BR112020007470A2 - métodos para produzir um colóide de lipossoma, para preparar partículas, para a fabricação de fluxo contínuo, para preparar uma composição congelada e para preparar uma composição aquosa, colóide de lipossoma, composições, composição congelada e composição aquosa - Google Patents

Abstract

a presente invenção se refere a métodos para a preparação de partículas de lipoplexo de rna para entrega de rna a tecidos alvo após administração parenteral, em particular após administração intravenosa, e composições compreendendo essas partículas de lipoplexo de rna. a presente invenção também se refere a métodos que permitem a preparação de partículas de lipoplexo de rna de uma maneira industrial em conformidade com bpf. além disso, a presente invenção se refere a métodos e composições para armazenar partículas de lipoplexo de rna sem perda substancial da qualidade do produto e, em particular, sem perda substancial da atividade de rna.

Description

“MÉTODOS PARA PRODUZIR UM COLÓIDE DE LIPOSSOMA, PARA PREPARAR PARTÍCULAS, PARA A FABRICAÇÃO DE FLUXO CONTÍNUO, PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO CONGELADA E PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO AQUOSA, COLÓIDE DE LIPOSSOMA, COMPOSIÇÕES, COMPOSIÇÃO CONGELADA E COMPOSIÇÃO AQUOSA” CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção se refere a métodos para a preparação de partículas de lipoplexo de RNA para entrega de RNA a tecidos alvo após administração parenteral, em particular após administração intravenosa, e composições compreendendo essas partículas de lipoplexo de RNA. A presente invenção também se refere a métodos que permitem a preparação de partículas de lipoplexo de RNA de uma maneira industrial em conformidade com BPF. Além disso, a presente invenção se refere a métodos e composições para armazenar partículas de lipoplexo de RNA sem perda substancial da qualidade do produto e, em particular, sem perda substancial da atividade de RNA. As formulações de partículas de lipoplexo de RNA descritas aqui podem ser congeladas ou desidratadas por criodessecação, secagem por pulverização ou métodos relacionados, permitindo obter maior prazo de validade dos produtos em comparação com o armazenamento de líquidos. As partículas de lipoplexo de RNA em uma forma de realização compreendem RNA de fita simples, tal como mRNA que codifica um peptídeo ou proteína de interesse, tal como um peptídeo ou proteína farmaceuticamente ativo. O RNA é absorvido pelas células de um tecido alvo e o RNA é traduzido no peptídeo ou proteína codificados, que pode exibir sua atividade fisiológica. O peptídeo ou proteína de interesse pode ser um peptídeo ou proteína compreendendo um ou mais epítopos para induzir ou intensificar uma resposta imune direcionada contra o um ou mais epítopos. Os métodos e composições aqui descritos são adequados para uso de uma maneira que atenda aos requisitos para produtos farmacêuticos, mais especificamente que atenda aos requisitos para fabricação de BPF e aos requisitos para a qualidade de produtos farmacêuticos para aplicação parenteral.

ANTECEDENTES

[002] O uso de RNA para a entrega de informações genéticas externas nas células-alvo oferece uma alternativa atraente ao DNA. As vantagens do uso de RNA incluem expressão transitória e um caráter não transformador. O RNA não precisa entrar no núcleo para ser expresso e, além disso, não pode se integrar ao genoma do hospedeiro, eliminando assim o risco de oncogênese.

[003] O RNA pode ser entregue pelas chamadas formulações de lipoplexo, nas quais o RNA está ligado a lipossomas compostos por uma mistura de um lipídio catiônico e lipídio auxiliar para formar formulações de nanopartículas injetáveis. O desenvolvimento de formulações para a entrega de RNA biologicamente ativo a um tecido alvo, mesmo após o armazenamento das formulações, é, no entanto, uma necessidade não atendida. Além disso, o desenvolvimento de métodos para a fabricação em conformidade com BPF de formulações de partículas de lipoplexo de RNA injetáveis, onde é fornecido um prazo de validade longo, ainda é uma necessidade não atendida.

[004] Assim, há uma necessidade de fornecer formulações para a entrega de RNA biologicamente ativo a um tecido alvo em que o RNA entregue seja eficientemente traduzido no peptídeo ou proteína que codifica.

Além disso, há uma necessidade de fornecer tais formulações que sejam de longa duração sem perda substancial da qualidade do produto e, em particular, sem perda substancial da atividade biológica do RNA.

[005] Os inventores verificaram surpreendentemente que as formulações de partículas de lipoplexo de RNA aqui descritas cumprem os requisitos acima mencionados.

DESCRIÇÃO RESUMIDA I. MÉTODOS PARA PREPARAR PARTÍCULAS DE LIPOPLEXO DE RNA, PARTÍCULAS DE LIPOPLEXO DE RNA E COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO PARTÍCULAS DE LIPOPLEXO DE RNA

[006] Em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a métodos para a preparação de partículas de lipoplexo de RNA com atividade biológica aprimorada, partículas de lipoplexo de RNA preparadas de acordo com a invenção e composições compreendendo essas partículas de lipoplexo de RNA. As partículas de lipoplexo de RNA e composições compreendendo partículas de lipoplexo de RNA são úteis para a entrega de RNA a um tecido alvo após administração parenteral, em particular após administração intravenosa. As partículas de lipoplexo de RNA são preparadas usando lipossomas que são obtidos por injeção de uma solução altamente concentrada dos lipídios em etanol em água ou em uma fase aquosa adequada. Em uma forma de realização, o produto de lipoplexo de RNA é caracterizado por um padrão específico no espalhamento de raios X, onde é observado um único pico de Bragg a cerca de 1 nm-1, onde a largura do pico é menor que 0,2 nm-1.

[007] Em uma forma de realização, os lipossomas e as partículas de lipoplexo de RNA compreendem 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamônio propano (DOTMA) e 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE). A concentração de DOPE na mistura lipídica é maior que a solubilidade de equilíbrio do DOPE em etanol sozinho. À temperatura ambiente, o DOPE sozinho possui uma solubilidade de cerca de 50 mM, em conjunto com o DOTMA possui uma solubilidade de 100 mM ou superior. As soluções lipídicas para formar lipossomas, a partir das quais são obtidos lipoplexos altamente ativos, podem ter uma concentração lipídica total de 270 mM ou superior (por exemplo, DOPE a 90 mM ou superior). Soluções de concentração ainda maior em etanol podem ser obtidas aumentando a temperatura. Os lipossomas obtidos a partir de soluções lipídicas em que a concentração do DOPE está acima da solubilidade de equilíbrio são significativamente maiores que os lipossomas das soluções lipídicas em que a concentração do DOPE está na solubilidade de equilíbrio e abaixo. O tamanho do lipossoma aumenta monotonamente com a concentração em etanol.

[008] Os lipossomas preparados de acordo com a invenção podem ser utilizados para preparar partículas de lipoplexo de RNA misturando os lipossomas com RNA. Em uma forma de realização, o RNA é incubado com NaCl antes da mistura, a fim de ajustar uma certa força iônica, necessária para o aumento da atividade dos lipoplexos. Os lipoplexos que são formados a partir desses lipossomas maiores possuem atividade biológica significativamente mais alta, como demonstrado por experimentos in vitro e in vivo. Esses lipoplexos com atividade mais alta podem ser claramente diferenciados daqueles com atividade mais baixa por certos parâmetros físico-químicos, por exemplo (i) uma largura de pico menor do pico de Bragg e (ii) um perfil de separação diferente em métodos analíticos dispersivos para medições de tamanho, como fracionamento de fluxo de campo. Lipoplexos com menor atividade são menores em média. Além disso, eles também possuem um perfil de eluição diferente, que está provavelmente relacionado a parâmetros como a conformação molecular, forma e as interações com a fase a granel.

[009] Por conseguinte, neste aspecto, a invenção se refere a um método para produzir um colóide de lipossoma que compreende injetar uma solução lipídica em etanol em uma fase aquosa para produzir o colóide de lipossoma, em que a concentração de pelo menos um dos lipídios na solução lipídica corresponde a ou é maior que a solubilidade de equilíbrio do pelo menos um lipídio em etanol.

[010] Em uma forma de realização, o método compreende o aquecimento da solução lipídica para aumentar a concentração de lipídios na solução lipídica. Em uma forma de realização, a solução lipídica é aquecida a uma temperatura de pelo menos cerca de 40 °C ou pelo menos cerca de 60 °C.

[011] Em uma forma de realização, a solução lipídica é uma solução de uma mistura de dois ou mais lipídios diferentes.

[012] Em uma forma de realização, a concentração de um lipídio na solução lipídica corresponde a ou é maior que a solubilidade de equilíbrio do lipídio em etanol.

[013] Em uma forma de realização, a concentração lipídica total na solução lipídica é de cerca de 180 mM a cerca de 600 mM, de cerca de 300 mM a cerca de 600 mM, ou cerca de 330 mM.

[014] Em uma forma de realização, a solução lipídica compreende pelo menos um lipídio catiônico e pelo menos um lipídio adicional.

[015] Em uma forma de realização, a concentração de um lipídio adicional na solução lipídica corresponde a ou é maior que a solubilidade de equilíbrio do lipídio adicional em etanol.

[016] Em uma forma de realização, o pelo menos um lipídio catiônico compreende 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamônio propano (DOTMA) e/ ou 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano (DOTAP).

[017] Em uma forma de realização, o pelo menos um lipídio adicional compreende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), colesterol (Chol) e/ ou 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC).

[018] Em uma forma de realização, o pelo menos um lipídio catiônico compreende 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamônio propano (DOTMA) e o pelo menos um lipídio adicional compreende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn- glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE).

[019] Em uma forma de realização, a razão molar do pelo menos um lipídio catiônico para o pelo menos um lipídio adicional é de cerca de 10:0 a cerca de 1:9, de cerca de 4:1 a cerca de 1:2, de cerca de 3:1 a cerca de 1:1 ou cerca de 2:1.

[020] Em uma forma de realização, a solução lipídica compreende DOTMA e DOPE em uma razão molar de cerca de 10:0 a cerca de 1:9, de cerca de 4:1 a cerca de 1:2, de cerca de 3:1 a cerca de 1:1, ou cerca de 2:1.

[021] Em uma forma de realização, a concentração de DOPE na solução lipídica é de pelo menos cerca de 60 mM ou pelo menos cerca de 90 mM.

[022] Em uma forma de realização, a solução lipídica é injetada na fase aquosa a uma velocidade de agitação da fase aquosa de cerca de 50 rpm a cerca de 150 rpm.

[023] Em uma forma de realização, a fase aquosa é água.

[024] Em uma forma de realização, a fase aquosa possui um pH ácido. Em uma forma de realização, a fase aquosa compreende ácido acético, por exemplo, em uma quantidade de cerca de 5 mM.

[025] Em uma forma de realização, o método compreende ainda a agitação do colóide de lipossoma.

[026] Em uma forma de realização, o colóide de lipossoma é agitado por cerca de 15 minutos a cerca de 60 minutos ou por cerca de 30 minutos.

[027] A invenção se refere ainda a um método para produzir um colóide de lipossoma compreendendo injetar uma solução lipídica compreendendo DOTMA e DOPE em uma razão molar de cerca de 2:1 em etanol em água agitada a uma velocidade de agitação de cerca de 150 rpm para produzir o colóide de lipossoma, em que a concentração de DOTMA e DOPE na solução lipídica é de cerca de 330 mM.

[028] Em uma forma de realização, o método de produção de um lipossoma não compreende a etapa de extrusão dos lipossomas.

[029] A invenção se refere ainda a um colóide de lipossoma que é obtenível pelo método de produção de um lipossoma.

[030] Em uma forma de realização, os lipossomas possuem um diâmetro médio de pelo menos cerca de 250 nm.

[031] Em uma forma de realização, os lipossomas possuem um diâmetro médio que varia de cerca de 250 nm a cerca de 800 nm.

[032] Em uma forma de realização, os lipossomas possuem um índice de polidispersidade menor que cerca de 0,5, menor que cerca de 0,4 ou menor que cerca de 0,3.

[033] Em uma forma de realização, os lipossomas são lipossomas catiônicos.

[034] Em uma forma de realização, os lipossomas compreendem pelo menos um lipídio catiônico e pelo menos um lipídio adicional.

[035] Em uma forma de realização, o pelo menos um lipídio catiônico compreende 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamônio propano (DOTMA) e/ ou 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano (DOTAP).

[036] Em uma forma de realização, o pelo menos um lipídio adicional compreende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), colesterol (Chol) e/ ou 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC).

[037] Em uma forma de realização, o pelo menos um lipídio catiônico compreende 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamônio propano (DOTMA) e o pelo menos um lipídio adicional compreende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn- glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE).

[038] Em uma forma de realização, a razão molar do pelo menos um lipídio catiônico para o pelo menos um lipídio adicional é de cerca de 10:0 a cerca de 1:9, de cerca de 4:1 a cerca de 1:2, de cerca de 3:1 a cerca de 1:1 ou cerca de 2:1.

[039] Em uma forma de realização, os lipossomas compreendem DOTMA e DOPE em uma razão molar de cerca de 10:0 a cerca de 1:9, de cerca de 4:1 a cerca de 1:2, de cerca de 3:1 a cerca de 1:1 ou cerca de 2:1.

[040] A invenção se refere ainda a um método para preparar partículas de lipoplexo de RNA compreendendo adicionar o colóide de lipossoma acima a uma solução compreendendo RNA.

[041] Em uma forma de realização, em um padrão de espalhamento de raios X, os lipoplexos de RNA são caracterizados por um único pico de Bragg a cerca de 1 nm-1, em que a largura do pico é menor que 0,2 nm-1.

[042] Em uma forma de realização, as partículas de lipoplexo de RNA possuem um diâmetro médio que varia de cerca de 200 a cerca de 800 nm, de cerca de 250 a cerca de 700 nm, de cerca de 400 a cerca de 600 nm, de cerca de 300 nm a cerca de 500 nm ou de cerca de 350 nm a cerca de 400 nm.

[043] A invenção se refere ainda a uma composição compreendendo partículas de lipoplexo de RNA que são obteníveis como descrito acima.

[044] Em uma forma de realização, as partículas de lipoplexo de RNA compreendem pelo menos um lipídio catiônico e pelo menos um lipídio adicional.

[045] Em uma forma de realização, o RNA codifica um peptídeo ou proteína compreendendo pelo menos um epítopo, em que a razão de cargas positivas para cargas negativas nas partículas de lipoplexo de RNA é de cerca de 1:2 a cerca de 1,9:2, ou cerca de 1,3:2,0.

[046] A invenção se refere ainda a uma composição que compreende: - partículas de lipoplexo de RNA compreendendo: RNA que codifica um peptídeo ou proteína que compreende pelo menos um epítopo; e pelo menos um lipídio catiônico e pelo menos um lipídio adicional; em que a razão de cargas positivas para cargas negativas nas partículas de lipoplexo de RNA é de cerca de 1:2 a cerca de 1,9:2 ou cerca de 1,3:2,0; e em que as partículas de lipoplexo de RNA são caracterizadas por um único pico de Bragg a cerca de 1 nm-1, em que a largura do pico é menor que 0,2 nm-1.

[047] Em uma forma de realização, a composição compreende ainda cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 300 mM, de cerca de 45 mM a cerca de 300 mM, de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM ou de cerca de 80 mM a cerca de 150 mM.

[048] Em uma forma de realização, a composição compreende ainda um tampão.

[049] Em uma forma de realização, a composição compreende ainda um agente quelante.

[050] Em uma forma de realização, as partículas de lipoplexo de RNA descritas neste aspecto em I. possuem um diâmetro médio que varia de cerca de 200 a cerca de 800 nm, de cerca de 250 a cerca de 700 nm, de cerca de 400 a cerca de 600 nm, de cerca de 300 nm a cerca de 500 nm, ou de cerca de 350 nm a cerca de 400 nm.

[051] Em uma forma de realização, as partículas de lipoplexo de RNA possuem um índice de polidispersidade menor que cerca de 0,5, menor que cerca de 0,4 ou menor que cerca de 0,3.

[052] Em uma forma de realização, o pelo menos um lipídio catiônico compreende 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamônio propano (DOTMA) e/ ou 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano (DOTAP).

[053] Em uma forma de realização, o pelo menos um lipídio adicional compreende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), colesterol (Chol) e/ ou 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC).

[054] Em uma forma de realização, o pelo menos um lipídio catiônico compreende 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamônio propano (DOTMA) e o pelo menos um lipídio adicional compreende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn- glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE).

[055] Em uma forma de realização, a razão molar do pelo menos um lipídio catiônico para o pelo menos um lipídio adicional é de cerca de 10:0 a cerca de 1:9, de cerca de 4:1 a cerca de 1:2, de cerca de 3:1 a cerca de 1:1 ou cerca de 2:1.

[056] Em uma forma de realização, as partículas de lipoplexo de RNA compreendem DOTMA e DOPE em uma razão molar de cerca de 10:0 a 1:9, de cerca de 4:1 a 1:2, de cerca de 3:1 a cerca de 1:1, ou cerca de 2:1 e em que a razão de carga de cargas positivas em DOTMA para cargas negativas no RNA é de cerca de 1:2 a 1,9:2.

[057] Em uma forma de realização, o agente quelante é o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).

[058] Em uma forma de realização, o EDTA está em uma concentração de cerca de 0,25 mM a cerca de 5 mM, ou de cerca de 2,5 mM.

[059] Em uma forma de realização, a composição compreende ainda um adjuvante.

[060] Em uma forma de realização, a composição é formulada para administração sistêmica.

[061] Em uma forma de realização, a administração sistêmica é por administração intravenosa.

[062] A invenção se refere ainda a uma composição, como descrita, para uso terapêutico.

II. MÉTODOS PARA PREPARAR PARTÍCULAS DE LIPOPLEXO DE RNA DE MANEIRA INDUSTRIAL EM CONFORMIDADE COM BPF

[063] Em um segundo aspecto, a presente invenção se refere a métodos que permitem a preparação de partículas de lipoplexo de RNA de uma maneira industrial em conformidade com BPF.

[064] Em uma forma de realização da invenção, um sistema de trajetórias de fluido é usado para a fabricação BPF do produto farmacêutico de partículas de lipoplexo de RNA, o que permite o controle preciso da taxa de mistura de RNA para lipossomas, o que é importante para a qualidade do produto. Em uma forma de realização, a trajetória do fluido compreende a mistura de uma solução de lipossoma e uma solução de RNA de uma maneira de 1 a 1 (volume/ volume), em que as concentrações dos componentes são selecionadas para manter precisamente a razão de carga pretendida. Em uma forma de realização, o RNA é incubado com NaCl antes da mistura, a fim de ajustar uma certa força iônica, necessária para a atividade dos lipoplexos. Em uma forma de realização, é realizada uma configuração de mistura do tipo Y, que é totalmente baseada em materiais de uso único. A dinâmica dos fluidos é otimizada para manter as características das partículas e evitar obstrução. Por outro lado, ao usar dispositivos microfluídicos disponíveis comercialmente, a obstrução ocorre após algum tempo, o que torna impossível a solicitação de BPF.

[065] Em uma forma de realização, os lipoplexos são fabricados incubando o RNA com lipossomas catiônicos, onde a razão de mistura e as condições de mistura são precisamente controladas usando uma bomba de seringa (bomba perfusora), onde duas seringas, uma compreendendo lipossomas e outra compreendendo RNA, são inseridas em bombas de seringa, preferencialmente em paralelo na mesma bomba. Os pistões das bombas são movidos para a frente pelo mesmo acionador, controlando precisamente os volumes relativos que são misturados. Nas condições de processo selecionadas, seringas idênticas são usadas para ambas as soluções, permitindo assim uma exata condição de mistura de um para um (v/v). Ajustando as concentrações das duas soluções antes da mistura, a razão entre RNA e lipossomas (lipídio catiônico) é então precisamente controlada.

[066] Por conseguinte, neste aspecto, a invenção se refere a um método para a fabricação de fluxo contínuo de partículas de lipoplexo de RNA compreendendo misturar uma solução compreendendo RNA e uma solução compreendendo lipossomas catiônicos sob condições controladas de mistura do RNA e dos lipossomas catiônicos.

[067] Em uma forma de realização, a solução compreendendo lipossomas catiônicos é o colóide de lipossoma como descrito acima.

[068] Em uma forma de realização, a solução compreendendo RNA e a solução compreendendo lipossomas catiônicos são soluções aquosas.

[069] Em uma forma de realização, é utilizada uma taxa de fluxo que permite a mistura da solução compreendendo RNA e da solução compreendendo lipossomas catiônicos.

[070] Em uma forma de realização, o fluxo é caracterizado por um número de Reynolds superior a 300 ou de cerca de 500 a cerca de 2100.

[071] Em uma forma de realização, as condições controladas de mistura compreendem controlar a razão de mistura da solução compreendendo RNA e da solução compreendendo lipossomas catiônicos.

[072] Em uma forma de realização, as condições controladas de mistura compreendem controlar o volume relativo da solução compreendendo RNA e da solução compreendendo lipossomas catiônicos que devem ser misturados.

[073] Em uma forma de realização, a razão de mistura do RNA e dos lipossomas catiônicos é controlada usando o volume de mistura idêntico (v/v) da solução compreendendo RNA e da solução compreendendo lipossomas catiônicos e ajustando as concentrações de RNA e lipossomas catiônicos nas respectivas soluções.

[074] Em uma forma de realização, as condições controladas de mistura são selecionadas para manter as características das partículas de lipoplexo de RNA, evitando a obstrução.

[075] Em uma forma de realização, o método compreende o uso de um elemento de mistura do tipo Y ou do tipo T.

[076] Em uma forma de realização, o elemento de mistura do tipo Y ou do tipo T possui um diâmetro de cerca de 1,2 mm a cerca de 50 mm.

[077] Em uma forma de realização, o método compreende o uso de um elemento de mistura, por exemplo, um elemento de mistura do tipo Y ou do tipo T, em que os fluidos de dois tubos ou mangueiras são reunidos e em que nenhum elemento de mistura estático interno, por exemplo, canais divididos e recombinados em padrão de zigue-zague escalonado, em zigue- zague ou torcidos ou serpentina tridimensional, estão presentes. Os elementos de mistura podem ter diâmetros entre 1,2 e 50,0 mm.

[078] Em uma forma de realização, o método compreende o uso de um dispositivo, onde duas seringas, uma compreendendo a solução compreendendo lipossomas catiônicos e outra compreendendo a solução compreendendo RNA, são inseridas em paralelo no mesmo ou em dois recipientes, e os pistões do dispositivo são ressaltados por um ou dois acionadores de precisão. Em uma forma de realização, o método compreende o uso de uma bomba de seringa, em que duas seringas, uma compreendendo a solução compreendendo lipossomas catiônicos e outra compreendendo a solução compreendendo RNA, são inseridas em paralelo na mesma bomba.

[079] Em uma forma de realização, o método compreende o uso de um recipiente pressurizado, uma bomba de membrana, uma bomba de engrenagem, uma bomba de levitação magnética, uma bomba peristáltica, bombas de HPLC/ FPLC ou qualquer outra bomba de pistão, opcionalmente em combinação com sensores de taxa de fluxo opcionalmente com circuito de realimentação para controle em linha e ajuste em tempo real da taxa de fluxo.

[080] Em uma forma de realização, a mistura da solução compreendendo RNA e da solução compreendendo lipossomas compreende cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 45 mM a cerca de 300 mM, ou compreende uma força iônica correspondente a cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 45 mM a cerca de 300 mM.

[081] Em uma forma de realização, a solução de RNA compreende cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 90 mM a cerca de 600 mM, ou compreende uma força iônica correspondente a cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 90 mM a cerca de 600 mM.

[082] Em uma forma de realização, a mistura da solução compreendendo RNA e da solução compreendendo lipossomas tem uma força iônica de pelo menos cerca de 50 mM.

[083] Em uma forma de realização, em um padrão de espalhamento de raios X, os lipoplexos de RNA são caracterizados por um único pico de Bragg a cerca de 1 nm-1, em que a largura do pico é menor que 0,2 nm-1.

[084] Em uma forma de realização, as partículas de lipoplexo de RNA possuem um diâmetro médio que varia de cerca de 200 a cerca de 800 nm, de cerca de 250 a cerca de 700 nm, de cerca de 400 a cerca de 600 nm, de cerca de 300 nm a cerca de 500 nm ou de cerca de 350 nm a cerca de 400 nm.

[085] A invenção se refere ainda a uma composição compreendendo partículas de lipoplexo de RNA que são obteníveis como descrito acima.

[086] Em uma forma de realização, as partículas de lipoplexo de RNA compreendem pelo menos um lipídio catiônico e pelo menos um lipídio adicional.

[087] Em uma forma de realização, o RNA codifica um peptídeo ou proteína compreendendo pelo menos um epítopo, em que a razão de cargas positivas para cargas negativas nas partículas de lipoplexo de RNA é de cerca de 1:2 a cerca de 1,9:2, ou cerca de 1,3:2,0.

[088] A invenção se refere ainda a uma composição que compreende: - partículas de lipoplexo de RNA compreendendo: RNA que codifica um peptídeo ou proteína que compreende pelo menos um epítopo; e pelo menos um lipídio catiônico e pelo menos um lipídio adicional; em que a razão de cargas positivas para cargas negativas nas partículas de lipoplexo de RNA é de cerca de 1:2 a cerca de 1,9:2 ou cerca de 1,3:2,0; e em que as partículas de lipoplexo de RNA são caracterizadas por um único pico de Bragg a cerca de 1 nm -1, em que a largura do pico é menor que 0,2 nm-1.

[089] Em uma forma de realização, a composição compreende ainda cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 10 a cerca de 300 mM, de cerca de 45 mM a cerca de 300 mM, de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM ou de cerca de 80 mM a cerca de 150 mM.

[090] Em uma forma de realização, a composição compreende ainda um tampão.

[091] Em uma forma de realização, a composição compreende ainda um agente quelante.

[092] Em uma forma de realização, as partículas de lipoplexo de RNA descritas neste aspecto em II. possuem um diâmetro médio que varia de cerca de 200 a cerca de 800 nm, de cerca de 250 a cerca de 700 nm, de cerca de 400 a cerca de 600 nm, de cerca de 300 nm a cerca de 500 nm ou de cerca de 350 nm a cerca de 400 nm.

[093] Em uma forma de realização, as partículas de lipoplexo de RNA possuem um índice de polidispersidade menor que cerca de 0,5, menor que cerca de 0,4 ou menor que cerca de 0,3.

[094] Em uma forma de realização, o pelo menos um lipídio catiônico compreende 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamônio propano (DOTMA) e/ ou 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano (DOTAP).

[095] Em uma forma de realização, o pelo menos um lipídio adicional compreende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), colesterol (Chol) e/ ou 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC).

[096] Em uma forma de realização, o pelo menos um lipídio catiônico compreende 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamônio propano (DOTMA) e o pelo menos um lipídio adicional compreende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn- glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE).

[097] Em uma forma de realização, a razão molar do pelo menos um lipídio catiônico para o pelo menos um lipídio adicional é de cerca de 10:0 a cerca de 1:9, de cerca de 4:1 a cerca de 1:2, de cerca de 3:1 a cerca de 1:1 ou cerca de 2:1.

[098] Em uma forma de realização, as partículas de lipoplexo de RNA compreendem DOTMA e DOPE em uma razão molar de cerca de 10:0 a 1:9, de cerca de 4:1 a 1:2, de cerca de 3:1 a cerca de 1:1, ou cerca de 2:1 e em que a razão de carga de cargas positivas em DOTMA para cargas negativas no RNA é de cerca de 1:2 a 1,9:2.

[099] Em uma forma de realização, o agente quelante é o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).

[0100] Em uma forma de realização, o EDTA está em uma concentração de cerca de 0,25 mM a cerca de 5 mM, ou de cerca de 2,5 mM.

[0101] Em uma forma de realização, a composição compreende ainda um adjuvante.

[0102] Em uma forma de realização, a composição é formulada para administração sistêmica.

[0103] Em uma forma de realização, a administração sistêmica é por administração intravenosa.

[0104] A invenção se refere ainda a uma composição, como descrita, para uso terapêutico.

III. MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA ARMAZENAR PARTÍCULAS DE LIPOPLEXO DE RNA

[0105] Em um terceiro aspecto, a presente invenção se refere a métodos e composições para armazenar partículas de lipoplexo de RNA sem perda substancial da qualidade do produto e, em particular, sem perda substancial da atividade de RNA. Em particular, a presente invenção se refere a formulações que permitem congelamento, liofilização ou secagem por pulverização de partículas de lipoplexo de RNA sem perda substancial da qualidade das partículas de lipoplexo de RNA e, em particular, sem perda substancial da atividade de RNA.

[0106] As formulações de partículas de lipoplexo de RNA descritas aqui podem ser congeladas ou desidratadas por criodessecação, secagem por pulverização ou métodos relacionados, permitindo obter maior prazo de validade dos produtos em comparação com o armazenamento de líquidos.

[0107] Para permitir o congelamento, é adicionado um estabilizador (crioprotetor). Em uma forma de realização, os lipoplexos são diluídos com o estabilizador (crioprotetor), após a fabricação, permitindo assim ajustar a força iônica, preferencialmente para reduzir a força iônica e ajustando a concentração apropriada do estabilizador. Para o congelamento do produto, a concentração do estabilizador pode ser maior que o valor para obter a osmolalidade fisiológica. Nesse caso, para administração, o produto é diluído com uma fase aquosa adequada (por exemplo, água para injeção, solução salina), a fim de ajustar a osmolalidade e a força iônica desejadas. Como estabilizadores, açúcares como glicose, sacarose ou trealose, mas também outros compostos, como dextranos, podem ser usados.

[0108] Surpreendentemente, foi verificado, de acordo com a invenção, que uma formulação de lipoplexo de RNA compreendendo um estabilizador, como aqui descrito, também pode ser liofilizada. Para a liofilização, a concentração necessária de estabilizador (lioprotetor) pode ser menor do que para o congelamento, e a concentração tolerada de NaCl (força iônica) pode ser maior do que para o congelamento. O produto também pode ser seco por pulverização, se for necessária desidratação econômica em larga escala.

[0109] O pH de algumas das formulações de lipoplexo de RNA é ajustado para um valor que é inferior ao intervalo fisiológico usual e ao pH usual ideal para armazenamento de RNA na fase a granel. O pH ideal é de cerca de 6,2, uma faixa adequada é entre cerca de 5,7 e cerca de 6,7. Para outras formulações, o pH ideal pode ser ainda mais baixo. É levantada a hipótese de que o pH local no interior dos lipoplexos de RNA é superior ao pH da fase a granel devido às cargas positivas do lipídio catiônico.

[0110] Nessas formas de realização da invenção em que as composições de lipoplexo de RNA são congeladas para armazenamento, as composições podem ser descongeladas e opcionalmente a osmolalidade, força iônica e/ ou o pH da composição podem ser ajustados adicionando um líquido aquoso. A composição resultante pode ser administrada a um sujeito.

[0111] Nessas formas de realização da invenção em que as composições de lipoplexo de RNA são liofilizadas ou criodessecadas para armazenamento, as composições podem ser reconstituídas adicionando um líquido aquoso e, opcionalmente, a osmolalidade, força iônica e/ ou o pH da composição podem ser ajustados adicionando um líquido aquoso. A composição resultante pode ser administrada a um sujeito.

[0112] Por conseguinte, neste aspecto, a invenção se refere a um método para preparar uma composição congelada compreendendo partículas de lipoplexo de RNA compreendendo (i) fornecer uma composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA e um estabilizador e (ii) congelar a composição.

[0113] Em uma forma de realização, o congelamento é a uma temperatura de cerca de -15 °C a cerca de -40 °C, ou cerca de -30 °C.

[0114] Em uma forma de realização, a composição é armazenada, por exemplo, a uma temperatura de armazenamento de cerca de -15 °C a cerca de -40 °C, ou cerca de -20 °C.

