JP2024509934A - Ｒｎａの体内伝達用組成物及びその製造方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、陽イオン性脂質ベースリポソームを含むｍＲＮＡ伝達用組成物に関し、本発明に係るｍＲＮＡ伝達用組成物は、保管安定性に優れており、ｉｎ ｖｉｖｏで高い細胞内伝達率及び発現率を示し、癌治療用のｍＲＮＡワクチン又はウイルス感染予防用のｍＲＮＡワクチンなどの安定性及び効率を向上させることができる。

Description

発明の詳細な説明
［技術分野］
本発明は、ｍＲＮＡ体内伝達用組成物に関し、具体的には、陽イオン性脂質ベースのリポソームを含むｍＲＮＡ体内伝達用組成物及びその製造方法に関する。
本特許出願は、２０２１年３月８日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０－２０２１－００２９９２９号に対して優先権を主張し、当該特許出願の開示事項は本明細書に参照によって組み込まれる。
［背景技術］
遺伝子治療法及び遺伝子ワクチンは医薬分野で既に証明され、一般に適用される技術であり、遺伝的疾患の他、自己免疫疾患、感染性疾患、癌又は腫瘍関連疾患、炎症性疾患なども治療対象になり得る。
遺伝子ワクチンは、ターゲット遺伝子をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを動物に直接注入すると、生きている動物でターゲット遺伝子が発現し、この発現によって免疫が可能であることが報告されながら開発され始めた（Ｗｏｌｆｆ ＪＡ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４６５－８，１９９０）。
遺伝子ワクチン接種は、バクテリア表面の特徴的な構成要素、ウイルス粒子、腫瘍抗原などのような選択された抗原に対して所望の免疫反応を起こすことを可能にする。概して、ワクチン接種は現代医学の中枢的な成果の一つである。しかし、効果的なワクチンは、現在、限られた数の疾患にしか利用できない。このため、ワクチン接種によって予防できない感染症は依然として毎年数百万の人々に影響を及ぼす。
遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種において、ＤＮＡとＲＮＡが遺伝子投与のための核酸分子として用いられてよく、ＤＮＡがＲＮＡに比べてより安定しており、扱いやすいものとして知られている。
しかし、ＤＮＡは、患者の遺伝体内に投与されたＤＮＡ切片が不所望の位置に挿入されて遺伝子が損傷する場合に、潜在的な危険が発生し得る。しかも、不所望の抗ＤＮＡ抗体が現れることがあり、他の問題点は、ＤＮＡ投与及びその後の転写／翻訳によって発現するペプチド又はタンパク質の発現レベルが限定されるという点である。ＤＮＡ転写を調節する特定転写因子の存否が、投与されたＤＮＡの発現レベルに主要な影響を及ぼし、特定転写因子がない場合には、ＤＮＡ転写によって十分な量のＲＮＡが生成されず、結果的に、翻訳されて生成されるペプチド又はタンパク質のレベルも限定される。
一方、ＲＮＡを遺伝子投与のための道具として用いる場合に、ＲＮＡは、転写が不要なため、ＤＮＡのように核に入ることなく細胞質内に直ちにタンパク質を合成でき、よって、細胞染色体内に割り込んで不所望の遺伝子損傷を起こす虞がない。また、ＤＮＡに比べて半減期が短いため、長期遺伝子変形を誘導しない（Ｓａｙｏｕｒ ＥＪ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ２０１５；３：１３，２０１５）。一般のＲＮＡワクチンは、細胞中に伝達すると短期間だけ活性化してターゲットタンパク質を発現させ、数日内に酵素学的反応によって破壊されるが、発現したターゲット抗原（タンパク質）に対する特異的な免疫反応は残る。
また、遺伝子投与のための道具としてＲＮＡを用いる場合に、核膜を通過することなく細胞膜のみを通過するだけで作用するため、ＤＮＡよりも少量を使用しても、ＤＮＡと同じ量のターゲットタンパク質を発現させることができる。また、ＲＮＡは独自て免疫補強原性を持っているため、ＤＮＡに比べて少量を投与しても同じ免疫効果を得ることができる。
遺伝子ワクチン接種のためにＤＮＡの代わりにＲＮＡを用いることにより、不所望のゲノム統合及び抗ＤＮＡ抗体生成の危険は最小化又は防止される。しかし、ＲＮＡは、偏在するＲＮａｓｅによって分解されやすい非常に不安定な分子種とされている。
ここ数年間多くの発展があったにもかかわらず、抗原の早期分解又は細胞でのｍＲＮＡの非効率的な放出によるｍＲＮＡの非効率的な翻訳によって投与が酷く損傷しない方法を提供する必要性は当該分野に依然として残っている。その上、安全性に対する潜在的な心配を減少させるために、そしてワクチンを第３世界でも十分に使用できるようにするために、ｍＲＮＡワクチンの容量を減少させることが切実である。ワクチンのような核酸ベースの治療剤は、膨大な可能性があるが、この可能性を実現するためには、細胞又は有機体内で適切な部位に核酸をより効果的に伝達する必要性が依然として残っている。
しかしながら、治療及び予防の目的における核酸の使用は、現在、２つの問題に直面している。第一に、遊離ＲＮＡは、血漿でヌクレアーゼ消化に脆弱である。第二に、遊離ＲＮＡは、関連した翻訳機構が常在する細胞内区画に接近する能力が制限的である。中性脂質、コレステロール、ＰＥＧ、ペグ化脂質及び核酸のような他の脂質構成要素と陽イオン性脂質から形成された脂質ナノ粒子が血漿においてＲＮＡの分解を遮断し、オリゴヌクレオチドの細胞吸収を促進するために試みられている。
リポソーム（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ）や脂質ナノ粒子（ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）のような脂質ベースの伝達体を用いる場合に、ｍＲＮＡは通常、外部に吸着（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）されるか、内部に封入（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）される方法を用いる。特に、ｍＲＮＡを外部に吸着させる場合には、一般に、単一のリポソームではなく、リポソームと核酸の凝集体として存在することが知られており、脂質の組合せ、核酸の状態、及び核酸とリポソームとの比率によって、吸着力がばらつき、安定性にも影響が及ぶため、それに対する最適化が必要である。
また、ｍＲＮＡの発現能において、一般的に伝達体のｉｎ ｖｉｔｒｏで発現が検証されたとしてもｉｎ ｖｉｖｏ発現の結果は異なるという問題がある。Ｉｎ ｖｉｖｏでは脂質の構成及び伝達体の物理化学的特性によって、血漿タンパク質（ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ）の凝集によって半減期（ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ）及び生体内分布（ｂｉｏ－ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）の減少、及び脂質構成による細胞取り込み（ｃｅｌｌ ｕｐｔａｋｅ）方式の違い、ＥＣＭ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）によるバリア（ｂａｒｒｉｅｒ）などのように、細胞内に伝達される効率を減少させる要因が多数存在する。したがって、体外伝達と違い、体内伝達において伝達体最適化が必須である。
［発明の概要］
［発明が解決しようとする課題］
本発明者らは、ｍＲＮＡを安定的に体内伝達して細胞内発現効率を上げることにより、安定したタンパク質発現を誘導できる伝達体改良技術を見いだそうと鋭意研究努力した。その結果、特定工程によって陽イオン性リポソームベースの［リポソーム＋ｍＲＮＡ複合体］を製造し、当該工程によって製造された［リポソーム＋ｍＲＮＡ複合体］がｉｎ ｖｉｖｏで高い細胞内伝達率及び発現率を示し得ることを突き止め、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の目的は、高い体内伝達率及び発現率を有する、陽イオン性脂質ベースリポソームを含むｍＲＮＡ伝達用組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、前記ｍＲＮＡ伝達用組成物を有効成分として含有する、癌、腫瘍、自己免疫疾患、遺伝疾患、炎症性疾患、ウイルス感染及びバクテリア感染からなる群から選ばれる疾病の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記ｍＲＮＡ伝達用組成物を有効成分として含有するワクチンを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記ｍＲＮＡ伝達用組成物を有効成分として含有する機能性化粧料組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ｍＲＮＡ伝達用組成物の製造方法を提供することである。
［課題を解決するための手段］
本発明者らは、ｍＲＮＡを安定的に体内伝達して細胞内発現効率を上げることにより、安定したタンパク質発現を誘導できる伝達体改良技術を見いだそうと鋭意研究努力した。その結果、特定工程によって陽イオン性リポソームベースの［リポソーム＋ｍＲＮＡ複合体］を製造し、当該工程によって製造された［リポソーム＋ｍＲＮＡ複合体］がｉｎ ｖｉｖｏで高い細胞内伝達率及び発現率を示し得ることを突き止めた。
本発明は、陽イオン性脂質ベースリポソームを含むｍＲＮＡ伝達用組成物、前記ｍＲＮＡ伝達用組成物を有効成分として含有する、癌、ウイルス感染及びバクテリア感染からなる群から選ばれる疾病の予防又は治療用薬剤学的組成物、前記ｍＲＮＡ伝達用組成物を有効成分として含有するワクチン、前記ｍＲＮＡ伝達用組成物を有効成分として含有する機能性化粧料組成物、及び前記ｍＲＮＡ伝達用組成物の製造方法に関する。
特に定義しない限り、本明細書で使われる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使われる命名法は、当該技術分野でよく知られており、通常使われているものである。
本発明では、核酸を用いた体内遺伝子伝達において、ウイルスやバクテリア表面の特徴的な構成要素、ウイルス粒子及び腫瘍抗原などのような選択された抗原に対して所望の免疫反応を誘導して治療用タンパク質発現を誘導し、疾病を予防又は治療する方法が開発されたことをきっかけに、ｍＲＮＡの細胞内発現効率を上げて安定した効果が得られる方法を見いだそうとした。
