ES2256043T3 - Vacunas de uso oral que contienen liposomas y adn atrapado. - Google Patents
Vacunas de uso oral que contienen liposomas y adn atrapado.Info
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Abstract
Utilización de una composición que comprende un ácido nucleico, que codifica funcionalmente un antígeno, complejado con liposomas o atrapado dentro de liposomas formados a partir de componentes formadores de liposomas, incluyendo compuestos catiónicos en una cantidad molar comprendida dentro del intervalo entre 5 y 50% y fosfolípido zwitteriónico, y que comprende a) por lo menos un compuesto catiónico b) por lo menos 50% en moles de componentes formadores de liposomas, es seleccionado de entre el grupo constituido por distearoilfosfatidilcolina, distearoilfosfatidiletanolamina, dipalmitoilfosfatidilcolina y dipalmitoilfosfatidiletanolamina, en la preparación de una vacuna para su utilización en la vacunación de un sujeto humano o animal, en la que la vacuna se administra por vía oral al sujeto para provocar una respuesta inmune al antígeno codificado.
Description
Vacunas de uso oral que contienen liposomas y ADN
atrapado.
La presente invención se refiere a vacunas orales
que comprenden liposomas catiónicos y, complejada o inmovilizada
dentro de los liposomas, una vacuna genética, es decir, un ácido
nucleico que codifica un antígeno, contra el cual se desea la
vacunación.
En el documento
WO-A-9810748 se describen vacunas
genéticas que comprenden un ácido nucleico que codifica un antígeno
contra el cual se requiere vacunación, en las que el ácido nucleico
está atrapado dentro de liposomas. Los liposomas se forman a partir
de componentes formadores de liposomas, incluyendo lípidos
catiónicos. Se afirma que las composiciones son adecuadas para su
administración, entre otras, por vías orales, pero en los ejemplos
las composiciones se administran por vía intramuscular, subcutánea,
intravenosa o intraperitoneal.
Para que una vacuna provoque una respuesta inmune
tras su administración oral, la composición debe interaccionar con
el sistema linfoide en el intestino. En consecuencia, la vacuna debe
permanecer estable en el tracto gastrointestinal, y debe ser lo
suficientemente estable como para interaccionar con las células
relevantes del sistema antes de ser destruida por sales biliares. Es
claramente más deseable que las vacunas se puedan administrar por
vía oral antes que tener que ser inyectadas. La presente invención
se refiere a composiciones adecuadas para su administración oral y a
vacunas orales y procedimientos para vacunar humanos o animales no
humanos por administración oral de las vacunas.
Según un primer aspecto de la presente invención,
se da a conocer un método de preparación de una vacuna oral tal como
se define en la reivindicación 1. El compuesto catiónico puede
ser
a) como mínimo, un compuesto catiónico que
presenta la fórmula general I,
IR^{1}OCH_{2}CH(OR^{2})CH_{2}R^{5}X^{1}R^{6}{}_{n}
en la que R^{1} y R^{2} son
iguales o distintos y se seleccionan de entre los grupos de fórmula
CH_{3}(CH_{2})_{a}(CH=CH-CH_{2})_{b}(CH_{2})_{c}(CO)_{d}-,
en la que b está comprendido entre 0 y 6, a y c
se seleccionan, cada uno de ellos, de entre 0 y 23, y (a + c + 3b)
tiene un valor comprendido entre 12 y 23, y d es 0 ó 1;
R^{5} es un enlace o un grupo
C_{1-8} alcanodiilo, un grupo
C_{1-4}
alcoxi-C_{1-4} alquilo o un grupo
C_{1-8} oxi-alquileno;
X^{1} es N, P o S;
n es 3 si X^{1} es N o P, y es 2 si X^{1} es
S; y
los grupos R^{6} son iguales o distintos y se
seleccionan de entre el grupo constituido por hidrógeno,
C_{1-8} alquilo, C_{6-12} arilo
o aralquilo, o dos o tres de los grupos R^{6}, junto con X^{1},
pueden formar un grupo heterocíclico saturado o insaturado con entre
5 y 7 átomos en el anillo.
La composición puede comprender diluyentes
farmacéuticamente aceptables, y puede incluir componentes que
mejoran las propiedades inmunogénicas de la vacuna, tal como los
adyuvantes convencionales.