[0115] Em uma forma de realização, o estabilizador é um carboidrato selecionado a partir de um monossacarídeo, um dissacarídeo, um trissacarídeo, um álcool de açúcar, um oligossacarídeo ou seu álcool de açúcar correspondente e um poli-álcool de cadeia linear.

[0116] Em uma forma de realização, fornecer uma composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA e um estabilizador compreende fornecer uma composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA e adicionar o estabilizador à composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA. Por conseguinte, um método de preparação de uma composição para congelamento compreende fornecer uma composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA e adicionar um estabilizador à composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA.

[0117] Em uma forma de realização, adicionar o estabilizador à composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA reduz a força iônica da composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA.

[0118] Em uma forma de realização, a concentração de estabilizador na composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA e um estabilizador é superior ao valor necessário para a osmolalidade fisiológica.

[0119] Em uma forma de realização, a concentração de estabilizador na composição aquosa compreendendo lipoplexos de RNA e um estabilizador é suficiente para manter a qualidade das partículas de lipoplexo de RNA e, em particular, para evitar perda substancial da atividade de RNA após o armazenamento da composição a uma temperatura de cerca de -15 °C a cerca de -40 °C durante pelo menos um mês, durante pelo menos 6 meses, durante pelo menos 12 meses, durante pelo menos 24 meses ou durante pelo menos 36 meses.

[0120] Em uma forma de realização, a concentração de estabilizador na composição aquosa compreendendo lipoplexos de RNA e um estabilizador é de cerca de 5% a cerca de 35,0% (p/v), de cerca de 10% a cerca de 30,0% (p/v), de cerca de 12,5% a cerca de 25,0% (p/v) ou cerca de 22,0% (p/v).

[0121] Em uma forma de realização, o pH na composição aquosa compreendendo lipoplexos de RNA e um estabilizador é menor que o pH usual ideal para armazenamento de RNA.

[0122] Em uma forma de realização, a composição aquosa compreendendo lipoplexos de RNA e um estabilizador compreende cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM, ou compreende uma força iônica correspondente a cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM.

[0123] Em uma forma de realização, a composição aquosa compreendendo lipoplexos de RNA e um estabilizador tem uma força iônica correspondente ao cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 20 mM.

[0124] Em uma forma de realização, as partículas de lipoplexo de RNA são obteníveis pelo método como descrito acima em I. e II.

[0125] Em uma forma de realização, o método de preparação de uma composição congelada compreende ainda o armazenamento da composição congelada compreendendo partículas de lipoplexo de RNA. A composição pode ser armazenada a uma temperatura que corresponde ou corresponde essencialmente à temperatura de congelamento, ou a uma temperatura que é maior ou menor que a temperatura de congelamento.

Geralmente, a composição é armazenada a uma temperatura de cerca de -15 °C a cerca de -40 °C, por exemplo, a cerca de -20 °C.

[0126] A invenção se refere ainda a uma composição compreendendo partículas de lipoplexo de RNA que é obtenível pelo método acima de preparar uma composição congelada. A invenção também se refere a uma composição compreendendo partículas de lipoplexo de RNA que é obtenível pelo método acima de preparar uma composição para congelamento.

[0127] Em uma forma de realização, as partículas de lipoplexo de RNA compreendem pelo menos um lipídio catiônico e pelo menos um lipídio adicional.

[0128] Em uma forma de realização, o RNA codifica um peptídeo ou proteína compreendendo pelo menos um epítopo, em que a razão de cargas positivas para cargas negativas nas partículas de lipoplexo de RNA é de cerca de 1:2 a cerca de 1,9:2 ou cerca de 1,3:2,0.

[0129] Em uma forma de realização, a composição compreende ainda cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM.

[0130] A invenção se refere ainda a uma composição que compreende: - partículas de lipoplexo de RNA compreendendo: RNA que codifica um peptídeo ou proteína que compreende pelo menos um epítopo; pelo menos um lipídio catiônico e pelo menos um lipídio adicional; em que a razão de cargas positivas para cargas negativas nas partículas de lipoplexo de RNA é de cerca de 1:2 a cerca de 1,9:2 ou cerca de 1,3:2,0; - cloreto de sódio em uma concentração de 0 mM a cerca de 40 mM; e - um estabilizador.

[0131] Em uma forma de realização, a composição compreende ainda um tampão.

[0132] Em uma forma de realização, a quantidade de RNA na composição é de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 1 mg/ml, cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 0,5 mg/ml ou cerca de 0,05 mg/ml.

[0133] Em uma forma de realização, o cloreto de sódio está em uma concentração de cerca de 20 mM a cerca de 30 mM.

[0134] Em uma forma de realização, o cloreto de sódio está a uma concentração de cerca de 20 mM.

[0135] Em uma forma de realização, o cloreto de sódio está a uma concentração de cerca de 30 mM.

[0136] Em uma forma de realização, a concentração de estabilizador na composição é superior ao valor necessário para a osmolalidade fisiológica.

[0137] Em uma forma de realização, a concentração de estabilizador na composição é de cerca de 5 a cerca de 35% em peso por volume (% em p/v), ou de cerca de 12,5 a cerca de 25% em peso por volume (% em p/v).

[0138] Em uma forma de realização, o estabilizador é um carboidrato selecionado a partir de um monossacarídeo, um dissacarídeo, um trissacarídeo, um álcool de açúcar, um oligossacarídeo ou seu álcool de açúcar correspondente e um poli-álcool de cadeia linear.

[0139] Em uma forma de realização, o estabilizador é sacarose em uma concentração de cerca de 5 a cerca de 25% em peso por volume (% em p/v).

[0140] Em uma forma de realização, a sacarose está em uma concentração de cerca de 15% (p/v) a cerca de 25% (p/v).

[0141] Em uma forma de realização, a sacarose está em uma concentração de cerca de 20% (p/v) a cerca de 25% (p/v).

[0142] Em uma forma de realização, a sacarose está em uma concentração de cerca de 22% (p/v).

[0143] Em uma forma de realização, a sacarose está em uma concentração de cerca de 20% (p/v).

[0144] Em uma forma de realização, a composição possui um pH que é menor que o pH usual ideal para armazenamento de RNA.

[0145] Em uma forma de realização, a composição possui um pH de cerca de 5,7 a cerca de 6,7, ou de cerca de 6,2.

[0146] Em uma forma de realização, o tampão é o ácido 2-[4-(2- hidroxietil)piperazin-1-il]etanossulfônico (HEPES).

[0147] Em uma forma de realização, o HEPES está em uma concentração de cerca de 2,5 mM a cerca de 10 mM, ou de cerca de 7,5 mM.

[0148] Em uma forma de realização, a composição compreende ainda um agente quelante.

[0149] A invenção se refere ainda a uma composição que compreende: - partículas de lipoplexo de RNA compreendendo: RNA que codifica um peptídeo ou proteína compreendendo pelo menos um epítopo a uma concentração de cerca de 0,05 mg/ml; e DOTMA e DOPE em uma razão molar de cerca de 2:1; em que a razão de cargas positivas para cargas negativas nas partículas de lipoplexo de RNA é de cerca de 1,3:2,0; - cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 20 mM; - sacarose a uma concentração de cerca de 22% (p/v); - HEPES a uma concentração de cerca de 7,5 mM com um pH de cerca de 6,2; e - EDTA a uma concentração de cerca de 2,5 mM.

[0150] Em uma forma de realização, a composição está em um estado líquido ou congelado.

[0151] Em uma forma de realização, a composição congelada é estável a uma temperatura de cerca de -15 °C a cerca de -40 °C durante pelo menos um mês, durante pelo menos 6 meses, durante pelo menos 12 meses, durante pelo menos 24 meses ou durante pelo menos 36 meses.

[0152] Em uma forma de realização, a composição congelada é estável a uma temperatura de cerca de -15 °C durante pelo menos um mês, durante pelo menos 6 meses, durante pelo menos 12 meses, durante pelo menos 24 meses ou durante pelo menos 36 meses.

[0153] Em uma forma de realização, a composição congelada é estável a uma temperatura de cerca de -15 °C durante pelo menos dois meses.

[0154] Em uma forma de realização, a composição congelada é estável a uma temperatura de cerca de -20 °C durante pelo menos um mês, durante pelo menos 6 meses, durante pelo menos 12 meses, durante pelo menos 24 meses ou durante pelo menos 36 meses.

[0155] Em uma forma de realização, a composição congelada é estável a uma temperatura de cerca de -20 °C durante pelo menos dois meses.

[0156] Em uma forma de realização, a composição congelada é estável a uma temperatura de cerca de -30 °C durante pelo menos um mês, durante pelo menos 6 meses, durante pelo menos 12 meses, durante pelo menos 24 meses ou durante pelo menos 36 meses.

[0157] Em uma forma de realização, a composição congelada é estável a uma temperatura de cerca de -30 °C durante pelo menos dois meses.

[0158] A invenção se refere ainda a uma composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA obtenível por descongelamento da composição congelada acima e, opcionalmente, ajuste da osmolalidade e força iônica adicionando um líquido aquoso.

[0159] Em uma forma de realização, a osmolalidade da composição é de cerca de 200 mOsmol a cerca de 450 mOsmol.

[0160] Em uma forma de realização, a composição compreende cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 80 mM a cerca de 150 mM.

[0161] Em uma forma de realização, as partículas de lipoplexo de RNA são obteníveis pelo método como descrito acima em I. e II.

[0162] A invenção se refere ainda a um método de preparação de uma composição desidratada, por exemplo, liofilizada ou seca por pulverização, compreendendo partículas de lipoplexo de RNA, em que o método compreende (i) fornecer uma composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA e um estabilizador e (ii) desidratar, por exemplo, liofilizar ou secar por pulverização, a composição.

[0163] Em uma forma de realização, o estabilizador é um carboidrato selecionado a partir de um monossacarídeo, um dissacarídeo, um trissacarídeo, um álcool de açúcar, um oligossacarídeo ou seu álcool de açúcar correspondente e um poli-álcool de cadeia linear.

[0164] Em uma forma de realização, fornecer uma composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA e um estabilizador compreende fornecer uma composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA e adicionar o estabilizador à composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA. Por conseguinte, um método de preparação de uma composição para desidratação, por exemplo, liofilização ou secagem por pulverização, compreende fornecer uma composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA e adicionar um estabilizador à composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA.

[0165] Em uma forma de realização, adicionar o estabilizador à composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA reduz a força iônica da composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA.

[0166] Em uma forma de realização, a concentração de estabilizador na composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de

RNA e um estabilizador é superior ao valor necessário para a osmolalidade fisiológica.

[0167] Em uma forma de realização, a concentração de estabilizador na composição aquosa compreendendo lipoplexos de RNA e um estabilizador é suficiente para manter a qualidade das partículas de lipoplexo de RNA e, em particular, para evitar perda substancial da atividade de RNA após o armazenamento da composição durante pelo menos um mês, durante pelo menos 6 meses, durante pelo menos 12 meses, durante pelo menos 24 meses ou durante pelo menos 36 meses.

[0168] Em uma forma de realização, a concentração de estabilizador na composição aquosa compreendendo lipoplexos de RNA e um estabilizador é de cerca de 5% a cerca de 35,0% (p/v), de cerca de 10% a cerca de 30,0% (p/v), de cerca de 12,5% a cerca de 25,0% (p/v) ou cerca de 22,0% (p/v).

[0169] Em uma forma de realização, o pH na composição aquosa compreendendo lipoplexos de RNA e um estabilizador é menor que o pH usual ideal para armazenamento de RNA.

[0170] Em uma forma de realização, a composição aquosa compreendendo lipoplexos de RNA e um estabilizador compreende cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 80 mM ou de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM, ou compreende uma força iônica correspondente ao cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 80 mM ou de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM.

[0171] Em uma forma de realização, a composição aquosa compreendendo lipoplexos de RNA e um estabilizador possui uma força iônica correspondente ao cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 20 mM, cerca de 40 mM, cerca de 60 mM ou cerca de 80 mM.

[0172] Em uma forma de realização, as partículas de lipoplexo de RNA são obteníveis pelo método como descrito acima em I. e II.

[0173] Em uma forma de realização, o método de preparação de uma composição desidratada, por exemplo, liofilizada ou seca por pulverização, compreende ainda armazenar a composição liofilizada ou seca por pulverização compreendendo partículas de lipoplexo de RNA. Geralmente, a composição é armazenada a uma temperatura de cerca de -15 °C a cerca de -40 °C, por exemplo, a cerca de -20 °C. Em certas formas de realização, a composição é armazenada a uma temperatura superior a 0 °C, por exemplo, a cerca de 25 °C ou cerca de 4 °C, ou por exemplo, à temperatura ambiente.

[0174] A invenção se refere ainda a uma composição compreendendo partículas de lipoplexo de RNA que é obtenível pelo método acima de preparação de uma composição desidratada, por exemplo, liofilizada ou seca por pulverização. A invenção também se refere a uma composição compreendendo partículas de lipoplexo de RNA que é obtenível pelo método acima de preparação de uma composição para desidratação, por exemplo, liofilização ou secagem por pulverização.

[0175] Em uma forma de realização, as partículas de lipoplexo de RNA compreendem pelo menos um lipídio catiônico e pelo menos um lipídio adicional.

[0176] Em uma forma de realização, o RNA codifica um peptídeo ou proteína compreendendo pelo menos um epítopo, em que a razão de cargas positivas para cargas negativas nas partículas de lipoplexo de RNA é de cerca de 1:2 a cerca de 1,9:2, ou cerca de 1,3:2,0.

[0177] Em uma forma de realização, a composição compreende ainda cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 80 mM ou de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM.

[0178] A invenção se refere ainda a uma composição que compreende: - partículas de lipoplexo de RNA compreendendo: RNA que codifica um peptídeo ou proteína que compreende pelo menos um epítopo; pelo menos um lipídio catiônico e pelo menos um lipídio adicional; em que a razão de cargas positivas para cargas negativas nas partículas de lipoplexo de RNA é de cerca de 1:2 a cerca de 1,9:2 ou cerca de 1,3:2,0; - cloreto de sódio em uma concentração de 10 mM a cerca de 80 mM; e - um estabilizador.

[0179] Em uma forma de realização, a composição compreende ainda um tampão.

[0180] Em uma forma de realização, a quantidade de RNA na composição é de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 1 mg/ml, cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 0,5 mg/ml ou cerca de 0,05 mg/ml.

[0181] Em uma forma de realização, o cloreto de sódio está em uma concentração de cerca de 20 mM a cerca de 30 mM.

[0182] Em uma forma de realização, o cloreto de sódio está a uma concentração de cerca de 20 mM.

[0183] Em uma forma de realização, o cloreto de sódio está a uma concentração de cerca de 30 mM.

[0184] Em uma forma de realização, a concentração de estabilizador na composição é superior ao valor necessário para a osmolalidade fisiológica.

[0185] Em uma forma de realização, a concentração de estabilizador na composição é de cerca de 5 a cerca de 35% em peso por volume (% em p/v), ou de cerca de 10 a cerca de 25% em peso por volume (% em p/v).

[0186] Em uma forma de realização, o estabilizador é um carboidrato selecionado a partir de um monossacarídeo, um dissacarídeo, um trissacarídeo, um álcool de açúcar, um oligossacarídeo ou seu álcool de açúcar correspondente e um poli-álcool de cadeia linear.

[0187] Em uma forma de realização, o estabilizador é trealose a uma concentração de cerca de 5 a cerca de 35% em peso por volume (% em p/v).

[0188] Em uma forma de realização, a trealose está em uma concentração de cerca de 5% (p/v) a cerca de 25% (p/v).

[0189] Em uma forma de realização, a trealose está em uma concentração de cerca de 10% (p/v) a cerca de 25% (p/v).

[0190] Em uma forma de realização, a trealose está em uma concentração de cerca de 10% (p/v).

[0191] Em uma forma de realização, a trealose está em uma concentração de cerca de 15% (p/v).

[0192] Em uma forma de realização, a composição possui um pH que é menor que o pH usual ideal para armazenamento de RNA.

[0193] Em uma forma de realização, a composição possui um pH de cerca de 5,7 a cerca de 6,7, ou de cerca de 6,2.

[0194] Em uma forma de realização, o tampão é o ácido 2-[4-(2- hidroxietil)piperazin-1-il]etanossulfônico (HEPES).

[0195] Em uma forma de realização, o HEPES está em uma concentração de cerca de 2,5 mM a cerca de 10 mM, ou de cerca de 7,5 mM.

[0196] Em uma forma de realização, a composição compreende ainda um agente quelante.

[0197] A invenção se refere ainda a uma composição que compreende: - partículas de lipoplexo de RNA compreendendo: RNA que codifica um peptídeo ou proteína compreendendo pelo menos um epítopo a uma concentração de cerca de 0,05 mg/ml; e DOTMA e DOPE em uma razão molar de cerca de 2:1; em que a razão de cargas positivas para cargas negativas nas partículas de lipoplexo de RNA é de cerca de 1,3:2,0; - cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 20 mM; - trealose a uma concentração de cerca de 10% (p/v); - HEPES a uma concentração de cerca de 7,5 mM com um pH de cerca de 6,2; e - EDTA a uma concentração de cerca de 2,5 mM.

[0198] Em uma forma de realização, a composição está em um estado líquido ou desidratado, por exemplo, liofilizado ou criodessecado.

[0199] Em uma forma de realização, a composição desidratada, por exemplo, liofilizada ou criodessecada, é estável durante pelo menos um mês, durante pelo menos 6 meses, durante pelo menos 12 meses, durante pelo menos 24 meses ou durante pelo menos 36 meses. Em uma forma de realização, a composição é armazenada a uma temperatura superior a 0 °C, por exemplo, a cerca de 25 °C ou cerca de 4 °C, ou por exemplo, à temperatura ambiente.

[0200] Em uma forma de realização, a composição desidratada, por exemplo, liofilizada ou criodessecada, é estável durante pelo menos um mês.

[0201] Em uma forma de realização, a composição desidratada, por exemplo, liofilizada ou criodessecada, é estável durante pelo menos dois meses.

[0202] A invenção se refere ainda a uma composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA obtenível por reconstituição da composição acima desidratada, por exemplo, liofilizada ou criodessecada e, opcionalmente, ajuste da osmolalidade e força iônica adicionando um líquido aquoso.

[0203] Em uma forma de realização, a osmolalidade da composição é de cerca de 150 mOsmol a cerca de 450 mOsmol.

[0204] Em uma forma de realização, a composição compreende cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 80 mM a cerca de 150 mM.

[0205] Em uma forma de realização, as partículas de lipoplexo de RNA são obteníveis pelo método como descrito acima em I. e II.

[0206] Em uma forma de realização, as partículas de lipoplexo de RNA descritas neste aspecto em III. são caracterizadas por um único pico de Bragg a cerca de 1 nm-1, em que a largura do pico é menor que 0,2 nm-1.

[0207] Em uma forma de realização, as partículas de lipoplexo de RNA descritas neste aspecto em III. possuem um diâmetro médio que varia de cerca de 200 a cerca de 800 nm, de cerca de 250 a cerca de 700 nm, de cerca de 400 a cerca de 600 nm, de cerca de 300 nm a cerca de 500 nm ou de cerca de 350 nm a cerca de 400 nm.

[0208] Em uma forma de realização, as partículas de lipoplexo de RNA possuem um índice de polidispersidade menor que cerca de 0,5, menor que cerca de 0,4 ou menor que cerca de 0,3.

[0209] Em uma forma de realização, o pelo menos um lipídio catiônico compreende 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamônio propano (DOTMA) e/ ou 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano (DOTAP).

[0210] Em uma forma de realização, o pelo menos um lipídio adicional compreende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), colesterol (Chol) e/ ou 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC).

[0211] Em uma forma de realização, o pelo menos um lipídio catiônico compreende 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamônio propano (DOTMA) e o pelo menos um lipídio adicional compreende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn- glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE).

[0212] Em uma forma de realização, a razão molar do pelo menos um lipídio catiônico para o pelo menos um lipídio adicional é de cerca de 10:0 a cerca de 1:9, de cerca de 4:1 a cerca de 1:2, de cerca de 3:1 a cerca de 1:1 ou cerca de 2:1.

[0213] Em uma forma de realização, as partículas de lipoplexo de RNA compreendem DOTMA e DOPE em uma razão molar de cerca de 10:0 a 1:9, de cerca de 4:1 a 1:2, de cerca de 3:1 a cerca de 1:1, ou cerca de 2:1 e em que a razão de carga de cargas positivas em DOTMA para cargas negativas no RNA é de cerca de 1:2 a 1,9:2.

[0214] Em uma forma de realização, o agente quelante é o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).

[0215] Em uma forma de realização, o EDTA está em uma concentração de cerca de 0,25 mM a cerca de 5 mM, ou de cerca de 2,5 mM.

[0216] Em uma forma de realização, a composição compreende ainda um adjuvante.

[0217] Em uma forma de realização, a composição é formulada para administração sistêmica.

[0218] Em uma forma de realização, a administração sistêmica é por administração intravenosa.

[0219] A invenção se refere ainda a uma composição, como descrita, para uso terapêutico.

[0220] A invenção se refere ainda a um método de preparar uma composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA, compreendendo descongelar a composição congelada descrita acima ou reconstituir a composição liofilizada ou seca por pulverização descrita acima e, opcionalmente, ajustar a osmolalidade e força iônica adicionando um líquido aquoso.

[0221] Em uma forma de realização, um líquido aquoso é adicionado para obter uma osmolalidade da composição de cerca de 200 mOsmol a cerca de 450 mOsmol.

[0222] Em uma forma de realização, um líquido aquoso é adicionado para obter cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 80 mM a cerca de 150 mM.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0223] A Figura 1 mostra a correlação entre a concentração lipídica na solução estoque lipídica e o tamanho do lipossoma. Os lipossomas foram preparados por injeção de etanol em água (nenhum processo de filtração foi realizado após a injeção de etanol). O tamanho dos lipossomas aumenta com a concentração lipídica em etanol. Este exemplo: mistura lipídica DOTMA/ DOPE com uma razão molar % de 66:33.

[0224] A Figura 2 mostra a quantidade de partículas presentes nas formulações de lipossomas DOTMA/ DOPE preparadas com diferentes soluções lipídicas em diferentes concentrações.

[0225] A Figura 3 mostra o impacto do tamanho do precursor do lipossoma (colóide de lipossoma não filtrado usado) no tamanho do lipoplexo de RNA. Pequenos lipoplexos de RNA foram obtidos quando pequenos lipossomas foram utilizados para a sua formação. Não foi encontrada correlação clara entre o tamanho do lipossoma e o tamanho do lipoplexo de RNA em todos os lipoplexos de RNA preparados com lipossomas maiores.

[0226] A Figura 4 mostra a quantidade de partículas presentes nas formulações de lipoplexo de RNA preparadas com diferentes precursores de lipossomas (lipossomas não filtrados). A quantidade de partículas de 0,5 µm aumenta nas formulações de lipoplexo de RNA preparadas com lipossomas maiores. Os lipossomas foram preparados por injeção de etanol usando diferentes soluções estoque lipídicas em diferentes concentrações.

[0227] A Figura 5 mostra curvas de difração obtidas a partir de medidas SAXS do lipoplexo de RNA formado com lipossomas preparados em uma razão de carga de 4/1 (superior) e em uma razão de carga de 1,3/ 2, onde os lipossomas para a formação de lipoplexos foram obtidos com mM de solução estoque lipídica em etanol de 400 mM, 300 mM e 100 mM.

[0228] A Figura 6 mostra o comprimento de correlação e a eficiência da transfecção in vitro (células dendríticas humanas) de diferentes lipoplexos de RNA preparados com diferentes precursores de lipossomas. A atividade biológica (transfecção de RNA in vitro) aumenta monotonamente com o comprimento de correlação do lipoplexo de RNA. Os lipossomas foram preparados por injeção de etanol e diferentes soluções estoque lipídicas preparadas em diferentes concentrações lipídicas.

[0229] A Figura 7 mostra medições AF4 de lipoplexos de dois tipos diferentes de lipossomas, fabricados a partir de uma solução estoque de 150 mM em etanol ou de uma solução estoque de 400 mM em etanol.

[0230] A Figura 8 mostra a eficiência de transfecção in vitro de diferentes lipoplexos de RNA em células dendríticas. O sinal da luciferase aumenta monotonamente com o tamanho do lipossoma usado para a formação de lipoplexo de RNA.

[0231] A Figura 9 mostra a eficiência de transfecção in vitro de diferentes lipoplexos de RNA em células dendríticas. O sinal da luciferase aumenta monotonamente com o tamanho do lipossoma.

[0232] A Figura 10 mostra a eficiência de transfecção in vivo de formulações de lipoplexo de RNA 6 horas após a aplicação. Os lipoplexos de RNA foram preparados com lipossomas pequenos e grandes (lipossomas não filtrados). Os lipoplexos de RNA preparados com lipossomas maiores resultam em uma expressão mais alta da luciferase.

[0233] A Figura 11 mostra imagens in vivo de lipoplexos de RNA 6 horas após a aplicação. Os lipoplexos de RNA foram preparados com lipossomas pequenos e grandes. A) lipoplexo de RNA preparado com lipossomas pequenos a partir de um colóide bruto. B) lipoplexo de RNA preparado com lipossomas maiores a partir de um colóide bruto. C) lipoplexo de RNA preparado com pequenos lipossomas filtrados. D) lipoplexo de RNA preparado com grandes lipossomas filtrados. Sinais de bioluminescência mais altos obtidos com o lipoplexo de RNA preparado com lipossomas maiores.

[0234] A Figura 12 mostra o procedimento geral para a produção automatizada em lote de lipoplexos de RNA.

[0235] A Figura 13 mostra o Z-médio e a polidispersidade de lipoplexos de RNA sendo preparados usando um elemento de mistura do tipo Y com um diâmetro interno de 3,2 mm a diferentes taxas de fluxo.

[0236] Figura 14: mostra o Z-médio e a polidispersidade de lipoplexos de RNA sendo preparados usando um elemento de mistura do tipo Y com um diâmetro interno de 2,4 mm a diferentes taxas de fluxo.

[0237] A Figura 15 mostra a correlação do tamanho de partícula e a concentração de RNA na formação de lipoplexo. A medição do PCS foi realizada antes do congelamento.

[0238] A Figura 16 mostra a correlação das características das partículas e a concentração de RNA na formação de lipoplexo após três ciclos de congelamento e descongelamento.

[0239] A Figura 17 mostra a correlação das características das partículas e razão de carga (positiva: negativa) na faixa de 1,0:2,0 a 2,1:2,0.

[0240] A Figura 18 mostra a correlação das características das partículas e a razão de carga (positiva: negativa) na faixa de 2,0:1,0 a 5,0:1,0.

[0241] A Figura 19 mostra a correlação das características das partículas e a concentração de NaCl na formação de lipoplexo.

[0242] A Figura 20 mostra a correlação de bioatividade e concentração de NaCl na formação de lipoplexo.

[0243] A Figura 21 mostra medições da integridade do RNA em composições de RNA(LIP) sem crioprotetor usando diferentes substâncias tampão (HEPES; Na-acetato; Na-fosfato; Na-carbonato) em vários valores de pH após armazenamento acelerado a + 40 °C. As barras diferentes indicam períodos de armazenamento crescentes da esquerda (3 dias) para a direita (21 dias).

[0244] A Figura 22 mostra medições da integridade do RNA em formulações de lipoplexo de RNA com sacarose como crioprotetor usando HEPES como substância tampão a vários valores de pH após armazenamento acelerado a + 40 °C. As diferentes barras indicam períodos de armazenamento crescentes da esquerda (1 dia) para a direita (21 dias).

[0245] A Figura 23 mostra a integridade do RNA nos lipoplexos armazenados a 40 °C com diferentes teores de EDTA.

[0246] A Figura 24 é um diagrama geral indicando que a concentração de NaCl e crioprotetor foi otimizada em cada etapa.

[0247] A Figura 25 mostra o Z-médio e a polidispersidade dos lipoplexos de RNA congelados na presença de quantidades crescentes de crioprotetores alternativos.

[0248] A Figura 26 mostra o número de partículas subvisíveis ≥ 10 µm em formulações de lipoplexo de RNA congeladas na presença de quantidades crescentes de crioprotetores alternativos.

[0249] A Figura 27 mostra medições do tamanho de partícula em formulações de lipoplexo de RNA contendo 5-20% em p/v de sacarose (eixo X) e várias concentrações baixas de NaCl antes e após o congelamento a -30 °C.

[0250] A Figura 28 mostra medições do tamanho de partícula em formulações de lipoplexo de RNA contendo 5-20% em p/v de dihidrato de trealose (eixo x) e várias concentrações baixas de NaCl antes e após o congelamento a -30 °C.

[0251] A Figura 29 mostra medições do tamanho de partícula em formulações de lipoplexo de RNA contendo NaCl 50 mM e várias quantidades (% em p/v) de dihidrato de trealose após múltiplos ciclos de congelamento e descongelamento.

[0252] A Figura 30 mostra medições do tamanho de partícula em formulações de lipoplexo de RNA contendo NaCl 70 mM e várias quantidades (% em p/v) de dihidrato de trealose após vários ciclos de congelamento e descongelamento.

[0253] A Figura 31 mostra medições do tamanho de partícula em formulações de lipoplexo de RNA contendo NaCl 90 mM e várias quantidades (% em p/v) de dihidrato de trealose após múltiplos ciclos de congelamento e descongelamento.

[0254] A Figura 32 mostra medições do tamanho de partícula em formulações de lipoplexo de RNA contendo 5-20% em p/v de sacarose e várias concentrações baixas de NaCl após armazenamento a -15 °C por 8 meses. As barras diferentes indicam períodos de armazenamento crescentes da esquerda (0 meses) para a direita (8 meses). Nas combinações de sacarose/ NaCl com menos de 8 barras, o tamanho das partículas excedeu as especificações nos dois instantes seguintes e a análise foi interrompida.

[0255] A Figura 33 mostra medições do tamanho de partícula em formulações de lipoplexo de RNA contendo 5-20% em p/v de sacarose e várias concentrações baixas de NaCl após armazenamento a -30 °C por 8 meses. As barras diferentes indicam períodos de armazenamento crescentes da esquerda (0 meses) para a direita (8 meses). Nas combinações de sacarose/ NaCl com menos de 8 barras, o tamanho das partículas excedeu as especificações nos dois instantes seguintes e a análise foi interrompida.

[0256] A Figura 34 mostra medições do tamanho de partícula em formulações de lipoplexo de RNA contendo 5-20% em p/v de dihidrato de trealose e várias concentrações baixas de NaCl após armazenamento a -15 °C por 8 meses. As barras diferentes indicam períodos de armazenamento crescentes da esquerda (0 meses) para a direita (8 meses). Nas combinações de trealose/ NaCl com menos de 8 bar, o tamanho das partículas excedeu as especificações nos dois instantes seguintes e a análise foi interrompida.

[0257] A Figura 35 mostra medições do tamanho de partícula em formulações de lipoplexo de RNA contendo 5-20% em p/v de dihidrato de trealose e várias concentrações baixas de NaCl após armazenamento a -30 °C por 8 meses. As barras diferentes indicam períodos de armazenamento crescentes da esquerda (0 meses) para a direita (8 meses). Nas combinações de trealose/ NaCl com menos de 8 bar, o tamanho das partículas excedeu as especificações nos dois instantes seguintes e a análise foi interrompida.

[0258] A Figura 36 mostra medições do tamanho de partícula em formulações de lipoplexo de RNA contendo 22% em p/v de sacarose e várias concentrações baixas de NaCl após armazenamento a -20 °C.

[0259] A Figura 37 mostra medições do tamanho de partícula em formulações de lipoplexo de RNA contendo 22% em p/v de dihidrato de trealose e várias concentrações baixas de NaCl após armazenamento a -20 °C.

