KR20220126235A - Rna의 체내 전달용 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

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KR20220126235A
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Abstract

본 발명은 양이온성 지질 기반 리포좀을 포함하는 mRNA 전달용 조성물 관한 것으로, 본 발명에 의한 mRNA 전달용 조성물은 보관 안정성이 우수하고, in vivo에서 높은 세포 내 전달율과 발현율을 나타내어, 암 치료용 mRNA 백신 또는 바이러스 감염 예방용 mRNA 백신 등의 안정성 및 효율을 향상시킬 수 있다.

Description

RNA의 체내 전달용 조성물 및 이의 제조방법{Composition for delivering RNA and Preparing method for the same}
본 발명은 mRNA 체내 전달용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 양이온성 지질 기반의 리포좀을 포함하는 mRNA 체내 전달용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
유전자 치료법 및 유전자 백신은 의약 분야에서 이미 증명되고 일반에 적용되는 기술로, 유전적 질환뿐 아니라 자가면역질환, 감염성 질환, 암 또는 종양 관련 질환, 염증성 질환 등도 치료대상이 될 수 있다.
유전자 백신은 타겟 유전자를 코딩하는 DNA 및 RNA를 직접 동물에 주입하면, 타겟 유전자가 살아있는 동물에서 발현하고, 이 발현에 의해 면역이 가능하다는 것이 보고되면서부터 개발되기 시작하였다(Wolff JA et al. Science, 247:1465-8, 1990).
유전자 백신 접종은 박테리아 표면의 특징적인 구성요소, 바이러스 입자, 종양 항원 등과 같은 선택된 항원에 대해 원하는 면역 반응을 일으킬 수 있게 한다. 대체로, 백신 접종은 현대 의학의 중추적인 성과 중 하나이다. 그러나 효과적인 백신은 현재 한정된 수의 질환에만 이용될 수 있다. 따라서 백신 접종에 의해 예방할 수 없는 감염증은 여전히 매년 수백만 명의 사람들에게 영향을 미친다.
유전자 치료 또는 유전자 백신 접종에서 DNA와 RNA가 유전자 투여를 위한 핵산 분자로서 사용될 수 있으며, DNA가 RNA에 비해 상대적으로 안정하고 다루기 쉬운 것으로 알려져 있다.
그러나, DNA의 경우, 환자의 유전체 내로 투여된 DNA-절편이 원하지 않은 위치에 삽입되어, 유전자가 손상되는 경우, 잠재적인 위험이 발생할 수 있다. 추가적으로, 원하지 않는 항-DNA 항체가 나타낼 수 있으며, 또다른 문제점은, DNA 투여 및 이의 이후의 전사/번역에 의해 발현되는 펩타이드 또는 단백질의 발현 수준이 한정적이라는 점이다. DNA 전사를 조절하는 특정 전사 인자의 존재 여부가 투여된 DNA의 발현 수준에 주요한 영향을 미치며, 특정 전사 인자가 없는 경우에는 DNA 전사에 의해 충분한 양의 RNA가 생성되지 않아, 결과적으로, 번역되어 생성되는 펩타이드 또는 단백질의 수준도 한정된다.
반면, RNA를 유전자 투여를 위한 도구로 사용할 경우, RNA는 전사가 필요하지 않아 DNA처럼 핵으로 들어가야 할 필요없이 세포질 내에서 바로 단백질을 합성할 수 있어, 세포 염색체 내로 끼어들어가 원치 않는 유전자 손상을 일으킬 염려가 없다. 또한, DNA에 비해 반감기가 짧아 장기 유전자 변형을 유도하지 않는다(Sayour EJ et al., J Immunother Cancer 2015;3:13, 2015). 일반적인 RNA 백신은 세포 안에 전달하게 되면 단기간만 활성화되어 타겟 단백질을 발현하게 되고, 수일 안에 효소학적 반응으로 인해 파괴되고, 발현한 타켓 항원(단백질)에 대한 특이적인 면역 반응은 남아있게 된다.
또한, 유전자 투여를 위한 도구로 RNA를 사용의 경우, 핵막을 통과할 필요가 없이 세포막만을 통과하면 작용하기 때문에, DNA보다 적은 양을 사용하여도, DNA 와 같은 양의 타겟 단백질을 발현할 수 있다. 또한, RNA는 자체가 면역 보강원성을 가지고 있어, DNA에 비해 소량만 투여하여도 동일한 면역효과를 볼 수 있다.
유전자 백신 접종을 위해 DNA 대신 RNA를 이용함으로써, 원치 않는 게놈 통합 및 항-DNA 항체의 생성 위험은 최소화되거나 방지된다. 그러나 RNA는 편재하는 RNase에 의해 용이하게 분해될 수 있는 상당히 불안정한 분자 종으로 여겨진다.
지난 수년간 많은 발전이 이루어졌음에도, 항원의 조기 분해 또는 세포에서의 mRNA의 비효율적인 방출로 인한 mRNA의 비효율적인 번역에 의해 투여가 심하게 손상되지 않는 방법을 제공할 필요성이 당해 분야에 여전히 남아 있다. 나아가, 잠재적인 안전성 우려를 감소시키기 위하여, 그리고 백신을 제3 세계에서 감당할 수 있게 하기 위하여, mRNA 백신의 용량을 감소시킬 필요가 절실하다. 백신과 같은 핵산기반의 치료제는 엄청난 가능성이 있으나, 이 가능성을 실현하기 위해서는 세포 또는 유기체 내에서 적절한 부위로 핵산을 더욱 효과적으로 전달할 필요성이 여전하다.
그러나 치료 및 예방의 목적에서의 핵산의 사용은 현재 두 가지 문제와 직면하고 있다. 첫째, 유리 RNA는 혈장에서 뉴클레아제 소화에 취약하다. 둘째, 유리 RNA는 관련된 번역 기구가 상재하는 세포 내 구획에 접근하는 능력이 제한적이다. 중성 지질, 콜레스테롤, PEG, 페길화 지질 및 핵산과 같은 다른 지질 구성요소와 양이온성 지질로부터 형성된 지질 나노입자가 혈장에서 RNA의 분해를 차단하고 올리고뉴클레오티드의 세포 흡수를 촉진하기 위해서 시도되고 있다.
리포좀(Liposome)이나 지질 나노입자(lipid nanoparticle)와 같은 지질 기반의 전달체를 이용할 경우, mRNA는 통상적으로 외부에 흡착(adsorption)되거나, 내부에 봉입(encapsulation)되는 방법을 이용하게 된다. 특히 mRNA를 외부에 흡착시킬 경우에는 일반적으로 단일의 리포좀이 아닌, 리포좀과 핵산의 응집체로 존재하는 것으로 알려져 있으며, 지질의 조합, 핵산의 상태 및 핵산과 리포좀의 비율에 따라, 흡착력에 차이가 있고, 안정성에도 영향이 있기 때문에, 이에 대한 최적화가 필요하다.
또한, mRNA의 발현능에 있어서, 일반적으로 전달체의 in vitro에서 발현이 검증되었다 하더라도 in vivo expression의 결과는 차이가 있을 수 있다는 문제가 있다. In vivo에서는 지질의 구성 및 전달체의 물리화학적 특성에 따라, plasma protein의 응집으로 half-life 및 bio-distribution 감소, 및 지질 구성에 따른 cell uptake 방식 차이, ECM(extracellular matrix)에 의한 barrier 등과 같이, 세포 내로 전달되는 효율을 감소시키는 요인이 다수 존재한다. 따라서, 체외 전달과 다르게 체내 전달에 있어 전달체 최적화가 반드시 필요하다.
국내공개특허 KR10-2021-0056953A
본 발명자들은 mRNA를 안정적으로 체내 전달하여 세포 내 발현 효율을 높임으로써 안정적인 단백질 발현을 유도할 수 있는 전달체 개량 기술을 찾고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 특정 공정을 통해 양이온성 리포좀 기반의 [리포좀 + mRNA 복합체]를 제조하고 해당 공정에 의해 제조된 [리포좀 + mRNA 복합체]가 in vivo에서 높은 세포 내 전달율과 발현율을 나타낼 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 높은 체내 전달율과 발현율을 가지는, 양이온성 지질 기반 리포좀을 포함하는 mRNA 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 함유하는 암, 종양, 자가면역질환, 유전질환, 염증성 질환, 바이러스 감염 및 박테리아 감염으로 구성된 군에서 선택되는 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 함유하는 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 mRNA 전달용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 mRNA를 안정적으로 체내 전달하여 세포 내 발현 효율을 높임으로써 안정적인 단백질 발현을 유도할 수 있는 전달체 개량 기술을 찾고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 특정 공정을 통해 양이온성 리포좀 기반의 [리포좀 + mRNA 복합체]를 제조하고 해당 공정에 의해 제조된 [리포좀 + mRNA 복합체]가 in vivo에서 높은 세포 내 전달율과 발현율을 나타낼 수 있음을 규명하였다.