そこで、陽イオン性脂質ベースリポソームを用いたｍＲＮＡ伝達用組成物を製造し、前記ｍＲＮＡ伝達用組成物がｉｎ ｖｉｖｏで高い細胞内伝達率及び発現率を示すことを確認した。
本発明の陽イオン性脂質ベースリポソームを用いたｍＲＮＡ伝達用組成物において、ｍＲＮＡは陽イオン性脂質ベースリポソームと複合体をなす形態で存在し得ることから、陽イオン性脂質ベースリポソームを用いたｍＲＮＡ伝達用組成物と、［リポソーム＋ｍＲＮＡの複合体」は同じ意味で使われる。
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明の一態様によれば、本発明は、陽イオン性脂質ベースリポソームを含むｍＲＮＡ伝達用組成物を提供する。
本発明において、「陽イオン性脂質」は、ｐＨ変化の影響無しで持続的に陽イオン性を有する脂質、又はｐＨ変化によって陽イオン性に転換されるイオン性脂質を含む。
前記陽イオン性脂質は、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタンカバモイルコレステロール（３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）ｃａｒｂａｍｏｙｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ，ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、１，２－ジオレオイルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリエチルアンモニウムプロパン（１，２－ｄｉ－Ｏ－ｏｃｔａｄｅｃｅｎｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｒｏｐａｎｅ，ＤＯＴＭＡ）、１，２－ジミリストレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１，２－ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，１４：１ Ｅｔｙｌｅ ＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，１６：０－１８：１ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，１８：１ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎ，１８：０ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１，２－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，１６：０ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１，２－ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，１４：０ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１，２－ｄｉｌａｕｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎ，１２：０ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、Ｎ１－［２－（（１Ｓ）－１－［（３－アミノプロピル）アミノ］－４－［ジ（３－アミノ－プロピル）アミノ］ブチルカルボキサミド）エチル］－３，４－ジ［オレイルオキシ］－ベンザミド（Ｎ１－［２－（（１Ｓ）－１－［（３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏ］－４－［ｄｉ（３－ａｍｉｎｏ－ｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｕｔｙｌｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］－３，４－ｄｉ［ｏｌｅｙｌｏｘｙ］－ｂｅｎｚａｍｉｄｅ，ＭＶＬ５）、１，２－ジミリストイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（１，２－ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ－３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ，１４：０ ＤＡＰ）、１，２－ジパルミトイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（１，２－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ－３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ，１６：０ ＤＡＰ）、１，２－ジステアロイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ，１８：０ ＤＡＰ）、Ｎ－（４－カルボキシベンジル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（オレオイルオキシ）プロパン－１－アミニウム（Ｎ－（４－ｃａｒｂｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）－Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２，３－ｂｉｓ（ｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎ－１－ａｍｉｎｉｕｍ，ＤＯＢＡＱ）、１，２－ステアロイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（１，２－ｓｔｅａｒｏｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｐｒｏｐａｎｅ，１８：０ ＴＡＰ）、１，２－ジパルミトイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（１，２－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ，１６：０ ＴＡ）、１，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（１，２－ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ，１４：０ ＴＡＰ）及び／又はＮ４－コレステリル－スペルミン（Ｎ４－Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ－Ｓｐｅｒｍｉｎｅ，ＧＬ６７）であってよく、好ましくは、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）又はＣ１２－２００であってよいが、これに限定されるものではない。
具体的には、前記「ＤＯＴＡＰ（１，２－Ｄｉｏｌｅｏｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｒｏｐａｎｅ）」は、下記化学式１の構造を有する陽イオン性乳化剤であり、繊維柔軟剤として用いられており、最近では、リポソームを形成する核酸運搬体として用いられている。
本発明の陽イオン性脂質ベースリポソームを含むｍＲＮＡ伝達用組成物は、中性脂質がさらに含まれてよい。
本発明において、「中性脂質」は、ｐＨ変化の影響無しで持続的に中性を有する脂質又はｐＨ変化によって中性に転換されるイオン性脂質を含む。
前記中性脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，ＤＯＰＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（１，２－Ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１，２－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＰＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＳＰＣ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１，２－ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＬＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスホエタノラミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスホリックアシッド（ＰＡ）及び／又はホスファチジルコリン（ＰＣ）であってよく、好ましくは、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，ＤＯＰＥ）であってよいが、これに限定されるものではない。
具体的には、前記「ＤＯＰＥ（１，２－Ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）」は、下記化学式２の構造を有し、陽イオン性リポソーム用補助脂質として用いられる。
本発明において、前記陽イオン性脂質と中性脂質の重量比は、１：９～９．５：０．５、２：８～９：１、３：７～８：２、又は４：６～７：３であってよいが、これに限定されるものではない。
前記重量比を外れると、ｍＲＮＡ伝達効率が顕著に低下することがある。
また、本発明の陽イオン性脂質ベースリポソームを含むｍＲＮＡ伝達用組成物は、コレステロールがさらに含まれてよい。
本発明において、前記陽イオン性脂質とコレステロールの重量比は、６：１～１：３、４：１～１：２．５、３：１～１：２、又は２：１～１：１．５であってよいが、これに限定されるものではない。
また、本発明に係るリポソームに陽イオン性脂質、中性脂質及びコレステロールが全て含まれる場合に、前記陽イオン性脂質、中性脂質及びコレステロールの重量比は、１～９．５：９～０．５：０．０５～３、３～８：７～１：０．４５～７．０、又は１～３．５：１～３．５：０．５～３であってよいが、これに限定されるものではない。
前記重量比を外れると、ｍＲＮＡ伝達効率が顕著に低下することがある。
例示的には、コレステロールがさらに含まれる場合に、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ＝１：１に対してコレステロールを０．２～０．８５、又は０．５～０．８５の重量比の割合で混合してリポソームを製造することができる。
