JP2003529550A - リポソーム封入されたｄｎａ経口ワクチン - Google Patents

リポソーム封入されたｄｎａ経口ワクチン

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Abstract

(57)【要約】 リポソームならびに複合化されているかまたは好ましくは封入されている抗原を作動可能にコードするＤＮＡを含む経口ワクチンであって、ここで、リポソームが、カチオン性化合物および双性イオン性リン脂質を含む成分から形成さている。リポソーム形成化合物内の疎水基は、少なくとも１つの飽和された基を含まなければならない。これは、遷移温度を上昇させ、経口送達される場合にリポソームをより安定にすると考えられる。組成物は、有効な経口ワクチン送達において重要な、検出可能な、ＩｇＡレベルが増加した、分泌免疫グロブリンを与えることが分かった。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、カチオン性リポソームおよび、該リポソームと複合化される（comp
lexed）かまたはこの中に封入された（entrapped）、遺伝子ワクチン、すなわち
ワクチン接種が望まれる抗原をコードする核酸を含む経口ワクチンに関する。
【０００２】 WO-A-9810748において、ワクチン接種が必要とされる抗原をコードする核酸を
含む遺伝子ワクチンが記載され、そこでは、核酸がリポソーム中に封入されてい
る。リポソームは、カチオン性脂質を含むリポソーム形成成分から形成される。
組成物は、とりわけ経口経路による投与に好適であると述べられているが、実施
例において、組成物は、筋肉内、皮下、静脈内または腹腔内で投与されている。
【０００３】 ワクチンが経口投与に続いて免疫応答を発生させるために、組成物は、消化管
（gut）においてリンパ系と相互作用しなければならない。従って、ワクチンは
、ＧＩ管において安定でなければならず、そして胆汁酸塩によって破壊される前
に該系の関連細胞と相互作用するに十分に安定でなければならない。明らかに、
ワクチンが注射されなければならないよりむしろ経口投与され得ることが望まし
い。本発明は、経口投与に好適である組成物、ならびに該ワクチンの経口投与に
よってヒトまたは非ヒト動物をワクチン接種するための経口ワクチンおよび方法
に関する。
【０００４】 本発明の第１局面によれば、以下を含むリポソーム形成成分から形成されるリ
ポソームと複合化されおよび／またはこの中に封入された、抗原を作動可能にコ
ードする核酸を含む新規のワクチンを提供する： ａ）一般式Ｉを有する少なくとも１つのカチオン性化合物 Ｒ1ＯＣＨ2ＣＨ（ＯＲ2）ＣＨ2Ｒ5Ｘ1Ｒ6 n Ｉ ここで、Ｒ1およびＲ2は同一かまたは異なり、そして式ＣＨ3（ＣＨ2）a（Ｃ
Ｈ＝ＣＨ−ＣＨ2）b（ＣＨ2）c（ＣＯ）d−の群から選択され、 ここで、ｂは０〜６であり、ａおよびｃは各々０〜２３から選択され、そして
（ａ＋ｃ＋３ｂ）は１２〜２３の範囲にあり、そしてｄは０または１であり； Ｒ5は、結合あるいはＣ1-8アルカンジイル基 Ｃ1-4アルコキシ -Ｃ1-4アル
キル基、またはＣ1-8オキシ−アルキレン基であり； Ｘ1はＮ、ＰまたはＳであり； ｎは、Ｘ1がＮまたはＰである場合に３であり、そしてＸ1がＳである場合に２
であり；そして 基Ｒ6は同一かまたは異なり、そして水素、Ｃ1-8アルキル、Ｃ6-12アリールま
たはアラルキルから選択されるか、あるいは２または３の基Ｒ6が、Ｘ1と一緒に
なって、５〜７環原子を有する飽和または不飽和ヘテロ環式基を形成し得る； ｂ）一般式IIを有する少なくとも１つの双性イオン性リン脂質
【０００５】
【化２】
【０００６】 ここで、Ｒ3およびＲ4は同一かまたは異なり、そして式ＣＨ3（ＣＨ2）e（Ｃ
Ｈ＝ＣＨ−ＣＨ2）f（ＣＨ2）g−の群から選択され、 ここで、ｆは０〜６であり、ｅおよびｇの各々は０〜２３であり、そして（ｅ
＋ｇ＋３ｆ）が１２〜２３の範囲にあり； Ｒ7はＣ1-8アルカンジイル基であり； Ｙは−Ｏ−または結合であり； Ｘ2はＮ、ＰまたはＳであり； ｍは、Ｘ2がＮまたはＰである場合に３であり、そしてＸ2がＳである場合に２
であり；そして 基Ｒ8は同一かまたは異なり、そして水素、Ｃ1-8アルキル、Ｃ6-11アリールま
たはアラルキルからなる群から選択されるか、あるいは２または３の基Ｒ8が、
Ｘ2と一緒になって、５〜７環原子を有する飽和または不飽和のヘテロ環式基を
形成し得る； 但し、基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4の少なくとも１つにおいて、ｂまたはｆは、
場合によっては、０である。
【０００７】 組成物は、好ましくは経口ワクチンであり、そして本発明はまた、経口経路に
よって該ワクチンを投与する方法を包含する。組成物は、薬学的に許容される希
釈剤を含み得、そして該ワクチンの免疫原性特性を増強する成分、例えば慣用の
アジュバントを含み得る。
【０００８】 本発明において、基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4の少なくとも１つは、飽和長鎖ア
ルキル基を有するべきであるという条件は、比較的高い遷移温度を有する組成物
を提供する傾向にある。従って、リポソーム形成成分は、混合状態で、少なくと
も３７℃、好ましくは３８〜５０℃の範囲内の遷移温度を有するべきである。
【０００９】 基Ｒ1およびＲ2が互いに同一であり、そして基Ｒ3およびＲ4が互いに同一であ
ることが好ましい。一般的に、本発明者らは、Ｒ1およびＲ2が不飽和でありそし
てＲ3およびＲ4が飽和であるか、あるいはその逆のいすれかであることが望まし
いことを見出した。好ましくは、カチオン性化合物は、式Ｉの単一の化合物を含
む。
【００１０】 本発明の特定の実施形態において、式II内で各々、異なる式を有する２つの双
性イオン性リン脂質が、リポソーム形成成分に使用される。
【００１１】 このような混合物が使用される１つの実施形態において、第１双性イオン性リ