본 발명은 양이온성 지질 기반 리포좀을 포함하는 mRNA 전달용 조성물, 상기 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 함유하는 암, 바이러스 감염 및 박테리아 감염으로 구성된 군에서 선택되는 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 상기 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 함유하는 백신, 상기 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물, 및 상기 mRNA 전달용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 핵산을 이용한 체내 유전자 전달에 있어서, 바이러스나 박테리아 표면의 특징적인 구성요소, 바이러스 입자 및 종양 항원 등과 같은 선택된 항원에 대해 원하는 면역반응을 유도하고 치료용 단백질 발현을 유도하여 질병을 예방 또는 치료하는 방법이 개발됨에 따라, mRNA의 세포 내 발현 효율을 높여 안정적인 효과를 나타내게 할 수 있는 방법을 찾고자 하였으며,
이에 양이온성 지질 기반 리포좀을 이용한 mRNA 전달용 조성물을 제조하고, 상기 mRNA 전달용 조성물이 in vivo에서 높은 세포 내 전달율과 발현율을 나타내는 것을 확인하였다.
본 발명의 양이온성 지질 기반 리포좀을 이용한 mRNA 전달용 조성물에서, mRNA는 양이온성 지질 기반 리포좀과 복합체를 이루는 형태로 존재할 수 있으며, 이에 따라 양이온성 지질 기반 리포좀을 이용한 mRNA 전달용 조성물과, [리포좀 + mRNA의 복합체]는 동일한 의미로 사용된다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 양이온성 지질 기반 리포좀을 포함하는 mRNA 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 '양이온성 지질'은 pH 변화의 영향 없이 지속적으로 양이온성을 가지는 지질 또는 pH 변화에 의하여 양이온성으로 전환되는 이온성 지질을 포함한다.
상기 양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄프로페인(DOTAP), 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DDA), 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에테인 카바모일 콜레스테롤(3β-[N-(N',N'-dimethylaminoethane) carbamoyl cholesterol, DC-Chol), 1,2-디올레오일옥시-3-디메틸암모늄프로페인(DODAP),1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리에틸암모늄 프로페인(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane, DOTMA), 1,2-디미리스토레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 14:1 Etyle PC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1-palmitoyl-2-oleoyl-snglycero-3-ethylphosphocholine, 16:0-18:1 Ethyl PC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 18:1 Ethyl PC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin, 18:0 Ethyl PC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 16:0 Ethyl PC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 14:0 Ethyl PC), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin, 12:0 Ethyl PC), N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3-아미노-프로필)아미노]부틸카복사미도)에틸]-3,4-디[올레일옥시]-벤자마이드(N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropyl)amino]-4-[di(3-amino-propyl)amino]butylcarboxamido)ethyl]-3,4-di[oleyloxy]-benzamide, MVL5), 1,2-디미리스토일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-dimyristoyl-3-dimethylammonium-propane,14:0 DAP), 1,2-디팔미토일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-dipalmitoyl-3-dimethylammonium-propane, 16:0DAP), 1,2-디스테아로일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-distearoyl-3-dimethylammonium-propane, 18:0 DAP), N-(4-카복시벤질)-N,N-디메틸-2,3-비스(올레오일옥시)프로판-1-아미늄(N-(4-carboxybenzyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)propan-1-aminium, DOBAQ), 1,2-스테아로일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-stearoyl-3-trimethylammoniumpropane, 18:0 TAP), 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-dipalmitoyl-3-trimethylammonium-propane, 16:0 TA), 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium-propane, 14:0 TAP) 및/또는 N4-콜레스테릴-스퍼민(N4-Cholesteryl-Spermine, GL67)일 수 있고, 바람직하게는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄프로페인(DOTAP) 또는 C12-200일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 'DOTAP(1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium propane)'는 하기 화학식 1의 구조를 가지는 양이온성 유화제로, 섬유 유연제로 사용되고 있으며, 최근에는 리포좀을 형성하는 핵산 운반체로 사용되고 있다.
Figure pat00001
본 발명의 양이온성 지질 기반 리포좀을 포함하는 mRNA 전달용 조성물은 추가적으로 중성 지질이 포함될 수 있다.
본 발명에서 '중성 지질'은 pH 변화의 영향 없이 지속적으로 중성을 가지는 지질 또는 pH 변화에 의하여 중성으로 전환되는 이온성 지질을 포함한다.
상기 중성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine, DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC), 1,2-디리노레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DLPC), 포스파티딜세린(PS), 포스포에탄올라민(PE), 포스파티딜글리세롤(PG), 포스포릭액시드(PA) 및/또는 포스파티딜콜린(PC)일 수 있고, 바람직하게는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 'DOPE(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)'는 하기 화학식 2의 구조를 가지며, 양이온성 리포좀용 보조 지질로 사용된다.
Figure pat00002
본 발명에서, 상기 양이온성 지질과 중성 지질의 중량비는 1:9 내지 9.5:0.5, 2:8 내지 9:1, 3:7 내지 8:2, 또는 4:6 내지 7:3일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 중량 비율을 벗어나는 경우, mRNA 전달 효율이 현저히 떨어질 수 있다.
또한, 본 발명의 양이온성 지질 기반 리포좀을 포함하는 mRNA 전달용 조성물은 추가적으로 콜레스테롤이 포함될 수 있다.
본 발명에서, 상기 양이온성 지질과 콜레스테롤의 중량비는 6:1 내지 1:3, 4:1 내지 1:2.5, 3:1 내지 1:2, 또는 2:1 내지 1:1.5일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 리포좀에 양이온성 지질, 중성 지질 및 콜레스테롤이 모두 포함되는 경우, 상기 양이온성 지질, 중성 지질 및 콜레스테롤의 중량비는 1 내지 9.5:9 내지 0.5:0.05 내지 3, 3 내지 8:7 내지 1:0.45 내지 7.0, 또는 1 내지 3.5:1 내지 3.5:0.5 내지 3일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 중량 비율을 벗어나는 경우, mRNA 전달 효율이 현저히 떨어질 수 있다.
예시적으로, 콜레스테롤이 추가로 포함될 경우, DOTAP:DOPE=1:1에 대해 콜레스테롤을 0.2 내지 0.85, 또는 0.5 내지 0.85의 중량비의 비율로 혼합하여 리포좀을 제조할 수 있다.
나아가, 본 발명의 양이온성 지질 기반 리포좀을 포함하는 mRNA 전달용 조성물은 추가적으로 protamine, albumin, transferrin, PTD(protein transduction domains), CPP(cell penetrating peptide) 및 Macrophage targeting moiety 등의 하나 이상의 전달용 인자가 포함될 수 있다.
더 나아가, 본 발명의 양이온성 지질 기반 리포좀을 포함하는 mRNA 전달용 조성물은 추가적으로 면역증강제가 포함될 수 있다.
상기 면역증강제는 병원체연관 분자유형(Pathogen-associated molecular pattern, PAMP)에 해당하여 패턴인식수용체(Pathogen recognition receptor, PRR)에 반응하는 물질군, 비독성 리포올리고사카라이드(detoxified lipooligosaccharide, dLOS), CpG DNA, lipoprotein, flagella, poly I:C, 사포닌, 스쿠알렌(Squalene), 트리카프린(tricaprin) 및/또는 3D-MPL일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 비독성 리포올리고사카라이드(dLOS)는 대한민국 등록특허 제1509456호 또는 대한민국 등록특허 제2042993호에 개시된 물질일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 mRNA 전달용 조성물에 있어서, 리포좀으로 대표되는 mRNA 전달체와 mRNA의 혼합비율은 N:P ratio로 표시할 수 있으며, N:P ratio에 따라 발현 및 전달체의 안정성에 영향을 미친다.