La mezcla de componentes formadores de liposomas
debe tener una temperatura de transición de, por lo menos, 37ºC y,
preferentemente, debe estar comprendida dentro del intervalo entre
38 y 50ºC.
Resulta preferente que los grupos R^{1} y
R^{2} sean iguales. En general, los presentes inventores han
descubierto que resulta deseable que R^{1} y R^{2} sean
insaturados y que R^{3} y R^{4} sean saturados, o viceversa.
Preferentemente, el compuesto catiónico comprende un único compuesto
de fórmula I.
En una forma de realización particular de la
invención, en los componentes formadores de liposomas se utilizan
dos fosfolípidos zwitteriónicos que presentan fórmulas
distintas.
En el compuesto catiónico de fórmula I, los
grupos hidrofóbicos R^{1} y R^{2} pueden estar unidos al resto
de la molécula a través de enlaces éter (es decir, d es 0) o enlaces
éster (en los que d es 1) . Preferentemente, en compuestos de
fórmula I, el grupo R^{5} es un grupo C_{1-4}
alcanodiilo. Preferentemente, el compuesto catiónico es
permanentemente catiónico, es decir, sustancialmente ionizado por
completo a todos los pH susceptibles de encontrarse in vivo,
comprendidos en un intervalo entre 5 y 9. Preferentemente, cada uno
de los grupos R^{6} es distinto del hidrógeno, y en consecuencia,
son particularmente grupos C_{1-4} alquilo, siendo
muy preferentemente todos los grupos R^{6} un grupo metilo.
R^{5} es preferentemente un enlace o un grupo
metileno.
Una forma de realización particularmente
preferente de la composición según la invención utiliza un compuesto
catiónico de fórmula general I, en el que cada uno de los grupos
R^{1} y R^{2} es un grupo oleoilo, y en el que el grupo R^{5}
es un enlace, X^{1} es N y todos los grupos R^{6} son
metil(1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano
(DOTAP)). Un compuesto catiónico alternativo es el compuesto análogo
en el que los grupos oleoilo hidrofóbicos se substituyen por grupos
oleilo, es decir enlazados a través de enlaces éter en lugar de
enlaces éster. Un compuesto catiónico adecuado, en el que los
grupos hidrofóbicos están saturados, es el
1,2-bis(hexadeciloxi)-3-trimetilaminopropano(BisHOP).
Los fosfolípidos zwitteriónicos formadores de
liposomas incluyen la distearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), la
distearoiloxifosfatidilcolina (DSPC), la
dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), la
dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) y mezclas de las mismas.
Una mezcla de dos fosfolípidos zwitteriónicos
comprende generalmente sus dos compuestos en relaciones de peso
dentro de un intervalo entre 10:1 y 1:10, muy preferentemente dentro
de un intervalo entre 5:1 y 1:5, y más preferentemente entre 2:1 y
1:2.
Generalmente, la relación entre compuesto
catiónico y fosfolípido zwitteriónico (total) está comprendida
dentro de un intervalo entre 1:1 y 1:20, más preferentemente dentro
de un intervalo entre 1:1 y 1:10, y más preferentemente dentro de un
intervalo entre 1:1 y 1:5.
En todos los aspectos de la invención, resulta
preferente que la combinación de los componentes formadores de
liposomas tengan una temperatura de transición de, por lo menos,
37ºC. Las temperaturas de transición se determinan por calorimetría
diferencial de barrido.
Preferentemente, el compuesto catiónico es un
derivado de propilamina 2,3-di(aciloxi o
alcoxi) substituida, por ejemplo presentando la fórmula general I
anteriormente mencionada. Alternativamente, el compuesto puede estar
formado por compuestos anfifílicos catiónicos simples, tal como la
mono o distearilamina u otras alquilaminas de cadena larga, o los
derivados secundarios, terciarios o cuaternarios de las mismas que
presentan, respectivamente, uno, dos o tres sustituyentes
N-alquil menores (C_{1-4}
alquilo), tal como los haluros de dimetildioctadecilamonio. Otra
categoría de compuestos catiónicos anfifílicos adecuados para ser
incorporados en liposomas son los conjugados de la espermina con
compuestos di(acil graso)glicéridos o
N,N-di(C_{12-24})alquilacilamidas,
o el
3\beta-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamil]colesterol
(DC chol). En Kabanov A.V. et al., Bioconjugate Chem. (1995),
6(1), 7-20 se describe una serie de
compuestos catiónicos anfifílicos adecuados.
