用胆固醇3β-N-(二甲基氨基乙基)氨基甲酰基(DC-Chol)代替阳离子二油酰三甲铵丙烷的影响。
方法学:
制备脂质体
按实施例1方法,采用下述组合物,用干燥-再水化(DRV)法制备脂质体:
1)32微摩尔磷脂酰胆碱(PC),
16微摩尔二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE),
8微摩尔二油酰三甲铵丙烷(DOTAP)。
2)32微摩尔二硬脂酰磷脂胆碱(DSPC),
16微摩尔DOPE,
8微摩尔DOTAP。
3)32微摩尔PC,
16摩尔胆固醇(CHOL),
8微摩尔DOTAP。
4)32微摩尔DSPC,
16微摩尔胆固醇(CHOL),
8微摩尔胆固醇3β-N-(二甲基氨基乙基)氨基甲酰基(DC-Chol)。
将600μg可编码乙型肝炎表面抗原S(小)区(HBsAg;ayw亚型)的pRc/CMV HBS质粒DNA包裹于上述脂质体制剂中。每组组合物的包裹率为85-95%。该DRV脂质体的粒径同实施例1。
免疫
每组为4只雌性Balb/c小鼠(20-24g),用连有1ml注射器的动物进料针,经口服给予“裸露”DNA(第4组)或脂质体包裹的DNA(1-4组)进行免疫。于第0、28和38天,给予每只小鼠500μl含有100μgDNA的PBS。
免疫组:
1)PC:DOPE:DOTAP(100μgDNA)
2)DSPC:DOPE:DOTAP(100μgDNA)
3)PC:CHOL:DOTAP(1001ugDNA)
4)DSPC:DOPE:DC-Chol(100μgDNA)
5)“裸露”DNA(100μgDNA)
从粪便沉淀物中提取IgA
于第0、30、45、60和70天,从鼠笼中收集粪便沉淀物。将沉淀物混悬于PBS中,浓度为100mg/ml,离心后取上清液(含有IgA)用于分析。
ELISA测量
对粪便提取物进行ELISA分析,测定分泌型IgA。平皿用乙型肝炎表面抗原S(小)区(HBsAg;ayw亚型)包被,用1%BSA封闭以避免非特异性结合,然后加入双份沉淀物提取物(未稀释)。加入辣根过氧化物酶偶联的山羊抗-鼠IgA,然后加入邻苯二胺底物。于450nm处测定吸光度。结果为每组小鼠两次测定的均值。
结果
分别于给予首剂量后的第60和70天测定分泌型IgA免疫应答,结果如图1和2所示。结果表明,含有DPSC:DOPE:DOTAP的DRV在上述时间点均加强了口服免疫小鼠最高应答。用DC-CHOL代替阳离子类脂DOTAP而制备的脂质体,经包裹的DNA的抗-HBsAgIgA免疫应答降低。另外,在介导免疫应答方面,PC:CHOL:DOTAP脂质体不如DPSC:DOPE:DOTAP有效。
结论
从实施例1-3得出的结论是,上述实验是可重复的。另外,较低水平的包裹DNA即可提供足够用于免疫应答的转染率(比较实施例2的1和5组)。饱和类酯制备的脂质体似乎具有更好的性能。
实施例4
口服施用后报告基因表达
目标
口服给予小鼠裸露的或脂质体包裹的可编码荧光绿蛋白报道基因(pCMV.efgp)的质粒DNA后,比较它们在鼠肠系膜淋巴结中的表达水平。如果报道基因被表达,则在收集的淋巴结中出现可见绿蛋白,这表明DNA达到肠系膜淋巴结,并被胞饮和表达。抗原提呈细胞位于淋巴结,基因疫苗产生免疫应答的靶。
方法学:
制备脂质体
按实施例1所述的干燥-再水化(DRV)方法,制备含有32微摩尔DSPC、16微摩尔DOPE、8微摩尔DOTAP的脂质体,将600μg的pCMV.efgp质粒DNA包裹于上述脂质体中。
给药和测定基因表达
用连有1ml注射器的动物进料针,将“裸露”DNA或脂质体包裹的DNA经口服给予2只雌性Balb/c小鼠(20-24g)。给予每只小鼠500μl含有100μgDNA的PBS。于给药44小时后,取给药小鼠和对照(幼)鼠采集肠系膜淋巴结。用Tissue-Teck(Miles公司,美国),将收集的新鲜淋巴结置于恒冷切片机中,然后用液氮冷冻。用Slee恒冷切片机切成20μm切片。于Nikon微光显微镜下,用入射荧光和Kodakektachrome4000ASA拍摄图像。
结果和结论
与给予裸露pCMV.efgp的小鼠(图3b)和幼鼠淋巴结切片中的本底水平(图3c)相比,给予脂质体包裹pCMV.efgp的小鼠肠系膜淋巴结中可观察到较高水平质粒编码的荧光绿蛋白(图4a)。由此可以推断出,经口服给予的DNA被清除(clear)到肠系膜淋巴结,并且用含有饱和类酯的阳离子脂质体包裹可提高报告基因在肠系膜淋巴结中的表达率。这与用含有饱和类酯的阳离子脂质体包裹可提高免疫应答的结果相一致。