ン脂質において、基Ｒ3およびＲ4は同一であり、そして各々は、ｆが１であり、
そしてここでｅ＋ｇが１４〜２０の範囲内、好ましくは１４〜１８の範囲内であ
る、基を示す。好ましくは、不飽和基は、
【００１２】
【数１】
【００１３】 好ましくはｅ＝ｇ＝７であるＲ3またはＲ4の中央にある。通常、エチレン性結合
はｃｉｓである。
【００１４】 リン脂質の混合物が使用される第２の実施形態において、混合物の第１リン脂
質において、基Ｒ8は、好ましくは全て同一であり、そして好ましくは水素であ
る。式IIの第２リン脂質において、基Ｒ8は全て同一であり、そしてＣ1-4−アル
キルである。しばしばこの実施形態において、両方のリン脂質について、ｆは０
である。
【００１５】 一般的に、リン脂質の混合物を使用する両方の実施形態において、第１および
第２リン脂質の両方において、ＹはＯであり、そしてＸ2はＮである。さらに、
Ｒ7は、好ましくはＣ2-3−アルカンジイルである。
【００１６】 式Ｉのカチオン性化合物において、疎水基Ｒ1およびＲ2は、エーテル結合（す
なわち、ｄは０である）またはエステル結合（ここでｄは１である）を介して残
りの分子へ結合され得る。好ましくは、式Ｉの化合物において、Ｒ5はＣ1-4−ア
ルカンジイルである。好ましくは、カチオン性化合物は、永久的にカチオン性で
あり、すなわちインビボで直面しそうな全ｐＨ、５〜９の範囲内で、実質的に完
全にイオン化されている。好ましくは、基Ｒ6の各々は、水素以外であり、従っ
て、特にはＣ1-4−アルキル、最も好ましくは各基Ｒ6はメチルである。
【００１７】 Ｒ5は、好ましくは、結合またはメチレン基である。
【００１８】 本発明の組成物の特に好ましい実施形態は、基Ｒ1およびＲ2の各々がオレオイ
ル基であり、そして、基Ｒ5が結合であり、Ｘ1がＮであり、そして基Ｒ6の各々
がメチル（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）
プロパン（ＤＯＴＡＰ））である、一般式Ｉのカチオン性化合物を使用する。代
替のカチオン性化合物は、疎水性オレオイル基がオレイル基で置換されている、
すなわちエステル結合ではなくてエーテル結合によって結合されている、類似化
合物である。疎水性基が飽和されている好適なカチオン性化合物は、１，２−ビ
ス（ヘキサデシルオキシ）−３−トリメチルアンミノプロパン（1,2-bis(hexade
cyloxy)-3-trimethylammino propane）（ＢｉｓＨＯＰ）である。
【００１９】 好適な双性イオン性リン脂質としては、ジオレオイルオキシホスファチジルエ
タノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレオイルオキシホスファチジルコリン（ＤＯ
ＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジステ
アロイルオキシホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチ
ジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ｄ
ＰＰＣ）、および混合物が挙げられる。特に好ましい双性イオン性リン脂質混合
物は、ジステアロイルホスファチジルコリンおよびジオレオイルホスファチジル
エタノールアミンを含む。
【００２０】 ２つの双性イオン性リン脂質の混合物は、一般的に、１０：１〜１：１０の範
囲内、最も好ましくは５：１〜１：５、より好ましくは２：１〜１：２の範囲内
の重量比で該２つの化合物を含む。好ましくは、混合物中で飽和されている基Ｒ3 およびＲ4の割合は、少なくとも５０％である。
【００２１】 一般的に、カチオン性化合物の双性イオン性リン脂質（総計）に対する比は、
１０：１〜１：２０の範囲内、より好ましくは５：１〜１：１０の範囲内、より
好ましくは１：１〜１：５の範囲内である。
【００２２】 本発明のさらなる局面によれば、少なくとも１つのグリセロ脂質、少なくとも
１つのカチオン性化合物および少なくとも１つの双性イオン性リン脂質を含むリ
ポソーム形成成分から形成されるリポソームへ複合化されおよび／またはこの中
に封入された、抗原をコードする核酸を含む経口ワクチンであって、該グリセロ
脂質がＯ，Ｏ’−ジアルカノイルまたはＯ，Ｏ’−ジアルキルリン脂質であるこ
とを特徴とする経口ワクチンが提供される。好ましくは、グリセロ脂質は、Ｒ3
およびＲ4の両方においてｆが０である、上記一般式IIの化合物である。
【００２３】 本発明の全ての局面において、組み合わせたリポソーム形成成分は、少なくと
も３７℃の遷移温度を有することが好ましい。遷移温度は、示差走査熱量測定法
によって測定される。
【００２４】 本発明のこの局面において、双性イオン性リン脂質は、好ましくは、脂質の混
合物、例えば、飽和および不飽和の脂質の混合物、および／またはホスファチジ
ルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンの混合物を含む。
【００２５】 カチオン性化合物は、好ましくは、２，３−ジ（アシルオキシまたはアルコキ
シ）置換プロピルアミン誘導体であり、例えば上記一般式Ｉを有する。あるいは
、該化合物は、例えばモノ−またはジ−ステアリルアミンもしくは他の長鎖アル
キルアミン、あるいはそれぞれ１，２または３のＮ−低級アルキル（Ｃ1-4アル
キル）置換基を有するその第２級，第３級または第４級誘導体（例えばジメチル
ジオクタデシルアンモニウムハライド）のような単一のカチオン性両親媒性化合
物から形成され得る。リポソーム中へ組み込むに好適である別のカテゴリーの両
親媒性カチオン性化合物は、ジ（脂肪アシル）グリセリドまたはＮ，Ｎ−ジ（Ｃ12-24 ）アルキルアシルアミド化合物または３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチ
ルアミノエタン）−カルバミル］コレステロール（ＤＣ ｃｈｏｌ）とのスペル
ミン複合体である。好適なカチオン性両親媒性化合物の範囲は、Kabanov A. V.