Según otro aspecto de la invención, se da a
conocer un método de preparación de una vacuna oral que comprende un
ácido nucleico, que codifica funcionalmente un antígeno, complejado
con liposomas y/o atrapado dentro de liposomas formados a partir de
componentes formadores de liposomas que incluyen, por lo menos, un
compuestos catiónico y, por lo menos, un fosfolípido zwitteriónico,
caracterizado porque los componentes formadores de liposomas
incluyen, por lo menos, un 50% en moles de DSPE, DSPC, DPPE o DPPC
que, individualmente, tienen una temperatura de transición superior
a 40ºC.
En este aspecto de la invención, el efecto de
utilizar niveles relativamente elevados de componentes lipídicos de
alta temperatura de transición consiste en que la temperatura de
transición de la mezcla liposómica para la utilización en los
componentes será superior a 37ºC. La temperatura de transición de
una mezcla tiende a acercarse al promedio de temperaturas de
transición de los componentes individuales. Sin embargo,
generalmente, resulta más sencillo determinar la temperatura de
transición de los componentes individuales, conociéndose los
valores para muchos de ellos. Son fosfolípidos zwitteriónicos de
alta temperatura de transición preferentes el DPPC (T_{c} 41,4ºC),
el DSPC (T_{c} 55,1ºC), el DPPE (T_{c} 64ºC) y el DSPE (T_{c}
74,2ºC).
En todos los aspectos de la invención, se pueden
incluir otros componentes en la mezcla de formación de liposomas,
tal como el colesterol. Preferentemente, los componentes formadores
de liposomas no contienen colesterol.
La cantidad de compuesto catiónico está
comprendida entre el 5 y el 50% de los moles totales de componentes
formadores de liposomas, preferentemente entre el 10 y el 25% en
moles.
Generalmente, la composición liposómica se
presenta en forma de suspensión acuosa, por ejemplo como tampón
fisiológico. Alternativamente, podría ser una composición seca para
rehidratación.
Los liposomas se pueden realizar mediante
cualquiera de las técnicas de formación de liposomas conocidas. Los
liposomas resultantes pueden ser vesículas multilaminares o
unilaminares, y pueden ser relativamente grandes (diámetros de
vesícula dentro de un intervalo entre 300 nm y 2.000 nm,
preferentemente con un diámetro promedio comprendido dentro de un
intervalo entre 500 nm y 1.000 nm), o bien pequeños (diámetros de
vesícula dentro de un intervalo entre 100 nm y 400 nm,
preferentemente con un diámetro promedio comprendido dentro de un
intervalo entre 200 nm y 300 nm). Preferentemente, los liposomas
presentan un diámetro medio no superior a 1.000 nm y,
preferentemente, sustancialmente todos ellos presentan diámetros
menores de 2.000 nm. Muy preferentemente, el diámetro medio está
comprendido dentro del intervalo entre 200 y 750 nm.
En las composiciones novedosas, el ácido nucleico
puede estar complejado con liposomas, es decir, situado
exteriormente a los liposomas. Preferentemente, sin embargo, el
ácido nucleico está, por lo menos parcialmente, atrapado.
Preferentemente, los liposomas se forman mediante
un procedimiento en el que las vesículas se forman, mezcladas con el
ácido nucleico que se debe atrapar, y a continuación se deshidratan,
preferentemente por liofilización, y, subsiguientemente, se
rehidratan en composición acuosa para formar vesículas de
deshidratación-rehidratación (DRV); opcionalmente,
las DRV se pueden someter subsiguientemente a microfluidización para
reducir su tamaño medio. Preferentemente, sin embargo, las DRV no se
someten a microfluidización, o únicamente se someten a uno o dos
ciclos de microfluidización. Preferentemente, el material no
atrapado se separa de los liposomas por centrifugación o por
cromatografía de tamizado molecular después de las etapas de
rehidratación y/o microfluidización, aunque este paso puede no ser
necesario.