[0260] A Figura 38 mostra medições do tamanho de partícula em formulações de lipoplexo de RNA contendo 22% em p/v de glicose e várias concentrações baixas de NaCl após armazenamento a -20 °C.

[0261] A Figura 39 mostra medições do tamanho de partícula em formulações de lipoplexo de RNA contendo 22% em p/v de glicose e NaCl 20 mM sendo congeladas e armazenadas de -15 a -40 °C.

[0262] A Figura 40 mostra medições do tamanho de partícula de lipoplexos de RNA congelados em composições contendo as combinações de crioprotetores listados na Tabela 10 após armazenamento a -20 °C.

[0263] A Figura 41 mostra o efeito da concentração de trealose nas formulações de lipoplexo de RNA [RNA (lip)] após congelamento- descongelamento ou após criodessecação e reconstituição.

[0264] A Figura 42 mostra a alteração do tamanho das partículas nas formulações de RNA(lip) criodessecadas preparadas em trealose a 22% após reconstituição com solução de NaCl a 0,9% ou WFI (água para injeção).

[0265] A Figura 43 mostra a transfecção Luc-RNA in vitro de formulações de lipoplexo de RNA criodessecadas [RNA (lip)] preparadas em trealose a 22% em diferentes concentrações de NaCl. As amostras criodessecadas foram reconstituídas com solução de NaCl a 0,9%. (Coluna texturizada: controle líquido).

[0266] A Figura 44 mostra o diâmetro médio Z de formulações de lipoplexo de RNA criodessecadas [RNA (lip)] formuladas em diferentes proporções de trealose/ NaCl armazenadas a 2-8 °C ou 25 °C após reconstituição com solução de NaCl a 0,9%. As formulações foram reconstituídas no volume original após criodessecação.

[0267] A Figura 45 mostra a integridade do RNA (% de RNA de comprimento total) do RNA (lip) criodessecado formulado em diferentes proporções de trealose/ NaCl após reconstituição com solução de NaCl a 0,9% e armazenado a 2-8 °C ou 25 °C. As formulações foram reconstituídas no volume original após criodessecação e diluídas 1:1 com solução de NaCl a 0,9% para os experimentos de cultura celular (0,01 mg/ml de RNA).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0268] Embora a presente invenção seja descrita em detalhes abaixo, deve-se entender que esta invenção não se limita às metodologias,

protocolos e reagentes específicos aqui descritos, pois estes podem variar.

Também deve ser entendido que a terminologia usada neste documento tem o objetivo de descrever formas de realização particulares somente, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, o qual será limitado apenas pelas reivindicações anexas. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento possuem os mesmos significados que são comumente entendidos por um técnico no assunto.

[0269] De preferência, os termos aqui utilizados são definidos como descrito em “A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)”, H.G.W. Leuenberger, B. Nagel e H. Kölbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Suíça, (1995).

[0270] A prática da presente invenção empregará, salvo indicação em contrário, métodos convencionais de química, bioquímica, biologia celular, imunologia e técnicas de DNA recombinante que são explicadas na literatura no campo (ver, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edição, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

[0271] A seguir, os elementos da presente invenção serão descritos. Esses elementos são listados com formas de realização específicas, no entanto, deve-se entender que eles podem ser combinados de qualquer maneira e em qualquer número para criar formas de realização adicionais. Os exemplos e formas de realização descritos de várias maneiras não devem ser interpretados como limitando a presente invenção apenas às formas de realização explicitamente descritas. Esta descrição deve ser entendida para revelar e abranger formas de realização que combinam as formas de realização explicitamente descritas com qualquer número dos elementos revelados. Além disso, quaisquer permutações e combinações de todos os elementos descritos devem ser consideradas reveladas por esta descrição, a menos que o contexto indique o contrário.

[0272] O termo “cerca de” significa aproximadamente ou quase e, no contexto de um valor ou intervalo numérico apresentado aqui em uma forma de realização, significa ± 20%, ± 10%, ± 5% ou ± 3% do valor ou intervalo numérico citado ou reivindicado.

[0273] Os termos “um”, “uma”, “o” e “a” e referência semelhante usados no contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações) devem ser interpretados como abrangendo tanto o singular quanto o plural, a menos que indicado de outra forma aqui ou claramente contradito pelo contexto. A citação de faixas de valores neste documento destina-se apenas a servir como um método abreviado de se referir individualmente a cada valor separado dentro da faixa. Salvo indicação em contrário aqui, cada valor individual é incorporado na especificação como se fosse aqui citado individualmente. Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que indicado de outra forma aqui ou claramente contradito pelo contexto. O uso de todo e qualquer exemplo, ou linguagem exemplificativa (por exemplo, “tal como”), aqui fornecido, visa meramente ilustrar melhor a invenção e não representa uma limitação no escopo das reivindicações. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado essencial para a prática da invenção.

[0274] A menos que expressamente especificado de outra forma, o termo “compreendendo” é usado no contexto do presente documento para indicar que outros membros podem, opcionalmente, estar presentes além dos membros da lista apresentada por “compreendendo”. É, no entanto, contemplado como uma forma de realização específica da presente invenção que o termo “compreendendo” engloba a possibilidade de nenhum membro adicional estar presente, isto é, para os fins desta forma de realização “compreendendo” deve ser entendido como tendo o significado de “consistindo em”.

[0275] Vários documentos são citados ao longo do texto deste relatório descritivo. Cada um dos documentos citados aqui (incluindo todas as patentes, pedidos de patentes, publicações científicas, especificações de fabricante, instruções etc.), supra ou infra, são incorporados por referência em sua totalidade. Nada neste documento deve ser interpretado como uma admissão de que a presente invenção não tinha o direito de preceder essa divulgação.

DEFINIÇÕES

[0276] A seguir, serão fornecidas definições que se aplicam a todos os aspectos da presente invenção. Os termos a seguir possuem os seguintes significados, a menos que seja indicado de outra forma. Quaisquer termos não explicados possuem seus significados reconhecidos na arte.

[0277] Termos como “reduzir” ou “inibir”, como aqui utilizado, significa a capacidade de causar uma diminuição geral, por exemplo, de cerca de 5% ou mais, cerca de 10% ou mais, cerca de 20% ou mais, cerca de 50% ou mais, ou cerca de 75% ou mais, no nível. O termo “inibir” ou frases semelhantes inclui uma inibição completa ou essencialmente completa, isto é, uma redução para zero ou essencialmente para zero.

[0278] Termos como “aumentar” ou “intensificar” em uma forma de realização referem-se a um aumento ou intensificação de pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 100%.

[0279] “pH fisiológico”, como aqui utilizado, se refere a um pH de cerca de 7,5.

[0280] Conforme utilizado na presente invenção, “% em p/v” se refere à porcentagem em peso por volume, que é uma unidade de concentração que mede a quantidade de soluto em gramas (g) expressa como uma porcentagem do volume total de solução em mililitros (ml).

[0281] O termo “força iônica” se refere à relação matemática entre o número de diferentes tipos de espécies iônicas em uma solução específica e suas respectivas cargas. Assim, a força iônica I é representada matematicamente pela fórmula: 1 𝐼= ∙ ∑ z𝑖2 ∙ 𝑐𝑖 2 𝑖 em que c é a concentração molar de uma espécie iônica específica e z o valor absoluto de sua carga. A soma Σ é tomada sobre todos os diferentes tipos de íons (i) em solução.

[0282] De acordo com a invenção, o termo “força iônica” em uma forma de realização se refere à presença de íons monovalentes. No que diz respeito à presença de íons bivalentes, em particular cátions bivalentes, sua concentração ou concentração efetiva (presença de íons livres) devido à presença de agentes quelantes é, em uma forma de realização, suficientemente baixa para evitar a degradação do RNA. Em uma forma de realização, a concentração ou concentração efetiva de íons bivalentes está abaixo do nível catalítico para hidrólise das ligações fosfodiéster entre os nucleotídeos de RNA. Em uma forma de realização, a concentração de íons bivalentes livres é de 20 µM ou menos. Em uma forma de realização, não há ou essencialmente não há íons bivalentes livres.

[0283] “Osmolalidade” se refere à concentração de um determinado soluto expresso como o número de osmoles de soluto por quilograma de solvente.

[0284] O número de Reynolds é um número adimensional, que pode ser calculado usando o seguinte formalismo: 𝜌∙𝑣∙𝑙 𝑅𝑒 =  em que ρ é a densidade do fluido, ν é a velocidade do fluido, l é o comprimento característico (aqui o diâmetro interno do elemento de mistura) e η é a viscosidade.

[0285] O termo “congelamento” se refere à solidificação de um líquido, geralmente com a remoção de calor.

[0286] O termo “liofilizar” ou “liofilização” se refere à criodessecação de uma substância congelando-a e depois reduzindo a pressão circundante para permitir que o meio congelado na substância sublime diretamente da fase sólida para a fase gasosa.

[0287] O termo “secagem por pulverização” se refere à secagem por pulverização de uma substância misturando gás (aquecido) com um fluido que é atomizado (pulverizado) dentro de um recipiente (secador por pulverização), onde o solvente das gotículas formadas evapora, levando a um pó seco.

[0288] O termo “crioprotetor” se refere a uma substância que é adicionada a uma formulação para proteger os ingredientes ativos durante as etapas de congelamento.

[0289] O termo “lioprotetor” se refere a uma substância que é adicionada a uma formulação para proteger os ingredientes ativos durante as etapas de secagem.

[0290] O termo “reconstituir” se refere à adição de um solvente, tal como a água, a um produto seco, para devolvê-lo a um estado líquido, tal como seu estado líquido original.

[0291] O termo “recombinante”, no contexto da presente invenção, significa “feito por engenharia genética”. Em uma forma de realização, um “objeto recombinante”, no contexto da presente invenção, não é de ocorrência natural.

[0292] O termo “ocorrência natural”, tal como aqui utilizado, se refere ao fato de que um objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, um peptídeo ou ácido nucleico que está presente em um organismo (incluindo vírus) e pode ser isolado de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificado pelo homem no laboratório é de ocorrência natural. O termo “encontrado na natureza” significa “presente na natureza” e inclui objetos conhecidos, bem como objetos que ainda não foram descobertos e/ ou isolados da natureza, mas que podem ser descobertos e/ ou isolados no futuro a partir de uma fonte natural.

[0293] O termo “solubilidade de equilíbrio” se refere à concentração do soluto na qual a taxa na qual o soluto se dissolve e a taxa na qual o soluto é depositado na solução são as mesmas. Em uma forma de realização, o termo se refere à concentração respectiva à temperatura ambiente.

[0294] Como aqui utilizado, o termo “temperatura ambiente” se refere a temperaturas superiores a 4 °C, preferencialmente de cerca de 15 °C a cerca de 40 °C, de cerca de 15 °C a cerca de 30 °C, de cerca de 15 °C a cerca de 24 °C ou de cerca de 16 °C a cerca de 21 °C. Tais temperaturas incluirão 14 °C, 15 °C, 16 °C, 17 °C, 18 °C, 19 °C, 20 °C, 21 °C e 22 °C.

[0295] No contexto da presente invenção, o termo “partícula” se refere a uma entidade estruturada formada por moléculas ou complexos de moléculas. Em uma forma de realização, o termo “partícula” se refere a uma estrutura de tamanho micro ou nano, tal como uma estrutura compacta de tamanho micro ou nano.

[0296] No contexto da presente invenção, o termo “partícula de lipoplexo de RNA” se refere a uma partícula que contém lipídio, em particular lipídio catiônico, e RNA. As interações eletrostáticas entre lipossomas carregados positivamente e RNA carregado negativamente resultam em complexação e formação espontânea de partículas de lipoplexo de RNA. Os lipossomas carregados positivamente podem ser geralmente sintetizados usando um lipídio catiônico, tal como DOTMA, e lipídios adicionais, tais como DOPE. Em uma forma de realização, uma partícula de lipoplexo de RNA é uma nanopartícula.

[0297] Como usado na presente invenção, “nanopartícula” se refere a uma partícula compreendendo RNA e pelo menos um lipídio catiônico e possuindo um diâmetro médio adequado para administração intravenosa.

[0298] O termo “diâmetro médio” se refere ao diâmetro hidrodinâmico médio das partículas, medido por espalhamento dinâmico de luz (DLS) com análise de dados usando o chamado algoritmo cumulante, que fornece como resultados o chamado Zmédio com a dimensão de um comprimento, e o índice de polidispersidade (PI), que é adimensional (Koppel, D., J. Chem. Phys. 57, 1972, p. 4814-4820, ISO 13321). Aqui “diâmetro médio”, “diâmetro” ou “tamanho” para partículas são usados como sinônimos com este valor de Zmédio.

[0299] O termo “índice de polidispersidade” é usado aqui como uma medida da distribuição de tamanho de um conjunto de partículas, por exemplo, nanopartículas. O índice de polidispersidade é calculado com base em medidas de espalhamento dinâmico de luz pela chamada análise cumulante.

[0300] Como aqui utilizado, “partículas subvisíveis” se refere a partículas com um diâmetro médio inferior a 100 micrômetros (µm). O número de partículas subvisíveis pode ser medido usando obscurecimento de luz para indicar o grau de agregação de partículas de lipoplexo de RNA na presente invenção. Em algumas formas de realização, o número de partículas subvisíveis com um diâmetro médio maior ou igual a 10 μm é medido. Em outras formas de realização, o número de partículas subvisíveis com um diâmetro médio maior ou igual a 25 μm é medido.

[0301] O termo “técnica de injeção de etanol” se refere a um processo, no qual uma solução de etanol compreendendo lipídios é rapidamente injetada em uma solução aquosa através de uma agulha. Essa ação dispersa os lipídios por toda a solução e promove a formação de estrutura lipídica, por exemplo, a formação de vesículas lipídicas, como a formação de lipossomas. Geralmente, as partículas de lipoplexo de RNA aqui descritas são obteníveis por adição de RNA a uma dispersão de lipossomas coloidais.

Usando a técnica de injeção de etanol, essa dispersão de lipossomas coloidais é, em uma forma de realização, formada da seguinte forma: uma solução de etanol compreendendo lipídios, tais como lipídios catiônicos como DOTMA e lipídios adicionais, é injetada em uma solução aquosa sob agitação. Em uma forma de realização, as partículas de lipoplexo de RNA aqui descritas são obteníveis sem uma etapa de extrusão.

[0302] O termo “extrudir” ou “extrusão” se refere à criação de partículas com um perfil de seção transversal fixo. Em particular, se refere à redução de tamanho de uma partícula, pelo que a partícula é forçada através de filtros com poros definidos.

DIÂMETRO DE PARTÍCULAS DE LIPOPLEXO DE RNA

[0303] As partículas de lipoplexo de RNA descritas aqui possuem um diâmetro médio que, em uma forma de realização, varia de cerca de 200 nm a cerca de 1000 nm, de cerca de 200 nm a cerca de 800 nm, de cerca de 250 a cerca de 700 nm, de cerca de 400 a cerca de 600 nm, de cerca de 300 nm a cerca de 500 nm, ou de cerca de 350 nm a cerca de 400 nm. Em formas de realização específicas, as partículas de lipoplexo de RNA possuem um diâmetro médio de cerca de 200 nm, cerca de 225 nm, cerca de 250 nm, cerca de 275 nm, cerca de 300 nm, cerca de 325 nm, cerca de 350 nm, cerca de 375 nm, cerca de 400 nm, cerca de 425 nm, cerca de 450 nm, cerca de 475 nm, cerca de 500 nm, cerca de 525 nm, cerca de 550 nm, cerca de 575 nm, cerca de 600 nm, cerca de 625 nm, cerca de 650 nm, cerca de 700 nm, cerca de 725 nm, cerca de 750 nm, cerca de 775 nm, cerca de 800 nm, cerca de 825 nm, cerca de 850 nm, cerca de 875 nm, cerca de 900 nm, cerca de 925 nm, cerca de 950 nm, cerca de 975 nm ou cerca de 1000 nm. Em uma forma de realização, as partículas de lipoplexo de RNA possuem um diâmetro médio que varia de cerca de 250 nm a cerca de 700 nm. Em outra forma de realização, as partículas de lipoplexo de RNA possuem um diâmetro médio que varia de cerca de 300 nm a cerca de 500 nm. Em uma forma de realização exemplificativa, as partículas de lipoplexo de RNA possuem um diâmetro médio de cerca de 400 nm.

[0304] Partículas de lipoplexo de RNA aqui descritas, por exemplo, geradas pelos processos aqui descritos, exibem um índice de polidispersidade menor que cerca de 0,5, menor que cerca de 0,4 ou menor que cerca de 0,3. A título de exemplo, as partículas de lipoplexo de RNA podem exibir um índice de polidispersidade em um intervalo de cerca de 0,1 a cerca de 0,3.

LIPÍDIO

[0305] Em uma forma de realização, as soluções lipídicas, lipossomas e partículas de lipoplexo de RNA descritas aqui incluem um lipídio catiônico. Como aqui utilizado, um “lipídio catiônico” se refere a um lipídio com uma carga líquida positiva. Os lipídios catiônicos ligam o RNA carregado negativamente por interação eletrostática à matriz lipídica. Geralmente, os lipídios catiônicos possuem uma porção lipofílica, tal como um esterol, uma cadeia de acila ou diacila, e o grupo cabeça do lipídio normalmente carrega a carga positiva. Exemplos de lipídios catiônicos incluem, mas não estão limitados a 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamônio propano (DOTMA), dimetildioctadecilamônio (DDAB); 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano (DOTAP); 1,2-dioleoil-3-dimetilamônio-propano (DODAP); 1,2-diaciloxi-3- dimetilamônio propanos; 1,2-dialquiloxi-3-dimetilamônio propanos; cloreto de dioctadecildimetil amônio (DODAC), 2,3-di(tetradecoxi)propil-(2-hidroxietil)- dimetilazânio (DMRIE), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DMEPC), 1,2- dimiristoil-3-trimetilamônio propano (DMTAP), brometo de 1,2-dioleiloxipropil-3- dimetil-hidroxietil amônio (DORIE) e trifluoroacetato de 2,3-dioleoiloxi-N- [2(espermina carboxamida)etil]-N,N-dimetil-1-propanâmio (DOSPA). Os preferidos são DOTMA, DOTAP, DODAC e DOSPA. Em formas de realização específicas, o pelo menos um lipídio catiônico é DOTMA e/ ou DOTAP.

[0306] Um lipídio adicional pode ser incorporado para ajustar a razão geral de carga positiva para negativa e a estabilidade física das partículas de lipoplexo de RNA. Em certas formas de realização, o lipídio adicional é um lipídio neutro. Como aqui utilizado, um “lipídio neutro” se refere a um lipídio com uma carga líquida igual a zero. Exemplos de lipídios neutros incluem, mas não estão limitado a 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3- fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), diacilfosfatidil colina, diacilfosfatidil etanolamina, ceramida, esfingomielina, cefalina, colesterol e cerebrosídeo. Em formas de realização específicas, o segundo lipídio é DOPE, colesterol e/ ou DOPC.

[0307] Em certas formas de realização, as partículas de lipoplexo de RNA incluem um lipídio catiônico e um lipídio adicional. Em uma forma de realização exemplificativa, o lipídio catiônico é DOTMA e o lipídio adicional é DOPE. Sem desejar ser limitado pela teoria, a quantidade do pelo menos um lipídio catiônico em comparação com a quantidade do pelo menos um lipídio adicional pode afetar características importantes das partículas de lipoplexo de RNA, tais como carga, tamanho de partícula, estabilidade, seletividade tecidual e bioatividade do RNA. Por conseguinte, em algumas formas de realização, a razão molar do pelo menos um lipídio catiônico para o pelo menos um lipídio adicional é de cerca de 10:0 a cerca de 1:9, cerca de 4:1 a cerca de 1:2 ou cerca de 3:1 a cerca de 1:1. Em formas de realização específicas, a razão molar pode ser de cerca de 3:1, cerca de 2,75:1, cerca de 2,5:1, cerca de 2,25:1, cerca de 2:1, cerca de 1,75:1, cerca de 1,5:1, cerca de 1,25:1 ou cerca de 1:1. Em uma forma de realização exemplificativa, a razão molar do pelo menos um lipídio catiônico para o pelo menos um lipídio adicional é de cerca de 2:1.

RNA

[0308] Na presente invenção, o termo “RNA” se refere a uma molécula de ácido nucleico que inclui resíduos de ribonucleotídeo. Em formas de realização preferidas, o RNA contém todos ou a maioria dos resíduos de ribonucleotídeo. Como aqui utilizado, “ribonucleotídeo” se refere a um nucleotídeo com um grupo hidroxila na posição 2’ de um grupo β-D- ribofuranosil. O RNA abrange, sem limitação, RNA de fita dupla, RNA de fita simples, RNA isolado tal como RNA parcialmente purificado, RNA essencialmente puro, RNA sintético, RNA produzido recombinantemente, bem como RNA modificado que difere do RNA de ocorrência natural pela adição, remoção, substituição e/ ou alteração de um ou mais nucleotídeos. Tais alterações podem se referir à adição de material não nucleotídico aos nucleotídeos de RNA interno ou à(s) extremidade(s) do RNA. Também é contemplado neste documento que os nucleotídeos no RNA podem ser nucleotídeos não padrão, tais como nucleotídeos ou desoxinucleotídeos sintetizados quimicamente. Para a presente invenção, esses RNAs alterados são considerados análogos do RNA de ocorrência natural.

[0309] Em certas formas de realização da presente invenção, o RNA é RNA mensageiro (mRNA) que se refere a um transcrito de RNA que codifica um peptídeo ou proteína. Como estabelecido na técnica, o mRNA geralmente contém uma região 5’ não traduzida (5’-UTR), uma região codificadora de peptídeos e uma região 3' não traduzida (3’-UTR). Em algumas formas de realização, o RNA é produzido por transcrição in vitro ou síntese química. Em uma forma de realização, o mRNA é produzido por transcrição in vitro usando um molde de DNA em que DNA se refere a um ácido nucleico que contém desoxirribonucleotídeos.

[0310] Em uma forma de realização, o RNA é RNA transcrito in vitro (RNA IVT) e pode ser obtido por transcrição in vitro de um molde de DNA apropriado. O promotor para controlar a transcrição pode ser qualquer promotor para qualquer RNA polimerase. Um molde de DNA para transcrição in vitro pode ser obtido por clonagem de um ácido nucleico, em particular cDNA, e introduzindo-o em um vetor apropriado para transcrição in vitro. O cDNA pode ser obtido por transcrição reversa de RNA.

[0311] Em certas formas de realização da presente invenção, o RNA nas composições de lipoplexo de RNA aqui descritas está em uma concentração de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 1 mg/ml, ou de cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 0,5 mg/ml. Em formas de realização específicas, o RNA está em uma concentração de cerca de 0,05 mg/ml, cerca de 0,06 mg/ml, cerca de 0,07 mg/ml, cerca de 0,08 mg/ml, cerca de 0,09 mg/ml, cerca de 0,10 mg/ml, cerca de 0,11 mg/ml, cerca de 0,12 mg/ml, cerca de 0,13 mg/ml, cerca de 0,14 mg/ml, cerca de 0,15 mg/ml, cerca de 0,16 mg/ml, cerca de 0,17 mg/ml, cerca de 0,18 mg/ml, cerca de 0,19 mg/ml, cerca de 0,20 mg/ml, cerca de 0,21 mg/ml, cerca de 0,22 mg/ml, cerca de 0,23 mg/ml, cerca de 0,24 mg/ml, cerca de 0,25 mg/ml, cerca de 0,26 mg/ml, cerca de 0,27 mg/ml, cerca de 0,28 mg/ml, cerca de 0,29 mg/ml, cerca de 0,30 mg/ml, cerca de 0,31 mg/ml, cerca de 0,32 mg/ml, cerca de 0,33 mg/ml, cerca de 0,34 mg/ml, cerca de 0,35 mg/ml, cerca de 0,36 mg/ml, cerca de 0,37 mg/ml, cerca de 0,38 mg/ml, cerca de 0,39 mg/ml, cerca de 0,40 mg/ml, cerca de 0,41 mg/ml, cerca de 0,42 mg/ml, cerca de 0,43 mg/ml, cerca de 0,44 mg/ml, cerca de 0,45 mg/ml, cerca de 0,46 mg/ml, cerca de 0,47 mg/ml, cerca de 0,48 mg/ml, cerca de 0,49 mg/ml ou cerca de 0,50 mg/ml. Em uma forma de realização exemplificativa, o RNA está em uma concentração de 0,05 mg/ml.

[0312] Em uma forma de realização, o RNA pode ter ribonucleotídeos modificados. Exemplos de ribonucleotídeos modificados incluem, sem limitação, 5-metilcitidina e pseudouridina.

[0313] Em algumas formas de realização, o RNA de acordo com a presente invenção compreende um cap 5’. Em uma forma de realização, o RNA da presente invenção não possui 5'-trifosfatos não limitados. Em uma forma de realização, o RNA pode ser modificado por um análogo de cap 5’. O termo “cap 5’” se refere a uma estrutura encontrada na extremidade 5’ de uma molécula de mRNA e geralmente consiste em um nucleotídeo de guanosina conectado ao mRNA por meio de uma ligação de 5’ a 5’-trifosfato. Em uma forma de realização, esta guanosina é metilada na posição 7. O fornecimento de um RNA com um cap 5’ ou análogo de cap 5’ pode ser alcançado por transcrição in vitro, na qual o cap 5’ é co-transcricionalmente expresso na fita de RNA ou pode ser ligado ao RNA pós-transcricionalmente usando enzimas de cobertura (capping).

[0314] Em algumas formas de realização, o RNA de acordo com a presente invenção compreende um 5’-UTR e/ou um 3’-UTR. O termo “região não traduzida” ou “UTR” se refere a uma região em uma molécula de DNA que é transcrita, mas não é traduzida em uma sequência de aminoácidos ou na região correspondente em uma molécula de RNA, tal como uma molécula de mRNA. Uma região não traduzida (UTR) pode estar presente 5’ (a montante)

de um quadro de leitura aberto (5’-UTR) e/ ou 3’ (a jusante) de um quadro de leitura aberto (3’-UTR). Uma 5’-UTR, se presente, está localizada na extremidade 5’, a montante do códon de iniciação de uma região codificadora de proteína. Uma 5’-UTR está a jusante do cap 5’ (se presente), por exemplo diretamente adjacente ao cap 5’. Uma 3’-UTR, se presente, está localizada na extremidade 3’, a jusante do códon de terminação de uma região codificadora de proteína, mas o termo “3’-UTR” preferencialmente não inclui a cauda poli(A).

Assim, a 3’-UTR está a montante da sequência poli(A) (se presente), por exemplo, diretamente adjacente à sequência poli(A).

[0315] Em algumas formas de realização, o RNA de acordo com a presente invenção compreende uma sequência 3’-poli(A). O termo “sequência poli(A)” se refere a uma sequência de resíduos de adenil (A) que está tipicamente localizada na extremidade 3’ de uma molécula de RNA. De acordo com a invenção, em uma forma de realização, uma sequência poli(A) compreende pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 80 ou pelo menos cerca de 100 e até cerca de 500, até cerca de 400, até cerca de 300, até cerca de 200 ou até cerca de 150 nucleotídeos A, e em particular cerca de 120 nucleotídeos A.

[0316] No contexto da presente invenção, o termo “transcrição” se refere a um processo, em que o código genético em uma sequência de DNA é transcrito em RNA. Posteriormente, o RNA pode ser traduzido em peptídeo ou proteína.

[0317] No que diz respeito ao RNA, o termo “expressão” ou “tradução” se refere ao processo nos ribossomos de uma célula pelo qual uma fita de mRNA direciona a montagem de uma sequência de aminoácidos para formar um peptídeo ou proteína.

[0318] Em uma forma de realização, após a administração das partículas de lipoplexo de RNA aqui descritas, pelo menos uma porção do RNA é entregue a uma célula alvo. Em uma forma de realização, pelo menos uma porção do RNA é entregue ao citosol da célula alvo. Em uma forma de realização, o RNA é um RNA que codifica um peptídeo ou proteína e o RNA é traduzido pela célula alvo para produzir o peptídeo ou proteína. Em uma forma de realização, a célula alvo é uma célula do baço. Em uma forma de realização, a célula alvo é uma célula apresentadora de antígeno, tal como uma célula apresentadora de antígeno profissional no baço. Em uma forma de realização, a célula alvo é uma célula dendrítica no baço. Assim, as partículas de lipoplexo de RNA aqui descritas podem ser utilizadas para a entrega de RNA a essa célula alvo. Por conseguinte, a presente invenção também se refere a um método para entregar RNA a uma célula alvo em um sujeito, compreendendo a administração das partículas de lipoplexo de RNA aqui descritas ao sujeito. Em uma forma de realização, o RNA é entregue ao citosol da célula alvo. Em uma forma de realização, o RNA é um RNA que codifica um peptídeo ou proteína e o RNA é traduzido pela célula alvo para produzir o peptídeo ou proteína.

[0319] Em uma forma de realização, o RNA codifica um peptídeo ou proteína farmaceuticamente ativo.

[0320] De acordo com a invenção, o termo “RNA codifica” significa que o RNA, se presente no meio apropriado, tal como dentro de células de um tecido alvo, pode direcionar a montagem de aminoácidos para produzir o peptídeo ou proteína que codifica durante o processo de tradução. Em uma forma de realização, o RNA é capaz de interagir com o mecanismo de tradução celular, permitindo a tradução do peptídeo ou proteína. Uma célula pode produzir o peptídeo ou a proteína codificados intracelularmente (por exemplo, no citoplasma e/ou no núcleo), pode secretar o peptídeo ou a proteína codificados ou pode produzi-los na superfície.

[0321] De acordo com a invenção, o termo “peptídeo” compreende oligo- e polipeptídeos e se refere a substâncias que compreendem cerca de dois ou mais, cerca de 3 ou mais, cerca de 4 ou mais, cerca de 6 ou mais, cerca de 8 ou mais, cerca de 10 ou mais, cerca de 13 ou mais, cerca de 16 ou mais, cerca de 20 ou mais e até cerca de 50, cerca de 100 ou cerca de 150 aminoácidos consecutivos ligados entre si por meio de ligações peptídicas. O termo “proteína” se refere a peptídeos grandes, em particular peptídeos com pelo menos cerca de 151 aminoácidos, mas os termos “peptídeo” e “proteína” são aqui utilizados normalmente como sinônimos.

[0322] Um “peptídeo ou proteína farmaceuticamente ativo” tem um efeito positivo ou vantajoso em uma condição ou estado de doença de um sujeito quando fornecido ao sujeito em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Em uma forma de realização, um peptídeo ou proteína farmaceuticamente ativo tem propriedades curativas ou paliativas e pode ser administrado para melhorar, mitigar, aliviar, reverter, retardar o início ou diminuir a gravidade de um ou mais sintomas de uma doença ou distúrbio. Um peptídeo ou proteína farmaceuticamente ativo pode ter propriedades profiláticas e pode ser usado para retardar o início de uma doença ou diminuir a gravidade de tal doença ou condição patológica. O termo “peptídeo ou proteína farmaceuticamente ativo” inclui proteínas ou polipeptídeos inteiros e também pode se referir a fragmentos farmaceuticamente ativos dos mesmos.

Também pode incluir análogos farmaceuticamente ativos de um peptídeo ou proteína.