상기 리포좀과 mRNA의 N:P ratio는 0.23 내지 1.39:1, 0.3 내지 1.3:1, 0.4 내지 1.2:1, 0.5 내지 1.1:1, 0.6 내지 1.0:1, 0.6 내지 0.9:1, 0.6 내지 0.8:1, 또는 0.7:1일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 mRNA 전달용 조성물에 있어서, 상기 mRNA는 면역원으로 작용할 수 있는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 mRNA는 전형적으로 mRNA와 함께 제공되는 세포 또는 유기체에 의해 번역될 수 있는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임(Open reading frame, ORF)을 갖는 mRNA일 수 있다. 이 번역의 산물은 항원, 바람직하게 면역원으로 작용할 수 있는 펩타이드 또는 단백질이다. 이 산물은 또한, 둘 이상의 면역원으로 이루어진 융합 단백질, 예를 들어 동일하거나 상이한 바이러스 단백질로부터 유래된 둘 이상의 에피토프, 펩타이드 또는 단백질로 이루어지는 융합 단백질일 수 있고, 이때, 에피토프, 펩타이드 또는 단백질은 링커 서열에 의해 연결될 수 있다.
또한, 상기 mRNA는 인공 mRNA, 즉 자연적으로 발생하지 않는 mRNA 분자인 것으로 이해될 수 있다. 인공 mRNA 분자는 비-천연 mRNA 분자로서 이해될 수 있다. 이러한 mRNA 분자는 (자연적으로 발생하지 않는) 개별 서열 및/또는 자연적으로 발생하지 않는 다른 변경, 예컨대 뉴클레오티드의 구조적 변경으로 인해 비-천연적일 수 있다. 인공 mRNA 분자는 뉴클레오티드의 원하는 인공 서열(이종 서열)에 상응하는 유전자 조작 방법에 의해 설계 및/또는 생성될 수 있다.
나아가, 상기 mRNA는 생체 내 분해(예를 들어 엑소- 또는 엔도-뉴클레아제에 의한 분해) 및/또는 생체 외 분해(예를 들어 백신 투여 전 제조 과정에 의해, 예를 들어 투여되는 백신 용액의 제조 과정에서)에 대한 내성을 증가시키는 변형을 나타낼 수 있다. RNA의 안정화는 예를 들어 5'-CAP 구조, 폴리-A-꼬리, 또는 임의의 기타 UTR 변형의 제공에 의해 달성될 수 있다. 또한, RNA의 안정화는 화학적 변형 또는 핵산의 G/C 함량의 변형에 의해 달성될 수 있다. 다양한 다른 방법이 당해 분야에 공지되어 있으며, 본 발명의 적용이 가능하다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 함유하는 암, 종양, 자가면역질환, 유전질환, 염증성 질환, 바이러스 감염 및 박테리아 감염으로 구성된 군에서 선택되는 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 '예방'이란 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여에 의해 상술한 질환을 억제시키거나 이의 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 '치료'란 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여에 의해 상술한 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 제약상 또는 생리학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합으로 포함할 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 완충제, 예컨대 중성 완충 염수, 포스페이트 완충 염수, 시트르산 완충 용액 등; 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 어주번트(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 방부제를 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 종양 내 투여, 뇌내 투여, 두개골 내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효량은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 포함하므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 암, 종양, 자가면역질환, 염증성 질환, 바이러스 감염 및 박테리아 감염에 대한 예방 또는 치료가 필요한 환자에게, 본 발명의 mRNA 전달용 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암, 종양, 자가면역질환, 염증성 질환, 바이러스 감염 및 박테리아 감염에 대한 예방 또는 치료방법을 제공한다.
상기 mRNA의 투여량은 용량 당 1 내지 5㎍, 5 내지 10㎍, 10 내지 15㎍, 15 내지 20㎍, 10 내지 25㎍, 20 내지 25㎍, 20 내지 50㎍, 30 내지 50㎍, 40 내지 50㎍, 40 내지 60㎍, 60 내지 80㎍, 60 내지 100 ㎍, 50 내지 100㎍, 80 내지 120㎍, 40 내지 120㎍, 40 내지 150㎍, 50 내지 150㎍, 50 내지 200㎍, 80 내지 200㎍, 100 내지 200㎍, 120 내지 250㎍, 150 내지 250㎍, 180 내지 280㎍, 200-300㎍, 50 내지 300㎍, 80 내지 300㎍, 100 내지 300㎍, 40 내지 300㎍, 50 내지 350㎍, 100 내지 350㎍, 200 내지 350㎍, 300 내지 350㎍, 320 내지 400㎍, 40 내지 380㎍, 40 내지 100㎍, 100 내지 400㎍, 200 내지 400㎍, 또는 300 내지 400㎍일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 백신은 인플루엔자, 코로나 바이러스, 대상포진, 사람파필로마바이러스, 지카바이러스, 헤르페스바이러스, 에이즈바이러스, SFTS 바이러스, 홍역바이러스, 수두 바이러스, 에볼라 바이러스, 메르스 바이러스, 간염 바이러스, 조류 인플루엔자, 광견병 바이러스 및 구제역 바이러스 등 인간과 동물에 감염을 일으킬 수 있는 바이러스에 대한 백신일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 백신은 적어도 하나의 바이러스 항원의 폴리펩타이드 또는 이의 면역원성 단편을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 갖는 적어도 하나의 mRNA를 포함한다.
본 발명의 치료방법은 상술한 약제학적 조성물을 유효성분으로 포함하므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 함유하는 백신을 제공한다.
상기 백신은 상술한 mRNA가 면역원으로 작용할 수 있는 펩티드 또는 단백질에 의해 야기되는 질병의 예방 목적 범위에서 투여 대상의 체중, 연령, 식이 단계 및/또는 면역력을 고려하여 적절한 농도로 상술한 mRNA 전달용 조성물을 포함할 수 있다.
상기 백신은 담체, 희석제, 부형제, 및 어주번트(adjuvant)로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상을 더 포함할 수 있다. 담체는 그 종류를 특별히 한정하지 않으나, 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 안정제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장제, 흡수지연제 등을 포함할 수 있다.
상기 백신은 경구, 비경구, 피하, 근육내, 피내, 설하, 경피, 직장, 경점막, 흡입을 통한 표면적, 협측 투여를 통해, 또는 이의 조합으로 투여될 수 있다.
상기 백신은 백신 접종 또는 치료의 원하는 기간 및 유효성에 따라 1회 또는 여러 번, 또한 간헐적으로, 예컨대 수일, 수주 또는 수개월 동안 매일 동일한 양 또는 다른 투여량으로 투여될 수 있다. 주사는 원하는 양으로 주사하거나 피하 혹은 비강에 분무하여 주입할 수 있다, 또는 대안적으로 연속 주입할 수 있다.
본 발명의 백신은 상술한 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 포함하므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 금속이온봉쇄제, 활성성분(예를 들면, Sodium Hyaluronate 및 Tocopheryl Acetate 등), 방부제, 점증제 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 당 업계에서 일반적인 제형, 예를 들어 유화 제형이나 가용화 제형 등의 형태로 제조될 수 있다. 유화 제형으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등을 예로 들 수 있으며, 가용화 제형으로는 유연화장수를 예로 들 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 화장품 이외에도 피부 과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소 적용 또는 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.
적합한 화장품의 제형으로는 예를 들면, 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱(conceal stick)의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종 크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 패취, 분무제 등의 제형을 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 상술한 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 포함하므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 mRNA 및 리포좀을 혼합하는 단계를 포함하는, mRNA 전달용 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 mRNA 및/또는 리포좀은 동결건조된 상태의 분말 형태로 제공될 수도 있고, 적절한 용액이나 버퍼에 용해된 상태로 제공될 수 있다. mRNA 및/또는 리포좀이 동결건조된 상태로 제공될 경우, 적절한 용액이나 버퍼에 용해시켜 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 리포좀 및 mRNA의 혼합 순서를 조절하여 제조된 mRNA-리포좀 복합체의 특성을 분석하고, 리포좀 및 mRNA의 혼합 순서에 따른 in vivo mRNA 발현을 확인하였다.
본 발명에서, 상기 mRNA 및 리포좀은 mRNA → 리포좀의 순서로 투입하여 혼합하는 것일 수 있다.