Un método para atrapar polinucleótidos en
liposomas puede incluir las etapas de:
- i)
- formación de una suspensión acuosa que comprende polinucleótidos desnudos, los cuales codifican funcionalmente un polipéptido inmunogénico adecuado para inducir una respuesta inmune deseada en un sujeto humano o animal, y liposomas previamente formados a partir de componentes formadores de liposomas, tal como se especifica anteriormente para las composiciones novedosas,
- ii)
- liofilización o secado por pulverización de la suspensión, y
- iii)
- rehidratación del producto de la etapa ii) para formar vesículas de deshidratación/rehidratación.
Otras etapas que se pueden llevar a cabo, aunque
no son necesarias, son:
- iv)
- sometimiento de la suspensión acuosa de vesículas de deshidratación/rehidratación de la etapa iii) a microfluidización, para controlar su tamaño; y/o
- v)
- opcionalmente, separación de los polinucleótidos no atrapados de los liposomas.
Generalmente, la etapa iv) resulta innecesaria,
puesto que las vesículas de deshidratación/rehidratación.
Generalmente, la última etapa resulta
innecesaria, debido a que el ácido nucleico externo puede estar
parcialmente protegido del entorno estando complejado con los
liposomas cargados catiónicamente.
La deshidratación/rehidratación de las etapas son
sustancialmente tal como se describen en Kirby y Gregoriadis, (1984)
Biotechnology, 2, 979-984. De este modo, los
liposomas de la etapa i) son, preferentemente, pequeños y
unilaminares (SUV) (aunque pueden ser MLV, teniendo, por ejemplo, un
tamaño de 2 \mum) y las hechas en la etapa iii) son
preferentemente liposomas multilaminares (MLV), respectivamente. Los
liposomas obtenidos en la etapa iii) se designan generalmente
vesículas de deshidratación/rehidratación (DRV).
La microfluidización de las DRV se lleva a cabo
sustancialmente tal como se describe en el documento
WO-A-92/04009 y en Gregoriadis et
al., (1990), Int. J. Pharm. 65, 235-242. Tal
como se ha mencionado anteriormente, en caso de que se lleve a cabo
una microfluidización, es preferente que no se lleven a cabo más de
uno o dos ciclos.
La presente invención no comprende la
polimerización de los componentes formadores de liposomas para
aumentar la temperatura de transición. Esto puede reducir la tasa de
suministro de sustancia activa y constituye una etapa adicional no
deseada para el procedimiento.
Utilizando la técnica de las DRV, los inventores
han establecido que hasta un 90%, e incluso más, de los
polinucleótidos presentes en la suspensión acuosa sometida a la
etapa de secado pueden quedar atrapados en los liposomas y/o
complejarse con los mismos. El nivel de atrapamiento y/o
complejación de los polinucleótidos en la composición liposómica
está comprendido preferentemente dentro de un intervalo entre 0,05 y
100 \mug/\mumol de lípido, preferentemente entre 1 y 50
\mug/\mumol de lípido, y más preferentemente entre 5 y 50
\mug/\mumol de lípido.
Las composiciones liposómicas se han mostrado
resistentes a las sales biliares, y se supone que este hecho se
correlaciona con la estabilidad en el tracto gastrointestinal.
La sustancia activa de ácido nucleico puede ser
ARN, por ejemplo, que se puede transcribir y traducir directamente
en la síntesis del antígeno, o que se debe retrotranscribir
primeramente para formar ADN para la replicación. Preferentemente,
el ácido nucleico es ADN, preferentemente replicado, y se transcribe
y traduce directamente para formar el antígeno escogido. El ADN
consiste preferentemente en ds ADN plásmido.
La invención se refiere a la utilización de las
composiciones de liposomas elaboradas mediante los procedimientos
según la invención en la preparación de una composición para su
utilización en un método terapéutico o profiláctico. Por ejemplo, el
método puede consistir en la inmunización (vacunación) de un sujeto
humano o animal para protegerlo contra la infección de
microorganismos infecciosos. Alternativamente, se puede generar una
respuesta inmune mediante el producto genético, lo que resulta útil
en terapia inmunológica, por ejemplo para tratar el cáncer u otras
enfermedades, incluyendo infecciones.