らによってBioconjugate Chem. (1995), 6 (1), 7-20において記載され、この内
容は、本明細書中で参考として援用される。
【００２６】 本発明のさらなる局面によれば、少なくとも１つのカチオン性化合物および少
なくとも１つの双性イオン性リン脂質を含むリポソーム形成成分から形成される
リポソームへ複合化されおよび／またはこの中に封入された、抗原をコードする
核酸を含む経口ワクチンであって、該リポソーム形成成分が、４０℃を超える遷
移温度を個々に有する成分を少なくとも２５モル％、好ましくは少なくとも５０
モル％含むことを特徴とする、経口ワクチンが提供される。
【００２７】 本発明のこの局面において、比較的高いレベルの高遷移温度脂質性成分を使用
することの効果は、成分を使用する場合のリポソームの混合物の遷移温度が３７
℃を超えることである。混合物の遷移温度は、個々の成分の平均化遷移温度に近
くなる傾向にある。しかし、一般的に、個々の成分の遷移温度を決定することは
より容易であり、これらの多くについての値は公知である。好ましい高遷移温度
双性イオン性リン脂質は、ＤＰＰＣ（Ｔc ４１．４℃）、ＤＳＰＣ（Ｔc ５５
．１℃）、ＤＰＰＥ（Ｔc ６４℃）およびＤＳＰＥ（Ｔc ７４．２℃）である
。
【００２８】 本発明の全ての局面において、他の成分（例えば、コレステロール）は、リポ
ソーム形成混合物中に、５０重量％までの量で含まれ得る。好ましくは、リポソ
ーム形成成分は、コレステロールを含まない。
【００２９】 カチオン性化合物の量は、好ましくは、リポソーム形成成分の総モルの５〜５
０％の範囲内、好ましくは１０〜２５％モルの範囲内である。
【００３０】 リポソーム組成物は、一般的に、水性懸濁液、例えば生理的緩衝液の形態であ
る。あるいは、それは、再水和のために乾燥された組成物であり得る。
【００３１】 リポソームは、任意の一般的に使用されるリポソーム形成技術によって作製さ
れ得る。プロダクトリポソームは、多層または単層小胞であり得、そして比較的
大きいか（３００ｎｍ〜２０００ｎｍの範囲内の小胞直径、好ましくは５００〜
１０００ｎｍの範囲内の平均直径を有する）、または小さい（１００ｎｍ〜４０
０ｎｍの範囲内の小胞直径、好ましくは２００〜３００ｎｍの範囲内の平均直径
を有する）ものであってもよい。好ましくは、リポソームは、１０００ｎｍを超
えない平均直径を有し、そして好ましくは実質的に全てが、２０００ｎｍ未満の
直径を有する。最も好ましくは、平均直径は、２００〜７５０ｎｍの範囲にある
。
【００３２】 新規の組成物において、核酸は、リポソームの外部に局在されてリポソームと
複合化され得る。しかし、好ましくは、核酸は、少なくとも部分的に封入される
。
【００３３】 好ましくは、リポソームは、小胞が形成され、封入される核酸と混合され、そ
して次いで脱水され（好ましくは、凍結乾燥による）、そして引き続いて水性組
成物において再水和されて、脱水−再水和小胞（ＤＲＶ）を作製し、必要に応じ
てＤＲＶは引き続いて平均サイズを減少させるために微細流動化（microfluidiz
ation）へ供され得る方法によって形成される。しかし、好ましくはＤＲＶは、
微細流動化へ供されないか、あるいは１または２サイクルのみの微細流動化へ供
される。好ましくは、封入されていない材料は、再水和および／または微細流動
化工程後、遠心分離または分子ふるいクロマトグラフィーによってリポソームか
ら分離されるが、これは不必要であり得る。
【００３４】 本発明のさらなる局面によれば、以下の工程： ｉ）ヒトまたは動物被験体において所望の免疫応答を誘発させるに有用な免疫
原性ポリペプチドを作動可能にコードする裸のポリヌクレオチド、および上記新
規組成物について特定したリポソーム形成成分から形成される予め形成されたリ
ポソームを含む、水性懸濁液を形成する工程、 ii）該懸濁液を凍結乾燥させるかまたは噴霧乾燥させる工程、ならびに iii）工程ii）の産物を再水和して脱水／再水和小胞を形成する工程、 を含む、ポリヌクレオチドをリポソーム中へ封入する方法が提供される。
【００３５】 行われ得るが必須ではないさらなる工程は、以下である： iv）工程iiiからの脱水再水和小胞の水性懸濁液を、微細流動化に供して、サ
イズを制御する工程；ならびに／あるいは ｖ）必要に応じて、封入されていないポリヌクレオチドをリポソームから分離
する工程。
【００３６】 工程iv）は、一般的に、脱水再水和小胞からは、不必要であると分かった。
【００３７】 最終工程は、一般的に不必要であると分かり、何故ならば、外部核酸は、カチ
オン性に帯電したリポソームへ複合化されることによって環境から部分的に保護
され得るからである。
【００３８】 工程の脱水−再水和は、実質的に、KirbyおよびGregoriadis, (1984) Biotech
nology, 2, 979-984によって記載される通りであり、この内容は、本明細書で参
考として援用される。従って、リポソームは、それぞれ、工程ｉ）におけるもの
は、好ましくは小さな単層（ＳＵＶ）（しかし、これらは、例えばサイズ２μｍ
を有するＭＬＶであり得る）であり、そして工程iii）で作製されるものは、好
ましくは多層リポソーム（ＭＬＶ）である。工程iii）のプロダクトリポソーム
は、一般的に、脱水−再水和小胞（ＤＲＶ）と呼ばれる。
【００３９】 ＤＲＶの微細流動化は、実質的にWO-A-92/04009に記載されるように行われ、
この開示は、Gregoriadisら(1990), Int. J. Pharm. 65, 235-242によりそして
本明細書で参考として援用される。上述されるように、微細流動化が行われるな
らば、２サイクルの１以下が行われることが好ましい。
【００４０】 本発明は、遷移温度を上昇させるために、リポソーム形成成分を重合すること
を含まない。これは、活性な（of active）送達速度を降下させ得、そして処理
（processing）において望まれない余分な工程である。
【００４１】 ＤＲＶ技術を使用することによって、本発明者らは、乾燥工程へ供された水性
懸濁液中に存在する９０％までまたはそれ以上のポリヌクレオチドが、リポソー
ム中へ封入されおよび／またはこれと複合化され得ることを確立した。リポソー
ム組成物におけるポリヌクレオチドの封入および／または複合化のレベルは、好
ましくは、０．０５〜１００、好ましくは１〜５０、より好ましくは５〜５０μ
ｇ／μモル脂質の範囲にある。
【００４２】 本発明のリポソーム組成物は、胆汁酸塩に耐性であると分かり、そしてこれは
、ＧＩ管における安定性に関連すると考えられる。
【００４３】 活性な核酸は、例えば抗原の合成において直接的に転写可能および翻訳可能で
あるか、または先ず逆転転写されて複製のためにＤＮＡを形成しなければならな