상기 순서로 mRNA 및 리포좀을 혼합함으로써, 제조된 mRNA-리포좀 복합체의 생체 내 mRNA 전달 및 발현율이 증가될 수 있다.
본 발명의 mRNA 전달용 조성물의 제조방법은 면역증강제를 혼합하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 면역증강제는 동결건조된 상태의 분말 형태로 제공될 수도 있고, 적절한 용액이나 버퍼에 용해된 상태로 제공될 수 있다. 면역증강제가 동결건조된 상태로 제공될 경우, 적절한 용액이나 버퍼에 용해시켜 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 리포좀, mRNA 및 면역증강제의 혼합 순서를 조절하여 제조된 mRNA-리포좀 복합체에 대하여, 리포좀, mRNA 및 면역증강제의 혼합 순서에 따른 in vivo mRNA 발현을 확인하였다.
본 발명에서, 상기 mRNA, 리포좀 및 면역증강제는 면역증강제 → mRNA → 리포좀의 순서로 투입하여 혼합하는 것일 수 있다.
상기 순서로 mRNA, 리포좀 및 면역증강제를 혼합함으로써, 제조된 mRNA-리포좀 복합체의 생체 내 mRNA 전달 및 발현율이 증가될 수 있다.
본 발명의 mRNA 및 리포좀은 상술한 mRNA 전달용 조성물의 유효성분이므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명에 따른 양이온성 리포좀을 포함하는 mRNA 전달용 조성물은 보관 안정성이 우수하고, in vivo에서 높은 세포내 전달율과 발현율을 나타내어, 암 치료/예방용용 mRNA 백신 또는 바이러스나 박테리아 감염 예방용 mRNA 백신 등의 안정성 및 효율을 향상시킬 수 있다.
도 1은 mRNA의 사용량을 달리하여 제조한 리포좀-mRNA 복합체의 마우스 내에서 mRNA의 발현을 확인한 결과이다.
도 2는 DOTAP:DOPE의 비율을 달리하여 제조한 리포좀을 사용한 리포좀-mRNA 복합체의 마우스 내에서 mRNA의 발현을 확인한 결과이다.
도 3은 DOTAP:DOPE:콜레스테롤의 비율을 달리하여 제조한 리포좀을 사용한 리포좀-mRNA 복합체의 마우스 내에서 mRNA의 발현을 확인한 결과이다.
도 4는 mRNA 및 리포좀의 혼합 순서를 달리하여 제조한 mRNA-리포좀 복합체의 시료의 크기, 분산도, 제타전위를 분석한 결과이다.
도 5는 mRNA 및 리포좀의 혼합 순서에 따른 mRNA의 발현 차이를 in vivo에서 확인한 결과이다.
도 6은 mRNA 및 리포좀의 혼합 순서를 달리하여 제조한 mRNA-리포좀 복합체로 마우스를 면역화한 후, 세포성 면역반응(도 6a), 항체성 면역반응(도 6b) 및 중화항체역가(도 6c)를 확인한 결과이다.
도 7은 dLOS 사용량을 달리하여 제조한 리포좀-mRNA 복합체의 마우스 내에서 mRNA의 발현을 확인한 결과이다.
도 8 은 mRNA, 리포좀, 및 dLOS의 혼합 순서를 달리하여 제조한 mRNA-리포좀-dLOS 복합체를 마우스에 주사하였을 때, mRNA의 발현을 확인한 결과이다(LP: 리포좀; R: mRNA; dL: dLOS)
도 9는 N/P ratio를 달리하여 제조한 mRNA-리포좀 복합체의 안정성을 측정하기 위해 보관 기간 별로 사이즈, 분산도, 제타전위를 측정한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
제조예 1. mRNA-리포좀 복합체(mRNA-liposome) 제조
리포좀 제조(Film method)
DOTAP(Merck & Cie/CH2900014), DOPE(Avanti Polar Lipid) 및/또는 콜레스테롤(Avanti Polar Lipid)에 클로로포름을 각각 혼합한 다음, 37 ℃에서 10분간 완전히 용해시켜 액상 용액으로 제조하였다.
둥근바닥 플라스크에 상기 액상 용액을 일정 중량비로 혼합하여 지질 혼합물(lipid mixture)을 만들고, Rotary evaporator(Buchi/B491_R200)에서 60 ℃, 30분간 휘발시켜 클로로포름을 날려 플라스크 벽면에 지질막 필름을 제작하였다.
상기 지질막 필름이 제작된 플라스크에 4%(w/v) 수크로오즈를 함유하는 20 mM HEPES 버퍼(pH 7.4)를 넣고 60 ℃에서 지질막을 녹여, 리포좀의 농도가 7.5 mg/mL이 되도록 리포좀을 형성하였다. 형성된 리포좀은 동적광산란 분석장비로 입자의 사이즈, 제타포텐셜, 분산도를 측정하였다. 제조된 나머지 리포좀은 시험 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
mRNA-리포좀 복합체 제조
4% 슈크로오스를 함유한 20 mM HEPES 버퍼(pH 7.4)에 상기에서 제조한 리포좀(LP-DOTAP/DOPE/Chol(40:40:20, w/w/w) 또는 LP-DOTAP/DOPE(50:50, w/w)) 및 Renilla Luciferase에 대한 mRNA(서열번호 1)를 혼합하여 mRNA-리포좀 복합체를 제조하였다.
이때, 7.5 mg/mL의 리포좀 용액(LP-DOTAP/DOPE/Chol(40:40:20, w/w/w)은 제조 직후 또는 최대 제조 후 2주 이내 기간동안 냉장 보관된 시료를 사용하였다. 1 mg/mL의 Renilla luciferase mRNA(서열번호 1) 용액은 -70 ℃에 보관하였고, 사용 직전 아이스 위에서 녹여 사용하였다. 4% 슈크로오스를 함유한 20 mM HEPES 버퍼(pH 7.4)는 실험 직전 만들어 사용하거나 실험 전일 제조한 후 냉장 보관하였다.
리포좀과 mRNA의 혼합비율인 N/P 비율(N/P ratio)은 다음의 계산식으로 계산하였다.
Figure pat00003
실시예 1. mRNA-리포좀 복합체의 mRNA 함량에 따른 mRNA 발현 확인
상기 제조예 1에서 리포좀-mRNA 복합체를 제조하는데 있어서, mRNA의 양을 5 ㎍, 10 ㎍ 및 20 ㎍으로 달리하고 각각의 경우에 대해 DOTAP:DOPE:Chol(40:40:20, w/w/w)의 리포좀의 양을 18.75 ㎍, 37.5 ㎍, 75 ㎍으로 혼합한 복합체(N/P ratio = 0.7)를 제조한 후, in vivo에서 발현율을 확인하였다.
구체적으로, 제모한 마우스(7주령 C57BL/6N 암컷, 오리엔트바이오, 중앙실험동물)에 각 리포좀-mRNA 복합체를 100 ㎕의 용량으로 대퇴부 삼각근에 근육내 주사(intramuscular injection; I.M. injection)하였다.
투여 6시간 후, 마우스를 avertin(250 mg/kg)으로 마취한 뒤, 루시퍼레이즈 기질 스톡 용액(ViviRenTM in vivo renilla luciferase substrate stock solution)에 1X PBS 2.4 mL를 넣어 0.15 ㎍/㎕로 만든 기질(substrate)을 200 ㎕씩 정맥주사(intravenous injection; I.V. injection)하였다.
투여 직후, IVIS 장비(Ami-HTX, USA) 내에 마우스를 포지션시키고 촬영 노출시간을 60 초로 설정하여 마우스를 촬영하였으며(xenogen IVIS-200), Aura Imaging Software(Spectral Instruments Imaging, USA)를 이용하여 투여 부위의 루시퍼레이즈의 발현 정도(Region of interest, ROI)를 수치화하였다.
그 결과, 도 1에서 확인할 수 있듯이, 5 ㎍, 10 ㎍ mRNA에서는 발현율의 차이가 없었으나 20 ㎍의 mRNA를 포함한 경우는 5 ㎍, 10 ㎍ mRNA를 포함한 경우에 비해 각각 발현율이 135 %, 170 % 증가하였다. mRNA가 일정 수준 이상 증가되면 in vivo 발현율이 증가하였다.
