JP2003509341A - サイトカインの分泌刺激および免疫応答の誘導組成物 - Google Patents

サイトカインの分泌刺激および免疫応答の誘導組成物

Info

Publication number
JP2003509341A
JP2003509341A JP2001520138A JP2001520138A JP2003509341A JP 2003509341 A JP2003509341 A JP 2003509341A JP 2001520138 A JP2001520138 A JP 2001520138A JP 2001520138 A JP2001520138 A JP 2001520138A JP 2003509341 A JP2003509341 A JP 2003509341A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
lipid
odn
nucleic acid
cells
salp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2001520138A
Other languages
English (en)
Inventor
センプル、ショーン、シー
ハラシム、トロイ、オー
クリムク、サンドラ、ケイ
コジック、リリアナ、ディー
ブラムソン、ジョナサン、エル
ムイ、バーバラ
ホープ、マイケル、ジェイ
Original Assignee
イネックス ファーマスーティカルズ コーポレイション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by イネックス ファーマスーティカルズ コーポレイション filed Critical イネックス ファーマスーティカルズ コーポレイション
Publication of JP2003509341A publication Critical patent/JP2003509341A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/18—Type of nucleic acid acting by a non-sequence specific mechanism

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

(57)【要約】 脂質−核酸粒子は、当該核酸が標的細胞中のコード化配列に対して相補関係に無くても、治療上のメリットを提供することができる。非配列固有オリゴデオキシヌクレオチドを含有する粒子を含む脂質−核酸粒子が、サイトカインを分泌させるために，その刺激に使用し、これにより治療を受ける哺乳類の全体的な免疫反応を高めることができることが見いだされた。さらに、非配列固有オリゴヌクレオチドを含有する脂質粒子と会合した抗原分子を投与することにより、特定の標的抗原に対する免疫反応を誘発させることができる。脂質−核酸粒子の中に含まれる核酸として、ホスフォジエステル（即ち、ホスフォジエステル結合で会合させたヌクレオチド残基から成るオリゴデオキシヌクレオチド），又はホスフォロチオエート又はその他の修飾結合を含む修飾核酸を使用することができ、従来の核酸間塩基対相互作用とは独立な方法で免疫刺激を提供するように作用するように、ヒトゲノムに対して適切に非相補核酸であることが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、リピドにより製剤化された核酸の組成物および哺乳動物に免疫応答
を誘導するためのそれらの使用方法に関する。それらの組成物の一部ではさらに
付加的な成分たとえば抗原、付加的治療剤および／または他の成分を使用できる
が、これらの付加的成分はすべての適用において必要なわけではない。
【０００２】 （発明の背景） １９８０年代の中頃から、核酸は他の巨大分子と同様に、生物学的応答モディ
ファイヤーとして作用し、そのインビボ投与により哺乳動物に免疫応答を誘導で
きることが知られている（Ｔｏｋｕｎａｇａら１９８４；Ｓｈｉｍａｄａら１９
８５；Ｍａｓｈｉｂａら１９８８；Ｙａｍａｍｏｔｏら１９８８；Ｐｈｉｐｐｓ
ら１９８８）。１９９０年代初期のいくつかの文献で、免疫応答の刺激は使用し
た核酸の特徴に依存することが確立されている。重要な特徴には、二次構造パリ
ンドロームの存在（Ｙａｍａｍｏｔｏ １９９２ａ）および核酸の化学［すなわ
ちＣヌクレオチドのメチル化状態−ＤＮＡの細菌または哺乳動物ソースに依存（
Ｍｅｓｓｉｎａら１９９１；Ｙａｍａｍｏｔｏ １９９２ａ）、またはヌクレオ
チド間結合化学たとえばホスホロチオエート（Ｐｉｓｅｔｓｋｙ ＆ Ｒｅｉｃ
ｈ １９９３）］；ならびにヌクレオチド配列に特異的な作用、たとえばポリｄ
ＧおよびＣｐＧモチーフ（Ｔｏｋｕｎａｇａら１９９２；Ｙａｍａｍｏｔｏら１
９９２ｂ；ＭｃＩｎｔｙｒｅ，ＫＷら１９９３；Ｐｉｓｅｔｓｋｙ ＆ Ｒｅｉ
ｃｈ １９９３；Ｙａｍａｍｏｔｏら１９９４；Ｋｒｉｅｇら１９９５）が包含
される。
【０００３】 これらの免疫刺激配列（本技術分野ではイムノスティミュラトリー配列または
「ＩＳＳ」とも呼ばれる）の作用機構は本技術分野で周知の「アンチセンス」ま
たは「遺伝子発現」機構とは異なることが示唆されている。これは核酸の異なる
重要な利用の可能性を生じる。このような様々の利用可能性はＰｉｓｅｔｓｋｙ
ＤＳ，１９６６によって掲げられ、また他は本技術分野で周知である。これら
には、遊離型のＩＳＳの免疫アジュバント、様々な抗原との組み合わせでのワク
チン（Ｄａｖｉｓ ＨＬら，ＰＣＴ公告ＷＯ９８／４０１００参照）、および他
の生物活性物質との組み合わせとしての使用が包含される。免疫刺激作用を回避
する方法も提案されている。
【０００４】 ＩＳＳの発見をさらに利用し、それらを利用した治療用産物を発生させること
がきわめて望ましい。本発明の目的はリピドにより製剤化された核酸組成物およ
び哺乳動物に免疫応答を誘導するためのそれらの使用方法を提供することにある
。また、付加的成分たとえば抗原、付加的な治療剤および／または他の成分を使
用するリピド-核酸組成物、ならびにそれらの使用方法を提供することを目的と
する。
【０００５】 リピド担体中に核酸を含有する組成物は本技術分野において既知である。たと
えば、国際特許公告ＷＯ９８／５１２７８には、プロトン化可能なリピドおよび
凝集制限リピドを包含し、その中に核酸が完全に封入された粒子が産生されたリ
ピド-アンチセンス核酸組成物が記載されている。
【０００６】 これらの組成物は、標的細胞中におけるコード核酸配列に相補性のアンチセン
ス核酸を使用した場合、たとえば腫瘍サイズの低下のような治療効果を示した。
【０００７】 （発明の開示） 核酸が標的細胞におけるコード配列に相補性ではない場合でも、驚くべきこと
にリピド−核酸粒子は治療的利益を提供できることが見出された。すなわち、配
列非特異的オリゴデオキシヌクレオチドを含有する粒子を含めて、リピド−核酸
粒子はサイトカイン分泌の刺激に使用することが可能で、したがって、処置動物
の免疫応答を全体的に増強するために使用することができる。さらに、配列非特
異的オリゴデオキシヌクレオチドを含有するリピド粒子に会合した抗原性分子の
投与によって、特異的標的抗原に対する免疫応答を誘導することができる。
【０００８】 本発明によれば、リピド製剤中に完全に封入された核酸からなり、そのリピド
製剤は陽イオン性リピドからなるリピド−核酸粒子を調製し、リピド−核酸粒子
を哺乳動物に投与することによって、ヒトを含めた哺乳動物に治療的利益を与え
る方法が提供される。本発明の一実施態様においては、リピド−核酸粒子中に包
含される核酸は特定の細胞に特異的な配列に結合しないが、それにもかかわらず
リピド粒子と組み合わせて投与された場合、サイトカインの分泌を刺激するのに
有効である。本発明の第二の実施態様においては、抗原性分子は標的抗原に特異
的な免疫応答を誘導するためにリピド−核酸粒子と配合される。
【０００９】 リピド核酸粒子中に包含される核酸はホスホジエステル（すなわち、ホスホジ
エステル結合によって連結するヌクレオチド残基から構成されるオリゴデオキシ
ヌクレオチド）またはホスホロチオエートもしくは他の修飾結合を含む修飾核酸
とするか、またはヒトゲノムに対して相補性ではない核酸、たとえばその核酸と
処置された哺乳動物の核酸との間の慣用の塩基ペア相互作用とは独立の様式での
免疫刺激を提供するように働く核酸とすることができる。とくに同核酸は免疫刺
激モチーフたとえばＣｐＧモチーフまたは免疫刺激パリンドローム配列を適当に
含有する。
【００１０】 核酸粒子に包含される陽イオン性リピドは、ＤＯＤＡＰ，ＤＯＤＭＡ，ＤＭＤ
ＭＡ，ＤＯＴＡＰ，ＤＣ−Ｃｈｏｌ，ＤＤＡＢ，ＤＯＤＡＣ，ＤＭＲＩＥ，ＤＯ
ＳＰＡおよびＤＯＧＳ中から適当に選択される。さらにリピド粒子は修飾された
凝集制限リピド、たとえばＰＥＧ−リピド、ＰＡＯ−リピドまたはガングリオシ
ドを適当に含有する。
【００１１】 図面の簡単な説明 図１Ａ〜Ｃは免疫コンピーテントなＢａｌｂ／ｃ マウス（Ａ）、ならびに免
疫コンプロマイズＢａｌｂ／ｃ ヌード（Ｂ）およびＢａｌｂ／ｃ ＳＣＩＤ−
Ｒａｇ２ マウス（Ｃ）に反復投与した場合のＰＥＧ−リポソームの循環レベル
を示す。 図２ＡおよびＢは、ＳＡＬＰ（ＰＥＧ−ＣｅｒＣ20）の消失に対する核酸配列
（Ａ）および構造（Ｂ）の影響を示す。 図３はリポソームの回収に対するＤＮＡ対リピド比の影響を示す。 図４は迅速な消失応答の発現に対する投与スケジュールの影響を示す。 図５ＡおよびＢはＯＤＮを含有するリポソームの迅速な消失におけるＰＥＧ−
リピドの役割を例示する。 図６はクロスオーバー試験の結果を示す。 図７ＡおよびＢは固形腫瘍におけるＡＳ４２００の蓄積を示す。 図８ＡおよびＢは遊離ｃ−ｍｙｃに優るｃ−ｍｙｃ／ＴＣＳの増強された効力
およびアンチセンス／リピド比の影響を例示する。 図９は封入されたホスホジエステルＯＤＮ（ＩＮＸ−６２９８）の遊離ＩＮＸ
−６２９８に比較したマウスＢ１６メラノーマに対する改良された効力の証明を
示す。 図１０はＳＣＩＤ−Ｒａｇ２ マウスにおけるＤｏＨＨ２ ヒトリンパ腫への
１５マーＩＮＸ−６２９８の効力を示す。 図１１Ａおよび１１Ｂはｉ．ｖ．ＤｏＨＨ２における遊離およびＡＳ４２００
ＩＮＸ−６２９５に対する用量反応を例示する。 図１２は様々なｃ−ｍｙｃおよびリピド製剤で処置したマウスにおける脾臓重
量における変動を示す。 図１３は、インビトロ脾臓細胞増殖アッセイにおける各種ＯＤＮのマイトジェ
ニシティー（有糸分裂促進性）を示す。 図１４は、マイトジェニックコントロールＯＤＮ ＩＮＸ−４４２０がＬＲ−
３２８０と同様に、インビボでの皮下Ｂ１６メラノーマにおける活性の証明を示
す。 図１５はｃ−ｍｙｃおよび慣用の薬物（ドキソルビシン）の単一リポソーム中
への共封入が腫瘍の増殖を阻害することを示す。 図１６はＡＳ４２０４の免疫原性および共封入したドキソルビシンの逆使用を
例示する。 図１７はＩＮＸ−６２９５およびＩＮＸ−６３００のマイトジェニシティーを
示す。 図１８ＡおよびＢは、ＩＮＸＣ−６２９５の反復投与後の肝臓における単核球
細胞およびナチュラルキラー細胞活性の上昇を示す。 図１９ＡおよびＢはＩＮＸ−６２９５／ＳＡＬＰ処置後の肝臓におけるＮＫ１
．１＋／ＴＣＲ−細胞の増加を示す。 図２０は、ＩＮＸ−６２９５／ＳＡＬＰ処置後のベージュマウスからのＨＭＮ
Ｃにおける細胞溶解活性の欠損を示す。 図２１は遊離および封入ＰＳ ＯＤＮの投与後におけるＨＭＮＣの増加を示す
。 図２２ＡおよびＢはＳＡＬＰ処置後の肝臓におけるＮＫ１．１＋／ＴＣＲ−細
胞の増加を示す。 図２３Ａ〜Ｃは遊離および封入ＰＳ ＯＤＮの投与後におけるＨＭＮＣ集団内
のナチュラルキラー細胞の活性化合物を示す。 図２４Ａ〜ＣはＤＯＤＡＣ，ＤＯＴＡＰまたはＤＯＴＭＡのいずれかを含有す
るリポプレックスのトランスフェクションプロファイルを示す。 図２５は、リポプレックス投与後の腹膜における細胞浸潤のレベルを示す。 図２６Ａ〜Ｃは、リポプレックス誘導炎症がＩＦＮ−γの産生の増加を伴うこ
とを示す。 図２７は、リポプレックス誘導ＮＫ細胞の活性化を示す。 図２８Ａ〜Ｄは、遊離およびリポソームｃ−ｍｙｃ ＰＳ ＯＤＮによって誘
導された血清サイトカインを示す。 図２９Ａ〜Ｄは、遊離およびリポソームｃ−ｍｙｃ ＰＳ ＯＤＮによって誘
導された血清サイトカインを示す、 図３０Ａ〜Ｄは、ＰＯおよびＰＳ ＯＤＮによるサイトカイン分泌を比較する
試験の結果を示す。 図３１ＡおよびＢは２つの相のＩＦＮ−γ誘導を示す。 図３２ＡおよびＢはＩＮＦγ誘導の第２相に相当する時点における血清ＩＬ−
１２のレベルを示す。 図３３は血清サイトカインの誘導に対するＯＤＮ用量の作用を示す。
【００１２】 発明の詳細な説明 その最も広い意味で、ここに記載する発明はリピドにより製剤化された核酸の
組成物、ならびに哺乳動物におけるサイトカイン分泌の刺激および標的抗原に対
する免疫応答の誘導のためのそれらの使用方法に関する。ある種の組成物は付加
的成分たとえば抗原、付加的治療剤および／または他の成分を使用するが、これ
らの付加的成分はすべての適用に必要ではない。
【００１３】 明細書および特許請求の範囲において使用される「サイトカイン分泌の刺激」
の語は、本発明の組成物が投与された生物体による、このような投与の近接した
結果として分泌される1または2種以上のサイトカインの量における増加を意味す
る。
【００１４】 本出願の明細書および特許請求の範囲において用いられる「免疫応答の誘導」
の語は、標的抗原に対する最初の免疫応答の発生または既存免疫応答の増強のい
ずれかを意味する。
【００１５】 Ａ．リピド−核酸組成物 Ａ．１ 核酸 本発明の組成物はそれぞれ核酸を包含する。任意の核酸を使用できるが、一般
に使用される核酸は、大きな二本鎖プラスミドＤＮＡ（５００〜５０，０００ｂ
ｐ）、または８〜５０ｎｔの短い一本鎖オリゴヌクレオチド（場合により、ＯＤ
Ｎまたはオリゴデオキシヌクレオチドと呼ばれる）である。標準的な核酸はヌク
レオチドの間にホスホジエステル結合を包含するが、これらの結合は、ホスホロ
チオエート、ホスホロアミデート等を含む任意の化学であってもよい。塩基、糖
または結合残基への多くの他の化学的な修飾も有用である。塩基はメチル化され
ていても、メチル化されていなくてもよい。好ましい核酸化学はポリ陰イオン性
であり、以下に記載する好ましい製造方法とともに使用される。ヌクレオチド配
列はたとえばアンチセンスオリゴヌクレオチドのように、患者／対象ｍＲＮＡと
相補性であるか、または異種もしくは非相補性でもよい（これは、それらが患者
／対象ゲノムに特異的にハイブリダイズしないことを意味する）。配列は発現可
能であり、適当なプロモーターおよび発現エレメントに連結した遺伝子配列は、
一般に大きなプラスミド構築体の部分である。配列はヘパリン二次構造を招くあ
る種のパリンドロームのような免疫刺激配列（「ＩＳＳ」）（Ｙａｍａｍｏｔｏ
Ｓら１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：４０７２−４０７６参照）もし
くはＣｐＧモチーフ（下記参照）であるか、または他の既知ＩＳＳの特徴を有し
てもよく（マルチ−Ｇドメイン、ＷＯ９６／１１２６６参照）、またはそれらは
非−ＩＳＳ配列であるか、もしくはそれらはＣｐＧモチーフの活性を抑制する免
疫中和モチーフであってもよい。多くのＩＳＳ，非−ＩＳＳおよび免疫中和モチ
ーフが本技術分野で知られている。
【００１６】 ＣｐＧモチーフとして知られるＩＳＳは、隣接塩基の特異的パターン内での非
メチル化シチジン−グアノシンジヌクレオチドである（Ｋｒｅｉｇ，Ａ．Ｍ．ら
，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６−５４９）。さらに、ＰＣＴ公告Ｗ
Ｏ９６／０２５５５；ＰＣＴ公告ＷＯ９８／１８８１０；ＰＣＴ公告ＷＯ９８／
４０１００；ＵＳ特許５，６６３，１５３；ＵＳ特許５，７２３，３３５も参照
されたい。多くのＣｐＧモチーフは免疫刺激性ではないことから、ＣｐＧモチー
フの塩基関係はＩＳＳ活性に明らかに重要である。特定のＤＮＡ配列の免疫刺激
性に対する最も劇的な作用は一般にＣｐＧジヌクレオチドに（５’および３’側
に）直接隣接する２つの塩基に対する変化から生じる。一本鎖でもＩＳＳモチー
フを非−ＩＳＳモチーフに変換することができる。さらに、連続的なＣｐＧジヌ
クレオチド，ＣＣＧトリヌクレオチドまたはＣＧＧトリヌクレオチドは単独でま
たは組み合わせでＣｐＧモチーフの免疫刺激作用を遮断する中和モチーフであり
得た（Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．，１９９９，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ １：５６−６
３）。
【００１７】 ＩＳＳ，非−ＩＳＳおよび中和モチーフ配列は生物特異的である。生物体にお
ける配列の免疫刺激能力は問題の配列を他のアジュバントと単純に比較するか、
または宿主の防御機構の活性化、免疫系成分の誘導等を測定することによって簡
単な実験で決定することができる。これらはすべて本技術分野において周知であ
る。非−ＩＳＳ配列は遊離型でナイーブな動物に投与した場合、免疫系の刺激ま
たは免疫応答の誘導を生じない。
【００１８】 Ａ．２ 粒子のリピドおよび他の成分 核酸のほかに、本発明の組成物はリピドを使用し、また他の成分も使用する。
「リピド」の語は脂肪酸のエステルであり、水不溶性であるが多くの有機溶媒に
は可溶性の有機化合物のグループを意味する。それらは通常、少なくとも３つの
クラスに分類される。すなわち、（１）「単純リピド」、これには脂肪および油
脂ならびにワックスが包含される；（２）「複合リピド」これにはホスホリピド
およびグリコリピドが包含される；および（３）「誘導化リピド」たとえばステ
ロイドおよびリピドの操作により誘導される化合物である。
【００１９】 「荷電リピド」の語は、陽性電荷もしくは陰性電荷のいずれかを有するリピド
種または正味荷電されていない両性イオンであるリピド種を意味し、一般にその
リピドが見出される溶液のｐＨの参照が要求される。
【００２０】 生理的ｐＨにおいて陽性に荷電されるリピドには、それらに限定されるもので
はないが、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「Ｄ
ＯＤＡＣ」）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリ
メチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，
Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ−（２，３−ジオレイ
ルオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴ
ＡＰ」）；３β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）
コレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）およびＮ−（１，２−ジミリスチルオキ
シプロピ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウム
ブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）が包含される。さらに、陽イオン性リピドの多くの
市販製品が入手可能であるが、これらも本発明に使用することができる。これら
にはたとえば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（ＤＯＴＭＡおよび１，２−
ジオレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノーアミン（ＤＯＰＥ）からなる市販の陽
イオン性リポソーム，ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，ＵＳＡから）；Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（Ｎ−（
１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボ
キサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（
「ＤＯＳＰＡ」）およびＤＯＰＥからなる市販の陽イオン性リポソーム，ＧＩＢ
ＣＯ／ＢＲＬより）；およびＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）（エタノール
中ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（「ＤＯＧＳ」）からな
る市販の陽イオン性リピド，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉ
ｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡより）が包含される。
【００２１】 一部の陽性に荷電したリピドは滴定可能であり、すなわちそれらは生理学的ｐ
Ｈまたはその近くにｐＫａを有し、それらは緩和な酸性条件では強力な陽イオン
性を、生理学的ｐＨでは弱い（またはそうでない）陽イオン性を示す本発明には
重要な結果を示す。このような陽性に荷電したリピドには、それらに限定される
ものではないが、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＭＡ」）および１，２−ジオレオイル−３−
ジメチルアンモニウム−プロパン（「ＤＯＤＡＰ」）が包含される。ＤＭＤＭＡ
も有用な滴定可能陽イオン性リピドである。
【００２２】 生理学的ｐＨにおいて陰イオン性に荷電しているリピドには、それらに限定さ
れるものではないが、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホ
スファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ジホスファチジルグリセロール
、ポリ（エチレングリコール）−ホスファチジルエタノールアミン、ジミリスト
イルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、
ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリ
セロール、ジステアリルオイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホ
スファチン酸、ジパルミトイルホスファチン酸、ジミリストイルホスファチジル
セリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、脳ホスファチジルセリン等が包
含される。
【００２３】 一部の陰性に荷電したリピドは滴定可能であり、すなわちそれらは生理学的ｐ
Ｈまたはその近くにｐＫａを有し、それらが緩和な塩基性条件では強力な陰イオ
ン性を、生理学的ｐＨでは弱い（またはそうでない）陰イオン性を示す本発明に
は重要な結果を示す。このような陰性に荷電したリピドは本明細書に開示された
原理に基づいて本技術分野の熟練者によって同定することができる。
【００２４】 「中性リピド」の語は、非荷電または中性両性イオン型のいずれかの生理学的
ｐＨで存在する多くのリピド種を意味する。このようなリピドにはたとえば、ジ
アシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラ
ミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシドおよび
ジアシルグリセロールが包含される。
【００２５】 本発明に使用される一部の好ましいリピド製剤には、凝集防止化合物たとえば
ＰＥＧ−リピドまたはポリアミドオリゴマーリピド（たとえば、ＡＴＴＡ−リピ
ド）および他の立体障害または「隠れ」リピド、界面活性剤等が包含される。こ
のようなリピドはＳｅａｒｓ，ＵＳ特許４，３２０，１２１，Ｃｈｏｉら，ＵＳ
特許５，８２０，８７３，Ｈｏｌｌａｎｄら，ＵＳ特許５，８８５，６１３，Ｗ
Ｏ９８／５１２７８（発明者Ｓｅｍｐｌｅら）およびポリアミドオリゴマーに関
するＵＳ特許出願一連番号０９／２１８９８８に記載されている。これらはすべ
て引用により本明細書に導入される。これらのリピドおよび界面活性化合物は反
対の荷電を有するリピドおよび治療剤を含有する製剤の沈殿および凝集を防止す
る。これらのリピドはまたインビボにおける循環半減期の改良に使用され（Ｋｌ
ｉｂａｎｏｖら，１９９０，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２６８（１）：２３５
−２３７）、またそれらはインビボにおける製剤からの迅速な交換に選択するこ
とができる（ＵＳ特許５，８８５，６１３参照）。
【００２６】 本発明の好ましい実施態様は、交換可能な立体障害リピドを使用する（本発明
の譲受人に譲渡されたＵＳ特許５，８２０，８７３，５，８８５，６１３，およ
びＵＳ特許出願一連番号０９／０９４５４０および０９／２１８９８８に記載。
引用によって本明細書に導入される）。交換可能な立体障害リピドたとえばＰＥ
Ｇ2000−ＣｅｒＣ１４およびＡＴＴＡ８−ＣｅｒＣ１４は、患者／対象に投与す
るとリピド粒子の外側単層から迅速に交換される立体障害リピドである。このよ
うなリピドそれぞれは、アシル鎖の長さ、飽和度、立体障害残基のサイズ、膜組
成および血清組成等を含む様々なファクターに依存して粒子から交換される特徴