い、ＲＮＡであり得る。好ましくは、核酸は、好ましくは複製されてそして転写
されそして翻訳されて選択の抗原を形成する、ＤＮＡである。ＤＮＡは、好まし
くは、ｄｓプラスミドＤＮＡである。
【００４４】 本発明はまた、リポソームすなわち本発明の方法によって作製されるリポソー
ムの組成物の、治療または予防の方法における使用のための組成物の製造におけ
る使用を含む。例えば、方法は、感染性微生物による感染からヒトまたは動物被
験体を保護するためのそれの免疫化（ワクチン接種）であり得る。あるいは、免
疫応答が、例えば癌または他の疾患（感染を含む）を処置するために、免疫療法
において有用である該遺伝子産物によって発生され得る。
【００４５】 本発明は、以下の実施例においてさらに例示される。
【００４６】 実施例１ 方法：経口免疫化実験１ リポソーム調製 以下の組成を有するリポソームを、脱水−再水和法（Dehydration-Rehydratio
n method）（ＤＲＶ）を使用して調製した。
【００４７】 １）３２μモルの卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）（いくつかの飽和基含む、
ジ脂肪アシルホスファチジルコリンの混合物）、 １６μモルのジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）
、 ８μモルのジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）
。
【００４８】 ２）３２μモルのジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、 １６μモルのＤＯＰＥ、 ８μモルのＤＯＴＡＰ。
【００４９】 ３）３２μモルのＤＳＰＣ、 １６μモルのコレステロール（ＣＨＯＬ）、 ８μモルのＤＯＴＡＰ。
【００５０】 Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ表面抗原（ＨＢｓＡｇ；サブタイプａｙｗ）のＳ（ス
モール）領域をコードするｐＲｃ／ＣＭＶ ＨＢＳプラスミドＤＮＡ ６００μ
ｇを、以下の技術を使用して、上記のリポソーム処方物（formulation）に封入
した。
【００５１】 脱水−再水和手順（KirbyおよびGregoriadis, (1984) 前掲書中）を、リポソ
ームへのｐＲｃ／ＣＭＶ ＨＢＳプラスミドＤＮＡの組み込みのために、使用し
た。手短に言えば、２ｍｌの小さな単層小胞（small unilamellar vesicles）（
ＳＵＶ）を、プラスミドＤＮＡと混合した特定したリポソーム形成成分から調製
し、−２０Ｃで凍結させ、そして一晩凍結乾燥させた。次いで、リポソームを、
制御した再水和へ供し、多層（Gregoriadisら, (1993) Biochim. Biophys. Acta
1147, 185-193）脱水−再水和小胞（ＤＲＶ）を生じさせた。産物は、封入され
ていないＤＮＡを除去するための工程へ供させず、そして恐らく、リポソームへ
複合化された外部ＤＮＡを含む。微細流動化は行わなかった。
【００５２】 各組成物についての封入複合化効率（Entrapment complexation efficiency）
は、35Ｓ−ｄＡＴＰから産生される、35Ｓ−標識化ＤＮＡを使用することによっ
て決定され、８５〜９５％であった。ＤＲＶは、５５０〜７５０ｎｍの範囲内の
平均直径を有した。
【００５３】 免疫化 方法は、Roy, Kら（1999） Nature Medicine 5 (4) 387-391に基づく。
【００５４】 ４の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（２０〜２４ｇ）のグループを、１ｍｌシリンジ
へ接続された動物給餌針（animal feeding needles）を使用して、“裸の（nake
d）”（グループ４）またはリポソーム−封入化（グループ１〜３）ＤＮＡのい
ずれかで経口的に免疫化した。各マウスに、第０、２８および３８日に、５００
μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の容量中１００μｇのＤＮＡを与えた。
【００５５】 免疫化グループ： １）ＰＣ：ＤＯＰＥ：ＤＯＴＡＰ（１００μｇＤＮＡ）（発明） ２）ＤＳＰＣ：ＤＯＰＥ：ＤＯＴＡＰ（１００μｇＤＮＡ）（発明） ３）ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＯＴＡＰ（１００μｇＤＮＡ）（発明） ４）“裸の”ＤＮＡ（１００μｇＤＮＡ）（リファレンス） ５）コントロール（ＤＮＡ無し）。
【００５６】 糞便ペレット（foecal pellet）からのｌｇＡ抽出 糞便ペレットを、第０、１４、２１、３２、４０、４８、６２、８４、９６お
よび１１９日に、マウスのケージから回収した。
【００５７】 これらのペレットを、１００ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに懸濁させ、遠心分離
に供し、そして上澄み（ＩｇＡを含有する）を分析した。
【００５８】 ＥＬＩＳＡ測定 ＥＬＩＳＡを、糞便抽出物において行い、分泌ＩｇＡを測定した。プレートを
、Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ表面抗原（ＨＢｓＡｇ；サブタイプ ａｙｗ）のＳ（
スモール）領域でコーティングし、１％ＢＳＡでブロックし、非特異的結合を回
避し、次いでペレット抽出物を２重で添加した（希釈していない）。セイヨウワ
サビペルオキシダーゼ−複合体化ヤギ抗−マウスＩｇＡ、続いてｏ−フェニレン
ジアミン基質を添加した。４５０ｎｍでの吸光度を測定した。図１ａ〜ｉ中の結
果は、マウスの各グループについての２重測定値の平均を示す。
【００５９】 実施例２ 方法：経口免疫化実験２ リポソーム調製 以下の組成を有するリポソームを、脱水−再水和法（ＤＲＶ）を使用して調製
した： １）３２μモルのＤＳＰＣ、 １６μモルのＤＯＰＥ、 ８μモルのＤＯＴＡＰ。
【００６０】 ２）３２μモルのＤＳＰＣ、 １６μモルのジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ
）、 ８μモルのＤＯＴＡＰ。
【００６１】 ３）３２μモルのＤＳＰＣ、 １６μモルのジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＥ）、 ８μモルのＤＯＴＡＰ。
【００６２】 ４）３２μモルのＤＳＰＣ、 １６μモルのＤＯＰＥ。
【００６３】 ｐＲｃ／ＣＭＶ ＨＢＳプラスミドＤＮＡを、実施例１と同一の方法を使用し
て、上記のリポソーム処方物中へ封入した。ＤＲＶ組成物１、２および３は、使