제조예 2. 리포좀의 양이온성 지질:중성 지질:콜레스테롤(DOTAP:DOPE:cholesterol) 혼합 비율이 조절된 mRNA-리포좀 복합체 제조
2-1. DOTAP:DOPE의 혼합 비율 조절
하기 표 1에 나타낸 DOTAP:DOPE의 비율(w/w)로 리포좀을 제조한 다음, mRNA와 혼합하여 리포좀-mRNA 복합체를 제조하였다. 리포좀-mRNA 복합체의 NP ratio(molar ratio)는 0.7:1이 되도록, 20 ㎍ mRNA(Renilla luciferase mRNA, 서열번호 1)에 대하여 30 ㎍ DOTAP이 포함된 리포좀을 사용하였다. 이때, 리포좀 대조군으로, 제조사가 권장하는 프로토콜을 이용하여 NanoAssemblr　Ignite(Precision NanoSystems)로 C12-200, DSPC, Cholesterol 및 DMG-PEG2000을 50:10:38.5:1.5로 혼합한 LNP(C12-200:DSPC:Chol:DMG-PEG2000 = 50:10:38.5:1.5)를 사용하였다.
실험군 1 2 3 4 5 6 7
DOTAP 20 30 40 50 70 90 100
DOPE 80 70 60 50 30 10 0
2-2. DOTAP:DOPE:cholesterol의 혼합 비율 조절
하기 표 2에 나타낸 DOTAP:DOPE:콜레스테롤의 비율(w/w)로 리포좀을 제조한 다음, mRNA와 혼합하여 리포좀-mRNA 복합체를 제조하였다. 리포좀-mRNA 복합체의 NP ratio는 0.7:1이 되도록 20 ㎍ mRNA(Renilla luciferase mRNA, 서열번호 1)에 대하여 30 ㎍ DOTAP이 포함된 리포좀을 사용하였다. 이때, 리포좀 대조군으로 invivofectamine(Thermo Fisher Scientific)을 사용하였다.
실험군 1 2 3 4 5 6 7 8 9
DOTAP 50 45 40 35 30 20 40 60 80
DOPE 50 45 40 35 30 60 40 20 0
Chol 0 10 20 30 40 20 20 20 20
실시예 2. 리포좀의 양이온성 지질:중성 지질:콜레스테롤(DOTAP:DOPE:cholesterol) 혼합 비율에 따른 mRNA 발현 확인
2-1. DOTAP:DOPE의 혼합 비율에 따른 in vivo 발현율
상기 제조예 2-1에서 제조된 각 리포좀-mRNA 복합체에 대하여, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 in vivo 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 2에서 확인할 수 있듯이, 40:60, 50:50 및 70:30의 DOTAP:DOPE 비율로 제조된 리포좀을 사용한 리포좀-mRNA 복합체에서 마우스 내 높은 mRNA 발현율을 나타내었다.
2-2. DOTAP:DOPE:cholesterol의 혼합 비율에 따른 in vivo 발현율
상기 제조예 2-2에서 제조된 각 리포좀-mRNA 복합체에 대하여, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 in vivo 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 3에서 확인할 수 있듯이, DOTAP:DOPE의 비율을 1:1로 고정하고 콜레스테롤의 비율을 조정하였을 때 40:40:20 내지 35:35:30의 DOTAP:DOPE:콜레스테롤 비율로 제조된 리포좀을 사용한 리포좀-mRNA 복합체에서 마우스 내 높은 mRNA 발현율을 나타내었으며, 콜레스테롤 비율을 고정하였을 때, 20:60:20 내지 40:40:20의 DOTAP:DOPE:콜레스테롤 비율로 제조된 리포좀을 사용한 리포좀-mRNA 복합체에서 마우스 내 높은 mRNA 발현율을 나타내었다.
실시예 3. 리포좀의 양이온성 지질:중성 지질:콜레스테롤(DOTAP:DOPE:cholesterol) 혼합 비율에 따른 특성 분석
상기 제조예 2-2에서 제조한 리포좀 및 mRNA-리포좀 복합체를 4% 슈크로오스를 함유하는 20 mM HEPES 버퍼(pH 7.4)로 1/10 희석하였다. Zetasizer Nano ZSP(Malvern Pnanlytical)로 DLS(Dynamic Light Scattering) 분석을 진행하여, 복합체의 크기(size), 분산도(PDI), 제타전위(Zeta potential)를 측정하였다.
그 결과, 하기 표 3(리포좀) 및 표 4(리포좀-mRNA 복합체)에서 확인할 수 있듯이, 리포좀의 크기는 100-200 nm, 분산도는 0.4 미만으로 나타났다. DOTAP과 DOPE가 동비일 때 콜레스테롤 함유비가 커질수록 입자 사이즈와 분산도가 커졌고, 콜레스테롤 함유비가 20으로 동일 할 때 DOATP에 비해 DOPE 함유량이 많으면 입자 크기와 분산도가 커지는 경향이 관찰되었다(표 3). 리포좀-mRNA 복합체는 대체로 180-240 nm, 분산도는 0.3 미만이었으며 이들 수치는 mRNA가 혼합되지 않은 리포좀보다 증가하였다. mRNA가 혼합된 경우에는 콜레스테롤의 함유 비율에 따른 입자 크기 변화 양상이 관찰되지 않았다.
LP-DOTAP/DOPE/Chol
(Weight ratio, 2 mg/mL)		 분석 항목
DOTAP DOPE Chol 입자 사이즈(d, nm) 분산도
50 50 0 116.9 0.161
45 45 10 124.0 0.161
40 40 20 128.3 0.162
35 35 30 130.8 0.160
30 30 40 172.3 0.346
20 60 20 192.3 0.225
60 20 20 131.8 0.163
80 0 20 111.5 0.156
LP-DOTAP/DOPE/Chol + mRNA 분석 항목
DOTAP DOPE Chol 입자 사이즈
(d, nm)		 분산도 제타전위
(mV)
50 50 0 197.8 0.208 -63.5
45 45 10 195.8 0.188 -63.9
40 40 20 222.2 0.244 -61.2
35 35 30 184.0 0.176 -60.0
30 30 40 223.0 0.258 -56.0
20 60 20 236.7 0.210 -48.3
60 20 20 190.3 0.179 -66.2
80 0 20 187.6 0.207 -68.0
제조예 3. 리포좀 및 mRNA의 혼합 순서가 조절된 mRNA-리포좀 복합체 제조
상기 제조예 1의 -70 ℃에 보관되어 있던 1 mg/mL의 Renilla luciferase mRNA 용액, 및 냉장 보관된 리포좀 용액(LP-DOTAP/DOPE/Chol(40:40:20, w/w/w)) 및 4% 슈크로오스를 함유한 20 mM HEPES 버퍼(pH 7.4)를 사용하였다.
하기 제조 방법은 리포좀-mRNA 복합체 400 μL 제조 예시이며, 필요에 따라 일정 비율로 증량하여 제조하였으며, 용액의 혼합은 파이펫팅을 비롯하여 교반 등의 알려진 방법을 사용하였다.
3-1. mRNA → Liposome의 순서
RNA 전용 200P 팁(tip)을 이용하여 4% 슈크로오스를 함유한 20 mM HEPES 버퍼(pH 7.4) 340 μL를 취하여 마이크로튜브에 분주하였다. 200P 팁을 이용하여 완전 해동된 1 mg/mL의 Renilla luciferase mRNA 용액 40 μL(40 μg mRNA)를 취하여 버퍼가 분주된 마이크로튜브에 넣은 후 약 10회 파이펫팅하였다. 200P 팁을 이용하여 7.5 mg/mL의 리포좀 용액(LP-DOTAP/DOPE/Chol(40:40:20, w/w/w) 20 μL(150 μg 리포좀)를 취하여 상기 버퍼 및 mRNA 용액이 분주된 마이크로튜브에 넣은 후 약 30회 파이펫팅하였다. 끝으로, 상기 버퍼, mRNA 용액 및 리포좀 용액이 혼합된 시료를 1000P 팁으로 약 10회 파이펫팅하여 추가 혼합하였다.