的な速度を有する。このようなリピドは粒子形成時における凝集の防止に有用で
あり、上記特許出願に記載した、投与時に粒子からのそれらの加速された脱離、
プログラム可能なフューゾゲニシティーおよび粒子不安定化活性のような利益を
提供する。
【００２７】 一部のリピド粒子の形成はある種の標的細胞または標的組織におけるリポソー
ムの局在を促進するように設計された標的残基を使用することができる。標的残
基は、形成時または形成後に、リピド粒子の外層と会合させてもよい（すなわち
、直接接合、疎水性相互作用または他の方法で）。これらの方法は本技術分野に
おいて周知である。さらに、一部のリピド粒子製剤にはフソゲニックポリマーた
とえばＰＥＡＡ，ヘマグルチニン、他のリポ−ペプチド（ＵＳ特許出願ＳＮ０８
／８３５，２８１および６０／０８３，２９４参照，すべて引用により本明細書
に導入される）およびインビボおよび／または細胞間送達に有用な他の性質を使
用することができる。
【００２８】 Ａ．３ 他の薬物成分 本発明のある種の好ましい実施態様はさらに他の薬物または生物活性物質から
なる。これらの付加的成分は直接付加的な治療的利益または付加的な免疫刺激の
利益を提供する。以下の実施例において、よく知られた化学療法剤、ドキソルビ
シン（ヒドロキシダウノルビシン）を本発明の粒子中に核酸とともに共封入する
。他の薬物または生物活性物質も、本発明の所望の適用に依存して同様に使用す
ることができる。細胞傷害物質には細胞殺滅能力を有するすべての化合物、それ
らに限定されるものではないが、シクロホスファミド、ジカルバジン、タキサン
類、キャンプトテシン類、ビンクリスチンおよび他のビンカアルカロイド、シス
プラチンが包含される。他の特定の例には非ホジキンリンパ腫の処置用のＲＩＴ
ＵＸＩＮ（登録商標，Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）がある。抗細菌剤たとえばシプロフ
ロキサシンも使用できる。換言すれば、リピド粒子中に導入できる本技術分野で
周知のすべての生物活性物質が付加的成分の可能性のある候補である。
【００２９】 本発明の一実施態様においては、薬物または他の生物活性物質はリピド−核酸
粒子と会合させて適宜提供される。本出願の明細書および特許請求の範囲におい
て用いられる「会合して」の語は、薬物または生物活性物質が核酸と、リピド粒
子の管腔または薄層空間内に共封入されていること、リピド膜内部もしくは部分
的にリピド膜内部に配置されていること、またはリピド粒子の外側に結合（共有
結合またはイオン結合）していることを意味する。
【００３０】 薬物または生物活性物質のリピド粒子との会合の別法としては、本発明の組成
物がリピド−核酸粒子に会合していない薬物または生物活性物質を包含している
場合である。このような薬物または生物活性物質は分離されたリピド担体内にあ
ってもよい。たとえば、リポソームビンクリスチン（Ｏｎｃｏ ＴＣＳ，登録商
標）を使用することができる。
【００３１】 Ａ．４ ワクチン成分 本発明は、本発明の組成物がＰＥＧ−リピド、通常は非免疫原性またわずかに
しか免疫原性でない化合物に対して強力な体液性応答を励起することをここに証
明する。本発明のある種の実施態様はワクチン組成物の部分として他の抗原分子
を使用する。抗原分子は固有に免疫原性であるか、またはそれらは非免疫原性ま
たはわずかにしか免疫原性でない抗原であってもよい。これらの抗原には異種ま
たは同種抗原が包含され、またＨＢＡ−Ｂ型肝炎抗原（組換えまたは他の方法に
よる）；他の肝炎ペプチド；ＨＩＶタンパク質ＧＰ１２０およびＧＰ１６０；マ
イコプラズマ細胞壁リピド；任意の腫瘍関連抗原；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；腫
瘍特異的抗原として発現される他の胎児性ペプチド；細菌細胞壁グリコリピド；
ガングリオシド（ＧＭ２，ＧＭ３）；マイコバクテリアグリコリピド；ＰＧＬ−
１；Ａｇ８５Ｂ；ＴＢＧＬ；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅから
の淋菌ｌｉｐ−オリゴヌクレオチドエピトープ２Ｃ７；Ｌｅｗｉｓ（ｙ）；Ｇｌ
ｏｂｏ−Ｈ；Ｔｎ；ＴＦ；ＳＴｎ；ＰｏｒＡ；ＴｓｐＡまたはウイルスグリコリ
ピド／グリコタンパク質および表面タンパク質等が包含される。
【００３２】 抗原分子はペプチド抗原の形でもまた処置動物における発現に適した形で抗原
性ペプチドをコードする核酸として免疫系を提供する。抗原はまたグリコリピド
またはグリコペプチドであってもよい。いずれにしても、抗原は完全な抗原であ
るか、または完全な抗原のフラグメントであり少なくとも１個の治療的に関係の
あるエピトープを包含する。本出願で使用される「治療的に関係のあるエピトー
プ」の語はそのエピトープに対する免疫応答の増強が治療的利益をもたらすエピ
トープを意味する。したがってこの語は、高度に免疫原性であっても完全な抗原
または抗原性ソース（たとえば、細菌）に向けられた免疫応答を生じないフラグ
メントは除外される。同じ標的抗原からの多重エピトープまたは2もしくはそれ
以上の異なる標的抗原からのエピトープ（ポリトープワクチン）を包含する混合
抗原も使用できる。後者の場合、抗原は同じタイプまたは異なるタイプである（
たとえば、ペプチド＋ペプチド、グリコペプチド＋ペプチド、グリコペプチド＋
グリコペプチド）。
【００３３】 本発明のワクチン組成物は、リピド−核酸粒子および抗原性分子からなる。本
発明の好ましい実施態様においては、抗原性分子はリピド核酸−粒子に会合して
いる。
【００３４】 本発明のワクチンは筋肉内または皮下注射によって投与することができること
に留意すべきである。これは製造のある種の拘束を低下させ、静脈内投与のため
の組成物の調製に望ましい。とくに、大きいサイズ（１５０〜３００ｎｍ）のリ
ピド粒子を使用することが可能で、これは高価につく押し出し工程をなくすか減
らすことができる。さらに、粒子は循環させる必要がないので、リピド成分の選
択は安価な材料を好んで偏向させることができる。たとえば、Ｃｈｏｌの量を減
らし、ＤＳＰＣは剛性の低いものたとえばＤＯＰＣまたはＤＭＰＣに置換し、Ｐ
ＥＧ−リピドは高価でないＰＥＧ−アシル鎖に置換することができる。
【００３５】 Ｂ．組成物の製造 Ｂ．１ 製造 本発明の組成物の製造および調製は任意の技術によって達成できるが、とくに
好ましい方法はエタノール透析または界面活性剤透析法であり、以下の特許およ
び特許出願に詳細に記載されている。すなわち、ＵＳ特許５，７０５，３８５；
ＵＳ特許出願ＳＮ０８／６６０，０２５；０９／１４０，４７６；０８／４８４
，２８２；０８／８５６，３７４；０９／０７８９５４；０９／０７８９５５；
６０／１４３，９７８；およびＰＣＴ公告ＷＯ９６／４０９６４およびＷＯ９８
／５１２７８である。これらはすべて、引用により本明細書に導入される。
【００３６】 これらの方法は小規模または大規模なリピド−核酸粒子の製造方法を提供し、
優れた医薬用の特性（以下のＣ．２に記載）を有する粒子が発生する。これらの
技術については一部の特定の実施態様を以下の実施例に示す。
【００３７】 界面活性剤透析およびエタノール透析に加えて、本発明の粒子を発生させるた
めには、きわめて困難ではあるが、古典的なリポソーヌ製造技術を使用すること
もできる。受容的負荷、能動的負荷（ｐＨ勾配による）、リピドフィルム再水和
、押し出し／サイジング、脱水等の旧来の技術は上述の特許書類を含めて、ほか
に詳細に述べられている。
【００３８】 これらの古典的な技術は、付加的な慣用の治療剤を本発明の組成物中に導入す
る場合に使用することが期待できる。細胞傷害化合物たとえばドキソルビシン、
ダウノルビシン、ビンカアルカロイドたとえばビンクリシチンおよびビンブラス
チンを含有する三級または四級アミンの負荷は、リピド−核酸粒子の製剤化後に
達成できる。粒子の下部空間ははじめの製剤化操作における低ｐＨ４．２に維持
することが便利である。中性緩衝溶液中の治療的物質の中和粒子への添加は、本
技術分野において周知なように、粒子の負荷に十分である。
【００３９】 本発明のワクチン組成物は、応答が形成操作時には望ましい弱い抗原の添加ま
たは形成後の操作により調製される。抗原の導入手段には、１．形成過程におけ
る受動封入（すなわちＯＤＮ溶液との配置）；２．グリコリピドおよび他の抗原
性リピドの場合には、リピドのエタノール混合物中への導入およびそれ自体好ま
しいプロトコールによる形成；３．挿入後（すなわち、抗原−リピドは形成され
た小胞中に小胞を抗原−リピドミセルとインキュベートすることにより添加でき
る）；および４．リピドがリンカー残基とともに製剤化粒子中に包含され、リン
カーは所望の抗原をカップリングするように製剤化後に活性化される方法がある
。標準的なカップリングおよび架橋方法は本技術分野において周知である。別の
製造法では、核酸を含有しないリピド粒子中に抗原を導入し、これらの粒子を患
者への投与前にリピド−核酸粒子と混合する。
【００４０】 本発明の組成物の特徴 それらの製造に使用した技術とは関係なく、本発明の組成物は以下の好ましい
特徴を有する。 本発明のリピド−核酸粒子は内部空間に完全に封入されたリピド膜（一般的に
は、リン脂質二重層）外面からなる。ときにリピド膜小胞とも呼ばれるこれらの
粒子は、直径５０〜２００ｎｍ，好ましくは６０〜１３０ｎｍの小さな粒子であ
る。静脈内投与のためには、９５％の粒子が平均３０ｎｍ以内の比較的均一なサ
イズの粒子であることが最も好ましい。核酸および他の生物活性物質は下方空間
に含有されるか、または封入膜の内部表面と会合している。
【００４１】 「完全に封入」の語は粒子中の核酸が血清に暴露後または有意に遊離ＤＮＡに
分解されるヌクレアーゼアッセイ後、有意に分解されないことを意味する。完全
に封入されたシステムでは、遊離核酸の１００％が通常分解される処理で好まし
くは２５％未満、さらに好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満の粒状
核酸しか分解されない。また、完全な封入はＯｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）アッ
セイによって決定される。完全な封入は、粒子が血清に安定であること、すなわ
ちそれらはインビボ投与時にそれらの成分部分に速やかには分解されないことを
示唆する。
【００４２】 これらの特性が、本発明の鍵となる粒子とリピド核酸凝集体（陽イオン性複合
体またはリポプレックスとしても知られる）たとえばＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（Ｌ
ＩＰＯ ＦＥＣＴＩＮ，登録商標）製剤との区別する。これらの凝集体は一般に
はるかに大きい（＞２５０ｎｍ）直径を有し、ヌクレアーゼ消化に完全には抵抗
せず、それらは一般にインビボにおける投与時に分解される。陽イオン性リピド
−核酸は上述のように弱い抗原と凝集し、局所および部位適用たとえば筋肉内、
腹腔内および鞘内投与に適当なワクチンを提供する。
【００４３】 本発明の粒子は広範囲の薬物：リピド比で製剤化することができる。本明細書
で使用される「薬物：リピド比」の語は、製剤の所定容量中における治療的核酸
の量（すなわち、封入され、血液に暴露されても迅速には分解されない核酸の量
）を同容量中のリピド量で除した値を意味する。これはモル／モル、重量／モル
または重量／重量のベースで決定される。薬物対リピドの比は与えられた用量の
核酸と会合するリピドの用量を決定する。可能な最高の薬物対リピド比が必ずし
も最も効力の高い製剤ではないことに注意すべきである。本発明の粒子は０．０
０１〜０．４５の薬物：リピド比（ｗ／ｗ）の範囲で有用である。
【００４４】 ワクチン組成物は、粒子と会合した（共有結合または非共有結合のいずれかに
よる）弱い抗原を有することを除いて、本発明の他の粒子と同様である。
【００４５】 Ｃ．リピド核酸組成物の使用 その最も広い意味において、ここに記載される発明はリピド製剤化核酸の組成
物および哺乳動物に免疫応答の誘導のためのそれらの使用方法に関する。免疫刺
激核酸の従来技術における使用に比較して、本発明には以下の著しい、驚くべき
利点を有する。
【００４６】 １．核酸の遊離製剤と比較して、使用したリピド製剤は核酸を異なる細胞およ
び免疫系成分に送達し、それらをこれらの細胞および成分に異なる様式で提供し
、したがって有意に異なり改良された免疫応答を与える。その一部は以下の実施
例に例示する。
【００４７】 ２．核酸の遊離製剤と比較して、リピド製剤では免疫応答を与えるオリゴヌク
レオチドの量を有意に低下させることを要求し、したがって経費および毒性の可
能性が減少する。
【００４８】 ３．リピド製剤は、遊離型では送達できない化合物、ホスホジエステルオリゴ
ヌクレオチドを免疫刺激に使用するため送達することができる。
【００４９】 ４．リピド製剤は正常には非−ＩＳＳ核酸をＩＳＳ核酸に変換することが可能
であり、したがって新しいクラスのＩＳＳが創製される。
【００５０】 ５．さらに強力なワクチンを核酸のリポソーム製剤中に発生させることができ
る。その免疫原に対する望ましい免疫応答はその製剤に直接および固有に伴われ
、したがって、アジュバントおよび免疫原の単純な混合の場合（ＰＣＴ公告ＷＯ
９８／４０１００，発明者Ｄａｖｉｓらに見出される）と違って、免疫原に対す
る異なる改良された免疫応答を招来する。
【００５１】 ６．核酸とともに直接「アンチセンス」作用を得るのに有用なことが知られて
いるリピド製剤を用いると（ＵＳ特許５，７０５，３８５；ＵＳ特許出願ＳＮ０
８／６６０，０２５；０９／１４０，４７６；０８／４８４，２８２；０８／８
５６，３７４；０９／０７８９５４；０９／０７８９５５；６０／１４３，９７
８；およびＰＣＴ公告ＷＯ９６／４０９６４およびＷＯ９８／５１２７８参照。
これらはすべて引用により本明細書に導入される）、本発明の製剤はともに障害
の処置に有効な相乗的免疫応答およびアンチセンス作用を生じることができる。
【００５２】 ７．核酸および細胞傷害性物質たとえばドキソルビシンを含有するリピド製剤
の共投与はともに障害の処置に有効な相乗的免疫応答および細胞傷害作用を生じ
ることができる。
【００５３】 ８．核酸のリピド製剤は、遊離型ＩＳＳ核酸に応答しないインビボモデルにお
ける治療効果が証明された。
【００５４】 これらの各利点は以下に掲げる１または２以上の実施例において例示する。
【００５５】 「免疫刺激」または「免疫応答の誘導」は介入に対する免疫系細胞または成分
の直接または間接的な応答として広く特徴づけられている。これらの応答は免疫
系細胞（Ｂ細胞，Ｔ細胞，樹状細胞、ＡＰＣ，マクロファージ，ＮＫ細胞，ＮＫ
Ｔ細胞等）の活性化、増殖または分化、マーカーの発現の上方調整もしくは下方
調整、血清中へのサイトカイン、インターフェロン、ＩｇＭおよびＩｇＧの放出
、巨脾腫（脾臓細胞充実性の増大を含む）、各種臓器の過形成および混合細胞性
浸潤を含む多くの方法で測定することができる。多くの更なる応答ならびに多く
の他の免疫系細胞および成分が本技術分野で知られている。さらに刺激または応
答は先天性の免疫細胞系細胞でも後天性免疫系細胞（たとえば、正常な弱い抗原
を含有するワクチンによるような）でもよい。免疫刺激は、直接アンチセンス作
用（ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションによる）または遺伝子発現（プラスミ
ドによる）のような核酸における他の作用の可能性からの機構に基づいて識別可
能であるが、結果において、治療有効性の所望の結果は必ずしも識別可能ではな
い。
【００５６】 Ｄ．適応症、投与および投与量 本発明の組成物および方法は、とくに、免疫系の刺激の必要性を有する任意の
患者または生物体における使用が適応である。これには、腫瘍、炎症、関節炎お
よびリウマチ、免疫不全障害等が包含される。本技術分野の熟練者は本明細書の
開示に基づく有効性試験に対して適当な適応症を選択することができる。好まし
い実施態様においては、本発明の組成物および方法は新生物（病的または病的で
ある可能性のある新生物形成細胞増殖）たとえば以下に記載の新生物の処置に使
用される。
【００５７】 本発明の組成物の対象／患者への投与にはインビボまたはエキソビボの方法が
包含される。インビボ方法には局所、領域または全身的適用が包含される。好ま
しい実施態様においては、粒子の患者のＢ細胞、マクロファージまたは脾臓細胞
へのアクセスおよび／または粒子のリンパ球増殖の刺激が可能な静脈内に投与さ
れ、上記患者にＩＬ−６，ＩＬ−１２，ＩＦＮ−γおよび／またはＩｇＭの分泌
を生じさせる。
【００５８】 本技術分野の熟練者は、製剤の毒性の可能性、たとえば補体活性化、凝集、腎
毒性、肝臓酵素アッセイ等を同定することは周知である。このような毒性は生物
体の間で相違する。以下の実施例では毒性が同定されれば記録されるが、リピド
の用量６００ｍｇ／ｋｇまで（反復投与した場合を除いて）マウスに毒性は観察
されなかった。
【００５９】 組成物の医薬製剤化には通常、送達様式を改良または補助する付加的な担体が
使用される。典型的には、本発明の組成物は、標準的な医薬実務に従い選択され
る生理学的に許容される担体たとえば食塩水またはリン酸塩緩衝液中で投与され
る。他の適当な担体には、水、０．９％食塩水、０．３％グリシン等、安定性を
強化するためにはグリコタンパク質たとえばアルブミン、リポタンパク質、グロ
ブリン等が包含される。
【００６０】 リピド−核酸粒子の投与量は、望ましいリピドの投与量、望ましい核酸の投与
量、および組成物の薬物：リピド比に依存する。哺乳動物においては、典型的な
リピドの用量は０．５ｍｇ／ｋｇ〜３００ｍｇ／ｋｇである。投与後、大量のリ
ピドが直ちにＲＥＳ細胞（たとえば、肝臓のクッパー細胞）によりクリアされ、
したがって、ＲＥＳ細胞を飽和し、粒子を循環させるための最小投与量のリピド
が一般に要求される。核酸の投与量は好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜６０ｍｇ
／ｋｇである。典型的には、哺乳動物は薬物：リピド比０．０１〜０．２５の製
剤を投与され、したがって１００ｍｇ／ｋｇのリピドおよび１〜２５ｍｇ／ｋｇ
の核酸を投与されることになる。霊長類には通常、５〜５０ｍｇ／ｋｇのリピド
および０．００５〜１５ｍｇ／ｋｇのＯＤＮが投与される。本技術分野の熟練者
は本明細書に提供された情報に基づいて適正な投与量を選択することができる。
【００６１】 （実施例） Ｅ．例： 材料および方法 オリゴデオキシヌクレオチド（「ＯＤＮ」）およびプラスミドＤＮＡ：これら
の研究に使用されるＯＤＮ（カッコ内に既知の説明を含む）およびプラスミドの
名称および５’−３’配列は次の通りである。 hICAMまたはINX-2302（ヒトICAM-1 mRNAの3’非翻訳領域）（PO & PS）; GCCCAAGCTGGCATCCGTCA 配列番号：1 mICAMまたはINX-3082（マウスICAM-1 mRNAの3’非翻訳領域）（PO & PS）; TGCATCCCCCAGGCCACCAT 配列番号：2 EGFR（ヒト表皮増殖因子mRNA, 受容体翻訳停止コドン領域）； CCGTGGTCATGCTCC 配列番号：3 c-mycまたはINX-6295（ヒト／マウスc-myc 癌原遺伝子mRNAの開始コドン領域
）（PSおよびメチル化PS）; TAACGTTGAGGGGCAT 配列番号：4 c-mycまたはINX-3280もしくはLR-3280（ヒト／マウスc-myc 癌原遺伝子mRNAの
開始コドン領域）（PS） AACGTTGAGGGGCAT 配列番号：5 c-mycまたはINX-6298（ヒト／マウスc-myc 癌原遺伝子mRNAの開始コドン領域
）（PO & PS）; AACGTTGAGGGGCAT 配列番号：5 c-myccまたはINX-6300（INX-6295に対する非-ISS対照類似組成物） TAAGCATACGGGGTGT 配列番号：6 LR-4420（INX-6295に対するISS対照類似組成物） AACGAGTTGGGGCAT 配列番号：7 LR-3001またはINX-3001（c-myb mRNAにハイブリダイズ） TATGCTGTGCCGGGGTCTTCGGGC 配列番号：8 IGF-1RまたはINX-4437（IGF-1R mRNAにハイブリダイズ） GGACCCTCCTCCGGAGCC 配列番号：9 INX-6299（INX-6298に対する対照PO） AAGCATACGGGGTGT 配列番号：10 INX-8997（3CpGモチーフを含有する対照）（PO & PS） TCGCATCGACCCGCCCACTA 配列番号：11
【００６２】 使用したプラスミドＤＮＡは、ルシフェラーゼ発現プラスミド，ｐＣＭＶｌｕ
ｃ１８（ｐＣＭＶＬｕｃとも呼ばれる）であった。プラスミドは以前に記載され
たように大腸菌内で生成され、単離され、精製された（Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｊ．Ｊ
．，Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．，Ｏｓｓａｎｌｏｕ，Ｍ．，ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｉ
．，Ｇｒａｈａｍ，Ｒ．Ｗ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｐ．，Ｈｏｐｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｓ
ｃｈｅｒｒｅｒ，Ｐ． ＆ Ｃｕｌｌｉｓ，Ｐ．Ｒ．，１９９９，Ｇｅｎｅ Ｔ
ｈｅｒ．６：２７１−２８１）。（またＭｏｒｔｉｍｅｒ Ｉ，Ｔａｍ Ｐ，Ｍ
ａｃＬａｃｈｌａｎ Ｉ，Ｇｒａｈａｍ ＲＷ，Ｓａｒａｖｏｌａｃ ＥＧ，Ｊ
ｏｓｈｉ ＰＢ，Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎ
ｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅ
ｓ ｍｉｏｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９９，６：４
０３−４１１も参照）。
【００６３】 ホスホジジエステル（ＰＯ）およびホスホロチオエート（ＰＳ）ＯＤＮはＨｙ
ｂｒｉｄｏｎ Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍ
Ａ）から購入したか、Ｉｎｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂｕｒｎｂ
ｙ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）で合成された。メチル化ＯＤＮは標準技術によってＩ
ｎｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（ＵＳＡ），Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒ
ｄ ＣＡ）により製造された。骨格組成物は31Ｐ−ＮＭＲによって確認された。
すべてのＯＤＮはエンドトキシンについて特異的に分析されたが、含量は０．０
５ＥＵ／ｍｇ未満であった。
【００６４】 例１ このシリーズの実施例はとくに、ポリエチレングリコール-リピド接合体を含
む立体的に安定なリポソームは、リポソームが核酸を含有する場合に免疫原性で
あることを例示し、このような組成物の使用を確認する。
【００６５】 化学物質およびリピド：ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ
−３−ホスホコリン）およびポリエチレングリコール接合−ジステアロイルホス
ファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ2000−ＤＳＰＥ）はＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌ
ａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｐｅｌｈａｍ，ＡＬ）またはＮｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉ
ｄｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）から購入した。コレステロー
ル（ＣＨ）はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。１，２−ジ
オレオイル−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）はＳｔ
ｅｖｅｎ Ａｎｓｅｌｌ博士（Ｉｎｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃ
ｏｒｐ．）により合成されたか、またはＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ
ｓから購入した（ＤＯＤＡＰのみ）。１−Ｏ−（２’−（ω−メトキシポリエチ
レングリコール）スクシニル）−２−Ｎ−ミリストイルスフィンゴシン（ＰＥＧ
−ＣｅｒＣ14）および１−Ｏ−（２’−（ω−メトキシポリエチレングリコール
）スクシニル）−２−Ｎ−アラキドイルスフィンゴシン（ＰＥＧ−ＣｅｒＣ20）
はＺｈａｏ Ｗａｎｇ博士（Ｉｎｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏ
ｒｐ．）によって合成された。［3Ｈ］−コレステリルヘキサデシルエーテル（