さらに、本発明の陽イオン性脂質ベースリポソームを含むｍＲＮＡ伝達用組成物はさらに、プロタミン、アルブミン、トランスフェリン、ＰＴＤ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓ）、ＣＰＰ（ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）及びマクロファージ標的化部分（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）などの一つ以上の伝達用因子が含まれてよい。
なお、本発明の陽イオン性脂質ベースリポソームを含むｍＲＮＡ伝達用組成物はさらに、免疫増強剤が含まれてよい。
前記免疫増強剤は、病原体関連分子類型（Ｐａｔｈｏｇｅｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎ，ＰＡＭＰ）に該当してパターン認識受容体（Ｐａｔｈｏｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＰＲＲ）に反応する物質群、非毒性リポオリゴサッカライド（ｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄ ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ｄＬＯＳ）、ＣｐＧ ＤＮＡ、リポタンパク質、フラジェラ（ｆｌａｇｅｌｌａ）、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、サポニン、スクアレン（Ｓｑｕａｌｅｎｅ）、トリカプリン（ｔｒｉｃａｐｒｉｎ）及び／又は３Ｄ－ＭＰＬであってよいが、これに限定されるものではない。
具体的には、前記非毒性リポオリゴサッカライド（ｄＬＯＳ）は、大韓民国登録特許第１５０９４５６号又は大韓民国登録特許第２０４２９９３号に開示された物質であってよいが、これに限定されるものではない。
本発明のｍＲＮＡ伝達用組成物において、リポソームに代表されるｍＲＮＡ伝達体とｍＲＮＡとの混合比率はＮ：Ｐ比率（ｒａｔｉｏ）で表示でき、Ｎ：Ｐ比によって発現及び伝達体の安定性に影響が及ぶ。
前記リポソームとｍＲＮＡのＮ：Ｐ比率は、０．２３～１．３９：１、０．３～１．３：１、０．４～１．２：１、０．５～１．１：１、０．６～１．０：１、０．６～０．９：１、０．６～０．８：１、又は０．７：１であってよいが、これに限定されるものではない。
本発明のｍＲＮＡ伝達用組成物において、前記ｍＲＮＡは免疫原としては働き得るペプチド又はタンパク質をコードすることを特徴とし得る。
前記ｍＲＮＡは、典型的に、ｍＲＮＡと共に提供される細胞又は有機体によって翻訳され得る少なくとも一つのオープンリーディングフレーム（Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）を有するｍＲＮＡであってよい。この翻訳の産物は、抗原、好ましくは免疫原として働き得るペプチド又はタンパク質である。この産物は、また、２つ以上の免疫原からなる融合タンパク質、例えば、同一又は個別のウイルスタンパク質に由来する２つ以上のエピトープ、ペプチド又はタンパク質からなる融合タンパク質であってよく、このとき、エピトープ、ペプチド又はタンパク質はリンカー配列によって連結されてよい。
また、前記ｍＲＮＡは、人工ｍＲＮＡ、すなわち、自然的に発生しないｍＲＮＡ分子として理解されてよい。人工ｍＲＮＡ分子は、非天然ｍＲＮＡ分子として理解されてよい。このようなｍＲＮＡ分子は、（自然的に発生しない）個別配列及び／又は自然的に発生しない他の変更、例えばヌクレオチドの構造的変更によって非天然的であってよい。人工ｍＲＮＡ分子は、ヌクレオチドの所望の人工配列（異種配列）に相応する遺伝子操作方法によって設計及び／又は生成されてよい。
なお、前記ｍＲＮＡは、生体内分解（例えば、エクソ－又はエンド－ヌクレアーゼによる分解）及び／又は生体外分解（例えば、ワクチン投与前の製造過程によって、例えば、投与されるワクチン溶液の製造過程において）に対する耐性を増加させる変形を示すことができる。ＲＮＡの安定化は、例えば、５’－ＣＡＰ構造、ポリ－Ａ－尾部、又は任意のその他ＵＴＲ変形の提供によって達成されてよい。また、ＲＮＡの安定化は、化学的変形又は核酸のＧ／Ｃ含有量の変形によって達成されてよい。様々な他の方法が当該分野に公知されており、本発明の適用が可能である。
本発明の他の態様によれば、本発明は、上述したｍＲＮＡ伝達用組成物を有効成分として含有する、癌、腫瘍、自己免疫疾患、遺伝疾患、炎症性疾患、ウイルス感染及びバクテリア感染からなる群から選ばれる疾病の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供する。
本発明において「予防」とは、本発明に係る薬剤学的組成物の投与によって上述の疾患を抑制させたりその進行を遅延させたりする全ての行為を意味する。
本発明において「治療」とは、本発明に係る薬剤学的組成物の投与によって上述の疾患に対する症状が好転したり有益に変更されたりする全ての行為を意味する。
本発明の薬剤学的組成物は、一つ以上の製薬上又は生理学上に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わされてよい。前記薬剤学的組成物は、緩衝剤、例えば、中性緩衝塩水、ホスフェート緩衝塩水、クエン酸緩衝溶液など；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチド又はアミノ酸、例えば、グリシン；抗酸化剤；キレーティング剤、例えば、ＥＤＴＡ又はグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；及び防腐剤を含んでよい。
本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与でき、例えば、静脈内投与、皮下投与、血内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、脳内投与、頭蓋骨内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与できるが、これに限定されるものではない。
本発明の薬剤学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／危険の割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効量は患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時使用薬物を含む要素及びその他医学分野によく知られた要素によって決定されてよい。
本発明の薬剤学的組成物は、個別治療剤として、又は他の治療剤と併用して投与されてよく、従来の治療剤とは順次に又は同時に投与されてよく、単回又は多回投与されてよい。前記要素を全て考慮して副作用無しで最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者にとって容易に決定できる。
具体的には、本発明の薬学的組成物の有効量は、患者の年齢、性別、状態、体重、体内に活性成分の吸収度、不活性率及び排泄速度、疾病の種類、併用薬物によって異なってよい。
本発明の薬剤学的組成物は、上述したｍＲＮＡ伝達用組成物を有効成分として含むので、重複する内容については本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、癌、腫瘍、自己免疫疾患、炎症性疾患、ウイルス感染及びバクテリア感染に対する予防又は治療が必要な患者に、本発明のｍＲＮＡ伝達用組成物を投与する段階を含む、癌、腫瘍、自己免疫疾患、炎症性疾患、ウイルス感染及びバクテリア感染に対する予防又は治療方法を提供する。
前記ｍＲＮＡの投与量は、容量当たりに１～５μｇ、５～１０μｇ、１０～１５μｇ、１５～２０μｇ、１０～２５μｇ、２０～２５μｇ、２０～５０μｇ、３０～５０μｇ、４０～５０μｇ、４０～６０μｇ、６０～８０μｇ、６０～１００μｇ、５０～１００μｇ、８０～１２０μｇ、４０～１２０μｇ、４０～１５０μｇ、５０～１５０μｇ、５０～２００μｇ、８０～２００μｇ、１００～２００μｇ、１２０～２５０μｇ、１５０～２５０μｇ、１８０～２８０μｇ、２００－３００μｇ、５０～３００μｇ、８０～３００μｇ、１００～３００μｇ、４０～３００μｇ、５０～３５０μｇ、１００～３５０μｇ、２００～３５０μｇ、３００～３５０μｇ、３２０～４００μｇ、４０～３８０μｇ、４０～１００μｇ、１００～４００μｇ、２００～４００μｇ、又は３００～４００μｇであってよいが、これに限定されるものではない。
前記ワクチンは、インフルエンザー、コロナウイルス、帯状疱疹、ヒトパピローマウイルス、ジカウイルス、ヘルペスウイルス、エイズウイルス、ＳＦＴＳウイルス、麻疹ウイルス、水痘ウイルス、エボラウイルス、メルスウイルス、肝炎ウイルス、鳥類インフルエンザー、狂犬病ウイルス及び口蹄疫ウイルスなど、ヒトと動物に感染を起こし得るウイルスに対するワクチンであってよいが、これに限定されるものではない。
前記ワクチンは、少なくとも一つのウイルス抗原のポリペプチド又はその免疫原性断片を暗号化するオープンリーディングフレームを有する少なくとも一つのｍＲＮＡを含む。
本発明の治療方法は、上述した薬剤学的組成物を有効成分として含むので、重複する内容については本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、上述したｍＲＮＡ伝達用組成物を有効成分として含有するワクチンを提供する。
前記ワクチンは、上述したｍＲＮＡが免疫原として働き得るペプチド又はタンパク質によって引き起こされる疾病の予防目的の範囲において、投与対象の体重、年齢、食餌段階及び／又は免疫力を考慮して適切な濃度で上述したｍＲＮＡ伝達用組成物を含んでよい。
前記ワクチンは、担体、希釈剤、賦形剤、及びアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）からなる群から選ばれる１以上をさらに含んでよい。担体は、その種類に特に限定されず、任意の全ての溶媒、分散媒質、コーティング、安定剤、保存剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などを含んでよい。
前記ワクチンは、経口、非経口、皮下、筋肉内、血内、舌下、経皮、直腸、経粘膜、吸入による表面的、頬側投与で、又はその組合せで投与されてよい。