3-2. Liposome → mRNA의 순서
RNA 전용 200P 팁(tip)을 이용하여 4% 슈크로오스를 함유한 20 mM HEPES 버퍼(pH 7.4) 340 μL를 취하여 마이크로튜브에 분주하였다. 200P 팁을 이용하여 7.5 mg/mL의 리포좀 용액(LP-DOTAP/DOPE/Chol(40:40:20, w/w/w)) 20 μL(150 μg 리포좀)를 취하여 버퍼가 분주된 마이크로튜브에 넣은 후 약 10회 파이펫팅하였다. 200P 팁을 이용하여 완전 해동된 1 mg/mL의 Renilla luciferase mRNA 용액 40 μL(40 μg mRNA)를 취하여 상기 버퍼 및 리포좀 용액이 분주된 마이크로튜브에 넣은 후 약 30회 파이펫팅하였다. 끝으로, 상기 버퍼, mRNA 용액 및 리포좀 용액이 혼합된 시료를 1000P 팁으로 약 10회 파이펫팅하여 추가 혼합하였다.
실시예 4. 리포좀 및 mRNA의 혼합 순서에 따른 특성 분석
상기 제조예 3에서 제조된 리포좀-mRNA 복합체에 대한 DLS 분석을 수행하여 복합체의 크기(size), 분산도(PDI), 제타전위(Zeta potential)의 평균과 표준편차를 도출하였다.
그 결과, 도 4에서 확인할 수 있듯이, 각 리포좀-mRNA 복합체의 물리적 특성에는 큰 차이가 없는 것으로 나타났다.
실시예 5. 리포좀 및 mRNA의 혼합 순서에 따른 mRNA 발현 확인
상기 제조예 3에서 혼합 순서에 따라 달리 제조된 리포좀-mRNA 복합체에 대하여, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 in vivo 발현을 분석하였다.
그 결과, 도 5에서 확인할 수 있듯이, mRNA → Liposome 순서로 혼합하여 제조한 복합체에서 mRNA 발현이 우월하게 높게 나타났다.
실시예 6. 리포좀 및 mRNA의 혼합 순서에 따른 면역원성 확인
Renilla Luciferase에 대한 mRNA 대신 SARS-CoV-2 S mRNA(서열번호 3)를 사용한 것을 제외하고, 상기 제조예 3과 동일한 방법으로 혼합 순서에 따라 달리 제조된 리포좀-mRNA 복합체에 대하여, 다음의 실험을 진행하였다.
먼저, 6주령 암컷 마우스(B6C3F1/slc, 중앙실험동물)에 혼합 순서를 달리하여 제조된 리포좀-mRNA 복합체를 마우스 왼쪽 뒷다리 대퇴부에 근육 투여 경로로 0.1 HD(human dose)씩 3주 간격 2회 투여하였다.
6-1. 사이토카인
비장세포 재자극(Splenocyte restimulation)
마지막 투여 2주 후에 경추 탈골로 마우스를 희생시켜 비장을 적출한 후 비장을 풀링(pooling)하여 1% 페니실린 스트렙토마이신 용액이 첨가된 PBS(이하, PBS w/antibiotics)가 분주된 24 웰 플레이트로 옮겼다. 사용한 배지는 하기 표 5 및 표 6에 나타내었다.
Complete media 첨가량 최종 농도
RPMI 1640 medium 439.9 ml -
FBS(non-heat inactivated) 50 ml 10 %(v/v)
Penicillin streptomycin solution(100X)(antibiotics) 5 ml Penicillin(100 U/㎕)Streptomycin(100 ㎍/㎕)
HEPES buffer solution(1 M) 5 ml 10 mM
0.5 M β-mercaptoethanol 50 ㎕ 50 uM
Recombinant mouse IL-2 12.5 ㎕ 0.5 ng/㎕)
Basal media 첨가량 최종 농도
RPMI 1640 medium 439.9 ml -
FBS(non-heat inactivated) 50 ml 10 %(v/v)
Penicillin streptomycin solution(100X)(antibiotics) 5 ml Penicillin(100 U/㎕)Streptomycin(100 ㎍/㎕)
HEPES buffer solution(1 M) 5 ml 10 mM
클린벤치 내에서 비장 조직을 포셉으로 집어 PBS w/antibiotics에 세척한 후 3 mL의 기본배지(basal media)가 들어있는 60 mm 디쉬로 옮기고, 40 ㎛ 셀 스트레이너(cell strainer)를 사용하여, 조직을 으깨어 비장세포(splenocyte)를 분리하였다. 분리된 비장세포를 15 mL 튜브로 옮긴 후 4 ℃, 3,000 rpm 조건으로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, 세포를 3 mL의 RBC 용해 버퍼로 현탁하여 상온에 3분 정치한 후, 4 ℃, 3,000 rpm 조건으로 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 세포를 3 mL의 PBS w/antibiotics로 현탁하여 4 ℃, 3,000 rpm 조건으로 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거한 다음 세포를 10 mL의 완전배지(complete media)로 현탁하였다. 상기 세포 현탁액을 완전배지를 이용하여 2 X 107 cells/mL이 되도록 희석한 후, 96-웰 세포 배양 플레이트에 100 ㎕/웰로 분주하였다.
별도로, PepMix SARS-CoV-2-S1 펩타이드 풀(pool, JPT) 및 SARS-CoV-2-S2 펩타이드 풀(JPT)을 각 1 바이알에 50 ㎕의 DMSO를 넣고 용해시킨 후, 최종농도 2.5 ㎍/mL가 되도록 완전배지와 혼합하여 SARS CoV-2 스파이크 펩타이드 자극제(stimulant)를 제조하였다.
상기 세포 현탁액이 담긴 96-웰에 상기 자극제 40 ㎍/웰 및 완전배지 60㎕/웰씩 첨가하여 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 72시간 동안 반응시켰다.
IFN-γ 농도 확인
자극된 비장세포의 배양액을 시약 희석제(reagent diluent, 1% BSA)로 1/5 희석하여 항마우스 IFN-γ 캡쳐 항체(Jackson)가 코팅된 마이크로플레이트에 100 ㎕/웰로 분주하고 실링 필름을 덮어 상온에서 2시간 동안 정치한 후, ELISA washer(Tecan/Hydroflexelisa)로 각 웰의 용액을 제거하고 세척 버퍼를 사용하여 3회 세척하였다.
시약 희석제를 사용하여 IFN-γ ELISA kit(Mouse IFN-γ Duoset ELISA, R&D systems) 내의 Streptavidin-HRP를 1/40로 희석한 후 이뮤노플레이트에 100 ㎕/웰씩 분주하고 실링 필름으로 덮어 상온에서 20분 동안 정치한후, ELISA washer로 각 웰의 용액을 제거하고 세척 버퍼를 사용하여 3회 세척하였다.
키트 내의 anti-mouse IFN-γ 검출 항체를 시약 희석제를 사용하여 200 ng/mL로 희석한 다음 이뮤노플레이트에 100 μL/웰씩 분주하고 실링 필름을 덮어 상온에서 1시간 동안 정치한 후, ELISA washer(Tecan/Hydroflexelisa)로 각 웰의 용액을 제거하고 세척 버퍼를 사용하여 3회 세척하였다.
TMB 기질(KPL sureblue TMB microwell peroxidase substrate, Seracare) 용액을 이뮤노플레이트에 100 ㎕씩 분주하고 상온의 암소에서 15분 동안 반응시킨 다음, 1N H2SO4 용액을 이뮤노플레이트에 100 ㎕씩 분주하여 반응을 정지하고 ELISA reader를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 6a에서 확인할 수 있듯이, mRNA → Liposome 순서로 순서로 혼합하여 제조한 복합체에서 IFN-γ 농도가 가장 높았다.
6-2. 항체 역가(IgG titers)
마지막 투여 2주 후에 Avertin working solution을 250 mg/kg으로 복강 투여하여 마취시키고, 심장 채혈을 통해 전혈을 채취하였다. 채취된 전혈을 마이크로튜브로 옮겨 상온에 3시간 동안 정치한 후, 4 ℃, 15,000 rpm 조건으로 10 분 동안 원심분리하고, 상층액을 새로운 마이크로튜브로 옮겨 혈청을 확보해 분석 전까지 -20 ℃에 보관하였다.