ＣＨＥ）はＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から入手した。すべて
のリピドは＞９９％以上の純度であった。すべての試薬はさらに精製することな
く使用した。
【００６６】 ＯＤＮおよびプラスミドの封入：ＤＳＰＣ：ＣＨ：ＤＯＤＡＰ：ＰＥＧ−Ｃｅ
ｒＣ14（ＡＳ４２００とも呼ばれる）またはＤＳＰＣ：ＣＨ：ＤＯＤＡＰ：ＰＥ
Ｇ−ＣｅｒＣ20（ＡＳ４２０４とも呼ばれる）からなる安定化アンチセンス−リ
ピド粒子および封入されたＰＳ ＯＤＮは本特許出願の母体の特許出願すなわち
ＵＳ特許出願一連番号０８／８５６，３７４，０９／０７８９５４，０９／０７
８９５５およびＰＣＴ公告ＷＯ９８／５１２７８（すべて、本特許出願の譲受人
に譲渡され、引用により本明細書に導入される）に記載のように調製された。通
常、総リピド１０００ｍｇを１００ｍｌのエタノールに溶解した。ＯＤＮを含む
溶液を別のフラスコ中、３００ｍＭのクエン酸，ｐＨ４．０，６０ｍｌに２００
ｍｇ（Ａ260に基づいて）を溶解して調製した。ＯＤＮ溶液にリピド溶液を２６
Ｇの針を通して、絶えず攪拌しながら滴下した。混合物を、６５℃に維持した恒
温槽押出機（Ｌｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂ
Ｃ，Ｃａｎａｄａ）を使用して二重の８０ｎｍポリカルボネートフィルター（Ｐ
ｏｒｅｔｉｃｓ）を１０回通過させた。１０００００Ｍ．Ｗ．カットオフの接線
流装置を用いてクエン酸緩衝液を２０容量の２０ｍＭ ＰＢＳ／１４５ｍＭ Ｎ
ａＣｌと交換した。この工程は過剰のエタノールおよび封入されなかったＯＤＮ
を除去し、インビボ投与に適合する等張性溶液を発生させる。接線流を用いてＳ
ＡＬＰプレパレーションを濃縮し、１．５ｍｇ／ｍｌ ＯＤＮに調整し、０．２
２μＭ膜を通して滅菌ろ過し、４℃で保存した。ＳＡＬＰの平均直径およびサイ
ズ分布を、ＮＩＣＯＭＰ型３７０サブミクロン粒子サイザーを用いて測定すると
、通常１１０±３０ｎｍであった。低いオリゴヌクレオチド：リピド重量比を含
有する製剤が必要な場合は、初期溶液のＯＤＮ濃度を、本出願の母体ケースにさ
らに記載されたように粒子を発生させる適当な比によって低下させた。別法とし
て、投与のためには、ある種のサンプルをＨＥＰＥＳ−緩衝食塩水（ＨＢＳ），
ｐＨ７．５０にスイッチし、最低１２時間透析して外部クエン酸緩衝液をＨＢＳ
で置換した。これは外部二重層におけるＤＯＤＡＰの大部分を中性にし、表面に
結合したアンチセンスを放出させた。さらに非封入アンチセンスはついで、ＤＥ
ＡＥ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーによりＡＳ４２００／４から除去
した。ＰＯ−ＯＤＮおよびプラスミド製剤については、使用した初期緩衝液は２
０ｍＭクエン酸，ｐＨ４．０である。プラスミド製剤は押出さなかったので、約
２００ｎｍの粒子を生じた。ＡＳ４２００またはＡＳ４２０４製剤中に封入した
ＯＤＮは本明細書では場合によりＯＤＮの名称で言及するが、ＩＮＸまたはＩＮ
ＸＣ（すなわちＩＮＸＣ−６２９５）に変更する。
【００６７】 本技術分野で既知の標準リポソーム法により対照製剤を調製した。ＤＳＰＣ：
ＣＨおよびＤＳＰＣ：ＣＨ：ＰＥＧ2000−ＤＳＰＥ小胞はＨｏｐｅら（４１）の
方法に従い、ＨＢＳ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，１４５ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．
４）中水性水和によって乾燥リピドフィルムから調製した。同様に、ＯＤＮの封
入は１．０ｍｌ ＨＢＳ中１００ｍｇのＯＤＮを１００ｍｇのリピドで水和し、
ついで５サイクルの凍結−解凍、および二重の１００ｎｍフィルターを通しての
押出しにより達成された。［3Ｈ］−ＣＨＥ，交換不能、代謝不能のリピドマー
カーを血液中のリピドレベルをモニターするため、すべての小胞組成物に導入し
た（４２）。得られた粒子は、ＮＩＣＯＭＰサブミクロン粒子サイザー（３７０
型）を用いる準弾性散乱により判定して直径約１１０〜１４０ｎｍであった。こ
の方法における封入効率は通常１０％未満である。非封入ＯＤＮはＤＥＡＥ−ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂを用いる陰イオンクロマトグラフィーによりプレ
パレーションから除去する。遊離のオリゴヌクレオチドをＨＢＳに溶解し、Ａ26 0 によって要求用量（３５μｇ／ｍｌを与え、１．０のＡ260と仮定する）に調整
する。ドキソルビシンをオリゴヌクレオチドとともに封入する場合、オリゴヌク
レオチド含有粒子はまずこれらの方法により調製し、ついで標準ｐＨ負荷技術を
用いて所望の濃度に粒子中に負荷する。ドキソルビシン遮断実験は、ｐＨ負荷に
よって調製したＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ封入ドキソルビシン（約１０ｍｇ／リピド／
ｋｇおよび０．０５〜０．２ｍｇ Ｄｏｘ／ｋｇ）を用いＡＳ４２０４注射前２
４時間にマウスに投与して実施した。
【００６８】 マウス：雌性、７〜８週齢のＩＣＲ，Ｃ５７ＢＬ／６およびＢａｌｂ／ｃ マ
ウスをＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉ
ｓ，ＩＮ）から入手した。Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕおよびＢａｌｂ／ｃ ＳＣ
ＩＤ−Ｒａｇ２ マウスはＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂ
ａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手し、病原体のない状態下に維持した。すべ
ての動物は使用の少なくとも１週前に検疫を行った。動物に関するすべての操作
は動物の看護に関するカナダ州議会によって確立された指針に従って実施した。
【００６９】 投与量：マウスには、とくに他の指示がない限り、試験期間中隔日に投与を行
った（指示したように総計７または１０用量）。試験サンプルおよび対照の投与
は尾静脈注射を介して実施した（注射容量：２００μｌ）。とくに他の指示がな
ければ、これらの製剤についてのリピド用量は１００ｍｇ／ｋｇ／用量に調整し
た。異なる薬物：リピド比を用いた実験では、すべての製剤についてのリピド用
量は８０ｍｇ／ｋｇ／用量に調整した。サンプルは注射の前にろ過する（０．２
２μｍ）。外部緩衝液はＨＢＳ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，１４５ｍＭ ＮａＣｌ
，ｐＨ７．４５）である。
【００７０】 循環からのリポソームの除去：血液からのリポソーム消失（本明細書では「血
中からのリポソームの回収」とも呼ぶ）の評価には、マウスに側方尾静脈を介し
て、空のリポソ−ム（５０ｍｇ／ｋｇ リピド）またはリポソーム封入ＯＤＮ（
他の指示がなければ、５０ｍｇ／ｋｇ リピドおよび２０ｍｇ／ｋｇ ＯＤＮ）
含有１μＣｉ／マウス［3Ｈ］−ＣＨＥの単回静脈内用量を投与した。投与は他
の指示がない限り毎週とした。滅菌したメスを用いて尾狭窄によって注射１時間
後に血液（２５μｌ）を収集し、ガラスシンチレーションバイアル中２００μｌ
の５％ＥＤＴＡ中に加えた。ついで血液を消化し（Ｓｏｌｖａｂｌｅ，登録商標
，Ｐａｃｋａｒｄ）、脱色し、標準シンチレーション技術を用いて放射能を製造
業者の指示に従って分析した。尾狭窄操作は心臓穿刺によって血液を採取したマ
ウス群の場合にきわめて類似した結果を生じたが、データはすべて同じ動物群か
ら収集されるのでさらに有用であった。
【００７１】 図１Ａ〜Ｃは、免疫コンピーテントＢａｌｂ／ｃマウス（図１Ａ）、および免
疫コンプロマイズＢａｌｂ／ｃヌードマウス（図１Ｂ）およびＢａｌｂ／ｃ Ｓ
ＣＩＤ−Ｒａｇ２マウス（図１Ｃ）に反復投与した場合のＰＥＧ−リポソームの
循環レベルを示す。マウス静脈内（ｉ．ｖ．）に、空のＤＳＰＣ：ＣＨ：ＰＥＧ 2000 −ＤＳＰＥリポソーム（ａ），ＤＳＰＣ：ＣＨ：ＰＥＧ2000−ＤＳＰＥリポ
ソーム含有ｈＩＣＡＭ ＰＳ ＯＤＮ（ｂ），空のＳＡＬＰ（ＰＥＧ−ＣｅｒＣ 20 ，ｃ），またはＳＡＬＰ（ＰＥＧ−ＣｅｒＣ20，ｄ）含有ｈＩＣＡＭ ＯＤＮ
を注射した。リピドの用量は５０ｍｇ／ｋｇであった。ＤＳＰＣ：ＣＨ：ＰＥＧ 2000 およびＳＡＬＰ（ＰＥＧ−ＣｅｒＣ20）についてのＯＤＮ／リピド比はそれ
ぞれ０．０５および０．２０であった。注射は毎週投与し、注射１時間後の循環
レベルをリピド標識［3Ｈ］−ＣＨＥによりモニターした。バーは１回目（白）
、２回目（バックスラッシュ）、３回目（フォワードスラッシュ）および４回目
（格子）を表す。バーはすべて８匹のマウスの平均および標準偏差を示す。「ａ
」および「ｃ」欄に反映されるように、動物の免疫状態とは無関係に空のＰＥＧ
−リピド含有小胞については消失に差は観察されなかった。しかしながら、２回
目および以後の注射後にはＯＤＮ含有小胞の驚くべき迅速な消失（１時間で血液
中に注射用量の＜２０％が残存）が観察された。この効果は著しい病的状態を伴
い一部の例では注射後３０分以内に動物の死亡を生じた。この迅速な消失はＴ−
細胞欠損Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスでも観察されたが、Ｂ−細胞およびＴ−細胞
欠損Ｂａｌｂ／ｃ ＳＣＩＤ−Ｒｅｇ２マウスでは認められず、応答はＢ−細胞
および免疫グロブリンの存在に依存することが確立された。
【００７２】 図２ＡおよびＢはＳＡＬＰ（ＰＥＧ−Ｃｅｒ20）の消失に対する核酸配列（Ａ
）および構造（Ｂ）の影響を示す。マウスには様々なヌクレオチド配列のＳＡＬ
Ｐ（ＰＥＧ−ＣｅｒＣ20）含有ＰＳ ＯＤＮをｉ．ｖ．注射した（図２Ａ）。ホ
スホジエステル（ＰＯ）ｈＩＣＡＭ ＯＤＮおよび細菌性プラスミドＤＮＡにつ
いても評価した（図２Ｂ）。リピドの用量は５０ｍｇ／ｋｇに調整し、各製剤の
ＯＤＮ／リピド比は約０．２０であった。注射は毎週投与し、注射１時間後の循
環レベルを、リピド標識［3Ｈ］−ＣＨＥによりモニターした。バーおよび動物
数は図１Ａ〜Ｃの説明中に指示する。ｉ．ｖ．投与後、ＳＡＬＰ（ＰＥＧ−Ｃｅ
ｒＣ20）中に封入したＰＳ ＯＤＮはすべて死亡を誘発し、反復投与により循環
から速やかに消失した。これはＯＤＮのＩＳＳ（ｈＩＣＡＭ，ｃ−ｍｙｃ，ｃ−
ｍｙｃＣ）または非−ＩＳＳ（すなわち、ｍＩＣＡＭ，ＥＧＦＲ）状態に無関係
に観察された。図２Ｂは血液からの粒子の迅速な消失は封入された核酸がＰＳ，
ＰＯまたはプラスミドであるかに無関係に起こることを示す（毎週の注射は注射
１時間後にモニターした）。
【００７３】 図３は、ＤＮＡ対リピド比およびリポソーム回収の間の関係を示す。マウスに
様々なＯＤＮ／リピド比でｈＩＣＡＭ ＰＳ ＯＤＮを含むＳＡＬＰ（ＰＥＧ−
ＣｅｒＣ20）をｉ．ｖ．注射した。リピドの用量は５０ｍｇ／ｋｇに調整した。
注射は毎週投与し、注射１時間後の循環レベルをリピド標識［3Ｈ］−ＣＨＥに
よりモニターした。バーおよび動物数は図１Ａ〜Ｃの説明中に指示する。図から
明らかなように結果は０．０４０以上の薬物：リピド比（ｗ／ｗ）を含む粒子は
迅速なクリアランス応答を誘導し、一方０．０４０未満の粒子は反復投与後にも
クリアランスは起こらないことを示す。これは免疫系がクリアランス応答を起こ
す前に核酸の閾値量（または濃度）を認識することを示唆する。また０．０４０
ｗ／ｗ未満の粒子は直接アンチセンス作用を得るのに有用であり、ＡＳ４２０４
（長期循環）製剤における反復投与に際して迅速なクリアランスが回避される。
【００７４】 図４は迅速なクリアランス応答の発生に対する投与スケジュールの影響を示す
。マウスに様々な用量スケジュールでｈＩＣＡＭ ＰＳ ＯＤＮを含むＳＡＬＰ
（ＰＥＧ−ＣｅｒＣ20）をｉ．ｖ．注射した：毎日（○）、隔日（●）、３日に
１回（□）および毎週（■）である。リピドの用量は５０ｍｇ／ｋｇに調整し、
注射１時間後の循環レベルをリピド標識［3Ｈ］−ＣＨＥによりモニターした。
記号は８匹のマウスの平均および標準偏差を表す。粒子のＤ：Ｌ比は閾値クリア
ランス誘導レベル以上である。図４に示すように、ＳＡＬＰをどのような頻度で
投与しても（毎日，２，３または７日に１回）無関係に、マウスに迅速なクリア
ランス応答能を発生させるには少なくとも５日を要する。毎日注射した場合、循
環担体の血漿レベルは最初の３回の注射にわたって上昇する。これは、与えられ
た用量のＰＥＧ−コートリポソームの３０〜４０％が注射２４時間後に循環中に
残存することを考えれば驚くことではない。しかしながらこの上昇に続いて、以
後の用量の循環レベルは劇的に低下した。すべての投与スケジュールにおいて、
以後の用量の迅速な消失は最初の投与から４〜６日後に観察された。これらの結
果は、クリアランス応答を起こす免疫系成分は最初の投与後に飽和し、介入する
投与回数には無関係にクリアランス応答のプロセッシングおよび発生にはほぼ５
〜６日を要することが確認される。これは体液性（ＡＢ）応答の発生を示唆する
。
【００７５】 図５ＡおよびＢはＯＤＮ含有リポソームの迅速な消失におけるＰＥＧ−リピド
の役割を例示する。図５Ａに記録した最初の実験では、マウスに空のＳＡＬＰ（
ＰＥＧ−ＣｅｒＣ20，ａ），ＳＡＬＰ（ＰＥＧ−ＣｅｒＣ20，ｂ），空のＳＡＬ
Ｐ（ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14，ｃ），ＳＡＬＰ（ＰＥＧ−Ｃｅｒ14，ｄ），空のＤＳ
ＰＣ：ＣＨリポソーム（ｅ）またはｈＩＣＡＭ ＰＳ ＯＤＮ含有ＤＳＰＣ：Ｃ
Ｈ（ｆ）をｉ．ｖ．注射した。リピドの用量は５０ｍｇ／ｋｇに調整し、注射１
時間後の循環レベルをリピド標識［3Ｈ］−ＣＨＥによりモニターした。バーお
よび動物数は図１の説明中に指示する。図５Ｂに記録した第二の実験では、ＰＥ
Ｇ−ＣｅｒＣ20（●）とＰＥＧ−ＣｅｒＣ14（○）の交換の時間経過を、マウス
の血漿中で２４時間にわたって［3Ｈ］−ＰＥＧ−セラミドと［14Ｃ］−ＣＨＥ
の比をモニタリングすることによって評価した。記号は６匹のマウスの平均およ
び標準偏差である。
【００７６】 ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14はＰＥＧ−ＣｅｒＣ20よりも短いアシル鎖リピド−アンカ
ーを有し、したがって二重層からより容易に交換される（ｔ1/2インビボ＝〜３
分ｖｓ．＞２４時間）。ＰＥＧ−Ｃｅｒ14が本発明の粒子に用いられた場合、Ｃ
ｅｒ20含有ＳＡＬＰ（カラムｂ）に比較して反復投与（カラムｃおよびｄ）時に
迅速なクリアランスは検出されない。空もしくはＯＤＮを有するＤＳＰＣ：ＣＨ
小胞またはＰＥＧ−Ｃｅｒ14製剤のいずれでも何ら差を示さず、本発明者らは粒
子の外部二重層は迅速なクリアランスの発生に必須であると結論する。
【００７７】 図６はＰＥＧ−Ｃｅｒ20ＳＡＬＰ含有ＯＤＮの前３週注射後に実施したクロス
オーバー試験の結果であり、クリアランス応答が開始された。マウスには、ＳＡ
ＬＰ（ＰＥＧ−ＣｅｒＣ20）を計４回週間隔でｉ．ｖ．注射し、図１Ａ〜Ｃで観
察されたのに類似の消失プロファイルを生じた。最終注射で、マウスには、ＳＡ
ＬＰ（ＰＥＧ−ＣｅｒＣ20），空のＳＡＬＰ（ＰＥＧ−ＣｅｒＣ20），空のＤＳ
ＰＣ：ＣＨ：ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ小胞，空のＳＡＬＰ（ＰＥＧ−ＣｅｒＣ 14 ）またはＤＳＰＣ：ＣＨリポソームのいずれかを投与した。各場合、リピドの
用量は５０ｍｇ／ｋｇに調整して、注射１時間後の循環レベルをリピド標識［3
Ｈ］−ＣＨＥによりモニターした。各バーは８匹の動物の平均および標準偏差で
ある。４回目の投与では、それらがＯＤＮをもつか否かには無関係にＰＥＧ−リ
ピドが外部リピド単層に維持される場合には、クリアランス応答はもっぱらそれ
らの粒子に向けられたことが証明されたのに対し、非−ＰＥＧ−リピド製剤では
クリアされない。これは一旦、粒子の外部表面上において前に弱い免疫原を認識
することを学習すれば、クリアランス応答は粒子の（内部）ＯＤＮ状態に依存し
ないことを確立するものである。ワクチンは最初、ＯＤＮ含有フォーマットで投
与され、ついで病原体により患者にチャレンジすると、病原体のＯＤＮ状態とは
関係なく認識される。
【００７８】 例２ この一連の実施例はさらに免疫刺激リピド−核酸粒子に対する応答を例示する
。使用したこれらの方法は実施例１の材料および方法とは以下の相違がある。
【００７９】 これらの試験には以下のマウス株を使用した。すなわち、ＩＣＲ，Ｂａｌｂ／
ｃ，Ｂａｌｂ／ｃヌード，Ｂａｌｂ／ｃ ＳＣＩＤ−Ｒａｇ２，Ｃ５７ＢＬ／６
である。すべてＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａ
ｐｏｌｉｓ，ＩＮ）またはＴａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ
，ＮＹ）から市販されている。
【００８０】 これらのマウスの腫瘍モデルは次のように確立された。 Ｂ１６／ＢＬ６ マウスメラノーマ：細胞［ＮＣＩカタログＢ１６ＢＬ−６］
を１０％ＦＢＳ補充ＭＥＭメジウム中の培養液に維持した。試験日０に、３×１
０5の細胞をＣ５７ＢＬ／６雌性マウス（２０〜３０ｇ）の腹側背部に皮下（ｓ
．ｃ．）投与した（注射用量：５０ｍｌ）。通常、１５％余分のマウスに非回転
楕円形状の腫瘍を注射するか、または腫瘍が観察されないマウスを試験から除外
した。腫瘍を５〜７日間生育させたのち、試験サンプル／対照による処置を開始
し、ランダムにグループ分けした。腫瘍が５０〜１００ｍｍ3になったときに処
置を開始した。
【００８１】 ＤｏＨＨ２ヒト濾胞性リンパ腫：ＤｏＨＨ２細胞（Ｋｌｕｉｎ−Ｎｅｌｅｍａ
ｎｓ ＨＣら，１９９１，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ５（３）：２２１−２２４に記載
された非ホジキンＢ−細胞リンパ腫細胞系）を、１０％ＦＢＳ補充ＲＰＭ１メジ
ウム培養液に維持した。試験の日０に、５×１０6細胞をＳＣＩＤ／Ｒａｇ−２
雌性マウス（２０〜３０ｇ）に静脈内注射した（ｉ．ｖ．；注射容量，２００
μｌ ＨＢＳＳ）。腫瘍を３日間生育させたのち、試験サンプル／対照による処
置を開始した。日３に投与前、マウスをランダムにグループ分けした。
【００８２】 ルーイス肺：マウスルーイス肺癌細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１６４２）を１０
％ＦＢＳ補充ＭＥＭメジウム中で生育させた。試験の日０に３×１０5の細胞を
背部に皮下（ｓ．ｃ．）注射した（注射容量，１００μｌ）。腫瘍を３日間生育
させたのち、試験サンプル／対照による処置を開始した。一次腫瘍の容量はカリ
パスを用いて測定した。
【００８３】 ＮＧメラノーマ：Ｒｅｇｉｎａ Ｅｌｅｎａ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕ
ｔｅの外科部門（Ｒｏｍｅ，Ｉｔａｌｙ）の患者の生検から得られたヒト一次メ
ラノーマをＬｅｏｎｅｔｔｉ，Ｃら，１９９６，Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓ
ｔ．８８（７）：４１９−４２９におけるセットアウトとして用いた。６週齢の
ＣＤ−１ 雄性ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスの後肢筋肉に２．５×１０6ＮＧ細
胞懸濁液を注射した。移植後日４にはすべてのマウスで約７０ｍｇの腫瘍マスが
明らかであった。すべての実験はヌードマウスのＮＧ腫瘍の５〜８継代間に実施
した。
【００８４】 有効性／効力終点：「腫瘍サイズ（または容量）の増大」として記載される結
果は以下のように測定した。すなわち、一次腫瘍容量はカリパスを用いて測定し
た。隔日（非注射日）の長さ（ｍｍ）、幅（ｍｍ）および高さ（ｍｍ）の測定を
試験期間中実施した。腫瘍容量は次式で計算された。 腫瘍容量（ｍｍ3）＝（π／６）（Ｌ×Ｗ×Ｈ） 腫瘍の容量が体重の１０％に達したときまたは潰瘍の最初の徴候が表れたとき
、マウスを屠殺した（ＣＯ2吸入または全身麻酔後の頚椎脱臼）。
【００８５】 「腫瘍重量阻止」（「ＴＷＩ％」）は、処置群の平均腫瘍重量を対照群の平均
腫瘍重量で除し、１を引き１００倍して計算する。「腫瘍の成長遅延」（「Ｔ−
Ｃ」）は処置群（Ｔ）が任意の測定腫瘍重量（すなわち、２５０ｍｇ）に達した
日におけるメジアンタイムから対照（Ｃ）群が同じ値に到達した日におけるメジ
アンタイムを引いて計算する。
【００８６】 「生存率」または「生存％」は初期の試験グループの動物数に基づいて計算さ
れる。動物看護のカナダ州議会の指針に従い死亡を終点として使用しなかった。
それに代えて、動物は毎日観察し、これらのモデルで典型的に後肢の麻痺として
表現される死亡または危篤状態の最初の徴候で安楽死させた。安楽死の場合には
、翌日に動物の死亡として記録した。他の終点：
【００８７】 ＩｇＭおよびＩｇＧの産生／クリアランス：組成物に対する免疫応答として発
生したＩｇＭおよびＩｇＧ抗体は、マウスより採集した血液サンプルから適当な
ＥＬＩＳＡアッセイいよって測定した。
【００８８】 腫瘍蓄積：ＯＤＮの腫瘍蓄積をモニターするために、動物に遊離または安定化
アンチセンス−リピド粒子（ＳＡＬＰ）に封入した［3Ｈ］−標識ＯＤＮ（２０
０μｌ）を静脈内注射した。送達システムの運命をモニターするために、［14Ｃ
］−コレステリルヘキサアデシルエーテルを交換不能、代謝不能なリピドマーカ
ーとしてＳＡＬＰに導入した。様々な時点で、マウスを安楽死させ、腫瘍を外科
的に除去して秤量し、Ｆａｓｔ Ｐｒｅｐチューブに取った。ＰＢＳ（５００μ
ｌ）をそれぞれのチューブに加え、サンプルをＢｉｏ １０１ Ｆａｓｔ Ｐｒ
ｅｐ ＦＰ１２０装置（Ｓａｖａｎｔ）を用いて３×８秒ホモジナイズした。腫
瘍ホモジネートのアリコート（１００〜２００μｌ）をついで組織ソリュビライ
ザー（Ｓｏｌｖａｂｌｅ，登録商標，Ｐａｃｋａｒｄ）５００μｌ中に取り、製
造業者の指示書に従い消化し、脱色した。得られたサンプルを５．０ｍｌのＰｉ
ｃｏ−Ｆｌｕｏｒｏ ４０（登録商標）シンチレーションカクテルに加え、標準
液体シンチレーション法を用いて総放射能を分析した。結果はμｇ ＯＮＤ当量
／ｇ組織として表した。
【００８９】 インビトロ脾臓細胞増殖アッセイ：これらの試験に使用されたＯＤＮのマイト
ジェニシティーをインビトロで脾臓細胞の増殖刺激の測定によって評価した。脾
臓細胞の懸濁液を２つのつや消し末端ガラススライドを用いてｃＲＰＭＩ中で脾
臓を穏やかに引き裂いて調製した。新たに調製された１００：１脾臓細胞懸濁液
（完全ＲＰＭＩ中５×１０6細胞／ｍｌ）のアリコートを、等容量の完全ＲＰＭ
Ｉと２×濃度のＯＤＮ（すなわち、不完全ＲＰＭＩ中１２．５，５０．０または
１００．０ｍｇ／ｍｌのＯＤＮ）を含有する９６ウエルプレートの三重のウエル
に加えた。２４時間後に、１：Ｃｉの［3Ｈ］−チミジン（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を各ウエル
に加え、培養液をさらに４８時間インキュベートした。インキュベーション時間
の終わりに、細胞をガラスフィルター上に収穫し、導入された放射能をβシンチ
レーションカウンターの使用によって測定した。適当な対照（マイトジェン：Ｃ
ｏｎＡおよびＬＰＳ，またはメジウム単独）を各プレート上でインキュベートし
た。［3Ｈ］−チミジンの取り込みは平均ＤＰＭ±ＳＥＭとして表す。
【００９０】 図７ＡおよびＢはＡＳ−４２００製剤がある種の固形腫瘍に蓄積することを示
す。ＡＳ−４２００製剤は時点０に静脈内投与した。マウスは指示した時点で屠
殺し、腫瘍を摘出した。ＯＤＮの蓄積を測定した。ルーイス肺腫瘍（図７Ｂ）に
おいては、それは遊離ＯＤＮよりもはるかに高度に（用量の５〜１０％ ｖｓ．
用量の１％）蓄積するが、Ｂ１６腫瘍（図７Ａ）においては、それは遊離ＯＤＮ
とほぼ同量（用量の１〜３％）蓄積するのみである。ＯＤＮの蓄積はこれらの腫
瘍の微小環境により、多分腫瘍発生のステージにより影響される。
【００９１】 図８ＡおよびＢはＡＳ−４２００製剤がＯＤＮの効力を著しく増強することを
示す。処置（リピド用量＝１００ｍｇ／ｋｇ；Ｄ／Ｌ比０．１８〜０．００５）
は腫瘍移植後日５に開始して７日間隔日に投与した（星印で指示）。「ｃ−ｍｙ
ｃ」＝ＩＮＸ−６２９５。腫瘍＝Ｂ１６マウスメラノーマ。ＡＳ−４２００製剤
では（図８Ａ）、０．５ｍｇ／ｋｇのＯＤＮ投与量は１８ｍｇ／ｋｇ ＯＤＮの
投与量と同じ効果を提供する。これは、０．５ｍｇ／ｋｇはＨＢＳ対照に比較し
て有意な効果を提供しない遊離のＯＤＮ（図８Ｂ）と対照的である。
【００９２】 図９は、ＩＮＸ−６２９８、もっぱらホスホジエステルＯＤＮはＴＣＳ（ＡＳ
４２００）中に封入された場合、腫瘍の生育を阻害するが、遊離型で送達された
場合には阻害は認められないことを示す。腫瘍容量は腫瘍の移植後日２１に測定
した。
【００９３】 表１にはＮＧヒト転移メラノーマモデルにおけるＯＤＮ製剤の有効性を証明す
る結果を示す。マウスに８連続日（＝１サイクル）、０．５ｍｇ／マウス／日（
約２０ｍｇ／ｋｇ／日）のＯＤＮ用量を提供するように後肢筋肉に２．５×１０ 6 細胞を注射した。サイクルの間には７日の間隔を置き、計３サイクルを実施し
た。ＯＤＮ：リピド比＝０．２０ｗ／ｗ。「腫瘍重量阻止」（ＴＷＩ％）は、各
サイクルの終わりに計算した。腫瘍の成長遅延（Ｔ−Ｃ）は処置および対照腫瘍
が同じサイズに達するメジアンタイム（日）である。
【００９４】 図１０はＤｏＨＨ２腫瘍を有し、腫瘍接種後４日に開始して１０日間２日置き