A continuación se ilustra la invención en mayor
detalle mediante los ejemplos siguientes:
Ejemplo
1
Se prepararon liposomas con las siguientes
composiciones siguiendo el método de
deshidratación-rehidratación (DRV):
- 1)
- 32 \mumol de fosfatidilcolina (PC) de huevo (mezcla de di(acilo graso) fosfatidilcolinas, incluyendo algunos grupos saturados),
- 16 \mumol de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE),
- 8 \mumol de dioleoiltrimetilamoniopropano (DOTAP).
- 2)
- 32 \mumol de distearoilfosfatidilcolina (DSPC),
- 16 \mumol de DOPE,
- 8 \mumol de DOTAP.
- 3)
- 32 \mumol de DSPC,
- 16 \mumol de colesterol (CHOL),
- 8 \mumol de DOTAP.
Se atraparon 600 \mug de ADN plásmido pRc/CMV
HBS, que codifica la región S (small) del antígeno de superficie de
la hepatitis B (HbsAg; subtipo ayw), en las formulaciones de
liposomas detalladas anteriormente utilizando la técnica descrita a
continuación.
Se utilizó el método de
deshidratación-rehidratación (Kirby y Gregoriadis,
(1984) op. cit.) para la incorporación del ADN plásmido
pRc/CMV HBS en liposomas. En resumen, se prepararon 2 ml de
vesículas pequeñas unilaminares (SUV) a partir de los componentes
formadores de liposomas especificados mezclados con ADN plásmido
congelado a -20ºC y liofilizados durante toda la noche. A
continuación, se sometieron los liposomas a una rehidratación
controlada para generar vesículas multilaminares de
deshidratación-rehidratación (DRV) (Gregoriadis
et al., (1993) Biochim. Biophys. Acta 1147,
185-193). No se sometió el producto a etapas de
eliminación del ADN no atrapado y, probablemente, incluye ADN
externo complejado con los liposomas. No se llevó a cabo
ninguna
microfluidización.
microfluidización.
La eficacia de complejación de atrapamiento para
todas las composiciones estuvo comprendida entre el 85 y el 95%, tal
como se determinó utilizando ADN marcado con ^{35}S, producido a
partir de ^{35}S-dATP. Las DRV tenían diámetros
medios comprendidos dentro del intervalo entre 550 y 750 nm.
El método está basado en Roy, K. et al.
(1999), Nature Medicine 5(4) 387-391.
Se inmunizaron por vía oral grupos de 4 ratones
Balb/c hembra (20-24 g) respectivamente con ADN
"desnudo" (grupo 4) o atrapado en liposomas (grupos 1 a 3),
utilizando agujas de alimentación de animales unidas a una
jeringuilla de 1 ml. Se alimentó cada ratón con 100 \mug de ADN en
un volumen de 500 \mul de solución salina con tampón de fosfato
(PBS) en los días 0, 28 y 38.
- 1)
- PC:DOPE:DOTAP (100 \mug ADN) (invención)
- 2)
- DSPC:DOPE:DOTAP (100 \mug ADN) (invención)
- 3)
- DSPC:CHOL:DOTAP (100 \mug ADN) (invención)
- 4)
- ADN "desnudo" (100 \mug ADN) (referencia)
- 5)
- Control (ausencia de ADN)
Se recolectaron las materias fecales de las
jaulas de los ratones en los días 0, 14, 21, 32, 40, 48, 62, 84, 96
y 119.
Se suspendieron dichas materias en PBS a una
concentración de 100 mg/ml, se sometió la suspensión a
centrifugación y se analizó el sobrenadante (que contenía IgA).
Se llevó a cabo una prueba de ELISA sobre los
extractos fecales para medir la IgA secretoria. Se recubrieron unas
placas con la región S (small) del antígeno de superficie de la
hepatitis B (HbsAg; subtipo ayw), bloqueado con BSA al 1% para
impedir los enlaces no específicos y, a continuación, se añadieron
materias fecales en duplicado (sin disolver). Se añadió
anti-IgA de ratón obtenido en cabra conjugado con
peroxidasa de rábano picante, seguido de substrato de
o-fenilendiamina. Se midió la absorbancia a 450 nm.
Los resultados de las figuras 1a-i representan la
media de mediciones por duplicado para cada grupo de ratones.