다음으로, 1X PBS를 이용하여 RBD(SARS-CoV-2 receptor binding domain) 항원(Mybiosource, USA)을 1 ㎍/mL로 희석한 후 이뮤노플레이트(immunoplate)에 100 ㎕/웰씩 분주하고 실링 필름을 덮어 4 ℃에 하룻밤 정치하였다. ELISA washer(Tecan/Hydroflexelisa)로 각 웰의 용액을 제거하고 세척 버퍼(20X PBS를 정제수로 희석한 1 L의 1X PBS에 500 ㎕의 tween20을 투입)를 사용하여 5회 세척하였다. 이뮤노플레이트에 시약 희석제(reagent diluent, 1% BSA, 1 g의 BSA를 100 mL의 PBS에 녹여 제조)를 200 ㎕/웰씩 분주하고 실링 필름을 덮어 37 ℃ 반응기에서 1시간 동안 정치하였다. ELISA washer로 각 웰의 용액을 제거하고 세척 버퍼를 사용하여 5회 세척하였다. 시약 희석제를 이뮤노플레이트에 100 ㎕/웰씩 분주하였다.
시약 희석제(1% BSA)를 이용하여 상기에서 확보한 혈청을 1:50으로 희석한 후, 이뮤노플레이트의 B ~ G의 1열에 100 ㎕로 분주하고, 웰 내에서 수회 파이펫팅하여 시료를 혼합한 후, 1열에서 100 ㎕를 취해 2번 열에 넣는 방법으로 ELISA 플레이트 상에서 시료를 12열까지 1/2 순차 희석(serial dilution)하였다. 이때, 시험의 적합성 평가를 위해, 시약 희석제를 이용하여 과혈청(hyper serum)을 1:200으로 희석한 뒤 각 이뮤노플레이트 H의 1열에 100 ㎕로 분주하고 상기와 같은 방법으로 1/2 순차 희석하였다.
이뮤노플레이트를 실링 필름으로 덮어 37 ℃ 반응기에서 2시간 동안 반응시켰다. ELISA washer로 각 웰의 용액을 제거하고 세척 버퍼를 사용하여 5회 세척하였다. 시약 희석제를 이용하여 goat anti-mouse IgG 항체(Jackson Laboratory)를 1:5,000으로 희석한 후, 이뮤노플레이트에 100 ㎕씩 분주하고 실링 필름을 덮어 37 ℃ 반응기에서 1시간 동안 반응시켰다. ELISA washer로 각 웰의 용액을 제거하고 세척 버퍼를 사용하여 5회 세척하였다.
상온과 평형화시킨 TMB 기질용액을 이뮤노플레이트에 100 ㎕씩 분주하고 상온의 암소에서 5분 동안 반응시켰다. 1N H2SO4 용액을 이뮤노플레이트에 100 ㎕씩 분주하여 반응을 정지하고 ELISA reader(Biotek/Epoch)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 6b에서 확인할 수 있듯이, mRNA → Liposome 순서로 혼합하여 제조한 복합체에서 항체성 면역반응이 가장 우수하였다.
6-3. 중화항체형성능(surrogate Neutalization)(%) 분석
1.5 mL 마이크로튜브에 negative control(DMEM 배지) 또는 상기 실시예 6-2에서 확보하여 -20 ℃에 보관 중인 면역화한 마우스 혈청 샘플 60 μL 각각을 1:1000 diluted-HRP conjugated RBD 60 ㎕와 혼합한 후 37 ℃에서 30분 동안 반응시키고, Microtiter test strip plate에 100 ㎕를 분주한 다음 실링 필름을 덮어 37 ℃에서 15분 동안 반응시켰다. ELISA washer로 각 웰의 용액을 제거하고 1X 세척 용액으로 4회 세척하였다. TMB solution를 100 ㎕/웰씩 분주하고 실링 필름을 덮어 상온의 암소에서 15분 동안 반응시킨 후, 정지 용액을 50 ㎕/웰씩 분주하여 반응을 정지시킨 다음, ELISA reader를 사용하여 405 nm에서 광학 밀도(optical density)를 측정하였다.
그 결과, 도 6c에서 확인할 수 있듯이, mRNA → Liposome 순서로 혼합하여 제조한 복합체에서 가장 높은 수준의 중화항체역가 유도능을 나타내었다.
소결
mRNA와 리포좀 복합체 제조 시 혼합 방법에 따라 in vivo 발현 및 면역원성 유도능에 차이가 있으며, mRNA → Liposome 순으로 혼합할 때 가장 효과가 우수한 것으로 나타났다.
제조예 4. 리포좀, mRNA 및 면역증강제의 혼합 순서가 조절된 mRNA-리포좀 복합체 제조
4-1. 리포좀, mRNA 및 면역증강제가 포함된 mRNA-리포좀 복합체
상기 제조예 1에서 면역증강제 dLOS(detoxified Lipooligosaccharide)(TLR4 agonist; 아이진(주), 한국)를 추가로 혼합하여 mRNA-리포좀 복합체를 제조하였다.
4-2. 리포좀, mRNA 및 면역증강제의 혼합 순서 조절
상기 제조예 1의 -70 ℃에 보관되어 있던 1 mg/mL의 Renilla luciferase mRNA 용액, 및 냉장 보관된 리포좀 용액(LP-DOTAP/DOPE/Chol(40:40:20, w/w/w)) 및 4% 슈크로오스를 함유한 20 mM HEPES 버퍼(pH 7.4)를 사용하였다. 추가적으로, 면역증강제 dLOS를 사용하였다. 상기 3가지 용액(mRNA, 리포좀 및 dLOS)의 혼합 순서를 조합할 수 있는 경우의 수인, 하기의 6가지 방법으로 시료를 혼합하였다:
a: Liposome → mRNA → dLOS
b: Liposome → dLOS → mRNA
c: mRNA → Liposome → dLOS
d: mRNA → dLOS → Liposome
e: dLOS → Liposome → mRNA
f: dLOS → mRNA → Liposome
구체적으로, RNA 전용 200P 팁(tip)을 이용하여 4% 슈크로오스를 함유한 20 mM HEPES 버퍼(pH 7.4) 정량을 취하여 마이크로튜브에 분주하였다. 200P 팁을 이용하여 첫 번째 용액 정량을 취하여 버퍼가 분주된 마이크로튜브에 넣은 후 약 10회 파이펫팅하였다. 200P 팁을 이용하여 두 번째 용액 정량을 취하여 버퍼가 분주된 마이크로튜브에 넣은 후 약 10회 파이펫팅하였다. 200P 팁을 이용하여 세 번째 용액 정량을 취하여 버퍼가 분주된 마이크로튜브에 넣은 후 약 10회 파이펫팅하였다. 끝으로, 1000P 팁를 이용하여 30회 파이펫팅하여 혼합하였다.
실시예 7: 면역증강제 함량별 mRNA 발현 확인
상기 제조예 4-1에서 면역증강제 dLOS를 함량별로 달리 첨가하여 리포좀-mRNA 복합체의 in vivo에서 발현율을 확인하였다. 이때, dLOS는 0.25 ㎍, 0.5 ㎍, 0.75 ㎍ 및 1 ㎍을 첨가하였으며, in vivo 발현 확인은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, dLOS 첨가량은 0.25 ㎍ 이상, 1 ㎍ 이하일 경우 발현량이 증가하는 것으로 나타났다.
실시예 8: 리포좀, mRNA 및 면역증강제의 혼합 순서에 따른 mRNA 발현 확인
상기 제조예 4-2에서 제조된 각 리포좀-mRNA 복합체에 대하여, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 in vivo 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, dLOS → mRNA → Liposome의 순서로 혼합한 조성물을 투여한 마우스에서 더 높은 발현량을 확인하였다.
실시예 9: mRNA-리포좀 복합체의 시간에 따른 안정성(물리화학적 성질) 변화 확인
[EGFP]
EGFP mRNA(서열번호 2)와 리포좀(DOTAP:DOPE:Chol 40:40:20, w/w/w)의 복합체를 대상으로, 제조 후 시간의 경과에 따른 물리화학적 성질 변화를 DLS 측정을 통해 확인하였다.
구체적으로, 상기 제조된 EGFP mRNA-리포좀 복합체를 동결건조 제형 상태로 9 주동안 냉장보관하면서 매주 크기, 제타전위 및 PDI를 측정하였다.
그 결과, 도 9에서 확인할 수 있듯이, NP 비율이 1.39:1 이하에서, 9 주동안 안정적인 것을 알 수 있었다.
[SARS-CoV-2 S]
액상 제형과 동결건조 제형의 SARS-CoV-2 S mRNA(서열번호 3)와 리포좀(DOTAP:DOPE:Chol 40:40:20, w/w/w)의 복합체를 대상으로, 제조 후 시간의 경과에 따른 물리화학적 성질 변화를 DLS 측정을 통해 확인하였다.