にｃ−ｍｙｃまたは対照ＯＤＮの各種製剤で処置したＳＣＩＤ−Ｒａｇ２ マウ
スの生存曲線である。１×１０6のｉ．ｖ．注射を受けたマウスの生存を１５０
日間モニターした。各群は５〜６匹から構成される。全く顕著に、ＰＯ−ＯＤＮ
６２９８のＡＳ４２００製剤は本質的に腫瘍を治癒することを示す（ｎ＝５〜
６マウス）。ＰＳ対照（６２９９）ＡＳ４２００は遊離のＯＤＮより有意な生存
率の上昇を示す。
【００９５】 図１１Ａはｉ．／ｖ／ＤｏＨＨ２マウスにおける遊離およびＡＳ４２００ Ｉ
ＮＸ−６２９５に対する用量応答を示す。一定のＤ／Ｌ比（高Ｄ／Ｌ，０．２０
で開始）がＡＳ４２００製剤について用いられた。投与は１０日間２日置きに行
った。各薬剤の用量はＨＢＢ，ｐＨ７．６に希釈して得られた。リピド用量は変
動させた（５０ｍｇおよび２０ｍｇ）。図から明らかなように、ＡＳ４２００
ＩＮＸ−６２９５処置は薬物の遊離型に比較してＤｏＨＨ２マウスの著しく大き
い生存率を生じる。薬物の遊離型はこの用量（５ｍｇ／ｋｇ）でこのモデルでは
、ＨＢＳ対照に比較して統計的な改善を与えない。付加的なまた全く顕著な、有
意な、しかし小さい利益がＡＳ４２００／ＩＮＸ−６３００から５ｍｇ／ｋｇで
誘導される。ＩＮＸ−６３００はＩＳＳ配列をもたず、その使用が生存の利益を
提供することは期待されなかった（ＩＮＸ−６３００の更なる特徴については下
記参照）。ＡＳ−４２０４により寄与される生存の利益は、これらのマウスがＢ
−細胞不全であり、したがって迅速なクリアランス応答を生じないという事実に
よるものである。すなわち、Ｂ−細胞はクリアランス作用に関与するが、処置の
処置効果／生存の利益には必ずしも関与しない。実際、ＡＳ４２０４製剤の長い
循環の局面はＡＳ４２００以上に処置の生存の利益を増強するようにみえる。図
１１Ｂは、異なる投与量レベルにおける類似の結果を示す。すなわち、リピドの
用量は１００〜２０ｍｇ／ｋｇに変動させた。図から明らかなように、処置の利
益もさらに高い（１０ｍｇ／ｋｇ）用量で見出された。
【００９６】 ｉ．ｖ．投与されたＬＲ−３２８０（ｃ−ｍｙｃ）の一部の用量では、本発明
の粒子の一部に応答してマウスの脾臓肥大を反映して、インビボで巨脾腫を誘導
することが見出された。図１２は、リピドそれ自体（６００ｍｇ）は巨脾腫を誘
導せず、遊離のｃ−ｍｙｃ（ＬＲ−３２８０）（１２５ｍｇ／ｋｇ）は軽度の巨
脾腫を誘発し、ＡＳ４２００に封入されたＬＲ−３２８０は高用量（＞２００ｍ
ｇ／ｋｇ リピドおよび４２ｍｇ／ｋｇ ＯＤＮ）では巨脾腫を誘導するが、２
０ｍｇ／ｋｇ リピド以下および４２ｍｇ／ｋｇ ＯＤＮ以下）では巨脾腫は誘
導されない。封入されたリピドの投与は遊離ＯＤＮの投与の場合より有意に大き
な脾臓の肥大を誘発する。
【００９７】 図１３は、様々な遊離ＯＤＮおよびインビトロでの脾臓細胞に対する対照のマ
イトジェニシティーを示す。ＰＳ ＯＤＮはすべてバックグランド刺激作用を表
すが、ＩＳＳ含有配列に最大の作用が見出される。この作用は標準または周知の
ＬＰＳおよびＣｏｎＡに等しいかまたはそれ以上である。ＰＯ−ＯＤＮは作用を
示さないが、多分これは血清緩衝液中での分解によるものである。非メチル化Ｉ
ＮＸ−６２９５に比較してマイトジェニシティーがはるかに低下しているメチル
化ＩＮＸ−６２９５の結果は示していないが、その活性は完全に消失し、他のＰ
Ｓ ＯＤＮに匹敵する。
【００９８】 ＬＲ−４４２０のマイトジェニシティーは、図１３におけるその活性の結果か
らさらに検討された。図１４にみられるように、１０ｍｇ／ｋｇの用量で遊離の
ＬＲ−４４２０は遊離のＬＲ−３２８０に比べて等しいかまたは改良された腫瘍
阻止作用を有する（ＬＲ−３２８０の遊離およびＡＳ４２００製剤の相対活性に
ついては図７参照）。
【００９９】 ドキソルビシンおよびｃ−ｍｙｃ ＯＤＮはＡＳ４２００リポソームに封入し
た。図１５に結果をまとめる（ドキソルビシンの量は（）内にｍｇで示す。ＡＳ
４２００はＯＤＮを包含し、Ｌ４２００はリピド封入ドキソルビシンであり、Ｏ
ＤＮをもたない。この図中では、ＡＳ４２００はＩＮＸ−６２９５を含有する）
。結果は日２１において、ドキソルビシン（２ｍｇ）と共封入されたＡＳ４２０
０（１５ｍｇ）は、別個に投与された製剤より驚くほどの、統計的に有意な改善
を提供する。ＡＳ４２００中のドキソルビシンを１０ｍｇに増加させても応答は
改良されないが、１０ｍｇ／ｋｇの封入されたドキソルビシン単独は同じ応答を
与える。これらの結果は細胞の複合相互作用を指示し、応答は本発明の粒子が提
供されれば、組み合わせ治療が実施できる可能性がある。Ｄｏｘの用量の増加は
ＯＤＮの作用を妨害することが可能である。
【０１００】 肝臓のＲＥＳ、とくにクッパー細胞がクリアランス応答に関与するかどうかを
決定するため、ＲＥＳの遮断によってクッパー細胞の阻害を実施した。これは低
用量の封入ドキソルビシン（成熟クッパー細胞の殺滅には十分）をＡＳ４２０４
の投与前２４時間に投与することにより達成された。さらに、初期ドキソルビシ
ン／リピド比０．２，０．１，０．０５および０．０１でＡＳ４２０４中に共封
入したドキソルビシンを、相当するインビボ応答の評価のために週１回投与した
。血液中におけるリピドの回収（初期の％）は図１６にプロットする。ＤＳＰＣ
／Ｃｈｏｌ ドキソルビシンによる遮断が循環の消失に作用を示さなかったこと
は、２回目および次の注射後の循環中に、初期に投与したリピドの５％未満が存
在することから明らかである。しかしながら、初期比０．２および０．１でのＡ
Ｓ４２０４中ドキソルビシンの共封入は、以後３回の注射の循環レベルを初期に
投与された製剤の７５％以上への維持を生じた。したがって、循環消失の閾値は
０．１と０．０５の間にあるものと思われる。これらの結果は、クッパー細胞は
単独ではクリアランス応答に関与せず、０．０５以上の共投与されたｄｏｘによ
って不能な他の細胞が著しく関与することを示唆する。これらの他の細胞はＢ−
細胞であるか、またはＢ−細胞を活性化する細胞か、またはたとえば腫瘍関連マ
クロファージ等のような末梢免疫系細胞であると考えられる。
【０１０１】 （例３） この一連の例は、本発明の脂質（リピド）−核酸粒子の投与により生じた免疫
反応の一部の特徴を示すものである。すべての方法および材料は、例１および２
と同一であって、変更があればこれを明記する。これらの例は、治療上の利益の
ために利用できるＳＡＬＰ処方の予想外の性質を証明している。
【０１０２】 （細胞株およびマウス系統） ＹＡＣ−１細胞をｃＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ １６４０，１０％ＦＣＳ，５０μＭ ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ スト
レプトマイシン、１００μｇ／ｍｌペニシリン）中で培養した。組織培養培地の
試薬はすべてＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，米国）
より購入し、ＦＡＬＣＯＮプラスチック器具はＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ社（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，米国）より購入した。雌性Ｃ５７
Ｂｌ／６マウスはＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ社（Ｉｎｄｉａ
ｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，米国）より入手した。雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｙｓｔ bg-J ／＋（ｂｅｉｇｅ）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ研究所（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏ
ｒ，ＭＥ，米国）より入手した。Ｂｅｉｇｅマウスを使用する際には、野生種Ｃ
５７Ｂｌ／６Ｊ対照もＪａｃｋｓｏｎ研究所より入手したことに留意しなければ
ならない。
【０１０３】 （肝臓単核細胞のハーベスト（ＨＭＮＣｓ）） 過量の麻酔薬［３．２％（ｖ／ｖ）ケタミン／０．８％（ｖ／ｖ）キシラジン
］でマウスを安楽死させた。次に、動物の左心房より、あらかじめ３７℃に加温
した６ｍｌのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、続いて０．２５％コラゲナーゼ
ＩＶ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）ＨＢＳＳ溶液（これもあら
かじめ加温する）６ｍｌを用いて還流した。１５分間消化させた後、肝臓を摘出
し、ＦＣＳを５％添加した５ｍｌのＲＰＭＩ １６４０を氷冷したもの（ＲＰＭ
Ｉ−５％）の入った１００ｍｌのペトリ皿の中で、手で少し崩し、氷冷ＲＰＭＩ
−５％を全量２０ｍｌ入れた５０ｍｌの円錐形試験管に移し替えた。次に消化生
成物を１００μｍのスチールメッシュに通し、該肝臓を機械的に分散させた。６
００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上清より肝細胞を取り除いた。残りの細胞
は１３００ｒｐｍで５分間遠心分離してペレット化し、ＨＢＳＳで１回洗浄した
。細胞ペレットを３０％ Ｐｒｅｃｏｌｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｂａｉｅ ｄ’Ｕｒｆｅ，ＰＱ，カナダ）ＰＢＳ溶液中
で再度懸濁し、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して肝臓単核細胞を分離した
。Ｐｅｒｃｏｌｌを慎重に取り除き、細胞ペレットを１０ｍｌのＨＢＳＳで２回
洗浄し、ｃＲＰＭＩに再懸濁して最終容積を２ｍｌとした。通常この操作では、
８〜１０週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウス１匹の肝臓より、２〜３×１０6個の単核
細胞が得られた。
【０１０４】 （クロム放出分析） 単核細胞試料中のＮＫ活性を測定するために、Ｂｒａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．
（１９９６）の報告に従い、細胞懸濁液の51Ｃｒ標識ＮＫ−標的細胞（ＹＡＣ−
１）に対する溶解能を試験した。１０6個の細胞を３７℃の51Ｃｒ（ＮＥＮ Ｌ
ｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，米国）５０
μＣｉ中で、３７℃として１時間インキュベーションし、ＹＡＣ−１細胞の一部
を51Ｃｒで標識した。標識ＹＡＣ−１細胞をｃＲＰＭＩに再懸濁して濃度を１０ 6 個／ｍｌとし、該ＹＡＣ−１懸濁液を５０μｌ取って、９６穴丸底プレート内
で様々な個数の腹膜浸出液細胞と混合し、エフェクターを生成した。標的比は９
０：１、３０：１、および１０：１とした。プレートは、ＣＯ2 ５％の気相下
で３７℃として４〜６時間インキュベーションした。インキュベーション時間終
了後、各ウェルより培養の上清を１００μｌ取り、シンチレーションカウントを
実施した。
【０１０５】 （ＦＡＣＳ分析） ＰＥ−結合抗ＮＫ１．１抗体（クローンＰＫ１３６）、ＦＩＴＣ結合抗ＴＣＲ
β抗体（クローンＨ５７−５９７）、ＰＥ結合マウスＩｇＧ2a抗体、κアイソタ
イプ対照抗体（クローンＧ１５５−１７８）およびＦＩＴＣ−結合ハムスターＩ
ｇＧ抗体、グループ２抗体、λアイソタイプ対照抗体（クローンＨａ４／８）を
用いて、２色フローサイトメトリー法により、単核細胞試料のＮＫ１．１および
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）表面発現を測定した：。全抗体ともＰｈａｒｍｉｇｅｎ
社（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）より入手した。該細胞群中の単陽性および
二重陽性細胞の百分率は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアパッケージ（Ｂｅｃ
ｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて算出した。NK
細胞およびNKT細胞の絶対数は、染色陽性細胞の百分率より非特異的染色細胞の
百分率を引いたものに全細胞数をかけて算出した。
【０１０６】 （統計分析） データはいずれも平均±ＳＥＭで表示し、両側Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定で比較
している。統計の計算は、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ用Ｓｔａｔｖｉｅｗ ５１２＋（
Ａｂａｃｕｓ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）を用い
て実施した。
【０１０７】 図１７は、ＩＮＸ−６２９５（ＣｐＧを含む）およびＩＮＸ−６３００（Ｃｐ
Ｇを含まない）の有糸分裂促進性分析（マイトジェニシティー アッセイ）にお
いて、ＩＮＳ−６２９５の有糸分裂促進性（マイトジェニック）が少なくとも4
倍高いことを示したものである。それにもかかわらず、ＩＮＸ−６３００は培地
のみの場合よりも促進活性が高く、ＰＳ主鎖それ自体が有糸分裂促進性物質ある
という報告と一致した。段階的に遊離ＰＳ ＯＤＮの量を増やしながら（６．２
５μｇ／ｍｌから２５μｇ／ｍｌまで）、ナイーブ（Ｎａｉｖｅ）脾臓細胞をｉ
ｎ ｖｉｔｒｏでインキュベーションした。培養に3Ｈ−チミジンを間歇的に添
加し、７２時間後にハーベストした。各点は、異なる３つの培養の平均3Ｈ−チ
ミジン取り込み量±ＳＥＭを表している。この図は、３回１組として実施した２
つの実験の一方を示している。黒い四角は遊離のＩＮＸ−６２９５、黒い丸は遊
離のＩＮＸ−６３００である。
【０１０８】 Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに対し、ＩＮＸ−６２９５／ＳＡＬＰの静脈内注射を（
１５ｍｌ／ｋｇ ＯＤＮ；注射の間隔は４８時間）を１回（６２９５×１）、２
回（６２９５×２）、または３回（６２９５×３）、あるいはＰＢＳの静脈内注
射を３回（注射の間隔は４８時間）実施した。最後の注射より２４時間後に肝臓
単核細胞（ＨＭＮＣ）をハーベストした。図１８ＡはＨＭＮＣの総数を示してい
る。各棒は６〜２５匹のマウスの平均ＨＭＮＣ数＋ＳＥＭを表している。図１８
Ｂは、ＹＡＣ−１細胞に対するＨＭＮＣの溶解活性を示している。各点は、異な
る３つのＨＭＮＣ群の特異的溶解の平均百分率±ＳＥＭを表している。この図は
３回１組として実施した２つの実験の一方を表している。四角はＩＮＸ−６２９
５／ＳＡＬＰを３回注射した群であり、菱形はＩＮＸ−６２９５／ＳＡＬＰを２
回注射した群、三角はＩＮＸ−６２９５／ＳＡＬＰを１回注射した群、丸はＰＢ
Ｓを３回注射した群である。***はＰ＜０．０００１、**はＰ＜０．０１である
。図１８Ａに反映されているように、ＩＮＸＣ−６２９５の注射を３回繰り返す
と、肝臓での単核細胞およびナチュラルキラー細胞の活性が線形の上昇を示す。
脾臓の重量を測定したところ、ＩＮＸＣの２回目および３回目の投与後に巨脾症
が認められたが、脾臓細胞数は増加しなかったため（データは示さず）、肥大の
原因は細胞数の増加でないことを示した。図１８Ｂは、ＹＡＣ−１のクロム放出
分析により測定したＨＭＮＣ群の細胞溶解活性が、ＩＮＸＣ−６２９５投与後に
上昇したことを示している。２回目および３回目のＩＮＸＣ−６２９５投与後に
ハーベストしたＨＭＮＣ群の溶解曲線の勾配がほぼ同じであることから、両試料
とも同量のエフェクター細胞が含まれていることが示唆される。ＨＭＮＣより上
昇度は低いものの、ＩＮＸＣ−６２９５投与後の脾臓内のＮＫ活性の上昇が認め
られた。
【０１０９】 ３群のＣ５７Ｂｌ／６マウスにＩＮＸ−６２９５／ＳＡＬＰ（１５ｍｇ／ｋｇ
ＯＤＮ；注射の間隔は４８時間）あるいはＰＢＳ（注射の間隔は４８時間）を
２回静脈内注射した。最後の注射より２４時間後に肝臓単核細胞（ＨＭＮＣ）を
ハーベストした。３回分の試料より同数の細胞をプールし、フローサイトメトリ
ーによりＮＫ１．１およびＴＣＲβの表面発現を測定した。図１９Ａは、ＨＭＮ
Ｃプール中のＮＫ１．１＋／ＴＣＲ−細胞の総数を示している。各棒は、５〜６
回の実験の平均細胞数＋ＳＥＭを表している。図１９Ｂは、ＨＭＮＣプール中の
ＮＫ１．１＋／ＴＣＲ＋細胞の総数を示している。各棒は、５〜６回の実験の平
均細胞数＋ＳＥＭを表している。***はｐ＜０．０００１、Ｎ．Ｓ．は有意差な
しである。図に示すように、ＩＮＸ−６２９５／ＳＡＬＰ投与後の肝臓のＮＫ１
．１＋／ＴＣＲ−細胞は増加している。ＹＡＣ−１細胞はＮＫおよびＮＫＴを介
した溶解のいずれにも感受性があるため、原因となった群はクロム放出分析から
は判明しなかった。ＩＮＸＣ−６２９５投与後のＮＫＴ細胞の増加は有意ではな
かった。対照的に、肝臓ＮＫ細胞はＩＮＸＣ−６２９５の投与後に５倍と有意に
増加した。これらの結果より、ＩＮＸＣ−６２９５投与後の溶解活性上昇の原因
となった細胞群はＮＫ細胞であることが強く示唆される。 ３群のＣ／５７Ｂｌ／６Ｊマウス（野生種）および３群のＣ５７ＢＬ／６Ｊ−
Ｌｙｓｔbg-J／＋（ｂｅｉｇｅ）に、ＩＮＸ−６２９５／ＳＡＬＰ（１５ｍｇ／
ｋｇ ＯＤＮ；注射の間隔は４８時間）あるいはＰＢＳ（注射の間隔は４８時間
）を２回静脈内注射した。最後の注射より２４時間後に肝臓単核細胞（ＨＭＮＣ
）をハーベストした。ＨＮＮＣについて、ＹＡＣ−１細胞に対する溶解活性を試
験した。その結果は図２１に示しており、各点は異なる３つのＨＭＮＣ群の特異
的溶解の百分率の平均±ＳＥＭを表している。黒い四角はＩＮＸ−６２９５／Ｓ
ＡＬＰを２回注射した野生種マウス群、黒い菱形はＰＢＳを２回注射した野生種
マウス群、白い四角はＩＮＸ−６２９５／ＳＡＬＰを２回注射したｂｅｉｇｅマ
ウス群、白い菱形はＰＢＳを２回注射したｂｅｉｇｅマウス群である。図２１に
示すように、ｂｅｉｇｅマウス群（ＮＫ細胞およびＢ細胞が欠損）由来のＨＭＮ
Ｃには、ＩＮＸ−６２９５／ＳＡＬＰ投与後の細胞溶解活性がみられない。ＩＮ
ＸＣ−６２９５は野生種マウスの溶解活性を強力に誘導する一方で、同じものを
投与したｂｅｉｇｅマウスではわずかな溶解活性のみが認められた。このことは
、本発明の粒子によってＮＫ細胞が特異的に活性化されることを示唆している。
Ｂｅｉｇｅマウスでの溶解活性が微弱である原因は、やはり当該マウスのＮＫ活
性の抑制が無効であるためと考えられ、またＮＫＴ細胞活性の要素が小さいこと
を裏付けていると思われる。担腫瘍ｂｅｉｇｅマウスでは、ＩＮＸＣ−６２９５
の投与の応答あるいは有効性が見られないことが証明されており、それゆえＮＫ
細胞およびＢ細胞の応答は、本発明の粒子により活性化される重要な細胞である
ことを示唆している。
【０１１０】 Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに対し、ＩＮＸ−６２９５／ＳＡＬＰ，ＩＮＸ−６３０
０／ＳＡＬＰ、遊離ＩＮＸ−６２９５、遊離ＩＮＸ−６３００（１５ｍｇ／Ｋｇ
ＯＤＮ；注射の間隔は４８時間）、脂質単独あるいはＰＢＳ（注射の間隔は４
８時間）の静脈内注射を２回実施した。最後の注射より２４時間後にＨＭＮＣを
ハーベストした。その結果を図２２に示し、各棒は８〜２５匹のマウスの平均Ｈ
ＭＮＣ＋ＳＥＭを表している。***はｐ＝０．０００１、Ｎ．Ｓ．は有意差なし
である。図に示すように、遊離およびカプセル化ＰＳ ＯＤＮの投与後のＨＭＮ
Ｃは増加している。遊離のＩＮＸ−６２９５の投与により、ＩＮＸ−６２９５の
ＡＳ４２００処方で認められたものと同様のＨＭＮＣ増加が起こった。しかしＡ
Ｓ４２００中のＩＮＸ−６３００によって起こるＨＭＮＣの増加は、ＰＢＳと比
較してわずかに過ぎないが、遊離のＩＮＸ−６３００はまったく増加を誘発しな
かった。
【０１１１】 ３群のＣ５７Ｂｌ／６マウスに対し、ＩＮＸ−６２９５／ＳＡＬＰ，ＩＮＸ−
６３００／ＳＡＬＰ、遊離のＩＮＸ−６２９５、遊離のＩＮＸ−６３００（１５
ｍｇ／ｋｇ ＯＤＮ；注射の間隔は４８時間）、脂質単独あるいはＰＢＳ（注射
の間隔は４８時間）の静脈内注射を２回実施した。最後の注射より２４時間後に
ＨＭＮＣをハーベストした。３回分の試料より同数の細胞をプールし、フローサ
イトメトリーでＮＫ．１．１およびＴＣＲβ鎖の表面発現を測定した。図２２Ａ
はＨＭＮＣプール中のＮＫ１．１＋／ＴＣＲ−細胞の総数を示している。各棒は
、３〜６回の実験の平均細胞数＋ＳＥＭを表している。図２２ＢはＨＭＮＣプー
ル中のＮＫ１．１＋／ＴＣＲ＋細胞の総数を示している。各棒は、３〜６回の実
験の平均細胞数＋ＳＥＭを表している。***はｐ＜０．０００１、Ｎ．Ｓ．は有
意差なしである。図に示すように、ＳＡＬＰ投与後の肝臓のＮＫ１．１＋ＴＣＲ
−細胞数は増加している。遊離あるいはカプセル化ＩＮＸ−６２９５投与後にも
ＮＫ細胞数の増加が認められ、ＩＮＸＣ−６３００でもこれより少ない増加度（
有意差なし）が認められている。いずれの投与でも、ＮＫＴコンパートメントに
有意差は見られなかった。
【０１１２】 ３群のＣ５７Ｂｌ／６マウスに対して、ＩＮＸ−６２９５／ＳＡＬＰ、ＩＮＸ
−６３００／ＳＡＬＰ、遊離のＩＮＸ−６２９５、遊離のＩＮＸ−６３００（１
５ｍｇ／ｋｇ ＯＤＮ；注射の間隔は４８時間）あるいはＰＢＳ（注射の間隔は
４８時間）の２回の静脈内注射を０日目と２日目に実施した。最後の注射の２４
時間後である３日目に、肝臓単核細胞（ＨＭＮＣ）をハーベストした。ＨＭＮＣ
について、ＹＡＣ−１細胞に対する溶解活性を試験した。その結果は図２３Ａ〜
Ｃに示しており、各点は異なる３つのＨＭＮＣ群の特異的溶解の百分率の平均±
ＳＥＭを表している。各グラフはそれぞれ３回１組で実施した２〜３組の実験の
うち代表的なものである。黒い四角は遊離のＩＮＸ−６２９５の２回注射、黒い
菱形は遊離のＩＮＸ−６３００の２回注射、白い四角はＩＮＸ−６２９５／ＳＡ
ＬＰの２回注射、白い菱形はＩＮＸ−６３００／ＳＡＬＰの２回注射、白い丸は
ＰＢＳの２回注射である。図に示すように、遊離およびカプセル化ＰＳ ＯＤＮ
の投与後のＨＭＮＣ群ではナチュラルキラー細胞が活性化する。ＳＡＬＰの静脈
内投与により、ＩＳＳモチーフがなくてもＮＫ細胞が活性化することがある。図
２３Ａは、遊離およびカプセル化ＩＮＸ−６２９５が肝臓のＮＫ細胞に対して同
様の活性化を促進することを示している。驚くべきことに、ＩＮＸ−６３００／
ＳＡＬＰはＩＮＸＣ−６２９５とほぼ同等の分解活性を呈し、非ＩＳＳ配列のＳ
ＡＬＰ（あるいはＡＳ４２００）処方により、ＩＳＳ型応答が惹起されることを
示した。このことから、遊離型では免疫応答を活性化しないが、その代わり免疫
応答の惹起が脂質粒子によるカプセル化（封入）に依存している、新たなＩＳＳ
モチーフの種類が確立される。
【０１１３】 これらの結果を考え合わせると、ＩＮＸ−６３００／ＳＡＬＰによるものであ
って、ＯＤＮあるいは脂質それ自体によるものでない免疫活性化は、ＩＳＳモチ
ーフあるいは二重らせん形の核酸から独立した新たな免疫刺激経路であることが
、この例の結果より証明される。しかし、ＩＮＸ−６３００／ＳＡＬＰ（ＩＳＳ
モチーフが欠損）により刺激されたＮＫ細胞は、ＩＮＸ−６２９５／ＳＡＬＰ（
ＩＳＳモチーフを含む）に刺激されたＮＫ細胞とほぼ同じ溶解活性を示したが、
ＯＤＮ荷重がＩＳＳモチーフを含む場合のみＮＫ細胞の増加が認められたことに
留意しなければならない。このことは、ＮＫ細胞の溶解活性および増殖の活性化
には複数のシグナルを必要とし、あるいはＩＮＸ−６３００／ＳＡＬＰにより誘
発されたシグナルの強度は、細胞毒性の活性化には十分であるが、増殖の促進に
は低すぎることを示唆している。ＳＡＬＰ処方をα−ガラクトースセラミドなど
の刺激性脂質を用いて変更すれば、増殖の促進への更なる刺激となり、また肝臓
ＮＫ細胞を活性化し、さらにはＮＫＴ細胞を活性化する可能性もある。
【０１１４】 （例４） この一連の例は、ある種の陽イオン脂質であるＤＮＡ複合体（非カプセル化系
あるいはリポプレックス）が免疫応答を引き起こすことにより、癌の遺伝子治療
において機能を補助する能力を例示している。
【０１１５】 （試薬） ＤＯＤＡＣ（塩化Ｎ，Ｎ−ジオレニルーＮ，Ｎ−ジメチルアンモニウム）およ
びＤＯＴＭＡ（塩化Ｎ−［１−（２，３−ジオレイロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ
，Ｎ−トリメチルアンモニウム）は、Ｓｔｅｖｅｎ Ａｎｓｅｌｌ博士（Ｉｎｅ
ｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，カナダ）が
調製した。ＤＯＴＡＰ（塩化Ｎ−［１−（２，３−ジオレオオイロキシ）プロピ
ル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム）およびＤＯＰＥ（１，２−ジオレ
オイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）は、Ａｖａｎｔｉ Ｐ
ｏｌａ Ｌｉｐｉｄｓ社（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，米国）より入手した。ア
クチノマイシンＤおよびＮ−（１−ナフチル）エチレンジアミンスルファニルア
ミドはＳｉｇｍａ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）より購入した。