Ejemplo
2
Se prepararon liposomas con las siguientes
composiciones siguiendo el método de
deshidratación-rehidratación (DRV):
- 1)
- 32 \mumol de DSPC,
- 16 \mumol de DOPE,
- 8 \mumol de DOTAP.
- 2)
- 32 \mumol de DSPC,
- 16 \mumol de distearoilfosfatidiletanolamina (DSPE),
- 8 \mumol de DOTAP.
- 3)
- 32 \mumol de DSPC,
- 16 \mumol de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC),
- 8 \mumol de DOTAP,
- 4)
- 32 \mumol de DSPC,
- 16 \mumol de DOPE.
Se atrapó ADN plásmido pRc/CMV HBS en las
formulaciones de liposomas detalladas anteriormente utilizando el
mismo método que en el ejemplo 1. Las composiciones de DRV atraparon
entre el 85 y el 95% de la cantidad total de ADN utilizada. Los
liposomas DRV no catiónicos (composición 4) mostraron una eficacia
de atrapamiento comprendida entre el 45 y el 55% (de la cantidad
total de ADN utilizada). Los tamaños de los liposomas DRV estuvieron
dentro del mismo intervalo que en el ejemplo 1.
Se inmunizaron por vía oral grupos de 4 ratones
Balb/c hembra (20-24 g) respectivamente con ADN
"desnudo" (grupo 6) o atrapado en liposomas (grupos 1 a 5),
utilizando agujas de alimentación de animales unidas a una
jeringuilla de 1 ml. Se alimentó cada ratón con 50 \mug (grupo 5)
ó 100 \mug (grupos 1, 2, 3, 4 y 6) de ADN en un volumen de 500
\mul de PBS en los días 0 y 32.
- 1)
- DSPC:DOPE:DOTAP (100 \mug ADN) (invención)
- 2)
- DSPC:DSPE:DOTAP (100 \mug ADN) (invención)
- 3)
- DSPC:DPPE:DOTAP (100 \mug ADN) (invención)
- 4)
- DSPC:DOPE (100 \mug ADN) (referencia)
- 5)
- DSPC:DOPE:DOTAP (50 \mug ADN) (invención)
- 6)
- ADN "desnudo" (100 \mug ADN)
- 7)
- Control (ausencia de ADN)
Se recolectaron las materias fecales de las
jaulas de los ratones en los días 0, 42, 55, 65 y 92. Se
suspendieron dichas materias en PBS a una concentración de 100
mg/ml, se sometió la suspensión a centrifugación y se analizó el
sobrenadante (que contenía IgA).
Se llevó a cabo una prueba de ELISA sobre los
extractos fecales para medir la IgA secretoria, tal como en el
primer experimento de inmunización oral. Como en el primer
experimento, los resultados de las figuras 2a-d
representan la media de mediciones por duplicado para cada grupo de
ratones.
Este experimento pretende investigar
adicionalmente la influencia de la composición de los liposomas en
la inmunización oral mediada por liposomas. Se midieron dos
factores:
- 1)
- La influencia de la combinación de la presencia de fosfatidilcolina y colesterol en la bicapa.
- 2)
- El efecto de sustituir el dioleoiltrimetilamoniopropano catiónico por colesterol 3\beta-N-(dimetilaminoetil)carbamato (DC-Chol).
Se prepararon liposomas con las siguientes
composiciones siguiendo el método de
deshidratación-rehidratación (DRV), tal como se ha
descrito en el ejemplo 1:
- 1)
- 32 \mumol de fosfatidilcolina (PC),
- 16 \mumol de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE),
- 8 \mumol de dioleoiltrimetilamoniopropano (DOTAP).
- 2)
- 32 \mumol de distearoilfosfatidilcolina (DSPC),
- 16 \mumol de DOPE,
- 8 \mumol de DOTAP.
- 3)
- 32 \mumol de PC,
- 16 \mumol de colesterol (CHOL),
- 8 \mumol de DOTAP.
- 4)
- 32 \mumol de DSPC,
- 16 \mumol de colesterol (CHOL),
- 8 \mumol de colesterol 3\beta-N-(dimetilaminoetil)carbamato (DC-CHOL).