用されるＤＮＡの総量の８５〜９５％を封入した。非カチオン性ＤＲＶリポソー
ム（組成物４）は、（使用されるＤＮＡの総量の）４５〜５５％の封入効率を有
した。ＤＲＶリポソームサイズは、実施例１と同一の範囲にあった。
【００６４】 免疫化 ４の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（２０〜２４ｇ）のグループを、１ｍｌシリンジ
へ接続された動物給餌針を使用して、“裸の”（グループ６）またはリポソーム
−封入化（グループ１〜５）ＤＮＡのいずれかで経口的に免疫化した。各マウス
に、第０、３２日に、５００μｌのＰＢＳの容量中５０μｇ（グループ５）また
は１００μｇ（グループ１、２、３、４および６）のいずれかのＤＮＡを与えた
。
【００６５】 免疫化グループ： １）ＤＳＰＣ：ＤＯＰＥ：ＤＯＴＡＰ（１００μｇＤＮＡ）（発明） ２）ＤＳＰＣ：ＤＳＰＥ：ＤＯＴＡＰ（１００μｇＤＮＡ）（発明） ３）ＤＳＰＣ：ＤＰＰＥ：ＤＯＴＡＰ（１００μｇＤＮＡ）（発明） ４）ＤＳＰＣ：ＤＯＰＥ（１００μｇＤＮＡ）（リファレンス） ５）ＤＳＰＣ：ＤＯＰＥ：ＤＯＴＡＰ（５０μｇＤＮＡ）（発明） ６）“裸の”ＤＮＡ（１００μｇＤＮＡ） ７）コントロール（ＤＮＡ無し）。
【００６６】 糞便ペレットからのＩｇＡ抽出 糞便ペレットを、第０、４２、５５、６５および９２日に、マウスのケージか
ら回収した。これらのペレットを、１００ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに懸濁させ
、遠心分離に供し、そして上澄み（ＩｇＡを含有する）を分析した。
【００６７】 ＥＬＩＳＡ測定 ＥＬＩＳＡを、第１の経口免疫化実験についてのように、糞便抽出物において
行い、分泌ＩｇＡを測定した。第１の実施例についてのように、図２ａ〜ｄ中の
結果は、マウスの各グループについての２重測定値の平均を示す。
【００６８】 経口免疫化実験３ この実験は、リポソーム組成物のリポソーム媒介経口免疫化に対する影響をさ
らに研究することを目的とする。２つの因子を測定した： １）二重層におけるホスファチジルコリンおよびコレステロールの存在の組み
合わせの影響 ２）カチオン性ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンをコレステロー
ル ３β−Ｎ−（ジメチル−アミノエチル）カルバメート（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）で
置換する効果。
【００６９】 方法： リポソーム調製 以下の組成を有するリポソームを、上記で実施例１に記載されるように、脱水
−再水和法（ＤＲＶ）を使用して調製した： １）３２μモルのホスファチジルコリン（ＰＣ）、 １６μモルのジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）
、 ８μモルのジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）
。
【００７０】 ２）３２μモルのジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、 １６μモルのＤＯＰＥ、 ８μモルのＤＯＴＡＰ。
【００７１】 ３）３２μモルのＰＣ、 １６μモルのコレステロール（ＣＨＯＬ）、 ８μモルのＤＯＴＡＰ。
【００７２】 ４）３２μモルのＤＳＰＣ、 １６μモルのコレステロール（ＣＨＯＬ）、 ８μモルのコレステロール３β−Ｎ−（ジメチル−アミノエチル）カルバ
メート（ＤＣ−ＣＨＯＬ）。
【００７３】 Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ表面抗原（ＨＢｓＡｇ；サブタイプａｙｗ）のＳ（ス
モール）領域をコードするｐＲｃ／ＣＭＶ ＨＢＳプラスミドＤＮＡ ６００μ
ｇを、上記のリポソーム処方物に封入した。各組成物についての封入効率は、８
５〜９５％であった。ＤＲＶ直径は、実施例１と同一の範囲にあった。
【００７４】 免疫化 ４の雌性Ｂｌａｂ／ｃマウス（２０〜２４ｇ）のグループを、１ｍｌシリンジ
へ接続された動物給餌針を使用して、“裸の”（グループ４）またはリポソーム
−封入化（グループ１〜４）ＤＮＡのいずれかで経口的に免疫化した。各マウス
に、第０、２８および３８日に、５００μｌのＰＢＳの容量中１００μｇのＤＮ
Ａを与えた。
【００７５】 免疫化グループ １）ＰＣ：ＤＯＰＥ：ＤＯＴＡＰ（１００μｇＤＮＡ） ２）ＤＳＰＣ：ＤＯＰＥ：ＤＯＴＡＰ（１００μｇＤＮＡ） ３）ＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＯＴＡＰ（１００μｇＤＮＡ） ４）ＤＳＰＣ：ＤＯＰＥ：ＤＣ−Ｃｈｏｌ（１００μｇＤＮＡ） ５）“裸の”ＤＮＡ（１００μｇＤＮＡ）。
【００７６】 糞便ペレットからのＩｇＡ抽出 糞便ペレットを、第０、３０、４５、６０、７０日に、マウスのケージから回
収した。
【００７７】 これらのペレットを、１００ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ中におき、遠心分離へ
供し、そして上澄み（ＩｇＡを含有する）を分析した。
【００７８】 ＥＬＩＳＡ測定 ＥＬＩＳＡを、糞便抽出物において行い、分泌ＩｇＡを測定した。プレートを
、Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ表面抗原（ＨＢｓＡｇ；サブタイプ ａｙｗ）のＳ（
スモール）領域でコーティングし、１％ＢＳＡでブロックし、非特異的結合を回
避し、そして次いでペレット抽出物を２重で添加した（希釈していない）。セイ
ヨウワサビペルオキシダーゼ−複合体化ヤギ抗−マウスＩｇＡ、続いてｏ−フェ
ニレンジアミン基質を添加した。４５０ｎｍでの吸光度を測定した。結果は、マ
ウスの各グループについての２重測定値の平均を示す。
【００７９】 結果 最初の投薬後６０および７０日に測定された分泌ＩｇＡ免疫応答を、図１およ
び２にそれぞれ示す。結果は、ＤＰＳＣ：ＤＯＰＥ：ＤＯＴＡＰから構成される
ＤＲＶは、両方のタイムポイントで、経口的に免疫化されたマウスにおいて、最
も高い応答を増強したことを示す。リポソーム封入されたＤＮＡにおいてカチオ
ン性脂質ＤＯＴＡＰをＤＣ−ＣＨＯＬで置換することは、より低い抗−ＨＢｓＡ
ｇ ＩｇＡ免疫応答を生じる。さらに、ＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＯＴＡＰから構成さ
れるリポソームはまた、免疫応答を媒介することにおいて、ＤＳＰＣ：ＤＯＰＥ
：ＤＯＴＡＰから構成するものより効率が低かった。
【００８０】 結論 実施例１〜３から導かれる結論は、これら実施例は繰り返し可能であるという