[0323] Exemplos de proteínas farmaceuticamente ativas incluem, mas não se limitam a, citocinas e proteínas do sistema imunológico, tais como compostos imunologicamente ativos (por exemplo, interleucinas, fator estimulador de colônias (CSF), fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-

CSF), eritropoietina, fator de necrose tumoral (TNF), interferons, integrinas,

adresinas, seletinas, receptores homing, receptores de células T,

imunoglobulinas, antígenos do complexo principal de histocompatibilidade solúvel, antígenos imunologicamente ativos tais como antígenos bacterianos,

parasitários ou virais, alérgenos, auto-antígenos, anticorpos), hormônios

(insulina, hormônio tireoidiano, catecolaminas, gonadotrofinas, hormônios tróficos, prolactina, oxitocina, dopamina, somatotropina bovina, leptinas e assim por diante), hormônios de crescimento (por exemplo, hormônio de crescimento humano), fatores de crescimento (por exemplo, fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento nervoso, fator de crescimento semelhante à insulina e assim por diante), receptores de fator de crescimento, enzimas

(ativador de plasminogênio tecidual, estreptoquinase, enzimas esteriodogênicas biossintéticas e degradantes do colesterol, quinases,

fosfodiesterases, metilases, desmetilases, desidrogenases, celulases,

proteases, lipases, fosfolipases, aromatases, citocromos, adenilatos ou guanilasto ciclases, neuramidases e assim por diante), receptores (receptores de hormônios esteróides, receptores peptídicos), proteínas de ligação

(proteínas de ligação a hormônio do crescimento ou fator de crescimento e assim por diante), fatores de transcrição e tradução, proteínas supressoras de crescimento de tumores (por exemplo, proteínas que inibem a angiogênese),

proteínas estruturais (tais como colágeno, fibroína, fibrinogênio, elastina,

tubulina, actina e miosina), proteínas sanguíneas (trombina, albumina sérica,

Fator VII, Fator VIII, insulina, Fator IX, Fator X, ativador de plasminogênio tecidual, proteína C, fator de von Wilebrand, antitrombina III,

glucocerebrosidase, eritropoietina e fator estimulador de colônias de granulócitos (GCSF) ou Fator VIII modificado, anticoagulantes e assim por diante.

[0324] O termo “composto imunologicamente ativo” se refere a qualquer composto que altera uma resposta imune, por exemplo, induzindo e/ ou suprimindo a maturação das células imunes, induzindo e/ ou suprimindo a biossíntese de citocinas e/ ou alterando a imunidade humoral, estimulando a produção de anticorpos por células B. Os compostos imunologicamente ativos possuem atividade imunoestimulante potente, incluindo, mas não se limitando a, atividade antiviral e antitumoral, e também podem regular negativamente outros aspectos da resposta imune, por exemplo, afastando a resposta imune de uma resposta imune TH2, que é útil para o tratamento de uma ampla faixa de doenças mediadas por TH2. Os compostos imunologicamente ativos podem ser úteis como adjuvantes de vacina.

[0325] Em uma forma de realização, um peptídeo ou proteína farmaceuticamente ativo compreende um ou mais antígenos ou um ou mais epítopos, isto é, a administração do peptídeo ou proteína a um sujeito induz uma resposta imune contra o um ou mais antígenos ou um ou mais epítopos em um sujeito, que pode ser terapêutico ou parcialmente ou totalmente protetor.

[0326] O termo “antígeno” se refere a um agente compreendendo um epítopo contra o qual uma resposta imune pode ser gerada. O termo “antígeno” inclui, em particular, proteínas e peptídeos. Em uma forma de realização, um antígeno é apresentado por células do sistema imunológico, tais como células apresentadoras de antígeno, como células dendríticas ou macrófagos. Um antígeno ou um produto de processamento do mesmo, tal como um epítopo de célula T está, em uma forma de realização, ligado por um receptor de célula T ou B, ou por uma molécula de imunoglobulina, tal como um anticorpo. Por conseguinte, um antígeno ou um produto de processamento do mesmo pode reagir especificamente com anticorpos ou linfócitos T (células T). Em uma forma de realização, um antígeno é um antígeno associado à doença, tal como um antígeno tumoral, um antígeno viral ou um antígeno bacteriano e um epítopo é derivado desse antígeno.

[0327] O termo “antígeno associado à doença” é usado em seu sentido mais amplo para se referir a qualquer antígeno associado a uma doença. Um antígeno associado à doença é uma molécula que contém epítopos que estimularão o sistema imunológico de um hospedeiro a produzir uma resposta imune específica ao antígeno celular e/ ou uma resposta de anticorpo humoral contra a doença. O antígeno associado à doença ou um epítopo do mesmo pode, portanto, ser utilizado para fins terapêuticos. Os antígenos associados à doença podem estar associados à infecção por micróbios, tipicamente antígenos microbianos, ou associados ao câncer, tipicamente tumores.

[0328] O termo “antígeno tumoral” se refere a um constituinte de células cancerígenas que pode ser derivado do citoplasma, da superfície celular e do núcleo celular. Em particular, se refere aos antígenos que são produzidos intracelularmente ou como antígenos de superfície nas células tumorais.

[0329] O termo “antígeno viral” se refere a qualquer componente viral com propriedades antigênicas, isto é, capaz de provocar uma resposta imune em um indivíduo. O antígeno viral pode ser uma ribonucleoproteína viral ou uma proteína de envelope.

[0330] O termo “antígeno bacteriano” se refere a qualquer componente bacteriano com propriedades antigênicas, isto é, capaz de provocar uma resposta imune em um indivíduo. O antígeno bacteriano pode ser derivado da parede celular ou membrana citoplasmática da bactéria.

[0331] O termo “epítopo” se refere a uma parte ou fragmento de uma molécula, tal como um antígeno que é reconhecido pelo sistema imunológico. Por exemplo, o epítopo pode ser reconhecido por células T,

células B ou anticorpos. Um epítopo de um antígeno pode incluir uma porção contínua ou descontínua do antígeno e pode ter entre cerca de 5 e cerca de 100 aminoácidos de comprimento. Em uma forma de realização, um epítopo tem entre cerca de 10 e cerca de 25 aminoácidos de comprimento. O termo “epítopo” inclui epítopos de células T.

[0332] O termo “epítopo de célula T” se refere a uma parte ou fragmento de uma proteína que é reconhecida por uma célula T quando apresentada no contexto de moléculas de MHC. O termo “complexo principal de histocompatibilidade” e a abreviatura “MHC” incluem moléculas de MHC de classe I e MHC de classe II e se refere a um complexo de genes que está presente em todos os vertebrados. Proteínas ou moléculas de MHC são importantes para sinalizar entre linfócitos e células apresentadoras de antígeno ou células doentes em reações imunes, em que as proteínas ou moléculas de MHC ligam epítopos peptídicos e os apresentam para reconhecimento pelos receptores de células T em células T. As proteínas codificadas pelo MHC são expressas na superfície das células e exibem auto-antígenos (fragmentos peptídicos da própria célula) e não auto-antígenos (por exemplo, fragmentos de microorganismos invasores) a uma célula T. No caso de complexos de MHC de classe I/ peptídeo, os peptídeos de ligação possuem tipicamente cerca de 8 a cerca de 10 aminoácidos de comprimento, embora peptídeos mais longos ou mais curtos possam ser eficazes. No caso de complexos de MHC de classe II / peptídeo, os peptídeos de ligação possuem tipicamente cerca de 10 a cerca de 25 aminoácidos de comprimento e, em particular, cerca de 13 a cerca de 18 aminoácidos de comprimento, embora peptídeos mais longos e mais curtos possam ser eficazes.

[0333] Em certas formas de realização da presente invenção, o RNA codifica pelo menos um epítopo. Em certas formas de realização, o epítopo é derivado de um antígeno tumoral. O antígeno tumoral pode ser um antígeno “padrão”, que geralmente é conhecido por ser expresso em vários cânceres. O antígeno tumoral também pode ser um “neo-antígeno”, que é específico ao tumor de um indivíduo e não foi reconhecido anteriormente pelo sistema imunológico. Um neo-antígeno ou neo-epítopo pode resultar de uma ou mais mutações específicas do câncer no genoma de células cancerígenas, resultando em alterações de aminoácidos. Exemplos de antígenos tumorais incluem, sem limitação, p53, ART-4, BAGE, beta-catenina/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, proteínas da superfície celular da família claudin, tais como CLAUD ΓΝ-6, CLAUDIN-18.2 e CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap 100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (ou hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, de preferência MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE- A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A 10, MAGE-A 11, ou MAGE- A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1 /Melan-A, MC1R, Miosina/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, menor pl90 BCR-abL, Pml/RARa, PRAME, proteinase 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 ou RU2, SAGE, SART-1 ou SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE, WT e WT-1.

[0334] As mutações de câncer variam de acordo com cada indivíduo. Assim, mutações de câncer que codificam novos epítopos (neo- epítopos) representam alvos atraentes no desenvolvimento de composições de vacinas e imunoterapias. A eficácia da imunoterapia para tumores depende da seleção de antígenos e epítopos específicos para o câncer, capazes de induzir uma resposta imune potente dentro de um hospedeiro. O RNA pode ser usado para fornecer epítopos tumorais específicos do paciente a um paciente. As células dendríticas (DCs) residentes no baço representam células apresentadoras de antígenos de interesse particular para a expressão de RNA de epítopos imunogênicos ou antígenos, tais como epítopos tumorais. Foi demonstrado que o uso de múltiplos epítopos promove eficácia terapêutica em composições de vacinas para tumores. O sequenciamento rápido do mutanoma do tumor pode fornecer vários epítopos para vacinas individualizadas que podem ser codificados pelo RNA aqui descrito, por exemplo, como um único polipeptídeo em que os epítopos são opcionalmente separados por ligantes. Em certas formas de realização da presente invenção, o RNA codifica pelo menos um epítopo, pelo menos dois epítopos, pelo menos três epítopos, pelo menos quatro epítopos, pelo menos cinco epítopos, pelo menos seis epítopos, pelo menos sete epítopos, pelo menos oito epítopos, pelo menos nove epítopos ou pelo menos dez epítopos. Formas de realização exemplificativas incluem RNA que codifica pelo menos cinco epítopos (denominado “pentatopo”) e RNA que codifica pelo menos dez epítopos (denominado “decatopo”).

RAZÃO DE CARGA

[0335] A carga elétrica das partículas de lipoplexo de RNA da presente invenção é a soma das cargas elétricas presentes no pelo menos um lipídio catiônico e as cargas elétricas presentes no RNA. A razão de carga é a razão entre as cargas positivas presentes no pelo menos um lipídio catiônico e as cargas negativas presentes no RNA. A razão de carga das cargas positivas presentes no pelo menos um lipídio catiônico para as cargas negativas presentes no RNA é calculada pela seguinte equação: razão de carga = [(concentração de lipídio catiônico (mol)) * (o número total de cargas positivas no lipídio catiônico)]/ [(concentração de RNA (mol)) * (o número total de cargas negativas no RNA)]. A concentração de RNA e a quantidade do pelo menos um lipídio catiônico podem ser determinadas usando métodos de rotina por um técnico no assunto.

[0336] Em uma primeira forma de realização, em pH fisiológico, a razão de carga de cargas positivas para cargas negativas nas partículas de lipoplexo de RNA é de cerca de 1,9:2 a cerca de 1:2. Em formas de realização específicas, a razão de carga de cargas positivas para cargas negativas nas partículas de lipoplexo de RNA em pH fisiológico é de cerca de 1,9:2,0, cerca de 1,8:2,0, cerca de 1,7:2,0, cerca de 1,6:2,0, cerca de 1,5:2,0, cerca de 1,4:2.0, cerca de 1,3:2,0, cerca de 1,2:2,0, cerca de 1,1:2,0 ou cerca de 1:2,0.

Em uma forma de realização, a razão de carga de cargas positivas para cargas negativas nas partículas de lipoplexo de RNA em pH fisiológico é de 1,3:2,0.

Em outra forma de realização, as partículas de lipoplexo de RNA descritas aqui podem ter um número igual de cargas positivas e negativas em pH fisiológico, produzindo partículas de lipoplexo de RNA com uma razão de carga líquida neutra.

[0337] Em uma segunda forma de realização, em pH fisiológico, a razão de carga de cargas positivas para cargas negativas nas partículas de lipoplexo de RNA é de cerca de 6:1 a cerca de 1,5:1. Em formas de realização específicas, a razão de carga de cargas positivas para cargas negativas nas partículas de lipoplexo de RNA em pH fisiológico é de cerca de 6,0:1,0, cerca de 5,9:1,0, cerca de 5,8:1,0, cerca de 5,7:1,0, cerca de 5,6:1,0, cerca de 5,5:1,0, cerca de 5,4:1,0, cerca de 5,3:1,0, cerca de 5,2:1,0, cerca de 5,1:1,0, cerca de 5,0:1,0, cerca de 4,9:1,0, cerca de 4,8:1,0, cerca de 4,7:1,0, cerca de 4,6:1,0, cerca de 4,5:1,0, cerca de 4,4:1,0, cerca de 4,3:1,0, cerca de 4,2:1,0, cerca de 4,1:1,0, cerca de 4,0:1,0, cerca de 3,9:1,0, cerca de 3,8:1,0, cerca de 3,7:1,0, cerca de 3,6:1,0, cerca de 3,5:1,0, cerca de 3,4:1,0, cerca de 3,3:1,0, cerca de 3,2:1,0, cerca de 3,1:1,0, cerca de 3,0:1,0, cerca de 2,9:1,0, cerca de 2,8:1,0, cerca de 2,7:1,0, cerca de 2,6:1,0, cerca de 2,5:1,0, cerca de 2,4:1,0, cerca de 2,3:1,0, cerca de 2,2:1,0, cerca de 2,1:1,0, cerca de 2,0:1,0, cerca de 1,9:1,0, cerca de 1,8:1,0, cerca de 1,7:1,0, cerca de 1,6:1,0 ou cerca de 1,5:1,0.

[0338] Para a imunoterapia baseada em RNA, é necessário atingir órgãos precisos, tais como o baço, para evitar uma resposta autoimune em outros órgãos e uma potencial toxicidade. De acordo com a invenção, o RNA pode ser direcionado a diferentes células, tecidos ou órgãos.

[0339] Verificou-se que as partículas de lipoplexo de RNA com uma razão de carga de acordo com a primeira forma de realização podem ser usadas para atingir preferencialmente tecido do baço ou células do baço, tais como células apresentadoras de antígeno, em particular células dendríticas.

Por conseguinte, em uma forma de realização, após a administração das partículas de lipoplexo de RNA, ocorre acúmulo de RNA e/ ou expressão de RNA no baço. Assim, as partículas de lipoplexo de RNA da invenção podem ser usadas para expressar RNA no baço. Em uma forma de realização, após a administração das partículas de lipoplexo de RNA, não ocorre ou essencialmente não ocorre acúmulo de RNA e/ ou expressão de RNA no pulmão e/ ou fígado. Em uma forma de realização, após a administração das partículas de lipoplexo de RNA, ocorre acúmulo de RNA e/ ou expressão de RNA em células apresentadoras de antígeno, tais como células apresentadoras de antígenos profissionais no baço. Assim, as partículas de lipoplexo de RNA da invenção podem ser usadas para expressar RNA nessas células apresentadoras de antígeno. Em uma forma de realização, as células apresentadoras de antígeno são células dendríticas e/ ou macrófagos.

[0340] Verificou-se que partículas de lipoplexo de RNA com uma razão de carga de acordo com a segunda forma de realização podem ser usadas para atingir preferencialmente tecido pulmonar ou células pulmonares.

Por conseguinte, em uma forma de realização, após a administração das partículas de lipoplexo de RNA, ocorre acúmulo de RNA e/ ou expressão de RNA no pulmão. Assim, as partículas de lipoplexo de RNA da invenção podem ser usadas para expressar RNA no pulmão. Por conseguinte, se a expressão de RNA em outro tecido que não o baço for desejada, nas formas de realização aqui descritas em conexão com uma razão de carga de acordo com a primeira forma de realização, por exemplo, uma razão de carga de cerca de 1:2 a cerca de 1,9:2, uma razão de carga de acordo com a segunda forma de realização, por exemplo, uma razão de carga de cerca de 6:1 a cerca de 1,5:1, pode ser usada em vez da razão de carga de acordo com a primeira forma de realização. Nestas e outras formas de realização aqui descritas, o RNA diferente do RNA que codifica um peptídeo ou proteína compreendendo pelo menos um epítopo, por exemplo, o RNA que codifica um peptídeo ou proteína farmaceuticamente ativo, como aqui descrito, pode ser usado. Em uma forma de realização, o peptídeo ou proteína farmaceuticamente ativo é uma citocina e/ ou o tratamento de câncer de pulmão é pretendido.

COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO PARTÍCULAS DE LIPOPLEXO DE RNA A. SAL E FORÇA IÔNICA

[0341] De acordo com a presente invenção, as composições aqui descritas podem compreender sais, tais como cloreto de sódio. Sem desejar estar vinculado à teoria, o cloreto de sódio funciona como um agente de osmolalidade iônica para pré-condicionar o RNA antes da mistura com o pelo menos um lipídio catiônico. Certas formas de realização contemplam sais orgânicos ou inorgânicos alternativos ao cloreto de sódio na presente invenção.

Os sais alternativos incluem, sem limitação, cloreto de potássio, fosfato dipotássico, fosfato monopotássico, acetato de potássio, bicarbonato de potássio, sulfato de potássio, acetato de potássio, fosfato dissódico, fosfato monossódico, acetato de sódio, bicarbonato de sódio, sulfato de sódio, acetato de sódio, cloreto de lítio, cloreto de magnésio, fosfato de magnésio, cloreto de cálcio e sais de sódio de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).

[0342] Geralmente, as composições compreendendo partículas de lipoplexo de RNA aqui descritas compreendem cloreto de sódio em uma concentração que preferencialmente varia de 0 mM a cerca de 500 mM, de cerca de 5 mM a cerca de 400 mM, ou de cerca de 10 mM a cerca de 300 mM.

Em uma forma de realização, as composições compreendendo partículas de lipoplexo de RNA compreendem uma força iônica correspondente a essas concentrações de cloreto de sódio.

[0343] Geralmente, as composições para e resultantes da formação de partículas de lipoplexo de RNA a partir de RNA e lipossomas, tais como os aqui descritos, compreendem altas concentrações de cloreto de sódio ou compreendem uma força iônica alta. Em uma forma de realização, o cloreto de sódio está em uma concentração de pelo menos 45 mM. Em uma forma de realização, o cloreto de sódio está em uma concentração de cerca de 45 mM a cerca de 300 mM, ou de cerca de 50 mM a cerca de 150 mM. Em uma forma de realização, as composições compreendem uma força iônica correspondente a tais concentrações de cloreto de sódio.

[0344] Geralmente, as composições para armazenar partículas de lipoplexo de RNA, tais como para o congelamento de partículas de lipoplexo de RNA, tais como aquelas aqui descritas, compreendem baixas concentrações de cloreto de sódio ou compreendem uma baixa força iônica. Em uma forma de realização, o cloreto de sódio está em uma concentração de 0 mM a cerca de 50 mM, de 0 mM a cerca de 40 mM, ou de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM.

Em formas de realização específicas, o cloreto de sódio está em uma concentração de cerca de 1 mM, cerca de 2 mM, cerca de 3 mM, cerca de 4 mM, cerca de 5 mM, cerca de 6 mM, cerca de 7 mM, cerca de 8 mM, cerca de 9 mM, cerca de 10 mM, cerca de 11 mM, cerca de 12 mM, cerca de 13 mM, cerca de 14 mM, cerca de 15 mM, cerca de 16 mM, cerca de 17 mM, cerca de 18 mM, cerca de 19 mM, cerca de 20 mM, cerca de 21 mM, cerca de 22 mM, cerca de 23 mM, cerca de 24 mM, cerca de 25 mM, cerca de 26 mM, cerca de 27 mM, cerca de 28 mM, cerca de 29 mM, cerca de 30 mM, cerca de 31 mM, cerca de 32 mM, cerca de 33 mM, cerca de 34 mM, cerca de 35 mM, cerca de 36 mM, cerca de 37 mM, cerca de 38 mM, cerca de 39 mM, cerca de 40 mM,

cerca de 41 mM, cerca de 42 mM, cerca de 43 mM, cerca de 44 mM, cerca de 45 mM, cerca de 46 mM, cerca de 47 mM, cerca de 48 mM, cerca de 49 mM ou cerca de 50 mM. Em formas de realização preferidas, o cloreto de sódio está em uma concentração de cerca de 20 mM, cerca de 30 mM ou cerca de 40 mM. Em uma forma de realização exemplificativa, o cloreto de sódio está em uma concentração de 20 mM. Em outra forma de realização exemplificativa, o cloreto de sódio está em uma concentração de 30 mM. Em uma forma de realização, as composições compreendem uma força iônica correspondente a tais concentrações de cloreto de sódio.

[0345] Geralmente, as composições resultantes do descongelamento das composições de partículas de lipoplexo de RNA congeladas e, opcionalmente, ajuste da osmolalidade e da força iônica adicionando um líquido aquoso, compreendem altas concentrações de cloreto de sódio ou compreendem uma alta força iônica. Em uma forma de realização, o cloreto de sódio está em uma concentração de cerca de 50 mM a cerca de 300 mM, ou de cerca de 80 mM a cerca de 150 mM. Em uma forma de realização, as composições compreendem uma força iônica correspondente a tais concentrações de cloreto de sódio.

B. ESTABILIZADOR

[0346] As composições aqui descritas podem compreender um estabilizador para evitar perda substancial da qualidade do produto e, em particular, perda substancial da atividade de RNA durante o congelamento, liofilização ou secagem por pulverização e armazenamento da composição congelada, liofilizada ou seca por pulverização. Essa composição também é aqui referida como estável. Tipicamente, o estabilizador está presente antes do processo de congelamento, liofilização ou secagem por pulverização e persiste na preparação congelada, liofilizada ou criodessecada resultante. Pode ser usado para proteger partículas de lipoplexo de RNA durante o congelamento,

liofilização ou secagem por pulverização e armazenamento da preparação congelada, liofilizada ou criodessecada, por exemplo, para reduzir ou impedir a agregação, colapso de partículas, degradação de RNA e/ ou outros tipos de danos.

[0347] Em uma forma de realização, o estabilizador é um carboidrato. O termo “carboidrato”, como aqui utilizado, se refere a e abrange monossacarídeos, dissacarídeos, trissacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos.

[0348] Em uma forma de realização, o estabilizador é um monossacarídeo. O termo “monossacarídeo”, como aqui utilizado, se refere a uma única unidade de carboidrato (por exemplo, um açúcar simples) que não pode ser hidrolisada em unidades de carboidratos mais simples.

Estabilizadores de monossacarídeo exemplificativos incluem glicose, frutose, galactose, xilose, ribose e assim por diante.

[0349] Em uma forma de realização, o estabilizador é um dissacarídeo. O termo “dissacarídeo”, como aqui utilizado, se refere a um composto ou uma porção química formada por 2 unidades de monossacarídeo que são ligadas entre si através de uma ligação glicosídica, por exemplo, através de ligações 1-4 ou ligações 1-6. Um dissacarídeo pode ser hidrolisado em dois monossacarídeos. Estabilizadores de dissacarídeos exemplificativos incluem sacarose, trealose, lactose, maltose e assim por diante.

[0350] O termo “trissacarídeo” significa três açúcares ligados entre si para formar uma molécula. Exemplos de trissacarídeos incluem rafinose e melezitose.

[0351] Em uma forma de realização, o estabilizador é um oligossacarídeo. O termo “oligossacarídeo”, conforme aqui utilizado, se refere a um composto ou uma porção química formada por 3 a cerca de 15, de preferência 3 a cerca de 10 unidades de monossacarídeo que são ligadas por meio de ligações glicosídicas, por exemplo, por ligações 1-4 ou ligações 1-6, para formar uma estrutura linear, ramificada ou cíclica. Estabilizadores de oligossacarídeos exemplificativos incluem ciclodextrinas, rafinose, melezitose, maltotriose, estaquiose, acarbose e assim por diante. Um oligossacarídeo pode ser oxidado ou reduzido.

[0352] Em uma forma de realização, o estabilizador é um oligossacarídeo cíclico. O termo “oligossacarídeo cíclico”, como aqui utilizado, se refere a um composto ou uma porção química formada por 3 a cerca de 15, de preferência 6, 7, 8, 9 ou 10 unidades de monossacarídeo que são ligadas por meio de ligações glicosídicas, por exemplo, através de ligações 1-4 ou ligações 1-6, para formar uma estrutura cíclica. Estabilizadores de oligossacarídeos cíclicos exemplificativos incluem oligossacarídeos cíclicos que são compostos discretos, tais como α ciclodextrina, β ciclodextrina ou γ ciclodextrina.

[0353] Outros estabilizadores de oligossacarídeos cíclicos exemplificativos incluem compostos que incluem uma porção de ciclodextrina em uma estrutura molecular maior, tal como um polímero que contém uma porção de oligossacarídeo cíclico. Um oligossacarídeo cíclico pode ser oxidado ou reduzido, por exemplo, oxidado a formas dicarbonílicas. O termo “porção ciclodextrina”, como aqui utilizado, se refere ao radical ciclodextrina (por exemplo, uma α, β ou γ ciclodextrina) que é incorporado em, ou uma parte de uma estrutura molecular maior, tal como um polímero. Uma porção de ciclodextrina pode ser ligada a uma ou mais outras porções diretamente, ou através de um ligante opcional. Uma porção de ciclodextrina pode ser oxidada ou reduzida, por exemplo, oxidada a formas dicarbonílicas.

[0354] Os estabilizadores de carboidratos, por exemplo, estabilizadores de oligossacarídeos cíclicos, podem ser carboidratos derivatizados. Por exemplo, em uma forma de realização, o estabilizador é um oligossacarídeo cíclico derivatizado, por exemplo, uma ciclodextrina derivatizada, por exemplo, 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina, por exemplo, ciclodextrinas parcialmente eterificadas (por exemplo, β ciclodextrinas parcialmente eterificadas).

[0355] Um estabilizador exemplificativo é um polissacarídeo. O termo “polissacarídeo”, como aqui utilizado, se refere a um composto ou uma porção química formada por pelo menos 16 unidades de monossacarídeos que são ligadas por meio de ligações glicosídicas, por exemplo, através de ligações 1-4 ou ligações 1-6, para formar uma estrutura linear, ramificada ou cíclica e inclui polímeros que compreendem polissacarídeos como parte de sua estrutura principal. Nas estruturas principais, o polissacarídeo pode ser linear ou cíclico. Estabilizadores de polissacarídeo exemplificativos incluem glicogênio, amilase, celulose, dextrano, maltodextrina e assim por diante.

[0356] Em uma forma de realização, o estabilizador é um álcool de açúcar. Como aqui utilizado, o termo “álcool de açúcar” se refere a produtos de redução de “açúcares” e indica que todos os átomos de oxigênio em uma molécula simples de álcool de açúcar estão presentes na forma de grupos hidroxila. Os álcoois de açúcar são “polióis”. Este termo se refere a compostos químicos contendo três ou mais grupos hidroxila e é sinônimo de outro termo habitual, álcool poli-hídrico. Exemplos de álcoois de açúcar incluem, mas não estão limitados a, sorbitol, manitol, maltitol, lactitol, eritritol, glicerina, xilitol ou inositol.

[0357] De acordo com a presente invenção, são fornecidas composições farmacêuticas que incluem sacarose como estabilizante. Sem desejar estar limitado pela teoria, a sacarose funciona para promover a crioproteção da composição, impedindo assim a agregação de partículas de lipoplexo de RNA e mantendo a estabilidade química e física da composição.

Certas formas de realização contemplam estabilizadores alternativos à sacarose na presente invenção. Estabilizadores alternativos incluem, sem limitação, trealose, glicose, frutose, arginina, glicerina, manitol, prolina, sorbitol, glicina betaína e dextrano. Em uma forma de realização específica, um estabilizador alternativo à sacarose é a trealose.

[0358] Em uma forma de realização, o estabilizador está em uma concentração de cerca de 5% (p/v) a cerca de 35% (p/v), ou de cerca de 10% (p/v) a cerca de 25% (p/v). Em formas de realização específicas, o estabilizador está em uma concentração de cerca de 10% (p/v), cerca de 11% (p/v), cerca de 12% (p/v), cerca de 13% (p/v), cerca de 14% (p/v), cerca de 15% (p/v), cerca de 16% (p/v), cerca de 17% (p/v), cerca de 18% (p/v), cerca de 19% (p/v), cerca de 20% (p/v), cerca de 21% (p/v), cerca de 22% (p/v), cerca de 23% (p/v), cerca de 24% (p/v) ou cerca de 25% (p/v). Em uma forma de realização preferida, o estabilizador está em uma concentração de cerca de 15% (p/v) a cerca de 25% (p/v). Em outra forma de realização preferida, o estabilizador está em uma concentração de cerca de 20% (p/v) a cerca de 25% (p/v). Em uma forma de realização exemplificativa, o estabilizador está em uma concentração de cerca de 25% (p/v). Em outra forma de realização exemplificativa, o estabilizador está em uma concentração de cerca de 22% (p/v). Nas formas de realização da invenção, o estabilizador é sacarose ou trealose. Em uma forma de realização da invenção, o estabilizador é sacarose.

Em uma forma de realização da invenção, o estabilizador é trealose.

[0359] De acordo com a presente invenção, as composições de partículas de lipoplexo de RNA descritas aqui possuem uma concentração de estabilizador adequada para a estabilidade da composição, em particular para a estabilidade das partículas de lipoplexo de RNA e para a estabilidade do RNA. C. PH E TAMPÃO

[0360] De acordo com a presente invenção, as composições de partículas de lipoplexo de RNA descritas aqui possuem um pH adequado para a estabilidade das partículas de lipoplexo de RNA e, em particular, para a estabilidade do RNA. Em uma forma de realização, as composições de partículas de lipoplexo de RNA descritas aqui possuem um pH de cerca de 5,7 a cerca de 6,7. Em formas de realização específicas, as composições possuem um pH de cerca de 5,7, cerca de 5,8, cerca de 5,9, cerca de 6,0, cerca de 6,1, cerca de 6,2, cerca de 6,3, cerca de 6,4, cerca de 6,5, cerca de 6,6 ou cerca de 6,7.

[0361] De acordo com a presente invenção, são fornecidas composições que incluem tampão. Sem desejar ser limitado pela teoria, o uso de tampão mantém o pH da composição durante a fabricação, armazenamento e uso da composição. Em certas formas de realização da presente invenção, o tampão pode ser bicarbonato de sódio, fosfato monossódico, fosfato dissódico, fosfato monopotássico, fosfato dipotássico, ácido [tris(hidroximetil)metilamino] propanossulfônico (TAPS), ácido 2-(Bis(2-hidroxietil)amino)acético (Bicina), 2- Amino-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol (Tris), N-(2-Hidroxi-1,1-bis(hidroximetil) etil)glicina (Tricina), ácido 3-[[1,3-di-hidroxi-2-(hidroximetil)propan-2-il]amino]-2- hidroxipropano-1-sulfônico (TAPSO), ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il] etanossulfônico (HEPES), ácido 2-[[1,3-di-hidroxi-2-(hidroximetil)propan-2-il] amino]etanossulfônico (TES), ácido 1,4-piperazinodietanossulfônico (PIPES), ácido dimetilarsínico, ácido 2-morfolin-4-iletanossulfônico (MES), ácido 3- morfolino-2-hidroxipropanossulfônico (MOPSO) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). Outros tampões adequados podem ser ácido acético em um sal, ácido cítrico em um sal, ácido bórico em um sal e ácido fosfórico em um sal.

[0362] Em algumas formas de realização, o tampão tem um pH de cerca de 5,7 a cerca de 6,7. Em formas de realização específicas, o tampão tem um pH de cerca de 5,7, cerca de 5,8, cerca de 5,9, cerca de 6,0, cerca de 6,1, cerca de 6,2, cerca de 6,3, cerca de 6,4, cerca de 6,5, cerca de 6,6 ou cerca de 6,7. Em uma forma de realização, o tampão é HEPES. Em uma forma de realização preferida, o HEPES tem um pH de cerca de 5,7 a cerca de 6,7.