前記ワクチンは、ワクチン接種又は治療の所望の期間及び有効性によって１回又は多回、また、間欠的に、例えば、数日、数週又は数カ月の間に毎日、同量又は異なる投与量で投与されてよい。注射は、所望の量で注射したり又は皮下或いは鼻腔に噴霧したりして注入できる。或いは、連続注入してもよい。
本発明のワクチンは、上述したｍＲＮＡ伝達用組成物を有効成分として含むので、重複する内容については本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、上述したｍＲＮＡ伝達用組成物を有効成分として含有する機能性化粧料組成物を提供する。
本発明に係る化粧料組成物は、化粧料組成物に通常用いられる成分を含んでよく、例えば、金属イオン封鎖剤、活性成分（例えば、ヒアルロン酸ナトリウム及び酢酸トコフェロールなど）、防腐剤、粘増剤及び香料のような通常の補助剤、そして担体を含む。
また、本発明に係る化粧料組成物は、当業界における一般的な剤形、例えば、乳化剤形や可溶化剤形などの形態で製造されてよい。乳化剤形には、栄養化粧水、クリーム、エッセンスなどを挙げることができ、可溶化剤形には、柔軟化粧水を挙げることができる。また、本発明の化粧料組成物は、化粧品の他にも、皮膚科学的に許容可能な媒質又は基剤を含有することにより、皮膚科学分野において通常用いられる局所適用又は全身適用可能な補助剤の形態で製造されてよい。
適切な化粧品の剤形には、例えば、溶液、ゲル、固体又は練り無水生成物、水相に油相を分散させて得たエマルジョン、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微細顆粒球又はイオン型（リポソーム）、非イオン型の小嚢分散剤の形態、クリーム、スキン、ローション、パウダー、軟膏、スプレー又はコンシールスティック（ｃｏｎｃｅａｌ ｓｔｉｃｋ）の形態で提供されてよい。また、泡沫（ｆｏａｍ）の形態又は圧縮された推進剤をさらに含有したエアゾール組成物の形態でも製造されてよい。
また、本発明の化粧料組成物はさらに、脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤及びゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型又は非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤及びキレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、親水性又は親油性活性剤、脂質小嚢又は化粧品に通常使用される任意の他の成分のような化粧品学又は皮膚科学分野において通常使用される補助剤を含有できる。そして、上記の成分は、皮膚科学分野において一般に使われる量で導入されてよい。
本発明の化粧料組成物を添加可能な製品には、例えば、収れん化粧水、柔軟化粧水、栄養化粧水、各種クリーム、エッセンス、パック、ファンデーションなどのような化粧品類とクレンジング、洗顔剤、石鹸、トリートメント、美容液などがある。
本発明の化粧料組成物の具体的な剤形としては、スキンローション、スキンソフナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、エッセンス、栄養エッセンス、パック、石鹸、シャンプー、クレンジングフォーム、クレジングローション、クレンジングクリーム、ボディーローション、ボディークレンザー、乳液、プレスパウダー、ルーズパウダー、パッチ、噴霧剤などの剤形を含む。
本発明の化粧料組成物は、上述したｍＲＮＡ伝達用組成物を有効成分として含むので、重複する内容については本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、ｍＲＮＡ及びリポソームを混合する段階を含む、ｍＲＮＡ伝達用組成物の製造方法を提供する。
前記ｍＲＮＡ及び／又はリポソームは、凍結乾燥された状態の粉末形態で提供されてよく、適切な溶液やバッファに溶解された状態で提供されてよい。ｍＲＮＡ及び／又はリポソームが凍結乾燥された状態で提供される場合に、適切な溶液やバッファに溶かして使用可能である。
本発明の具体的な実施例において、本発明者らは、リポソーム及びｍＲＮＡの混合順序を調節して製造されたｍＲＮＡ－リポソーム複合体の特性を分析し、リポソーム及びｍＲＮＡの混合順序によるｉｎ ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ発現を確認した。
本発明において、前記ｍＲＮＡ及びリポソームは、ｍＲＮＡ→リポソームの順序で投入して混合してよい。
前記順序でｍＲＮＡ及びリポソームを混合することによって、製造されたｍＲＮＡ－リポソーム複合体の生体内ｍＲＮＡ伝達及び発現率が増加し得る。
本発明のｍＲＮＡ伝達用組成物の製造方法は、免疫増強剤を混合する段階をさらに含んでよい。
前記免疫増強剤は、凍結乾燥した状態の粉末形態で提供されてもよく、適切な溶液やバッファに溶解された状態で提供されてもよい。免疫増強剤が凍結乾燥した状態で提供される場合に、適切な溶液やバッファに溶解して使用可能である。
本発明の具体的な実施例において、本発明者らは、リポソーム、ｍＲＮＡ及び免疫増強剤の混合順序を調節して製造されたｍＲＮＡ－リポソーム複合体に対して、リポソーム、ｍＲＮＡ及び免疫増強剤の混合順序によるｉｎ ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ発現を確認した。
本発明において、前記ｍＲＮＡ、リポソーム及び免疫増強剤は、免疫増強剤→ｍＲＮＡ→リポソームの順序で投入して混合するものであってよい。
前記順序でｍＲＮＡ、リポソーム及び免疫増強剤を混合することによって、製造されたｍＲＮＡ－リポソーム複合体の生体内ｍＲＮＡ伝達及び発現率が増加し得る。
本発明のｍＲＮＡ及びリポソームは、上述したｍＲＮＡ伝達用組成物の有効成分であるので、重複する内容については本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
［発明の効果］
本発明に係る陽イオン性リポソームを含むｍＲＮＡ伝達用組成物は、保管安定性に優れており、ｉｎ ｖｉｖｏで高い細胞内伝達率及び発現率を示し、癌の治療／予防用のｍＲＮＡワクチン又はウイルスやバクテリア感染予防用のｍＲＮＡワクチンなどの安定性及び効率を向上させることができる。
［図面の簡単な説明］
［図１］ｍＲＮＡの使用量を異ならせて製造したリポソーム－ｍＲＮＡ複合体のマウスにおけるｍＲＮＡの発現を確認した結果である。
［図２］ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥの比率を異ならせて製造したリポソームを使用したリポソーム－ｍＲＮＡ複合体のマウスにおけるｍＲＮＡの発現を確認した結果である。
［図３］ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：コレステロールの比率を異ならせて製造したリポソームを使用したリポソーム－ｍＲＮＡ複合体のマウスにおけるｍＲＮＡの発現を確認した結果である。
［図４］ｍＲＮＡ及びリポソームの混合順序を異ならせて製造したｍＲＮＡ－リポソーム複合体の試料のサイズ、分散度、ゼータ電位を分析した結果である。
［図５］ｍＲＮＡ及びリポソームの混合順序によるｍＲＮＡの発現差をｉｎ ｖｉｖｏで確認した結果である。
［図６］ｍＲＮＡ及びリポソームの混合順序を異ならせて製造したｍＲＮＡ－リポソーム複合体でマウスを免疫化した後、細胞性免疫反応（図６Ａ）、抗体性免疫反応（図６Ｂ）及び中和抗体力価（図６Ｃ）を確認した結果である。
［図７］ｄＬＯＳ使用量を異ならせて製造したリポソーム－ｍＲＮＡ複合体のマウスにおけるｍＲＮＡの発現を確認した結果である。
［図８］ｍＲＮＡ、リポソーム、及びｄＬＯＳの混合順序を異ならせて製造したｍＲＮＡ－リポソーム－ｄＬＯＳ複合体をマウスに注射した時に、ｍＲＮＡの発現を確認した結果である（ＬＰ：リポソーム；Ｒ：ｍＲＮＡ；ｄＬ：ｄＬＯＳ）
［図９］Ｎ／Ｐ比率を異ならせて製造したｍＲＮＡ－リポソーム複合体の安定性を測定するために、保管期間別にサイズ（図９Ａ）、分散度（図９Ｂ）、ゼータ電位（図９Ｃ）を測定した結果である。
［発明を実施するための形態］
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
製造例１．ｍＲＮＡ－リポソーム複合体（ｍＲＮＡ－ｌｉｐｏｓｏｍｅ）製造
リポソーム製造（Ｆｉｌｍ ｍｅｔｈｏｄ）
ＤＯＴＡＰ（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｉｅ／ＣＨ２９０００１４）、ＤＯＰＥ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ）及び／又はコレステロール（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ）にクロロホルムをそれぞれ混合した後、３７℃で１０分間完全に溶解させて液状溶液として製造した。
丸底フラスコに前記液状溶液を一定重量比で混合して脂質混合物（ｌｉｐｉｄ ｍｉｘｔｕｒｅ）を作り、ロータリーエバポレーター（Ｂｕｃｈｉ／Ｂ４９１＿Ｒ２００）で６０℃、３０分間揮発させてクロロホルムを飛ばし、フラスコ壁面に脂質膜フィルムを作製した。
前記脂質膜フィルムが作製されたフラスコに４％（ｗ／ｖ）スクロース含有の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ ７．４）を入れて６０℃で脂質膜を溶かし、リポソームの濃度が７．５ｍｇ／ｍＬとなるようにリポソームを形成した。形成されたリポソームは、動的光散乱分析装備で粒子のサイズ、ゼータ電位、分散度を測定した。製造された残りリポソームは試験前まで４℃で保管した。
ｍＲＮＡ－リポソーム複合体製造
４％スクロース含有の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ７．４）に、上記で製造したリポソーム（ＬＰ－ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール（４０：４０：２０，ｗ／ｗ／ｗ）又はＬＰ－ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（５０：５０，ｗ／ｗ））及びレニラルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）に対するｍＲＮＡ（配列番号１）を混合してｍＲＮＡ－リポソーム複合体を製造した。