구체적으로, 상기 제조된 SARS-CoV-2 S mRNA-리포좀 복합체를 16 주동안 냉장보관하면서 일정 기간 별(0, 2, 4, 8, 12, 16주)로 크기, 제타전위, PDI를 측정하였다.
그 결과, 표 7(액상 제형) 및 표 8(동결건조 제형)에서 확인할 수 있듯이, 액상 제형과 동결건조 제형 모두 16 주동안 안정적인 것을 알 수 있었다.
구분 0주 2주 4주 8주 12주 16주
입자크기(nm) 216.0 225.8 227.1 222.9 199.9 196.5
분산도 0.187 0.194 0.175 0.219 0.187 0.159
제타전위(mV) -62.7 -56.4 -52.3 -55.0 -72.3 -68.7
구분 0주 2주 4주 8주 12주 16주
입자크기(nm) 339.1 316.1 322.4 329.2 280.5 272.0
분산도 0.284 0.215 0.245 0.264 0.243 0.228
제타전위(mV) -45.4 -43.7 -42.8 -43.8 -60.7 -60.2
<110> EYEGENE INC. <120> Composition for delivering RNA and Preparing method for the same <130> PN210484 <150> KR 10-2021-0029929 <151> 2021-03-08 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 936 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Renilla mRNA <400> 1 augaccagca agguguacga ccccgagcag cggaagcgga ugaucaccgg cccccagugg 60 ugggcccggu gcaagcagau gaacgugcug gacagcuuca ucaacuacua cgacagcgag 120 aagcacgccg agaacgccgu gaucuuccug cacggcaacg ccgccagcag cuaccugugg 180 cggcacgugg ugccccacau cgagcccgug gcccggugca ucauccccga ccugaucggc 240 augggcaaga gcggcaagag cggcaacggc agcuaccggc ugcuggacca cuacaaguac 300 cugaccgccu gguucgagcu gcugaaccug cccaagaaga ucaucuucgu gggccacgac 360 uggggcgccu gccuggccuu ccacuacagc uacgagcacc aggacaagau caaggccauc 420 gugcacgccg agagcguggu ggacgugauc gagagcuggg acgaguggcc cgacaucgag 480 gaggacaucg cccugaucaa gagcgaggag ggcgagaaga uggugcugga gaacaacuuc 540 uucguggaga ccaugcugcc cagcaagauc augcggaagc uggagcccga ggaguucgcc 600 gccuaccugg agcccuucaa ggagaagggc 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1380 cugaagcccu ucgagcggga caucuccacc gagaucuauc aggccggcag caccccuugu 1440 aacggcgugg aaggcuucaa cugcuacuuc ccacugcagu ccuacggcuu ucagcccaca 1500 aauggcgugg gcuaucagcc cuacagagug guggugcuga gcuucgaacu gcugcaugcc 1560 ccugccacag ugugcggccc uaagaaaagc accaaucucg ugaagaacaa augcgugaac 1620 uucaacuuca acggccugac cggcaccggc gugcugacag agagcaacaa gaaguuccug 1680 ccauuccagc aguuuggccg ggauaucgcc gauaccacag acgccguuag agauccccag 1740 acacuggaaa uccuggacau caccccuugc agcuucggcg gagugucugu gaucaccccu 1800 ggcaccaaca ccagcaauca gguggcagug cuguaccagg gcgugaacug uacagaggug 1860 ccaguggcca uucacgccga ucagcugacc ccuacuuggc ggguguacuc cacaggcagc 1920 aauguguuuc agaccagagc cggcugucug aucggagccg agcacgugaa caauagcuac 1980 gagugcgaca uccccaucgg cgcuggcauc ugugccagcu accagacaca gacaaacagc 2040 ccucagcagg cccagucugu ggccagccag agcaucauug ccuacacaau gucucugggc 2100 gccgagaaca gcguggccua cuccaacaac ucuaucgcua uccccaccaa cuucaccauc 2160 agcgugacca cagagauccu gccugugucc augaccaaga ccagcgugga cugcaccaug 2220 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Claims (19)

  1. 양이온성 지질 기반 리포좀을 포함하는 mRNA 전달용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 리포좀은 중성 지질을 추가로 포함하는 것인, mRNA 전달용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 리포좀은 콜레스테롤을 추가로 포함하는 것인, mRNA 전달용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DDA), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄프로페인(DOTAP), 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에테인 카바모일 콜레스테롤(3β-[N-(N',N'-dimethylaminoethane) carbamoyl cholesterol, DC-Chol), 1,2-디올레오일옥시-3-디메틸암모늄프로페인(DODAP), 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리에틸암모늄 프로페인(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane, DOTMA), 1,2-디미리스토레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine,14:1 Etyle PC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 16:0-18:1 Ethyl PC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dioleoyl-snglycero-3-ethylphosphocholine, 18:1 Ethyl PC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin, 18:0 Ethyl PC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 16:0 Ethyl PC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 14:0 Ethyl PC), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin, 12:0 Ethyl PC), N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3-아미노-프로필)아미노]부틸카복사미도)에틸]-3,4-디[올레일옥시]-벤자마이드(N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropyl)amino]-4-[di(3-aminopropyl)amino]butylcarboxamido)ethyl]-3,4-di[oleyloxy]-benzamide, MVL5), 1,2-디미리스토일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-dimyristoyl-3-dimethylammoniumpropane, 14:0 DAP), 1,2-디팔미토일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-dipalmitoyl-3-dimethylammonium-propane, 16:0DAP), 1,2-디스테아로일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-distearoyl-3-dimethylammonium-propane, 18:0 DAP), N-(4-카복시벤질)-N,N-디메틸-2,3-비스(올레오일옥시)프로판-1-아미늄(N-(4-carboxybenzyl)-N,Ndimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)propan-1-aminium, DOBAQ), 1,2-스테아로일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-stearoyl-3-trimethylammonium-propane, 18:0 TAP), 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-dipalmitoyl-3-trimethylammoniumpropane, 16:0 TA), 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium-propane, 14:0 TAP) 및 N4-콜레스테릴-스퍼민(N4-Cholesteryl-Spermine, GL67)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, mRNA 전달용 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 중성 지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine, DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC), 1,2-디리노레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DLPC), 포스파티딜세린(PS), 포스포에탄올라민(PE), 포스파티딜글리세롤(PG), 포스포릭액시드(PA) 및 포스파티딜콜린(PC)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, mRNA 전달용 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 양이온성 지질과 중성지질의 중량비는 1:9 내지 9.5:0.5인 것인, mRNA 전달용 조성물.
  7. 제3항에 있어서, 상기 양이온성 지질과 콜레스테롤의 중량비는 6:1 내지 1:3인 것인, mRNA 전달용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 양이온성 지질, 중성 지질 및 콜레스테롤의 중량비는 1 내지 9.5:9 내지 0.5:0.05 내지 3인 것인, mRNA 전달용 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 mRNA는 면역원으로 작용할 수 있는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 것인, mRNA 전달용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 리포좀과 mRNA의 N:P ratio는 0.23:1 내지 1.39:1 인 것인, mRNA 전달용 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 면역증강제를 추가로 포함하는 것인, mRNA 전달용 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 면역증강제는 PAMP, 사포닌, CpG DNA, lipoprotein, flagella, poly I:C, 스쿠알렌(Squalene), 트리카프린(tricaprin), 3D-MPL, 및 비독성 리포올리고사카라이드(detoxied lipooligosaccharide, dLOS)구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인, mRNA 전달용 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 함유하는 암, 종양, 자가면역질환, 유전질환, 염증성 질환, 바이러스 감염 및 박테리아 감염으로 구성된 군에서 선택되는 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 함유하는 백신.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물.
  16. mRNA 및 리포좀을 혼합하는 단계를 포함하는, mRNA 전달용 조성물의 제조방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 방법은 mRNA, 리포좀의 순서로 투입하여 혼합하는 것인, mRNA 전달용 조성물의 제조방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 방법은 면역증강제를 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 것인, mRNA 전달용 조성물의 제조방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 방법은 면역증강제, mRNA, 리포좀의 순서로 투입하여 혼합하는 것인, mRNA 전달용 조성물의 제조방법.
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