Em formas de realização específicas, o HEPES tem um pH de cerca de 5,7, cerca de 5,8, cerca de 5,9, cerca de 6,0, cerca de 6,1, cerca de 6,2, cerca de 6,3, cerca de 6,4, cerca de 6,5, cerca de 6,6 ou cerca de 6,7. Em uma forma de realização exemplificativa, o HEPES tem um pH de cerca de 6,2.

[0363] Ainda em outra forma de realização, o tampão tem uma concentração de cerca de 2,5 mM a cerca de 10 mM. Em formas de realização específicas em que HEPES é o tampão, a concentração de HEPES é de cerca de 2,5 mM, cerca de 2,75 mM, 3,0 mM, cerca de 3,25 mM, cerca de 3,5 mM, cerca de 3,75 mM, cerca de 4,0 mM, cerca de 4,25 mM, cerca de 4,5 mM, cerca de 4,75 mM, cerca de 5,0 mM, cerca de 5,25 mM, cerca de 5,5 mM, cerca de 5,75 mM, cerca de 6,0 mM, cerca de 6,25 mM, cerca de 6,5 mM, cerca de 6,75 mM, cerca de 7,0 mM, cerca de 7,25 mM, cerca de 7,5 mM, cerca de 7,75 mM, cerca de 8,0 mM, cerca de 8,25 mM, cerca de 8,5 mM, cerca de 8,75 mM, cerca de 9,0 mM, cerca de 9,25 mM, cerca de 9,5 mM, cerca de 9,75 mM ou cerca de 10,0 mM. Em uma forma de realização preferida, o HEPES está em uma concentração de cerca de 7,5 mM.

D. AGENTE QUELANTE

[0364] Certas formas de realização da presente invenção contemplam o uso de um agente quelante. Os agentes quelantes referem-se a compostos químicos que são capazes de formar pelo menos duas ligações covalentes coordenadas com um íon metálico, gerando assim um complexo estável e solúvel em água. Sem desejar estar vinculado à teoria, os agentes quelantes reduzem a concentração de íons bivalentes livres que, de outra forma, podem induzir a degradação acelerada do RNA na presente invenção.

Exemplos de agentes quelantes adequados incluem, sem limitação, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), um sal de EDTA, desferrioxamina B, deferoxamina, ditiocarb sódico, penicilamina, pentetato de cálcio, um sal de sódio de ácido pentético, succimer, trientina, ácido nitrilotriacético, ácido trans- diaminociclohexanotetraacético (DCTA), ácido dietilenotriaminopentaacético (DTPA), ácido bis(aminoetil)glicoléter-N,N,N',N'-tetraacético, ácido iminodiacético, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido fumárico ou um sal dos mesmos. Em certas formas de realização, o agente quelante é EDTA ou um sal de EDTA. Em uma forma de realização exemplificativa, o agente quelante é o di-hidrato dissódico de EDTA.

[0365] Em algumas formas de realização, o EDTA está em uma concentração de cerca de 0,25 mM a cerca de 5 mM. Em formas de realização específicas, o EDTA está em uma concentração de cerca de 0,25 mM, cerca de 0,3 mM, cerca de 0,4 mM, cerca de 0,5 mM, cerca de 0,6 mM, cerca de 0,7 mM, cerca de 0,8 mM, cerca de 0,9 mM, cerca de 1,0 mM, cerca de 1,1 mM, cerca de 1,2 mM, cerca de 1,3 mM, cerca de 1,4 mM, cerca de 1,5 mM, cerca de 1,6 mM, cerca de 1,7 mM, cerca de 1,8 mM, cerca de 1,9 mM, cerca de 2,0 mM, cerca de 2,1 mM, cerca de 2,2 mM, cerca de 2,3 mM, cerca de 2,4 mM, cerca de 2,5 mM, cerca de 2,6 mM, cerca de 2,7 mM, cerca de 2,8 mM, cerca de 2,9 mM, cerca de 3,0 mM, cerca de 3,1 mM, cerca de 3,2 mM, cerca de 3,3 mM, cerca de 3,4 mM, cerca de 3,5 mM, cerca de 3,6 mM, cerca de 3,7 mM, cerca de 3,8 mM, cerca de 3,9 mM, cerca de 4,0 mM, cerca de 4,1 mM, cerca de 4,2 mM, cerca de 4,3 mM, cerca de 4,4 mM, cerca de 4,5 mM, cerca de 4,6 mM, cerca de 4,7 mM, cerca de 4,8 mM, cerca de 4,9 mM ou cerca de 5,0 mM.

Em uma forma de realização preferida, o EDTA está em uma concentração de cerca de 2,5 mM. E. COMPOSIÇÕES EXEMPLIFICATIVAS DA INVENÇÃO

[0366] Em uma forma de realização exemplificativa, a composição de partículas de lipoplexo de RNA inclui DOTMA e DOPE em uma razão molar de cerca de 2:1 a cerca de 1:1 e RNA em uma concentração de cerca de 0,05 mg/ml que codifica pelo menos um epítopo em que, em pH fisiológico, a razão de carga de cargas positivas para cargas negativas nas partículas de lipoplexo de RNA é de cerca de 1,3:2,0; cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 20 mM; sacarose em uma concentração de cerca de 22% (p/v); HEPES em uma concentração de cerca de 7,5 mM com um pH de cerca de 6,2; e EDTA em uma concentração de cerca de 2,5 mM. Em outras formas de realização específicas, o RNA codifica cinco epítopos ou dez epítopos.

[0367] Em outra forma de realização exemplificativa, a composição de partículas de lipoplexo de RNA inclui DOTMA e DOPE em uma razão molar de cerca de 2:1 a cerca de 1:1 e RNA em uma concentração de cerca de 0,05 mg/ml que codifica pelo menos um epítopo em que, em pH fisiológico, a razão de carga de cargas positivas para cargas negativas nas partículas de lipoplexo de RNA é de cerca de 1,3:2,0; cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 30 mM; sacarose em uma concentração de cerca de 20% (p/v); HEPES em uma concentração de cerca de 7,5 mM com um pH de cerca de 6,2; e EDTA em uma concentração de cerca de 2,5 mM. Em outras formas de realização específicas, o RNA codifica cinco epítopos ou dez epítopos.

F. ESTABILIDADE DE COMPOSIÇÕES DA INVENÇÃO

[0368] Como aqui utilizado, “estável” se refere a uma composição em que os valores medidos para vários parâmetros físico-químicos estão dentro de um intervalo definido. Em uma forma de realização, a composição é analisada para avaliar a estabilidade de acordo com vários parâmetros. De acordo com a presente invenção, os parâmetros de estabilidade incluem, sem limitação, diâmetro médio das partículas de lipoplexo de RNA, índice de polidispersidade, integridade do RNA, conteúdo do RNA, pH, osmolalidade e número de partículas subvisíveis. Um técnico no assunto seria capaz de medir esses parâmetros usando técnicas e instrumentos laboratoriais de rotina. Por exemplo, os parâmetros de estabilidade podem ser avaliados usando espalhamento dinâmico de luz (DLS), obscurecimento de luz, espectrometria, eletroforese em gel de agarose, bioanalisadores ou qualquer outra técnica adequada. Em uma forma de realização, o bioanalisador é um bioanalisador Agilent 2100 (Agilent Technologies) capaz de medir a integridade do RNA e do conteúdo do RNA. Em uma forma de realização, o bioanalisador é um Analisador de Fragmentos da Advanced Analytical.

[0369] Sem desejar ser limitado pela teoria, as medições de DLS são úteis para analisar parâmetros relacionados às partículas de lipoplexo de RNA da presente invenção. Em uma forma de realização, o DLS pode ser usado para determinar o diâmetro médio das partículas de lipoplexo de RNA, que é expresso em termos de Z-médio (uma medida para o tamanho médio das partículas). Em outra forma de realização, o DLS pode ser usado para determinar o índice de polidispersidade das partículas de lipoplexo de RNA, o que indica a distribuição de tamanho e peso das partículas de lipoplexo de RNA.

[0370] Em certas formas de realização, a composição é estável quando as medições para os parâmetros de estabilidade estão dentro de um intervalo definido. Em uma forma de realização de uma composição estável, as partículas de lipoplexo de RNA possuem um diâmetro médio que difere do diâmetro médio original (ou seja, o diâmetro médio anterior ao congelamento, criodessecação ou secagem por pulverização e descongelamento ou reconstituição) em não mais que ± 20%, ± 10%, ± 5% ou ± 3% após o armazenamento, por exemplo, após o armazenamento a uma temperatura de cerca de -15 °C a cerca de -40 °C. Em uma forma de realização de uma composição estável, as partículas de lipoplexo de RNA possuem um diâmetro médio que não é maior que 20%, 10%, 5% ou 3% em comparação com o diâmetro médio original (isto é, o diâmetro médio antes do congelamento, criodessecação ou secagem por pulverização e descongelamento ou reconstituição) após armazenamento, por exemplo, após armazenamento a uma temperatura de cerca de -15 °C a cerca de -40 °C. Em outra forma de realização de uma composição estável, as partículas de lipoplexo de RNA possuem um índice de polidispersidade que difere do índice original de polidispersidade (ou seja, o índice de polidispersidade antes do congelamento, criodessecação ou secagem por pulverização e descongelamento ou reconstituição) em não mais que ± 20%, ± 10%, ± 5% ou ± 3% após o armazenamento, por exemplo, após o armazenamento a uma temperatura de cerca de -15 °C a cerca de -40 °C. Em uma forma de realização, uma composição estável tem não mais de 6.000 partículas subvisíveis com um diâmetro maior ou igual a 10 µm após o armazenamento, por exemplo, após o armazenamento a uma temperatura de cerca de -15 °C a cerca de -40 °C. Em uma forma de realização, uma composição estável tem não mais que 600 partículas subvisíveis com um diâmetro maior ou igual a 25 μm após o armazenamento, por exemplo, após o armazenamento a uma temperatura de cerca de -15 °C a cerca de -40 °C.

[0371] Em uma forma de realização de uma composição estável, a integridade do RNA é de pelo menos 80% após o armazenamento, por exemplo, após o armazenamento a uma temperatura de cerca de -15 °C a cerca de -40 °C.

[0372] Em uma forma de realização, a composição é estável a uma temperatura de armazenamento de cerca de -15 °C a cerca de -40 °C. Em formas de realização específicas, a composição é estável a uma temperatura de cerca de -15 °C, cerca de -16 °C, cerca de -17 °C, cerca de -18 °C, cerca de

-19 °C, cerca de -20 °C, cerca de - 21 °C, cerca de -22 °C, cerca de -23 °C, cerca de -24 °C, cerca de -25 °C, cerca de -26 °C, cerca de -27 °C, cerca de - 28 °C, cerca de -29 °C, cerca de -30 °C, cerca de -31 °C, cerca de -32 °C, cerca de -33 °C, cerca de -34 °C, cerca de -35 °C, cerca de -36 °C, cerca de - 37 °C, cerca de -38 °C, cerca de -39 °C ou cerca de -40 °C. Em uma forma de realização preferida, a composição é estável a uma temperatura de cerca de - 15 °C, cerca de -20 °C, cerca de -30 °C ou cerca de -40 °C.

[0373] Em uma forma de realização, a composição é estável a uma temperatura de cerca de -15 °C a cerca de -40 °C quando a composição farmacêutica é protegida da luz. Em uma forma de realização preferida, a composição é estável a uma temperatura de cerca de -15 °C a cerca de -25 °C quando a composição é protegida da luz.

[0374] Em uma forma de realização, a composição é estável a uma temperatura de cerca de -15 °C a cerca de -40 °C durante pelo menos 1 mês até cerca de 24 meses. Em formas de realização específicas, a composição é estável a uma temperatura de cerca de -15 °C a cerca de -40 °C durante pelo menos 1 mês, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, pelo menos 4 meses, pelo menos 5 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 7 meses, pelo menos 8 meses, pelo menos 9 meses, pelo menos 10 meses, pelo menos 11 meses, pelo menos 12 meses, pelo menos 13 meses, pelo menos 14 meses, pelo menos 15 meses, pelo menos 16 meses, pelo menos 17 meses, pelo menos 18 meses, pelo menos 19 meses, pelo menos 20 meses, pelo menos 21 meses, pelo menos 22 meses, pelo menos 23 meses, pelo menos 24 meses, pelo menos 25 meses, pelo menos 26 meses, pelo menos 27 meses, pelo menos 28 meses, pelo menos 29 meses, pelo menos 30 meses, pelo menos 31 meses, pelo menos 32 meses, pelo menos 33 meses, pelo menos 34 meses, pelo menos 35 meses, ou pelo menos 36 meses.

[0375] Em uma forma de realização preferida, a composição é estável a uma temperatura de cerca de -15 °C durante pelo menos 1 mês, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, pelo menos 4 meses, pelo menos 5 meses ou pelo menos 6 meses.

[0376] Em outra forma de realização preferida, a composição é estável a uma temperatura de cerca de -20 °C durante pelo menos 1 mês, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, pelo menos 4 meses, pelo menos 5 meses ou pelo menos 6 meses.

[0377] Ainda em outra forma de realização preferida, a composição é estável a uma temperatura de cerca de -30 °C durante pelo menos 1 mês, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, pelo menos 4 meses, pelo menos 5 meses ou pelo menos 6 meses.

[0378] Em uma forma de realização, a composição é estável após o congelamento a uma temperatura de cerca de -15 °C a cerca de -40 °C e o descongelamento a uma temperatura de cerca de 4 °C a cerca de 25 °C (temperatura ambiente). Em outra forma de realização, a composição é estável após o congelamento a uma temperatura de cerca de -15 °C a cerca de -40 °C e o descongelamento a uma temperatura de cerca de 4 °C a cerca de 25 °C (temperatura ambiente) em vários ciclos de congelamento e descongelamento.

G. ESTADO FÍSICO DE COMPOSIÇÕES DA INVENÇÃO

[0379] Em formas de realização, a composição da presente invenção é um líquido ou um sólido. Exemplos não limitativos de um sólido incluem uma forma congelada ou uma forma liofilizada. Em uma forma de realização preferida, a composição é um líquido.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS DA INVENÇÃO

[0380] As composições compreendendo partículas de lipoplexo de RNA aqui descritas são úteis como ou para preparar composições farmacêuticas ou medicamentos para tratamentos terapêuticos ou profiláticos.

[0381] As partículas da presente invenção podem ser administradas na forma de qualquer composição farmacêutica adequada.

[0382] O termo “composição farmacêutica” se refere a uma formulação compreendendo um agente terapeuticamente eficaz, de preferência em conjunto com veículos, diluentes e/ ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. A referida composição farmacêutica é útil para o tratamento, prevenção ou redução da gravidade de uma doença ou distúrbio pela administração da referida composição farmacêutica a um sujeito. Uma composição farmacêutica também é conhecida na técnica como uma formulação farmacêutica. No contexto da presente invenção, a composição farmacêutica compreende partículas de lipoplexo de RNA como aqui descrito.

[0383] As composições farmacêuticas da presente invenção compreendem, preferencialmente, um ou mais adjuvantes ou podem ser administradas com um ou mais adjuvantes. O termo “adjuvante” se refere a um composto que prolonga, melhora ou acelera uma resposta imune. Os adjuvantes compreendem um grupo heterogênio de compostos tais como emulsões oleosas (por exemplo, adjuvantes de Freund), compostos minerais (tais como alume), produtos bacterianos (tais como a toxina de Bordetella pertussis) ou complexos de estimulação imune. Exemplos de adjuvantes incluem, sem limitação, oligodesoxinucleotídeos LPS, GP96, CpG, fatores de crescimento e citocinas, tais como monocinas, linfocinas, interleucinas, quimiocinas. As quimiocinas podem ser IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL- 8, IL-9, IL-10, IL-12, INFa, INF-γ, GM-CSF, LT-a. Outros adjuvantes conhecidos são hidróxido de alumínio, adjuvante de Freund ou óleo como Montanide® ISA51. Outros adjuvantes adequados para uso na presente invenção incluem lipopeptídeos, tais como Pam3Cys.

[0384] As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção são geralmente aplicadas em uma “quantidade farmaceuticamente eficaz” e em “uma preparação farmaceuticamente aceitável”.

[0385] O termo “farmaceuticamente aceitável” se refere à não toxicidade de um material que não interage com a ação do componente ativo da composição farmacêutica.

[0386] O termo “quantidade farmaceuticamente eficaz” se refere à quantidade que atinge uma reação desejada ou um efeito desejado isoladamente ou em conjunto com doses adicionais. No caso do tratamento de uma doença em particular, a reação desejada se refere preferencialmente à inibição do curso da doença. Isso compreende retardar o progresso da doença e, em particular, interromper ou reverter o progresso da doença. A reação desejada no tratamento de uma doença também pode ser atraso do início ou prevenção do início da referida doença ou condição. Uma quantidade eficaz das partículas ou composições aqui descritas dependerá da condição a ser tratada, da gravidade da doença, dos parâmetros individuais do paciente, incluindo idade, condição fisiológica, tamanho e peso, da duração do tratamento, do tipo de uma terapia de acompanhamento (se presente), da via específica de administração e fatores semelhantes. Por conseguinte, as doses administradas das partículas ou composições aqui descritas podem depender de vários desses parâmetros. No caso de uma reação em um paciente ser insuficiente com uma dose inicial, doses mais altas (ou doses efetivamente mais altas alcançadas por uma via de administração diferente e mais localizada) podem ser usadas.

[0387] As composições farmacêuticas da presente invenção podem conter sais, tampões, conservantes e, opcionalmente, outros agentes terapêuticos. Em uma forma de realização, as composições farmacêuticas da presente invenção compreendem um ou mais veículos, diluentes e/ ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[0388] Conservantes adequados para uso nas composições farmacêuticas da presente invenção incluem, sem limitação, cloreto de benzalcônio, clorobutanol, parabeno e timerosal.

[0389] O termo “excipiente”, conforme aqui utilizado, se refere a uma substância que pode estar presente em uma composição farmacêutica da presente invenção, mas não é um ingrediente ativo. Exemplos de excipientes incluem, sem limitação, veículos, aglutinantes, diluentes, lubrificantes, espessantes, agentes tensoativos, conservantes, estabilizadores, emulsificantes, tampões, agentes aromatizantes ou corantes.

[0390] O termo “diluente” se refere a um agente de diluição e/ou diluente. Além disso, o termo “diluente” inclui qualquer um ou mais dentre fluido, suspensão de líquido ou sólido e/ou meio de mistura. Exemplos de diluentes adequados incluem etanol, glicerol e água.

[0391] O termo “veículo” se refere a um componente que pode ser natural, sintético, orgânico, inorgânico no qual o componente ativo é combinado, a fim de facilitar, aprimorar ou permitir a administração da composição farmacêutica. Um veículo como aqui utilizado pode ser uma ou mais cargas sólidas ou líquidas compatíveis, diluentes ou substâncias encapsulantes, que são adequados para administração ao sujeito. Um veículo adequado inclui, sem limitação, água estéril, Ringer, Ringer lactato, solução estéril de cloreto de sódio, solução salina isotônica, polialquileno glicóis, naftalenos hidrogenados e, em particular, polímeros de lactídeo biocompatíveis, copolímeros de lactídeo/ glicolídeo ou copolímeros de polioxietileno/ polioxi-propileno. Em uma forma de realização, a composição farmacêutica da presente invenção inclui solução salina isotônica.

[0392] Os veículos, excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis para uso terapêutico são bem conhecidos na arte farmacêutica e são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit., 1985).

[0393] Os veículos, excipientes ou diluentes farmacêuticos podem ser selecionados em relação à via de administração pretendida e à prática farmacêutica padrão.

VIAS DE ADMINISTRAÇÃO DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS DA INVENÇÃO

[0394] Em uma forma de realização, as composições farmacêuticas aqui descritas podem ser administradas por via intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intradérmica ou intramuscular. Em certas formas de realização, a composição farmacêutica é formulada para administração local ou administração sistêmica. A administração sistêmica pode incluir administração enteral, que envolve absorção através do trato gastrointestinal ou administração parenteral. Como aqui utilizado, “administração parenteral” se refere à administração de qualquer maneira que não seja através do trato gastrointestinal, tal como por injeção intravenosa. Em uma forma de realização preferida, as composições farmacêuticas são formuladas para administração sistêmica. Em outra forma de realização preferida, a administração sistêmica é por administração intravenosa.

ARTIGOS DE MANUFATURA

[0395] Em um aspecto, as partículas de lipoplexo de RNA descritas aqui estão presentes em uma composição farmacêutica. Em outro aspecto, uma composição aqui descrita é uma composição farmacêutica.

[0396] Em um aspecto, a invenção se refere a um frasco que contém uma composição farmacêutica aqui descrita. Em outro aspecto, a invenção se refere a uma seringa contendo uma composição farmacêutica aqui descrita.

USO DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS DA INVENÇÃO

[0397] As partículas de lipoplexo de RNA aqui descritas podem ser usadas no tratamento terapêutico ou profilático de várias doenças, em particular doenças nas quais a provisão de um peptídeo ou proteína a um sujeito resulta em um efeito terapêutico ou profilático. Por exemplo, a provisão de um antígeno ou epítopo que é derivado de um vírus pode ser útil no tratamento de uma doença viral causada pelo referido vírus. A provisão de um antígeno tumoral ou epítopo pode ser útil no tratamento de uma doença cancerígena em que as células cancerígenas expressam o referido antígeno tumoral.

[0398] O termo “doença” se refere a uma condição anormal que afeta o corpo de um indivíduo. Uma doença é muitas vezes interpretada como uma condição médica associada a sintomas e sinais específicos. Uma doença pode ser causada por fatores originalmente de uma fonte externa, como doença infecciosa, ou pode ser causada por disfunções internas, como doenças autoimunes. Nos seres humanos, “doença” é frequentemente usada de maneira mais ampla para se referir a qualquer condição que cause dor, disfunção, aflição, problemas sociais ou morte do indivíduo afetado ou problemas semelhantes para aqueles em contato com o indivíduo. Nesse sentido mais amplo, às vezes inclui lesões, incapacidades, distúrbios, síndromes, infecções, sintomas isolados, comportamentos diferentes e variações atípicas de estrutura e função, enquanto em outros contextos e para outros fins, essas podem ser consideradas categorias distinguíveis. As doenças geralmente afetam os indivíduos não apenas fisicamente, mas também emocionalmente, pois a contração e a convivência com muitas doenças podem alterar a perspectiva de alguém sobre a vida e a personalidade.

[0399] No presente contexto, o termo “tratamento”, “tratar” ou “intervenção terapêutica” se refere ao gerenciamento e cuidado de um sujeito com o objetivo de combater uma condição tal como uma doença ou distúrbio. O termo pretende incluir todo o espectro de tratamentos para uma determinada condição da qual o sujeito está sofrendo, tal como a administração do composto terapeuticamente eficaz para aliviar os sintomas ou complicações, para atrasar a progressão da doença, distúrbio ou condição, para suavizar ou aliviar os sintomas e complicações e/ ou para curar ou eliminar a doença, distúrbio ou condição, bem como para prevenir a condição, em que a prevenção deve ser entendida como o gerenciamento e o cuidado de um indivíduo com o objetivo de combater a doença, condição ou distúrbio e inclui a administração dos compostos ativos para impedir o aparecimento dos sintomas ou complicações.

[0400] O termo “tratamento terapêutico” se refere a qualquer tratamento que melhore o estado de saúde e/ ou prolongue (aumente) o tempo de vida de um indivíduo. O referido tratamento pode eliminar a doença em um indivíduo, interromper ou retardar o desenvolvimento de uma doença em um indivíduo, inibir ou retardar o desenvolvimento de uma doença em um indivíduo, diminuir a frequência ou gravidade dos sintomas em um indivíduo e/ ou diminuir a recorrência em um indivíduo que atualmente tem ou que já teve previamente uma doença.

[0401] Os termos “tratamento profilático” ou “tratamento preventivo” referem-se a qualquer tratamento destinado a impedir que uma doença ocorra em um indivíduo. Os termos “tratamento profilático” ou “tratamento preventivo” são aqui utilizados de forma intercambiável.

[0402] Os termos “indivíduo” e “sujeito” são usados aqui de forma intercambiável. Eles se referem a um humano ou outro mamífero (por exemplo, camundongo, rato, coelho, cachorro, gato, gado, suíno, ovelha, cavalo ou primata) que pode ser afetado por ou é suscetível a uma doença ou distúrbio (por exemplo, câncer), mas pode ou pode não ter a doença ou distúrbio. Em muitas formas de realização, o indivíduo é um ser humano. Salvo indicação em contrário, os termos “indivíduo” e “sujeito” não denotam uma idade específica e, portanto, abrangem adultos, idosos, crianças e recém-nascidos. Nas formas de realização da presente invenção, o “indivíduo” ou “sujeito” é um “paciente”.

[0403] O termo “paciente” significa um indivíduo ou sujeito para tratamento, em particular um indivíduo ou sujeito doente.

[0404] Em uma forma de realização da invenção, o objetivo é fornecer uma resposta imune contra células doentes que expressam um antígeno, tais como células cancerígenas que expressam um antígeno tumoral, e tratar uma doença, tal como uma doença cancerígena envolvendo células que expressam um antígeno, tal como um antígeno tumoral.

[0405] Uma composição farmacêutica compreendendo partículas de lipoplexo de RNA, como aqui descrito, compreendendo RNA que codifica um peptídeo ou proteína que compreende um ou mais antígenos ou um ou mais epítopos, pode ser administrada a um sujeito para induzir uma resposta imune contra o um ou mais antígenos ou um ou mais epítopos no sujeito que pode ser terapêutico ou parcialmente ou totalmente protetor. Um técnico no assunto saberá que um dos princípios de imunoterapia e vacinação se baseia no fato de que uma reação imunoprotetora a uma doença é produzida pela imunização de um indivíduo com um antígeno ou epítopo, que é imunologicamente relevante em relação à doença a ser tratada. Por conseguinte, as composições farmacêuticas aqui descritas são aplicáveis para induzir ou intensificar uma resposta imune. As composições farmacêuticas aqui descritas são, portanto, úteis no tratamento profilático e/ ou terapêutico de uma doença que envolve um antígeno ou epítopo.

[0406] Como aqui utilizado, “resposta imune” se refere a uma resposta física integrada a um antígeno ou uma célula que expressa um antígeno e se refere a uma resposta imune celular e/ ou uma resposta imune humoral. Uma resposta imune celular inclui, sem limitação, uma resposta celular direcionada a células que expressam um antígeno e é caracterizada pela apresentação de um antígeno com molécula de MHC de classe I ou classe II. A resposta celular se refere a linfócitos T, que podem ser classificados como células T auxiliares (também denominadas células T CD4+) que desempenham um papel central regulando a resposta imune ou células assassinas (também denominadas células T citotóxicas, células T CD8+ ou CTLs) que induzem apoptose em células infectadas ou células cancerígenas. Em uma forma de realização, a administração de uma composição farmacêutica da presente invenção envolve a estimulação de uma resposta de células T CD8+ antitumoral contra células cancerígenas que expressam um ou mais antígenos tumorais. Em uma forma de realização específica, os antígenos tumorais são apresentados com a molécula de MHC de classe I.

[0407] A presente invenção contempla uma resposta imune que pode ser protetora, preventiva, profilática e/ ou terapêutica. Como usado aqui, “induz [ou induzindo] uma resposta imune” pode indicar que nenhuma resposta imune contra um antígeno específico estava presente antes da indução ou pode indicar que havia um nível basal de resposta imune contra um antígeno específico antes da indução, que foi intensificada após indução. Portanto, “induz [ou induzindo] uma resposta imune” inclui “intensifica [ou intensificando] uma resposta imune”.

[0408] O termo “imunoterapia” se refere ao tratamento de uma doença ou condição induzindo ou intensificando uma resposta imune. O termo “imunoterapia” inclui imunização com antígeno ou vacinação com antígeno.

[0409] Os termos “imunização” ou “vacinação” descrevem o processo de administração de um antígeno a um indivíduo com o objetivo de induzir uma resposta imune, por exemplo, por razões terapêuticas ou profiláticas.

[0410] Em uma forma de realização, a presente invenção prevê formas de realização em que são administradas partículas de lipoplexo de RNA como aqui descritas visando o tecido do baço. O RNA codifica um peptídeo ou proteína compreendendo um antígeno ou um epítopo como descrito, por exemplo, neste documento. O RNA é absorvido pelas células apresentadoras de antígenos no baço, como as células dendríticas, para expressar o peptídeo ou a proteína. Após o processamento e apresentação opcionais pelas células apresentadoras de antígeno, uma resposta imune pode ser gerada contra o antígeno ou epítopo, resultando em um tratamento profilático e/ ou terapêutico de uma doença envolvendo o antígeno ou epítopo. Em uma forma de realização, a resposta imune induzida pelas partículas de lipoplexo de RNA descritas aqui compreende a apresentação de um antígeno ou fragmento do mesmo, tal como um epítopo, por células apresentadoras de antígeno, tal como células dendríticas e/ ou macrófagos, e ativação de células T citotóxicas devido a esta apresentação. Por exemplo, peptídeos ou proteínas codificados pelos RNAs ou produtos de progressão dos mesmos podem ser apresentados por proteínas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) expressas em células apresentadoras de antígeno. O complexo peptídico MHC pode então ser reconhecido por células imunes, tais como células T ou células B, levando à sua ativação.

[0411] Assim, em uma forma de realização, o RNA nas partículas de lipoplexo de RNA aqui descritas, após a administração, é entregue ao baço e/ ou é expresso no baço. Em uma forma de realização, as partículas de lipoplexo de RNA são entregues ao baço para ativar células apresentadoras de antígeno esplênicas. Assim, em uma forma de realização, após a administração das partículas de lipoplexo de RNA, ocorre a entrega de RNA e/ ou expressão de RNA em células apresentadoras de antígeno. As células apresentadoras de antígeno podem ser células apresentadoras de antígenos profissionais ou células apresentadoras de antígenos não profissionais. As células apresentadoras de antígenos profissionais podem ser células dendríticas e/ ou macrófagos, ainda mais preferencialmente células dendríticas esplênicas e/ ou macrófagos esplênicos.

[0412] Por conseguinte, a presente invenção se refere a partículas de lipoplexo de RNA ou uma composição farmacêutica compreendendo partículas de lipoplexo de RNA, como aqui descrito, para induzir ou intensificar uma resposta imune, preferencialmente uma resposta imune contra o câncer.

[0413] Em uma forma de realização adicional, a presente invenção se refere a partículas de lipoplexo de RNA ou uma composição farmacêutica compreendendo partículas de lipoplexo de RNA, como aqui descrito, para uso em um tratamento profilático e/ ou terapêutico de uma doença que envolve um antígeno, preferencialmente uma doença de câncer.

[0414] Em uma forma de realização adicional, a presente invenção se refere a um método para entregar um antígeno ou um epítopo de um antígeno às células apresentadoras de antígenos, tais como células apresentadoras de antígenos profissionais, no baço, ou expressar um antígeno ou epítopo de um antígeno nas células apresentadoras antígenos, tais como células apresentadoras de antígeno profissionais, no baço, compreendendo administrar a um sujeito partículas de lipoplexo de RNA ou uma composição farmacêutica compreendendo partículas de lipoplexo de RNA, como descrito aqui. Em uma forma de realização, o antígeno é um antígeno tumoral. Neste aspecto, o antígeno ou um epítopo de um antígeno é preferencialmente codificado pelo RNA nas partículas de lipoplexo de RNA.

[0415] Em uma forma de realização, a administração sistêmica de partículas de lipoplexo de RNA ou uma composição farmacêutica compreendendo partículas de lipoplexo de RNA, como aqui descrito, resulta em direcionamento e/ ou acúmulo de partículas de lipoplexo de RNA ou RNA no baço e não no pulmão e/ ou fígado. Em uma forma de realização, as partículas de lipoplexo de RNA liberam RNA no baço e/ ou entram nas células no baço.