このとき、７．５ｍｇ／ｍＬのリポソーム溶液（ＬＰ－ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール（４０：４０：２０，ｗ／ｗ／ｗ）は、製造直後又は最大で製造後２週以内の期間で冷蔵保管された試料を使用した。１ｍｇ／ｍＬのレニラルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１）溶液は－７０℃に保管したし、使用直前にアイス上で溶かして使用した。４％スクロース含有の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ７．４）は、実験の直前に作って使用したり又は実験前日に製造した後に冷蔵保管した。
リポソームとｍＲＮＡの混合割合であるＮ／Ｐ比率（Ｎ／Ｐ ｒａｔｉｏ）は、次の計算式で計算した。
実施例１．ｍＲＮＡ－リポソーム複合体のｍＲＮＡ含有量によるｍＲＮＡ発現確認
前記製造例１においてリポソーム－ｍＲＮＡ複合体を製造するとき、ｍＲＮＡの量を５μｇ、１０μｇ及び２０μｇと別々にし、それぞれの場合に対してＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：コレステロール（４０：４０：２０，ｗ／ｗ／ｗ）のリポソームの量を１８．７５μｇ、３７．５μｇ、７５μｇで混合した複合体（Ｎ／Ｐ比率＝０．７）を製造した後、ｉｎ ｖｉｖｏで発現率を確認した。
具体的には、除毛したマウス（７週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ雌、オリエントバイオ、中央実験動物）に各リポソーム－ｍＲＮＡ複合体を１００μｌの容量で大腿部三角筋に筋肉内注射（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；Ｉ．Ｍ．ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。
投与６時間後に、マウスをアバチン（ａｖｅｒｔｉｎ）（２５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した後、ルシフェラーゼ基質ストック溶液（ＶｉｖｉＲｅｎＴＭ ｉｎ ｖｉｖｏ ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に１Ｘ ＰＢＳ ２．４ｍＬを入れて０．１５μｇ／μｌにした基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を２００μｇずつ静脈注射（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；Ｉ．Ｖ．ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。
投与の直後に、ＩＶＩＳ装備（Ａｍｉ－ＨＴＸ，ＵＳＡ）内にマウスをポジションさせ、撮影露出時間を６０秒に設定してマウスを撮影したし（ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ－２００）、Ａｕｒａ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ，ＵＳＡ）を用いて、投与部位のルシフェラーゼの発現程度（Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＲＯＩ）を数値化した。
その結果、図１から確認できるように、５μｇ、１０μｇ ｍＲＮＡでは発現率の差がなかったが、２０μｇのｍＲＮＡを含む場合は、５μｇ、１０μｇｍ ＲＮＡを含む場合に比べてそれぞれ、発現率が１３５％、１７０％増加した。ｍＲＮＡが一定レベル以上増加すればｉｎ ｖｉｖｏ発現率が増加した。
製造例２．リポソームの陽イオン性脂質：中性脂質：コレステロール（ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）混合比率が調節されたｍＲＮＡ－リポソーム複合体製造
２－１．ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥの混合比率調節
下記の表１に示すＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥの比率（ｗ／ｗ）でリポソームを製造した後、ｍＲＮＡと混合してリポソーム－ｍＲＮＡ複合体を製造した。リポソーム－ｍＲＮＡ複合体のＮＰ比率（ｍｏｌａｒ ｒａｔｉｏ）は０．７：１となるように、２０μｇ ｍＲＮＡ（レニラルシフェラーゼｍＲＮＡ、配列番号１）に対して３０μｇ ＤＯＴＡＰが含まれたリポソームを使用した。この時、リポソーム対照群として、メーカーが推奨するプロトコルを用いてＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ Ｉｇｎｉｔｅ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）でＣ１２－２００、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を５０：１０：３８．５：１．５に混合したＬＮＰ（Ｃ１２－２００：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００＝５０：１０：３８．５：１．５）を使用した。
２－２．ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：コレステロールの混合比率調節
下記の表２に示すＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：コレステロールの比率（ｗ／ｗ）でリポソームを製造した後、ｍＲＮＡと混合してリポソーム－ｍＲＮＡ複合体を製造した。リポソーム－ｍＲＮＡ複合体のＮＰ比率は０．７：１となるように、２０μｇ ｍＲＮＡ（レニラルシフェラーゼｍＲＮＡ、配列番号１）に対して３０μｇ ＤＯＴＡＰが含まれたリポソームを使用した。この時、リポソーム対照群としてインビボフェクタミン（ｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。
実施例２．リポソームの陽イオン性脂質：中性脂質：コレステロール（ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：コレステロール）混合比率によるｍＲＮＡ発現確認
２－１．ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥの混合比率によるｉｎ ｖｉｖｏ発現率
前記製造例２－１で製造された各リポソーム－ｍＲＮＡ複合体に対して、前記実施例１と同じ方法でｉｎ ｖｉｖｏ発現を確認した。
その結果、図２から確認できるように、４０：６０、５０：５０及び７０：３０のＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥの比率で製造されたリポソームを使用したリポソーム－ｍＲＮＡ複合体において、高いマウス内ｍＲＮＡ発現率を示した。
２－２．ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：コレステロールの混合比率によるｉｎ ｖｉｖｏ発現率
前記製造例２－２で製造された各リポソーム－ｍＲＮＡ複合体に対して、前記実施例１と同じ方法でｉｎ ｖｉｖｏ発現を確認した。
その結果、図３から確認できるように、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥの比率を１：１に固定し、コレステロールの比率を調整した時に、４０：４０：２０～３５：３５：３０のＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：コレステロールの比率で製造されたリポソームを使用したリポソーム－ｍＲＮＡ複合体において、高いマウス内ｍＲＮＡ発現率を示したし、コレステロール比率を固定した時に、２０：６０：２０～４０：４０：２０のＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：コレステロール比率で製造されたリポソームを使用したリポソーム－ｍＲＮＡ複合体において、高いマウス内ｍＲＮＡ発現率を示した。
実施例３．リポソームの陽イオン性脂質：中性脂質：コレステロール（ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：コレステロール）混合比率による特性分析
前記製造例２－２で製造したリポソーム及びｍＲＮＡ－リポソーム複合体を、４％スクロースを含有する２０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ７．４）で１／１０に希釈した。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳＰ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐｎａｎｌｙｔｉｃａｌ）でＤＬＳ（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）分析を行い、複合体のサイズ（ｓｉｚｅ）、分散度（ＰＤＩ）、ゼータ電位（Ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を測定した。
その結果、下記の表３（リポソーム）及び表４（リポソーム－ｍＲＮＡ複合体）から確認できるように、リポソームのサイズは１００～２００ｎｍ、分散度は０．４未満であった。ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥが同比であるとき、コレステロール含有比が大きくなるほど粒子サイズと分散度が大きくなったし、コレステロール含有比が２０であって、同一であるとき、ＤＯＡＴＰに比べてＤＯＰＥ含有量が多いと、粒子サイズと分散度が大きくなる傾向が観察された（表３）。リポソーム－ｍＲＮＡ複合体は概ね１８０～２４０ｎｍ、分散度は０．３未満であったし、これらの数値は、ｍＲＮＡが混合していないリポソームに比べて増加した。ｍＲＮＡが混合している場合には、コレステロールの含有比率による粒子サイズ変化様相が観察されなかった。
製造例３．リポソーム及びｍＲＮＡの混合順序が調節されたｍＲＮＡ－リポソーム複合体製造
前記製造例１の－７０℃に保管されていた１ｍｇ／ｍＬのレニラルシフェラーゼｍＲＮＡ溶液、及び冷蔵保管されたリポソーム溶液（ＬＰ－ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール（４０：４０：２０，ｗ／ｗ／ｗ））及び４％スクロース含有の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ７．４）を使用した。
下記の製造方法は、リポソーム－ｍＲＮＡ複合体４００μＬ製造例示であり、必要によって一定比率で増量して製造したし、溶液の混合は、ピペッティングをはじめとして撹拌などの周知の方法を用いた。