【０１１６】 （細胞培養） ＭＣＡ２０７（マウス線維肉腫）（Ｓ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ／Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ，ＭＤより提供）、ＳＫＯＶ−３（ヒト卵巣癌、ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−７７）、
ＬＳ１８０（ヒト結腸直腸癌）およびＷＥＨＩ １３ＶＡＲ （ＡＴＣＣ＃ＣＲ
Ｌ−２１４８）を、ｃＲＰＭＩ［ＲＰＭＩ １６４０，１０％ ＦＣＳ，５０μ
Ｍ ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌスト
レプトマイシン、１００μｇ／ｍｌペニシリン］中で培養した。全ての組織培養
培地の試薬は、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，米国
）より購入し、ＦＡＬＣＯＮプラスチック器具はＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓ
ｏｎ社（Ｆｒａｎｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，米国）より購入した。
【０１１７】 （ＬＵＶの調製） 脂質フィルムは、脂質を１００％エタノールに溶解して１０ｍｇ／ｍｌとした
脂質溶液を凍結乾燥して調製した。脂質を水に再懸濁し、最終脂質濃度を４０ｍ
Ｍとした。次に可溶化したリポソームを１００ｎｍのカーボネート膜を通して１
０回押し出し、巨大一枚膜リポソーム（ＬＵＶ）を生成し、４℃で保存した。こ
れらの実験で使用したＬＵＶは、カチオン脂質（ＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡあるい
はＤＯＴＡＰ）とＤＯＰＥとのモル比組成が１：１であった。
【０１１８】 （リポプレックスの形成） ＬＵＶ／ＤＮＡ複合体（本明細の目的のための「不完全カプセル化系」である
）を、電荷比＋３で調整した。ｐＣＭＶｌｕｃ１８の５％グルコース溶液を調製
し、最終濃度を５００μｇ／ｍｌとした。９．０ｍＭのＤＯＤＡＣ：ＤＯＰＥ（
１：１）ＬＵＶを含んだ溶液を撹拌し、その中にＤＮＡ溶液を一滴ずつ滴下した
。次に該複合体を４℃で３０分間インキュベーションした。リポプレックスは用
時毎に調製した。
【０１１９】 （ルシフェラーゼおよびタンパク質分析） ルシフェラーゼ分析は、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍキ
ット（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，米国）を用い、すでに報告され
た方法に従い実施した（１２）。ビシンコニン酸比色法（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｃｏ．；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，米国）を用い、メーカーのプロ
トコルに従って、細胞溶解物のタンパク質含量を測定した。
【０１２０】 （マウス腹膜炎） 雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ； Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，米国）に対し、ＬＵＶあるいはリポプレッ
クスを５％グルコース溶液２００μｌに溶解し腹腔内注射した（脂質用量＝６０
ｍｇ／ｋｇ）。指定の測定時に、マウスをＣＯ2で窒息させて安楽死させ、５ｍ
ｌの氷冷ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄して、腹膜浸出液細胞を回収し
た。洗浄液中の細胞濃度を、セルカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃｓ；Ｈｉａｌｅａｈ，Ｆｌａ．，米国）で定量し、ＨＢＳＳで細胞を２回
洗浄した。最終洗浄後、細胞ペレットをｃＲＰＭＩに再懸濁した。
【０１２１】 （ＮＫ分析） ＮＫ活性の分析を目的として、Ｂｒａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１３）の報告
に従い、腹膜浸出液細胞の51Ｃｒ標識ＹＡＣ−１細胞に対する溶解能力を試験し
た。１溶解単位（ＬＵ）は、５０００個のＹＡＣ−１細胞の３０％を特異的に溶
解するのに要した浸出液細胞の個数と同等である。
【０１２２】 （ＴＮＦ−αの生物学的試験） ＴＮＦ−αの生物学的試験は、Ｋｈａｂａｒ ｅｔ ａｌ．（１４）の報告に
従い、以下のように改変して実施した。分析時間終了時に、各ウェルより上清を
１００μｌ取り、２０μｌのＭＴＳ溶液（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅ
ｏｕｓ Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉ
ｏｎ Ａｓｓａｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，米国）を各ウェルに加え、プレート
をさらに１．５時間インキュベーションした。各ウェルの４９０ｎｍにおける吸
光度を測定した。実験ウェル中のＴＮＦ−αの濃度は、遺伝子組み換え標品と比
較して算出した。通常この測定法は１５ｐｇ／ｍｌの組み替え標品に感受性を示
した。
【０１２３】 （サイトカインのＥＬＩＳＡ法） ＩＦＮγ（Ｅｎｄｏｇｅｎ；Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，米国）およびＩＬ−１２ｐ
７０（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，米国）のレベルは、
特異的なＥＬＩＳＡ法を用い、メーカーの指示に従って測定した。
【０１２４】 （一酸化窒素（ＮＯ）放出法） ５×１０5個の腹膜浸出液細胞を取って２４穴プレートに移した。次に該細胞
を、総容積１ｍｌの＋／−１０ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ培地中で２４時間インキュベ
ーションした。インキュベーション時間終了後、グリース法により上清中の硝酸
塩濃度を測定した。培地を１００μｌ取り、平底９６穴プレート中で１００μｌ
のグリース試薬［グリース試薬Ａ（０．１％ Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジ
アミン）とグリース試薬Ｂ（１％スルファニルアミド５％燐酸溶液）の等容積混
合物］と混合した。次に各ウェルの５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。１ｍ
Ｍ〜１．６μＭの標準曲線を用いて硝酸塩濃度を算出した。
【０１２５】 カチオン脂質とＤＯＰＥのモル比組成が１：１である１００ｎｍ ＬＵＶと０
．２５μｇ／ｍｌ ＤＮＡの複合体中で細胞を一晩インキュベーションした。次
に細胞を溶解し、「材料と方法」の節で解説した方法でルシフェラーゼの発現を
測定した。その結果は図２４Ａ〜Ｃに示している。この実験には、マウス繊維肉
腫ＭＣＡ２０７（図２４Ａ）、ヒト卵巣癌ＳＫＯＶ−３（図２４Ｂ）、およびヒ
ト直腸結腸癌ＬＳ１８０（図２４Ｃ）の３種類の腫瘍細胞株を使用した。このデ
ータは別個に実施した３回の実験のうちの１つである。各棒は４回の反復トラン
スフェクションのＲＬＵの平均＋ｓ．ｅ．ｍ．を表している。ＤＯＤＡＣ、ＤＯ
ＴＡＰあるいはＤＯＴＭＡを含んだリポプレックスのトランスフェクションプロ
フィールは、カチオン脂質の種類が異なればトランスフェクション能力が異なり
、またこれに対する腫瘍細胞株の応答も異なることを例示している。このことか
ら、本発明の粒子には、治療対象の適応（腫瘍の種類）に応じてカチオン脂質の
種類を変えても用いてよいことが示唆される。
【０１２６】 Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、カチオン脂質とＤＯＰＥのモル比組成が１：１であ
るＬＵＶとＤＮＡの複合体５０μｇを接種した。０，１，３および５日目に腹膜
浸出液細胞をハーベストした。その結果は図２５に示しており、各群ごとに４〜
６匹のマウスを用いて独立に２回実施した結果を表している。各点は、８〜１２
匹のマウスから採取した洗浄液の細胞浸潤の平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表している。
図に示すように、リポプレックス投与後には腹膜内の細胞の割合が増加している
が、ＤＯＴＡＰリポプレックスにより５日目までに正常値に回復していた。
【０１２７】 Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、カチオン脂質とＤＯＰＥのモル比組成が１：１であ
るＬＵＶとＤＮＡとの複合体５０μｇを接種した。１，３および５日目に洗浄に
より腹膜浸出液細胞をハーベストした。図２６Ａ〜Ｃは、カチオン脂質としてＤ
ＯＤＡＣ（図２６Ａ）、ＤＯＴＡＰ（図２６Ｂ）およびＤＯＴＭＡ（図２６Ｃ）
を用いて各群４〜６匹の動物を用いて独立に２回実施した実験の結果を示してい
る。各点は、８〜１２匹のマウスから採取した洗浄液のＩＦＮ−γ濃度の平均＋
ｓ．ｅ．ｍを表している。図に示すように、サイトカインＩＦＮ−γ濃度の反応
は、投与するカチオン脂質の種類によって異なっていた。この測定法では、ＴＮ
Ｆ−αあるいはＬ−１２の検出可能な反応はなかった。
【０１２８】 Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、カチオン脂質とＤＯＰＥのモル比組成が１：１であ
るＬＵＶとＤＮＡとの複合体５０μｇを接種した。１，３および５日目に洗浄に
より腹膜浸出液細胞をハーベストし、51Ｃｒで標識したＹＡＣ−１細胞に対する
細胞毒性を試験した。図２７は各群４〜６匹のマウスを用いて独立に２回実施し
た実験のうち一方の結果を示している。各点は，４〜６匹のマウスの洗浄液中の
平均溶解単位±ｓ．ｅ．ｍ．を表している。図に示すように、これらの実験では
、リポプレックスによるＮＫ細胞の誘発は、細胞浸潤の蓄積と同時に起こってい
る。ＤＯＤＡＣ、およびＤＯＴＭＡリポプレックスはＮＫ細胞の５日間にわたる
漸進的増加を誘発したのに対し、ＤＯＴＡＰリポプレックスによるＮＫ活性の誘
発は３日目に最高となり、５日目にはかなり高い値を保っていた。また、炎症反
応の過程を通じて、腹膜腔内の活性化マクロファージも増加している（データは
示さず）。
【０１２９】 これらの結果を考え合わせると、樹状細胞の適正な成熟と機能を達成するには
炎症シグナルが必要であるので、リポプレックス投与後の炎症反応は、サイトカ
インによる腫瘍作用を回復させることが示唆される。さらに、リポプレックスの
投与によって局所のＮＫ活性が上昇し、ＮＫ細胞が自然に腫瘍細胞を溶解するこ
とが認められたため、リポプレックス投与の腫瘍の微小環境に対する複合作用は
、好ましい治療反応をもたらす可能性がある。
【０１３０】 （例５） この一連の実験は、脂質カプセル化（封入）ＩＳＳオリゴデオキシヌクレオチ
ド投与後のｆ血清サイトカインの誘導の研究を目的として計画された。
【０１３１】 （材料と方法） ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）および１，２−ジオレイノ
ル−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）は、Ａｖａｎｔ
ｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，米国）より、コ
レステロールはＳｉｇｍａ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）より購入した。
１−Ｏ−（２’−（ω−メトキシポリエチレングリコール）サクシノイル−２−
Ｎ−ミリストイルスフィンゴシン（ＰＥＧ−ＣｅｒＣ14）は、Ｚｈａｏ Ｗａｎ
ｇ博士（Ｉｎｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．）が合成した
。使用したＯＤＮ配列には、ヒト／マウスｃ−ｍｙｃプロト癌遺伝子ｍＲＮＡの
開始コドン領域と相補的な１５量体ｃ−ｍｙｃ ＯＤＮ（５’−ＡＡＣＧＴＴＧ
ＡＧＧＧＧＣＡＴ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）、同じＯＤＮの１６量体
バージョン（５’−ＴＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ−３’）、（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．４）、およびＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡと相補的な３’非翻訳領域ＩＣＡ
Ｍ １ ＯＤＮ（ＩＳＩＳ ３０８２）（５’−ＴＧＣＡＴＣＣＣＣＣＡＧＧＣ
ＣＡＣＣＡＴ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）が含まれている。該ｃ−ｍｙ
ｃ ＯＤＮはＬｙｎｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，
米国）より、ＩＳＩＳ ３０８２はＢｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎ
ｃ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，米国）で購入した。第６週齢の雌性ＩＣＲマウスは
Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉ
Ｎ，米国）より入手し、使用前に少なくとも１週間隔離した。
【０１３２】 （ＳＡＬＰ） ＳＡＬＰはＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＯＤＡＰ：ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４（
モル比２０：４５：２５：１０）の組成を有し、カプセル化ＰＳ ＯＤＮは従来
法（Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９）で調製した。ＰＳ ＯＤＮについ
ては、３００ｍＭクエン酸緩衝液を用いてＯＤＮを溶解したが、ＰＯ ＯＤＮを
含んだＳＡＬＰにはｐＨ４．０の２０ｍＭクエン酸を用いた。脂質混合物のエタ
ノール溶液をＯＤＮ（３．３３ｍｇ／ｍｌ）クエン酸緩衝液溶液に少量加えた（
最終エタノール濃度は４０％）。生成した小胞混合物に対して凍結解凍を５回行
い、押し出し器（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖａｎ，ＢＣ，カナダ）を
用いて２枚重ねた孔径１００ｎｍのフィルタを通して押し出した。小胞はクエン
酸緩衝液で２時間透析してエタノールを除去し、５００倍容積のＨＢＳ（１５０
ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５）中で一晩放置して一枚膜
外面のＤＯＤＡＰを中和した。ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂを用いた陰イ
オン交換クロマトグラフィにより、試料中の非カプセル化ＯＤＮを除去した。Ｏ
ＤＮと脂質の比率はＡ２６０による定量に基づいて算出し、脂質含量は、脂質混
合物が２０モル％のＤＳＰＣを含んでいると仮定して、リン酸分析法（Ｆｉｓｋ
ｅ ＆ Ｓｕｂｂａｒｏｗ，１９２５）により算出した。ＯＤＮ主鎖上のリン酸
が脂質の分析に干渉すると思われたので、試料はＢｌｉｇｈ ＆ Ｄｙｅｒ（１
９５９）の方法で処理した後、水ーメタノールで３回洗浄してＤＳＰＣを除去し
た。ＯＤＮと脂質の比率は０．１５〜０．２０（ｗｔ／ｗｔ）のものが多かった
。ＮＩＣＯＭＰ ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅｒ（Ｍｏｄ
ｅｌ ３７０）を用いて、準弾性レーザー散乱法で測定した小胞の大きさは、約
１２０ｎｍであった。
【０１３３】 （血清の分離） ＩＣＲマウス（実験開始時は第７週齢）に試料のＨＢＳ溶液０．２ｍｌを静脈
内注射した。マウスは測定時を変えて致死量の麻酔薬（３．２％（ｖ／ｖ）ケタ
ミン／０．８％（ｖ／ｖ）キシラジン）により屠殺し、ＥＤＴＡを入れたＶａｃ
ｕｔａｉｎｅｒ管で血液を採取した。血液を遠心分離して（４℃で２０００×ｇ
、１０分間）血液をペレット化し、血清を分離して分析時まで−２０℃で凍結し
た。
【０１３４】 （ＥＬＩＳＡ） 市販のＥＬＩＳＡキット（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ
，米国）を用いて、血清中のＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２，Ｉ
ＦＮ−γ，ＭＣＰ−１およびＴＮＦ−α含量を測定した。
【０１３５】 この例で使用している免疫刺激性ＣｐＧ ＯＤＮは、マウスおよびヒトのｃ−
ｍｙｃプロト癌遺伝子の開始コドン領域に対して相補的となるよう設計されたア
ンチセンスＯＤＮである。このＯＤＮの１５量体および１６量体の両バージョン
とも、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでヒトおよびマウスの様々な腫瘍
に活性であることが証明されている（Ｌｅｏｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９
６；Ｃｉｔｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｈａｒａｓｙｍ ｅｔ ａｌ．，原
稿作成中）。しかし、両ＯＤＮ（１６量体は５’末端の１個のチミジンが多い以
外は１５量体と同一である）とも、既知の刺激性ＣｐＧモチーフである５’−（
Ｔ）ＡＡＣＧＴＴ−３’を含んでいる（Ｂａｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６
）。本実験で対照として用いたＯＤＮ配列は、マウスＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡの
３’非翻訳領域と相補的な２０量体アンチセンスＯＤＮである、ＩＳＩＳ ３０
８２である。ＩＳＩＳ ３０８２はｃ−ｍｙｃ ＯＤＮと異なり、ＣｐＧモチー
フを含まず、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは免疫原性でない（Ｂｏｇｇｓ ｅｔ ａｌ．
，１９９７）。
【０１３６】 血清サイトカインレベルの上昇によって、遊離のＰＳ ＯＤＮに対する免疫応
答はすでに認められている。遊離のＰＳ ＯＤＮ（５０ｍｇ／ｋｇ）をＩＣＲマ
ウスに腹腔内注射すると、ＩＬ−１２，ＩＬ−６，ＭＩＰ−１βおよびＭＣＰ−
１レベルが上昇するのに対して、ＩＦＮ−γ，ＩＬ−１０，ＩＬ−２およびＩＬ
−４は変化しなかった（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。ＳＡＬＰのカプ
セル化の効果を評価するために、我々は、１６量体ｃ−ｍｙｃ ＰＳ ＯＤＮの
遊離型あるいはカプセル化体（ＳＡＬＰ ｃ−ｍｙｓ ＰＳ ＯＤＮ）２０ｍｇ
／ｋｇ、あるいは空のＳＡＬＰ小胞を静脈内注射したＩＣＲマウスの血清サイト
カインレベルの特徴を明らかにする類似の実験を行った。２４時間に渡る血清サ
イトカインレベルの推移の特徴には、Ｔｈ１／Ｔｈ２応答（ＩＬ−１２，ＩＦＮ
−γ，ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−１０）、ＭＣＰ−１（マクロファ
ージサイトカイン）およびＴＮＦ−α（炎症メディエーター）への作用が含まれ
ていた。Ｔｈ１／Ｔｈ２と関係したサイトカインのうち、ＩＬ−１２およびＩＦ
Ｎ−γはＴｈ１応答の強力な促進因子であるが、ＩＬ−４およびＩＬ−１０はＴ
ｈ２応答を促進する。遊離のｃ−ｍｙｃ ＰＳ ＯＤＮを注射すると、注射より
２〜２４時間後にＩＬ−１２の有意な上昇の誘導が認められ、４時間後に発現の
ピーク（非投与マウスの２０倍の上昇）が現れた（図２８Ｂ）。ＭＣＰ−１（図
２８Ｃ）およびＩＬ−１０（図２９Ｂ）は２〜３倍とわずかに促進されたが、Ｉ
Ｌ−６（図２８Ａ）、ＩＦＮ−γ（図１Ｄ）、ＩＬ−２（図２９Ａ），ＩＬ−４
（図２９Ｃ）およびＴＮＦ−α（図２９Ｄ）レベルに有意差は見られなかった。
【０１３７】 ｃ−ｍｙｃ ＰＳ ＯＤＮをリポソームでカプセル化すると、ＯＤＮの有糸分
裂促進性が亢進した。遊離のｃ−ｍｙｃ ＰＳ ＯＤＮと同様に、ＳＡＬＰ ｃ
−ｍｙｃ ＰＳ ＯＤＮの注射より２時間が経過すると、ＩＬ−１２レベルは大
きく上昇し、４時間後に発現のピークが現れた（図２８Ｂ）。ＳＡＬＰ ｃ−ｍ
ｙｃ ＰＳ ＯＤＮによるＩＬ−１２誘導レベルは、初期値の５０倍、あるいは
遊離のｃ−ｍｙｃ ＰＳ ＯＤＮの２．５倍であった。血清中のＩＬ−６（１０
００倍）、ＭＣＰ−１（４００倍）およびＩＦＮ−γ（２０倍）レベルも大きく
上昇し、ＩＬ−６およびＭＣＰ−１の発現のピークは４時間後、ＩＦＮ−γの発
現のピークは８時間後に現れた（図２８Ａ〜Ｄ）。ＴＮＦ−α（図２９Ｄ）およ
びＩＬ−１０（図２９Ｂ）レベルは、非投与マウスよりわずかに上昇したが、Ｉ
Ｌ−２およびＩＬ−４レベルは変化しなかった。空のＳＡＬＰの作用についても
検討した。注射の１時間後にＩＬ−６の上昇開始が見られたが、３時間後までに
初期値に戻った（図２８Ａ）。ＭＣＰ−１およびＩＬ−１２レベルもわずかに誘
導されたが、ＩＬ−６とは異なり、その効果はＳＰＬＰ ｃ−ｍｙｃ ＰＳ Ｏ
ＤＮ（図２８Ａ〜Ｄ）と比較して顕著に低かった。ＩＦＮ−γの発現は変化しな
かった。よって、ＳＡＬＰ ｃ−ｍｙｃ ＰＳ ＯＤＮによる血清サイトカイン
レベル上昇の原因は、遊離のＯＤＮおよび脂質単体の付加的作用ではなかった。
【０１３８】 （ＯＤＮ主鎖の血清サイトカイン誘導に対する作用） ＰＯ ＯＤＮは、線型の一本鎖であり、血清中のヌクレアーゼによって速やか
に分解されるため（Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、遊離形でより安
定なホスホロチオアートＯＤＮほど免疫原性が高くない（Ｂｏｇｇｓ ｅｔ ａ
ｌ．， １９９７）。しかしＯＤＮをカプセル化すれば、血流中での分解より保
護されるであろう。もしも免疫系が進化してＣｐＧモチーフを含む細菌のＤＮＡ
を認識するようになったならば、通常のホスホジエステル主鎖を有するＯＤＮの
認識が迅速化するので、化学修飾を受けたホスホロチオアート主鎖を含むＯＤＮ
よりも刺激性となると予測される。このため、ＰＳ ＯＤＮを含むＳＡＬＰ処方
とＰＯ ＯＤＮを含むＳＡＬＰ処方の免疫原性の比較が重要となった。供給上の
制約により、本実験では１５量体ＰＯ ｃ−ｍｙｃ ＯＤＮは使用したが、５’
末端に余剰のチミジンを有する１６量体ｃ−ｍｙｃ ＯＤＮはＰＳ ＯＤＮとし
て使用した。既知の免疫刺激配列モチーフは、両ＯＤＮとも同じであり、誘導さ
れる血清サイトカインレベルは、１６量体ＰＯあるいは１６量体ｃ−ｍｙｃ Ｐ
Ｓ ＯＤＮを含んだＳＡＬＰによる血清サイトカイン誘導レベルを比較した対照
実験で、同じであることが証明された。７日間の実験期間中、有意差は認められ
なかった。実験に関する留意点を付け加えると、実験間で、同様の試料で測定し
た血清サイトカインレベルに約２倍の差が認められた。例えば、ＳＡＬＰ ｃ−
ｍｙｃ ＰＳ ＯＤＮ（１６量体）は以下の実験（図３０Ａ〜Ｄ）の他に、図２
８Ａ〜Ｄで示した実験でも使用されていたものの、１回目の実験では４時間後に
２３±２μｇ／ｍｌのＩＬ−１２が検出されたが、次の試験では１０±１しか検
出されなかった。このばらつきの原因はＳＡＬＰ試料の差ではなく（データは示
さず）、環境条件あるいはＩＣＲマウスの各バッチ間の遺伝的ばらつきであると
思われる。しかし反復実験により、各種類の試料の比較によって認められた差は
、比較的変化しないことが示されている。
【０１３９】 図３０Ａ〜Ｄに示した実験では、ＩＣＲマウスに２０ｍｇ／ｋｇのＳＡＬＰ
ｃ−ｍｙｃ ＰＳ ＯＤＮ（１６量体）、ＳＡＬＰ ｃ−ｍｙｃ ＰＯ ＯＤＮ
（１５量体）あるいは遊離のｃ−ｍｙｃ ＰＯ ＯＤＮ（１５量体）を注射し、
８日間にわたって血清サイトカインレベルを測定した。ＳＡＬＰ ｃ−ｍｙｃ
ＰＳ ＯＤＮを注射したマウスでは、前と同様に（図２８Ａ〜Ｄ）血清中のＩＬ
−６，ＩＬ−１２，ＭＣＰ−１およびＩＦＮ−γレベルの上昇が検出され、ＩＬ
−６（図３０Ａ）、ＩＬ−１２（図３０Ｂ）、およびＭＣＰ−１（図３０Ｃ）で
は４時間後に、ＩＦＮ−γ（図３０Ｄ）では８時間後にピークとなった。ＳＡＬ
Ｐ ｃ−ｍｙｃ ＰＯ ＯＤＮを注射したマウスでも約４時間後および８時間後
に血清サイトカインレベルが最高となったが、血清サイトカイン発現レベルはよ
り高くなった。ＭＣＰ−１の血清サイトカインレベルは１．４倍に上昇したが、
ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−６ではは２〜４倍の上昇を認めた（図３）
。遊離のｃ−ｍｙｃ ＰＯ ＯＤＮを注射したマウスでは、血流中でホスホジエ
ステルＯＤＮが速やかに分解されるため、予想通り検出可能なサイトカインレベ
ルの変化は検出されなかった。
【０１４０】 ホスホロチオアートＯＤＮを含んだＳＡＬＰと、ホスホジエステルＯＤＮを含