Claims (20)
1.一种口服疫苗,包括结合或包裹于脂质体中可有效编码抗原的核酸,其中脂质体由包括以下物质的组分所制得:
a)至少一种式I阳离子化合物,
R1OCH2CH(OR2)CH2R5X1R6 n I
其中R1和R2相同或不同,选自式CH3(CH2)a(CH=CH-CH2)b(CH2)c(CO)d -
其中b为0-6,每一a和c选自0-23,(a+C+3b)为12-23,和d为0或1;
R5为化学键或C1-8亚烷基基团;
X1为N、P或S;
X1为N或P时n为3,X1为S时n为2;和
基团R6相同或不同,选自氢、C1-8烷基、C6-12芳香基或芳烷基,或者2或3个基团R6与X1形成的饱和或不饱和5-7元杂环基团;
其中R3和R4相同或不同,选自式CH3(CH2)e(CH=CH-CH2)f(CH2)g -,
其中f为0-6,每一e和g为0-23,和(e+g+3f)为12-23;
R7为C1-8亚烷基基团;
Y为-O-或化学键;
X2为N、P或S;
X2为N或P时m为3,X2为S时m为2;和
基团R8相同或不同,选自氢、C1-8烷基、C6-11芳香基或芳烷基,或者2或3个基团R8与X2可形成的饱和或不饱和5-7元杂环基团;
其条件是R1、R2、R3和R4中至少一种基团的b或f为0。
2.如权利要求1的疫苗,其中R1=R2和R3=R4。
3.如权利要求2的疫苗,其中R1和R2代表与R3和R4不同的基团。
4.如权利要求2和3的疫苗,其中R1和R2的b=1和(a+C)为10-20。
5.如权利要求2-4之一的疫苗,其中d=0。
6.如权利要求2-5之一的疫苗,其中f=0。
7.如前述任一权利要求的疫苗,其中X1为N和R6均为C1-4烷基。
8.如前述任一权利要求的疫苗,包括式II的两种两性离子型磷脂,其中Y为O和X2为N,其中第一磷脂上的基团R8均为氢和第二磷脂上的基团R8均为C1-4烷基、优选为甲基。
9.如权利要求8的疫苗,其中每一磷脂中的Y为O和R7为(CH2)h,其中h为2或3。
10.如权利要求8或9的疫苗,其中第一磷脂的基团R3和R4相同,并且每个基团中的f=1和(e+g)为10-20、优选12-14。
11.如权利要求8-10之一的疫苗,其中第二磷脂的基团R3和R4相同,并且每个基团中的f=0和e+g为15-23、优选15-17。
12.一种口服疫苗,包括结合或包裹于脂质体中可有效编码抗原的核酸,其中脂质体形成组分包括至少一种甘油类脂,至少一种阳离子化合物和至少一种两性离子型磷脂,其特征在于所述至少一种甘油类脂为O’O-二烷酰基或O,O-二烷基磷脂。
13.如权利要求12的疫苗,所述甘油类脂为权利要求1所定义的式II化合物,其中R3和R4的f均为0。
14.一种口服疫苗,包括结合和/或包裹于脂质体中可有效编码抗原的核酸,其中脂质体形成组分包括至少一种阳离子化合物和至少一种两性离子型磷脂,其特征在于脂质体形成组分包括至少25摩尔%、优选至少50摩尔%的独立相变温度高于40℃的化合物。
15.如权利要求12-14之一的疫苗,其中两性离子型磷脂选自二硬脂酰磷脂胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺及它们的混合物。
16.如权利要求12-15之一的疫苗,其中阳离子化合物为 1所定义的式I化合物。
17.如权利要求12-15之一的疫苗,其中阳离子化合物DC-胆固醇。
18.用于人类或非人类动物预防接种的方法,包括经口服给予如前述任一权利要求的疫苗,而产生针对编码抗原的免疫应答。
19.将多核苷酸包封到脂质体的方法,包括:
i)制备含有裸露多核苷酸和预制脂质体的水性混悬液,其中多核苷酸可有效地编码用于诱导人或动物受治疗者产生期望免疫应答的免疫原性多肽,所述脂质体由如权利要求1、12或14所定义的脂质体形成组分制得,
ii)冻干或喷雾干燥混悬液;和
iii)水合步骤ii)的产品,得到干燥/再水化囊泡。
20.如权利要求19的方法,还包括:
iv)将步骤iii)的干燥/再水化囊泡水性混悬液进行微流化处理以控制其大小;和
v)任选从脂质体中除去未包裹的多核苷酸。
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