Em uma forma de realização, a administração sistêmica de partículas de lipoplexo de RNA ou uma composição farmacêutica compreendendo partículas de lipoplexo de RNA, como descrito neste documento, entrega o RNA às células apresentadoras de antígeno no baço. Em uma forma de realização específica, as células apresentadoras de antígeno no baço são células dendríticas ou macrófagos.

[0416] Em uma forma de realização adicional, a presente invenção se refere a um método para induzir ou intensificar uma resposta imune em um sujeito compreendendo a administração ao sujeito de partículas de lipoplexo de RNA ou uma composição farmacêutica compreendendo partículas de lipoplexo de RNA, como aqui descrito. Em uma forma de realização exemplificativa, a resposta imune é contra o câncer.

[0417] O termo “macrófago” se refere a um subgrupo de células fagocíticas produzidas pela diferenciação de monócitos. Macrófagos que são ativados por inflamação, citocinas imunes ou produtos microbianos engolem e matam inespecificamente patógenos estranhos dentro do macrófago por ataque hidrolítico e oxidativo, resultando em degradação do patógeno. Os peptídeos das proteínas degradadas são exibidos na superfície celular dos macrófagos, onde podem ser reconhecidos pelas células T, e eles podem interagir diretamente com os anticorpos na superfície da célula B, resultando na ativação das células T e B e na estimulação adicional da resposta imune. Os macrófagos pertencem à classe de células apresentadoras de antígenos. Em uma forma de realização, os macrófagos são macrófagos esplênicos.

[0418] O termo “célula dendrítica” (DC) se refere a outro subtipo de células fagocíticas pertencentes à classe de células apresentadoras de antígeno. Em uma forma de realização, as células dendríticas são derivadas de células progenitoras hematopoiéticas de medula óssea. Essas células progenitoras se transformam inicialmente em células dendríticas imaturas.

Essas células imaturas são caracterizadas por alta atividade fagocítica e baixo potencial de ativação de células T. As células dendríticas imaturas constantemente amostram o meio circundante em busca de patógenos, tais como vírus e bactérias. Uma vez que entram em contato com um antígeno apresentável, elas são ativadas em células dendríticas maduras e começam a migrar para o baço ou para o linfonodo. As células dendríticas imaturas fagocitam os patógenos e degradam suas proteínas em pequenos pedaços e, após a maturação, apresentam esses fragmentos em sua superfície celular usando moléculas de MHC. Simultaneamente, elas regulam positivamente os receptores da superfície celular que atuam como co-receptores na ativação das células T, tais como CD80, CD86 e CD40, intensificando consideravelmente sua capacidade de ativar as células T. Elas também regulam positivamente o CCR7, um receptor quimiotático que induz a célula dendrítica a viajar pela corrente sanguínea até o baço ou pelo sistema linfático a um linfonodo. Aqui, elas atuam como células apresentadoras de antígenos e ativam células T auxiliares e células T assassinas, bem como células B, apresentando-lhes antígenos, juntamente com sinais co-estimuladores específicos não-antígenos.

Assim, as células dendríticas podem induzir ativamente uma resposta imune relacionada à célula T ou à célula B. Em uma forma de realização, as células dendríticas são células dendríticas esplênicas.

[0419] O termo “célula apresentadora de antígeno” (APC) é uma célula de uma variedade de células capazes de exibir, adquirir e/ ou apresentar pelo menos um antígeno ou fragmento antigênico sobre (ou em) sua superfície celular. As células apresentadoras de antígeno podem ser distinguidas em células apresentadoras de antígenos profissionais e células apresentadoras de antígenos não profissionais.

[0420] O termo “células apresentadoras de antígenos profissionais” se refere a células apresentadoras de antígeno que expressam constitutivamente as moléculas do Complexo Principal de Histocompatibilidade de classe II (MHC de classe II) necessárias para interação com células T simples. Se uma célula T interage com o complexo de moléculas de MHC de classe II na membrana da célula apresentadora de antígeno, a célula apresentadora de antígeno produz uma molécula coestimuladora que induz a ativação da célula T. As células apresentadoras de antígenos profissionais compreendem células dendríticas e macrófagos.

[0421] O termo “células apresentadoras de antígenos não profissionais” se refere a células apresentadoras de antígenos que não expressam constitutivamente moléculas de MHC de classe II, mas após estimulação por certas citocinas, tais como interferon-gama. Células apresentadoras de antígenos não profissionais exemplificativas incluem fibroblastos, células epiteliais tímicas, células epiteliais da tireóide, células gliais, células beta pancreáticas ou células endoteliais vasculares.

[0422] “Processamento de antígeno” se refere à degradação de um antígeno em produtos de progressão, que são fragmentos do referido antígeno (por exemplo, degradação de uma proteína em peptídeos) e a associação de um ou mais desses fragmentos (por exemplo, via ligação) a moléculas de MHC para apresentação pelas células, tais como células apresentadoras de antígeno, a células T específicas.

[0423] O termo “doença envolvendo um antígeno” ou “doença envolvendo um epítopo” se refere a qualquer doença que implique um antígeno ou epítopo, por exemplo, uma doença que é caracterizada pela presença de um antígeno ou epítopo. A doença envolvendo um antígeno ou epítopo pode ser uma doença infecciosa, ou uma doença de câncer ou simplesmente câncer.

Como mencionado acima, o antígeno pode ser um antígeno associado a uma doença, tal como um antígeno associado a um tumor, um antígeno viral ou um antígeno bacteriano e o epítopo pode ser derivado desse antígeno.

[0424] O termo “doença infecciosa” se refere a qualquer doença que pode ser transmitida de indivíduo para indivíduo ou de organismo para organismo e é causada por um agente microbiano (por exemplo, resfriado comum). As doenças infecciosas são conhecidas na arte e incluem, por exemplo, uma doença viral, uma doença bacteriana ou uma doença parasitária, cujas doenças são causadas por um vírus, uma bactéria e um parasita, respectivamente. Nesse sentido, a doença infecciosa pode ser, por exemplo, hepatite, doenças sexualmente transmissíveis (por exemplo, clamídia ou gonorreia), tuberculose, HIV/ síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS), difteria, hepatite B, hepatite C, cólera, síndrome respiratória aguda grave (SARS), gripe aviária e influenza.

[0425] Os termos “doença de câncer” ou “câncer” se referem ou descrevem a condição fisiológica em um indivíduo que é tipicamente caracterizada por crescimento celular desregulado. Exemplos de cânceres incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Mais particularmente, exemplos de tais cânceres incluem câncer de osso, câncer no sangue, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer do pâncreas, câncer de pele, câncer de cabeça ou pescoço, melanoma cutâneo ou intra-ocular, câncer uterino, câncer de ovário, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer de cólon, câncer de mama, câncer de próstata, câncer uterino, carcinoma dos órgãos sexuais e reprodutivos, doença de Hodgkin, câncer de esôfago, câncer de intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireóide, câncer da glândula paratireóide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecidos moles, câncer da bexiga, câncer do rim, carcinoma de células renais, carcinoma da pelve renal, neoplasmas do sistema nervoso central (SNC), câncer neuroectodérmico, tumores do eixo espinhal, glioma, meningioma e adenoma da hipófise. O termo “câncer” de acordo com a invenção também compreende metástases de câncer.

[0426] Estratégias de combinação no tratamento de câncer podem ser desejáveis devido a um efeito sinérgico resultante, que pode ser consideravelmente mais forte que o impacto de uma abordagem monoterapêutica. Em uma forma de realização, a composição farmacêutica é administrada com um agente imunoterapêutico. Como aqui utilizado, “agente imunoterapêutico” se refere a qualquer agente que possa estar envolvido na ativação de uma resposta imune específica e/ ou função(ões) efetora(s) imunológica(s). A presente invenção contempla o uso de um anticorpo como um agente imunoterapêutico. Sem desejar estar vinculado pela teoria, os anticorpos são capazes de alcançar um efeito terapêutico contra as células cancerígenas através de vários mecanismos, incluindo a indução de apoptose, bloquear componentes das vias de transdução de sinal ou inibir a proliferação de células tumorais. Em certas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Um anticorpo monoclonal pode induzir a morte celular via citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) ou ligar proteínas do complemento, levando à toxicidade celular direta, conhecida como citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Exemplos não limitativos de anticorpos anticâncer e possíveis alvos de anticorpos (entre parênteses) que podem ser usados em combinação com a presente invenção incluem: Abagovomab (CA-125), Abciximab (CD41), Adecatumumab (EpCAM),

Afutuzumab (CD20), Alacizumab pegol (VEGFR2), Altumomab pentetate

(CEA), Amatuximab (MORAb- 009), Anatumomab mafenatox (TAG-72),

Apolizumab (HLA-DR), Arcitumomab (CEA), Atezolizumab (PD-L1),

Bavituximab (fosfatidilserina), Bectumomab (CD22), Belimumab (BAFF),

Bevacizumab (VEGF-A), Bivatuzumab mertansina (CD44 v6), Blinatumomab

(CD 19), Brentuximab vedotin (CD30 TNFRSF8), Cantuzumab mertansin

(mucina CanAg), Cantuzumab ravtansina (MUC1), Capromab pendetide

(células de carcinoma de próstata), Carlumab (CNT0888), Catumaxomab

(EpCAM, CD3), Cetuximab (EGFR), Citatuzumab bogatox (EpCAM),

Cixutumumab (receptor IGF-1), Claudiximab (Claudin), Clivatuzumab tetraxetan

(MUC1), Conatumumab (TRAIL-R2), Dacetuzumab (CD40), Dalotuzumab

(receptor do fator de crescimento semelhante à insulina I), Denosumab

(RANKL), Detumomab (linfoma de célula B), Drozitumab (DR5), Ecromeximab

(gangliosídeo GD3), Edrecolomab (EpCAM), Elotuzumab (SLAMF7),

Enavatuzumab (PDL192), Ensituximab (NPC-1C), Epratuzumab (CD22),

Ertumaxomab (HER2/neu, CD3), Etaracizumab (integrina ανβ3), Farletuzumab

(receptor de folato 1), FBTA05 (CD20), Ficlatuzumab (SCH 900105),

Figitumumab (receptor IGF-1), Flanvotumab (glicoproteína 75), Fresolimumab

(TGF-β), Galiximab (CD80), Ganitumab (IGF-I), Gemtuzumab ozogamicina

(CD33), Gevokizumab (IL-Ιβ), Girentuximab (anidrase carbônica 9 (CA-IX)),

Glembatumumab vedotina (GPNMB), Ibritumomab tiuxetan (CD20), Icrucumab

(VEGFR-1 ), Igovoma (CA-125), Indatuximab ravtansina (SDC1), Intetumumab

(CD51), Inotuzumab ozogamicina (CD22), Ipilimumab (CD 152), Iratumumab

(CD30), Labetuzumab (CEA), Lexatumumab (TRAIL-R2), Libivirumab (antígeno de superfície da hepatite B), Lintuzumab (CD33), Lorvotuzumab mertansina

(CD56), Lucatumumab (CD40), Lumiliximab (CD23), Mapatumumab (TRAIL- R1), Matuzumab (EGFR), Mepolizumab (IL-5), Milatuzumab (CD74),

Mitumomab (gangliosídeo GD3), Mogamulizumab (CCR4), Moxetumomab pasudotox (CD22), Nacolomab tafenatox (antígeno C242), Naptumomab estafenatox (5T4), Namatumab (RON), Necitumumab (EGFR), Nimotuzumab (EGFR), Nivolumab (IgG4), Ofatumumab (CD20), Olaratumab (PDGF-R a), Onartuzumab (receptor quinase do fator de dispersão humano), Oportuzumab monatox (EpCAM), Oregovomab (CA-125), Oxelumab (OX-40), Panitumumab (EGFR), Patritumab (HER3), Pemtumoma (MUC1), Pertuzuma (HER2/neu), Pintumomab (antígeno do adenocarcinoma), Pritumumab (vimentina), Racotumomab (ácido N-glicolilneuramínico), Radretumab (domínio-B extra da fibronectina), Rafivirumab (glicoproteína do vírus da raiva), Ramucirumab (VEGFR2), Rilotumumab (HGF), Rituximab (CD20), Robatumumab (receptor IGF-1), Samalizumab (CD200), Sibrotuzumab (FAP), Siltuximab (IL-6), Tabalumab (BAFF), Tacatuzumab tetraxetan (alfa-fetoproteína), Taplitumomab paptox (CD 19), Tenatumomab (tenascina C), Teprotumumab (CD221), Ticilimumab (CTLA-4), Tigatuzumab (TRAIL-R2), TNX-650 (IL-13), Tositumomab (CD20), Trastuzumab (HER2/neu), TRBS07 (GD2), Tremelimumab (CTLA-4), Tucotuzumab celmoleucina (EpCAM), Ublituximab (MS4A1), Urelumab (4-1 BB), Volociximab (integrina α5β1), Votumumab (antígeno tumoral CTAA 16.88), Zalutumumab (EGFR) e Zanolimumab (CD4).

[0427] Em uma forma de realização, o agente imunoterapêutico é um antagonista de ligação ao eixo PD-1. Um antagonista de ligação ao eixo PD-1 inclui, mas não está limitado a um antagonista de ligação a PD-1, um antagonista de ligação a PD-L1 e um antagonista de ligação a PD-L2. Nomes alternativos para “PD-1” incluem CD279 e SLEB2. Os nomes alternativos para “PD-L1” incluem B7-H1, B7-4, CD274 e B7-H. Nomes alternativos para “PD-L2” incluem B7-DC, Btdc e CD273. Em algumas formas de realização, o antagonista de ligação ao PD-1 é uma molécula que inibe a ligação do PD-1 aos seus parceiros de ligação ao ligantes. Em um aspecto específico, os parceiros de ligação ao ligante PD-1 são PD-L1 e/ ou PD-L2. Em outra forma de realização, um antagonista de ligação ao PD-L1 é uma molécula que inibe a ligação de PD-L1 a seus parceiros de ligação. Em uma forma de realização específica, os parceiros de ligação a PD-L1 são PD-1 e/ou B7-1. Em outra forma de realização, o antagonista de ligação a PD-L2 é uma molécula que inibe a ligação de PD-L2 a seus parceiros de ligação. Em uma forma de realização específica, o parceiro de ligação ao PD-L2 é o PD-1. O antagonista de ligação ao PD-1 pode ser um anticorpo, um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, uma imunoadesina, uma proteína de fusão ou oligopeptídeo. Em algumas formas de realização, o antagonista de ligação ao PD-1 é um anticorpo anti-PD-1 (por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico). Exemplos de um anticorpo anti-PD-1 incluem, sem limitação, MDX-1106 (Nivolumab, OPDIVO), Merck 3475 (MK-3475, Pembrolizumab, KEYTRUDA), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001, REGN2810, BGB-108 e BGB-A317.

[0428] Em uma forma de realização, o antagonista de ligação ao PD-1 é uma imunoadesina que inclui uma porção extracelular ou de ligação ao PD-1 de PD-L1 ou PD-L2 fundida a uma região constante. Em uma forma de realização, o antagonista de ligação ao PD-1 é o AMP-224 (também conhecido como B7-DCIg, é um PD-L2-Fc), que é um receptor solúvel de fusão descrito nos documentos WO 2010/027827 e WO 2011/066342.

[0429] Em uma forma de realização, o antagonista de ligação ao PD-1 é um anticorpo anti-PD-L1, incluindo, sem limitação, YW243.55.S70, MPDL3280A (Atezolizumab), MEDI4736 (Durvalumab), MDX-1105 e MSB0010718C (Avelumab).

[0430] Em uma forma de realização, o agente imunoterapêutico é um antagonista de ligação a PD-1. Em outra forma de realização, o antagonista de ligação ao PD-1 é um anticorpo anti-PD-L1. Em uma forma de realização exemplificativa, o anticorpo anti-PD-L1 é Atezolizumab.

[0431] A citação de documentos e estudos aqui referidos não pretende ser uma admissão de que qualquer um dos anteriores é estado da técnica pertinente. Todas as declarações quanto ao conteúdo desses documentos são baseadas nas informações disponíveis para a depositante e não constituem nenhuma admissão quanto à exatidão do conteúdo desses documentos.

[0432] A descrição a seguir é apresentada para permitir que um técnico no assunto faça e use as várias formas de realização. As descrições de dispositivos, técnicas e aplicações específicos são fornecidas apenas como exemplos. Várias modificações nos exemplos aqui descritos serão prontamente aparentes para o técnico no assunto, e os princípios gerais aqui definidos podem ser aplicados a outros exemplos e aplicações sem se afastar do sentido e do escopo das várias formas de realização. Assim, as várias formas de realização não pretendem se limitar aos exemplos aqui descritos e mostrados, mas devem estar em concordância com o escopo consistente com as reivindicações.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: MATERIAIS

[0433] Os materiais notáveis usados para os experimentos descritos a seguir foram: Material Empresa. Artigo Nº R-DOTMA Merck & Cie. 5000249.2900-10G DOPE CordenPharma. LP-04-069 Etanol absoluto VWR chemicals. 20821.365 Água Aqua B.Braun. 0082479E Minisart 0,45 µm Sartorius Stedim. 16555-K Minisart 0,8 µm Sartorius Stedim. 17593-K Minisart 1,2 µm Sartorius Stedim. 17593-K Minisart 5 µm Sartorius Stedim. 17594-K Microlança BD 3 0,9x40mm. 301300

Material Empresa. Artigo Nº Injekt-F 1 ml B. Braun. 9166017V Solução de NaCl 5M Ambion. AM9760G RNA que codifica para Luciferase; gerado a partir de Luc-RNA Biontech RNA Pharmaceuticals EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DE MISTURAS LIPÍDICAS

[0434] Mistura lipídica DOTMA/ DOPE preparada em diferentes concentrações lipídicas em etanol com uma razão molar lipídica 2:1, respectivamente. A solução é preparada da seguinte forma: - Pesar o lipídio DOPE; - Calcular a quantidade de DOTMA para manter a razão molar % de 2:1 DOTMA/ DOPE; - Pesar o lipídio DOTMA; - Calcular a quantidade de etanol absoluto necessária para dissolver os lipídios; - Pesar etanol absoluto; e - Dissolver os lipídios em etanol com a ajuda de água ruim a 37 °C.

[0435] A solubilidade de DOPE e DOPE/ DOTMA em etanol foi investigada através da preparação de soluções de DOPE 300 mM ou de DOPE/ DOTMA 330 mM (66:33) em etanol. Os lipídios foram dissolvidos por incubação das soluções lipídicas a 37 °C por 20 minutos. As soluções de DOPE foram centrifugadas a 17000 G por 1 hora e a concentração de DOPE foi medida no sobrenadante por HPLC. As soluções DOTMA/ DOPE foram filtradas através de um filtro de seringa PES de 0,22 µm e a concentração lipídica foi medida no filtrado por HPLC.

[0436] Outras misturas lipídicas que podem ser preparadas da mesma forma seguindo as etapas básicas descritas neste exemplo, desde que outros lipídios sejam utilizados como materiais de partida e/ou outras razões molares sejam calculados.

EXEMPLO 3: PREPARAÇÃO DE LIPOSSOMAS

[0437] Os lipossomas foram preparados por injeção de etanol da seguinte forma: 0,2 mL de DOTM/ DOPE ou (outra solução lipídica) em etanol foram injetados com o auxílio de uma seringa de 1 mL equipada com uma agulha de 0,9 x 40 mm em 9,8 mL de água sob agitação a 120 rpm. O colóide de lipossoma foi agitado durante 30 minutos. Os lipossomas foram filtrados, ou não, através de filtros de seringa CA de 0,45 ou 1,2 ou 5 µm. Os colóides de lipossomas foram armazenados a 4-8 °C. As soluções lipídicas DOTMA/ DOPE foram preparadas na razão molar de 66:33% em diferentes concentrações lipídicas totais, de 100 a 400 mM com etapas intermediárias de 50 mM.

EXEMPLO 4: PREPARAÇÃO DE LIPOPLEXOS DE RNA

[0438] As formulações de lipoplexo de RNA foram preparadas da seguinte forma, misturando primeiramente uma solução de RNA (por exemplo, solução luc-RNA) com uma solução de NaCl para pré-condensar o luc-RNA.

Depois disso, o colóide de lipossoma e a solução luc-RNA-NaCl foram misturados para formar os lipoplexos de RNA. A formulação de lipoplexo de RNA foi incubada à temperatura ambiente por 10 minutos e armazenada a 4-8 °C. As diferentes formulações de lipoplexo de RNA foram, por exemplo, preparadas com uma razão N/P de 0,65. A concentração de RNA nessas diferentes formulações de lipoplexo de RNA foi de 0,1 mg/ml e a concentração de NaCl foi de 50 mM. Diferentes precursores de lipossomas (tamanhos diferentes) foram utilizados para a preparação dos lipoplexos de RNA.

EXEMPLO 5: ESPALHAMENTO DINÂMICO DE LUZ

[0439] Os tamanhos dos lipossomas e os tamanhos dos lipoplexos de RNA foram medidos pelo método conhecido de espalhamento dinâmico de luz (DLS) usando um instrumento Nicomp (PSS. Santa Barbara. EUA). As amostras de lipossomas foram diluídas com água até uma concentração lipídica total de 1 mM. As amostras de lipoplexo de RNA foram diluídas 1 para 5 com solução de NaCl a 0,9%. As amostras foram medidas em tubos de cultura de 5x50 mm (Kimble, EUA).

EXEMPLO 6: OBSCURECIMENTO DE LUZ - ESPALHAMENTO DINÂMICO DE LUZ

[0440] A contagem/ medição de partículas das diferentes formulações de lipossomas e lipoplexo de RNA em uma faixa de tamanho entre 0,5 - 5 µm foi realizada usando um instrumento Accusizer A7000 (PSS. Santa Barbara. EUA). Foram realizadas três medições de um volume de 5 mL (2,5 µL de amostra/ 20 mL de partícula livre de água). Os resultados obtidos representaram o valor médio da quantidade de partículas de três medidas.

EXEMPLO 7: ESPALHAMENTO DE RAIOS-X A BAIXOS ÂNGULOS

[0441] Os parâmetros de estrutura interna de diferentes formulações de lipoplexo de RNA, preparados com diferentes precursores de lipossomas, foram medidos por espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS). O SAXS é uma técnica pela qual as diferenças de densidade em nanoescala em uma amostra podem ser quantificadas analisando o comportamento do espalhamento elástico dos raios X ao viajar pelo material, registrando seu espalhamento a baixos ângulos. Os parâmetros de comprimento de correlação e espaçamento-d foram calculados para cada formulação de RNA testada. As formulações de lipoplexo de RNA foram preparadas com uma razão N/P de 0,65, 0,1 mg/ml de RNA e NaCl 112 mM.

EXEMPLO 8: ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

[0442] A quantidade de RNA livre nas diferentes amostras de lipoplexo de RNA foi medida por eletroforese em gel. Foi utilizado gel de agarose a 1% contendo hipoclorito de sódio para realizar as medições. As amostras de lipoplexo de RNA foram diluídas 1:6 com corante de carregamento de DNA. 12 µL de amostras de lipoplexo de RNA diluídas foram cuidadosamente carregados no gel de agarose. A eletroforese foi realizada em 80V com um tempo de corrida de 40 minutos.

EXEMPLO 9: HPLC

[0443] A concentração de lipídios nas diferentes formulações de lipossomas foi medida por HPLC (Agilent technologies. Santa Clara. EUA) usando uma coluna Sunfire C18 de 2,5 µm 4,6 x 75 mm (Waters.

Massachusetts. EUA) e um comprimento de onda de 205 nm. A fase móvel A era uma mistura de 70% de metanol/ 30% de isopropanol/ 0,1% de TFA, a fase móvel B era uma mistura de 55% de metanol/ 15% de isopropanol/ 30% de água/ 0,1% de TFA. As amostras de lipossomas foram, ou não, diluídas com água até uma concentração lipídica total de 3 mM.

EXEMPLO 10: CULTURA CELULAR: TRANSFECÇÃO DE RNA EM CÉLULAS

DENDRÍTICAS IN VITRO

[0444] As formulações de lipoplexo de RNA foram preparadas com diferentes precursores de lipossomas e luc-RNA. Os lipoplexos de RNA foram diluídos para 0,01 mg/ml de RNA com solução de NaCl a 0,9% para experimentos de cultura celular. A eficiência da transfecção de RNA das diferentes formulações de lipoplexo de RNA foi investigada em células dendríticas humanas semeadas em sangue médio ou total.

EXEMPLO 11: MODELO ANIMAL: DIRECIONAMENTO DO BAÇO E TRANSFECÇÃO DE

RNA EM CÉLULAS DENDRÍTICAS

[0445] A eficiência da transfecção de diferentes formulações de lipoplexo de RNA foi investigada em camundongos BALB/c. 20 µg de lipoplexos de RNA formulados foram injetados retro-orbitais e a expressão de luciferase em células dendríticas (alvo do baço) foi medida após 6 horas. Os lipoplexos de RNA foram preparados com luc-RNA e diferentes precursores de lipossomas, lipossomas pequenos ou grandes obtidos de colóides brutos e lipossomas pequenos e grandes após filtração de 0,45 µm, razão N/P 0,65 e NaCl 112 mM.

EXEMPLO 12: TESTE DE SOLUBILIDADE

[0446] Foi testado se soluções contendo DOPE de maior concentração podem ser preparadas (no estado supersaturado) e usadas para injeção de etanol para a fabricação de lipossomas (próxima seção). Os resultados obtidos nesta série de testes de solubilidade são mostrados nas Tabelas 1 e 2: TABELA 1: SOLUBILIDADE DO LIPÍDIO DOPE EM ETANOL OBTIDO DE DIFERENTES

FORNECEDORES Solubilidade de DOPE em etanol Fornecedor Ordem Nº mM Corden Pharma F0624 56 Corden Pharma W0650 59 NOF 14099612 63 Merck MK2885-C 59 TABELA 2: MAIOR SOLUBILIDADE DO LIPÍDIO DOPE EM UMA MISTURA LIPÍDICA DOTMA/ DOPE COM UMA RAZÃO MOLAR % DE 66:33 PREPARADA EM ETANOL

ABSOLUTO Solubilidade de DOPE em etanol compreendendo DOTMA 220 mM Fornecedor Ordem Nº mM após a filtração Corden Pharma F0624 93 Corden Pharma W0650 106 NOF 14099612 103 Merck MK2885-C 94

[0447] De acordo com esses resultados, o DOPE, adquirido de diferentes fornecedores, tem uma solubilidade de equilíbrio em etanol de cerca de 50 a 60 mM (temperatura ambiente). Entretanto, se uma co-solução com o lipídio catiônico DOTMA for preparada, a solubilidade de equilíbrio aumenta significativamente, por exemplo para cerca de 90 a 100 mM se for utilizada uma co-solução DOTMA/ DOPE com uma razão molar de 66:33.

EXEMPLO 13: FABRICAÇÃO DE LIPOSSOMAS DE DIFERENTES TAMANHOS

[0448] Os lipossomas foram fabricados por injeção de etanol usando o protocolo como descrito no Exemplo 3. Nenhum processo de filtração foi realizado após a injeção de etanol. A concentração lipídica em etanol foi variada, mantendo todos os outros parâmetros fixos. Os tamanhos dos lipossomas foram medidos como descrito por espalhamento dinâmico de luz (DLS) nos Exemplos 5 e 6.

[0449] Como exemplo, os resultados relacionados aos lipossomas obtidos a partir de uma mistura DOTMA/ DOPE com uma razão molar % de 66:33 são mostrados na Tabela 3 (abaixo) e nas Figuras 1 e 2.

TABELA 3: DEPENDÊNCIA DOS TAMANHOS DE LIPOSSOMAS EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE LIPÍDIOS NA SOLUÇÃO ESTOQUE.

Solução estoque Tamanho do lipossoma (nm) colóide Estatística de lipídica bruto Tamanho mM 1 2 3 Ẋ σ 100 28 32 30 2,83 150 36 35 34 35 1 200 82 76 74 76 4,16 250 202 195 194 195 4,36 300 371 220 369 369 86,61 350 620 644 652 644 16,65 400 665 665 740 665 43,3 450 721 783 723 723 35,23 500 739 767 766 766 15,89 550 770 754 656 754 61,72

[0450] Como pode ser visto, os tamanhos obtidos (Z-médio) dos lipossomas aumentam com a concentração lipídica na solução de etanol utilizada para a injeção de etanol. Assim, a concentração lipídica em etanol pode ser eficientemente usada para controlar o tamanho dos lipossomas.

Curiosamente, a mudança de tamanho foi mais proeminente se a concentração de DOPE estivesse abaixo e acima da solubilidade de equilíbrio do DOPE em etanol apenas. Se a concentração de DOPE estava acima de 50 mM

(concentração lipídica total de 150 mM), o tamanho do lipossoma obtido aumentava drasticamente, de < 50 nm para mais de 500 nm (Figura 1). No entanto, também acima do limite de solubilidade o tamanho dos lipossomas aumentou ainda mais monotonamente com o aumento da concentração lipídica.

[0451] Uma fração de lipossomas de 0,5 µm estava presente em todas as formulações de lipossomas, essa fração de lipossomas foi maior nos lipossomas preparados com uma solução lipídica 300 mM e diminuiu nos lipossomas preparados em concentrações lipídicas mais baixas e mais altas.

Além disso, as frações de lipossomas de 0,6 µm e 0,7 µm foram medidas nas formulações de lipossomas preparadas em concentrações lipídicas mais elevadas (Figura 2). Após a injeção de etanol de uma solução lipídica altamente concentrada, lipossomas maiores foram formados. A quantidade total de lipossomas formados foi menor em comparação com as formulações de lipossomas preparadas com baixa concentração lipídica na solução lipídica.

Os resultados obtidos representaram o valor médio da quantidade de partículas de três medidas.

EXEMPLO 14: FABRICAÇÃO DE LIPOPLEXOS DE RNA A PARTIR DE LIPOSSOMAS DE

TAMANHOS DIFERENTES

[0452] Os lipoplexos de RNA foram fabricados como descrito no Exemplo 4, usando diferentes precursores de lipossomas, em que o tamanho dos lipossomas para a sua formação foi variado, mantendo todos os outros parâmetros fixos. Os tamanhos dos lipossomas (Z-médio) e os índices de polidispersidade (PDI) foram determinados no decorrer dos experiementos de espalhamento dinâmico de luz (DLS), conforme descrito nos Exemplos 5 e 6.

[0453] Os resultados relacionados ao impacto das concentrações de lipídios na preparação de lipossomas (e, portanto, no tamanho do precursor de lipossomas) nos tamanhos de lipoplexo de RNA (Z-médio) são mostrados na Tabela 4 (abaixo) e nas Figuras 3 e 4 correspondentes.

TABELA 4: QUANTIDADE DE PARTÍCULAS PRESENTES NAS FORMULAÇÕES DE

LIPOPLEXO DE RNA PREPARADAS COM DIFERENTES PRECURSORES DE LIPOSSOMAS (LIPOSSOMAS NÃO FILTRADOS)

[0454] A quantidade de partículas de 0,5 µm aumenta nas formulações de lipoplexo de RNA preparadas com lipossomas maiores. Os lipossomas foram preparados por injeção de etanol usando diferentes soluções estoque lipídicas em diferentes concentrações. O tamanho dos lipossomas aumenta com a concentração lipídica na solução estoque.