んだＳＡＬＰの作用の２番目に大きな違いは、２４時間後のＩＦＮ−γレベルに
注目したときに検出された。ＳＡＬＰ ｃ−ｍｙｃ ＰＳ ＯＤＮを注射したマ
ウスでは、ＩＦＮ−γレベルのピークは前に示されたように８時間後に発生した
が、２番目の幅広い誘導相は２〜７日後に見られ、約５日後にピークに達した（
図３１Ａ）。ＳＡＬＰ ｃ−ｍｙｃ ＰＯ ＯＤＮも、８時間後にＩＦＮ−γの
誘導レベルが高くなり、約６日後に２番目のＩＦＮ−γのピークが始まった（図
３１Ｂ）。しかし、発現量はＳＡＬＰ ｃ−ｍｙｃ ＰＳ ＯＤＮによる誘導よ
りも有意に低かった。ホスホロチオアートと、ホスホジエステルＯＤＮ−を含ん
だＳＡＬＰのＩＦＮ−γ誘導レベルの差より、２番目のＩＦＮ−γ相は未分解の
ＯＤＮの存在に依存していることが示唆されるであろう。Ｉｎ ｖｉｖｏでのポ
リヌクレオチドに誘導されるＩＦＮ−γは、マクロファージから放出されるＩＬ
−１２に応答して、ＮＫ細胞から分泌されることが確認されている（Ｃｈａｓｅ
ｅｔ ａｌ．， １９９７）。しかし血清ＩＬ−１２レベルを分析したところ
、２回目のＩＬ−１２誘導相は明確でなかった。ＳＡＬＰ ｃ−ｍｙｃ ＰＳ
ＯＤＮ（図３２Ａ）では３〜５日目（７２〜１２０時間後）に、ＳＡＬＰ ｃ−
ｍｙｃ ＰＯ ＯＤＮ（図３２Ｂ）では７日後（１６８時間後）に（図３２Ｂ）
、極めて小さなＩＬ−１２の増加が見られた。図５の点線は、ＨＢＳを注射した
マウスのＩＬ−１２レベルを表している。２つの誘導相におけるＩＬ−１２とＩ
ＦＮ−ガンマの相対レベルの差についての一つの説明として、後の相ではＮＫ細
胞数が増加するため（Ｂｒａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，提出済み）、ＩＬ−１２
の作用が増幅されるというものがある。またＩＬ−１２の放出が樹状細胞の成熟
によって起こると考えれられ、これが局在化することも考えられる。未成熟の樹
状細胞は、ＳＡＬＰ／ＯＤＮを摂取すると、リンパ節内を流れる間に活性化して
Ｔ細胞の多い部位に移動し、ＩＬ−１２を放出してＴ細胞とＮＫ細胞を活性化し
てＩＦＮ−ガンマを産生すると思われる。遊離のｃ−ｍｙｃ ＰＳ ＯＤＮもＩ
ＦＮ−γ発現の第２相を誘導したが、検出可能な差（初期値の２倍）に達するに
はより多くの用量（＞４０ｍｇ／ｋｇ）を要するのに対し、遊離のｃ−ｍｙｃ
ＰＯ ＯＤＮは効果を示さなかった（データは示さず）。７日間の経過を通じて
、最初の４時間後のピーク（図２８および３０）の終了と関与すると思われるも
の以外に、ＩＬ−６およびＭＣＰ−１レベルの有意な上昇は、検出されなかった
。また、ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−１０あるいはＴＮＦ−αレベルの変化は検
出されなかった。
【０１４１】 （ＯＤＮ配列依存性） ＳＡＬＰ処方にＯＤＮが含まれる場合、反復注射時に認識を誘導し、ポリエチ
レンが結合した脂質を除去することにより（Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，提出
済み）、免疫作用を適合させることが認められている。しかし、認められている
応答は、ＯＤＮ配列だけでなく、使用した配列がＰＳあるいはＰＯ ＯＤＮであ
るかということにも無関係であった。このため、サイトカイン誘導レベルについ
てＯＤＮ配列およびＳＡＬＰの主鎖の作用を試験した。免疫刺激性がないかある
いは微弱であるＩＳＩＳ ３０８２、ｃ−ｍｙｃ ＯＤＮの２種類のＯＤＮ配列
を比較した。
【０１４２】 マウスを濃度２０ｍｇ／ｋｇのＳＡＬＰ ｃ−ｍｙｃ ＰＯ ＯＤＮ（１５ｍ
ｅｒ），ＳＡＬＰ ＩＳＩＳ ３０８２ ＰＯ ＯＤＮ又は遊離ＩＳＩＳ ３０
８２ ＰＯ ＯＤＮで処理し、血清ＩＬ−６，ＩＬ−１２，ＭＣＰ−１及びＩＦ
Ｎ−γの濃度を７日間に亘って測定した。血清サイトカイン誘導の動力学は、前
にＩＬ−６，ＭＣＰ−１及びＩＬ−１２で発生した４時間ピーク，並びにＩＦＮ
−γで発生した８時間及び１２０時間ピークの発現で観察したものと類似してい
た。これらの時点における血清サイトカイン濃度を、前の２つの試験結果（図２
８及び２９）とともに表１に纏めた。ＩＬ−６，ＭＣＰ−１，ＩＬ−１２及びＩ
ＦＮ−γの血清濃度は、ＳＡＬＰ ＩＳＩＳ ３０８２（ＰＯ）で処理したマウ
スにおいては、ＳＡＬＰ ｃ−ｍｙｃ ＰＯ ＯＤＮと比較して２−１０倍も低
かった。ＯＣＮのＰＳバーションを比較した場合においても、これと類似の効果
が見られる。ＳＡＬＰ ｃ−ｍｙｃ ＰＳ ＯＤＮの上記サイトカイン発現誘発
量は、ＩＳＩＳ ＰＳ ＯＤＮを含むＳＡＬＰと比較して、１０−２０００倍も
高かった。
【０１４３】 （投与量がサイトカイン誘発量に及ぼす効果） ＳＡＬＰによるサイトカインの相対誘発濃度をより良く特徴付けるために、我
々はＳＡＬＰ ｃ−ｍｙｃ ＰＳ ＯＤＮ（１５ｍｅｒ），ＳＡＬＰ ｃ−ｍｙ
ｃ ＰＯ ＯＤＮ（１５ｍｅｒ），遊離ｃ−ｍｙｃ ＰＳ ＯＤＮ（１５ｍｅｒ
）及び遊離ｃ−ｍｙｃ ＰＯ ＯＤＮ （１５ｍｅｒ）の滴加投与試験を実施し
た。マウスに２−２０又は１０−６０ｍｇ／ｋｇのＳＡＬＰ又は遊離ＯＤＮをそ
れぞれ注射し、ＩＬ−６，ＩＬ−１２，ＭＣＰ−１及びＩＦＮ−γの血清濃度を
測定した。ＩＬ−１２に対する代表的な滴定投与量においては、遊離ｃ−ｍｙｃ
ＰＳ ＯＤＮ，ＩＬ−６，ＩＬ−１２，ＭＣＰ−１及びＩＦＮ−γ濃度６０ｍ
ｇ／ｋｇにおいてさえも、５ｍｇ／ｋｇ ＳＡＬＰ ｃ−ｍｙｃ ＰＳ ＯＤＮ
又はＳＡＬＰ ｃ−ｍｙｃ ＰＯ ＯＤＮと比較して同じ濃度に達しないことを
示した（図３３）。
【０１４４】 これらの実験結果は、脂質担体中に包まれたＯＤＮの免疫性が増大したことを
示している。遊離ＯＤＮと比較してＳＡＬＰの免疫性が増大する事実は、一部は
ＯＤＮの安定性が高められること，及びマクロファージの生体分布が増大するこ
とに起因するものと考えられる。前者は、遊離ＰＯ ＯＤＮと比較して，封入ｃ
−ｍｙｃ ＰＯ ＯＤＮでは高サイトカイン発現濃度が観察され、これが血清ヌ
クレアーゼにより崩壊させられる事実を説明しているものと考えられる。ヌクレ
アーゼ抵抗ＰＳ ＯＤＮが増えると、マクロファージへのＯＤＮ分布が増大する
ことにより、ＳＡＬＰの免疫性が遊離ＰＳ ＯＤＮに比べて高くなる可能性が高
い。封入ＰＯ ＯＤＮも、対応するＳＡＬＰ ＰＳ ＯＤＮより免疫刺激性が強
かったが、それは恐らく天然ＰＯバックボーンに対して，より強い親和性を有す
るものと期待されるＣｐＧポリヌクレオチドに対するパターン認識受容体の能力
を反映しているものと考えられる。
【０１４５】 ＩＳＩＳ ３０８２ ＰＯ ＯＤＮ（ＣｐＧ配列のモチーフを含まない）も、
ＳＡＬＰ中で投与した場合、サイトカインの発現を刺激した。この効果が、この
ＯＤＮによるものか〔非ＣｐＧ ＯＤＮは、樹木状細胞（Ｊａｋｏｂら，１９９
８）及びＢ細胞（Ｄａｖｉｓら，１９９８；Ｍｏｎｔｅｉｔｈら，１９９７）の
両方を生体外で刺激することができるが、これより遙に高い濃度が必要である〕
、或いはＯＤＮそれ自体ではなく，脂質／ＯＤＮの複合効果によるものであるか
どうかについては明らかではない。サイトカイン（ＩＦＮ−γ）又は抗体のアイ
ソタイプ（ＩｇＧ２ａ）が誘発されることから明らかなように、タンパク質抗原
を含むリポソームは、当該抗原だけがＴｈ２のバイアス反応（Ａｆｒｉｎ及びＡ
ｌｉ，１９９８）；Ｋｒｉｓｈｎａｎら，２０００；Ｓｅｈｒａら，１９９８）
を有するとしても、Ｔｈ１型の反応を高める傾向にある。細胞レベルにおいて、
リポソームのタンパク質粒子は、脂質及びタンパク質のＡＰＣ内における細胞内
通過パターンを抗原もＭＨＣのクラスＩ通路に入るように共に変化させる（Ｒａ
ｏ及びＡｌｖｉｎｇ，２０００）。Ｔｈ１バイアス反応及びＭＨＣクラスＩ分子
との会合は、ウィルスなどの分子内病原体にとっては古典的な反応である。ウィ
ルス状の粒子として認識され得る多核酸を含むリポソームでも、これと類似の効
果が起こる可能性がある。
【０１４６】 遊離及び封入ｃ−ｍｙｃ ＰＳ ＯＤＮが共にＩＬ−１２を誘発する事実は、
Ｔｈ１−型の反応が誘発されることを示すものである。さらに、ＯＤＮをＳＡＬ
Ｐに封入して投与した場合、遊離状態で投与した場合と比べてＩＦＮ−γ，ＩＬ
−６及びＭＣＰ−１が大幅に上方調節された（表２）。このように、ＳＡＬＰは
免疫反応を著しく高めたが、ＯＤＮにより誘発されるサイトカインの種類又は動
力学を変化させるようには見えなかった（Ｚｈａｏら，１９９７；Ｋｌｉｎｍａ
ｎら，１９９６を参照のこと）。しかし、誘発されたサイトカインの相対的な発
現量は変化する。例えば、遊離ｃ−ｍｙｃ ＰＳ ＯＤＮと比較して、ＳＡＬＰ
はＩＬ−１２の発現量を２−３倍まで増加させただけである。これに対してＩＦ
Ｎ−γの発現量は、１０００倍まで高められた（表３）。ＳＡＬＰ ＩＳＩＳ
３０８２が４時間目に誘発させたＩＬ−１２の濃度は遊離ｃ−ｍｙｃ ＰＳと比
較して低かったが、８時間目に誘発させたＩＦＮ−γの量は＞１０００倍量に達
したことから、この効果は、単にＩＬ−１２の増幅効果がＩＦＮ−γのダウンス
トリーム発現に対して与えた変化だけには止まらない。
【０１４７】 ＳＡＬＰに反応して上方調節された４種類のサイトカインの中で、ＩＬ−１２
及びＩＦＮ−γは、ＣｐＧ ＯＤＮの抗腫瘍効果（Ｄｏｗら，１９９９）及び感
染性の病原体からの保護効果（Ｗａｌｋｅｒら，１９９９；Ｋｒｉｅｇら，１９
９８；Ｓｃｈｗａｒｔｚら，１９９９；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら，１９９８）に
おいて重要又は必須であることが知られている。ＩＦＮ−γの最大誘発量に達す
るまでの時間は、ＤＮＡ／脂質粒子において約８時間であることが知られている
（Ｄｏｗら，１９９９；Ｗｈｉｔｍｏｒｅら，１９９９）。この結果は、本研究
の結果に類似している。この初期時点において、ＳＡＬＰ ＰＯ ＯＤＮによる
ＩＦＮ−γの発現濃度は、ＳＡＬＰ ＰＳ ＯＤＮによる発現濃度より高かった
。しかし、我々が試験時間を７日間を越えて延長した場合には、二番目のより広
幅のＩＦＮ−γ誘発相が約５日目に現れることが観察された（図３１）。この第
二のＩＦＮ−γのピークは、ＳＡＬＰ ＰＳ ＯＤＮに関しては最大である。し
かし、ＰＯ ＯＤＮ含有ＳＡＬＰと比較すると著しく小さい。この事実は、未反
応ＯＤＮの存在が必要であることを示唆している。これに対応する血清ＩＬ−１
２の高発現がこの第二のＩＦＮ−γピークの前に存在しない事実は、恐らくはＮ
Ｋ細胞が発現することにより当該免疫系が変化し，又はプライム化されている（
Ｂｒａｍｓｏｎら，２０００）か、又は樹木状細胞が成熟した（Ｌｉｐｆｏｒｄ
，１９９８）ことを示唆している。マクロファージ及びＮＫ細胞の活性化，腫瘍
による血管形成の抑制，並びに適応免疫反応の調節には、抗体アイソタイプの切
り替え誘発を通して，ＩＦＮ−γが関与している。ＩＬ−１２は、ＩＦＮ−γと
共にＴｈ−１反応を促進する。このサイトカインは抗転移性及び抗血管形成性を
示し、マクロファージによる腫瘍の強力な浸透原因を創り出す。さらに、ＩＬ−
１２は成長を示し，抗癌剤としての臨床試験において、さらに免疫性の強い腫瘍
の退化原因となることができる（Ｇｏｌａｂ及びＺａｇｏｚｄｚｏｎ，１９９９
）。
【０１４８】 内皮筋細胞及び平滑筋細胞を含む種々の細胞によるＭＣＰ−１の発現（Ｇｒａ
ｖｅｓ及びＶａｌｅｎｔｅ，１９９１）は、単球及びマクロファージの関与を強
調している。その走化性効果に加え、ＭＣＰ−１はマクロファージ上の付着分子
を上方調節することにより接触依存性腫瘍細胞の溶解を誘発させることもできる
（Ｓｈｉｎｏｈａｒａら，２０００）。生体外でＣｐＧ ＯＤＮに反応してＢ細
胞及びマクロファージから放出されるＩＬ−６（参考文献）は、Ｂ細胞の分化及
び急性相タンパク質の誘発刺激に関与する。
【０１４９】 本研究の中で見られるサイトカイン誘発における差異とは異なり、ＯＤＮ配列
及びバックボーンへの依存性は、ＳＡＬＰではこれまでに観察されていなかった
。ＳＡＬＰには、ＰＥＧ脂質含有ベヒクルの免疫認識及びそれに続くクリアラン
スの誘発が見いだされていた。このことは、種々の理由による可能性がある。異
なる抗ＰＥＧ抗体の滴定値が異なるＯＤＮ含有ＳＡＬＰにより創り出されること
が可能ではあるが、ベヒクル クリアランス速度の測定値ではこれを検出するこ
とはできなかった。或いはＯＤＮにおいては、適用反応の発現が、初期の固有反
応と比較して敏感ではないのかも知れない。例えば、適応免疫反応を支持するた
めに必要なプライミング信号には、Ｂ細胞の分化及び増殖を支持するための限界
信号が存在するだけで良く、これに対してＯＤＮはマクロファージに対してより
直接的な影響を及ぼしている可能性もある。
【０１５０】 ここで報告した結果は、ＯＤＮをＳＡＬＰなどのリポソーム ベヒクル中に封
入すると、ＯＤＮ の免疫性が大幅に増大し、比較的に免疫性の低いＩＳＩＳ
３０８２などのＯＤＮにおいてさえも、真のアンチセンス活性から得られる結果
を複雑化していることを示している。しかし、これらの結果は、ＳＡＬＰを免疫
療法に使用し得る可能性をを支持している。遊離ＣｐＧ ＯＤＮは既にタンパク
質主体のワクチン（参考文献）用，並びに感染防止（参考文献）用及び抗癌治療
（参考文献）用のアジュバントとして使用されている。ＣｐＧ ＯＤＮに見られ
る潜在的なメリットは、Ｔｈ−１バイアス アジュバント反応を刺激するその能
力である。当該能力は、本研究結果から明らかなように、ＳＡＬＰにより著しく
高められる可能性が高い。ＳＡＬＰの免疫刺激効果は、腫瘍関連マクロファージ
を活性化してこれに殺腫瘍性を与える可能性がある。これは、現在他の免疫調節
剤であるムラミル ジペプチドで使用されている方法である（Ｆｉｄｌｅｒら，
１９９７；Ｗｏｒｔｈら，１９９９）。さらに免疫刺激が、正常細胞の壊死を防
止するために必要なサイトカインを誘発させることにより、ドキソルビシンなど
の抗癌剤が有する有毒な副作用を低下させる可能性がある。アジュバントとして
の見地から、リポソームは抗原及びＣｐＧ ＯＤＮを共局在化させ、これにより
体液性反応を高めている可能性が高い。現在、ＳＡＬＰのアジュバント特性を他
の一般的に使用されているモノホスホリル脂質Ａ，アルミニウム塩，及びフロイ
ント アジュバントなどのアジュバントと比較して、研究が進められているとこ
ろである。
【０１５１】 ここに示した例は、本発明の特定態様に関する説明である。しかし、より一般
的に言えば、本発明は哺乳類（ヒトを含む）の験体に対して、このような組成物
を使用することにより治療上のメリットを提供する組成物及び方法を網羅するも
のである。本発明の組成物は、脂質膜の小嚢，及び当該小嚢中に完全封入された
核酸で構成される形態を取るものである。特定抗原に対する反応刺激が望まれる
場合、当該組成物は当該小嚢とともに、例えば当該小嚢の外部表面と会合させて
これに抗原をさらに添加することもできる。
【０１５２】 望ましい組成物は、当該組成物を構成する核酸が、当該組成物に対して４重量
％を越える場合である。
【０１５３】 本発明の組成物に含まれる核酸は、治療対象哺乳類のゲノムに対して相補関係
に無く、且つ当該核酸が，当該哺乳類の核酸の相補塩基対との相互作用に依存し
ないような機構を通じて免疫刺激を与えることが適切である。このような核酸は
、しばしばＣｐＧモチーフ又は免疫刺激パリンドロームなどの免疫刺激配列を含
んでいる。
【０１５４】 本発明の組成物には、遊離形態でこれを未処理哺乳類に投与しても免疫刺激を
誘発させないような核酸，又は遊離形態で未処理哺乳類に投与してもヌクレオチ
ドの免疫刺激配列に対する免疫反応を抑制するような核酸を使用することができ
る。
【０１５５】 当該核酸は、独占的にホスフォジエステルのヌクレオチド間結合を有すること
ができ、又は複数のホスフォジエステルのヌクレオチド間結合を修飾ヌクレオチ
ド間結合とともに形成させるような方法で、これを修飾することができる。当該
核酸は、独占的に修飾された結合，又は複数の修飾結合を含むこともできる。例
えば、当該核酸は独占的にホスフォロチオエートのヌクレオチド間結合，又は複
数のホスフォロチオエートのヌクレオチド間結合を含むことができる。
【０１５６】 組成物の処方に適切に使用されるカチオン性リガンドは、これをＤＯＤＡＰ，
ＤＯＤＭＡ，ＤＭＤＭＡ，ＤＯＴＡＰ，ＤＣ−Ｃｈｏｌ，ＤＤＡＢ，ＤＯＤＡＣ
，ＤＭＲＩＥ，ＤＯＳＰＡ及びＤＯＧＳから選ぶことができる。さらに、当該脂
質処方は、好ましくはＰＥＧ−脂質，ＰＡＯ−脂質又はガングリオシドなどの凝
集防止化合物を含むこともできる。
【０１５７】 抗原の他に，又は抗原の代わりに、本発明の組成物には、ドキソルビシンなど
の細胞毒性化合物を共封入して含ませることもできる。当該脂質膜小嚢は、当該
核酸と細胞毒性化合物の両方を完全封入する。この種の組成物を調製する方法が
、本発明の他の側面である。この方法においては、脂質をエタノールに溶解し、
水性緩衝液中で当該脂質をオリゴヌクレオチドと混合してオリゴヌクレオチド付
加脂質小嚢を形成させ、当該オリゴヌクレオチド付加脂質小嚢を，当該細胞毒性
化合物が当該小嚢の内部に活発に蓄積されるように細胞毒性化合物に暴露させる
ことにより、当該治療用組成物を調製することができる。
【０１５８】 本発明の組成物は、ヒトを含む哺乳類に対して治療上のメリットを提供するた
めに、カチオン性脂質で構成される脂質−核酸粒子を医薬製造において使用する
ことにより、これを種々の方法で使用することができる。このようにして、当該
組成物は哺乳類の体内において免疫反応を誘発させ，哺乳類の体内でＢ細胞を活
性化させ，又は新生成を起こしている哺乳類の体内で当該新生成の治療を行うた
めに、これを使用することができる。当該治療方法は、脂質処方の中に完全封入
された核酸で構成される脂質−核酸粒子を調製し、当該脂質処方はカチオン性脂
質で構成され、当該脂質−核酸粒子を当該哺乳類に投与するステップで構成され
る。
【０１５９】 当該組成物に抗原が含まれる場合、本発明は免疫反応を当該抗原に誘発させる
方法を提供するものであり、当該方法は免疫反応を起こさせたい抗原を当該小嚢
の外部表面に会合させた粒子を調製し、当該粒子を治療対象の哺乳類験体に投与
するステップで構成される。
【０１６０】 本発明は、特にリンパ腫の治療に使用される。従って、本発明はリンパ腫の治
療方法を提供するものであり、当該方法は、リンパ腫を有する験体又は患者に複
数のホスフォジエステル ヌクレオチド間結合を含む，脂質膜小嚢中に完全封入
されたオリゴヌクレオチドを、０．００７５−７５ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオ
チド投与量で投与するステップで構成される。本発明の一つの態様において、当
該オリゴヌクレオチドは、免疫刺激配列を含むオリゴヌクレオチドである。
【０１６１】 上記の例に示したように、本発明の組成物中で脂質担体を使用することにより
、免疫系において希望する刺激を達成するに必要なオリゴヌクレオチドの量を実
質的に減少させることができる。これが、遊離形態においては見かけ上活性を有
していなかったオリゴヌクレオチドが、脂質封入形態で提供されると免疫反応を
刺激するという事実に反映される場合もある。言葉を変えて言えば、同じ水準の
反応を達成するに必要なＯＤＮの量が低下する事実に反映される。このように、
哺乳類の体内で免疫反応を刺激するために有効量のオリゴヌクレオチドを使用す
る方法を実施する場合、本発明は、オリゴヌクレオチドを脂質小嚢の中に完全封
入し、当該有効量に対して２０％未満のオリゴヌクレオチドを哺乳類験体に投与
し、これにより当該哺乳類験体の体内で希望する免疫反応を得ることにより構成
される改良方法を提供するものである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ〜Ｃは免疫コンピーテントなＢａｌｂ／ｃ マウス（Ａ）、ならびに免
疫コンプロマイズＢａｌｂ／ｃ ヌード（Ｂ）およびＢａｌｂ／ｃ ＳＣＩＤ−
Ｒａｇ２ マウス（Ｃ）に反復投与した場合のＰＥＧ−リポソームの循環レベル
を示す。
【図２】 図２ＡおよびＢは、ＳＡＬＰ（ＰＥＧ−ＣｅｒＣ20）の消失に対する核酸配列
（Ａ）および構造（Ｂ）の影響を示す。
【図３】 図３はリポソームの回収に対するＤＮＡ対リピド比の影響を示す。
【図４】 図４は迅速な消失応答の発現に対する投与スケジュールの影響を示す。
【図５】 図５ＡおよびＢはＯＤＮを含有するリポソームの迅速な消失におけるＰＥＧ−
リピドの役割を例示する。
【図６】 図６はクロスオーバー試験の結果を示す。
【図７】 図７ＡおよびＢは固形腫瘍におけるＡＳ４２００の蓄積を示す。
【図８】 図８ＡおよびＢは遊離ｃ−ｍｙｃに優るｃ−ｍｙｃ／ＴＣＳの増強された効力
およびアンチセンス／リピド比の影響を例示する。
【図９】 図９は封入されたホスホジエステルＯＤＮ（ＩＮＸ−６２９８）の遊離ＩＮＸ
−６２９８に比較したマウスＢ１６メラノーマに対する改良された効力の証明を
示す。
【図１０】 図１０はＳＣＩＤ−Ｒａｇ２ マウスにおけるＤｏＨＨ２ ヒトリンパ腫への
１５マーＩＮＸ−６２９８の効力を示す。
【図１１】 図１１Ａおよび１１Ｂはｉ．ｖ． ＤｏＨＨ２における遊離およびＡＳ４２０
０ ＩＮＸ−６２９５に対する用量反応を例示する。
【図１２】 図１２は様々なｃ−ｍｙｃおよびリピド製剤で処置したマウスにおける脾臓重
量における変動を示す。
【図１３】 図１３は、インビトロ脾臓細胞増殖アッセイにおける各種ＯＤＮのマイトジェ
ニシティー（有糸分裂促進性）を示す。
【図１４】 図１４は、マイトジェニックコントロールＯＤＮ ＩＮＸ−４４２０がＬＲ−
３２８０と同様に、インビボでの皮下Ｂ１６メラノーマにおける活性の証明を示
す。
【図１５】 図１５はｃ−ｍｙｃおよび慣用の薬物（ドキソルビシン）の単一リポソーム中
への共封入が腫瘍の増殖を阻害することを示す。
【図１６】 図１６はＡＳ４２０４の免疫原性および共封入したドキソルビシンの逆使用を
例示する。
【図１７】 図１７はＩＮＸ−６２９５およびＩＮＸ−６３００のマイトジェニシティーを
示す。
【図１８】 図１８ＡおよびＢは、ＩＮＸＣ−６２９５の反復投与後の肝臓における単核球
細胞およびナチュラルキラー細胞活性の上昇を示す。
【図１９】 図１９ＡおよびＢはＩＮＸ−６２９５／ＳＡＬＰ処置後の肝臓におけるＮＫ１
．１＋／ＴＣＲ−細胞の増加を示す。
【図２０】 図２０は、ＩＮＸ−６２９５／ＳＡＬＰ処置後のベージュマウスからのＨＭＮ
Ｃにおける細胞溶解活性の欠損を示す。
【図２１】 図２１は遊離および封入ＰＳ ＯＤＮの投与後におけるＨＭＮＣの増加を示す
。
【図２２】 図２２ＡおよびＢはＳＡＬＰ処置後の肝臓におけるＮＫ１．１＋／ＴＣＲ−細
胞の増加を示す。
【図２３】 図２３Ａ〜Ｃは遊離および封入ＰＳ ＯＤＮの投与後におけるＨＭＮＣ集団内
のナチュラルキラー細胞の活性化合物を示す。
【図２４】 図２４ Ａ〜ＣはＤＯＤＡＣ，ＤＯＴＡＰまたはＤＯＴＭＡのいずれかを含有
するリポプレックスのトランスフェクションプロファイルを示す。
【図２５】 図２５は、リポプレックス投与後の腹膜における細胞浸潤のレベルを示す。
【図２６】 図２６Ａ〜Ｃは、リポプレックス誘導炎症がＩＦＮ−γの産生の増加を伴うこ
とを示す。
【図２７】 図２７は、リポプレックス誘導ＮＫ細胞の活性化を示す。
【図２８】 図２８Ａ〜Ｄは、遊離およびリポソームｃ−ｍｙｃ ＰＳ ＯＤＮによって誘
導された血清サイトカインを示す。
【図２９】 図２９Ａ〜Ｄは、遊離およびリポソームｃ−ｍｙｃ ＰＳ ＯＤＮによって誘
導された血清サイトカインを示す、
【図３０】 図３０Ａ〜Ｄは、ＰＯおよび ＰＳ ＯＤＮによるサイトカイン分泌を比較す
る試験の結果を示す。
【図３１】 図３１ＡおよびＢは２つの相のＩＦＮ−γ誘導を示す。
【図３２】 図３２ＡおよびＢはＩＮＦγ誘導の第２相に相当する時点における血清ＩＬ−
１２のレベルを示す。
【図３３】 図３３は血清サイトカインの誘導に対するＯＤＮ用量の作用を示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１１月１日（２００１．１１．１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/02 Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ハラシム、トロイ、オー カナダ国 ブリティッシュ コロンビア、 ヴァンクーヴァー、 イースト トウェン ティース アヴェニュー 128 (72)発明者 クリムク、サンドラ、ケイ カナダ国 ブリティッシュ コロンビア、 ノース ヴァンクーヴァー、 チェスター フィールド アヴェニュー 3330 (72)発明者 コジック、リリアナ、ディー カナダ国 ブリティッシュ コロンビア、 ヴァンクーヴァー、 ケベック ストリー ト 3023 (72)発明者 ブラムソン、ジョナサン、エル カナダ国 オンタリオ、オークヴィル、 カースティ コート 22−1220 (72)発明者 ムイ、バーバラ カナダ国 ブリティッシュ コロンビア、 ヴァンクーヴァー、 ウェスト ブロード ウェイ 301−3440 (72)発明者 ホープ、マイケル、ジェイ カナダ国 ブリティッシュ コロンビア、 ヴァンクーヴァー、 ウェスト イレブン ス アヴェニュー 3550 Ｆターム(参考） 4C076 AA19 BB11 CC07 DD63F EE59 FF43 4C084 AA02 AA03 MA01 MA05 MA24 MA66 NA13 ZB052 ZB072 ZB212 4C085 AA03 BB23 CC31 CC32 EE01 GG01 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA02 MA04 MA05 MA24 MA66 NA13 ZB05 ZB07 ZB21