３－１．ｍＲＮＡ→リポソームの順序
ＲＮＡ専用２００Ｐチップ（ｔｉｐ）を用いて４％スクロース含有の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ７．４）３４０μＬを取ってマイクロチューブに分注した。２００Ｐチップを用いて、完全解凍された１ｍｇ／ｍＬのレニラルシフェラーゼｍＲＮＡ溶液４０μＬ（４０μｇ ｍＲＮＡ）を取ってバッファの分注されたマイクロチューブに入れた後、約１０回ピペッティングした。２００Ｐチップを用いて７．５ｍｇ／ｍＬのリポソーム溶液（ＬＰ－ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール（４０：４０：２０，ｗ／ｗ／ｗ）２０μＬ（１５０μｇリポソーム）を取って前記バッファ及びｍＲＮＡ溶液の分注されたマイクロチューブに入れた後、約３０回ピペッティングした。最後に、前記バッファ、ｍＲＮＡ溶液及びリポソーム溶液が混合された試料を１０００Ｐチップで約１０回ピペッティングしてさらに混合した。
３－２．リポソーム→ｍＲＮＡの順序
ＲＮＡ専用２００Ｐチップ（ｔｉｐ）を用いて４％スクロース含有の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ７．４）３４０μＬを取ってマイクロチューブに分注した。２００Ｐチップを用いて７．５ｍｇ／ｍＬのリポソーム溶液（ＬＰ－ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール（４０：４０：２０，ｗ／ｗ／ｗ））２０μＬ（１５０μｇリポソーム）を取ってバッファの分注されたマイクロチューブに入れた後、約１０回ピペッティングした。２００Ｐチップを用いて、完全解凍された１ｍｇ／ｍＬのレニラルシフェラーゼｍＲＮＡ溶液４０μＬ（４０μｇ ｍＲＮＡ）を取って前記バッファ及びリポソーム溶液の分注されたマイクロチューブに入れた後、約３０回ピペッティングした。最後に、前記バッファ、ｍＲＮＡ溶液及びリポソーム溶液が混合された試料を１０００Ｐチップで約１０回ピペッティングしてさらに混合した。
実施例４．リポソーム及びｍＲＮＡの混合順序による特性分析
前記製造例３で製造されたリポソーム－ｍＲＮＡ複合体に対するＤＬＳ分析を行い、複合体のサイズ（ｓｉｚｅ）、分散度（ＰＤＩ）、ゼータ電位（Ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）の平均と標準偏差を導出した。
その結果、図４から確認できるように、各リポソーム－ｍＲＮＡ複合体の物理的特性には大差がなかった。
実施例５．リポソーム及びｍＲＮＡの混合順序によるｍＲＮＡ発現確認
前記製造例３で混合順序によって個別に製造されたリポソーム－ｍＲＮＡ複合体に対して、前記実施例１と同じ方法でｉｎ ｖｉｖｏ発現を分析した。
その結果、図５から確認できるように、ｍＲＮＡ→リポソームの順序で混合して製造した複合体においてｍＲＮＡ発現が顕著に高く示された。
実施例６．リポソーム及びｍＲＮＡの混合順序による免疫原性確認
レニラルシフェラーゼに対するｍＲＮＡの代わりにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ｍＲＮＡ（配列番号３）を使用した以外は、前記製造例３と同じ方法で混合順序によって個別に製造されたリポソーム－ｍＲＮＡ複合体に対して、次の実験を行った。
まず、６週齢雌マウス（Ｂ６Ｃ３Ｆ１／ｓｌｃ，中央実験動物）に混合順序を異ならせて製造されたリポソーム－ｍＲＮＡ複合体を、マウスの左後肢の大腿部に筋肉投与経路で０．１ＨＤ（ｈｕｍａｎ ｄｏｓｅ）ずつ３週間隔で２回投与した。
６－１．サイトカイン
脾臓細胞再刺激（Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ ｒｅｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）
最後の投与２週後に頚椎脱骨でマウスを犠牲させ、脾臓を摘出した後、脾臓をプール（ｐｏｏｌｉｎｇ）し、１％ペニシリンストレプトマイシン溶液添加のＰＢＳ（以下、ＰＢＳ ｗ／ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）が分注された２４ウェルプレートに移した。使用した培地は、下記の表５及び表６に示す。
クリーンベンチ内で脾臓組織を鉗子で挟んでＰＢＳ ｗ／ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓに洗浄した後、３ｍＬの基本培地（ｂａｓａｌ ｍｅｄｉａ）の入っている６０ｍｍディッシュに移し、４０μｍセルストレーナー（ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ）を用いて、組織を潰して脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）を分離した。分離された脾臓細胞を１５ｍＬチューブに移した後、４℃、３，０００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離して上澄液を除去し、細胞を３ｍＬのＲＢＣ溶解バッファで懸濁して常温に３分静置した後、４℃、３，０００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離した。上澄液を除去して細胞を３ｍＬのＰＢＳ ｗ／ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓに懸濁して４℃、３，０００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離し、上澄液を除去した後、細胞を１０ｍＬの完全培地（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉａ）に懸濁した。前記細胞懸濁液を完全培地を用いて２×１０７細胞／ｍＬとなるように希釈した後、９６ウェル細胞培養プレートに１００μｌ／ウェルで分注した。
別途に、ＰｅｐＭｉｘ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ１ペプチドプール（ｐｏｏｌ，ＪＰＴ）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ２ペプチドプール（ＪＰＴ）を各１バイアルに５０μｌのＤＭＳＯを入れて溶解させた後、最終濃度２．５μｇ／ｍＬとなるように完全培地と混合してＳＡＲＳ ＣｏＶ－２スパイクペプチド刺激剤（ｓｔｉｍｕｌａｎｔ）を製造した。
前記細胞懸濁液の入っている９６ウェルに前記刺激剤４０μｇ／ウェル及び完全培地６０μｌ／ウェルずつ添加して３７℃、５％ ＣＯ２の条件で７２時間反応させた。
ＩＦＮ－γ濃度確認
刺激された脾臓細胞の培養液を試薬希釈剤（ｒｅａｇｅｎｔ ｄｉｌｕｅｎｔ，１％ ＢＳＡ）で１／５希釈し、抗マウスＩＦＮ－γキャプチャー抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）がコートされたマイクロプレートに１００μｌ／ウェルで分注し、シーリングフィルムを覆って常温で２時間静置した後、ＥＬＩＳＡウォッシャー（ＥＬＩＳＡ ｗａｓｈｅｒ）（Ｔｅｃａｎ／Ｈｙｄｒｏｆｌｅｘｅｌｉｓａ）で各ウェルの溶液を除去し、洗浄バッファを用いて３回洗浄した。
試薬希釈剤を用いてＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキット（Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ－γ Ｄｕｏｓｅｔ ＥＬＩＳＡ，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）内のＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰを１／４０に希釈した後、イムノプレートに１００μｌ／ウェルずつ分注し、シーリングフィルムで覆って常温で２０分間静置した後、ＥＬＩＳＡウォッシャーで各ウェルの溶液を除去し、洗浄バッファで３回洗浄した。
キット内の抗マウスＩＦＮ－γ検出抗体を試薬希釈剤を使って２００ｎｇ／ｍＬに希釈した後、イムノプレートに１００μＬ／ウェルずつ分注し、シーリングフィルムを覆って常温で１時間静置した後、ＥＬＩＳＡウォッシャー（Ｔｅｃａｎ／Ｈｙｄｒｏｆｌｅｘｅｌｉｓａ）で各ウェルの溶液を除去し、洗浄バッファで３回洗浄した。
ＴＭＢ基質（ＫＰＬ ｓｕｒｅｂｌｕｅ ＴＭＢ ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，Ｓｅｒａｃａｒｅ）溶液をイムノプレートに１００μｌずつ分注し、常温の暗所で１５分間反応させた後、１Ｎ Ｈ２ＳＯ４溶液をイムノプレートに１００μｌずつ分注して反応を停止し、ＥＬＩＳＡリーダー（ｒｅａｄｅｒ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。
その結果、図６Ａから確認できるように、ｍＲＮＡ→リポソームの順序で混合して製造した複合体においてＩＦＮ－γ濃度が最も高かった。
６－２．抗体力価（ＩｇＧ ｔｉｔｅｒｓ）
最後の投与２週後にアバチンワーキング溶液（Ａｖｅｒｔｉｎ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を２５０ｍｇ／ｋｇで腹腔投与して麻酔させ、心臓採血で全血を採取した。採取された全血をマイクロチューブに移して常温に３時間静置した後、４℃、１５，０００ｒｐｍの条件で１０分間遠心分離し、上澄液を新しいマイクロチューブに移して血清を確保し、分析前まで－２０℃に保管した。
次に、１Ｘ ＰＢＳを用いてＲＢＤ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）抗原（Ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，ＵＳＡ）を１μｇ／ｍＬに希釈した後、イムノプレート（ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ）に１００μｌ／ウェルずつ分注し、シーリングフィルムを覆って４℃に一晩静置した。ＥＬＩＳＡウォッシャー（Ｔｅｃａｎ／Ｈｙｄｒｏｆｌｅｘｅｌｉｓａ）で各ウェルの溶液を除去し、洗浄バッファ（２０Ｘ ＰＢＳを精製水で希釈した１Ｌの１Ｘ ＰＢＳに５００μｌのｔｗｅｅｎ２０を投入）を用して５回洗浄した。イムノプレートに試薬希釈剤（ｒｅａｇｅｎｔ ｄｉｌｕｅｎｔ，１％ ＢＳＡ、１ｇのＢＳＡを１００ｍＬのＰＢＳに溶かして製造）を２００μｌ／ウェルずつ分注し、シーリングフィルムを覆って３７℃反応器で１時間静置した。ＥＬＩＳＡウォッシャーで各ウェルの溶液を除去し、洗浄バッファで５回洗浄した。試薬希釈剤をイムノプレートに１００μｌ／ウェルずつ分注した。