ことである。さらに、比較的低いレベルの封入されたＤＮＡは、免疫応答に十分
なトランスフェクション率を提供するようである。（実施例２のグループ１およ
び５を比較して）。飽和脂質は、より良好なパフォーマンスを有するリポソーム
を生成するようである。
【００８１】 実施例４ 経口投薬後のレポーター遺伝子発現 目的 フルオレセントグリーンタンパク質レポーター遺伝子をコードする裸のまたは
リポソーム−封入されたかのいずれかのプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶ．ｅｆｇｐ
）をマウスに経口投薬後、腸間膜リンパ節における遺伝子発現のレベルを比較す
ること。レポーター遺伝子が回収したリンパ節において可視のグリーンタンパク
質によって示されるように発現されるならば、これは、ＤＮＡが腸間膜リンパ節
に到達しそしてエンドサイトーシスされてそして発現されるという表示である。
抗原提示細胞は、リンパ節、免疫応答を発生するための遺伝子ワクチンについて
の標的に局在する。
【００８２】 方法： リポソーム調製 ３２μモルのＤＳＰＣ、１６μモルのＤＯＰＥ、８μモルのＤＯＴＡＰから構
成されるリポソームを、実施例１について記載されるように、脱水−再水和法（
ＤＲＶ）を使用して調製し、そして６００μｇのｐＣＭＶ．ｅｆｇｐプラスミド
ＤＮＡを封入した。
【００８３】 投薬および遺伝子発現の測定 ２の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（２０〜２４ｇ）を、１ｍｌシリンジへ接続され
た動物給餌針を使用して、“裸の”またはリポソーム−封入化ＤＮＡのいずれか
で経口的に投薬した。各マウスに、５００μｌのＰＢＳの容量中１００μｇのＤ
ＮＡを与えた。投薬４４時間後、腸間膜リンパ節を、投薬したマウスおよびコン
トロール（天然）マウスから回収した。新たに回収したリンパ節を、Ｔｉｓｓｕ
ｅ−Ｔｅｃｋ（Ｍｉｌｅｓ Ｉｎｃ，ＵＳＡ）を使用してＣｒｙｏｓｔａｔチャ
ック（chucks）へ付着させ、次いで液体窒素中で凍結させた。切片をＳｌｅｅ
Ｃｒｙｏｓｔａｔ中で２０μｍに切断した。画像を、入射蛍光（incident fluor
escence）およびＫｏｄａｋ ｅｋｔａｃｈｒｏｍｅ ４０００ ＡＳＡを使用
して、Ｎｉｋｏｎ ｍｉｃｒｏｐｈｏｔｏ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ下で撮った。
【００８４】 結果および結論 より高いレベルのプラスミドコード化フルオレセントグリーンタンパク質が、
裸のｐＣＭＶ．ｅｆｇｐ（図３ｂ）を受けたものおよび天然マウス（図３ｃ）か
ら取ったリンパ節セクションにおいて見られるようなバックグラウンドレベルと
比較して、リポソーム封入されたｐＣＭＶ．ｅｆｇｐ（図４ａ）を投薬したマウ
スの腸間膜リンパ節において見られ得る。これから、経口投与されたＤＮＡが腸
間膜リンパ節へ通過されること、および腸間膜リンパ節におけるレポーター遺伝
子の発現率が飽和脂質を含むカチオン性リポソームにおける封入によって増加さ
れることが結論付けられ得る。これは、飽和脂質から形成されるカチオン性リポ
ソームにおける封入による免疫応答の増加を示す結果と一致する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１ａ〜ｉ中の結果は、マウスの各グループについての２重測定値の平均を示
す。
【図２】 図２ａ〜ｄ中の結果は、マウスの各グループについての２重測定値の平均を示
す。
【図３】 最初の投薬後６０および７０日に測定された分泌ＩｇＡ免疫応答。
【図４】 より高いレベルのプラスミドコード化フルオレセントグリーンタンパク質が、
裸のｐＣＭＶ．ｅｆｇｐ（図３ｂ）を受けたものおよび天然マウス（図３ｃ）か
ら取ったリンパ節セクションにおいて見られるようなバックグラウンドレベルと
比較して、リポソーム封入されたｐＣＭＶ．ｅｆｇｐ（図４ａ）を投薬したマウ
スの腸間膜リンパ節において見られ得る。
【手続補正書】特許協力条約第１９条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年３月２３日（２００１．３．２３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【化１】 ここで、Ｒ3およびＲ4は同一かまたは異なり、そして式ＣＨ3（ＣＨ2）e（Ｃ
Ｈ＝ＣＨ−ＣＨ2）f（ＣＨ2）g−の群から選択され、 ここで、ｆは０〜６であり、ｅおよびｇの各々は０〜２３であり、そしてｅ＋
ｇ＋３ｆが１２〜２３の範囲にあり； Ｒ7はＣ1-8アルカンジイル基であり； Ｙは−Ｏ−または結合であり； Ｘ2はＮ、ＰまたはＳであり； ｍは、Ｘ2がＮまたはＰである場合に３であり、そしてＸ2がＳである場合に２
であり；そして 基Ｒ8は同一かまたは異なり、そして水素、Ｃ1-8アルキル、Ｃ6-11アリールま
たはアラルキルからなる群から選択されるか、あるいは２または３の基Ｒ8が、
Ｘ3と一緒になって、５〜７環原子を有する飽和または不飽和のヘテロ環式基を
形成し得る； 但し、基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4の少なくとも１つにおいて、ｂまたはｆは、
場合によっては、０である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１４年１月１６日（２００２．１．１６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【化１】 ここで、Ｒ3およびＲ4は同一かまたは異なり、そして式ＣＨ3（ＣＨ2）e（Ｃ
Ｈ2）g−の群から選択され、 ここで、ｅおよびｇの各々は０〜２３であり、そしてｅ＋ｇが１２〜２３の範
囲にあり； Ｒ7はＣ1-8アルカンジイル基であり； Ｙは−Ｏ−または結合であり； Ｘ2はＮ、ＰまたはＳであり； ｍは、Ｘ2がＮまたはＰである場合に３であり、そしてＸ2がＳである場合に２
であり；そして 基Ｒ8は同一かまたは異なり、そして水素、Ｃ1-8アルキル、Ｃ6-11アリールま
たはアラルキルからなる群から選択されるか、あるいは２または３の基Ｒ8が、
Ｘ3と一緒になって、５〜７環原子を有する飽和または不飽和のヘテロ環式基を
形成し得る。
【化２】 ここで、Ｒ3およびＲ4は同一かまたは異なり、そして式ＣＨ3（ＣＨ2）e（Ｃ
Ｈ2）g−の群から選択され、 ここで、ｅおよびｇの各々は０〜２３であり、そしてｅ＋ｇが１２〜２３の範
囲にあり； Ｒ7はＣ1-8アルカンジイル基であり； Ｙは−Ｏ−または結合であり； Ｘ2はＮ、ＰまたはＳであり； ｍは、Ｘ2がＮまたはＰである場合に３であり、そしてＸ2がＳである場合に２
であり；そして 基Ｒ8は同一かまたは異なり、そして水素、Ｃ1-8アルキル、Ｃ6-11アリールま