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 陽イオン性リピドから構成されるリピド粒子に封入された核
    酸ポリマーからなる、哺乳動物においてサイトカインの分泌を刺激する組成物。
  2. 【請求項２】 核酸ポリマーは配列非特異的免疫刺激オリゴデオキシヌクレ
    オチド配列である「請求項１」記載の組成物。
  3. 【請求項３】 配列非特異的免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド配列は少
    なくとも１種のＣｐＧモチーフを包含する「請求項２」記載の組成物。
  4. 【請求項４】 核酸ポリマーはリピド粒子の不存在下には哺乳動物において
    検出可能な免疫刺激活性を示さない「請求項１」記載の組成物。
  5. 【請求項５】 核酸ポリマーはホスホジエステル結合によって連結したデオ
    キシヌクレオチド残基からなる「請求項１〜４」のいずれかに記載の組成物。
  6. 【請求項６】 陽イオン性リピドはＤＯＤＡＰ，ＤＯＤＭＡ，ＤＭＤＭＡ，
    ＤＯＴＡＰ，ＤＣ−Ｃｈｏｌ，ＤＤＡＢ，ＤＯＤＡＣ，ＤＭＲＩＥ，ＤＯＳＰＡ
    およびＤＯＧＳ中から選択される「請求項１〜５」のいずれかに記載の組成物。
  7. 【請求項７】 リピド粒子はさらに交換可能な立体障害リピドからなる「請
    求項１〜６」のいずれかに記載の組成物。
  8. 【請求項８】 交換可能な立体障害リピドはＰＥＧ−リピド、ＰＡＯ−リピ
    ドまたはガングリオシドである「請求項７」記載の組成物。
  9. 【請求項９】 哺乳動物におけるサイトカインの分泌を刺激する方法におい
    て「請求項１〜８」のいずれかに記載の組成物をサイトカイン分泌刺激有効量に
    おいて哺乳動物に投与することからなるサイトカイン分泌の刺激方法。
  10. 【請求項１０】 標的抗原に対する免疫応答を誘導する組成物において、 （ａ）リピド粒子中に封入された核酸ポリマー、および （ｂ）標的抗原の少なくとも１種のエピトープをコードする核酸および標的抗
    原の少なくとも１種のエピトープからなるポリペプチド、グリコリピドおよびグ
    リコペプチド中から選択される抗原性分子 からなる組成物。
  11. 【請求項１１】 抗原性分子はリピド粒子と会合している「請求項１０」記
    載の組成物。
  12. 【請求項１２】 核酸ポリマーは配列非特異的免疫刺激オリゴデオキシヌク
    レオチド配列である「請求項１１」記載の組成物。
  13. 【請求項１３】 配列非特異的免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド配列は
    少なくとも１種のＣｐＧモチーフを包含する「請求項１２」記載の組成物。
  14. 【請求項１４】 核酸ポリマーはリピド粒子の不存在下には哺乳動物におい
    て検出可能な免疫刺激活性を示さない「請求項１０または１１」記載の組成物。
  15. 【請求項１５】 オリゴデオキシヌクレオチドはホスホジエステル結合によ
    って連結したデオキシヌクレオチド残基からなる「請求項１０〜１４」のいずれ
    かに記載の組成物。
  16. 【請求項１６】 陽イオン性リピドはＤＯＤＡＰ，ＤＯＤＭＡ，ＤＭＤＭＡ
    ，ＤＯＴＡＰ，ＤＣ−Ｃｈｏｌ，ＤＤＡＢ，ＤＯＤＡＣ，ＤＭＲＩＥ，ＤＯＳＰ
    ＡおよびＤＯＧＳ中から選択される「請求項１０〜１５」のいずれかに記載の組
    成物。
  17. 【請求項１７】 リピド粒子はさらに交換可能な立体障害リピドからなる「
    請求項１０〜１６」のいずれかに記載の組成物。
  18. 【請求項１８】 交換可能な立体障害リピドはＰＥＧ−リピド、ＰＡＯ−リ
    ピドまたはガングリオシドである「請求項１７」記載の組成物。
  19. 【請求項１９】 標的抗原に対する免疫応答を誘導する方法において、哺乳
    動物に「請求項１０〜１８」のいずれかに記載の組成物を、標的抗原に対する免
    疫応答の誘導に有効な量、投与することからなる方法。
JP2001520138A 1999-08-27 2000-08-28 サイトカインの分泌刺激および免疫応答の誘導組成物 Pending JP2003509341A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US60/151,211 1999-08-26
US15121199P 1999-08-27 1999-08-27
US17640600P 2000-01-13 2000-01-13
US60/176,406 2000-01-13
PCT/CA2000/001013 WO2001015726A2 (en) 1999-08-27 2000-08-28 Compositions for stimulating cytokine secretion and inducing an immune response