Se atraparon 600 \mug de ADN plásmido pRc/CMV
HBS, que codifica la región S (small) del antígeno de
superficie de la hepatitis B (HbsAg; subtipo ayw), en las
formulaciones de liposomas anteriormente detalladas. La eficacia de
atrapamiento para todas las composiciones estuvo comprendida entre
el 85 y el 95%. Los diámetros de los liposomas DRV estuvieron dentro
del mismo intervalo que en el ejemplo 1.
Se inmunizaron por vía oral grupos de 4 ratones
Balb/c hembra (20-24 g) respectivamente con ADN
"desnudo" (grupo 5) o atrapado en liposomas (grupos 1 a 4),
utilizando agujas de alimentación de animales unidas a una
jeringuilla de 1 ml. Se alimentó cada ratón con 100 \mug de ADN en
un volumen de 500 \mul de PBS en los días 0, 28 y
38.
38.
- 1)
- PC:DOPE:DOTAP (100 \mug ADN)
- 2)
- DSPC:DOPE:DOTAP (100 \mug ADN)
- 3)
- PC:CHOL:DOTAP (100 \mug ADN)
- 4)
- DSPC:DOPE:DC-Chol (100 \mug ADN)
- 5)
- ADN "desnudo" (100 \mug ADN)
Se recolectaron las materias fecales de las
jaulas de los ratones en los días 0, 30, 45, 60 y 70.
Se suspendieron dichas materias en PBS a una
concentración de 100 mg/ml, se sometió la suspensión a
centrifugación y se analizó el sobrenadante (que contenía IgA).
Se llevó a cabo una prueba de ELISA sobre los
extractos fecales para medir la IgA secretoria. Se recubrieron unas
placas con la región S (small) del antígeno de superficie de la
hepatitis B (HbsAg; subtipo ayw), bloqueado con BSA al 1% para
impedir los enlaces no específicos y, a continuación, se añadieron
materias fecales en duplicado (sin disolver). Se añadió
anti-IgA de ratón obtenido en cabra conjugado con
peroxidasa de rábano picante, seguido de substrato de
o-fenilendiamina. Se midió la absorbancia a 450 nm.
Los resultados representan la media de mediciones por duplicado para
cada grupo de ratones.
Las respuestas inmunes por excreción de IgA
medidas 60 y 70 días después de la primera dosis se muestran en las
figuras 1 y 2 respectivamente. Los resultados muestran que las DRV
compuestas por DPSC:DOPE:DOTAP aumentaron las respuestas más altas
en ratones inmunizados por vía oral en los dos puntos temporales. La
substitución del lípido catiónico DOTAP por DC-CHOL
en el ADN atrapado en liposomas provoca respuestas inmunes
anti-HbsAg IgA más bajas. Además, los liposomas
compuestos por PC:CHOL:DOTAP también fueron menos eficaces que los
compuestos por DSPC:DOPE:DOTAP al mediar respuestas inmunes.
Las conclusiones que se pueden extraer de los
ejemplos 1 a 3 son que los experimentos son reproducibles. Además,
se demuestra que niveles relativamente bajos de ADN atrapado
proporcionan unas tasas de transfección adecuadas para una respuesta
inmune (comparando los grupos 1 y 5 del ejemplo 2). Los lípidos
saturados parecen producir liposomas con un mejor rendimiento.
Ejemplo
4
El objetivo consiste en comparar los niveles de
expresión génica en los ganglios linfáticos mesentéricos tras la
dosificación oral de ratones con ADN desnudo atrapado en liposomas,
el cual codifica el gen reportero de proteína verde fluorescente
(pCMV.efgp). En caso de que aparezca, la expresión del gen
reportero, detectada por la proteína verde visible en los ganglios
linfáticos recuperados, indica que el ADN alcanza los ganglios
linfáticos mesentéricos, donde sufre endocitosis y expresión. Las
células presentadores de antígeno se encuentran en los ganglios
linfáticos, los objetivos de las vacunas genéticas para desencadenar
una respuesta inmune.
Se prepararon liposomas compuestos por 32
\mumol de DSPC, 16 \mumol de DOPE y 8 \mumol de DOTAP
utilizando el método de deshidratación-rehidratación
(DRV), tal como se ha descrito para el ejemplo 1, y se atraparon 600
\mug de ADN plásmido pCMV.efgp.