Medições do tamanho do lipoplexo de RNA Solução Z-médio Estatística de Z-médio PDI Estatística de PDI lipídica (nm) (nm) Desvio Desvio mM 1 2 3 1 2 3 Ẋ Ẋ Padrão Padrão 20 19 0,13 0,17 0,18 0,1 100 196 195,07 4,82 0,03 0 0 6 1 6 6 22 18 0,16 0,2 150 208 0,3 0,17 205,03 17,04 0,08 0 7 5 1 20 21 0,09 0,12 0,1 200 189 0,14 202,43 11,81 0,02 7 2 3 5 2 28 27 0,20 0,20 0,2 250 208 0,3 253,17 39,61 0,06 2 0 3 2 4 47 47 0,43 0,37 0,35 0,3 300 473 474,7 1,41 0,04 6 5 2 2 6 9 47 48 0,29 0,40 0,40 0,3 350 448 470,83 19,99 0,06 9 5 4 7 2 7 44 41 0,42 0,29 0,29 0,3 400 465 442,03 25,29 0,08 7 5 4 5 2 4 44 43 0,33 0,31 0,31 0,3 450 412 431,2 17,66 0,02 7 4 8 2 1 2 44 41 0,40 0,31 0,33 0,3 500 448 436,73 15,62 0,05 3 9 1 2 3 5 47 41 0,31 0,29 0,3 550 434 0,46 440,43 27,29 0,09 0 7 6 4 6

[0455] De acordo com esta série de testes, os lipoplexos de RNA obtidos a partir de lipossomas pequenos eram menores do que os de lipossomas grandes. Os lipoplexos de RNA obtidos a partir de lipossomas que foram fabricados com uma solução de 300 mM e superior foram cerca de duas vezes maiores que os de lipossomas que foram obtidos a partir de uma solução estoque de 150 mM. Não foi encontrada correlação entre o tamanho do lipossoma e o tamanho do lipoplexo de RNA em todos os lipoplexos de RNA preparados com lipossomas maiores (Figura 3).

[0456] A quantidade obtida de lipoplexo de RNA aumentou com o tamanho do lipossoma utilizado para a sua formação. Quantidades maiores de partículas maiores de lipoplexos de RNA foram medidas nas formulações preparadas com lipossomas maiores, confirmando os dados obtidos a partir das medições de espalhamento dinâmico de luz (Figura 4). Os resultados obtidos representaram o valor médio da quantidade de partículas de três medidas.

EXEMPLO 15: ESPALHAMENTO DE RAIOS-X A BAIXOS ÂNGULOS (SAXS) DE

DIFERENTES LIPOPLEXOS

[0457] Realizaram-se experiementos de espalhamento de raios-X a baixos ângulos, como descrito com lipoplexos de RNA obtidos a partir de lipossomas de soluções estoque concentradas de forma diferente. Por exemplo, os lipoplexos de RNA foram formados a partir de lipossomas DOTMA/ DOPE 2/1 (mol/ mol) e RNA a uma razão de carga de 1,3 a 2. Os lipossomas foram fabricados por injeção de etanol, conforme descrito, a partir de concentrações lipídicas em etanol de 100 mM, 300 mM e 400 mM.

[0458] As curvas de difração obtidas a partir de medidas de espalhamento de raios-X a baixos ângulos de lipoplexos de RNA formados com lipossomas preparados a uma razão de carga de 4/1 (superior) e a uma razão de carga de 1,3/2, onde os lipossomas para formação de lipoplexos foram obtidos com mM de solução estoque de lipídios em etanol de 400 mM, 300 mM e 100 mM, são mostradas na Figura 5.

[0459] Os padrões de espalhamento compreendem um único pico de Bragg em torno de 1 nm-1. Este é o padrão de difração típico para o baço direcionado a lipoplexos, onde um excesso de RNA (carregado negativamente) foi usado para a formação de lipoplexo. Se os lipoplexos não estiverem carregados negativamente, o perfil de espalhamento é completamente diferente. Como exemplo, os lipoplexos de RNA com uma razão de carga de +/- 4/1 foram medidos, onde são encontrados picos muito menos pronunciados.

Também um pico de segunda ordem (embora com baixa intensidade) é discernível. De fato, uma característica geral dos perfis de espalhamento de raios-x dos lipoplexos é que existem vários picos que podem ser equidistantes ou podem ter outros espaçamentos, dependendo do estado da fase. Aqui, ao contrário, apenas um único pico é determinado. Além disso, a largura do pico muda dependendo da concentração da solução estoque que foi originalmente usada para a fabricação de lipossomas. Se a concentração em etanol era maior, a largura do pico era menor. O pico de Bragg indica que os lipoplexos são ordenados regularmente, onde a distância de repetição (espaçamento-d) é dada a partir da posição do pico como: 𝑛∙2𝜋 𝑑= (1) 𝑞max (𝑛) 4𝜋

[0460] Aqui, q é a transferência de momento, com 𝑞 = 𝑠𝑖𝑛 ,  com n a ordem e qmax a posição máxima do respectivo pico de Bragg,  o comprimento de onda e  o ângulo. O espaçamento-d que pode ser derivado dos picos de Bragg é da ordem de 6,5 nm.

[0461] A largura do pico, q, diminui com o aumento do número de unidades de repetição na pilha. Para uma matriz cristalina líquida, o comprimento de correlação pode ser dado como: 2 𝜉= (2) ∆𝑞

[0462] Para o produto de lipoplexo aqui, pode-se derivar uma clara correlação do padrão de espalhamento com a concentração lipídica acima mencionada em etanol para a fabricação de lipossomas e a atividade biológica.

Enquanto a posição do pico é invariável, a largura do pico muda monotonamente com a concentração lipídica aplicada em etanol. O aumento da concentração lipídica em etanol (o que leva ao aumento do tamanho do lipossoma) corresponde à diminuição da largura do pico e, portanto, ao maior comprimento da correlação. Ao mesmo tempo, a atividade biológica aumenta com o aumento do comprimento da correlação. Assim, os lipoplexos descritos com atividade aprimorada, que são fabricados a partir de lipossomas para os quais a solução estoque lipídica mais concentrada em etanol foi usada para fabricação, foram usados, e podem ser discernidos por uma característica estrutural clara. Além disso, também por outros métodos, como o fracionamento por campo de fluxo assimétrico (AF4), os lipoplexos descritos com atividade aprimorada podem ser distinguidos daqueles de atividade mais baixa.

EXEMPLO 16: EFICIÊNCIA DE TRANSFECÇÃO DE LIPOPLEXOS DE RNA EM CÉLULAS

DENDRÍTICAS HUMANAS

[0463] Os lipoplexos Luc-RNA foram fabricados como descrito usando diferentes precursores de lipossomas, onde o tamanho dos lipossomas para a sua formação foi variado (variando a concentração lipídica inicial para a sua formação), mantendo todos os outros parâmetros fixos. Posteriormente, a eficiência da transfecção de RNA das diferentes formulações de lipoplexo de RNA foi investigada em células dendríticas humanas semeadas em sangue médio ou total.

[0464] Os resultados que ilustram a eficiência da transfecção in- vitro (células dendríticas humanas), conforme determinado por medição da expressão de luciferase e da atividade biológica correspondente de diferentes lipoplexos de RNA preparados com diferentes precursores de lipossomas, são mostrados na Figura 6.

[0465] A atividade biológica (transfecção de RNA in vitro) aumenta monotonamente com o comprimento de correlação dos lipoplexos de RNA. Um comprimento de correlação mais alto indica uma população mais homogênea de bicamadas lipídicas no lipoplexo de RNA.

EXEMPLO 17: FRACIONAMENTO POR FLUXO EM CAMPO DE FLUXO ASSIMÉTRICO DE

DIFERENTES LIPOPLEXOS

[0466] O fracionamento por fluxo em campo de fluxo assimétrico (AF4), atualmente um método comum e do estado da técnica para fracionamento e separação de partículas em uma suspensão, foi utilizado para determinar outras diferenças nos lipoplexos de RNA. De acordo com a teoria de AF4, partículas com propriedades semelhantes e tamanho igual devem eluir ao mesmo tempo.

[0467] Alguns resultados relacionados às medições de AF4 de lipoplexos de dois tipos diferentes de lipossomas, fabricados a partir de uma solução estoque de 150 mM em etanol ou a partir de uma solução estoque de 400 mM em etanol, são mostrados na Figura 7.

[0468] Em resumo, as medições de fracionamento por campo de fluxo demonstram que os lipoplexos dos lipossomas da concentração lipídica de 150 mM em etanol são qualitativa e quantitativamente diferentes daqueles da concentração lipídica de 400 mM. Os lipoplexos derivados de 150 mM são menores, mas, contra-intuitivamente, são eluídos posteriormente; portanto, deve haver uma diferença qualitativa (forma, interações como meio, carga) entre as duas porções. Os lipoplexos de RNA da solução de etanol 150 mM eluem mais tarde, embora sejam menores em tamanho. Isto indica que os lipoplexos de RNA dos lipossomas que são fabricados a partir de lipossomas onde foi utilizada solução lipídica de 150 mM em etanol são, em média, menores do que os dos lipídios 400 mM em etanol. Mesmo no mesmo tamanho, os lipoplexos derivados de 150 mm possuem propriedades físico-

químicas diferentes dos derivados de 400 mM. Essas diferenças no tamanho e nas propriedades físico-químicas estão correlacionadas com a maior atividade biológica dos lipoplexos de RNA derivados de 400 mM.

EXEMPLO 18: ATIVIDADE BIOLÓGICA DE LIPOPLEXOS DE RNA IN VITRO

[0469] Conforme determinado por experimentos de transfecção de cultura celular (células dendríticas) com lipoplexos de RNA que codificam luciferase de diferentes tamanhos preparados a partir de lipossomas, diferentes soluções estoque de lipídios e/ ou diferentes concentrações de lipídios, conforme descrito, os sinais de luciferase e, portanto, as atividades biológicas aumentam monotonamente com as concentrações iniciais de lipídios e assim com os tamanhos de lipossomas utilizados para a formação de lipoplexo de RNA. Os resultados correspondentes são mostrados nas Figuras 6, 8 e 9.

[0470] Em resumo, os lipoplexos de RNA gerados a partir de concentrações lipídicas mais altas para a fabricação de lipossomas exibem uma atividade significativamente maior in vitro.

EXEMPLO 19: ATIVIDADE BIOLÓGICA DE LIPOPLEXOS DE RNA IN VIVO

[0471] Como determinado por experimentos de transfecção de cultura celular (células dendríticas) com lipoplexos de RNA que codificam luciferase preparados a partir de lipossomas de diferentes tamanhos, os lipoplexos de RNA preparados com lipossomas maiores resultam em uma expressão de luciferase significativamente mais alta e na atividade biológica correspondente.

[0472] Um exemplo não limitativo desta série de testes é mostrado nas Figuras 10 e 11. Lipoplexos de RNA preparados com lipossomas maiores a partir de um colóide bruto de 360 mM levam a um sinal de expressão in vivo significativamente do que pequenos lipoplexos de RNA de um colóide bruto de 200 mM.

EXEMPLO 20: FABRICAÇÃO AUTOMATIZADA DE LIPOPLEXOS DE RNA

[0473] Para a fabricação automatizada em lote de lipoplexos de RNA, foi desenvolvido um procedimento geralmente aplicável, que é mostrado na Figura 12. Todas as etapas são realizadas usando uma trajetória de fluido de uso único pré-esterilizada, permitindo o manuseio asséptico seguro dos materiais. Primeiro, a concentração do RNA é ajustada à concentração de lipossoma e NaCl é adicionado para condensação do RNA. Desse modo, a solução de RNA é ajustada para uma concentração de RNA, permitindo a mistura de volumes idênticos de RNA e lipossomas. O RNA e a solução lipossômica são transferidos para seringas de grande volume e as duas seringas são montadas em uma única bomba de seringa, acionando simultaneamente os dois pistões das seringas. Após a formação do lipoplexo de RNA, é adicionada uma solução crioprotetora e a concentração final do medicamento é ajustada. Após o enchimento do medicamento em frascos de vidro, o medicamento é congelado como um concentrado para armazenamento a longo prazo.

[0474] Um atributo crítico de qualidade dos lipoplexos de RNA é a razão de carga ajustada pela razão de mistura entre RNA e lipossomas. Foi desenvolvido um processo de fabricação industrial automatizável e dimensionável para lipoplexos de RNA, permitindo um controle eficiente da taxa de mistura. Em um processo para a fabricação em pequenas escalas (≤ 10 litros), o controle da mistura de volumes idênticos de duas soluções aquosas contendo lipossomas e RNA é alcançado usando uma única bomba perfusora, acionando simultaneamente duas seringas de grande volume preenchidas com RNA ou lipossomas. Para bombeamento equivalente de volumes maiores (≥ 10 litros), sistemas de bombeamento como recipientes pressurizados, bombas de membrana, bombas de engrenagem, bombas de levitação magnética ou bombas peristálticas são usados em combinação com sensores de taxa de fluxo com circuito de realimentação para controle em linha e ajuste em tempo real da taxa de fluxo.

[0475] Para a fabricação automatizada de lipoplexo de RNA, é necessário um elemento de mistura estático, garantindo uma mistura eficiente das soluções aquosas contendo RNA e lipossomas. Constatou-se que os elementos de mistura microfluídicos disponíveis comercialmente contendo serpentinas e estruturas incorporadas para aprimoramento da mistura, bem como elementos de mistura de protótipo com arquitetura comparável, bloquearam durante a fabricação. Portanto, esses elementos de mistura não são adequados para a fabricação automatizada de lipoplexos de RNA.

Verificou-se que os elementos de mistura do tipo Y e do tipo T com diâmetros entre 1,2 e 50,0 mm são adequados para a fabricação automatizada de lipoplexos de RNA.

[0476] Método: Os lipoplexos de RNA foram preparados usando diferentes elementos de mistura (Tabela 1). Durante a fabricação dos lipoplexos, os elementos de mistura foram observados pelo operador e a deposição de material ou obstrução foi documentada.

[0477] Resultados: Com o chip microfluídico comercialmente disponível (NanoAssemblrTM, Precision Nanosystems, Vancouver, Canadá), observou-se obstrução após a preparação de 3 mL de lipoplexos de RNA.

Observações semelhantes foram feitas durante o teste de outros elementos de mistura microfluídicos de protótipo (Tabela 5). Enquanto que para todos os elementos de mistura (micro) fluídicos, compreendendo arquiteturas comparáveis àquela do elemento de mistura comercialmente disponível, a deposição e particularmente o bloqueio dos elementos pôde ser observado, não houve observações ao usar elementos de mistura do tipo Y ou do tipo T. Além do elemento de mistura descrito do tipo Y com um diâmetro de 2,4 mm, foram testados elementos de mistura com diâmetros maiores. Como não foram encontradas limitações para o diâmetro do elemento de mistura do tipo Y, o método descrito é considerado adequado para a preparação de lipoplexos de RNA em diâmetros de até 50 mm dos elementos de mistura do tipo Y.

TABELA 5: OBSTRUÇÃO DE CHIP MICROFLUÍDICO Tamanho de partícula Elemento de Depósitos ou Canal com (µm) de lipoplexos de RNA mistura obstrução (nm) NanoAssemblr™ Cerca de 0,2 mm 374 Obstrução após 3 mL Protótipo 1 Cerca de 0,3 mm 337 Obstrução após 34 mL Protótipo 2 Cerca de 0,3 mm 372 Obstrução após 88 mL Protótipo 3 Cerca de 0,4 mm 336 Deposição, sem obstrução até 120 mL Protótipo 4 Cerca de 1,0 mm 326 Deposição, sem obstrução até 180 mL Elemento de 2,4 mm 348 Sem deposição, sem mistura tipo Y obstrução até 200 mL

[0478] Ao usar elementos de mistura do tipo Y ou do tipo T, é necessária uma taxa de fluxo mínima para obter uma mistura suficiente. A preparação de lipoplexo de RNA pode ser realizada misturando duas soluções aquosas contendo RNA e lipossomas usando um elemento de mistura do tipo Y ou do tipo T com um diâmetro interno de 1,6 a 50 mm. O número de Reynolds resultante da taxa de fluxo para mistura não deve ser menor que cerca de 300 para garantir uma mistura eficiente. A razão de taxa de fluxo para o diâmetro do elemento de mistura não deve ser inferior a cerca de 150 para garantir uma mistura eficiente. Os números de Reynolds até cerca de 2100 foram testados experimentalmente e considerados adequados para fabricação automatizada. Os dados suportam que também são possíveis taxas de fluxo mais altas. Isso é derivado do fato de que, no número de Reynolds de 2100, as condições já estavam no modo turbulento e, portanto, a taxas de fluxo ainda mais altas, condições de mistura semelhantes são esperadas.

[0479] Método: Os lipoplexos de RNA foram preparados bombeando a solução de RNA e a solução de lipossomas usando uma única bomba perfusora. A formação de lipoplexo de RNA foi realizada com elementos de mistura representativos do tipo Y compreendendo um diâmetro interno de 2,4 e 3,2 mm. Os tamanhos das partículas e a polidispersidade dos lipoplexos de RNA foram analisados por medidas de espectroscopia de correlação de fótons (PCS). Os números de Reynolds resultantes da combinação investigada de taxa de fluxo e diâmetro dos elementos de mistura foram calculados teoricamente usando a equação (Figura 13). A razão de taxa de fluxo para diâmetro do elemento de mistura foi calculada dividindo a taxa de fluxo (cm3/min) pelo diâmetro do elemento de mistura (cm). O fator é dado como um número adimensional.

[0480] Resultados: Ao fabricar lipoplexos de RNA com combinações de taxa de fluxo e elementos de mistura, resultando em números de Reynolds calculados teoricamente abaixo de cerca de 300, lipoplexos de RNA com tamanho de partícula e polidispersidade aumentados são formados (Figura 13 e Tabela 6). Para garantir a formação reprodutível de lipoplexos de RNA com as características desejadas das partículas, o número de Reynolds teórico deve ser no mínimo cerca de 300 (Figuras 13 e 14 e Tabela 6) e a razão de taxa de fluxo para diâmetro do elemento de mistura deve ser no mínimo cerca de 150. Verificou-se que o elemento de mistura de 2,4 mm permite a mistura eficiente e reproduzível de RNA e lipossomas em uma ampla faixa de taxas de fluxo (60 a 240 ml/min). Como nenhum limite superior foi encontrado durante esses estudos, nenhuma limitação superior do número de Reynolds ou da razão de taxa de fluxo para diâmetro do elemento de mistura é esperada. TABELA 6: NÚMEROS DE REYNOLDS CALCULADOS E RAZÃO DE TAXA DE FLUXO/

DIÂMETRO DO ELEMENTO DE MISTURA

Diâmetro do Razão de taxa de fluxo Número de Reynolds elemento de Taxa de fluxo (ml/min) para diâmetro do calculadoa mistura (mm) elemento de misturab 3,2 20 132 63 3,2 40 265 125 3,2 80 530 250 2,4 60 531 250 2,4 80 707 333 2,4 220 1945 917 2,4 240 2122 1000 a Viscosidade (0,001 Pa s) e densidade (1000 kg/m3) de água foram usadas para o cálculo do número de Reynolds. b O fator foi calculado dividindo a taxa de fluxo (cm3/min) pelo diâmetro do elemento de mistura (cm). O fator é dado como um número adimensional.

EXEMPLO 21: INFLUÊNCIA DAS CONCENTRAÇÕES DE RNA

[0481] Os lipoplexos de RNA foram preparados com o elemento de mistura do tipo Y com dimensões representativas (2,4 mm). Para identificar a faixa de concentração na qual os lipoplexos de RNA podem ser preparados na configuração atual, a concentração de RNA foi sistematicamente variada de 0,05 mg/ml a 0,5 mg/ml. A fim de investigar a estabilidade dos lipoplexos formados, a formulação final foi ajustada para 0,05 mg/ml de RNA, sacarose a 22% e NaCl 20 mM e as formulações foram congeladas três vezes.

[0482] A formação de lipoplexo de RNA em concentrações de RNA entre 0,1 e 0,5 mg/ml durante a formação de lipoplexo de RNA resulta em características de partículas comparáveis (Figura 15). As características das partículas dessas partículas também são preservadas em três tempos de congelamento, indicando um processo de fabricação muito robusto com relação às variações da concentração de RNA (Figura 16). Como não há dicas para uma limitação da concentração de RNA durante a preparação de lipoplexo de RNA, a configuração descrita é considerada adequada para a preparação de lipoplexo de RNA em uma concentração de RNA de até 5 mg/ml.

[0483] O processo descrito para a fabricação automatizada de lipoplexos de RNA permite a preparação reproduzível de lipoplexos de RNA estáveis com diferentes razões de carga.

[0484] Método: Para provar a robustez da preparação semi- automatizada de lipoplexos de RNA em relação à razão de carga, este parâmetro foi sistematicamente variado de 1,0:2,0 a 2,1:2,0 e de 2,0:1,0 a 5,0:1:0. O tamanho das partículas e a polidispersidade dos lipoplexos de RNA foram analisados por medidas de espectroscopia de correlação de fótons (PCS).

[0485] Resultados: Não foi encontrado impacto da variação da razão de carga no tamanho e polidispersidade dos lipoplexos de RNA entre uma razão de carga de 1,0:2,0 e 2,1:2,0 (Figura 17). Portanto, o intervalo entre 1,0:2,0 e 2,1:2,0 é considerado como resultado de preparações de lipoplexo de RNA com qualidade equivalente. Além disso, partículas estáveis com tamanho e polidispersidade definidos foram formadas entre uma razão de carga de 3,0:1,0 e 5,0:1,0 (Figura 18).

EXEMPLO 22: CONCENTRAÇÃO DE SAL DURANTE A FORMAÇÃO DE LIPOPLEXO DE

RNA

[0486] Para a fabricação automatizada de lipoplexos de RNA compreendendo alta atividade biológica, são necessárias condições iônicas controladas durante a formação de lipoplexo de RNA. Para garantir a atividade biológica, a formação de lipoplexo de RNA deve ser realizada na presença de NaCl de 45 a 300 mM. Outros compostos iônicos como, por exemplo, EDTA, HEPES etc. contribuem para a força iônica e podem reduzir a concentração mínima necessária de NaCl.

[0487] Método: Os lipoplexos de RNA foram automaticamente preparados em diferentes concentrações de NaCl durante a formação de lipoplexo de RNA. O tamanho das partículas e a polidispersidade dos lipoplexos de RNA foram analisados por medidas de espectroscopia de correlação de fótons (PCS). Além disso, a bioatividade dos lipoplexos foi investigada medindo o sinal da luciferase in vitro.

[0488] Resultados: As características das partículas podem ser controladas pelo ajuste da força iônica. O aumento das concentrações de sal durante a fabricação induziu um leve aumento no tamanho das partículas (Figura 19). Verificou-se que a concentração de sal afeta a bioatividade. O aumento da concentração de sal durante a fabricação induziu um aumento da bioatividade (Figura 20). Portanto, a concentração de NaCl durante a formação do lipoplexo de RNA não deve ser menor que NaCl 45 mM.

EXEMPLO 23: ESTABILIZAÇÃO DE LIPOPLEXOS DE RNA

[0489] Sistemas de tampão como HEPES, ácido acético/ acetato de sódio e fosfato de sódio para estabilização de RNA em lipoplexos na faixa de pH de pH 5,5 a 6,7 podem ser usados para estabilização de RNA em lipoplexos de RNA, tanto na presença quanto na ausência de um crioprotetor.

Verificou-se que o sistema de carbonato de sódio não resulta em eficácia de estabilização comparável.

[0490] Método: Investigar a faixa ideal de pH e testar a adequação de diferentes agentes de tamponamento que abrangem diferentes faixas de pH (HEPES pH 6,8-8,2, ácido acético/ acetato de sódio pH 3,7-5,6, fosfato de sódio pH 5,8-8,0 e carbonato de sódio pH 6,2-8,6). Os lipoplexos de RNA são inicialmente incubados sob condições de estresse (40 °C) na ausência de crioprotetor. A integridade do RNA foi analisada por eletroforese capilar durante 21 dias. Para investigar a faixa ideal de pH na presença de um crioprotetor exemplificativo, os lipoplexos de RNA foram incubados na presença de HEPES e sacarose a 40 °C e a integridade do RNA foi analisada durante 21 dias.

[0491] Resultados: Enquanto que para os sistemas de tamponamento HEPES, ácido acético/ acetato de sódio e fosfato de sódio foram obtidos resultados comparáveis, o sistema carbonato não resultou em uma estabilização comparável do RNA (Figura 21). A integridade do RNA depende do valor do pH da formulação. A faixa ideal de pH foi identificada como estando na faixa entre pH 5,5 e 7.4. Na presença do crioprotetor exemplificativo sacarose, foi identificado um intervalo de pH de 5,5 a 8,0, resultando na melhor estabilização do RNA (Figura 22).

[0492] Íons metálicos bivalentes podem surgir do processo de síntese de RNA, de excipientes de formulação ou de recipientes de vidro e podem afetar a estabilidade do RNA. O sal dissódico de EDTA forma complexos solúveis em água estáveis com íons alcalino-terrosos e de metais pesados. O sal dissódico de EDTA contribui para a concentração de íons presentes durante a formação do lipoplexo de RNA e, assim, reduz a concentração de NaCl necessária para a preparação de lipoplexos de RNA bioativos. A formação de lipoplexo de RNA na presença de EDTA (0 a 20 mM) é possível com o processo descrito.

[0493] Método: Os lipoplexos de RNA foram formados na presença de concentrações crescentes de EDTA (até 18 mM) e após diluição incubada com teor reduzido de EDTA (0,1 mM a 5,4 mM) a 40 °C. A integridade do RNA foi analisada como um parâmetro físico-químico chave durante 21 dias.

[0494] Resultados: Verificou-se que a formação de lipoplexos de RNA na presença de altas concentrações de EDTA (até 18 mM) resulta em características de partículas equivalentes à preparação na presença de concentrações mais baixas. Não foi encontrada diferença significativa entre os diferentes grupos contendo entre 0,01% (p/v) (0,1 mM) e 0,2% (p/v) (5,4 mM) de EDTA (Figura 23) durante o armazenamento. Como o sal dissódico de EDTA contribui para a concentração de íons presentes durante a formação de lipoplexo de RNA e pode funcionar como um eliminador de íons metálicos bivalentes, potencialmente diminuindo a integridade do RNA, a presença de concentrações de EDTA de até 20 mM durante a formação de lipoplexo de RNA é considerada vantajosa.

EXEMPLO 24: OTIMIZAÇÃO DO TEOR DE NACL E CRIOPROTETOR

[0495] As condições iônicas ajustadas precisam ser ajustadas durante a fabricação do lipoplexo de RNA, armazenamento a longo prazo e aplicação ao paciente (Figura 24). A concentração de NaCl pode ser de 45 a 300 mM durante a formação de lipoplexos de RNA; 10 a 50 mM durante o armazenamento a longo prazo de lipoplexos de RNA no estado congelado; e 80 a 150 mM após descongelação e diluição com solução salina.

[0496] Para cada concentração de NaCl ≤ 70 mM, foi encontrado um respectivo teor de crioprotetor que não deve ser diminuído para garantir a estabilização das características das partículas após congelamento múltiplo.

Como crioprotetor, podem ser utilizados açúcares mono- e bimoleculares como glicose, sacarose, manitol, trealose, sorbitol, trióis como glicerina e misturas dos mesmos em concentrações entre 12,5 e 35,0% (p/v). A eficácia de estabilização do sorbitol é menor quando comparada com os últimos compostos e a arginina não estabiliza eficientemente os lipoplexos do RNA durante o congelamento.

TABELA 7: COMBINAÇÕES DE CONCENTRAÇÃO DE NACL E TEOR DE CRIOPROTETOR

INVESTIGADAS APÓS UMA ÚNICA ETAPA DE CONGELAMENTO Crioprotetor (%p/v) NaCl (mM) 5 10 15 20 0 X X X X 20 X X X X 40 X X X X 60 X X X X TABELA 8: COMBINAÇÕES DE CONCENTRAÇÃO DE NACL E TEOR DE CRIOPROTETOR INVESTIGADAS APÓS 1, 2, 3, 5 E 10 ETAPAS DE CONGELAMENTO Crioprotetor (%p/v) NaCl (mM) 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5

Crioprotetor (%p/v) NaCl (mM) 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 50 X X X X X X X X 70 X X X X X X X X 90 X X X X X X X X

[0497] Métodos: Diferentes compostos representativos de monossacarídeos (glicose e sorbitol), dissacarídeos (sacarose e trealose), aminoácidos (arginina, prolina), trióis (glicerina) e sistemas crioprotetores contendo misturas de diferentes açúcares (manitol e sacarose) foram investigados para identificar crioprotetores adequados (Figuras 25 e 26).

Portanto, os lipoplexos de RNA foram congelados na presença de uma concentração crescente desses compostos. A fim de identificar o teor mínimo de crioprotetor em uma determinada concentração de NaCl, os lipoplexos de RNA foram congelados na presença de quantidades crescentes de sacarose ou trealose como crioprotetores representativos (Tabela 7). As amostras foram inicialmente congeladas uma única vez, a fim de determinar a faixa de concentração de crioprotetor a ser investigada em detalhes. Em um terceiro experimento, a eficácia da estabilização do tamanho de partícula foi desafiada pelo congelamento dos lipoplexos de RNA até 10 vezes na presença da trealose crioprotetora (Tabela 8).

[0498] Resultados: Enquanto a arginina claramente desestabiliza os lipoplexos de RNA, os outros crioprotetores são geralmente aplicáveis à estabilização dos lipoplexos de RNA durante o congelamento (Figuras 25 e 26).

Glicerina, manitol e sacarose (1:1, p/p), prolina e sorbitol podem ser usados como crioprotetores para lipoplexos de RNA. Além da arginina, todos os estabilizadores adicionalmente testados parecem adequados, indicando que uma ampla faixa de aminoácidos, açúcares e misturas de tais compostos são adequados para a estabilização dos lipoplexos de RNA durante o congelamento. A eficácia de estabilização do sorbitol é menor quando comparada com os últimos compostos.

[0499] Ao investigar em detalhes a quantidade necessária de crioprotetor em cada concentração de NaCl (Tabela 8), foi encontrada uma correlação direta entre a concentração de NaCl e a concentração necessária do crioprotetor após uma única etapa de congelamento (Figuras 27 e 28).

Enquanto a preservação aceitável do tamanho das partículas foi encontrada após uma única etapa de congelamento de 0 a 60 mM de NaCl a 20% (p/v) de sacarose ou dihidrato de trealose, não foi encontrada estabilização suficiente para menor porcentagem de crioprotetor (por exemplo, ≤ 15% para NaCl 60 mM; ≤ 10% para NaCl 40 mM; ≤ 5% para NaCl 20 mM). Dentro da faixa investigada, não houve diferença entre sacarose e trealose.

[0500] Ao analisar o tamanho de partícula dos lipoplexos de RNA após 1, 2, 3, 5 e 10 vezes de congelamento na presença das combinações de NaCl e trealose mostradas na Tabela 9.3.2, foram obtidos os seguintes resultados. Enquanto que a uma concentração de NaCl 50 mM ≥ 12,5% de trealose foi suficiente para estabilizar as características das partículas de lipoplexo de RNA, mesmo após 10 vezes de congelamento (Figura 29), a 70 mM de NaCl ≥ 12,5% foram necessários para estabilização mínima e ≥ 22,5% foram necessários para a preservação exata do tamanho de partícula (Figura 30). A NaCl 90 mM, ≥ 15,0% de trealose foram necessários para estabilização mínima e a preservação exata do tamanho de partícula não pôde ser alcançada, mesmo com a maior concentração investigada de 27,5% (Figura 31).

EXEMPLO 25: COMBINAÇÃO DE SAL E CRIOPROTETORES PARA ARMAZENAMENTO A

LONGO PRAZO

[0501] Para armazenamento a longo prazo à temperatura especificada, as combinações de NaCl e crioprotetor listadas na Tabela 9 devem ser usadas.