たはアラルキルからなる群から選択されるか、あるいは２または３の基Ｒ8が、
Ｘ3と一緒になって、５〜７環原子を有する飽和または不飽和のヘテロ環式基を
形成し得る。
【請求項２０】 前記ワクチンが請求項２〜１５に記載される通りである、
請求項１９に記載の使用。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年１１月６日（２００２．１１．６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【化１】 ここで、Ｒ3およびＲ4は同一かまたは異なり、そして式ＣＨ3（ＣＨ2）e（Ｃ
Ｈ＝ＣＨ−ＣＨ2）f（ＣＨ2）g−の群から選択され、 ここで、ｆは０〜６であり、ｅおよびｇの各々は０〜２３であり、そしてｅ＋
ｇ＋３ｆが１２〜２３の範囲にあり； Ｒ7はＣ1-8アルカンジイル基であり； Ｙは−Ｏ−または結合であり； Ｘ2はＮ、ＰまたはＳであり； ｍは、Ｘ2がＮまたはＰである場合に３であり、そしてＸ2がＳである場合に２
であり；そして 基Ｒ8は同一かまたは異なり、そして水素、Ｃ1-8アルキル、Ｃ6-11アリールま
たはアラルキルからなる群から選択されるか、あるいは２または３の基Ｒ8が、
Ｘ3と一緒になって、５〜７環原子を有する飽和または不飽和のヘテロ環式基を
形成し得る； 但し、基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4の少なくとも１つにおいて、ｂまたはｆは、
場合によっては、０である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/28 Ａ６１Ｋ 47/28 Ａ６１Ｐ 31/00 Ａ６１Ｐ 31/00 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ // Ａ６１Ｋ 39/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ペリエ イボンヌ イギリス国 ビー４ ７イーティー バー ミンガム アストン トライアングル ア ストン ユニヴァーシティー スクール オブ ライフ アンド ヘルス サイエン ス Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA31 CA01 HA17 4C076 AA19 BB01 CC06 CC26 DD49 DD55 DD63 FF68 4C084 AA13 MA05 MA24 MA52 NA10 ZB211 ZB212 ZB311 ZB312 4C085 AA03 BA01 CC31 EE01 EE05 GG08

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下を含むリポソーム形成成分から形成されるリポソームと
    複合化されるかまたはこの中に封入された、抗原を作動可能にコードする核酸を
    含む経口ワクチン： ａ）一般式Ｉを有する少なくとも１つのカチオン性化合物 Ｒ1ＯＣＨ2ＣＨ（ＯＲ2）ＣＨ2Ｒ5Ｘ1Ｒ6 n Ｉ ここで、Ｒ1およびＲ2は同一かまたは異なり、そして式ＣＨ3（ＣＨ2）a（Ｃ
    Ｈ＝ＣＨ−ＣＨ2）b（ＣＨ2）c（ＣＯ）d−の群から選択され、 ここで、ｂは０〜６であり、ａおよびｃは各々０〜２３から選択され、そして
    （ａ＋ｃ＋３ｂ）は１２〜２３の範囲にあり、そしてｄは０または１であり； Ｒ5は結合またはＣ1-8アルカンジイル基であり； Ｘ1はＮ、ＰまたはＳであり； ｎは、Ｘ1がＮまたはＰである場合に３であり、そしてＸ1がＳである場合に２
    であり；そして 基Ｒ6は同一かまたは異なり、そして水素、Ｃ1-8アルキル、Ｃ6-12アリールま
    たはアラルキルから選択されるか、あるいは２または３の基Ｒ6が、Ｘ1と一緒に
    なって、５〜７環原子を有する飽和または不飽和ヘテロ環式基を形成し得る； ｂ）一般式IIを有する少なくとも１つの双性イオン性リン脂質 【化１】 ここで、Ｒ3およびＲ4は同一かまたは異なり、そして式ＣＨ3（ＣＨ2）e（Ｃ
    Ｈ＝ＣＨ−ＣＨ2）f（ＣＨ2）g−の群から選択され、 ここで、ｆは０〜６であり、ｅおよびｇの各々は０〜２３であり、そしてｅ＋
    ｇ＋３ｆが１２〜２３の範囲にあり； Ｒ7はＣ1-8アルカンジイル基であり； Ｙは−Ｏ−または結合であり； Ｘ2はＮ、ＰまたはＳであり； ｍは、Ｘ2がＮまたはＰである場合に３であり、そしてＸ2がＳである場合に２
    であり；そして 基Ｒ8は同一かまたは異なり、そして水素、Ｃ1-8アルキル、Ｃ6-11アリールま
    たはアラルキルからなる群から選択されるか、あるいは２または３の基Ｒ8が、
    Ｘ3と一緒になって、５〜７環原子を有する飽和または不飽和のヘテロ環式基を
    形成し得る； 但し、基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4の少なくとも１つにおいて、ｂまたはｆは、
    場合によっては、０である。
  2. 【請求項２】 Ｒ1＝Ｒ2そしてＲ3＝Ｒ4である、請求項１に記載のワクチン
    。
  3. 【請求項３】 Ｒ1およびＲ2が、Ｒ3およびＲ4とは異なる基を示す、請求項
    ２に記載のワクチン。
  4. 【請求項４】 Ｒ1およびＲ2においてｂ＝１であり、そして（ａ＋ｃ）が１
    ０〜２０の範囲にある、請求項２および請求項３に記載のワクチン。
  5. 【請求項５】 ｄ＝０である、請求項２〜４のいずれかに記載のワクチン。
  6. 【請求項６】 ｆ＝０である、請求項２〜５のいずれかに記載のワクチン。
  7. 【請求項７】 Ｘ1がＮであり、そしてＲ6基が全てＣ1-4アルキルである、
    前記請求項のいずれかに記載のワクチン。
  8. 【請求項８】 ＹがＯであり、そしてＸ2がＮであり、そして第１リン脂質
    の基Ｒ8が全て水素であり、そして第２リン脂質の基Ｒ8が全てＣ1-4アルキル、
    好ましくはメチルである、各々が式IIを有する２つの双性イオン性リン脂質を含
    む、前記請求項のいずれかに記載のワクチン。
  9. 【請求項９】 各リン脂質において、ＹがＯでありそしてＲ7が（ＣＨ2）h
    であり、ここでｈが２または３である、請求項８に記載のワクチン。
  10. 【請求項１０】 前記第１リン脂質の基Ｒ3およびＲ4が同一であり、そして
    各々が、ｆ＝１でありそして（ｅ＋ｇ）が１０〜２０、好ましくは１２〜１４の
    範囲にある基である、請求項８または請求項９に記載のワクチン。
  11. 【請求項１１】 前記第２リン脂質の基Ｒ3およびＲ4が同一であり、そして
    各々が、ｆ＝０でありそしてｅ＋ｇが１５〜２３、好ましくは１５〜１７の範囲