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003509341A true JP2003509341A (ja) 2003-03-11

Family

ID=26848421

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001520138A Pending JP2003509341A (ja) 1999-08-27 2000-08-28 サイトカインの分泌刺激および免疫応答の誘導組成物

Country Status (15)

Country Link
EP (1) EP1212085B1 (ja)
JP (1) JP2003509341A (ja)
KR (1) KR100737980B1 (ja)
CN (1) CN100368020C (ja)
AT (1) ATE376838T1 (ja)
AU (1) AU780535B2 (ja)
BR (1) BR0013834A (ja)
CA (1) CA2382611A1 (ja)
CZ (1) CZ20021029A3 (ja)
DE (1) DE60036950T2 (ja)
HU (1) HUP0202327A3 (ja)
IL (1) IL148359A0 (ja)
MX (1) MXPA02002107A (ja)
PL (1) PL354879A1 (ja)
WO (1) WO2001015726A2 (ja)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030129251A1 (en) 2000-03-10 2003-07-10 Gary Van Nest Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof
US7129222B2 (en) 2000-03-10 2006-10-31 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory formulations and methods for use thereof
FR2814958B1 (fr) * 2000-10-06 2003-03-07 Aventis Pasteur Composition vaccinale
WO2002052002A2 (en) 2000-12-27 2002-07-04 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory polynucleotides and methods of using the same
EP1404873B1 (en) 2001-06-21 2013-05-22 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same
AU2002311617A1 (en) * 2001-06-25 2003-01-08 The Regents Of The University Of California Method for preparation of vesicles loaded with immunostimulatory oligodeoxynucleotides
AU2002326561B2 (en) 2001-08-07 2008-04-03 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory compositions, formulations, and methods for use thereof
EP1414490A1 (en) * 2001-08-10 2004-05-06 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory oligonucleotide formulations and methods for use thereof
US20030119774A1 (en) * 2001-09-25 2003-06-26 Marianna Foldvari Compositions and methods for stimulating an immune response
CA2472055A1 (en) * 2001-11-07 2003-05-15 Inex Pharmaceuticals Corporation Improved mucosal vaccines and methods for using the same
CN1589148A (zh) 2001-11-29 2005-03-02 辉瑞产品公司 5,8,14－三氮杂四环[10.3.1.0.2,10.04,8)－十六－2(11),3,5,7,9－五烯的琥珀酸盐及其药用组合物
AU2003229433B2 (en) * 2002-05-10 2008-04-24 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Methylated immunostimulatory oligonucleotides and methods of using the same
JP2005525414A (ja) * 2002-05-10 2005-08-25 イネックス ファーマシューティカルズ コーポレイション 病原体ワクチン及びその使用方法
CA2752143C (en) * 2002-05-15 2014-09-23 Sutter West Bay Hospitals Delivery of nucleic acid-like compounds
AU2003259827B2 (en) 2002-08-12 2008-09-04 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory compositions, methods of making, and methods of use thereof
CN101693890B (zh) 2002-12-23 2012-09-05 戴纳伐克斯技术股份有限公司 免疫刺激序列寡核苷酸和使用方法
US8158768B2 (en) 2002-12-23 2012-04-17 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same
JP2007509040A (ja) * 2003-10-11 2007-04-12 イネックス ファーマシューティカルズ コーポレイション 先天性免疫及び抗体依存性細胞傷害を強化するための方法及び組成物
WO2005060330A2 (en) * 2003-12-22 2005-07-07 Statens Serum Institut Freeze-dried vaccine adjuvant
WO2006096497A2 (en) * 2005-03-04 2006-09-14 Dynavax Technologies Corporation Vaccines comprising oligonucleotides having immunostimulatory sequences (iss) wherein the iss are conjugated to antigens and stabilized by buffer conditions and further excipients
CA2611944A1 (en) 2005-06-15 2006-12-28 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipids and uses thereof
CN100418583C (zh) * 2006-02-21 2008-09-17 朱鸿飞 预防和治疗乳腺炎的药物组合物
EP3100718B1 (en) 2008-01-02 2019-11-27 Arbutus Biopharma Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
PL2279254T3 (pl) 2008-04-15 2017-11-30 Protiva Biotherapeutics Inc. Nowe preparaty lipidowe do dostarczania kwasów nukleinowych
CA2984026C (en) 2008-10-09 2020-02-11 Arbutus Biopharma Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
US20120009222A1 (en) * 2008-10-27 2012-01-12 Massachusetts Institute Of Technology Modulation of the immune response
AU2009311667B2 (en) 2008-11-07 2016-04-14 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
CA3036963A1 (en) 2009-01-29 2010-08-05 Arbutus Biopharma Corporation Lipid formulations comprising cationic lipid and a targeting lipid comprising n-acetyl galactosamine for delivery of nucleic acid
NZ596186A (en) 2009-05-05 2014-03-28 Alnylam Pharmaceuticals Inc Lipid compositions
AU2010245933B2 (en) 2009-05-05 2016-06-16 Arbutus Biopharma Corporation Methods of delivering oligonucleotides to immune cells
NZ712719A (en) 2009-06-10 2017-03-31 Arbutus Biopharma Corp Improved lipid formulation
IL292615B2 (en) 2009-07-01 2023-11-01 Protiva Biotherapeutics Inc Nucleic acid-lipid particles, preparations containing them and their uses
EP2609135A4 (en) 2010-08-26 2015-05-20 Massachusetts Inst Technology POLY (BETA-AMINO ALCOHOLS), THEIR PREPARATION AND USES THEREOF
WO2012135025A2 (en) 2011-03-28 2012-10-04 Massachusetts Institute Of Technology Conjugated lipomers and uses thereof
BR112014020824B1 (pt) 2012-02-24 2022-10-04 Protiva Biotherapeutics Inc Lipídeo, partícula de lipídeo e composição farmacêutica
JP2015525209A (ja) * 2012-05-23 2015-09-03 ジ・オハイオ・ステート・ユニバーシティ 脂質ナノ粒子組成物と、それを作製する方法、及びそれを使用する方法
WO2014028487A1 (en) 2012-08-13 2014-02-20 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipidoids and uses thereof
WO2014179562A1 (en) 2013-05-01 2014-11-06 Massachusetts Institute Of Technology 1,3,5-triazinane-2,4,6-trione derivatives and uses thereof
WO2016004202A1 (en) 2014-07-02 2016-01-07 Massachusetts Institute Of Technology Polyamine-fatty acid derived lipidoids and uses thereof
WO2020017590A1 (ja) * 2018-07-19 2020-01-23 一般財団法人阪大微生物病研究会 ＡタイプＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド含有脂質粒子
EP3892260A1 (en) * 2020-04-10 2021-10-13 Bayer Animal Health GmbH Immunostimulatory compositions based on liposomes with zwiterionic and cationic lipids
JP2022104889A (ja) * 2020-12-28 2022-07-12 財團法人工業技術研究院 免疫刺激性リポプレックス、免疫刺激性リポプレックスを含む医薬組成物、およびその用途
WO2023144798A1 (en) 2022-01-31 2023-08-03 Genevant Sciences Gmbh Ionizable cationic lipids for lipid nanoparticles

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995027478A1 (en) * 1994-04-12 1995-10-19 The Liposome Company, Inc. Fusogenic liposomes and methods of making and using same
WO1998018810A1 (en) * 1996-10-30 1998-05-07 The University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
JPH10506265A (ja) * 1994-07-15 1998-06-23 ザ ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション 免疫調節オリゴヌクレオチド
WO1998040100A1 (en) * 1997-03-10 1998-09-17 Ottawa Civic Loeb Research Institute USE OF NUCLEIC ACIDS CONTAINING UNMETHYLATED CpG DINUCLEOTIDE AS AN ADJUVANT
WO1998051278A2 (en) * 1997-05-14 1998-11-19 Inex Pharmaceuticals Corporation High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
WO1998055609A1 (en) * 1997-06-06 1998-12-10 The Regents Of The University Of California Inhibitors of dna immunostimulatory sequence activity
WO1999004819A1 (en) * 1997-07-24 1999-02-04 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for the delivery of nucleic acid catalysts

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995027478A1 (en) * 1994-04-12 1995-10-19 The Liposome Company, Inc. Fusogenic liposomes and methods of making and using same
JPH10506265A (ja) * 1994-07-15 1998-06-23 ザ ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション 免疫調節オリゴヌクレオチド
WO1998018810A1 (en) * 1996-10-30 1998-05-07 The University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
WO1998040100A1 (en) * 1997-03-10 1998-09-17 Ottawa Civic Loeb Research Institute USE OF NUCLEIC ACIDS CONTAINING UNMETHYLATED CpG DINUCLEOTIDE AS AN ADJUVANT
WO1998051278A2 (en) * 1997-05-14 1998-11-19 Inex Pharmaceuticals Corporation High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
WO1998055609A1 (en) * 1997-06-06 1998-12-10 The Regents Of The University Of California Inhibitors of dna immunostimulatory sequence activity
WO1998055495A2 (en) * 1997-06-06 1998-12-10 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
WO1999004819A1 (en) * 1997-07-24 1999-02-04 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for the delivery of nucleic acid catalysts

Also Published As

Publication number Publication date
CZ20021029A3 (cs) 2002-08-14
EP1212085A2 (en) 2002-06-12
MXPA02002107A (es) 2003-08-20
CN1501811A (zh) 2004-06-02
WO2001015726A2 (en) 2001-03-08
WO2001015726A3 (en) 2001-07-26
IL148359A0 (en) 2002-09-12
DE60036950T2 (de) 2008-08-07
DE60036950D1 (de) 2007-12-13
PL354879A1 (en) 2004-03-08
EP1212085B1 (en) 2007-10-31
AU780535B2 (en) 2005-03-24
CN100368020C (zh) 2008-02-13
CA2382611A1 (en) 2001-03-08
ATE376838T1 (de) 2007-11-15
HUP0202327A3 (en) 2004-07-28
KR20020068500A (ko) 2002-08-27
BR0013834A (pt) 2002-04-23
KR100737980B1 (ko) 2007-07-12
HUP0202327A2 (en) 2002-10-28
AU6813900A (en) 2001-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100737980B1 (ko) 사이토카인 분비 자극용 및 면역반응 유도용 조성물
US20030104044A1 (en) Compositions for stimulating cytokine secretion and inducing an immune response
Guevara et al. Advances in lipid nanoparticles for mRNA-based cancer immunotherapy
Ickenstein et al. Lipid-based nanoparticle formulations for small molecules and RNA drugs
Kiaie et al. Recent advances in mRNA-LNP therapeutics: immunological and pharmacological aspects
Semple et al. Immunogenicity and rapid blood clearance of liposomes containing polyethylene glycol-lipid conjugates and nucleic acid
KR100507660B1 (ko) 리포좀
Guevara et al. Lipid-based vectors for therapeutic mRNA-based anti-cancer vaccines
JP6016970B2 (ja) インビボでのポリヌクレオチドの送達のための連続疎水相を含む担体におけるリポソームの使用
Nikoofal-Sahlabadi et al. Liposomal CpG-ODN: An in vitro and in vivo study on macrophage subtypes responses, biodistribution and subsequent therapeutic efficacy in mice models of cancers
US20050249794A1 (en) Compositions for stimulating cytokine secretion and inducing an immune response
JP2007509040A (ja) 先天性免疫及び抗体依存性細胞傷害を強化するための方法及び組成物
US20040009943A1 (en) Pathogen vaccines and methods for using the same
JP2005516897A (ja) 改善された粘膜のワクチン及びその使用方法
Bolhassani Lipid-based delivery systems in development of genetic and subunit vaccines
Walvekar et al. Long-acting vaccine delivery systems
MXPA04011127A (es) Oligonucleotidos inmuno estimuladores metilados y metodos para utilizar los mismos.
Ahmad et al. Liposomes and niosomes for targeted drug and gene delivery systems
Nardo et al. Modulating the immune response with liposomal delivery
KR20220126235A (ko) Rna의 체내 전달용 조성물 및 이의 제조방법
EP1505942B1 (en) Pathogen vaccines and methods for using the same
Aldosari et al. Lipid Nanoparticles as Delivery Systems for RNA-Based Vaccines. Pharmaceutics 2021, 13, 206
Liu et al. Bifunctional lipids in tumor vaccines: an outstanding delivery carrier and promising immune stimulator
WO2023192503A1 (en) Compositions of lipid nanoparticles for plasmid dna delivery to the liver and methods for preparing the same
Wang et al. The development and application of a liposomal delivery system in biomedical sciences

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20070628

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20101207

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20110304

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20110311

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20110719