[0502] Métodos: Para investigar o teor mínimo de crioprotetor para armazenamento a longo prazo de 15 a 30 °C a uma certa concentração de NaCl, lipoplexos de RNA foram congelados na presença de combinações de NaCl e sacarose ou trealose. As amostras foram congeladas a -30 °C e depois transferidas para a respectiva temperatura para armazenamento a longo prazo (-15 ou -30 °C). Após um tempo de armazenamento definido, as amostras foram analisadas e a preservação da estabilidade coloidal foi analisada através da medição do tamanho de partícula usando PCS.

[0503] Resultados: Considerando que as características das partículas dos lipoplexos de RNA podem ser preservadas durante o congelamento na presença de NaCl até 70 mM, um efeito adicional que contribui para a desestabilização da estabilidade coloidal pode ser observado nesses experiementos. Também foi confirmada a estabilização aceitável das características das partículas após o congelamento para, por exemplo, uma combinação de NaCl 60 mM e sacarose a 20%, com o tempo o tamanho de partícula dessas formulações aumentou significativamente (Figuras 32 e 33) a uma temperatura de armazenamento de -15 °C. Este efeito foi reduzido com o armazenamento a -30 °C (Figuras 34 e 35).

[0504] A estabilidade de lipoplexos de RNA com um determinado teor de NaCl depende da quantidade de crioprotetor. A quantidade de crioprotetor necessária para estabilizar aumenta com o aumento do teor de sal na solução de armazenamento. Este efeito é independente do tipo de açúcar usado como crioprotetor. As composições de lipoplexos de RNA para armazenamento a longo prazo no estado congelado a -15 ou -30 °C devem conter o teor de crioprotetor listado na Tabela 9.

TABELA 9: AS CONCENTRAÇÕES MÁXIMAS ACEITÁVEIS DE NACL EM COMBINAÇÃO COM O TEOR DE CRIOPROTETOR (SACAROSE OU TREALOSE) PARA ARMAZENAMENTO A -15 °C E -30 °C

Crioprotetor (% em p/v) NaCl (mM) Armazenamento a -15 °C Armazenamento a -30 °C 0 ≥5 ≥5 20 ≥ 15 ≥ 10 40 ≥ 20 ≥ 15 60 Estabilização insuficiente ≥ 20 EXEMPLO 26: ARMAZENAMENTO DE LONGO PRAZO COM DIFERENTES

CRIOPROTETORES

[0505] A estabilização durante 9 meses na presença de 22% (p/v) de açúcares mono- ou bimoleculares é possível com NaCl 10 a 40 mM. Essas formulações podem ser congeladas de -15 a -40 °C e podem ser mantidas à temperatura respectiva para armazenamento a longo prazo. Na presença de 12,6 a 16,8% (p/v) de dextrano, NaCl 10 a 30 mM, são viáveis.

[0506] Método: Para investigar o teor mínimo de crioprotetores representativos como sacarose, trealose, glicose e misturas, incluindo dextrano necessário para armazenamento a longo prazo a 20 °C, os lipoplexos de RNA foram congelados com um teor fixo de crioprotetor em combinação com concentrações variáveis de NaCl. Para crioprotetores moleculares monoméricos ou diméricos como glicose, sacarose e trealose, uma concentração de 22% (p/v) foi ajustada. Estas formulações foram congeladas e armazenadas de -15 a -40 °C e a estabilidade a longo prazo foi investigada medindo o tamanho das partículas usando PCS após um tempo de armazenamento definido.

[0507] Para formulações contendo misturas do polímero dextrano, as composições listadas na tabela 9.5.1 foram ajustadas. As amostras foram congeladas e armazenadas a -20 °C. Após um tempo de armazenamento definido, as amostras foram analisadas e a preservação da estabilidade coloidal foi analisada medindo o tamanho das partículas.

[0508] Resultados: Para todos os crioprotetores moleculares monoméricos ou diméricos investigados, foi encontrada uma concentração máxima de NaCl que não deve ser excedida para garantir a estabilização a longo prazo dos lipoplexos de RNA no estado congelado. Enquanto 60 e 80 mM de NaCl resultaram em rápida desestabilização dos lipoplexos, as propriedades coloidais puderam ser preservadas por no mínimo 9 meses quando a concentração de NaCl era ≤ 40 mM ao serem armazenadas a -20 °C (Tabela 10 e Figuras 36 a 38). Não foi encontrada diferença na eficácia da estabilização para sacarose, trealose e glicose. Para uma formulação que inclui NaCl 20 mM, não foi encontrada diferença na estabilidade a longo prazo quando as amostras foram congeladas e armazenadas de -15 a -40 °C (Figura 39).

[0509] Como as formulações contendo dextrano foram investigadas com menor teor de crioprotetor (12,6 a 16,8% (p/v)), a eficácia da estabilização é comparável ou melhor quando comparada aos açúcares mono ou bimoleculares (Figura 40).

TABELA 10: COMPOSIÇÃO DE FORMULAÇÕES 1 A 7 CONTENDO DEXTRANOS (VER FIGURA 40) Teor do co- Concentração de Dextrano 40 Formulação Co-estabilizador estabilizador (% NaCl (mM) (% em p/v) em p/v) Formulação 1 90 10,0 Dextrano 1 4,4 Formulação 2 90 10,0 Trealose 2,6 Formulação 3 70 10,0 Dextrano 1 6,3 Formulação 4 70 10,0 Trealose 3,1 Formulação 5 50 8,0 Dextrano 1 8,8 Formulação 6 50 8,0 Trealose 4,7 Formulação 7 40 0 Dextrano 1 12,9 EXEMPLO 27: CRIODESSECAÇÃO A) CONGELAMENTO E DESCONGELAMENTO

[0510] Para determinar a concentração mais eficaz de crio/ lioprotetor, estudos de congelamento e descongelamento foram realizados. As formulações de lipoplexo de RNA foram congeladas e descongeladas em HEPES 5 mM, NaCl 80 mM, EDTA 2,6 mM com a adição de 10%, 15%, 20%,

25% e 30% de trealose. O tamanho das partículas foi determinado antes e após o armazenamento a -20 °C. A agregação de partículas foi observada em formulações congeladas na ausência de trealose e seu tamanho de partícula não foi determinado. De acordo com a Figura 41, as formulações congeladas com crio/lioprotetor mostraram crioproteção dependente da concentração, o tamanho da partícula aumentou em concentrações mais baixas de lio/ crioprotetor. A 22% em p/v de trealose, apenas um aumento mínimo no tamanho de partícula foi observado com um Sf/Si (Sf = tamanho final, Si = tamanho inicial) de 1,04, que sendo menor que 1,3 ainda é considerado aceitável. Em concentrações mais baixas de trealose, as razões Sf/Si foram maiores. As razões Sf/Si obtidas a partir dos estudos de congelamento e descongelamento correlacionaram-se com as razões Sf/Si obtidas a partir das mesmas formulações após criodessecação e reconstituição.

B) RECONSTITUIÇÃO E ESTABILIDADE DE PARTÍCULAS

[0511] As formulações de lipoplexo de RNA preparadas em HEPES 5 mM, EDTA 2,6 mM, NaCl 0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 80 mM e trealose a 5%, 10%, 15% e 22% foram criodessecadas.

Todas as amostras criodessecadas exibiram boa aparência da torta. As amostras foram reconstituídas no volume original com solução de NaCl a 0,9%.

Todas as formulações de lipoplexo de RNA criodessecadas dissolveram-se instantaneamente após reconstituição com solução de NaCl a 0,9% ou WFI.

Foi determinada a alteração do tamanho das partículas nas formulações de lipoplexo de RNA criodessecadas preparadas em trealose a 22% após reconstituição com solução de NaCl a 0,9% ou água.

[0512] De acordo com a Figura 42, o tamanho das partículas permaneceu estável em todas as formulações de lipoplexo de RNA criodessecadas contendo trealose após criodessecação e reconstituição. Foi observada uma ligeira diminuição no tamanho dos lipoplexos de RNA quando as amostras criodessecadas foram reconstituídas com NaCl a 0,9% em comparação com as amostras criodessecadas reconstituídas com água. Foi observada uma correlação entre a razão de NaCl para trealose e a estabilidade das partículas. O tamanho das partículas de lipoplexo de RNA aumentou nas formulações preparadas em concentrações mais baixas de trealose e concentrações mais altas de NaCl.

C) EXPERIEMENTOS DE CULTURA CELULAR COM FORMULAÇÕES DE LIPOPLEXO DE RNA CRIODESSECADAS

[0513] Realizaram-se experiementos de transfecção in vitro de formulações criodessecadas de lipoplexo de RNA que codificam luciferase, preparadas em trealose a 22% em diferentes concentrações de NaCl. As amostras criodessecadas foram reconstituídas com solução de NaCl a 0,9%.

[0514] De acordo com a Figura 43, as formulações de lipoplexo de RNA criodessecadas preparadas com trealose a 22% e em diferentes concentrações de NaCl mostraram níveis semelhantes de transfecção de luc- RNA em células dendríticas. Não foi encontrada correlação entre a concentração de NaCl presente na formulação de lipoplexo de RNA e a transfecção de RNA in vitro. As amostras criodessecadas mostraram uma transfecção de luc-RNA semelhante ou até melhor em comparação com um controle de lipoplexo de RNA fresco.

D) ESTUDOS DE ESTABILIDADE

[0515] Formulações de lipoplexo de RNA criodessecadas contendo 10% de trealose, 22% de trealose e NaCl 0 mM, 20 mM, 40 mM, 60 mM e 80 mM, foram investigadas para estudos de estabilidade a 4 °C, 25 °C e 40 °C (1 mês e 6 meses). Após reconstituição no volume original com solução de NaCl a 0,9%, as amostras foram caracterizadas quanto ao tamanho de partícula e integridade do RNA (% de RNA de comprimento total).

[0516] De acordo com as Figuras 44 e 45, os tamanhos dos diferentes lipoplexos de RNA não mudaram significativamente ao longo do tempo, independentemente da formulação ou da temperatura de armazenamento.

Curiosamente, quantidades mais baixas de crioprotetor (por exemplo, 10%) são suficientes para manter a estabilidade das partículas na formulação criodessecada, enquanto uma quantidade maior (por exemplo,

22%) é necessária no caso da formulação congelada.

A integridade do RNA (%

de RNA de comprimento total) nas amostras criodessecadas após 6 meses de armazenamento a 4 °C variou entre 94% e 100% e para as formulações de

RNA(lip) armazenadas a 25 °C, variou entre 85% e 94%. No entanto, não foi identificada correlação com a razão de trealose para concentração de NaCl ou tempo de armazenamento.

Claims (115)

REIVINDICAÇÕES

1. MÉTODO PARA PRODUZIR UM COLÓIDE DE LIPOSSOMA, caracterizado por compreender injetar uma solução lipídica em etanol em uma fase aquosa para produzir o colóide de lipossoma, em que a concentração de pelo menos um dos lipídios na solução lipídica corresponde a ou é maior que a solubilidade de equilíbrio do pelo menos um lipídio em etanol.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela solução lipídica ser uma solução de uma mistura de dois ou mais lipídios diferentes.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela concentração de um lipídio na solução lipídica corresponder a ou ser maior que a solubilidade de equilíbrio do lipídio em etanol à temperatura ambiente.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela concentração lipídica total na solução lipídica ser de cerca de 180 mM a cerca de 600 mM, de cerca de 300 mM a cerca de 600 mM, ou cerca de 330 mM.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela solução lipídica compreender pelo menos um lipídio catiônico e pelo menos um lipídio adicional.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela concentração de um lipídio adicional na solução lipídica corresponder a ou ser maior que a solubilidade de equilíbrio do lipídio adicional em etanol.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 6, caracterizado por dito pelo menos um lipídio catiônico compreender 1,2- di-O-octadecenil-3-trimetilamônio propano (DOTMA) e/ou 1,2-dioleoil-3- trimetilamônio-propano (DOTAP).

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado por dito pelo menos um lipídio adicional compreender 1,2- di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), colesterol (Chol) e/ ou 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC).

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizado por dito pelo menos um lipídio catiônico compreender 1,2- di-O-octadecenil-3-trimetilamônio propano (DOTMA) e o pelo menos um lipídio adicional compreender 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE).

10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9, caracterizado pela razão molar do pelo menos um lipídio catiônico para o pelo menos um lipídio adicional ser de cerca de 10:0 a cerca de 1:9, de cerca de 4:1 a cerca de 1:2, de cerca de 3:1 a cerca de 1:1 ou cerca de 2:1.

11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pela solução lipídica compreender DOTMA e DOPE em uma razão molar de cerca de 10:0 a cerca de 1:9, de cerca de 4:1 a cerca de 1:2, de cerca de 3:1 a cerca de 1:1 ou cerca de 2:1.

12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pela concentração de DOPE na solução lipídica ser pelo menos cerca de 60 mM ou pelo menos cerca de 90 mM.

13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pela solução lipídica ser injetada na fase aquosa a uma velocidade de agitação da fase aquosa de cerca de 50 rpm a cerca de 150 rpm.

14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pela fase aquosa ser água.

15. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo método compreender ainda a agitação do colóide de lipossoma.

16. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo colóide de lipossoma ser agitado por cerca de 15 minutos a cerca de 60 minutos ou por cerca de 30 minutos.

17. MÉTODO PARA PRODUZIR UM COLÓIDE DE LIPOSSOMA, caracterizado por compreender injetar uma solução lipídica compreendendo DOTMA e DOPE em uma razão molar de cerca de 2:1 em etanol em água agitada a uma velocidade de agitação de cerca de 150 rpm para produzir o colóide de lipossoma, em que a concentração de DOTMA e DOPE na solução lipídica é de cerca de 330 mM.

18. COLÓIDE DE LIPOSSOMA caracterizado por ser obtenível pelo método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.

19. COLÓIDE DE LIPOSSOMA, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelos lipossomas possuírem um diâmetro médio de pelo menos cerca de 250 nm.

20. COLÓIDE DE LIPOSSOMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 19, caracterizado pelos lipossomas possuírem um diâmetro médio que varia de cerca de 250 nm a cerca de 800 nm.

21. COLÓIDE DE LIPOSSOMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizado pelos lipossomas serem lipossomas catiônicos.

22. COLÓIDE DE LIPOSSOMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, caracterizado pelos lipossomas compreenderem pelo menos um lipídio catiônico e pelo menos um lipídio adicional.

23. COLÓIDE DE LIPOSSOMA, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por dito pelo menos um lipídio catiônico compreender 1,2-di- O-octadecenil-3-trimetilamônio propano (DOTMA) e/ou 1,2-dioleoil-3- trimetilamônio-propano (DOTAP).

24. COLÓIDE DE LIPOSSOMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 23, caracterizado por dito pelo menos um lipídio adicional compreender 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), colesterol (Chol) e/ ou 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC).

25. COLÓIDE DE LIPOSSOMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizado por dito pelo menos um lipídio catiônico compreender 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamônio propano (DOTMA) e o pelo menos um lipídio adicional compreender 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn- glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE).

26. COLÓIDE DE LIPOSSOMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 25, caracterizado pela razão molar do pelo menos um lipídio catiônico para o pelo menos um lipídio adicional ser de cerca de 10:0 a cerca de 1:9, de cerca de 4:1 a cerca de 1:2, de cerca de 3:1 a cerca de 1:1 ou cerca de 2:1.

27. COLÓIDE DE LIPOSSOMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 26, caracterizado pelos lipossomas compreenderem DOTMA e DOPE em uma razão molar de cerca de 10:0 a cerca de 1:9, de cerca de 4:1 a cerca de 1:2, de cerca de 3:1 a cerca de 1:1 ou cerca de 2:1.

28. MÉTODO PARA PREPARAR PARTÍCULAS de lipoplexo de rna, caracterizado por compreender adicionar o colóide de lipossoma, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 27, a uma solução compreendendo RNA.

29. MÉTODO PARA A FABRICAÇÃO DE FLUXO CONTÍNUO de partículas de lipoplexo de rna, caracterizado por compreender misturar uma solução compreendendo RNA e uma solução compreendendo lipossomas catiônicos sob condições controladas de mistura do RNA e dos lipossomas catiônicos.

30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pela solução compreendendo lipossomas catiônicos ser o colóide de lipossoma, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 27.

31. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 30, caracterizado pela solução compreendendo RNA e a solução compreendendo lipossomas catiônicos serem soluções aquosas.

32. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, caracterizado por ser usada uma taxa de fluxo que permite a mistura da solução compreendendo RNA e da solução compreendendo lipossomas catiônicos.

33. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 32, em que o fluxo é caracterizado por um número de Reynolds superior a 300 ou de cerca de 500 a cerca de 2100.

34. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 33, caracterizado pelas condições controladas de mistura compreenderem controlar a razão de mistura da solução compreendendo RNA e da solução compreendendo lipossomas catiônicos.

35. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 34, caracterizado pelas condições controladas de mistura compreenderem controlar os volumes relativos da solução compreendendo RNA e da solução compreendendo lipossomas catiônicos que devem ser misturados.

36. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 35, caracterizado pela razão de mistura do RNA e dos lipossomas catiônicos ser controlada usando volumes de mistura idênticos (v/v) da solução compreendendo RNA e da solução compreendendo lipossomas catiônicos e ajustando as concentrações de RNA e lipossomas catiônicos nas respectivas soluções.

37. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 36, caracterizado pelas condições controladas de mistura serem selecionadas para manter as características das partículas de lipoplexo de RNA, evitando a obstrução.

38. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 37, caracterizado pelo método compreender o uso de um elemento de mistura do tipo Y ou do tipo T.

39. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 38, caracterizado pelo elemento de mistura tipo Y ou tipo T possuir um diâmetro de cerca de 1,2 mm a cerca de 50 mm.

40. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 39, caracterizado pelo método compreender o uso de uma bomba de seringa, em que duas seringas, uma compreendendo a solução compreendendo lipossomas catiônicos e outra compreendendo a solução compreendendo RNA, são inseridas em paralelo na mesma bomba.

41. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 40, caracterizado pelo método compreender o uso de um recipiente pressurizado, uma bomba de membrana, uma bomba de engrenagem, uma bomba de levitação magnética ou uma bomba peristáltica em combinação com sensores de taxa de fluxo opcionalmente com circuito de realimentação para controle em linha e ajuste em tempo real da taxa de fluxo.

42. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 41, caracterizado pela mistura da solução compreendendo RNA e da solução compreendendo lipossomas compreender cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 45 mM a cerca de 300 mM, ou compreender uma força iônica correspondente ao cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 45 mM a cerca de 300 mM.

43. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 42, caracterizado pela mistura da solução compreendendo RNA e da solução compreendendo lipossomas possuir uma força iônica de pelo menos cerca de 50 mM.

44. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 43, em que, em um padrão de espalhamento de raios X, os lipoplexos de RNA são caracterizados por um único pico de Bragg a cerca de 1 nm-1, em que a largura do pico é menor que 0,2 nm-1.

45. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 44, caracterizado pelas partículas de lipoplexo de RNA possuírem um diâmetro médio que varia de cerca de 200 a cerca de 800 nm, de cerca de 250 a cerca de 700 nm, de cerca de 400 a cerca de 600 nm, de cerca de 300 nm a cerca de 500 nm, ou de cerca de 350 nm a cerca de 400 nm.

46. MÉTODO PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO CONGELADA compreendendo partículas de lipoplexo de RNA, caracterizado por compreender (i) fornecer uma composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA e um estabilizador e (ii) congelar a composição.

47. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo congelamento ser a uma temperatura de cerca de -15 °C a cerca de -40 °C, ou a cerca de -30 °C.

48. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo estabilizador ser um carboidrato selecionado a partir de um monossacarídeo, um dissacarídeo, um trissacarídeo, um álcool de açúcar, um oligossacarídeo ou seu álcool de açúcar correspondente e um poli-álcool de cadeia linear.

49. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 48, caracterizado pelo fornecimento de uma composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA e um estabilizador compreender fornecer uma composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA e adicionar o estabilizador à composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA.

50. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 49, caracterizado pela adição do estabilizador à composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA reduzir a força iônica da composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA.

51. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 50, caracterizado pela concentração de estabilizador na composição aquosa compreendendo partículas de lipoplexo de RNA e um estabilizador ser superior ao valor necessário para a osmolalidade fisiológica.

52. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 51, caracterizado pela concentração de estabilizador na composição aquosa compreendendo lipoplexos de RNA e um estabilizador ser suficiente para manter a qualidade das partículas de lipoplexo de RNA e, em particular, para evitar perda substancial de atividade de RNA após armazenamento da composição a uma temperatura de cerca de -15 °C a cerca de -40 °C durante pelo menos um mês, durante pelo menos 6 meses, durante pelo menos 12 meses, durante pelo menos 24 meses ou durante pelo menos 36 meses.

53. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 52, caracterizado pelo pH na composição aquosa compreendendo lipoplexos de RNA e um estabilizador ser menor que o pH usual ideal para armazenamento de RNA.

54. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 53, caracterizado pela composição aquosa compreendendo lipoplexos de RNA e um estabilizador compreender cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM, ou compreender uma força iônica correspondente ao cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM.

55. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 54, caracterizado pela composição aquosa compreendendo lipoplexos de RNA e um estabilizador possuir uma força iônica correspondente ao cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 20 mM.

56. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 55, caracterizado pelas partículas de lipoplexo de RNA serem obteníveis pelo método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 28 a 44.

57. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender partículas de lipoplexo de RNA que são obteníveis pelo método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 28 a 45.

58. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelas partículas de lipoplexo de RNA compreenderem pelo menos um lipídio catiônico e pelo menos um lipídio adicional.

59. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 58, caracterizada pelo RNA codificar um peptídeo ou proteína compreendendo pelo menos um epítopo, em que a razão de cargas positivas para cargas negativas nas partículas de lipoplexo de RNA é de cerca de 1:2 a cerca de 1,9:2, ou cerca de 1,3:2,0.

60. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender: - partículas de lipoplexo de RNA compreendendo: RNA que codifica um peptídeo ou proteína que compreende pelo menos um epítopo; e pelo menos um lipídio catiônico e pelo menos um lipídio adicional; em que a razão de cargas positivas para cargas negativas nas partículas de lipoplexo de RNA é de cerca de 1:2 a cerca de 1,9:2 ou cerca de 1,3:2,0; e em que as partículas de lipoplexo de RNA possuem um único pico de Bragg a cerca de 1 nm-1, em que a largura do pico é menor que 0,2 nm-1.

61. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 60, caracterizada pela composição compreender ainda cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 10 a cerca de 300 mM, de cerca de 45 mM a cerca de 300 mM, de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM, ou de cerca de 80 mM a cerca de 150 mM.

62. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 61, caracterizada pela composição compreender ainda um tampão.

63. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 62, caracterizada pela composição compreender ainda um agente quelante.

64. COMPOSIÇÃO compreendendo partículas de lipoplexo de RNA caracterizada por ser obtenível pelo método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 46 a 56.

65. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 64, caracterizada pelas partículas de lipoplexo de RNA compreenderem pelo menos um lipídio catiônico e pelo menos um lipídio adicional.

66. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 65, caracterizada pelo RNA codificar um peptídeo ou proteína compreendendo pelo menos um epítopo, em que a razão de cargas positivas para cargas negativas nas partículas de lipoplexo de RNA é de cerca de 1:2 a cerca de 1,9:2, ou cerca de 1,3:2,0.

67. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 66, caracterizada pela composição compreender ainda cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM.

68. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender:

- partículas de lipoplexo de RNA compreendendo: RNA que codifica um peptídeo ou proteína que compreende pelo menos um epítopo; pelo menos um lipídio catiônico e pelo menos um lipídio adicional; em que a razão de cargas positivas para cargas negativas nas partículas de lipoplexo de RNA é de cerca de 1:2 a cerca de 1,9:2 ou cerca de 1,3:2,0; - cloreto de sódio em uma concentração de 0 mM a cerca de 40 mM; e - um estabilizador.

69. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 68, caracterizada pela composição compreender ainda um tampão.

70. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 69, caracterizada pela quantidade de RNA na composição ser de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 1 mg/ml, cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 0,5 mg/ml ou cerca de 0,05 mg/ml.

71. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 67 a 70, caracterizada pelo cloreto de sódio estar em uma concentração de cerca de 20 mM a cerca de 30 mM.

72. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 67 a 71, caracterizada pelo cloreto de sódio estar em uma concentração de cerca de 20 mM.

73. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 67 a 71, caracterizada pelo cloreto de sódio estar em uma concentração de cerca de 30 mM.

74. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 73, caracterizada pela concentração de estabilizador na composição ser superior ao valor necessário para a osmolalidade fisiológica.

75. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 74, caracterizada pela concentração de estabilizador na composição ser de cerca de 5 a cerca de 35% em peso por volume (% em p/v) ou de cerca de 12,5 a cerca de 25% em peso por volume (% em p/v).

76. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 75, caracterizada pelo estabilizador ser um carboidrato selecionado a partir de um monossacarídeo, um dissacarídeo, um trissacarídeo, um álcool de açúcar, um oligossacarídeo ou seu álcool de açúcar correspondente e um poli-álcool de cadeia linear.

77. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 76, caracterizada pelo estabilizador ser sacarose a uma concentração de cerca de 5 a cerca de 25% em peso por volume (% em p/v).

78. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 77, caracterizada pela sacarose estar em uma concentração de cerca de 15% (p/v) a cerca de 25% (p/v).

79. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 77, caracterizada pela sacarose estar em uma concentração de cerca de 20% (p/v) a cerca de 25% (p/v).

80. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 77, caracterizada pela sacarose estar em uma concentração de cerca de 22% (p/v).

81. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 77, caracterizada pela sacarose estar em uma concentração de cerca de 20% (p/v).

82. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 81, caracterizada pela composição possuir um pH que é menor que o pH usual ideal para armazenamento de RNA.

83. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 82, caracterizada pela composição possuir um pH de cerca de 5,7 a cerca de 6,7 ou de cerca de 6,2.

84. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 68 a 83, caracterizada pelo tampão ser o ácido 2-[4-(2- hidroxietil)piperazin-1-il]etanossulfônico (HEPES).

85. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 84, caracterizada pelo HEPES estar em uma concentração de cerca de 2,5 mM a cerca de 10 mM, ou de cerca de 7,5 mM.

86. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 85, caracterizada pela composição compreender ainda um agente quelante.

87. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender: - partículas de lipoplexo de RNA compreendendo: RNA que codifica um peptídeo ou proteína compreendendo pelo menos um epítopo a uma concentração de cerca de 0,05 mg/ml; e DOTMA e DOPE em uma razão molar de cerca de 2:1; em que a razão de cargas positivas para cargas negativas nas partículas de lipoplexo de RNA é de cerca de 1,3:2,0; - cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 20 mM; - sacarose a uma concentração de cerca de 22% (p/v); - HEPES a uma concentração de cerca de 7,5 mM com um pH de cerca de 6,2; e - EDTA a uma concentração de cerca de 2,5 mM.

88. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 87, caracterizada pela composição estar em um estado líquido ou congelado.

89. COMPOSIÇÃO CONGELADA, conforme definida na reivindicação 88, caracterizada pela composição ser estável a uma temperatura de cerca de -15 °C a cerca de -40 °C durante pelo menos um mês.

90. COMPOSIÇÃO CONGELADA, conforme definida na reivindicação 88, caracterizada pela composição ser estável a uma temperatura de cerca de -15 °C durante pelo menos um mês.

91. COMPOSIÇÃO CONGELADA, conforme definida na reivindicação 88, caracterizada pela composição ser estável a uma temperatura de cerca de -15 °C durante pelo menos dois meses.

92. COMPOSIÇÃO CONGELADA, conforme definida na reivindicação 88, caracterizada pela composição ser estável a uma temperatura de cerca de -20 °C durante pelo menos um mês.

93. COMPOSIÇÃO CONGELADA, conforme definida na reivindicação 88, caracterizada pela composição ser estável a uma temperatura de cerca de -20 °C durante pelo menos dois meses.

94. COMPOSIÇÃO CONGELADA, conforme definida na reivindicação 88, caracterizada pela composição ser estável a uma temperatura de cerca de -30 °C durante pelo menos um mês.

95. COMPOSIÇÃO CONGELADA, conforme definida na reivindicação 88, caracterizada pela composição ser estável a uma temperatura de cerca de -30 °C durante pelo menos dois meses.

96. COMPOSIÇÃO AQUOSA compreendendo partículas de lipoplexo de RNA, caracterizada por ser obtenível por descongelamento da composição congelada, conforme definida em qualquer uma das reivindicações

88 a 95 e, opcionalmente, ajuste da osmolalidade e força iônica adicionando um líquido aquoso.

97. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 96, caracterizada pela osmolalidade da composição ser de cerca de 200 mOsmol a cerca de 450 mOsmol.

98. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 96 a 97, caracterizada pela composição compreender cloreto de sódio a uma concentração de cerca de 80 mM a cerca de 150 mM.

99. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 98, caracterizada pelas partículas de lipoplexo de RNA serem obteníveis pelo método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 28 a 45.

100. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 99, em que as partículas de lipoplexo de RNA são caracterizadas por um único pico de Bragg a cerca de 1 nm-1, em que a largura do pico é menor que 0,2 nm-1.

101. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 100, caracterizada pelas partículas de lipoplexo de RNA possuírem um diâmetro médio que varia de cerca de 200 a cerca de 800 nm, de cerca de 250 a cerca de 700 nm, de cerca de 400 a cerca de 600 nm, de cerca de 300 nm a cerca de 500 nm, ou de cerca de 350 nm a cerca de 400 nm.

102. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 63, 65 a 86 e 88 a 101, caracterizada por dito pelo menos um lipídio catiônico compreender 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamônio propano (DOTMA) e/ou 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano (DOTAP).

103. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 63, 65 a 86 e 88 a 102, caracterizada por dito pelo menos um lipídio adicional compreender 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3- fosfoetanolamina (DOPE), colesterol (Chol) e/ou 1,2-dioleoil-sn-glicero-3- fosfocolina (DOPC).

104. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 63, 65 a 86 e 88 a 103, caracterizada por dito pelo menos um lipídio catiônico compreender 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamônio propano (DOTMA) e o pelo menos um lipídio adicional compreender 1,2-di-(9Z- octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE).

105. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 63, 65 a 86 e 88 a 104, caracterizada pela razão molar do pelo menos um lipídio catiônico para o pelo menos um lipídio adicional ser de cerca de 10:0 a cerca de 1:9, de cerca de 4:1 a cerca de 1:2, de cerca de 3:1 a cerca de 1:1 ou cerca de 2:1.

106. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 63, 65 a 86 e 88 a 105, caracterizada pelas partículas de lipoplexo de RNA compreenderem DOTMA e DOPE em uma razão molar de cerca de 10:0 a 1:9, de cerca de 4:1 a 1:2, de cerca de 3:1 a cerca de 1:1 ou cerca de 2:1 e em que a razão de carga de cargas positivas em DOTMA para cargas negativas no RNA é de cerca de 1:2 a 1,9:2.

107. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63, 86 e 88 a 106, caracterizada pelo agente quelante ser o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).

108. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 107, caracterizada pelo EDTA estar em uma concentração de cerca de 0,25 mM a cerca de 5 mM, ou de cerca de 2,5 mM.

109. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 108, caracterizada por compreender ainda um adjuvante.

110. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 109, caracterizada por ser formulada para administração sistêmica.

111. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 110, caracterizada pela administração sistêmica ser por administração intravenosa.

112. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 111, caracterizada por ser para uso terapêutico.

113. MÉTODO PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO AQUOSA compreendendo partículas de lipoplexo de RNA, caracterizado por compreender descongelar a composição congelada, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 88 a 112, e opcionalmente ajustar a osmolalidade e força iônica adicionando um líquido aquoso.

114. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 113, caracterizado por um líquido aquoso ser adicionado para obter uma osmolalidade da composição de cerca de 200 mOsmol a cerca de 450 mOsmol.

115. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 113 a 114, caracterizado por um líquido aquoso ser adicionado para obter cloreto de sódio em uma concentração de cerca de 80 mM a cerca de 150 mM.