試薬希釈剤（１％ ＢＳＡ）を用いて上記で確保した血清を１：５０に希釈した後、イムノプレートのＢ～Ｇの１列に１００μｌで分注し、ウェル内で数回ピペッティングして試料を混合した後、１列から１００μｌを取って２列に入れる方法で、ＥＬＩＳＡプレート上で試料を１２列まで１／２順次希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）した。この時、試験の適合性評価のために、試薬希釈剤を用いて過血清（ｈｙｐｅｒ ｓｅｒｕｍ）を１：２００に希釈した後、各イムノプレートＨの１列に１００μｌで分注し、上記のような方法で１／２順次希釈した。
イムノプレートをシーリングフィルムで覆って３７℃反応器で２時間反応させた。ＥＬＩＳＡウォッシャーで各ウェルの溶液を除去し、洗浄バッファで５回洗浄した。試薬希釈剤を用いてヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を１：５，０００に希釈した後、イムノプレートに１００μｌずつ分注し、シーリングフィルムを覆って３７℃反応器で１時間反応させた。ＥＬＩＳＡウォッシャーで各ウェルの溶液を除去し、洗浄バッファで５回洗浄した。
常温に平衡させたＴＭＢ基質溶液をイムノプレートに１００μｌずつ分注し、常温の暗所で５分間反応させた。１Ｎ Ｈ２ＳＯ４溶液をイムノプレートに１００μｌずつ分注して反応を停止し、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ／Ｅｐｏｃｈ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。
その結果、図６Ｂから確認できるように、ｍＲＮＡ→リポソームの順序で混合して製造した複合体において最も優れた抗体性免疫反応を示した。
６－３．中和抗体形成能（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ Ｎｅｕｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）（％）分析
１．５ｍＬマイクロチューブに、陰性対照群（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）（ＤＭＥＭ培地）、又は前記実施例６－２で確保して－２０℃に保管中である免疫化したマウス血清サンプル６０μＬをそれぞれ、１：１０００希釈されたＨＲＰ標識ＲＢＤ ６０μｌと混合した後に３７℃で３０分間反応させ、マイクロタイターテストストリッププレート（Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｔｅｓｔ ｓｔｒｉｐ ｐｌａｔｅ）に１００μｌを分注した後、シーリングフィルムを覆って３７℃で１５分間反応させた。ＥＬＩＳＡウォッシャーで各ウェルの溶液を除去し、１Ｘ洗浄溶液で４回洗浄した。ＴＭＢ溶液を１００μｌ／ウェルずつ分注し、シーリングフィルムを覆って常温の暗所で１５分間反応させた後、停止溶液を５０μｌ／ウェルずつ分注して反応を停止させた後、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４０５ｎｍで光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）を測定した。
その結果、図６Ｃから確認できるように、ｍＲＮＡ→リポソームの順序で混合して製造した複合体において、最も高いレベルの中和抗体力価誘導能を示した。
小結
ｍＲＮＡ－リポソーム複合体の製造時に、混合方法によってｉｎ ｖｉｖｏ発現及び免疫原性誘導能が変わり、ｍＲＮＡ→リポソームの順で混合する時に最も優れた効果を示した。
製造例４．リポソーム、ｍＲＮＡ及び免疫増強剤の混合順序が調節されたｍＲＮＡ－リポソーム複合体製造
４－１．リポソーム、ｍＲＮＡ及び免疫増強剤が含まれたｍＲＮＡ－リポソーム複合体
前記製造例１で免疫増強剤ｄＬＯＳ（ｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄ Ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）（ＴＬＲ４ ａｇｏｎｉｓｔ；アイジン（株）、韓国）をさらに混合してｍＲＮＡ－リポソーム複合体を製造した。
４－２．リポソーム、ｍＲＮＡ及び免疫増強剤の混合順序調節
前記製造例１の－７０℃に保管されていた１ｍｇ／ｍＬのレニラルシフェラーゼｍＲＮＡ溶液、及び冷蔵保管されたリポソーム溶液（ＬＰ－ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール（４０：４０：２０，ｗ／ｗ／ｗ））及び４％スクロース含有の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ７．４）を使用した。さらに、免疫増強剤ｄＬＯＳを使用した。前記３つの溶液（ｍＲＮＡ、リポソーム及びｄＬＯＳ）の混合順序を組合せ可能な場合の数である、下記の６つの方法で試料を混合した：
ａ：リポソーム→ｍＲＮＡ→ｄＬＯＳ
ｂ：リポソーム→ｄＬＯＳ→ｍＲＮＡ
ｃ：ｍＲＮＡ→リポソーム→ｄＬＯＳ
ｄ：ｍＲＮＡ→ｄＬＯＳ→リポソーム
ｅ：ｄＬＯＳ→リポソーム→ｍＲＮＡ
ｆ：ｄＬＯＳ→ｍＲＮＡ→リポソーム
具体的には、ＲＮＡ専用２００Ｐチップ（ｔｉｐ）を用いて４％スクロース含有の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ７．４）定量を取ってマイクロチューブに分注した。２００Ｐチップを用いて一番目の溶液定量を取ってバッファの分注されたマイクロチューブに入れた後、約１０回ピペッティングした。２００Ｐチップを用いて二番目の溶液定量を取ってバッファの分注されたマイクロチューブに入れた後、約１０回ピペッティングした。２００Ｐチップを用いて三番目の溶液定量を取ってバッファの分注されたマイクロチューブに入れた後、約１０回ピペッティングした。最後に、１０００Ｐチップを用いて３０回ピペッティングして混合した。
実施例７：免疫増強剤含有量別ｍＲＮＡ発現確認
前記製造例４－１において免疫増強剤ｄＬＯＳを含有量を異ならせて添加してリポソーム－ｍＲＮＡ複合体のｉｎ ｖｉｖｏで発現率を確認した。この時、ｄＬＯＳは、０．２５μｇ、０．５μｇ、０．７５μｇ及び１μｇを添加したし、ｉｎ ｖｉｖｏ発現確認は、前記実施例１と同じ方法で行った。
その結果、図７に示すように、ｄＬＯＳ添加量は０．２５μｇ以上、１μｇ以下の場合に発現量が増加することが見られた。
実施例８：リポソーム、ｍＲＮＡ及び免疫増強剤の混合順序によるｍＲＮＡ発現確認
前記製造例４－２で製造された各リポソーム－ｍＲＮＡ複合体に対して、前記実施例１と同じ方法でｉｎ ｖｉｖｏ発現を確認した。
その結果、図８に示すように、ｄＬＯＳ→ｍＲＮＡ→リポソームの順序で混合した組成物を投与したマウスにおいて相対的に高い発現量を確認した。
実施例９：ｍＲＮＡ－リポソーム複合体の時間による安定性（物理化学的性質）変化確認
［０ＥＧＦＰ］
ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（配列番号２）とリポソーム（ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：コレステロール ４０：４０：２０，ｗ／ｗ／ｗ）の複合体を対象に、製造後の時間の経過による物理化学的性質変化をＤＬＳ測定から確認した。
具体的には、前記製造されたＥＧＦＰ ｍＲＮＡ－リポソーム複合体を凍結乾燥剤形の状態で９週間冷蔵保管しながら毎週、サイズ、ゼータ電位及びＰＤＩを測定した。
その結果、図９から確認できるように、ＮＰ比率１．３９：１以下において、９週間安定していることが分かった。
［０ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ］
液状剤形と凍結乾燥剤形のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ｍＲＮＡ（配列番号３）とリポソーム（ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：コレステロール ４０：４０：２０，ｗ／ｗ／ｗ）の複合体を対象に、製造後の時間の経過による物理化学的性質変化をＤＬＳ測定から確認した。
具体的には、前記製造されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ｍＲＮＡ－リポソーム複合体を１６週間冷蔵保管しながら一定期間別（０、２、４、８、１２、１６週）に、サイズ、ゼータ電位、ＰＤＩを測定した。
その結果、表７（液状剤形）及び表８（凍結乾燥剤形）から確認できるように、液状剤形と凍結乾燥剤形のいずれも１６週間安定していることが分かった。

［産業上の利用可能性］
本発明は、ｍＲＮＡ体内伝達用組成物に関し、具体的には、陽イオン性脂質ベースのリポソームを含むｍＲＮＡ体内伝達用組成物及びその製造方法に関する。
ｍＲＮＡの使用量を異ならせて製造したリポソーム－ｍＲＮＡ複合体のマウスにおけるｍＲＮＡの発現を確認した結果である。
ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥの比率を異ならせて製造したリポソームを使用したリポソーム－ｍＲＮＡ複合体のマウスにおけるｍＲＮＡの発現を確認した結果である。
ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：コレステロールの比率を異ならせて製造したリポソームを使用したリポソーム－ｍＲＮＡ複合体のマウスにおけるｍＲＮＡの発現を確認した結果である。
ｍＲＮＡ及びリポソームの混合順序を異ならせて製造したｍＲＮＡ－リポソーム複合体の試料のサイズ、分散度、ゼータ電位を分析した結果である。
ｍＲＮＡ及びリポソームの混合順序によるｍＲＮＡの発現差をｉｎ ｖｉｖｏで確認した結果である。
ｍＲＮＡ及びリポソームの混合順序を異ならせて製造したｍＲＮＡ－リポソーム複合体でマウスを免疫化した後、細胞性免疫反応を確認した結果である。
ｍＲＮＡ及びリポソームの混合順序を異ならせて製造したｍＲＮＡ－リポソーム複合体でマウスを免疫化した後、抗体性免疫反応を確認した結果である。
ｍＲＮＡ及びリポソームの混合順序を異ならせて製造したｍＲＮＡ－リポソーム複合体でマウスを免疫化した後、中和抗体力価を確認した結果である。
ｄＬＯＳ使用量を異ならせて製造したリポソーム－ｍＲＮＡ複合体のマウスにおけるｍＲＮＡの発現を確認した結果である。
ｍＲＮＡ、リポソーム、及びｄＬＯＳの混合順序を異ならせて製造したｍＲＮＡ－リポソーム－ｄＬＯＳ複合体をマウスに注射した時に、ｍＲＮＡの発現を確認した結果である（ＬＰ：リポソーム；Ｒ：ｍＲＮＡ；ｄＬ：ｄＬＯＳ）