    にある基である、請求項８〜１０のいずれかに記載のワクチン。
  12. 【請求項１２】 少なくとも１つのグリセロ脂質、少なくとも１つのカチオ
    ン性化合物および少なくとも１つの双性イオン性リン脂質を含むリポソーム形成
    成分から形成されるリポソームへ複合化されるかまたはこの中に封入された、抗
    原をコードする核酸を含む経口ワクチンであって、少なくとも１つのグリセロ脂
    質がＯ’Ｏ−ジアルカノイルまたはＯ，Ｏ’−ジアルキルリン脂質であることを
    特徴とする、ワクチン。
  13. 【請求項１３】 前記グリセロ脂質が、請求項１に定義される一般式IIの化
    合物であり、ここでＲ3およびＲ4の両方においてｆが０である、請求項１２に記
    載のワクチン。
  14. 【請求項１４】 少なくとも１つのカチオン性化合物および少なくとも１つ
    の双性イオン性リン脂質を含むリポソーム形成成分から形成されるリポソームへ
    複合化されおよび／またはこの中に封入された、抗原をコードする核酸を含む経
    口ワクチンであって、該リポソーム形成成分が、４０℃を超える遷移温度を個々
    に有する成分を少なくとも２５モル％、好ましくは少なくとも５０モル％含むこ
    とを特徴とする、ワクチン。
  15. 【請求項１５】 前記双性イオン性リン脂質が、ジステアロイルホスファチ
    ジルコリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイル
    ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよび
    その混合物からなる群から選択される、請求項１２〜１４のいずれかに記載のワ
    クチン。
  16. 【請求項１６】 前記カチオン性化合物が、請求項１に定義される一般式Ｉ
    の化合物である、請求項１２〜１５のいずれかに記載のワクチン。
  17. 【請求項１７】 前記カチオン性化合物がＤＣ−コレステロールである、請
    求項１２〜１５のいずれかに記載のワクチン。
  18. 【請求項１８】 前記請求項のいずれかに記載のワクチンを経口投与するこ
    とによって、ヒトまたは非ヒト動物にワクチン接種し、それによって、コードさ
    れる抗原に対する免疫応答を発生させる、方法。
  19. 【請求項１９】 以下の工程： ｉ）ヒトまたは動物被験体において所望の免疫応答を誘発させるに有用な免疫
    原性ポリペプチドを作動可能にコードする裸のポリヌクレオチド、および請求項
    １、請求項１２または請求項１４に定義されるリポソーム形成成分から形成され
    る予め形成されたリポソームを含む、水性懸濁液を形成する工程、 ii）該懸濁液を凍結乾燥させるかまたは噴霧乾燥させる工程、ならびに iii）工程ii）の産物を再水和して脱水／再水和小胞を形成する工程、 を含む、ポリヌクレオチドをリポソーム中へ封入する方法。
  20. 【請求項２０】 さらに以下の工程： iv）前記工程iiiからの脱水／再水和小胞の水性懸濁液を、微細流動化に供し
    て、それらのサイズを制御する工程；ならびに ｖ）必要に応じて、封入されていないポリヌクレオチドをリポソームから分離
    する工程、 を含む、請求項１９に記載の方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010514412A (ja) * 2006-12-22 2010-05-06 ソリューシオネス バイオテクノロジカス イノヴァシオン リミターダ Ｄｎａ魚ワクチン

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2311911C2 (ru) * 2002-07-05 2007-12-10 Липоксен Текнолоджиз Лимитед Способ усиления иммунного ответа при вакцинации нуклеиновой кислотой
CA2524634A1 (en) * 2003-05-09 2004-11-25 Novosom Ag Injectable liposomal depots for delivering active ingredients
JP4255396B2 (ja) * 2004-03-19 2009-04-15 津田駒工業株式会社 水噴射式織機の水受け装置
EP2146692A1 (en) * 2007-03-19 2010-01-27 Fresenius Kabi Oncology Limited Proliposomal and liposomal compositions
CN101940321B (zh) * 2010-08-06 2012-06-20 南昌大学 动态高压微射流-冻融法制备中链脂肪酸纳米脂质体
CN101940320B (zh) * 2010-08-06 2012-08-29 南昌大学 薄膜分散-动态高压微射流制备中链脂肪酸纳米脂质体
EP2708134A1 (en) 2012-09-17 2014-03-19 Unilever N.V. Dough compositions comprising a structured fat phase

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998010748A1 (en) * 1996-09-13 1998-03-19 The School Of Pharmacy Liposomes

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2760193B1 (fr) * 1997-02-28 1999-05-28 Transgene Sa Lipides et complexes de lipides cationiques et de substances actives, notamment pour la transfection de cellules

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998010748A1 (en) * 1996-09-13 1998-03-19 The School Of Pharmacy Liposomes

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010514412A (ja) * 2006-12-22 2010-05-06 ソリューシオネス バイオテクノロジカス イノヴァシオン リミターダ Ｄｎａ魚ワクチン

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