Se dosificaron por vía oral 2 ratones Balb/c
hembra (20-24 g) respectivamente con ADN
"desnudo" y atrapado en liposomas, utilizando agujas de
alimentación de animales unidas a una jeringuilla de 1 ml. Se
alimentó cada ratón con 100 \mug de ADN en un volumen de 500
\mul de PBS. 44 horas después de la dosificación, se recolectaron
ganglios linfáticos mesentéricos de ratones dosificados y ratones de
control (naive). Los ganglios linfáticos recién recolectados se
adhirieron a secciones de criostato utilizando
Tissue-Teck (Miles Inc, USA) y, a continuación, se
congelaron en nitrógeno líquido. Se cortaron secciones a 20 \mum
en un criostato Slee. Se capturaron imágenes bajo un microscopio de
microfotografías Nikon utilizando fluorescencia incidente y Kodak
ektachrome 4000 ASA.
Se pueden observar niveles más elevados de
proteína verde fluorescente codificada por plásmido en los ganglios
linfáticos mesentéricos de los ratones dosificados con pCMV.efgp
(figura 4a) atrapado en liposomas en comparación con los ratones que
recibieron pCMV.efgp (figura 3b) desnudo, y niveles de fondo tal
como se muestra en las secciones de ganglio linfático tomadas de los
ratones naive (figura 3c). De todo ello se puede concluir que el ADN
administrado por vía oral se introduce en el ganglio linfático
mesentérico, y que la tasa de expresión de gen reportero en el
ganglio linfático mesentérico aumenta mediante encapsulación en
liposomas catiónicos que comprenden lípidos saturados. Esto es
consistente con los resultados que muestran un aumento en la
respuesta inmune mediante el atrapamiento en liposomas catiónicos
formados a partir de lípidos saturados.
Claims (5)
1. Utilización de una composición que comprende
un ácido nucleico, que codifica funcionalmente un antígeno,
complejado con liposomas o atrapado dentro de liposomas formados a
partir de componentes formadores de liposomas, incluyendo compuestos
catiónicos en una cantidad molar comprendida dentro del intervalo
entre 5 y 50% y fosfolípido zwitteriónico, y que comprende
- a)
- por lo menos un compuesto catiónico
- b)
- por lo menos 50% en moles de componentes formadores de liposomas, es seleccionado de entre el grupo constituido por distearoilfosfatidilcolina, distearoilfosfatidiletanolamina, dipalmitoilfosfatidilcolina y dipalmitoilfosfatidiletanolamina,
en la preparación de una vacuna para su
utilización en la vacunación de un sujeto humano o animal, en la que
la vacuna se administra por vía oral al sujeto para provocar una
respuesta inmune al antígeno codificado.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la
que el compuesto catiónico presenta la fórmula general I,
IR^{1}OCH_{2}CH(OR^{2})CH_{2}R^{5}X^{1}R^{6}{}_{n}
en la que R^{1} y R^{2} son
iguales o distintos y se seleccionan de entre los grupos de fórmula
CH_{3}(CH_{2})_{a}(CH=CH-CH_{2})_{b}(CH_{2})_{c}(CO)_{d}-,
en la que b está comprendido entre 0 y 6, a y c
se seleccionan, cada uno de ellos, de entre 0 y 23, y (a + c + 3b)
tiene un valor comprendido entre 12 y 23, y d es 0 ó 1;
R^{5} es un enlace o un grupo
C_{1-8} alcanodiilo;
X^{1} es N, P o S;
n es 3 si X^{1} es N o P, y es 2 si X^{1} es
S; y
los grupos R^{6} son iguales o distintos y se
seleccionan de entre el grupo constituido por hidrógeno,
C_{1-8} alquilo, C_{6-12} arilo
o aralquilo, o dos o tres de los grupos R^{6} junto con X^{1}
pueden formar un grupo heterocíclico saturado o insaturado con entre
5 y 7 átomos en el anillo.
3. Utilización según la reivindicación 2, en la
que R^{1} = R^{2}.
4. Utilización según la reivindicación 3, en la
que R^{1} y R^{2} son, cada uno de ellos, oleilo u oleoilo,
R^{5} es un enlace, X^{1} es N y cada R^{6} es metilo.
5. Utilización según la reivindicación 1, en la
que el compuesto catiónico es el colesterol
3\beta-N-(dimetilaminoetil)carbamato.
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