Ｎ／Ｐ比率を異ならせて製造したｍＲＮＡ－リポソーム複合体の安定性を測定するために、保管期間別にサイズを測定した結果である。
Ｎ／Ｐ比率を異ならせて製造したｍＲＮＡ－リポソーム複合体の安定性を測定するために、保管期間別に分散度を測定した結果である。
Ｎ／Ｐ比率を異ならせて製造したｍＲＮＡ－リポソーム複合体の安定性を測定するために、保管期間別にゼータ電位を測定した結果である。

Claims (19)

  1. 陽イオン性脂質ベースリポソームを含むｍＲＮＡ伝達用組成物。
  2. 前記リポソームが中性脂質をさらに含むものである、請求項１に記載のｍＲＮＡ伝達用組成物。
  3. 前記リポソームがコレステロールをさらに含むものである、請求項２に記載のｍＲＮＡ伝達用組成物。
  4. 前記陽イオン性脂質は、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタンカバモイルコレステロール（３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）ｃａｒｂａｍｏｙｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ，ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、１，２－ジオレオイルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリエチルアンモニウムプロパン（１，２－ｄｉ－Ｏ－ｏｃｔａｄｅｃｅｎｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｒｏｐａｎｅ，ＤＯＴＭＡ）、１，２－ジミリストレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１，２－ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，１４：１ Ｅｔｙｌｅ ＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，１６：０－１８：１ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，１８：１ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎ，１８：０ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１，２－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，１６：０ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１，２－ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，１４：０ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１，２－ｄｉｌａｕｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎ，１２：０ Ｅｔｈｙｌ ＰＣ）、Ｎ１－［２－（（１Ｓ）－１－［（３－アミノプロピル）アミノ］－４－［ジ（３－アミノ－プロピル）アミノ］ブチルカルボキサミド）エチル］－３，４－ジ［オレイルオキシ］－ベンザミド（Ｎ１－［２－（（１Ｓ）－１－［（３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏ］－４－［ｄｉ（３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｕｔｙｌｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］－３，４－ｄｉ［ｏｌｅｙｌｏｘｙ］－ｂｅｎｚａｍｉｄｅ，ＭＶＬ５）、１，２－ジミリストイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（１，２－ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ－３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｐｒｏｐａｎｅ，１４：０ ＤＡＰ）、１，２－ジパルミトイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（１，２－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ－３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ，１６：０ ＤＡＰ）、１，２－ジステアロイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ，１８：０ ＤＡＰ）、Ｎ－（４－カルボキシベンジル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（オレオイルオキシ）プロパン－１－アミニウム（Ｎ－（４－ｃａｒｂｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）－Ｎ，Ｎｄｉｍｅｔｈｙｌ－２，３－ｂｉｓ（ｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎ－１－ａｍｉｎｉｕｍ，ＤＯＢＡＱ）、１，２－ステアロイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（１，２－ｓｔｅａｒｏｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ，１８：０ ＴＡＰ）、１，２－ジパルミトイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（１，２－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｐｒｏｐａｎｅ，１６：０ ＴＡ）、１，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（１，２－ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ，１４：０ ＴＡＰ）及びＮ４－コレステリル－スペルミン（Ｎ４－Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ－Ｓｐｅｒｍｉｎｅ，ＧＬ６７）からなる群から選ばれる一つ以上である、請求項１に記載のｍＲＮＡ伝達用組成物。
  5. 前記中性脂質は、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（１，２－Ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，ＤＯＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１，２－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＰＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＳＰＣ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１，２－ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，ＤＬＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスホエタノラミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスホリックアシッド（ＰＡ）及びホスファチジルコリン（ＰＣ）からなる群から選ばれる一つ以上である、請求項２に記載のｍＲＮＡ伝達用組成物。
  6. 前記陽イオン性脂質と中性脂質の重量比は、１：９～９．５：０．５である、請求項２に記載のｍＲＮＡ伝達用組成物。
  7. 前記陽イオン性脂質とコレステロールの重量比は、６：１～１：３である、請求項３に記載のｍＲＮＡ伝達用組成物。
  8. 前記陽イオン性脂質、中性脂質及びコレステロールの重量比は、１～９．５：９～０．５：０．０５～３である、請求項７に記載のｍＲＮＡ伝達用組成物。
  9. 前記ｍＲＮＡは、免疫原として作用可能なペプチド又はタンパク質をコードする、請求項１に記載のｍＲＮＡ伝達用組成物。
  10. 前記リポソームとｍＲＮＡのＮ：Ｐ比率は、０．２３：１～１．３９：１である、請求項９に記載のｍＲＮＡ伝達用組成物。
  11. 前記組成物は、免疫増強剤をさらに含む、請求項１に記載のｍＲＮＡ伝達用組成物。
  12. 前記免疫増強剤は、ＰＡＭＰ、サポニン、ＣｐＧ ＤＮＡ、リポタンパク質、フラジェラ（ｆｌａｇｅｌｌａ）、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ，スクアレン（Ｓｑｕａｌｅｎｅ）、トリカプリン（ｔｒｉｃａｐｒｉｎ）、３Ｄ－ＭＰＬ、及び非毒性リポオリゴサッカライド（ｄｅｔｏｘｉｅｄ ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ｄＬＯＳ）からなる群から選ばれる一つ以上である、請求項１１に記載のｍＲＮＡ伝達用組成物。
  13. 請求項１～１２のいずれかに記載のｍＲＮＡ伝達用組成物を有効成分として含有する癌、腫瘍、自己免疫疾患、遺伝疾患、炎症性疾患、ウイルス感染及びバクテリア感染からなる群から選ばれる疾病の予防又は治療用薬剤学的組成物。
  14. 請求項１～１２のいずれかに記載のｍＲＮＡ伝達用組成物を有効成分として含有するワクチン。
  15. 請求項１～１２のいずれかに記載のｍＲＮＡ伝達用組成物を有効成分として含有する機能性化粧料組成物。
  16. ｍＲＮＡ及びリポソームを混合する段階を含む、ｍＲＮＡ伝達用組成物の製造方法。
  17. 前記方法は、ｍＲＮＡ、リポソームの順序で投入して混合する、請求項１６に記載のｍＲＮＡ伝達用組成物の製造方法。
  18. 前記方法は、免疫増強剤を混合する段階をさらに含む、請求項１６に記載のｍＲＮＡ伝達用組成物の製造方法。
  19. 前記方法は、免疫増強剤、ｍＲＮＡ、リポソームの順序で投入して混合する、請求項１８に記載のｍＲＮＡ伝達用組成物の製造方法。
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